CN107532128B - 使用数字微流体的数字pcr系统和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于使用数字微流体来执行数字PCR的系统和方法，该数字微流体被配置用于皮升到纳升尺寸的分区的精确移动（其可以被用于分区生成）、移动通过用于PCR和核酸解链的温度梯度、以及信号检测，所有这些都在单个消耗品设备内。

Description

使用数字微流体的数字PCR系统和方法
技术领域
本发明涉及核酸扩增领域，并且更特别地涉及用于使用数字微流体的数字聚合酶链反应的系统和方法。
背景技术
数字聚合酶链反应（dPCR）是常规PCR的改良并且可以被用来直接量化和克隆扩增核酸，例如DNA、cDNA或RNA。常规的PCR通常被用于测量核酸量并且通过每个样品的单次反应来实施。利用dPCR方法，也在样品上实施单次反应，然而样品被分离成大量分区并且在每个分区中单独地实施反应。该分离允许核酸量的更可靠收集和敏感测量。
在dPCR中，样品被划分以使得该样品内的个体核酸分子被定位且集中在许多分离的区域内。个体核酸分子的捕获或隔离可以在微孔板、毛细管、乳状液的分散相、和小型化室的阵列中以及在核酸结合表面上执行。样品的划分允许通过假设分子群体服从泊松分布来估计不同分子的数目。因此，每个被划分的样品将包含“0”或“1”分子，或者分别阴性反应或阳性反应。在PCR扩增之后，可以通过对包含PCR末端产物的区域、阳性反应进行计数来量化核酸。在常规PCR中，PCR扩增循环的数目与起始拷贝数dPCR成比例，然而这不取决于用来确定初始样品数量的扩增循环的数目，从而消除对用来量化靶核酸的不确定的指数数据的依赖，并因此提供绝对量化。
现有的dPCR系统和方法具有需要用户干预的碎片化的工作流程。因此，在本领域中存在对用来执行dPCR反应和分析的更有效且可靠的系统和方法的需要。
发明内容
描述了用于使用数字微流体来执行数字PCR的系统和方法，该数字微流体被配置用于具有皮升到纳升尺寸的分区的精确移动（其可以被用于分区生成）、移动通过用于PCR和核酸解链的温度梯度、以及信号检测，所有这些都在单个消耗品设备内。另外，用户可以使用高分辨率解链/解链曲线技术来执行定量复用[1,2]。
在一个实施例中，提供一种数字PCR系统，其包括：微流体设备，其具有包括用于容纳流体样品的至少一个井的样品装载区；连续稀释区，其包括用于稀释样品的第一试剂储槽；PCR建立区，其包括第二试剂储槽；分区生成区，其被配置成生成样品的多个分区；包括至少一个热区域的PCR区，该至少一个热区域包括为PCR扩增限定热协议（thermalprotocol）的第一温度区域和第二温度区域；以及解链曲线区，其包括被配置成生成PCR扩增产物的解链分布图的热梯度。
在一个具体实施例中，提供一种设备，其包括上基板和下基板以及定位在该上基板和下基板之间的侧向平面，该下基板包括被配置成沿着侧向平面移动分区的电极阵列，其中该侧向平面包括多个区，其从近端到远端包括（a）制备区，其包括（i）样品装载区，（ii）水储槽以及一个或多个试剂储槽，每一个都与样品装载区连通，以及（iii）分区生成区；（b）与一个或多个加热元件热连通的扩增区，该一个或多个加热元件被配置成使该扩增区经历用于PCR扩增的热协议；以及（c）与一个或多个附加加热元件热连通的解链曲线区，该一个或多个附加加热元件被配置成使该解链曲线区经历热梯度以生成扩增产物的解链分布图。
此外，还提供一种在基于电润湿的微流体设备上执行数字PCR的方法，该方法包括按以下顺序的步骤：（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区；（b）利用一定体积的水稀释该分区；（c）使该分区与PCR试剂混合物混合；（d）将该分区划分成多个分区；（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区；以及（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图。在该方法的一个具体实施例中，使第一组分区经历步骤(a)-(f)；并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(f) ，其中该一个或多个附加组中的分区中的样品的体积小于第一组中的样品的体积，其中重复该方法直到实现最佳泊松分布为止。此外，该方法可以包括使第一组分区经历步骤(a)-(f)并且使一个或多个附加组分区经历步骤(a)-(f) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。在这点上，可以使一个或多个后续组的分区经历步骤(a)-(f)，其中相对于该第一组分区以及一个或多个附加组的分区中的样品连续稀释该一个或多个后续组的分区中的样品。
此外，本公开内容提供一种在基于电润湿的微流体设备上执行复用的数字PCR分析的方法，该方法包括按以下顺序的步骤：（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区，其中该样品包括多个靶序列；（b）利用一定体积的水稀释该分区；（c）使该分区与PCR试剂混合物混合；（d）将该分区划分成多个分区；（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区；（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图；以及（g）基于对于该一个或多个扩增子中的每一个的解链分布图检测该多个靶序列中的每一个靶序列的存在和/或不存在。在该实施例中，使第一组分区经历步骤(a)-(g)；并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(g) ，其中该一个或多个附加组中的分区中的样品的体积小于第一组中的样品的体积，其中重复该方法直到实现最佳泊松分布为止。此外，可以使第一组分区经历步骤(a)-(g)并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(g) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。仍进一步地，使一个或多个后续组的分区经历步骤(a)-(g)，其中相对于该第一组分区以及一个或多个附加组的分区中的样品连续稀释该一个或多个后续组的分区中的样品。
最后，在本文中所述的方法中，在步骤（e）之后，该多个分区中的每一个都包括零个或一个靶序列。
在下面的附图和描述中阐述了本主题的一个或多个实施例的细节。根据附图和详细描述并且根据权利要求，其他特征、对象和优点将是显然的。
附图说明
图1图示包括上基板和下基板以及定位在它们之间的侧向平面的微流体设备的某些子部件，其中该侧向平面包括本文中所述的多个区。
图2A-2F图示微流体设备的附加子部件。图2A示出从近端到远端包括制备区（201）、扩增区（202）、和解链曲线区（203）的单一消耗品设备（200）。图2B-2C图示设备200的制备区的备选实施例，并且图2D示出样品稀释分级区、PCR试剂分级区、分区生成分级区、以及扩增区和解链曲线区的展开视图。图2E图示包括分区分类区的设备的一个实施例。并且图2F示出扩增区的具体配置。
图2G示出被配置成使用设备200的一个系统。
图3A图示如何将设备200用于同一样品的重新测试并且图3B图示样品的一部分的重复稀释直到实现期望的精确度为止。
图4图示实时PCR中的解链曲线和HRM分析与由数字PCR执行的如何不等同。
图5A-5C图示可以如何将本文中所述的设备和方法用于复用dPCR测量。
图6A-6D图示描述在利用和不利用具有高靶浓度的样品和低靶浓度的样品的动态划分的定量复用的四个场景。
图7图示来自Bio-Rad的QX200分析软件的对低阳性分区的影响。
图8示出HRM或解链曲线数据的使用以更好地区分利用低阳性分区获得的结果。
图9图示使用数字微流体技术的样品周转时间。
图10示出图示每小时的样品处理量的图表。
图11A-11C示出按顺序处理连续稀释所需的时间。
具体实施方式
为了本公开内容的目的，术语“连通”被用来指示两个或更多个部件或元件之间的结构、功能、机械、光学、热或流体关系或者其任何组合。一个部件被称为与第二部件连通的事实不意图排除附加部件可存在于第一和第二部件之间和/或可操作地与第一和第二部件相关联或结合的可能性。
此外，为了本公开内容的目的，将要理解，当处于任何形式（例如分区、液滴或连续主体，不管是移动的还是固定的）的液体被描述为在表面、电极、阵列或设备“上”、“处”或“上方”时，这样的液体可以与表面、电极、阵列、或设备、或者其部件直接接触，或者它可以与插入该液体和表面、电极、阵列、或设备、或者其部件之间的一个或多个层或膜接触。
为了本公开内容的目的，一个分区是总体积的一个分离的部分。该分区可以是由形成该总体积的样品（诸如制备样品）生成的样品分区。各分区可以是尺寸基本上一致的或者可具有不同的尺寸（例如两个或更多个分立的尺寸一致的分区的组）。示例性分区是液滴。分区还可以在尺寸上以预定尺寸分布或以随机尺寸分布连续变化。液滴是分区的一个示例并且如在本文中所使用的，液滴是通常具有球形、被不混溶流体（诸如乳状液的连续相）包封的少量的液体。液滴的体积和/或乳状液中的液滴的平均体积可以例如小于约1微升、小于约1纳升、或小于约1皮升。液滴（或乳状液的液滴）可尤其具有小于约1000、100或10微米的、或者约1000到10微米的直径（或平均直径）。液滴可以是球形或非球形的。液滴可以是单一液滴或复用液滴（即在其中至少一个液滴包封至少一个另一液滴的液滴）。
如本文中所使用的，术语“试剂”描述对与样品反应、稀释样品、使溶解样品、使样品悬浮、使样品乳化、包封样品、与样品相互作用或添加到样品有用的任何剂或两种或更多种剂的混合物。试剂可以是有生命的（诸如细胞）或无生命的。用于核酸扩增反应的试剂包括但不限于，缓冲剂、聚合酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料、核酸酶等等。
数字微流体使用电润湿或介电电泳来通过利用表面张力和电场的组合来操纵液体的分立的分区（例如液滴）。在1987年在Cytonix处首次实施的数字微流体使得电场的使用能够跨表面移动分区。简言之，当液体分区被放置在疏水性表面上时，该分区在该表面上形成液滴。当施加电场时，该表面变成亲水的，导致液体分区粘附到该表面。通过改变亲水性表面上的分区的周围表面，该分区将迁移到带电的亲水性表面，导致分区移动。因此，分区可以以越来越大的速度在表面周围移动。已表明，可以使得纳升液滴以90Hz迁移[3]。本主题的实施例合并数字微流体技术并且将其应用于数字PCR。
解链曲线（解离曲线）以图表记述了随着反应温度上升当双链的DNA解离或“解链”成单链的DNA时在荧光中观察到的变化。例如，当双链DNA被加热时，随着到达解链点（Tm）检测到荧光的突然下降。扩增后解链曲线分析可以被用来检测引物-二聚物矫作物和污染并且用来确保反应的特异性。因为核酸的Tm除其他因素外受到长度、GC含量、以及碱基误配的存在的影响，可以通过不同PCR产物的解链特性来区别它们。此外，经由解链曲线分析的反应产物（例如引物-二聚物与扩增子）的表征降低对耗时的凝胶电泳的需要。通过所使用的反应条件和引物来确定实时PCR试验的特异性。然而，一直存在甚至设计非常好的引物可形成引物-二聚物或扩增非特异性产物的可能性。当执行RNA样品包含也可被扩增的基因组DNA的qRT-PCR时也存在该可能性。使用解链曲线分析可以确认qPCR或qRT-PCR反应的特异性。
高分辨率解链曲线（HRM）分析是一种用于识别例如SNP、新突变和甲基化模式的同质、PCR后方法。HRM分析是一种用来进行传统解链曲线拟合的更敏感的方法，在其中针对双链DNA解离成单链DNA处的温度（Tm）监测该双链DNA。在扩增之后，仪器缓慢增大温度，而同时监测荧光。荧光级缓慢下降直到温度达到产物Tm并且非常靠近Tm为止，当样品从双链过渡到单链DNA时观察到荧光中的显著下降。具体的DNA序列具有特性分布图。当Tm位移时或者当解链曲线的形状变化时检测到突变。与传统解链曲线分析形成对比，HRM可以提供各扩增子之间的单核苷酸区分。
本文中所述的设备和方法被配置成为在扩增区中生成的产物生成解链分布图。如本文中所使用的，“解链分布图”包括传统解链曲线分析以及HRM分析。
本文中所述的设备的一个实施例是一种微流体设备，其包括上基板和下基板以及定位在该上基板和下基板之间的侧向平面。该下基板包括被配置成沿着侧向平面移动分区的电极阵列。另外地或备选地，该电极可以被定位在上基板中（该设备在本文中被描述为具有定位在下基板上的电极，但是本领域技术人员将会理解，在其中电极被定位在上基板上的备选配置是一个适当的备选）。该设备的侧向平面包括多个区，该多个区从近端到远端包括：
（a）制备区，其包括（i）样品装载区，（ii）水储槽以及一个或多个试剂储槽，每一个都与样品装载区连通，以及（iii）分区生成区；
（b）与一个或多个加热元件热连通的扩增区，该一个或多个加热元件被配置成使该扩增区经历用于聚合酶链反应（PCR）扩增的热协议；以及
（c）与一个或多个附加加热元件热连通的解链曲线区，该一个或多个附加加热元件被配置成使该解链曲线区经历热梯度以生成扩增产物的解链分布图。
在下面更详细地描述微流体设备以及使用其的方法的该实施例。
图1图示上基板和下基板以及定位在它们之间的侧向平面。设备100包括下基板101，其中薄膜电子设备102被定位在该下基板上。该电子设备被布置成驱动一个或多个阵列元件电极（例如103）。多个阵列元件电极103被布置在具有MxN个元件的电极阵列104中，其中M和N是整数。在一个具体实施例中，M和N中的每一个都等于或大于2。液体分区（例如液滴105）被围在下和上基板（分别是101和106）之间（在不偏离本发明的精神或范围的情况下多个分区可以被定位在下和上基板之间）。垫片107被安置在定位于该设备中的下和上衬底之间以便在两个衬底和填充未被分区占用的体积的例如油的非离子流体（未被示出）之间生成适当的间隙。通过薄膜电子设备的适当设计和操作，向阵列中的不同电极施加不同的电压，由此控制表面的疏水性并促进分区在上基板和下基板之间的侧向平面（108）中的移动。在这点上，通过改变施加于电极阵列的一个或多个区段的电压在设备中生成侧向平面中的流体网络以使分区从设备的一个区或区域迁移到另一个。在美国申请公开No. 2013/0062205中描述了适当的基于电润湿的数字微流体设备的附加细节。
图2A-2F图示图1中示出的设备的附加部件。图2A示出从近端到远端包括制备区（201）、扩增区（202）、和解链曲线区（203）的单一消耗品设备（200）。在下面更详细地描述每个区的元件。
该制备区包括样品装载区（204），其包括多个样品装载区域（例如205），每一个都被配置成容纳包括样品的乳化体积的一个分区（例如一个液滴）。在一个具体实施例中，每个样品装载区域都可操作连接至设备上的至少一个通道或路径，分区沿着该至少一个通道或路径从一个区迁移到下一个。如上文参考图1所述的，通过对定位在该设备中的电极阵列的一个或多个元件的电压的适当施加来限定每个通道或路径。因此，该通道或路径是线性或非线性的。每个样品装载区域都包括一个样品入口（未被示出），其被配置成接受包含样品的注射器、移液管或PCR管。图2A-2F中示出的设备包括多个样品装载区域（例如十六个分立区域），它们可以利用多通道移液管来装载。然而，熟练的技工将会容易认识到在不偏离本发明的精神或范围的情况下可以基于用户的需要来调整该配置。制备区还包括水储槽或一系列水储槽（206）以及一个或多个试剂储槽（207），每一个都与一个或多个样品装载区域连通。在一个具体实施例中，样品被添加到样品装载区（其可操作连接至水和试剂储槽），以使得通过经由对制备区的一个或多个区域中的电极阵列的电压的受控施加将分区沿着该设备的侧向平面从制备区的一个区域迁移到另一个来使样品分区稀释并且与试剂混合。一旦样品的初始分区被稀释并与试剂混合，随后该分区就沿着该设备的侧向平面移动到定位在制备区中的分区生成区（208）。该分区生成区被配置成进一步划分分区并且通过对分区生成区中的电极阵列的电压的适当施加来完成进一步划分。
然后该分区从制备区迁移到扩增区（202），在那里使其经历用于扩增的热协议。该扩增区与被配置成从近端到远端增大扩增区中的温度的一个或多个加热元件（未被示出）热连通。例如，该扩增区域与至少两个加热元件热连通，扩增区中的第一加热元件被配置成将扩增区的变性区域（未被示出）加热到DNA被变性的温度（例如95℃），并且第二加热元件被配置成将扩增区的退火区域（未被示出）加热到DNA被退火的温度，例如退火温度低于引物的Tm约5℃。对于特定靶上的任何给定引物对的最佳退火温度（Ta Opt）可以被如下计算：Ta Opt = 0.3 x(引物的Tm) + 0.7 x(产物的Tm) - 25；在这里引物的Tm是缺乏稳定性的引物-模板对的解链温度，并且产物的Tm是PCR产物的解链温度。在一个具体实施例中，分区沿着扩增区中的线性或非线性的路径迁移。该路径可选地是迂回的以使得该分区跨变性区域和退火区域之间的区来回迁移直到达到期望的循环次数为止。该扩增区可以与被配置成检测从扩增区中的分区发出的光信号的检测系统（未被示出）光连通。
一旦在扩增区中完成扩增，每个分区就迁移到被配置成使分区经历温度梯度以生成解链分布图的解链曲线区（203）。与扩增区相似，解链曲线区与被配置成使分区经历通过解链曲线区迁移到温度梯度的一个或多个附加加热元件热连通。该解链曲线区与被配置成检测从解链曲线区中的分区发出的光信号的检测系统（未被示出）光连通。可选地，分区被收集在各个隔离储槽（209）中以便帮助诸如测序之类的下游工作流程（如果需要的话）。工作流程的完全整合的该方法还可以被用于也具有被校准到一个温度的扩增区的等温扩增技术。
如上文参考扩增和解链曲线区所述的，该设备与受操作该设备的操作系统控制的一个或多个加热元件以及在其中操作该设备的关联系统的一个或多个部件热关联（参见例如图2G）。该操作系统包括被配置成根据期望协议致动该一个或多个加热元件的处理器（例如计算器）。
在图2B-2C中示出设备200的制备区的备选实施例的详细视图。经由样品装载区（210）引入样品，该样品装载区（210）包括多个样品装载区域（例如211），每一个都被配置成容纳包括样品的乳化体积的一个分区（例如一个液滴）。该样品装载区与共用水储槽（212）连通。经由电润湿将分区从样品装载区迁移到样品稀释分级区（213，包括多个稀释室，例如214）。一旦被稀释，该分区就被迁移到PCR试剂分级区（215，包括多个分级室，例如216）。PCR试剂分级区与一个或多个PCR试剂储槽（217）连通，以使得该分区经由电润湿与适当体积和浓度的PCR试剂混合。该分区被从PCR试剂分级区迁移到分区生成分级区域（218，包括多个分区生成分级室，例如219），在那里在分区迁移到扩增区（220）之前将它进一步划分，在该扩增区（220）处使该分区经历用于扩增的热协议。一旦扩增完成，每个分区都通过被配置成使分区经历温度梯度以生成解链分布图的解链曲线区（221）。最后，分区被收集在各个隔离储槽（222）中以便帮助诸如测序之类的下游工作流程（如果需要的话）。图2C包括设备（200）的一个通道的展开视图。
图2D提供样品稀释分级区（213）、PCR试剂分级区（215）、分区生成分级区（218）、以及扩增区（220）和解链曲线区（221）的展开视图。如图2D中所示，单个分区被进一步划分成多个分区，并且每一个都迁移到扩增区和解链曲线区中的多个通道（例如高达20个通道）中。此外，为了考虑在扩增之后许多分区可能为阴性的事实，该设备可以被适配成包括将在迁移到解链曲线区之前促进阴性分区的去除的分区分类区（223，在图2E中示出）。阴性分区可以被迁移到废料室（235）并且可以在扩增区的远端处例如经由来自每个分区的可检测信号的光学检测来分析阳性/阴性分区。因此，扩增区可选地与被配置成检测来自每个分区的光信号的检测系统光连通，例如经由指示阳性分区的存在的荧光信号的发射。该特征降低迁移通过解链曲线区的分区的数目，由此衰减分区移动的速度以使得样品可以被迅速处理。
在图2F中示出扩增区的配置的一个非限制示例。如图2F中所示，该设备与被配置成从扩增区的近端（224）到远端（225）增大温度的一个或多个加热和冷却元件（未被示出）热连通。使分区在其中迁移的通道或路径（226）可以是通过扩增区的线性路径或者如图2F中所示使分区从扩增区的近端迁移到远端并再次返回直到达到期望的循环次数为止的迂回路径。
在图2G中示出被配置成使用设备200的一个系统。该系统（227）包括：用户界面（228）；可操作连接至该系统的计算机（229），其包括存储在其上的计算机可读介质，当该计算机程序被计算机执行时促使该系统使用设备（200）执行分析；样品/试剂引入和制备室（230）；光学检测子系统（232）；以及被适配成容纳设备200的可移动抽屉（233）。该可移动抽屉包括被配置成在扩增区和解链曲线区处热接触下基板和/或上基板的一个或多个加热和冷却元件（234）。备选地，一个或多个加热元件可以被合并到该设备的上基板中，以及该冷却元件可以被合并到与设备（未被示出）的下基板热连通的抽屉中。计算机程序包括系统控制程序，其包括但不限于被配置成控制对设备的一个或多个区、路径和/或通道中的电极阵列的一个或多个元件的电压的选择性施加以便将定位在所选区、路径和/或通道中的分区分离（划分）的分区控制程序。
设备200被配置成容纳和操纵体积小于10nL、具体地小于5nL、更具体地大约2nL（即对应于约210个um像素）的分区。在一个特定实施例中，该设备被配置成迁移小于1nL（对应于约105个um像素）的分区且每个设备迁移接近20,000个分区。该设备处理量是每秒设备的接近10-30个分区/mm宽度，即约36-54 el/s的分区速度。
例如，本文中所述的设备被配置成分析被划分成至少1,000,000个的多个样品。更具体地，该设备可以分析被划分成至少100,000（例如20,000-50,000）个分区的多个样品。在一个具体实施例中，该设备可以分析被划分成20,000个分区的多个样品。该设备可以分析高达100个样品，例如高达50个样品、高达25个样品、以及更具体地高达16个样品。仍进一步地，该设备被配置成在小于500秒内（例如小于250秒内、小于150秒内）以及在一个具体实施例中在125-500秒之间或特别地在140-460秒之间分析多个样品。在一个特定实施例中，该设备被适配成在小于500秒内分析被划分成20,000个分区的至少16个样品。
在另一实施例中，该设备被适配成在小于500秒内分析被划分成100,000个分区的至少16个样品。该设备还可以被适配成在小于500秒内分析被划分成1,000,000个分区的至少16个样品。
本文中所述的设备的活性区域的大约长度是约11-16cm，即对于扩增区5-10cm，对于解链曲线区大约4cm以及对于制备区大约2cm。
本文中所述的设备被配置成通过以下方法执行数字PCR分析：
（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区，
（b）利用一定体积的水稀释该分区；
（c）利用PCR试剂混合物混合该分区；
（d）将该分区划分成多个分区；
（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区；以及
（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图。
在一个实施例中，使第一组分区经历步骤(a)-(f)；并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(f) ，其中该一个或多个附加组中的分区中的样品的体积小于第一组中的样品的体积，其中重复该方法直到实现最佳泊松分布为止（下面更详细地描述）。此外，该方法还可以包括使第一组分区经历步骤(a)-(f)并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(f) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。仍进一步地，可以使一个或多个后续组的分区经历步骤(a)-(f)，其中相对于该第一组分区以及一个或多个附加组的分区中的样品连续稀释该一个或多个后续组的分区中的样品。
此外，本文中所述的设备被配置成要在执行复用数字PCR分析的方法中使用，其中该方法包括按以下顺序的步骤：
（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区，其中该样品包括多个靶序列；
（b）利用一定体积的水稀释该分区；
（c）使该分区与PCR试剂混合物混合；
（d）将该分区划分成多个分区；
（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区；
（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图；以及
（g）基于对于该一个或多个扩增子中的每一个的解链分布图检测该多个靶序列中的每一个靶序列的存在和/或不存在。
在该方法中，可使第一组分区经历步骤(a)-(g)；并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(g) ，其中该一个或多个附加组中的分区中的样品的体积小于第一组中的样品的体积，其中重复该方法直到实现最佳泊松分布为止。此外，可以使第一组分区经历步骤(a)-(g)并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(g) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。仍进一步地，可使一个或多个后续组的分区经历步骤(a)-(g)，其中相对于该第一组分区以及一个或多个附加组的分区中的样品连续稀释该一个或多个后续组的分区中的样品。最后，在本文中所述的方法中，在步骤（e）之后，该多个分区中的每一个都包括零个或一个靶序列。
本文中所述的设备可以被配置成使得整个工作流程能够无缝流动从而允许可以基于被分析分区的结果对同一样品的未来分区进行动态改变的反馈回路。解链分布图实现定量复用以及帮助对可能难以区分为阳性或阴性的分区归类。可以通过光学成像对该消耗品实时分析以便在每个分区流过消耗品设备时跟踪该分区并且从PCR扩增和解链分布图分析捕获诸如信号强度之类的数据。还有可能使该设备使用用于实时跟踪和捕获数据的其他装置。
熟练技工将会认识到，在不偏离本发明的精神或范围的情况下设备的相对尺寸和形状可以基于用户需求而改变。不管尺寸如何，本文中所述的设备被配置成实现以下板载过程：（i）按照需要通过板载稀释的样品浓度调整；（2）用于PCR和解链曲线分析的分区制备；（3）分区生成；（4）分区PCR扩增；以及（5）解链曲线分析。该设备配置允许可以基于被分析的分区来对同一样品的后续分区进行动态改变的无缝工作流程和反馈回路。该解链分布图促进定量复用并且它还可以被用来识别和区分阳性与阴性分区。该设备可以被实时分析，例如通过光学成像以便在每个分区流过该设备时跟踪该分区，从PCR扩增和解链分布图分析捕获诸如信号强度之类的数据。
现在的数字PCR系统具有需要用户干预的碎片化的工作流程。然而，使用本文中所述的设备，实现许多优点。在下面的非限制示例中更详细地描述这些优点。
示例。
示例1.基于样品浓度的动态划分。
数字PCR中的动态范围基于被用来划分样品的分区的数目[4]。数字PCR允许用户在应用泊松统计以考虑每个分区的多于1个的靶拷贝的随机概率的同时简单地对阳性分区与阴性分区的数目计数。因此，如果具有20,000个靶拷贝的样品运行通过常规的dPCR系统，则用户将观察到大约12,652个阳性分区。然而，一些分区具有一个靶而其他具有2、3、4、5、6或7个靶。泊松统计将预测下面的12,652个阳性分区的分布：
表1
阳性分区的数目 每个分区的拷贝数目
7373 1
3636 2
1269 3
286 4
66 5
10 6
2 7
在应用泊松统计之后，使用在20,000之中显示12,652个阳性分区的未知样品，在118的标准偏差和0.59的变差系数（CV）下该样品将被量化成大约19,999个靶拷贝。如果CV是可接受的，则用户可以继续量化下一样品。如果未知靶的浓度太高（例如500,000个靶，在基因表达和病毒载量定量中这是可能的），则同一20,000分区系统将不能够用可接受的精度量化该样品。在该场景中，给定未知靶的高浓度，泊松统计将预测下面的阳性分区分布：
表2
阳性分区的数目 每个分区的拷贝数目
1 8
5 9
19994 10+
在其中未知样品具有比可以通过分区的数目来可靠量化的靶多得多的靶的这些情况下，因此用户必须使用比它们的样品更少的样品，例如通过稀释。在该场景中，每10微升样品体积的500,000个靶拷贝的样品可以被连续稀释直到达到可接受的标准偏差和方差相关性：
表3
样品浓度（靶拷贝/微升） 使用20,000个分区估计的数量 标准偏差 % CV
500,000 未知 N/A N/A
400,000 未知 N/A N/A
250,000 未知 N/A N/A
200,000 181,497 4,450 2.45%
100,000 100,009 1,698 1.7%
50,000 49,981 400 0.8%
在这种情况下，用户将需要把他们的样品稀释10倍以便在0.89%的CV下得到从500,000到50,000。不幸的是，用户不知道初始的起始浓度是什么并且因此预定量是必须的以保持有效的工作流程处理量并管理重复运行的成本。
理想地，人将简单地增加分区的数目以便扩展容纳任何未知样品浓度的动态范围。然而，当前数字PCR系统包括对于每个样品的固定数目或尺寸的分区，例如使用Bio-RadQX100/200液滴数字PCR系统、Fluidigm BioMark HD、Thermo QuantStudio 3D、Formulatrix Constellation、Raindance Raindrop系统。一种方法已经被用来显著增大使用各种尺寸的分区的动态范围并从数学上确定样品浓度[5]。然而该方法仍依赖于不能被定制成确保最佳浓度确定的样品浓度的静态数目和尺寸的分区。尽管微流体技术已经实现了个体皮升到纳升尺寸的分区的容易分析，但是与处于从单个拷贝靶到1010的范围中的实时PCR的宽动态范围相比在数字PCR中仍存在所需的相当多的优点。为了达到实时PCR的动态范围，数字PCR将需要把样品划分成太高而不允许快速测试的尺度（例如1010个分区）。最好的情况，在处理量上有相当大限制（例如每24小时大约8个样品）的情况下，当前常规dPCR系统可以每50微升反应体积的样品产生107个分区。如在病毒载量测试（例如乙肝病毒）中看到的靶拷贝高的样品可以达到多达109个靶。当在现在的数字PCR上测试这样的样品时，这些样品将不被准确地量化或者将需要某一初步量化步骤（例如使用分光光度计或荧光光度计）。如果这些样品初步量化超过数字PCR系统的动态范围，则用户因此必须执行某一初步样品操纵（诸如执行连续稀释）来达到系统的动态范围。在该场景中，工作流程更费劲得多，样品过程中的处理量被降低，并且归因于手动连续稀释步骤引入量化中的附加误差。
体现在本公开内容中的一种解决方案是允许分区的数目或分区的尺寸成为基于样品的浓度而灵活且动态的。为了实现这一点，整个数字PCR工作流程（从分区生成到分区内的靶扩增，以及最后分区产物信号检测）被集成到单个设备中。该方法是使用数字微流体而设想的，该数字微流体提供用来按照需要创建、分离、混合和移动分区的简单、巧妙方法。
在本文中所述的设备中，某些初始分区（例如100个分区）被生成、扩增和检测，其中结果产生多少个分区是阳性或阴性的初步分析。该阳性分区与阴性分区的比提供初始样品浓度。基于该结果，从该样品创建的任何未来分区可以被调整。例如，一种方法将如下改变分区尺寸：
假设未知样品的起始浓度是每20微升10,000,000个靶扩增子，可以使用下面的方法：
（a）从理论上每个分区含有500个靶拷贝的起始样品得到处于1纳升分区尺寸的100个初始分区，以使得从统计上来说所有分区都将是阳性的。利用设备上的单独储槽中的试剂，在扩增和检测之前该系统自动将样品与试剂组合。基于泊松统计的所计算的结果的靶浓度将不产生结果：
表4
理论上#跨100个分区 (1 nL)划分的靶 所估计的数量 标准偏差 % CV
50,000 未知 N/A N/A
（b）基于100%阳性分区/总分区结果，该系统从同一起始样品得到处于1纳升分区尺寸的第二组100个分区。归因于其小的尺寸，每个分区将因此产生每个分区的约0.5个拷贝。泊松估计将给出下面的结果：
表5
理论上#跨100个分区(1 pL)划分的靶 所估计的数量 标准偏差 % CV
50 50.26 3.93 7.8%
（c）用户然后将使用用于定量的原始20微升样品体积的仅0.1001微升（对于第一组100个1纳升分区的100纳升和对于第二组100个1皮升分区的100皮升）（即样品体积的0.5%）继续进行。使用这样的低体积具有节省用于其他应用（诸如下一生成测序、用于未来应用的样品储备等等）的起始样品的增加的益处。
（d）尽管该系统可以继续量化剩余的样品是可能的，但是如果0.101微升足以精确地执行计算则它可能是不必要的。
两个组之间的分区的数目不需要是相同的；当将根据分区的数目调整计算时这可以被调整。此外，最终达到最佳泊松分布所需的组的数目不被限于如上文所讨论的2，而是相反根据需要直到样品被可接受的量化为止。
该方法允许系统自动划分初始组、评估定量精度、确定并实施稀释（如果需要的话），以用于同一样品的重新测试（图3A）。整个工作流程实现没有用户干预的自动化。软件算法可以基于结果来确定接下来的步骤。用户可以简单地指定标准偏差的等级或期望的CV并且系统将反复稀释样品的一部分直到实现期望的精度为止（图3B）。
另一方法将是稀释每个组之间的样品。假设与上面相同的场景，未知样品的起始浓度是每20微升10,000,000个靶扩增子每微升。可以使用下面的方法：
（a）来自理论上每个分区将含有500个靶拷贝的起始样品的处于1纳升分区尺寸的100个初始分区意味从统计上来说所有分区都将是阳性的。基于泊松统计的所计算的结果的靶浓度将不产生结果：
表6
理论上#跨100个分区(1 nL)划分的靶 所估计的数量 标准偏差 % CV
50,000 未知 N/A N/A
（b）基于100%阳性分区/总分区结果，该系统将使用消耗品板载的水储槽执行初始1,000倍样品稀释，即利用999纳升水稀释1纳升样品。备选地，不是如在该情况中示出的单次1,000倍稀释，可以执行连续稀释来实现1:1000倍稀释。
（c）从1:1000倍稀释的样品得到处于1纳升分区尺寸的第二组100个分区。归因于其小的尺寸，每个分区将因此产生每个分区的约0.5个拷贝。泊松估计将给出这些结果：
表7
理论上#跨100个分区(1 pL)划分的靶 所估计的数量 标准偏差 % CV
50 50.26 3.93 7.8%
（d）用户然后将使用用于定量的原始20微升样品体积的仅0.101微升（对于第一组100个1纳升分区的100纳升和对于来自倍稀释的第二组100个分区的1纳升）（即样品体积的0.5%）来完成。使用这样的低体积具有节省用于其他应用（诸如下一生成测序、用于未来应用的样品储备等等）的起始样品的增加的益处。
（e）尽管该系统可以继续量化剩余的样品是可能的，但是如果0.101微升足以精确地执行计算则它可能是不必要的。
如上文所述，两个组之间的分区的尺寸不需要是相同的；当将根据分区的数目调整计算时这可以被调整。同样，最终实现最佳泊松分布所需的组的数目不被限于2，而是相反根据需要直到样品被可接受的量化为止。最后，如参考上述方法描述的，该方法允许系统自动划分初始组、评估定量精度、确定并执行稀释（如果同一样品的重新测试需要的话）。相比而言，下面的步骤将是现在的数字PCR系统的典型方法用户（假设与上面相同的场景，具有每20微升10,000,000个靶扩增子的未知样品的起始浓度）：
（i）将初始体积的样品手动等分以用于初步定量。通常利用标准移液器和工作流程，1-2微升通常被用于该步骤。
（ii）使用分光光度计或荧光光度计，在该1-2微升体积中确定大约核酸浓度。
（iii）根据样品计算总核酸浓度。
（iv）从总核酸浓度估计靶扩增子的浓度，即例如在1,000,000到100,000,000靶扩增子之间进行估计。
（v）使用给出20,000个分区的dPCR系统，执行使用1微升样品的1,000倍连续稀释。
（vi）利用已稀释样品设置PCR反应。
（vii）完成数字PCR工作流程。
（viii）在工作流程结束时，分析结果以确定原始样品浓度。考虑到与预定量步骤（iv）相关联的误差，则标准偏差或CV不在可接受的等级内是有可能的。如果那样的话，该过程必须以基于当前结果的更精确的稀释从步骤（v）重复。
在该当前工作流程中消耗的样品体积是2-3微升。这比在本公开内容中设想的明显更多。
在对这三种方法的比较中，前面两种是在本公开内容中设想的。其好处是（1）允许用户从必须通过另一方法（诸如分光光度技术/荧光测定技术/电泳技术）预量化他们的样品中脱身，（2）降低试剂成本，因为系统将优化用来量化样品所需的样品的最小数量，（3）降低消耗品成本，因为系统可以使用同一消耗品来执行多轮定量，以及（4）节省样品以使得如果需要稀释来达到数字PCR系统的动态范围则不需要将额外的样品用于二次运行。另外，数字微流体技术通过最小化手动移液方法中固有的误差来最大化定量精度。此外，在现在的数字PCR系统中对样品的最终定量确定是需要用户在设置PCR反应体积的同时基于稀释计算原始起始样品的手动过程。使用数字微流体，因为该系统执行必要的计算来自动完成对任何稀释的调整，所以原始起始样品浓度可以被自动确定。
利用使用数字微流体的自动稀释的另一应用是用于使用解链曲线[6]或高分辨率解链[7]的复用应用。将在下一部分中进一步详细地讨论这一点。
示例2.使用单个荧光团的定量复用。
现在的数字PCR和实时PCR系统受限于通过荧光团的复用-通常高达6个靶。然而，使得理想地在数字PCR中一个分区仅具有一个靶扩增子的个体靶的划分考虑到多于两个靶的定量复用的能力。曾经在实时PCR中的通过解链曲线或高分辨率解链（HRM）的定性分析变成数字PCR中的定量分析。使用HRM或解链曲线，对数字PCR的敏感性和精度的定量复用在靶上可以达到超过二个靶并且达到几百个靶[1,2,8]。已经存在指出使用解链曲线来更好区分多个扩增子的能力的实时PCR试验的一些示例，但是类似数字PCR的定量的等级是不可能的（例如Seegene TOCE技术和罗氏SeptiFast工具箱）。现在的商业数字PCR系统没有利用使用解链曲线或HRM的定量复用。尽管现在的使用解链曲线/HRM的复用仍依赖于不同的荧光团信号，但是利用数字PCR定量复用是可能的，其中单个荧光团或者作为嵌插DNA结合染料（比如SYBR绿）或基于探针的化学（比如分子信标）。
可以使用该方法来检测和验证新突变。如本文中所述的，实时PCR中的典型解链分布图是样品内的所有物种的平均解链分布图。这没有考虑靶和轻微变体之间的灵敏区分。因为数字PCR将靶和变体分离到不同分区中，所以对于每个分区的解链分布图是有区别的并且可以彼此区分，从而允许未知变体的识别。该方法的应用包括病毒突变研究（诸如HIV），在这里被治疗的患者可能由于病毒突变而产生耐药性。在治疗期间能够利用当新病毒突变发生时可以识别的试验来监视患者从研究的角度来看将是有价值的但也是临床相关的。该实施例还允许变体的隔离以用于下游分析（诸如测序）中的确认。
数字微流体已经被用来执行高分辨率解链[9]。在本公开内容中，HRM被提供用于定量，具体为数字PCR中的定量复用。
多年来实时PCR和数字PCR的用户对复用的需求不断增加。然而，区分荧光图的能力仅允许小程度的复用。Nanostring®是已引入一种每次复用高达800个靶的新颖方式的一种技术；然而灵敏度与基于PCR的方法不完全可比，其中成本和处理量受到限制。利用本文中所述的方法，将有可能在没有通常与复用相关联的困难的情况下复用几百个靶，因为在数字PCR中，划分通过靶的有限稀释降低对单定位点（singleplex）的复用并且各个分区中各个靶的随机分布不一定在同一分区中（参见图3）。
利用该等级的定量复用，这最终可以解决市场的定量复用需要[1,2]；以可受益于PCR灵敏度但向上复用2到几百个靶的脓毒症诊断市场、微生物分析、和遗传的生物标志物板为例。
实时PCR中的解链曲线和HRM分析不等同于由数字PCR执行的那些。在数字PCR中，因为在扩增之前每个分区都仅包含作为原始起始材料的单个模板，所以在PCR扩增之后对于每个分区的所有扩增子产物是同质的。该同质允许将更好的解链曲线/HRM数据用于区分其他分区[1,2,8]。在实时PCR中，在扩增之后多个靶的同质样品仍将保持异质并且因此解链曲线/HRM将是该异质性的反映。这使得经由解链曲线/HRM来区分多个靶是困难的并且因此依赖于荧光团来执行复用。
图4图示该讨论。具有两个靶的异质实时PCR样品的解链曲线/HRM产生反映两个扩增子产物的解链分布图的曲线。相反，将对于仅具有一个靶模板的每个分区生成数字PCR解链曲线。在实时PCR解链分布图中，有可能辨别2个峰值，但是将不可能量化每个峰值是由多少个模板造成的。并且因为更多靶被添加至复用板，所以解链分布图可能几乎无法分辨，尤其是在突变检测的情况下，在那里单个碱基对的变化在解链曲线中有非常细微的变化（例如SNP分析）。异质实时PCR样品的解链曲线/ HRM的分析最终要求用户例如使用分子信标、TaqMelt、双寡核苷酸杂交探针等等来改变杂交探针化学反应。相比之下，使用数字PCR，通过唯一的解链分布图对峰值的数目进行计数并且将这些峰值分类可以得出结论存在两个产物，每一个都具有跨4个分区划分的两个模板。
此外，使用实时PCR，所有靶都在同一反应容器中。该方法需要不同信号/荧光团都可用于突出和量化感兴趣的靶。在考虑光谱重叠的情况下现在对荧光团的数目的限制不会使其自身适于多于六个靶的复用。或许具有更小光谱分布的未来荧光团将允许使用实时PCR的高度复用。在使用本文中所述的方法的某些实施例中，所有靶都被隔离在个体分区中并因此需要仅一个信号来识别在每个分区中的靶是哪个。然而，单独作为在现在的数字PCR系统中示例化的端点PCR信号的信号强度并不足以识别每个分区中的靶是哪个。通过解链分布图采用核酸解离特性将允许靶识别。并且因为每个分区理想地具有一个起始模板，所以对由类似解链分布图分组的阳性分区的数目进行简单计数将允许定量复用。本公开内容将样品划分的优点与解链分布图分析组合以实现这一点。
某些实施例允许利用嵌插DNA结合染料的定量复用。现在通过使用多个荧光团来完成在实时PCR中的定量复用。多年来，许多用户已试图通过使用复用试验中的嵌插DNA结合染料来降低成本。这些试验往往不是定量的，但往往是识别靶的存在或不存在诸如SNP分析或传染性剂的识别[10,11]。利用在本公开内容中融入的解链分布图分析和划分靶（例如数字PCR）中发现的准确性和精度，可以使用有成本效益的嵌插DNA结合染料来获得定量复用。
如果使用多个信号（诸如实时PCR所共用的荧光团），则这将增加可以被复用的靶的数目。如图5A中所示，在实时PCR中，检测到表示对于样品中的所有扩增子的组合解链分布图的单个解链分布图。相比之下，在图5B中，dPCR实现对于每个分区的有区别的解链分布图的检测。如图5C中所图示的，两个不同的靶将会共享同一解链分布图（诸如解链分布图3与4、或2与5、或1与6），可以基于荧光团颜色识别每一个。因此，如果四个荧光团的组合以及如果30个靶可以利用对于每个荧光团的30个有区别的解链分布图被识别，则复用板可以被用来识别120个靶（30 x 4）。
此外，如所示的定量复用可以在靶的数目上进行扩增。最近的公开已示出利用足够的样品划分，92次复用试验是可能的[1]。如该公开物中描述的实施方式中的难点是将需要根据有多少个靶以及每个靶来按比例稀释以使得在1个分区中仅有1个靶模板的样品。本公开内容已经描述了基于样品浓度的动态划分的使用。使用如所述的动态划分，这将允许定量复用试验的实施。
图6A-6D图示描述在利用和不利用具有高靶浓度的样品和低靶浓度的样品的动态划分的定量复用的四个场景。在图6A的场景1中，假设靶数目将是40，其中在20微升反应体积中平均每个具有20,000个靶（例如如在基因表达、微生物分析、SNP分析等等的研究中），将存在大约800,000个靶。在所有分区都具有10+个靶的情况下，这将类似于比如在实时PCR中的异质混合物。当分区体积被降低时，泊松分布示出越来越多的分区将包含越来越少的靶，并且最终所有靶的99.6% (796,821/800,000)将按每个分区1个靶来分布。这允许在扩增和解链曲线分析之后每个分区内的同质混合物关于在该特定分区中的是40个靶中的哪个而非常可辨别且可识别。
某些实施例将允许分区体积的变化，因为可以容易地完成分区的分裂和合并。在图6B的场景2中，假设与场景1中相同的条件，将会存在大约800,000个靶。不是改变分区体积，而是最初将使用具有100个分区的初始化设置的动态划分工作流程对样品进行采样。示出所有100个分区都是阳性的，可以采用10倍稀释。在该等级处的定量复用将是困难的，因为每分区具有2个或更多靶的阳性分区将是异质样品并且因此不可被准确定义。然而进一步稀释将示出阳性分区的96%每个分区仅具有1个靶(770/800)的泊松分布。于是这将允许同质解链分布图并且帮助对每个不同靶的识别和定量。
某些实施例将允许样品的初始分析，之后是同一样品的动态划分和稀释以最终实现每个分区1个靶并且因此通过解链分布图的定量复用。同样将有可能的是，将会存在每个分区多于1个靶（诸如2个靶），解链分布图可以仍然足以区别于单独的任一靶以允许识别并将那些分区合并到样品定量中。
图6B的场景3图示期望高级复用的低靶拷贝数的示例。如在血液筛查或常规临床诊断中看到的脓毒症测试、低病毒载量筛查（例如、HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、呼吸道板、等等）、以及病毒潜伏期研究是可能的应用。假设40个不同的靶，每个都具有每20微升中的平均5个拷贝，需要量化总共200个靶。考虑到分区的数目与靶的较低数目的高比值，如在观察到的泊松分布s中示出的分区尺寸的影响是不明显的。因此所图示的任何分区尺寸都将精确地允许定量复用。如果使用动态划分，得到相同的结论。
就对初始浓度大大不同的多个靶进行量化而言，通过实时PCR的复用具有另外的优点。如果一个给定的靶在反应中仅有10个拷贝，而另一靶有107个拷贝，则理论上实时PCR系统的动态范围应该能够量化这二者。然而，自从实时PCR出现以来已经广泛讨论的是，当高和低靶被一起扩增时扩增效率会受到影响[12]。表8（下面）示出当现在复用浓度差异巨大的2靶时，来自靶2的产物数量将大大超过采用更快得多地影响靶1的扩增效率的耗尽Taq聚合酶和dNTP的反应这使得难以准确定量。结果是实时PCR系统的用户需要分离他们的试验并且在单独的井中运行对于每个靶的量化试验。
Figure 553417DEST_PATH_IMAGE001
在某些实施例中，假定可以通过如上文所述的动态划分并且利用解链分布图分析凭经验达到最佳浓度，彼此间差别巨大的靶可以准确地量化。反应中Taq聚合酶和dNTPs试剂的竞争是通过划分去除的，因为为每个分区仅存在1个靶。可以采用来自单个样品的定量复用而不考虑变化的靶浓度。
当与样品的数字划分和解链分布图分析组合时，数字微流体促进该复用。随着使包含单个模板的每个个体分区通过温度区（例如解链曲线协议），可以观察到双链DNA的解链。可以采用各种技术来检测这些经过的分区。可以使用传统荧光团化学反应（例如分子信标、TaqMelt、杂交探针）。另一方法是使用结合到DNA的电化学嵌插染料或比如电化学分子信标的探针[13-23]。通过氧化还原反应，分区的电导可以被测量以确定PCR扩增子是否存在。随着这些分区通过温度梯度，当PCR扩增子解离时可以通过数字微流体技术来直接测量电导的变化。
数字PCR中的定量复用的另一应用是确定基因连锁。一个示例是脓毒症细菌耐药性测试。实时PCR中的复用测试可以利用样品识别多个传染性剂。它还可以被用来识别耐药性基因。了解哪个传染性剂具有该耐药性基因具有临床意义。然而在实时PCR中，因为所有靶都在单个反应容器中，所以不可能确定哪个传染性剂具有该耐药性基因。在数字PCR中，每种传染性剂的基因组彼此隔离。因此在实时PCR中使用的同一复用试验中，将有可能识别哪个传染性剂具有该耐药性基因，因为PCR产物将共同定位到某一分区。最终这些分区可以在设备上被隔绝，并被隔离以用于下游应用（诸如测序以确认）。
示例3.解决低或假阳性分区。
作为端点PCR，数字PCR结果现在受到低或假阳性分区的挑战。有人已提出，低的假阳性来自于导致不良的扩增、探针的自发水解、分区碎片或由于污染而产生的真正假阳性的不良的试验设计。用户的困难在于不能准确地确定阳性分区是低阳性还是导致关于结果的值或相关性的不确定性的污染事件。通过增加扩增循环（从而减少周转时间）和/或重新设计试验引物和探针，已经花费了大量的时间和资源来改进试验以减少低阳性分区。虽然有人认为低阳性分区不常见并且对临床或研究应用也没有什么后果，但如果如在HIV潜伏期研究中所经历的用户正在观察罕见事件就不一定如此[24-27]。当预期只有几个阳性分区的几个低阳性可能会对临床或研究应用产生重大影响。图7示出图示来自Bio-Rad的QX200分析软件的该影响的示图。
事件0到大约15,500属于一个样品，而事件15,501到32,000属于一不同样品。在样品1中，用户将在y轴上4200左右看到阳性分区（这是每个分区的信号强度）并且在1000左右看到阴性分区。在样品2中，阳性分区在2000左右并且阴性分区在约900。在这两个示例中，存在既不落入阳性组群又不落入阴性组群的分区。这些分区通常被称为“雨”。雨的存在影响结果的精度。在预期靶的数目很低的应用中（诸如在用于血液筛查或临床诊断、败血症测试、病毒潜伏期研究的低病毒载量中），处于已经很少的阳性分区之间的很少的雨分区可以表示相当大的不确定性。这种不确定性现在在实时PCR中不存在。因为所有模板都在单个容器中被扩增，所以获得了一个平均读数，屏蔽任何这种不确定性。在实时PCR中常常采用解链分布图来确认是否产生预期的扩增子。对于现在的数字PCR用户，几乎所有样品都有一定量的雨。
该领域当前使用统计算法来消除雨，主要使用均值和标准偏差来建立阳性-阴性分区调用阈值。该方法中的难点是每天在逐个样品上的同一种试验可能改变，从而使得阳性分区确定困难。自动化数字PCR变得具有挑战性，因为每个样品都将需要人工检查以确保正确地确定样品结果。
某些实施例使用解链分布图来解决与雨相关联的问题。使用HRM或解链曲线数据，关于分区的添加的信息层可以被获得以更好地区分低阳性分区是不同的产物还是高背景荧光。利用对于每个分区的解链曲线分布图，用户可以更好地确定是否产生正确的扩增并且因此促进自动化的划分。来自引物-二聚物或矫作物扩增的雨可以被忽略，而低扩增效率被包括在内（参见图8）。
示例4.对于临床应用的试验验证。
数字PCR正将强劲的逆风带到定量PCR市场。归因于采用泊松统计而来代替逐个循环的扩增效率以及样品的合成富集、归因于划分已将其自身定位在当样品材料可能是限制的时其精度允许更好的诊断信心的低病毒载量定量和稀有突变检测的一个利基应用中，数字PCR提供超过实时PCR的固有灵敏度。然而归因于与雨相关联的问题，在数字PCR系统上开发的试验的验证一直是个挑战。
通过数字微流体，阳性分区的隔离允许用户隔离特定分区（例如阳性分区与阴性分区，雨分区与高信号分区）以执行下游分析（诸如测序）来验证试验性能。市场上具有液滴分区或固定分区的当前系统对具体分区挑战进行分类并隔离。数字微流体可以容易地处理该任务，因为它控制每个分区移动。消耗品上的储槽已经被设计成保持要收集的感兴趣分区以用于下游应用（参见图2C）。在图2C的最右边，存在可以保持各种分区的储槽（例如（222））。用户可以利用具体解链分布图来隔离仅某些阳性分区。储槽的数目可以根据用户的需要而灵活改变。
示例5.快速工作流程、周转时间和高样品处理量。
随着下一代测序的应用的发展，用户所面临的一个挑战是确保核酸样品质量是合适的。模板破碎程度、样品的纯度、和模板的浓度可以显著影响结果。常常在确定样品是否被充分制备以用于下一代工作流程中使用毛细管电泳法、分光光度法和荧光测定技术（诸如Agilent Bioanalyzer和Thermo Fisher NanoDrop和 Qubit）。一些用户已经开始使用实时PCR代替，因为样品质量的最终确定是在测序之前的库制备步骤期间当下一代测序本身要求PCR时样品是否可以是可扩增的。由伊鲁米那公司的MiSeq和HiSeq体现的下一代测序技术的一个限制是对将样品通道过聚类或欠聚类的敏感性。过聚类结果是因为聚类重叠的不准确性，而欠聚类导致序列生成的表现不佳，从而导致重复运行样品。鉴于执行实时PCR与电泳/分光光度法/荧光测定法的时间和资源的巨大差异，很多用户慢慢地采用实时PCR来作为对这些其他方法的一种替代。
某些实施例将允许作为来自于分区生成、分区移动、连续稀释（如果需要的话）、PCR、解链曲线、和分析的整个工作流程的明显更快的结果集成在一个系统中。而且，基于数字微流体技术的当前状态，分区处理的速度可以将时间从45-60分钟降低到低至小于6分钟的结果（这使得它在时间上类似于毛细管电泳法、分光光度法和荧光测定技术），其具有可以被直接转移到下一代测序应用中的库构建的增加的益处。
基于当前的数字微流体技术，可以以高速率（例如高达100个分区/秒）来生成和移动分区[3]。在某些实施例中，因为分区正移动到各个温度区，所以PCR扩增可以比实时PCR要明显更快地发生。许多现在的实时PCR系统（诸如Thermo QuantStudio 6、Bio-RadCFX96、Agilent MX3005P、Roche LightCycler）在样品周围的温度被加热和冷却的同时使样品固定。加热和冷却速率基本上限制40-60分钟的典型PCR运行时间的约75%。甚至现在的数字PCR系统（诸如Bio-Rad QX200、Thermo QuantStudio 3D、FormulatrixConstellation、Fluidigm BioMark、Raindance Raindrop）已围绕同一原理设计了PCR热循环步骤。不幸的是，分区附近的附加油/塑料/金属需要热循环更大的质量并且因此延长斜坡速率和温度保持时间。在某些实施例中，分区移动到温度区消除来自斜升温度和斜降温度的延迟，从而导致显著的时间节省。因为每个分区按顺序移动，所以存在低热质量以便很快达到合适的温度。图9中示出的表图示使用数字微流体技术的样品周转时间。假设分区以10个分区/秒跨消耗品移动，则将在7.0分钟内生成20,000个分区、扩增PCR和描绘解链曲线。如果分区移动可以被增大到如[3]描述的100个分区/秒，则周转时间将下降到0.7分钟。
如果需要100,000个分区来用于定量更高体积样品，则可以使用20个通道以100个分区/秒在2.7分钟内完成样品。
这些快速周转时间将允许更高的处理量。图10示出图示每小时的样品处理量的图表。这些计算背后的假设基于每个消耗品具有20通道的16个样品。如果每个样品使用40个通道，则样品处理量保持不变，因为样品/消耗品的数目从16个减少到8个样品槽，抵消了从更高周转时间获得的20到40个通道增益。该高周转时间将允许以与分光光度法/荧光光度法相当的速度以定量复用方式的核酸定量。
某些实施例还可以被用于测序工作流程中的库准备（参见图2A）。用于PCR的试剂储槽可以被设置成保持不同的试验。在分区生成之前每个唯一的试剂（试验）可以与每个样品分离和组合。如果针对多个样品需要运行多个试验板，则这将允许容易的PCR设置。在各种试验板运行的情况下这可以被应用于样品。用于测序的库构建也可以利用某些实施例。
某些实施例将许多通道用于每个样品。这促进分区的更快处理，在20,000或多得多时这可能非常明显。在当前设计中，它被设置成20个通道，但是在任何地方它可以是从2个通道或更多通道。
假设分区以10个分区/秒跨分区移动，则执行的110样品浓度、0.5纳升的分区尺寸和10X的连续稀释。图11A-11C中的表示出按顺序处理每个连续稀释将花费多长时间。
处理第一组200个分区在结果准备好之前将需要3分钟。如果线3中的第一稀释被执行，则在那里160个分区将花费额外2.8分钟，使来自第一200个和第二160个的总时间达到5.8分钟。最终，如果每个稀释都在系统达到如由泊松分布定义的可量化范围的时间内被连续分析，则这将花费24.3分钟。利用具有更低SD和CV的线9的理想量化结果将更好，其将花费28.1分钟。
因为存在许多个通道，所以有可能按顺序为每个稀释指定一个通道以使得所有分区被并行处理。在该示例中，该系统自动执行跨12个通道的所有稀释序列。这将总时间结果从24.3分钟降低到4分钟以下。如果对于用来量化的分区的数目而言SD和CV是可接受的，则系统可以停止。然而，如果需要更高的SD或CV，则系统可以识别哪个稀释是最佳的并且指定所有通道来处理来自该稀释步骤的分区。
类似地，独立地使用每个通道的该方法可以被适配成量化复用靶。复用试验可以用广阔范围的分区来量化各靶，一个靶是100 个拷贝/ul，而另一个处于100,000,000,000个拷贝/ul；因此，一种稀释可能对于一个靶是最佳的，一不同的稀释对于另一个靶将是最佳的。然后可以指定不同的通道来量化每个靶。例如，图2D示出可以被实施这一点的消耗品的区域。区域1-4 (215)是PCR试剂分级区域，在其中一种或多种PCR试剂与该区域中存在的分区混合。区域1可以包含100 个拷贝/ul的稀释混合物而区域2可以包含100,000,000个拷贝/ul的稀释混合物。这二者在这些区域中与PCR试剂混合。一旦已发生样品和PCR混合的适当混合，就依次经由数字微流体将区域1和2的内含物分别迁移到区域5和6。区域5然后将继续将各分区分配到通道1或更多通道（例如直到通道10），而区域6然后将各分区分配到通道11或更多个（例如在通道11-20之间）。因此，同一样品被定量用于跨不同通道的不同靶。即使起始靶是显著不同的，样品在不同室中的连续稀释、随后的在不同通道中分区通过PCR和解链分布图的分离允许以适当的靶浓度来对样品进行定量。尽管在技术上有可能仅稀释整个样品以使得最高浓度的靶被稀释到消耗品的动态范围，但是该方法可能生成将花费大量的时间的大量分区并且降低样品处理量。
尽管已经为了清楚和理解的目的相当详细地描述了前面提到的发明，但是从本公开内容的阅读对本领域技术人员来说将清楚的是，可以在不偏离本发明的真实范围的情况下作出形式和细节上的各种改变。例如，可以以各种组合来使用上文描述的所有技术和装置。
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Claims (19)

1.一种微流体设备，其包括上基板和下基板以及定位在上基板和下基板之间的侧向平面，该下基板包括被配置成沿着侧向平面移动分区的电极阵列，其中该侧向平面包括多个区，该多个区从近端到远端包括：
（a）制备区，其包括（i）样品装载区，（ii）水储槽以及一个或多个试剂储槽，每一个都与样品装载区连通，以及（iii）分区生成区；
（b）与一个或多个加热元件热连通的扩增区，该一个或多个加热元件被配置成使该扩增区经历用于聚合酶链反应（PCR）扩增的热协议；以及
（c）与一个或多个附加加热元件热连通的解链曲线区，该一个或多个附加加热元件被配置成使该解链曲线区经历热梯度以生成扩增产物的解链分布图。
2.根据权利要求1所述的微流体设备，其中该样品装载区包括每一个都被配置成容纳一分区的多个样品装载区。
3.根据权利要求1或2中的任一项所述的微流体设备，其中该样品装载区被配置成容纳体积高达100nL的分区。
4.根据权利要求1至2中的任一项所述的微流体设备，其中该扩增区与被配置成从近端到远端增大扩增区中的温度的一个或多个加热元件热连通。
5.根据权利要求4所述的微流体设备，其中该扩增区包括热梯度路径，分区沿着该热梯度路径迁移通过该扩增区。
6.根据权利要求5所述的微流体设备，其中该电极阵列被配置成沿着热梯度路径来回迁移该分区。
7.根据权利要求1至2中的任一项所述的微流体设备，其中该解链曲线区与被配置成使迁移通过解链曲线区的分区经历热梯度的一个或多个附加加热元件热连通。
8.根据权利要求7所述的微流体设备，其中该扩增区和解链曲线区中的一个或多个与检测系统光连通，该检测系统被适配成检测从定位在该扩增区中的分区发出的光信号。
9.根据权利要求1至2中的任一项所述的微流体设备，其中该制备区进一步包括样品稀释分级区，样品稀释分级区包括每一个都与水储槽连通的多个稀释室。
10.根据权利要求1至2中的任一项所述的微流体设备，其中该制备区进一步包括PCR试剂分级区，PCR试剂分级区包括每一个都与一个或多个PCR试剂储槽连通的多个分级室。
11.根据权利要求1至2中的任一项所述的微流体设备，其中该分区生成区包括分区生成分级区域，分区生成分级区域包括多个分区生成分级室。
12.根据权利要求2所述的微流体设备，其中该制备区进一步包括样品稀释分级区，样品稀释分级区包括多个稀释室，其中该多个稀释室的至少一个稀释室与样品装载区和水储槽连通。
13.根据权利要求12所述的微流体设备，其中该制备区进一步包括PCR试剂分级区，PCR试剂分级区包括每一个都与一个或多个PCR试剂储槽连通的多个分级室，其中该多个稀释室的该至少一个稀释室与该多个分级室的至少一个分级室连通。
14.根据权利要求13所述的微流体设备，其中该分区生成区包括分区生成分级区域，分区生成分级区域包括多个分区生成分级室，其中该至少一个分级室与至少一个分区生成分级室连通。
15.一种在基于电润湿的微流体设备上执行数字PCR的方法，基于电润湿的微流体设备是根据权利要求1-14中任一项所述的微流体设备，该方法包括按以下顺序的步骤：
（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区；
（b）将一定体积的水添加到该样品装载区中的分区，并由此稀释该分区；
（c）将PCR试剂混合物添加到该样品装载区中的分区用于使该分区与PCR试剂混合物混合；
（d）将该分区划分成多个分区，其中划分步骤在该设备上在分区生成区中进行；
（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区，其中经历步骤（e）在该设备上在扩增区中进行；
（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图，其中经历步骤（f）在该设备上在解链曲线区中进行；
（g）基于步骤（f）的结果确定样品浓度；以及
（h）用一个或多个附加分区重复步骤（a）-（g）直到获得最佳泊松分布为止，所述一个或多个附加分区包括相对于先前分区尺寸已调整的分区尺寸，以确定调整后的样品浓度。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使第一组分区经历步骤(a)-(f)并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(f) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。
17.一种在基于电润湿的微流体设备上执行复用数字PCR分析的方法，基于电润湿的微流体设备是根据权利要求1-14中任一项所述的微流体设备，该方法包括按以下顺序的步骤：
（a）将包括样品的分区添加到定位在该设备上的样品装载区，其中该样品包括多个靶序列；
（b）将一定体积的水添加到该样品装载区中的分区，并由此稀释该分区；
（c）将PCR试剂混合物添加到该样品装载区中的分区用于使该分区与PCR试剂混合物混合；
（d）将该分区划分成多个分区，其中划分步骤在该设备上在分区生成区中进行；
（e）使该多个分区经历热协议以生成一个或多个含有扩增子的分区，其中经历步骤（e）在该设备上在扩增区中进行；
（f）使该一个或多个含有扩增子的分区经历热梯度并由此为该一个或多个含有扩增子的分区中的每一个生成解链分布图，其中经历步骤（f）在该设备上在解链曲线区中进行；
（g）基于对于该一个或多个扩增子中的每一个的解链分布图检测该多个靶序列中的每一个靶序列的存在和/或不存在；以及
（h）用一个或多个附加分区重复步骤（a）-（g）直到获得最佳泊松分布为止，所述一个或多个附加分区包括相对于先前分区尺寸已调整的分区尺寸，以确定调整后的样品浓度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中使第一组分区经历步骤(a)-(g)并且使一个或多个附加组的分区经历步骤(a)-(g) ，其中相对于第一组分区中的样品连续稀释该一个或多个附加组的分区中的样品。
19.根据权利要求15至18中的任一项所述的方法，其中在步骤（e）之后，该多个分区中的每一个都包括零个或一个靶序列。
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