JP6872182B2 - 核酸分析および定量化のための方法ならびにシステム - Google Patents
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Description
本発明は、2016年11月17日に出願された米国仮特許出願62/423,601の利益を主張し、これは引用によって本明細書に完全に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた中小企業技術革新研究プログラム認可番号1R43OD023028−01および1R43HG009640の下で政府の支援をうけて作られた。米国政府は本発明に一定の権利を有している。
本明細書で言及される公開物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の公開物、特許あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度、参照により本明細書に組込まれる。
一態様では、本開示は、試料を分析および/または処理するためのマイクロ流体デバイスを含むシステムを使用する方法を提供する。デバイスは、入口および出口に接続されたマイクロチャネルを含み得る。マイクロ流体デバイスはまた、複数のマイクロチャンバーおよび複数の吸い上げ開口部を含み得る。複数のマイクロチャンバーは、複数の吸い上げ開口部によってマイクロチャネルに接続され得る。マイクロ流体デバイスは、マイクロチャネル、マイクロチャンバー、および吸い上げ開口部をキャップして密閉する(例えば、気密封止する)熱可塑性の薄膜を含み得る。熱可塑性の薄膜は、圧力差が熱可塑性の薄膜を横切って加えられるとき、少なくとも部分的にガス透過性であってもよい。
本開示の方法およびシステムに有用なマイクロ流体デバイスは、任意の有用な方法によって製造され得る。例えば、デバイスの製造は、熱可塑性プラスチックを射出成形してマイクロ流体構造を作り出すことを含み得る。マイクロ流体構造は、マイクロチャネル、複数のマイクロチャンバー、および複数の吸い上げ開口部を含み得る。複数のマイクロチャンバーは、複数の吸い上げ開口部によってマイクロチャネルに接続され得る。マイクロチャネルは、入口および出口を含み得る。熱可塑性の薄膜は、マイクロ流体構造をキャップするために適用されてもよい。熱可塑性の薄膜は、圧力差が熱可塑性の薄膜を横切って加えられるとき、少なくとも部分的にガス透過性であってもよい。
一態様では、本開示は、核酸分子などの試料を分析するためにマイクロ流体デバイスを使用するための方法を提供する。核酸分子は、細菌などの病原体を含有するか、または含有する疑いがある試料中にあるかまたはそれに由来し得る。その方法は、本明細書に記載されるように、マイクロ流体デバイスを提供する工程を含み得る。デバイスはマイクロチャネルを含み得る。マイクロチャネルは、入口および出口に接続されたマイクロチャネルを含み得る。マイクロ流体デバイスは、複数の吸い上げ開口部によってマイクロチャネルに接続された複数のマイクロチャンバーをさらに含んでもよい。マイクロ流体デバイスは、薄膜がマイクロチャネル、複数のマイクロチャンバー、および複数の吸い上げ開口部をキャップするように、マイクロ流体デバイスの表面に隣接して配された薄膜(例えば、熱可塑性の薄膜)によって密閉され得る。試薬および/または試料は、入口または出口に加えられることもある。マイクロ流体デバイスは、試薬および/または試料とマイクロ流体デバイスとの間に第1の圧力差を提供し、試薬および/または試料をマイクロ流体デバイスへと流れさせることによって充填され得る。試薬および/または試料は、マイクロチャネルと複数のマイクロチャンバーとの間に第2の圧力差を加え、複数のマイクロチャンバーへと試薬および/または試料を移動させ、複数のマイクロチャンバー内のガスを薄膜通過させることによって、マイクロチャンバーへと分配され得る。第2の圧力差は、第1の圧力差よりも大きい場合もある。入口と出口との間の第3の圧力差は、流体をマイクロチャンバーへと導入することなく、その流体をマイクロチャネルへと導入するために加えられ得る。第3の圧力差は、第2の圧力差よりも小さい場合もある。試薬は、試料の前、試料の後、または試料と同時に添加され得る。試薬もまた、別の方法によってデバイスの1つ以上の区画において提供される。例えば、試薬は、薄膜を用いて1つ以上の区画を覆う前に、1つ以上の区画内に置かれ得る。
本開示は、試料の熱力学的分析のための方法を提供する。例えば、本明細書に記載されるデバイスは、高解像度融解(HRM)分析に使用され得る。複数の核酸分子を分析するための方法は、本明細書に記載されるような複数の区画を含むデバイスを提供することを含み得る。複数の区画の少なくとも部分集合は、複数の核酸分子(例えばデオキシリボ核酸またはリボ核酸分子)を含み得る。複数の区画の部分集合の各区画は、区画を外部環境から分離する少なくとも1つの障壁を通る、区画から区画の外部の環境へのガスフローを可能にするように構成され得る。その後、複数の区画の部分集合は制御された加熱にさらされ得る。複数の区画の部分集合がこれらの条件にさらされている間、信号は、例えば、複数の時点にわたって、複数の区画の部分集合から収集され得る。その後、複数の区画から集められた信号は、複数の区画の部分集合における複数の核酸分子の少なくとも部分集合の融点を示すデータをもたらすために処理され得る。制御された加熱が進行している間、または制御された加熱が完了した後、信号の処理が行われ得る。
一態様では、本開示は、複数の核酸分子を分析するために、(例えば、本明細書に記載される)マイクロ流体デバイスを使用するためのシステムを提供する。システムは、複数の区画を含むデバイスを受け入れるように構成されたサポートユニットを含み得る。デバイスの複数の区画の部分集合の各区画は、複数の区画の部分集合を外部環境から分離する少なくとも1つの障壁を通る、区画から区画の外部の環境へのガスフローを可能にするように構成され得る。システムはまた、複数の時点にわたって、デバイスの複数の区画の部分集合から信号を収集するように構成された検出器を含み得る。システムはまた、検出器に動作可能に結合された1つ以上のコンピュータプロセッサを含み得る。本明細書に記載されるように、複数の核酸分子の少なくとも部分集合から増幅産物を生成するために、複数の核酸分子を使用して、複数の区画の部分集合を、核酸増幅反応を行なうのに十分な条件にさらすように、1つ以上コンピュータプロセッサが個々にまたはまとめてプログラムされ得る。増幅反応が進行している間、1つ以上のコンピュータプロセッサもまた、複数の時点にわたって、検出器によって複数の区画の部分集合から収集された信号を受信するようにプログラムされ得る。信号が収集され、検出器で保存されて、プロセッサに所定の時間に送られるか、または信号が収集される時にプロセッサに提供されてもよい。1つ以上のコンピュータプロセッサは、複数の区画の部分集合からの信号の収集を命令するようにプログラムされてもよい。さらに、それらは、複数の区画の部分集合中の核酸分子の数を判定するために、収集した信号を処理するようにプログラムされてもよい。システムは、複数の核酸分子を複数の区画へと向けるように構成される流体流動装置(例えば、空気圧ユニット)をさらに含み得る。1つ以上のコンピュータプロセッサは、複数の区画に複数の核酸分子を充填するために流体流動装置を向けるよう個々にまたはまとめてプログラムされ得る。
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされるコンピュータ制御システムを提供する。図7は、試料の分配、増幅、および検出を含む、核酸試料を処理および分析のためにプログラムされ得るか、またはそうでなければ構成され得るコンピュータシステム(701)を示す。コンピュータシステム(701)は、本開示の方法およびシステムの様々な態様を調節することができる。コンピュータシステム(701)は、ユーザーの電子デバイス、またはその電子デバイスに対して遠隔的に位置することができるコンピュータシステムであってもよい。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであてもよい。
試薬の分配を、標準的な顕微鏡スライドの寸法を使用して組み立てられたマイクロ流体デバイスを使用して実証する。マイクロ流体デバイスの合計寸法は、幅1インチ、長さ3インチ、および厚さ0.6インチである。そのデバイスは、4つの異なるマイクロチャンバーアレイの設計、および全部で8つの異なるマイクロチャンバーのアレイを含む。図8のAは、8ユニットのデバイス、および4つのアレイの設計のうちの1つの拡大斜視図を示す。マイクロ流体デバイスを、シクロオレフィンポリマー(COP)、Zeonor 790R(Zeon Chemicals, Japan)から成型し、そして100μmのCOP薄膜、Zeonox ZF14(Zeon Chemicals, Japan)を用いて熱接合することで密閉した。示される拡大されたマイクロ流体のセグメントは、吸い上げ開口部によりマイクロチャンバーに接続される、曲がりくねったマイクロチャネルを有する。マイクロチャンバーは格子構成である。マイクロチャンバーおよびマイクロチャネルの深さは40μmであり、吸い上げ開口部の深さは10μmである。各隔離されたマイクロ流体のセグメントは、入口および出口のチャネルを有する。膜をマイクロ流体デバイスの基部に熱的に結合する前に、入口および出口のチャネルに、機械的に穴をあける。入口および出口のチャネルの直径は、1.6mmである。
マイクロ流体デバイスにおける核酸の増幅および定量化のための方法は、単一の機器で実施され得る。その機器によって、試薬の分配、熱サイクル、画像の取得、およびデータの分析が可能であり得る。図9は、単一の機器のワークフローが可能なプロトタイプの機器を示す。その機器は、一度に最大で4つのデバイスを収容し、そして同時の画像の取得および熱サイクルが可能となるように設計されている。その機器は、試薬を分配するための空気圧ユニット、温度を制御して熱サイクルするための熱ユニット、画像化するための光学ユニット、およびスキャンニングユニットを含む。光学ユニットは、2つの蛍光イメージング機能を有し、そしてFAMおよびROXのフルオロフォアの発光波長にそれぞれ相当する、およそ520nmおよび600nmの蛍光発光を検出することができる。光学ユニットは、25mm×25mmの視野、および0.14の開口数(NA)を有する。
既知のPCR試薬キットが2つの試薬混合物を調製するために使用され、第1の試薬混合物は、第2の試薬混合物の10倍の標的の量を有した。試薬はデバイスの2つの隣接したユニットに充填され、既製のコントローラーおよびカスタムインターフェースジグ(custom interface jig)を使用して空気圧で調整された。その後、デバイス(1708)は取り除かれ、図17A−17Bのシステム内に置かれた。デバイス(1708)は、良好な熱接触のためにガラス片によって標準フラットブロックサーマルサイクラー(1703)上で保持された。デバイス(1708)は、標準96−61°Cx40 PCRプロトコルを使用して、40回熱サイクルされた。各サイクル(11−40サイクル)の低温工程(61°C)の間、画像がカメラ(1704)を使用して自動的に撮られた。20サイクルで撮られた1列目の画像、30サイクルで撮られた2列目の画像、40サイクルで撮られた3列目の画像が図18に示される。上の列の画像は1つの区画当たり10コピー率での充填に相当し、下の列は区画当たり1つのコピーに相当する。カスタムImageJ pluginは、30サイクルの画像の各々において10倍画像セットの53の選択されたポイントについての平均強度データを抽出するために使用された。これらのデータは図19に図示され、バックグラウンド変動に対して標準化される。
既知の試薬キットは2つの試薬混合物を調製するために使用され、第1の試薬混合物は、第2の試薬混合物の10倍の標的の量を有する。試薬はデバイスの2つの隣接したユニットに充填され、既製のコントローラーおよびカスタムインターフェースジグを使用して空気圧で調整された。その後、デバイス(1708)は取り除かれ、図17A−17Bのシステム内に置かれた。デバイス(1708)は、良好な熱接触のためにガラス片によって標準フラットブロックサーマルサイクラー(1703)上で保持された。デバイス(1708)は、dPCR工程を完了するために、標準96−61°Cx40 PCRプロトコルを使用して40回熱サイクルされた。熱ユニット(1703)が約0.1°C/sの速度で温度を約60°Cから約90°Cに上昇させるにつれて、カメラ(1704)は5秒毎にデバイスで連続的に画像化した。約70°Cで撮られた1列目の画像、約80°Cで撮られた2列目の画像、約90°Cで撮られた3列目の画像が図25に示される。上の列の画像は区画当たり10のコピー率での充填に相当し、下の列は区画当たり1つのコピーに相当する。カスタムImageJ pluginは、10倍画像セットの54の選択されたポイントについての平均強度データを抽出するために使用された。これらのデータは図26に図示される。
Claims (21)
- 複数の核酸分子を分析するための方法であって:
(a)複数の区画を含むデバイスを提供する工程であって、ここで、前記複数の区画の少なくとも部分集合は前記複数の核酸分子を含み、ここで、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各区画は、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の外部の環境から分離する少なくとも1つの薄膜を通る、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合から前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の外部の環境へのガスフローを可能にするように構成され、ここで、前記少なくとも1つの薄膜は、(i)第1の圧力差が前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えられる場合、非ガス透過性であり、および(ii)前記第1の圧力差より大きい第2の圧力差が前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えられる場合、ガス透過性である、工程と;
(b)圧力差を前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えて、前記複数の区画におけるガスを、前記少なくとも1つの薄膜を通って前記外部の環境への流れにさらすために、流体流動装置を使用する工程と;
(c)前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を制御された加熱にさらしている間、前記複数の区分の少なくとも部分集合から信号を収集する工程と;
(d)前記複数の区画の前記少なくとも部分集合における前記複数の核酸分子の少なくとも部分集合の少なくとも1つの融点を示すデータをもたらすために、(c)において収集された前記信号を処理する工程と、を含む、方法。 - (a)に先立って、核酸試料の増幅産物として前記複数の核酸分子をもたらすのに十分な条件下で、前記核酸試料に対して核酸増幅反応を行なう工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸増幅反応を行なう前に、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合に前記核酸試料を充填する工程をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸試料に対して核酸増幅反応を行う工程は、前記核酸試料の核酸分子の少なくとも部分集合の内部転写されたスペーサー領域の少なくとも一部を増幅することを含む、請求項2に記載の方法。
- (c)は、前記信号を収集するために、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を画像化することを含む、請求項1に記載の方法。
- (d)における前記処理する工程は、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合における、前記複数の核酸分子の少なくとも部分集合について、信号対温度データを生成するために前記信号を使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の核酸分子は、病原体を含有しているか、または含有していることが疑わしい試料に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記病原体は少なくとも1つの細菌である、請求項7に記載の方法。
- (a)に先立って、前記複数の核酸分子またはそれらの部分集合を、前記少なくとも1つの細菌から単離または抽出する工程をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各区画において、前記病原体の有無を判定するために前記少なくとも1つの融点を示す前記データを使用する工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記複数の核酸分子を前記複数の区画に充填する工程をさらに含み、ここで、前記充填する工程の間、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合におけるガスは、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合から、前記少なくとも1つの薄膜を通って、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の前記外部の環境への流れを受ける、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の核酸分子は血液試料に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の核酸分子内の1つ以上の変異体を同定するために、前記少なくとも1つの融点を使用する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の変異体を定量化する工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 複数の核酸分子を分析するための方法であって:
(a)複数の区画を含むデバイスを提供する工程であって、ここで、前記複数の区画の少なくとも部分集合は前記複数の核酸分子を含み、ここで、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各区画は、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の外部の環境から分離する少なくとも1つの薄膜を通る、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合から前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の外部の環境へのガスフローを可能にするように構成され、ここで、前記少なくとも1つの薄膜は、(i)第1の圧力差が前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えられる場合、非ガス透過性であり、および(ii)前記第1の圧力差より大きい第2の圧力差が前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えられる場合、ガス透過性である、工程と;
(b)圧力差を前記少なくとも1つの薄膜にわたって加えて、前記複数の区画におけるガスを、前記少なくとも1つの薄膜を通って前記外部の環境への流れにさらすために、流体流動装置を使用する工程と;
(c)複数の核酸分子の少なくとも部分集合から増幅産物を生成するために、前記複数の核酸分子を使用して、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を、核酸増幅反応を行なうのに十分な条件にさらす工程と;
(d)(c)において前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を前記の条件にさらしている間、複数の時点にわたって、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合から信号を収集する工程と;
(e)前記複数の区画の前記少なくとも部分集合における核酸分子の数を判定するために前記信号を処理する工程と、含む、方法。 - (c)における前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を、核酸増幅反応を行うのに十分な条件にさらす工程は熱サイクルを含み、ここで、(d)における前記信号を収集する工程は、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各区画から1熱サイクル当たり1回より多く信号を収集することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記熱サイクルはフラットブロックサーマルサイクラーを使用して行なわれる、請求項16に記載の方法。
- (d)は、前記信号を収集するために、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合を画像化することを含む、請求項15に記載の方法。
- (d)は、2以上の波長で蛍光発光を検出する検出器を用いて行われる、請求項15に記載の方法。
- (e)は、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各区画について光強度を判定することを含み、ここで、前記光強度が前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の各々における増幅産物の量に比例する、請求項15に記載の方法。
- 前記複数の核酸分子を前記複数の区画に充填する工程をさらに含み、ここで、前記充填する工程の間、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合におけるガスは、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合から、前記少なくとも1つの薄膜を通って、前記複数の区画の前記少なくとも部分集合の前記外部の環境への流れを受ける、請求項15に記載の方法。
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