JP6754301B2 - ドロップレットデジタルｐｃｒの測定方法および測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、ドロップレットデジタルＰＣＲの測定方法および測定装置に関する。

がんや感染症の診断においては、検体中に微量にしか含まれないがん関連遺伝子およびウイルス由来遺伝子の定量や、対象とするがん関連遺伝子の総量に比べ、極めて微量な変異の検出が求められている。これまでこのような遺伝子検査ではＰＣＲ（特許文献１−３）やリアルタイムＰＣＲ（非特許文献１）が用いられていた。ＰＣＲが、増幅した対象遺伝子をアガロース電気泳動によりエンドポイントで検出する半定量的な分析手法であるのに対して、リアルタイムＰＣＲは、蛍光標識プローブやＤＮＡインターカレーターなどを用いて対象遺伝子の指数関数的に増幅する過程をリアルタイムに検出する定量的な分析手法である。

近年、検体の微量化や早期診断のため、従来以上に高感度な遺伝子検査が求められる機会が増えており、このような高感度遺伝子検査を再現性よく定量的に測定できることの重要性がたかまっている。リアルタイムＰＣＲは対象遺伝子の定量測定が可能であるものの、対象遺伝子が微量になると定量測定の再現性が低下するという問題があった。これは、リアルタイムＰＣＲでは既知濃度に調整した対象遺伝子をサンプルとして用いた検量線を測定に必要とするために絶対的な定量ができないことや、検体由来の成分によりＰＣＲの増幅効率が左右されることが原因となっている。

ドロップレットデジタルＰＣＲ（特許文献４）は、限界希釈したサンプルを用いて絶対的に定量することで、従来の遺伝子検査における対象遺伝子が微量なときに測定再現性が低下するという課題を解決する方法として開発された。ドロップレットデジタルＰＣＲの実験手順を次に示す。まず、限界希釈した検体に、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、オイル中にＰＣＲ反応液のドロップレットを作製する。作製したドロップレットは、１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入っている。次に、ドロップレット内の対象遺伝子を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ後に各ドロップレットの蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつドロップレットの数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量する。ドロップレットデジタルＰＣＲでは、限界希釈した検体を用いてＰＣＲの阻害要因となる検体由来成分の影響が抑えられる。また、検量線を必要としないため、絶対的な定量ができる。

ＰＣＲでは、反応液中の反応阻害物の存在やテンプレートＤＮＡの二次構造の形成、プライマーの設計不十分などにより、反応効率が低下することが知られている。これまでドロップレットデジタルＰＣＲでは、エンドポイントで測定するためＰＣＲの反応効率が測定結果に大きく影響しないとされていた。しかし実際は、１分子のＤＮＡを含むドロップレットで４０サイクルのＰＣＲを行う場合、ＰＣＲ増幅産物の分子数は１サイクルの反応効率により大きく異なる。例えば、１サイクルの反応効率が２倍のときは１．１ｘ１０^１２分子、１サイクルの反応効率が１．５倍のときは１．１ｘ１０^７分子、１サイクルの反応効率が１．４倍のときは０．７ｘ１０^６分子に増幅する。ドロップレットの大きさが４ｐＬで、１μＭのプライマーを含む場合、プライマーの分子数は２．４ｘ１０^６分子となり、１サイクルの反応効率が１．５倍以上のときであればＰＣＲ増幅産物の分子数はプライマーの濃度で制限される。しかし、１サイクルの反応効率が１．４倍以下ではＰＣＲ増幅産物の分子数は１サイクルの反応効率により大きく異なる。したがって、ドロップレット１つ１つの反応効率を同等にそろえられないとドロップレットの蛍光強度のばらつきが大きくなる。

米国特許第４６８３１９５号 米国特許第４６８３２０２号 米国特許第４８００１５９号 特表２０１３−５２１７６４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０，ｐｐ９８６−９９４，１９９６

本発明の目的は、新たなドロップレットデジタルＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することである。

本発明者らは、蛍光標識プローブの色と蛍光強度に加え、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって、測定再現性および測定精度を向上させることができることを見出し、本発明の完成に至った。

本発明に係る一実施態様は、オイル中にあり、ＤＮＡと、前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、前記ドロップレット内で、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含むＤＮＡ検出方法である。前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有し、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光色素の蛍光強度の変化に基づいて、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度が測定されてもよい。

本発明に係る他の実施態様は、オイル中にあり、ＤＮＡと、ＤＮＡインターカレーターと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、を含むＤＮＡ検出方法である。

上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、複数の前記ドロップレットが平面配置されていてもよい。また、前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有してもよい。

本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットは前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含有し、前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、前記ドロップレット内で前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含み、第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法である。

本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットはＤＮＡインターカ
レーターを含有し、前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、を含み、第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第３の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法である。

上記いずれかのＤＮＡ判定方法において、前記増幅産物が検出でき、かつ前記融解温度が所定の範囲内であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有していたと判定してもよい。

本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中のドロップレット内のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、前記オイル中の前記ドロップレットを加温するための加温部と、前記オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、前記ドロップレットの昇温に伴う前記蛍光強度の変化から前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度または前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部と、を備えるＤＮＡ検出装置である。前記オイル中のドロップレット内のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。前記ドロップレット内のＤＮＡの有無を表示するモニターを備えてもよい。

本発明に係るさらなる実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、上記いずれかのＤＮＡ検出方法または上記いずれかのＤＮＡ判定方法を行わせるためのプログラムである。このＤＮＡ検出装置は、上述したＤＮＡ検出装置であってもよい。

本発明によって、新たなドロップレットデジタルＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することができるようになった。

本発明の一実施態様における基本概念を示す図である。 従来技術によるドロップレットデジタルＰＣＲの測定結果の例を示す図である。 本発明の一実施態様における、ドロップレットが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の模式図である。 従来技術において、ドロップレットに含まれる遺伝子が同定できないドロップレットデジタルＰＣＲ測定結果の一例を示す図である。 本発明の一実施態様において、ＤＮＡインターカレーターを用いてＤＮＡのＴｍを測定する方法を示す模式図である。 本発明の一実施態様において、蛍光標識プローブを用いてＤＮＡのＴｍを測定する方法を示す模式図である。 本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジを示す模式図である。 図７の装置とカートリッジを用いた測定でＤＮＡインターカレーターを用いてＴｍ測定を行う方法の一実施態様を示すフローチャートである。 図７の装置とカートリッジを用いた測定で蛍光標識プローブを用いてＴｍ測定を行う方法の一実施態様を示すフローチャートである。 モニターに表示される測定結果の一例である。 モニターに表示される測定結果の一例である。 本発明の一実施例において、ＤＮＡインターカレーターを用いてドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定した結果を示すグラフである。

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）ＤＮＡ検出方法の原理及び効果
本発明に係るＤＮＡ検出方法は、オイル中にあり、ＤＮＡと、そのＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、ＤＮＡを増幅する工程と、融解曲線分析によって、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度を測定する工程と、を含む。

図１に本発明の代表的な実施態様において想定される測定結果の例を示した。また、図２に従来のドロップレットデジタルＰＣＲのマルチプレックスでの測定結果の例を示した。

ドロップレットデジタルＰＣＲでは、ＤＮＡの変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲが行われることがある。図２Ａの例は、対象遺伝子の野生型アレルに対しては黄色の蛍光標識プローブを、対象遺伝子の変異型アレルに対しては緑色の蛍光標識プローブを用い、対象遺伝子の変異型Ａと変異型Ｂの蛍光標識プローブの量を３：５となるように使用した場合の結果を模式的に示した図である。ここでは、蛍光標識プローブは、ＰＣＲに用いられるプライマーペアの間に位置する配列に相補的であって、プライマーが伸長するときに、プローブが分解され、蛍光標識が蛍光を発するように構成されているものとする。具体的には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが例示できる。対象遺伝子の野生型アレルを含むドロップレット２０１では、対象遺伝子の野生型アレルに対応した黄色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、黄色の蛍光を発する。また、対象遺伝子の変異型Ａアレルを含むドロップレット２０２では、対象遺伝子の変異型Ａアレルに対応した緑色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、緑色の蛍光を発する。対象遺伝子の変異型Ｂアレルを含むドロップレット２０３では、対象遺伝子の変異型Ｂに対応した緑色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、緑色の蛍光を発する。このとき、変異型Ａアレルを含むドロップレットの蛍光強度と変異型Ｂアレルを含むドロップレットの緑色の蛍光強度は、ドロップレットに添加した蛍光標識プローブの量に比例し、３：５となる。対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０４は、緑色と黄色の蛍光のどちらもが検出されない。しかし、実際には図２Ｂ、Ｃに示すように、ＰＣＲの反応が不十分なドロップレットがあるため、ドロップレットの蛍光強度の分布が広くなることがあり、また、蛍光強度の分布の広がりが大きくなりすぎると、図２Ｄのように、変異型Ａのドロップレット２０２と変異型Ｂのドロップレット２０３の分布が重なってしまうことがある。

また、図２Ａに示すように、ドロップレットデジタルＰＣＲでは、１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を限界希釈してドロップレットを作製するため、作製されたドロップレットの５―９割は対象遺伝子を含まない空のドロップレット２０４となる。このような空のドロップレットであっても、検体由来の成分により一部の蛍光標識プローブが分解され、蛍光色素とそのクエンチャーが切断されて蛍光を発する場合があり、閾値を設定してこのような空のドロップレットを排除する。また、ドロップレットデジタルＰＣＲでは、変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一
度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲを実現するため、ＰＣＲ後、蛍光色素の色と強度から閾値を設定し、対象遺伝子を含むドロップレット２０１、２０２、２０３の数をカウントする。

ドロップレットデジタルＰＣＲの実験では、前述したような対象遺伝子を含まない空のドロップレットをデータから排除したり、マルチプレックスＰＣＲ後に変異の種類ごとにドロップレットの数をカウントしたりするための閾値を、実験者が設定していた。しかし、ドロップレットの蛍光強度のばらつきが大きくなると、閾値の設定が難しくなり、測定精度を低下させる要因となる。

本発明の一実施態様では、上述したように、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度Ｔｍを算出する工程を含む。これによって、図１に示すように、緑色の蛍光強度、黄色の蛍光強度およびＴｍの３軸でドロップレットの計測結果をプロットすることができるようになり、ドロップレットの集団１０１〜１０４を分離することができる。

また、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットを測定装置により確実に識別することができ、解析対象データを補正することにより、測定再現性および測定精度を向上させることができる。

（２）ＤＮＡ検出装置
本発明のＤＮＡ検出装置は、オイル中のドロップレットを加温するための加温部と、オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、ドロップレットの昇温に伴う蛍光強度の変化から蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部とを備える。図３に、ドロップレットが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の例を示す。

図３Ａに示す蛍光測定部の例では、マイクロ流路を用いてドロップレットの蛍光強度を測定する。ドロップレット３０１がマイクロ流路３０３中を矢印の方向に流れている。ドロップレット３０２の位置までドロップレットが流れると、加温部（図示せず）によってドロップレットが加温されつつ、光源３０４により励起光がドロップレットに照射される。光源３０４によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光を蛍光フィルター３０５を通してフォトマルチプルメーター３０６で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度が算出される。光源３０４、蛍光フィルター３０５、フォトマルチプルメーター３０６で構成される蛍光検出器は、蛍光色素の色ごとに別々に設けてもよいし、図３Ａに示すように１つの光源の励起光で励起して２つの蛍光フィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する構成にしてもよい。

また、図３ＢおよびＣのようにドロップレットを平面配置し、ドロップレットの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ドロップレット３１１をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置し、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でドロップレット検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うドロップレットの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置したドロップレット３１１に照射する。励起光によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の
融解温度が算出される。図３Ａでは、ドロップレットを一つずつ処理する必要があるが、多数のドロップレットを一度に処理できるという点で、図３ＢおよびＣの装置が好ましい。また、図３ＢおよびＣの装置では、温調装置３１２をＤＮＡの増幅反応にも用いることができる点でも、図３Ａより好適である。

（３）融解温度を算出する方法
図４は、図２Ｄで述べたのと同様に、検出した蛍光強度が重なってしまい、ドロップレットに含まれる遺伝子が同定できない測定結果を示す模式図の一例である。図５および図６は、図４で同定できなかった対象遺伝子に対し、ドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定した結果を示す模式図の一例である。

図４に示すように、変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲの場合、対象遺伝子の変異型Ａ４０２と変異型Ｂ４０３はどちらも緑色の蛍光標識プローブで検出しているため、ドロップレットａ４０５の蛍光強度が観察されればドロップレットが含む対象遺伝子は変異型Ｂであると分かるが、ドロップレットｂ４０６およびドロップレットｃ４０７の蛍光強度が観察されたときはドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａ４０２、変異型Ｂ４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができない。

そこで、図５に示すように、ＤＮＡインターカレーターを用いてドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定することによって、図４で同定できなかった対象遺伝子を同定することができる。具体的な方法は、まず、ＤＮＡインターカレーター５０２をＰＣＲ反応液に添加してドロップレットを作製し、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うと、室温程度の温度ではドロップレット内で増幅した２本鎖ＤＮＡ５０１にＤＮＡインターカレーター５０２が結合し、強い蛍光を発する。その後、ドロップレットの温度が上昇するにつれ、ドロップレット内の２本鎖ＤＮＡ５０１が解離して１本鎖ＤＮＡ５０１となり、ＤＮＡインターカレーター５０２が結合しなくなるため、蛍光強度が減少する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図５に示す。なお、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、ドロップレットを昇温させることによって行ってもよい。

図５では、ドロップレットａ４０５の測定結果が図５Ａ、ドロップレットｂ４０６の測定結果が図５Ｂ、ドロップレットｃ４０７の測定結果が図５Ｃに示されている。さらに、図５Ａ〜Ｃの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図５Ｄ〜Ｆのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これがＤＮＡ二重鎖の融解温度Ｔｍとして算出できる。図４では、ドロップレットｂ４０６とドロップレットｃ４０７はドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａのドロップレットの集団４０２、変異型Ｂのドロップレットの集団４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができなかったが、図５Ｄ、Ｅではドロップレットａ４０５とドロップレットｂ４０６のＴｍが同じであるためドロップレットｂ４０６は変異型Ｂであり、図５Ｄ、Ｆではドロップレットａ４０５とドロップレットｃ４０７のＴｍは異なるためドロップレットｃ４０７は変異型Ａであると判断できる。さらに、対象遺伝子に変異型Ａや変異型Ｂ以外の想定されていない変異が生じていた場合、測定したドロップレットのＴｍが野生型のドロップレット４０１、変異体Ａのドロップレット４０２、変異体Ｂのドロップレット４０３とも異なる値として検出することができるため、想定している変異だけでなく、想定していない変異も一度の測定で検出できる。

なお、対象遺伝子のＴｍは、プライマーの設計を変えることでＰＣＲ増幅産物の配列や配列の鎖長に依存して制御することができる。

ここで用いるＤＮＡインターカレーターは、２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、２本鎖ＤＮＡの検出に用いることのできるインターカレーターであれば適用できる。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＩやＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標） Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ（登録商標）−１、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＪＯＪＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＹＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＴＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＪＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＰＯ−Ｐｒｏ−３、ＹＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−５、エチジウムブロマイドなどが適用可能である。ＤＮＡインターカレーターが熱耐性である場合、ＰＣＲ反応を行う前からドロップレットに添加しておくことができる。

本方法で、ＤＮＡインターカレーターの代わりとして、蛍光標識プローブを用いることもできる。蛍光標識プローブは、両端またはその近傍に蛍光色素とそのクエンチャーを有し、両端周辺の配列が相補的になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する一方、ループ部分の配列がテンプレートＤＮＡと相補的になっており、テンプレートＤＮＡにハイブリダイズできるような構造を有するように設計する。蛍光標識プローブ６０２は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が近接しているため、蛍光は発しない。蛍光標識プローブ６０２をＰＣＲ反応が終了したドロップレットに添加すると、室温程度の温度ではドロップレット内で増幅したＤＮＡ６０１に蛍光標識プローブ６０２のループ部分がアニールし、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が離れるため、蛍光標識プローブ６０２は強い蛍光を発する。その後、ドロップレットを加熱すると、ＤＮＡ６０１と蛍光標識プローブ６０２が解離し、蛍光標識プローブ６０２内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ６０２からの蛍光強度が低下する。さらにドロップレットを加熱すると、蛍光標識プローブ６０２のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図６に示す。なお、この蛍光標識プローブは、ＰＣＲのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、ＰＣＲのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、ドロップレットを昇温させることによって行ってもよい。

図６では、ドロップレットａ４０５の測定結果が図６Ａ、ドロップレットｂ４０６の測定結果が図６Ｂ、ドロップレットｃ４０７の測定結果が図６Ｃのようになる。さらに、図６Ａ〜Ｃの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図６Ｄ〜Ｆのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これが対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度Ｔｍとなる。図４では、ドロップレットｂ４０６とドロップレットｃ４０７はドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａのドロップレットの集団４０２、変異型Ｂのドロップレットの集団４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができなかったが、図６Ｄ、Ｅでは、ドロップレットａ４０５とドロップレットｂ４０６のＴｍが同じであるためドロップレットｂ４０６は変異型Ｂであり、図６Ｄ、Ｆではドロップレットａ４０５とドロップレットｃ４０７のＴｍは異なるためドロップレットｃ４０７は変異型Ａであると判断できる。さらに、対象遺伝子に変異型Ａや変異型Ｂ以外の想定されていない変異が生じていた場合、測定したドロップレットのＴｍが野生型のドロップレット４０１、変異体Ａのドロップレット４０２、変異体Ｂのドロップレット４０３とも異なる値として検出することができるため、想定している変異を判断するというだけでなく、想定していない変異も一度の測定結果から検出できる。

なお、対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブのＴｍは、配列や配列の鎖長を変
えることで制御することができる。また、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）のような人工ＤＮＡを利用することで、Ｔｍを制御することができる。

ここで用いる蛍光標識プローブ６０２の蛍光色素６０３とクエンチャー６０４の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されず、蛍光色素６０３がＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー６０４がＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが例示できる。

蛍光標識プローブ６０２が認識する配列は、検出対象の遺伝子と同じ遺伝子上にあっても、異なる遺伝子上にあってもよく、検出対象の遺伝子と１塩基だけ異なる配列を有する遺伝子、例えば同じ遺伝子の野生型と変異型であってもよい。一例として、肺がんの遺伝子検査を行う場合であれば、分子標的薬の効果を予測するため、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を判定する。その時、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の各々を認識する配列であってもよいし、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異型とその野生型を認識する配列であってもよい。

（４）ＤＮＡ検出装置の他の構成
本発明の一実施態様にかかるＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部、及び／又はドロップレットに対してＤＮＡを増幅するための増幅部を含んでもよい。

図７は、本発明の方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジの一例を示す図である。図７Ａに示すように、ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１はドロップレット作製部７０１、増幅部としてのサーマルサイクラー７０２、ドロップレット検出部７０３、モニター７０４、制御部７２４から構成される。ドロップレット作製部７０１は、図７Ｂに示すドロップレット作製用カートリッジ７０５をセットして用いる。ドロップレット作製用カートリッジ７０５は、オイル供給口７１５、ＰＣＲ反応液導入口７１６、ドロップレット排出口７１７をもつ。ドロップレット検出部７０３は、図７Ｃに示すドロップレット検出用カートリッジ７０７を温調装置７２２の上にセットして用いる。ドロップレット検出用カートリッジ７０７は、オイル供給口７１８、ドロップレット導入口７１９、液溜７２３、廃液排出口７２０をもつ。ドロップレット作製用カートリッジのオイル供給口７１５はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０９によってオイル７１３が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのＰＣＲ反応液導入口７１６はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０８によって窒素ガスや空気などのガスまたはオイル７１２が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのドロップレット排出口７１７はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のオイル供給口７１８はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１０によってオイル７１３が供給される。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のドロップレット導入口７１９はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７の廃液排出口７２０は、ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１１によって廃液溜め７１４にドロップレット検出用カートリッジ７０７内の廃液が排出される。ポンプは、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。モニター７０４は、測定結果やメッセージを表示するための表示部であり、ユーザーが操作を入力する入力部でもある。

（５）Ｔｍ測定方法
図７の装置とカートリッジ、及びＤＮＡインターカレーターを用いてＴｍ測定を行う方法の一例を、図８のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、ＤＮＡを含む生体試料由来の検体を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブ、ＤＮＡインターカレーター、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ８０１）。蛍光標識プローブはＤＮＡポリメラーゼにより加水分解されて蛍光を発するＴａｑＭａｎプローブを用いる。このＰＣＲ反応液をドロップレット作製用カートリッジ７０５のＰＣＲ反応液導入口７１６に添加する（Ｓ８０２）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５をドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１のドロップレット作製部７０１にセットする。オイル供給口７１５からオイル７１３を、ＰＣＲ反応液導入口７１６からオイル７１２を添加する（Ｓ８０３）と、ドロップレット作製用カートリッジ７０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口７１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ７０６に移動し、チューブ内に貯蔵される（Ｓ８０４）。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ７０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ８０５）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、ＤＮＡが増幅するとともに、伸長工程で蛍光標識プローブが分解されて、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、温度を室温へと下げると合成したＤＮＡは２本鎖を形成し、ＤＮＡインターカレーターがこの２本鎖ＤＮＡにインターカレートし、蛍光を発する。ＰＣＲ後、ドロップレット検出部７０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口７１９からドロップレットを、オイル供給口７１８からオイル７１３を添加する（Ｓ８０６）。ドロップレット検出部７０３において、ドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ８０７）。温調装置７２２によりドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３を４０℃から９５℃まで昇温し、ＤＮＡインターカレーターの蛍光強度を測定する（Ｓ８０８）。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで、昇温によるＤＮＡインターカレーターの蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点がＴｍとして算出される（Ｓ８０９）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以下および／またはＴｍが所定の範囲外のドロップレットを、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと判定する（Ｓ８１０）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上およびＴｍが所定の範囲内のドロップレットをカウントする（Ｓ８１１）。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数をモニターに表示する（Ｓ８１２）。なお、所定の蛍光強度の閾値およびＴｍの所定の範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。

用いる検体は特に限定されないが、検出対象のＤＮＡを含む試料であればよく、動植物の体液や組織、細胞、排泄物などの生体試料や、土壌サンプルなど真菌や細菌などが含まれる試料が例示できる。体液としては血液、唾液、髄液などが例示でき、血液中には存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）や血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が含まれる。組織としては、外科手術や生検法によって得られた疾患の患部（例えば、乳房や肝臓などのがん組織）が例示できる。すでに固定された組織でもよく、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（ＦＦＰＥ）でもよい。細胞としては、生検法によって採取した患部またはその付近の細胞や、血液中を循環する血中循環腫瘍細胞などが例示できる。これらの検体の前処理は特に限定されず、生体や環境などから採取後、懸濁液に添加してホモジネートしたり、あるいは溶解液で溶解させたりしたものをそのまま用いてもよいが、それらに含まれる核酸を抽出したり、精製したものを用いることが好ましい。

オイルはドロップレットを構成するＰＣＲ反応液に不溶性もしくは難溶性である化学的
に不活性な物質であり、また、ＰＣＲのような高温での温度変化に対して安定である物質が好ましく、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイルなどが使用可能である。フッ素系オイルとしては、例えばＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎやＨｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｒなどが挙げられる。フッ素系オイルは、炭素鎖が長いほうが揮発性が低いので好ましい。また、フッ素系オイルは比重が１．７超であり、ＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重１に比べて重いため、作製したドロップレットはオイルに浮く。シリコーン系オイルとしては、例えばＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅやＴｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙｓｉｌｉｃａｔｅなどが挙げられる。シリコーン系オイルはフッ素系オイルと異なり、比重が０．９８程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重に近く、作製したドロップレットはオイル中に均一に分散する。炭化水素系オイルとしては、例えばミネラルオイルや流動パラフィン、ヘキサデカンなどが挙げられる。炭化水素系オイルは比重が０．８４程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重よりも軽いため、作製したドロップレットはオイルに沈む。

このオイルは、界面活性剤を添加して用いてもよい。ここで界面活性剤の種類は特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などが適用可能である。

次に、ＤＮＡインターカレーターの代わりに、モレキュラービーコンのような蛍光標識プローブを用いてＴｍ測定を行う方法の一例を、図９に示すフローチャートを参考にしながら説明する。ＤＮＡを含む生体試料由来の検体をＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブ、デオキシリボヌクレオチド類、ｐＨ緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ９０１）。蛍光標識プローブには、例えば、遊離状態で存在するときは、ステムループ構造を形成し、テンプレートＤＮＡにアニールして蛍光色素とクエンチャーが離れて蛍光を発するモレキュラービーコンを用いることができる。ドロップレット作製用カートリッジ７０５のＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液導入口７１６に添加する（Ｓ９０２）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５をドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置７２１のドロップレット作製部７０１にセットする。オイル供給口７１５からオイル７１３を、ＰＣＲ反応液導入口７１６からオイル７１２を添加する（Ｓ９０３）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口７１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ７０６に移動し、貯蔵される（Ｓ９０４）。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ７０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ９０５）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、伸長工程においてＤＮＡが増幅するとともに、蛍光標識プローブが多くＤＮＡにアニールして蛍光色素とクエンチャーが離れ、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、ドロップレット検出部７０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口７１９からドロップレットを、オイル供給口７１８からオイル７１３を添加する（Ｓ９０６）。ドロップレット検出部７０３において、ドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ９０７）。温調装置７２２によりドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３を４０℃から９５℃まで昇温し、蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ９０８）。測定された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで、昇温による蛍光標識プローブの蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点がＴｍとして算出される（Ｓ９０９）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以下および／またはＴｍが所定の範囲外であるドロップレットを、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと判定する（Ｓ９１０）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上およびＴｍが所定の範囲内のドロップレットをカウントする（Ｓ９１１）。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数を
モニターに表示する（Ｓ９１２）。なお、蛍光強度の所定の閾値および所定のＴｍの範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。

図１０および図１１は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図１０に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされたドロップレットの数が表示されてもよいし、図１１に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされたドロップレットの割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図１０や図１１のようなドロップレットの数や割合だけでなく、図１下のような緑色の蛍光強度、黄色の蛍光強度およびＴｍの３軸でドロップレットの計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、蛍光標識プローブの蛍光強度またはＴｍに対するドロップレットの数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度の閾値および／またはＴｍの範囲の設定を変えて、蛍光強度の閾値内及びＴｍの範囲内にあるドロップレットの数を再度カウントすることもできる。

（３）プログラム
本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。

本実施例では、ＤＮＡインターカレーターを用いて、ドロップレット内のＤＮＡのＴｍを測定した結果を示す。

まず、鎖長が１６、２３、７８ｂｐの二本鎖ＤＮＡを用意した。次に、二本鎖ＤＮＡの最終濃度が０．２μＭ、０．４μＭ、０．８μＭになるように、バッファーと混合した。バッファーは、塩化カリウムや塩化マグネシウムなどの塩、及びＤＮＡインターカレーターとして、ＥｖａＧｒｅｅｎを含むように調整した。

この反応液と界面活性剤を含むフッ素系オイルを用いて、マイクロ流路により直径２０μｍのドロップレットを作製した。高さ０．１ｍｍ、幅１ｍｍの平板キャピラリーの中に作製したドロップレットを封入した。温調ステージの上に平板キャピラリーを置き、顕微鏡下で昇温したときの単一のドロップレットの蛍光強度変化を観察した。

図１２Ａは、２３ｂｐの二本鎖ＤＮＡとＥｖａＧｒｅｅｎを含むドロップレットの昇温に伴う蛍光強度変化をグラフにした結果である。昇温に伴い、ドロップレットの蛍光強度は減少した。図１２Ｂは、図１２Ａの結果をもとに、横軸に温度、縦軸に蛍光強度の一次微分の負の値をプロットしたものであり、極大値をＴｍ値とする。表１に、鎖長および濃度の異なる二本鎖ＤＮＡを含むドロップレットのＴｍ測定結果とバルクでのＴｍ測定結果をまとめた。

表１より明らかであるが、ドロップレットのＴｍ測定結果とバルクでのＴｍ測定結果はよく一致しており、ＤＮＡの鎖長が長くなるにしたがってＴｍ値は高くなり、Ｔｍ値はＤＮＡ濃度が異なってもほぼ変わらない。

このように、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットであっても、Ｔｍ測定によりドロップレット内のＤＮＡの種類が同定できる。従って、蛍光標識プローブの色と蛍光強度に加え、ＰＣＲ増幅産物のＴｍを測定することで、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットを測定装置により見分け、その結果によって解析対象データを補正することにより、測定再現性および測定精度の向上を図ることができる。

１０１ 野生型の遺伝子を含むドロップレット
１０２ 変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット
１０３ 変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット
１０４ 空のドロップレット
２０１ 野生型の遺伝子を含むドロップレット
２０２ 変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット
２０３ 変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット
２０４ 空のドロップレット
３０１ 対象遺伝子を含むドロップレット
３０２ 対象遺伝子を含まないドロップレット
３０３ マイクロ流路
３０４ 光源
３０５ フィルター
３０６ フォトマルチプルメーター
３０７ ＣＣＤ
３０８ レンズ
３０９ ダイクロイックミラー
３１０ ドロップレット検出用カートリッジ
３１１ ドロップレット
３１２ 温調装置
４０１ 野生型の遺伝子を含むドロップレット
４０２ 変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット
４０３ 変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット
４０４ 空のドロップレット
４０５ ドロップレットａ
４０６ ドロップレットｂ
４０７ ドロップレットｃ
５０１ ＤＮＡ
５０２ ＤＮＡインターカレーター
５０３ Ｔｍ
６０１ ＤＮＡ
６０２ 蛍光標識プローブ
６０３ 蛍光色素
６０４ クエンチャー
６０５ Ｔｍ
７０１ ドロップレット作製部
７０２ サーマルサイクラー
７０３ ドロップレット検出部
７０４ モニター
７０５ ドロップレット作製用カートリッジ
７０６ マイクロチューブ
７０７ ドロップレット検出用カートリッジ
７０８〜７１１ ポンプ
７１２ オイル
７１３ オイル
７１４ 廃液溜め
７１５ オイル供給口
７１６ ＰＣＲ反応液導入口
７１７ ドロップレット排出口
７１８ オイル供給口
７１９ ドロップレット導入口
７２０ 廃液排出口
７２１ ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置
７２２ 温調装置
７２３ 液溜
７２４ 制御部

Claims (12)

1. オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットは前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含有し、
   前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、
   前記ドロップレット内で前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、
   第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する第３の工程と、
   を含むＤＮＡ判定方法。
2. 第１の工程で増幅産物が検出できず、かつ第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定される、請求項１に記載のＤＮＡ判定方法。
3. オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットはＤＮＡインターカレーターを含有し、
   前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、
   前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、
   前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、
   第３の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する第４の工程と、
   を含むＤＮＡ判定方法。
4. 第１の工程で増幅産物が検出できず、かつ第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する工程をさらに含む、請求項３に記載のＤＮＡ判定方法。
5. 第１の工程で増幅産物が検出でき、かつ前記融解温度が所定の範囲内であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有していたと判定する、請求項１〜４のいずれかに１項に記載のＤＮＡ判定方法。
6. 前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有し、
   前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光色素の蛍光強度の変化に基づいて、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度が測定される、請求項１または２に記載のＤＮＡ判定方法。
7. 複数の前記ドロップレットが平面配置されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ判定方法。
8. 前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ判定方法。
9. ＤＮＡ検出装置に、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ判定方法を行わせるためのプログラム。
10. 前記ＤＮＡ検出装置は、
    前記オイル中の前記ドロップレットを加温するための加温部と、
    前記オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、
    前記ドロップレットの昇温に伴う前記蛍光強度の変化から前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度または前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部と、
    を備える、請求項９に記載のプログラム。
11. 前記ＤＮＡ検出装置が、前記オイル中のドロップレット内のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備える、請求項９に記載のプログラム。
12. 前記ＤＮＡ検出装置が、前記ドロップレット内のＤＮＡの有無を表示するモニターを備える、請求項９に記載のプログラム。