WO2018128013A1 - Ｐｃｒの測定方法および測定装置 - Google Patents

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WO2018128013A1
WO2018128013A1 PCT/JP2017/041290 JP2017041290W WO2018128013A1 WO 2018128013 A1 WO2018128013 A1 WO 2018128013A1 JP 2017041290 W JP2017041290 W JP 2017041290W WO 2018128013 A1 WO2018128013 A1 WO 2018128013A1
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dna
droplet
oil
fluorescently labeled
labeled probe
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PCT/JP2017/041290
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淳子 田中
崇秀 横井
釜堀　政男
小原　賢信
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株式会社日立製作所
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a PCR measurement method and measurement apparatus.
  • PCR is a semi-quantitative analysis method that detects the amplified target gene at the end point by agarose electrophoresis, whereas real-time PCR is an exponential function of the target gene using a fluorescently labeled probe or a DNA intercalator. It is a quantitative analysis technique that detects the process of amplification in real time.
  • Droplet digital PCR (registered trademark) (special table 2013-521864) is subjected to absolute quantification using a limiting dilution sample, so that measurement reproducibility decreases when the amount of target gene in the conventional genetic test is very small. It was developed as a method to solve the problem.
  • the experimental procedure for droplet digital PCR is as follows. First, a DNA polymerase necessary for PCR, a primer, and a fluorescently labeled probe are added to the limit diluted sample, and a PCR reaction liquid droplet is prepared in oil. The produced droplet contains one or zero target genes in one droplet. Next, the target gene in the droplet is amplified by PCR.
  • the fluorescence intensity of each droplet is measured after PCR, and the target gene is quantified by counting the number of droplets having a fluorescence intensity exceeding a threshold value.
  • the influence of the sample-derived component which is a PCR inhibition factor, can be suppressed by using the limit-diluted sample.
  • absolute quantification is possible.
  • the reaction efficiency of one cycle when the reaction efficiency of one cycle is double, 1.1 ⁇ 10 12 molecules when the reaction efficiency of one cycle is 1.5 times, 1.1 ⁇ 10 7 molecules when the reaction efficiency of one cycle is 1.4 times, and when the reaction efficiency of one cycle is 1.4 times Amplifies to 0.7 ⁇ 10 6 molecules.
  • the droplet size is 4 pL and 1 ⁇ M primer is included, the number of primer molecules is 2.4 ⁇ 10 6 molecules, and the number of PCR amplification products is 1 ⁇ if the reaction efficiency of one cycle is 1.5 times or more. Is limited by the primer concentration.
  • the reaction efficiency of one cycle when the reaction efficiency of one cycle is 1.4 times or less, the number of molecules of the PCR amplification product varies greatly depending on the reaction efficiency of one cycle. Therefore, unless the reaction efficiencies of the droplets are equalized, variation in the fluorescence intensity of the droplets increases.
  • An object of the present invention is to provide a new PCR measuring method and measuring apparatus using droplets.
  • the present inventors have found that measurement reproducibility and measurement accuracy can be improved by measuring the melting temperature (Tm) of the PCR amplification product in addition to the color and fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe. Completed.
  • One embodiment of the present invention is a DNA detection method for detecting the DNA in a droplet that is in oil and contains DNA and a fluorescently labeled probe that hybridizes to the DNA, wherein the droplet
  • a DNA detection method comprising: a first step of amplifying the DNA by a nucleic acid amplification reaction; and a second step of measuring a melting temperature of the fluorescently labeled probe and the DNA in the droplet. It is.
  • the fluorescently labeled probe has a fluorescent dye and its quencher, and the melting temperature of the fluorescently labeled probe and the DNA is measured based on a change in fluorescence intensity of the fluorescent dye as the droplet is heated. May be.
  • Another embodiment according to the present invention is a DNA detection method for detecting the DNA in a droplet which is in oil and contains DNA and a DNA intercalator, wherein the nucleic acid is amplified in the droplet.
  • the first step of amplifying the DNA the second step of measuring the fluorescence intensity emitted from the DNA intercalator when the droplet is heated, and the temperature increase of the droplet
  • a plurality of the droplets may be arranged in a plane.
  • the oil may contain fluorine oil, silicone oil, or hydrocarbon oil.
  • a further embodiment according to the present invention is a DNA determination method for determining the presence or absence of specific DNA in a droplet in oil, wherein the droplet contains a fluorescently labeled probe that hybridizes to the DNA.
  • the DNA determination method it is determined that the DNA is not contained in the droplet when an amplification product cannot be detected and / or when the melting temperature is out of a predetermined range in the second step.
  • a further embodiment according to the present invention is a DNA determination method for determining the presence or absence of specific DNA in a droplet in oil, wherein the droplet contains a DNA intercalator, A first step of performing a nucleic acid amplification reaction; a second step of measuring fluorescence intensity emitted from the DNA intercalator when the droplet is heated; and the fluorescence intensity associated with the temperature increase of the droplet And a third step of calculating a melting temperature of the double strand of the DNA based on the change in the case where an amplification product cannot be detected in the first step and / or the melting temperature in the third step A DNA determination method for determining that the DNA is not contained in the droplet when it is outside a predetermined range.
  • the amplification product when the amplification product can be detected and the melting temperature is within a predetermined range, it may be determined that the DNA is contained in the droplet.
  • a further embodiment according to the present invention is a DNA detection device for detecting DNA in droplets in oil, a heating unit for heating the droplets in the oil, and in the oil
  • a fluorescence measuring unit for measuring the fluorescence intensity from the fluorescently labeled probe or DNA intercalator, and the melting temperature of the fluorescently labeled probe and the DNA or the DNA from the change in the fluorescence intensity accompanying the temperature rise of the droplet
  • a calculation unit for calculating the melting temperature of the double strands.
  • You may further provide the amplification part for amplifying DNA in the droplet in the said oil.
  • You may provide the monitor which displays the presence or absence of DNA in the said droplet.
  • a further embodiment according to the present invention is a program for causing a DNA detection apparatus to perform any one of the above DNA detection methods or any of the above DNA determination methods.
  • This DNA detection device may be the DNA detection device described above.
  • a DNA detection method according to the present invention is in a droplet, which is in oil and contains DNA and a fluorescently labeled probe that hybridizes to the DNA.
  • FIG. 1 shows an example of measurement results assumed in a typical embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows an example of measurement results in the conventional droplet digital PCR multiplex.
  • multiplex PCR in which a plurality of types of mutations are detected at one time by changing the color and amount of a fluorescently labeled probe for each DNA mutation may be performed.
  • the example of FIG. 2A uses a yellow fluorescently labeled probe for the wild type allele of the target gene and a green fluorescently labeled probe for the mutant allele of the target gene. It is the figure which showed typically the result at the time of using it so that the quantity of the fluorescent label probe of B may be set to 3: 5.
  • the fluorescently labeled probe is complementary to the sequence located between the primer pair used for PCR, and is configured such that when the primer is extended, the probe is degraded and the fluorescent label emits fluorescence. It shall be.
  • a TaqMan (registered trademark) probe can be exemplified.
  • the yellow fluorescently labeled probe corresponding to the wild type allele of the target gene is amplified and decomposed during PCR to emit yellow fluorescence.
  • a green fluorescently labeled probe corresponding to the mutant A allele of the target gene is amplified and decomposed during PCR to emit green fluorescence.
  • the green fluorescently labeled probe corresponding to the mutant B of the target gene is amplified and decomposed during PCR to emit green fluorescence.
  • the fluorescence intensity of the droplet containing the mutant A allele and the green fluorescence intensity of the droplet containing the mutant B allele are 3: 5 in proportion to the amount of the fluorescently labeled probe added to the droplet. Neither green nor yellow fluorescence is detected in the empty droplet 204 that does not include the target gene.
  • the fluorescence intensity distribution of the droplets may be widened, and the fluorescence intensity distribution may be broadened. If it becomes too large, the distribution of the variant A droplet 202 and the variant B droplet 203 may overlap as shown in FIG. 2D.
  • a sample is subjected to limiting dilution so that one or zero target genes are contained in one droplet, and thus a droplet is prepared.
  • 90% are empty droplets 204 that do not contain the target gene.
  • some fluorescently labeled probes may be decomposed by the components derived from the specimen, and the fluorescent dye and its quencher may be cleaved to emit fluorescence. Eliminate such empty droplets.
  • the color and intensity of fluorescent dyes are used after PCR to realize multiplex PCR in which multiple types of mutations are detected in one measurement by changing the color and amount of the fluorescently labeled probe for each mutation.
  • a threshold is set from the above, and the number of droplets 201, 202, 203 including the target gene is counted.
  • the method includes a step of calculating the melting temperature of the fluorescently labeled probe and the DNA or the melting temperature Tm of the DNA double strand.
  • the measurement results of the droplets can be plotted on three axes of green fluorescence intensity, yellow fluorescence intensity, and Tm, and the droplet populations 101 to 104 are separated. be able to.
  • empty droplets that do not contain the target gene and droplets with insufficient PCR reaction efficiency can be reliably identified by the measurement device, and the measurement reproducibility and measurement accuracy can be improved by correcting the analysis target data. Can be improved.
  • the DNA detection apparatus of the present invention comprises a heating unit for heating droplets in oil and fluorescence for measuring fluorescence intensity from a fluorescently labeled probe or DNA intercalator in oil.
  • FIG. 3 shows an example of a fluorescence measuring unit for measuring the color and fluorescence intensity of the fluorescent dye contained in the droplet.
  • the fluorescence intensity of the droplet is measured using a microchannel.
  • the droplet 301 flows in the direction of the arrow through the microchannel 303.
  • the droplet is heated by a heating unit (not shown), and excitation light is irradiated to the droplet by the light source 304.
  • the fluorescent material contained in the droplet is excited by the light source 304, and the emitted fluorescence is detected by the photo multiple meter 306 through the fluorescent filter 305.
  • the detected fluorescence data is sent to a calculation unit (not shown), where the melting temperature of the fluorescently labeled probe and the DNA or the melting temperature of the DNA duplex is calculated.
  • the fluorescence detector composed of the light source 304, the fluorescence filter 305, and the photo multiple meter 306 may be provided separately for each color of the fluorescent dye, or excited with the excitation light of one light source as shown in FIG. 3A. You may make it the structure which detects each fluorescence simultaneously with two fluorescence filters.
  • the droplets may be arranged in a plane as shown in FIGS. 3B and 3C, and the color and fluorescence intensity of the fluorescent dye of the droplets may be measured.
  • the droplet 311 is arranged in a plane on the droplet detection cartridge 310 and set on the temperature adjustment stage 312 which is a heating unit.
  • the temperature of the droplet detection cartridge is changed by the temperature adjustment device 312 and the fluorescence intensity of the droplet accompanying the temperature change is measured by the following procedure.
  • the excitation light is irradiated from the light source 304 through the lens 308, the filter 305, and the dichroic mirror 309 to the droplet 311 that is arranged in a plane on the droplet detection cartridge 310.
  • the fluorescent material contained in the droplet is excited by the excitation light, and the emitted fluorescence is detected by the CCD camera 307 through the dichroic mirror 309, the filter 305, and the lens 308.
  • the detected fluorescence data is sent to a calculation unit (not shown), where the melting temperature of the amplification product is calculated.
  • a calculation unit not shown
  • FIG. 3A it is necessary to process the droplets one by one, but the apparatus of FIGS. 3B and 3C is preferred in that many droplets can be processed at once.
  • 3B and 3C is also preferable to FIG. 3A in that the temperature adjustment device 312 can be used for DNA amplification reaction.
  • FIG. 4 is an example of a schematic diagram showing measurement results in which the detected fluorescence intensities overlap and the genes contained in the droplet cannot be identified, as described in FIG. 2D. is there.
  • FIG. 5 and FIG. 6 are examples of schematic diagrams showing the results of measuring the Tm of DNA amplified in a droplet for a target gene that could not be identified in FIG.
  • the target gene contained in the droplet is known to be mutant B if the fluorescence intensity of the droplet a405 is observed, but the fluorescence intensity of the droplet b406 and the droplet c407 Is observed, it cannot be determined from the measurement result whether the target gene contained in the droplet is the mutant A402 or the mutant B403.
  • a target gene that could not be identified in FIG. 4 can be identified by measuring the Tm of the DNA amplified in the droplet using a DNA intercalator.
  • a DNA intercalator 502 is added to a PCR reaction solution to produce a droplet.
  • a nucleic acid amplification reaction such as PCR is performed, the double strand amplified in the droplet at a temperature of about room temperature.
  • the DNA intercalator 502 binds to the DNA 501 and emits strong fluorescence.
  • FIG. 5 shows an example of the result when the fluorescence intensity change with respect to the temperature change is plotted on the graph.
  • the measurement of the fluorescence intensity change with respect to the temperature change may be performed by raising the temperature of the droplet independently of the nucleic acid amplification reaction (for example, after completion of the nucleic acid amplification reaction).
  • the measurement result of the droplet a405 is shown in FIG. 5A
  • the measurement result of the droplet b406 is shown in FIG. 5B
  • the measurement result of the droplet c407 is shown in FIG. 5C.
  • the temperatures become the inflection points of the fluorescence intensity changes as shown in FIGS. 5D to F, respectively, and this is calculated as the melting temperature Tm of the DNA duplex. it can.
  • Tm melting temperature
  • the droplets a405 and b406 have the same Tm, so the droplet b406 is a variant B.
  • the droplets a405 and c407 have Tm Since it is different, it can be judged that the droplet c407 is the mutant A.
  • the measured droplet Tm is the wild type droplet 401, the mutant A droplet 402, and the mutant B. Therefore, not only the assumed mutation but also the unexpected mutation can be detected by one measurement.
  • the Tm of the target gene can be controlled depending on the sequence of the PCR amplification product and the chain length of the sequence by changing the primer design.
  • the DNA intercalator used here is applicable to any intercalator that can be used for detection of double-stranded DNA because the fluorescence intensity increases by binding to double-stranded DNA.
  • SYBR registered trademark
  • Green I Green I
  • SYBR Gold PicoGreen
  • SYTO registered trademark
  • Blue SYTO Green
  • SYTO Orange SYTO Red
  • POPO registered trademark
  • BOBO registered trademark
  • YOYO registered trademark
  • TOTO registered trademark
  • JOJO registered trademark
  • POPO-3 LEO
  • LOLO registered trademark
  • BOBO-3 YOYO-3
  • TOTO- 3 PO-Pro (registered trademark) -1, YO-Pro (registered trademark) -1, TO-Pro (registered trademark) -1, JO-Pro (registered trademark) -1, PO-Pro-3, YO- Pro-3, TO-
  • a fluorescently labeled probe can be used in place of the DNA intercalator.
  • a fluorescently labeled probe has a fluorescent dye and its quencher at or near both ends, the sequences around both ends are complementary, and forms a stem loop structure like a molecular beacon, while the sequence of the loop portion is It is designed to have a structure that is complementary to the template DNA and can be hybridized to the template DNA.
  • the fluorescently labeled probe 602 exists alone and forms a stem loop, the fluorescent dye 603 and the quencher 604 are close to each other, so that no fluorescence is emitted.
  • the loop portion of the fluorescently labeled probe 602 anneals to the DNA 601 amplified in the droplet at a temperature of about room temperature, and the fluorescent dye 603 and the quencher 604 are separated.
  • the fluorescently labeled probe 602 emits strong fluorescence. Thereafter, when the droplet is heated, the DNA 601 and the fluorescently labeled probe 602 are dissociated, and a stem loop is formed in the fluorescently labeled probe 602, so that the fluorescence intensity from the fluorescently labeled probe 602 decreases.
  • FIG. 6 shows an example of the result when the fluorescence intensity change with respect to the temperature change is plotted on the graph.
  • This fluorescently labeled probe may be shared with a fluorescently labeled probe for PCR, but a probe different from the fluorescently labeled probe for PCR may be prepared and used.
  • the measurement of the fluorescence intensity change with respect to the temperature change may be performed in the nucleic acid amplification reaction, and is performed by raising the temperature of the droplet independently of the nucleic acid amplification reaction (for example, after completion of the nucleic acid amplification reaction). Also good.
  • the measurement result of the droplet a405 is as shown in FIG. 6A
  • the measurement result of the droplet b406 is as shown in FIG. 6B
  • the measurement result of the droplet c407 is as shown in FIG. 6C.
  • the fluorescence intensity change in FIGS. 6A to 6C is differentiated by the temperature change, it becomes as shown in FIGS. 6D to F, respectively, and the temperature that becomes the inflection point of the fluorescence intensity change is obtained.
  • the melting temperature Tm of DNA In FIG. 4, for the droplets b406 and c407, it is determined from the measurement results whether the target gene contained in the droplets is the variant A droplet population 402 or the variant B droplet population 403.
  • FIGS. 4 for the droplets b406 and c407, it is determined from the measurement results whether the target gene contained in the droplets is the variant A droplet population 402 or the variant B droplet population 403.
  • the droplet b406 is a variant B.
  • the Tm of the droplet a405 and the droplet c407 is used. Therefore, it can be determined that the droplet c407 is mutant A.
  • the measured droplet Tm is the wild type droplet 401, the mutant A droplet 402, and the mutant B. Since it can be detected as a different value from the droplet 403, not only the assumed mutation is judged but also the unexpected mutation can be detected from a single measurement result.
  • Tm of the fluorescently labeled probe for detecting the target gene can be controlled by changing the sequence and the chain length of the sequence.
  • Tm can be controlled by using artificial DNA such as Peptide Nucleic Acid (PNA) or Locked Nucleic Acid (LNA).
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the combination of the fluorescent dye 603 and the quencher 604 of the fluorescently labeled probe 602 used here is not particularly limited as long as it is a combination generally used for real-time PCR, and the fluorescent dye 603 is FAM, VIC, ROX, Cy3, Examples of the quencher 604 include TAMRA, BHQ1, BHQ2, and BHQ3.
  • the sequence recognized by the fluorescently labeled probe 602 may be on the same gene as the detection target gene or on a different gene, and a gene having a sequence different from the detection target gene by one base, for example, the same gene Wild type and mutant type may be used.
  • a genetic test for lung cancer is performed, the presence or absence of an ALK fusion gene and an EGFR gene mutation is determined in order to predict the effect of the molecular target drug.
  • a sequence that recognizes each of the ALK fusion gene and the EGFR gene may be used, or a sequence that recognizes the EGFR L858R mutant and its wild type.
  • a DNA detection apparatus includes a droplet preparation unit for preparing a droplet by adding a DNA solution containing DNA to be detected to oil, and An amplification unit for amplifying DNA with respect to the droplet may also be included.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of an apparatus for performing the method of the present invention and a cartridge used in the apparatus.
  • the PCR measurement device 721 includes a droplet preparation unit 701, a thermal cycler 702 as an amplification unit, a droplet detection unit 703, a monitor 704, and a control unit 724.
  • the droplet preparation unit 701 sets and uses a droplet preparation cartridge 705 shown in FIG. 7B.
  • the droplet preparation cartridge 705 has an oil supply port 715, a PCR reaction solution introduction port 716, and a droplet discharge port 717.
  • the droplet detection unit 703 uses the droplet detection cartridge 707 shown in FIG. 7C set on the temperature control device 722.
  • the droplet detection cartridge 707 has an oil supply port 718, a droplet introduction port 719, a liquid reservoir 723, and a waste liquid discharge port 720.
  • the oil supply port 715 of the droplet production cartridge is fluidly connected to the PCR measuring device 721, and oil 713 is supplied by the pump 709.
  • the PCR reaction solution inlet 716 of the droplet preparation cartridge is fluidly connected to the PCR measuring device 721, and a gas such as nitrogen gas or air or oil 712 is supplied by the pump 708.
  • the droplet outlet 717 of the droplet preparation cartridge is fluidly connected to the PCR measuring device 721 and connected to the microtube 706 set in the thermal cycler 702.
  • the oil supply port 718 of the droplet detection cartridge 707 is fluidly connected to the PCR measuring device 721, and oil 713 is supplied by the pump 710.
  • a droplet inlet 719 of the droplet detection cartridge 707 is fluidly connected to the PCR measuring device 721 and connected to a microtube 706 set in the thermal cycler 702.
  • the waste liquid discharge port 720 of the droplet detection cartridge 707 is fluidly connected to the PCR measuring device 721, and the waste liquid in the droplet detection cartridge 707 is discharged to the waste liquid reservoir 714 by the pump 711.
  • the pump may be a peristaltic pump, a syringe pump, or a diaphragm pump.
  • the monitor 704 is a display unit for displaying measurement results and messages, and is also an input unit for a user to input an operation.
  • Tm Measurement Method An example of a method for performing Tm measurement using the apparatus, cartridge, and DNA intercalator of FIG. 7 will be described with reference to the flowchart of FIG. First, a specimen derived from a biological sample containing DNA is added to a PCR reaction solution containing a DNA polymerase, a primer, a fluorescently labeled probe, a DNA intercalator, deoxyribonucleotides, and a buffer (S801).
  • a fluorescently labeled probe a TaqMan probe that is hydrolyzed by a DNA polymerase and emits fluorescence is used.
  • This PCR reaction solution is added to the PCR reaction solution inlet 716 of the droplet preparation cartridge 705 (S802).
  • the droplet preparation cartridge 705 is set in the droplet preparation unit 701 of the PCR measuring device 721.
  • the droplet is generated at the site where the oil in the droplet preparation cartridge 705 and the flow path of the PCR reaction solution intersect. Generate.
  • the generated droplets are discharged from the droplet discharge port 717, moved to the microtube 706 previously installed in the thermal cycler, and stored in the tube (S804).
  • the lid of the microtube 706 is closed, and PCR is performed by controlling the temperature of the thermal cycler (S805).
  • the DNA is amplified and the fluorescently labeled probe is decomposed in the extension step to increase the fluorescence intensity.
  • reaction conditions such as the temperature, time, and cycle number of each step.
  • the synthesized DNA forms a double strand, and the DNA intercalator intercalates the double-stranded DNA and emits fluorescence.
  • a droplet is added from a droplet introduction port 719 and an oil 713 is added from an oil supply port 718 of a droplet detection cartridge previously installed in the droplet detection unit 703 (S806).
  • the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe of the droplet stored in the liquid reservoir 723 of the droplet detection cartridge is measured (S807).
  • the temperature of the liquid reservoir 723 of the droplet detection cartridge is raised from 40 ° C. to 95 ° C. by the temperature controller 722, and the fluorescence intensity of the DNA intercalator is measured (S808).
  • the detected fluorescence data is sent to a calculation unit (not shown), where the change in fluorescence intensity of the DNA intercalator due to temperature rise is differentiated by temperature change, and the inflection point of the fluorescence intensity change is calculated as Tm ( S809).
  • a droplet having a fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe that is equal to or lower than a threshold and / or a Tm outside a predetermined range is determined as an empty droplet that does not include the target gene (S810).
  • the droplets in which the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe is equal to or higher than the threshold and Tm is within a predetermined range are counted (S811).
  • the number of droplets containing the target gene and the number of empty droplets are displayed on the monitor (S812).
  • the predetermined threshold value of fluorescence intensity and the predetermined range of Tm can be determined in advance by a pilot experiment or the like.
  • the sample to be used is not particularly limited, and may be a sample containing DNA to be detected.
  • biological samples such as animal and plant body fluids, tissues, cells, and excreta, and samples containing fungi and bacteria such as soil samples.
  • body fluid include blood, saliva, cerebrospinal fluid, and the like include cell-free DNA (cfDNA) and circulating tumor DNA (ctDNA) present in the blood.
  • cfDNA cell-free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • An example of the tissue is an affected part of a disease obtained by surgery or biopsy (for example, a cancer tissue such as breast or liver).
  • the tissue may be already fixed, for example, formalin-fixed paraffin-embedded tissue section (FFPE).
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded tissue section
  • cells include cells at or near the affected area collected by biopsy, circulating tumor cells in the blood, and the like.
  • the pretreatment of these specimens is not particularly limited, and after collection from a living body or the environment, it may be added to the suspension and homogenized, or may be used as it is by dissolving in a solution. It is preferable to use a nucleic acid extracted or purified.
  • Oil is a chemically inert substance that is insoluble or hardly soluble in the PCR reaction solution constituting the droplet, and is preferably a substance that is stable against temperature changes at high temperatures such as PCR.
  • Oil, silicone oil, hydrocarbon oil, etc. can be used.
  • the fluorinated oil include Perfluorocarbon and Hydrofluoroether. Fluorine-based oils are preferred because the longer carbon chain is less volatile.
  • the specific gravity of fluorine-type oil is more than 1.7 and is heavier than the specific gravity 1 of water as a solvent of the PCR reaction solution, the produced droplet floats on the oil.
  • silicone oil include Polyphenylmethylsiloxane and Trimethylsiloxysilicate.
  • silicone oils Unlike fluorinated oils, silicone oils have a specific gravity of about 0.98 and are close to the specific gravity of water, which is a solvent for PCR reaction solutions, and the produced droplets are uniformly dispersed in the oil.
  • the hydrocarbon oil include mineral oil, liquid paraffin, and hexadecane. Since the hydrocarbon-based oil has a specific gravity of about 0.84 and is lighter than the specific gravity of water, which is the solvent of the PCR reaction solution, the produced droplet sinks in the oil.
  • This oil may be used after adding a surfactant.
  • the type of the surfactant is not particularly limited, but Tween 20, Tween 80, Span 80, Triton X-100, and the like are applicable.
  • a fluorescently labeled probe such as a molecular beacon instead of a DNA intercalator
  • a fluorescently labeled probe for example, a molecular beacon that forms a stem-loop structure when annealed to the template DNA when it exists in a free state and emits fluorescence by separating the fluorescent dye and the quencher can be used.
  • the PCR reaction solution in the droplet preparation cartridge 705 is added to the PCR reaction solution inlet 716 (S902).
  • the droplet preparation cartridge 705 is set in the droplet preparation unit 701 of the PCR measuring device 721.
  • Oil 713 is added from the oil supply port 715, and oil 712 is added from the PCR reaction solution introduction port 716 (S903).
  • a droplet is generated at a portion where the oil in the droplet preparation cartridge 705 intersects the flow path of the PCR reaction solution.
  • the generated droplets are discharged from the droplet discharge port 717, moved to the microtube 706 previously installed in the thermal cycler, and stored (S904).
  • the lid of the microtube 706 is closed and PCR is performed by controlling the temperature of the thermal cycler (S905).
  • PCR is performed by controlling the temperature of the thermal cycler (S905).
  • DNA is amplified in the extension step, and many fluorescently labeled probes are annealed to the DNA so that the fluorescent dye and the quencher are separated to increase the fluorescence intensity.
  • reaction conditions such as the temperature, time, and cycle number of each step.
  • a droplet is added from a droplet introduction port 719 and an oil 713 is added from an oil supply port 718 of a droplet detection cartridge previously installed in the droplet detection unit 703 (S906).
  • the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe of the droplet stored in the liquid reservoir 723 of the droplet detection cartridge is measured (S907).
  • the temperature of the liquid reservoir 723 of the droplet detection cartridge is increased from 40 ° C. to 95 ° C. by the temperature controller 722, and the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe is measured (S908).
  • the measured fluorescence data is sent to a calculator (not shown), where the fluorescence intensity change of the fluorescently labeled probe due to temperature rise is differentiated by the temperature change, and the inflection point of the fluorescence intensity change is calculated as Tm ( S909).
  • a droplet in which the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe is equal to or lower than a threshold and / or Tm is outside a predetermined range is determined as an empty droplet that does not include the target gene (S910).
  • the droplets in which the fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe is equal to or higher than the threshold and Tm is within a predetermined range are counted (S911).
  • the number of droplets containing the target gene and the number of empty droplets are displayed on the monitor (S912). Note that the predetermined threshold value and the predetermined Tm range of the fluorescence intensity can be determined in advance by a pilot experiment or the like.
  • FIGS. 10 and 11 are examples of images of measurement results displayed on the monitor.
  • the number of droplets counted for each type of cancer-related gene and type of mutation may be displayed, and as shown in FIG.
  • the proportion of droplets counted for each type may be displayed.
  • the results displayed on the monitor are not only the number and ratio of the droplets as shown in FIGS. 10 and 11, but also the droplets in the three axes of green fluorescence intensity, yellow fluorescence intensity and Tm as shown in FIG.
  • a graph in which the measurement values are plotted may be included. Further, it may include a histogram in which the number of droplets versus the fluorescence intensity or Tm of the fluorescently labeled probe is plotted. The user looks at the graph or histogram, changes the fluorescence intensity threshold and / or Tm range setting of the fluorescently labeled probe, and counts the number of droplets within the fluorescence intensity threshold and Tm range again. You can also.
  • Program One embodiment of the present invention is a program for causing a DNA detection apparatus to perform a DNA detection method.
  • the DNA detection apparatus uses the apparatus detailed in (2), and executes the method detailed in (1) as the DNA detection method.
  • This example shows the results of measuring the Tm of DNA in a droplet using a DNA intercalator.
  • double-stranded DNAs having strand lengths of 16, 23, and 78 bp were prepared. Next, it was mixed with a buffer so that the final concentration of double-stranded DNA was 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M, and 0.8 ⁇ M.
  • the buffer was adjusted to contain EvaGreen as a salt such as potassium chloride or magnesium chloride and a DNA intercalator.
  • a droplet having a diameter of 20 ⁇ m was prepared by a microchannel.
  • the produced droplet was enclosed in a flat capillary having a height of 0.1 mm and a width of 1 mm.
  • a flat capillary was placed on the temperature control stage, and the fluorescence intensity change of a single droplet was observed when the temperature was raised under a microscope.
  • FIG. 12A is a graph showing the change in fluorescence intensity with increasing temperature of a droplet containing 23 bp double-stranded DNA and EvaGreen. As the temperature increased, the fluorescence intensity of the droplet decreased.
  • FIG. 12B is a plot of temperature on the horizontal axis and negative value of the first derivative of the fluorescence intensity on the vertical axis based on the result of FIG. 12A, and the maximum value is taken as the Tm value.
  • Table 1 summarizes the Tm measurement results of the droplets containing double-stranded DNA having different chain lengths and concentrations, and the Tm measurement results in bulk.
  • the type of DNA in the droplet can be identified by Tm measurement even for an empty droplet that does not contain the target gene or a droplet with insufficient PCR reaction efficiency. Therefore, in addition to the color and fluorescence intensity of the fluorescently labeled probe, by measuring the Tm of the PCR amplification product, an empty droplet that does not contain the target gene and a droplet with insufficient PCR reaction efficiency are identified by the measuring device, By correcting the analysis target data based on the result, it is possible to improve measurement reproducibility and measurement accuracy.
  • Droplet containing wild type gene 102 Droplet containing mutant A gene 103 Droplet containing mutant B gene 104 An empty droplet 201 A droplet 202 containing a wild-type gene A droplet 203 containing a mutant-type A gene A droplet 204 containing a mutant-type B gene An empty droplet 301 A droplet 302 containing a target gene A target gene Not including droplet 303 Micro flow path 304 Light source 305 Filter 306 Photo multiple meter 307 CCD 308 Lens 309 Dichroic mirror 310 Droplet detection cartridge 311 Droplet 312 Temperature controller 401 Droplet containing wild-type gene 402 Droplets containing mutant A gene 403 Droplet containing mutant B gene 404 Empty droplet 405 Droplet a 406 Droplet b 407 droplet c 501 DNA 502 DNA intercalator 503 Tm 601 DNA 602 Fluorescently labeled probe 603 Fluorescent dye 604 Quencher 605 Tm 701 Droplet preparation section 702 Thermal cycler 703 Droplet

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Abstract

本発明は、新たなＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することを目的とする。本発明の一実施態様として、オイル中にあり、ＤＮＡと、前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、前記ドロップレット内で、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含むＤＮＡ検出方法とする。

Description

ＰＣＲの測定方法および測定装置
　本発明は、ＰＣＲの測定方法および測定装置に関する。
　がんや感染症の診断においては、検体中に微量にしか含まれないがん関連遺伝子およびウイルス由来遺伝子の定量や、対象とするがん関連遺伝子の総量に比べ、極めて微量な変異の検出が求められている。これまでこのような遺伝子検査ではＰＣＲ（米国特許第４６８３１９５号；米国特許第４６８３２０２号；米国特許第４８００１５９号）やリアルタイムＰＣＲ（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，１０，ｐｐ９８６－９９４，１９９６）が用いられていた。ＰＣＲが、増幅した対象遺伝子をアガロース電気泳動によりエンドポイントで検出する半定量的な分析手法であるのに対して、リアルタイムＰＣＲは、蛍光標識プローブやＤＮＡインターカレーターなどを用いて対象遺伝子の指数関数的に増幅する過程をリアルタイムに検出する定量的な分析手法である。
　近年、検体の微量化や早期診断のため、従来以上に高感度な遺伝子検査が求められる機会が増えており、このような高感度遺伝子検査を再現性よく定量的に測定できることの重要性がたかまっている。リアルタイムＰＣＲは対象遺伝子の定量測定が可能であるものの、対象遺伝子が微量になると定量測定の再現性が低下するという問題があった。これは、リアルタイムＰＣＲでは既知濃度に調整した対象遺伝子をサンプルとして用いた検量線を測定に必要とするために絶対的な定量ができないことや、検体由来の成分によりＰＣＲの増幅効率が左右されることが原因となっている。
　ドロップレットデジタルＰＣＲ（登録商標）（特表２０１３－５２１７６４）は、限界希釈したサンプルを用いて絶対的に定量することで、従来の遺伝子検査における対象遺伝子が微量なときに測定再現性が低下するという課題を解決する方法として開発された。ドロップレットデジタルＰＣＲの実験手順を次に示す。まず、限界希釈した検体に、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、オイル中にＰＣＲ反応液のドロップレットを作製する。作製したドロップレットは、１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入っている。次に、ドロップレット内の対象遺伝子を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ後に各ドロップレットの蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつドロップレットの数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量する。ドロップレットデジタルＰＣＲでは、限界希釈した検体を用いてＰＣＲの阻害要因となる検体由来成分の影響が抑えられる。また、検量線を必要としないため、絶対的な定量ができる。
　ＰＣＲでは、反応液中の反応阻害物の存在やテンプレートＤＮＡの二次構造の形成、プライマーの設計不十分などにより、反応効率が低下することが知られている。これまでドロップレットデジタルＰＣＲでは、エンドポイントで測定するためＰＣＲの反応効率が測定結果に大きく影響しないとされていた。しかし実際は、１分子のＤＮＡを含むドロップレットで４０サイクルのＰＣＲを行う場合、ＰＣＲ増幅産物の分子数は１サイクルの反応効率により大きく異なる。例えば、１サイクルの反応効率が２倍のときは１．１ｘ１０１２分子、１サイクルの反応効率が１．５倍のときは１．１ｘ１０７分子、１サイクルの反応効率が１．４倍のときは０．７ｘ１０６分子に増幅する。ドロップレットの大きさが４ｐＬで、１μＭのプライマーを含む場合、プライマーの分子数は２．４ｘ１０６分子となり、１サイクルの反応効率が１．５倍以上のときであればＰＣＲ増幅産物の分子数はプライマーの濃度で制限される。しかし、１サイクルの反応効率が１．４倍以下ではＰＣＲ増幅産物の分子数は１サイクルの反応効率により大きく異なる。したがって、ドロップレット１つ１つの反応効率を同等にそろえられないとドロップレットの蛍光強度のばらつきが大きくなる。
　本発明の目的は、ドロップレットを用いたＰＣＲの新たな測定方法および測定装置を提供することである。
　本発明者らは、蛍光標識プローブの色と蛍光強度に加え、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって、測定再現性および測定精度を向上させることができることを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明に係る一実施態様は、オイル中にあり、ＤＮＡと、前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、前記ドロップレット内で、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含むＤＮＡ検出方法である。前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有し、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光色素の蛍光強度の変化に基づいて、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度が測定されてもよい。
　本発明に係る他の実施態様は、オイル中にあり、ＤＮＡと、ＤＮＡインターカレーターと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、を含むＤＮＡ検出方法である。
　上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、複数の前記ドロップレットが平面配置されていてもよい。また、前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有してもよい。
　本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットは前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含有し、前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、前記ドロップレット内で前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含み、第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法である。
　本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットはＤＮＡインターカレーターを含有し、前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、を含み、第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第３の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法である。
　上記いずれかのＤＮＡ判定方法において、前記増幅産物が検出でき、かつ前記融解温度が所定の範囲内であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有していたと判定してもよい。
　本発明に係るさらなる実施態様は、オイル中のドロップレット内のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、前記オイル中の前記ドロップレットを加温するための加温部と、前記オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、前記ドロップレットの昇温に伴う前記蛍光強度の変化から前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度または前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部と、を備えるＤＮＡ検出装置である。前記オイル中のドロップレット内のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。前記ドロップレット内のＤＮＡの有無を表示するモニターを備えてもよい。
　本発明に係るさらなる実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、上記いずれかのＤＮＡ検出方法または上記いずれかのＤＮＡ判定方法を行わせるためのプログラムである。このＤＮＡ検出装置は、上述したＤＮＡ検出装置であってもよい。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１７年１月５日付で出願した日本国特許出願２０１７－０００７７２に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施態様における基本概念を示す図である。 従来技術によるドロップレットデジタルＰＣＲの測定結果の例を示す図である。 本発明の一実施態様における、ドロップレットが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の模式図である。 従来技術において、ドロップレットに含まれる遺伝子が同定できないドロップレットデジタルＰＣＲ測定結果の一例を示す図である。 本発明の一実施態様において、ＤＮＡインターカレーターを用いてＤＮＡのＴｍを測定する方法を示す模式図である。 本発明の一実施態様において、蛍光標識プローブを用いてＤＮＡのＴｍを測定する方法を示す模式図である。 本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジを示す模式図である。 図７の装置とカートリッジを用いた測定でＤＮＡインターカレーターを用いてＴｍ測定を行う方法の一実施態様を示すフローチャートである。 図７の装置とカートリッジを用いた測定で蛍光標識プローブを用いてＴｍ測定を行う方法の一実施態様を示すフローチャートである。 モニターに表示される測定結果の一例である。 モニターに表示される測定結果の一例である。 本発明の一実施例において、ＤＮＡインターカレーターを用いてドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定した結果を示すグラフである。
　本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）ＤＮＡ検出方法の原理及び効果
　本発明に係るＤＮＡ検出方法は、オイル中にあり、ＤＮＡと、そのＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、ＤＮＡを増幅する工程と、融解曲線分析によって、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度を測定する工程と、を含む。
　図１に本発明の代表的な実施態様において想定される測定結果の例を示した。また、図２に従来のドロップレットデジタルＰＣＲのマルチプレックスでの測定結果の例を示した。
　ドロップレットデジタルＰＣＲでは、ＤＮＡの変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲが行われることがある。図２Ａの例は、対象遺伝子の野生型アレルに対しては黄色の蛍光標識プローブを、対象遺伝子の変異型アレルに対しては緑色の蛍光標識プローブを用い、対象遺伝子の変異型Ａと変異型Ｂの蛍光標識プローブの量を３：５となるように使用した場合の結果を模式的に示した図である。ここでは、蛍光標識プローブは、ＰＣＲに用いられるプライマーペアの間に位置する配列に相補的であって、プライマーが伸長するときに、プローブが分解され、蛍光標識が蛍光を発するように構成されているものとする。具体的には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが例示できる。対象遺伝子の野生型アレルを含むドロップレット２０１では、対象遺伝子の野生型アレルに対応した黄色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、黄色の蛍光を発する。また、対象遺伝子の変異型Ａアレルを含むドロップレット２０２では、対象遺伝子の変異型Ａアレルに対応した緑色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、緑色の蛍光を発する。対象遺伝子の変異型Ｂアレルを含むドロップレット２０３では、対象遺伝子の変異型Ｂに対応した緑色の蛍光標識プローブがＰＣＲ中にＤＮＡが増幅するとともに分解され、緑色の蛍光を発する。このとき、変異型Ａアレルを含むドロップレットの蛍光強度と変異型Ｂアレルを含むドロップレットの緑色の蛍光強度は、ドロップレットに添加した蛍光標識プローブの量に比例し、３：５となる。対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０４は、緑色と黄色の蛍光のどちらもが検出されない。しかし、実際には図２Ｂ、Ｃに示すように、ＰＣＲの反応が不十分なドロップレットがあるため、ドロップレットの蛍光強度の分布が広くなることがあり、また、蛍光強度の分布の広がりが大きくなりすぎると、図２Ｄのように、変異型Ａのドロップレット２０２と変異型Ｂのドロップレット２０３の分布が重なってしまうことがある。
　また、図２Ａに示すように、ドロップレットデジタルＰＣＲでは、１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を限界希釈してドロップレットを作製するため、作製されたドロップレットの５―９割は対象遺伝子を含まない空のドロップレット２０４となる。このような空のドロップレットであっても、検体由来の成分により一部の蛍光標識プローブが分解され、蛍光色素とそのクエンチャーが切断されて蛍光を発する場合があり、閾値を設定してこのような空のドロップレットを排除する。また、ドロップレットデジタルＰＣＲでは、変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲを実現するため、ＰＣＲ後、蛍光色素の色と強度から閾値を設定し、対象遺伝子を含むドロップレット２０１、２０２、２０３の数をカウントする。
　ドロップレットデジタルＰＣＲの実験では、前述したような対象遺伝子を含まない空のドロップレットをデータから排除したり、マルチプレックスＰＣＲ後に変異の種類ごとにドロップレットの数をカウントしたりするための閾値を、実験者が設定していた。しかし、ドロップレットの蛍光強度のばらつきが大きくなると、閾値の設定が難しくなり、測定精度を低下させる要因となる。
　本発明の一実施態様では、上述したように、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度Ｔｍを算出する工程を含む。これによって、図１に示すように、緑色の蛍光強度、黄色の蛍光強度およびＴｍの３軸でドロップレットの計測結果をプロットすることができるようになり、ドロップレットの集団１０１～１０４を分離することができる。
　また、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットを測定装置により確実に識別することができ、解析対象データを補正することにより、測定再現性および測定精度を向上させることができる。
（２）ＤＮＡ検出装置
　本発明のＤＮＡ検出装置は、オイル中のドロップレットを加温するための加温部と、オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、ドロップレットの昇温に伴う蛍光強度の変化から蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部とを備える。図３に、ドロップレットが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の例を示す。
　図３Ａに示す蛍光測定部の例では、マイクロ流路を用いてドロップレットの蛍光強度を測定する。ドロップレット３０１がマイクロ流路３０３中を矢印の方向に流れている。ドロップレット３０２の位置までドロップレットが流れると、加温部（図示せず）によってドロップレットが加温されつつ、光源３０４により励起光がドロップレットに照射される。光源３０４によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光を蛍光フィルター３０５を通してフォトマルチプルメーター３０６で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度が算出される。光源３０４、蛍光フィルター３０５、フォトマルチプルメーター３０６で構成される蛍光検出器は、蛍光色素の色ごとに別々に設けてもよいし、図３Ａに示すように１つの光源の励起光で励起して２つの蛍光フィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する構成にしてもよい。
　また、図３ＢおよびＣのようにドロップレットを平面配置し、ドロップレットの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ドロップレット３１１をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置し、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でドロップレット検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うドロップレットの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置したドロップレット３１１に照射する。励起光によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の融解温度が算出される。図３Ａでは、ドロップレットを一つずつ処理する必要があるが、多数のドロップレットを一度に処理できるという点で、図３ＢおよびＣの装置が好ましい。また、図３ＢおよびＣの装置では、温調装置３１２をＤＮＡの増幅反応にも用いることができる点でも、図３Ａより好適である。
（３）融解温度を算出する方法
　図４は、図２Ｄで述べたのと同様に、検出した蛍光強度が重なってしまい、ドロップレットに含まれる遺伝子が同定できない測定結果を示す模式図の一例である。図５および図６は、図４で同定できなかった対象遺伝子に対し、ドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定した結果を示す模式図の一例である。
　図４に示すように、変異ごとに蛍光標識プローブの色と量を変えて、複数種類の変異を一度の測定で検出するマルチプレックスＰＣＲの場合、対象遺伝子の変異型Ａ４０２と変異型Ｂ４０３はどちらも緑色の蛍光標識プローブで検出しているため、ドロップレットａ４０５の蛍光強度が観察されればドロップレットが含む対象遺伝子は変異型Ｂであると分かるが、ドロップレットｂ４０６およびドロップレットｃ４０７の蛍光強度が観察されたときはドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａ４０２、変異型Ｂ４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができない。
　そこで、図５に示すように、ＤＮＡインターカレーターを用いてドロップレット内で増幅したＤＮＡのＴｍを測定することによって、図４で同定できなかった対象遺伝子を同定することができる。具体的な方法は、まず、ＤＮＡインターカレーター５０２をＰＣＲ反応液に添加してドロップレットを作製し、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うと、室温程度の温度ではドロップレット内で増幅した２本鎖ＤＮＡ５０１にＤＮＡインターカレーター５０２が結合し、強い蛍光を発する。その後、ドロップレットの温度が上昇するにつれ、ドロップレット内の２本鎖ＤＮＡ５０１が解離して１本鎖ＤＮＡ５０１となり、ＤＮＡインターカレーター５０２が結合しなくなるため、蛍光強度が減少する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図５に示す。なお、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、ドロップレットを昇温させることによって行ってもよい。
　図５では、ドロップレットａ４０５の測定結果が図５Ａ、ドロップレットｂ４０６の測定結果が図５Ｂ、ドロップレットｃ４０７の測定結果が図５Ｃに示されている。さらに、図５Ａ～Ｃの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図５Ｄ～Ｆのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これがＤＮＡ二重鎖の融解温度Ｔｍとして算出できる。図４では、ドロップレットｂ４０６とドロップレットｃ４０７はドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａのドロップレットの集団４０２、変異型Ｂのドロップレットの集団４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができなかったが、図５Ｄ、Ｅではドロップレットａ４０５とドロップレットｂ４０６のＴｍが同じであるためドロップレットｂ４０６は変異型Ｂであり、図５Ｄ、Ｆではドロップレットａ４０５とドロップレットｃ４０７のＴｍは異なるためドロップレットｃ４０７は変異型Ａであると判断できる。さらに、対象遺伝子に変異型Ａや変異型Ｂ以外の想定されていない変異が生じていた場合、測定したドロップレットのＴｍが野生型のドロップレット４０１、変異体Ａのドロップレット４０２、変異体Ｂのドロップレット４０３とも異なる値として検出することができるため、想定している変異だけでなく、想定していない変異も一度の測定で検出できる。
　なお、対象遺伝子のＴｍは、プライマーの設計を変えることでＰＣＲ増幅産物の配列や配列の鎖長に依存して制御することができる。
　ここで用いるＤＮＡインターカレーターは、２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、２本鎖ＤＮＡの検出に用いることのできるインターカレーターであれば適用できる。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　ＩやＳＹＢＲ　Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標）　Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ　Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ　Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ　Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ（登録商標）－１、ＹＯＹＯ（登録商標）－１、ＴＯＴＯ（登録商標）－１、ＪＯＪＯ（登録商標）－１、ＰＯＰＯ－３、ＬＯＬＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ－３、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－３、ＰＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＹＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＴＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＪＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＰＯ－Ｐｒｏ－３、ＹＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－５、エチジウムブロマイドなどが適用可能である。ＤＮＡインターカレーターが熱耐性である場合、ＰＣＲ反応を行う前からドロップレットに添加しておくことができる。
　本方法で、ＤＮＡインターカレーターの代わりとして、蛍光標識プローブを用いることもできる。蛍光標識プローブは、両端またはその近傍に蛍光色素とそのクエンチャーを有し、両端周辺の配列が相補的になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する一方、ループ部分の配列がテンプレートＤＮＡと相補的になっており、テンプレートＤＮＡにハイブリダイズできるような構造を有するように設計する。蛍光標識プローブ６０２は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が近接しているため、蛍光は発しない。蛍光標識プローブ６０２をＰＣＲ反応が終了したドロップレットに添加すると、室温程度の温度ではドロップレット内で増幅したＤＮＡ６０１に蛍光標識プローブ６０２のループ部分がアニールし、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が離れるため、蛍光標識プローブ６０２は強い蛍光を発する。その後、ドロップレットを加熱すると、ＤＮＡ６０１と蛍光標識プローブ６０２が解離し、蛍光標識プローブ６０２内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ６０２からの蛍光強度が低下する。さらにドロップレットを加熱すると、蛍光標識プローブ６０２のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図６に示す。なお、この蛍光標識プローブは、ＰＣＲのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、ＰＣＲのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、ドロップレットを昇温させることによって行ってもよい。
　図６では、ドロップレットａ４０５の測定結果が図６Ａ、ドロップレットｂ４０６の測定結果が図６Ｂ、ドロップレットｃ４０７の測定結果が図６Ｃのようになる。さらに、図６Ａ～Ｃの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図６Ｄ～Ｆのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これが対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度Ｔｍとなる。図４では、ドロップレットｂ４０６とドロップレットｃ４０７はドロップレットが含む対象遺伝子が変異型Ａのドロップレットの集団４０２、変異型Ｂのドロップレットの集団４０３のどちらであるのかは測定結果から判断することができなかったが、図６Ｄ、Ｅでは、ドロップレットａ４０５とドロップレットｂ４０６のＴｍが同じであるためドロップレットｂ４０６は変異型Ｂであり、図６Ｄ、Ｆではドロップレットａ４０５とドロップレットｃ４０７のＴｍは異なるためドロップレットｃ４０７は変異型Ａであると判断できる。さらに、対象遺伝子に変異型Ａや変異型Ｂ以外の想定されていない変異が生じていた場合、測定したドロップレットのＴｍが野生型のドロップレット４０１、変異体Ａのドロップレット４０２、変異体Ｂのドロップレット４０３とも異なる値として検出することができるため、想定している変異を判断するというだけでなく、想定していない変異も一度の測定結果から検出できる。
　なお、対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブのＴｍは、配列や配列の鎖長を変えることで制御することができる。また、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）のような人工ＤＮＡを利用することで、Ｔｍを制御することができる。
　ここで用いる蛍光標識プローブ６０２の蛍光色素６０３とクエンチャー６０４の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されず、蛍光色素６０３がＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー６０４がＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが例示できる。
　蛍光標識プローブ６０２が認識する配列は、検出対象の遺伝子と同じ遺伝子上にあっても、異なる遺伝子上にあってもよく、検出対象の遺伝子と１塩基だけ異なる配列を有する遺伝子、例えば同じ遺伝子の野生型と変異型であってもよい。一例として、肺がんの遺伝子検査を行う場合であれば、分子標的薬の効果を予測するため、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を判定する。その時、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の各々を認識する配列であってもよいし、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異型とその野生型を認識する配列であってもよい。
（４）ＤＮＡ検出装置の他の構成
　本発明の一実施態様にかかるＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部、及び／又はドロップレットに対してＤＮＡを増幅するための増幅部を含んでもよい。
　図７は、本発明の方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジの一例を示す図である。図７Ａに示すように、ＰＣＲ測定装置７２１はドロップレット作製部７０１、増幅部としてのサーマルサイクラー７０２、ドロップレット検出部７０３、モニター７０４、制御部７２４から構成される。ドロップレット作製部７０１は、図７Ｂに示すドロップレット作製用カートリッジ７０５をセットして用いる。ドロップレット作製用カートリッジ７０５は、オイル供給口７１５、ＰＣＲ反応液導入口７１６、ドロップレット排出口７１７をもつ。ドロップレット検出部７０３は、図７Ｃに示すドロップレット検出用カートリッジ７０７を温調装置７２２の上にセットして用いる。ドロップレット検出用カートリッジ７０７は、オイル供給口７１８、ドロップレット導入口７１９、液溜７２３、廃液排出口７２０をもつ。ドロップレット作製用カートリッジのオイル供給口７１５はＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０９によってオイル７１３が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのＰＣＲ反応液導入口７１６はＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０８によって窒素ガスや空気などのガスまたはオイル７１２が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのドロップレット排出口７１７はＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のオイル供給口７１８はＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１０によってオイル７１３が供給される。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のドロップレット導入口７１９はＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７の廃液排出口７２０は、ＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１１によって廃液溜め７１４にドロップレット検出用カートリッジ７０７内の廃液が排出される。ポンプは、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。モニター７０４は、測定結果やメッセージを表示するための表示部であり、ユーザーが操作を入力する入力部でもある。
（５）Ｔｍ測定方法
　図７の装置とカートリッジ、及びＤＮＡインターカレーターを用いてＴｍ測定を行う方法の一例を、図８のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、ＤＮＡを含む生体試料由来の検体を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブ、ＤＮＡインターカレーター、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ８０１）。蛍光標識プローブはＤＮＡポリメラーゼにより加水分解されて蛍光を発するＴａｑＭａｎプローブを用いる。このＰＣＲ反応液をドロップレット作製用カートリッジ７０５のＰＣＲ反応液導入口７１６に添加する（Ｓ８０２）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５をＰＣＲ測定装置７２１のドロップレット作製部７０１にセットする。オイル供給口７１５からオイル７１３を、ＰＣＲ反応液導入口７１６からオイル７１２を添加する（Ｓ８０３）と、ドロップレット作製用カートリッジ７０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口７１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ７０６に移動し、チューブ内に貯蔵される（Ｓ８０４）。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ７０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ８０５）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、ＤＮＡが増幅するとともに、伸長工程で蛍光標識プローブが分解されて、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、温度を室温へと下げると合成したＤＮＡは２本鎖を形成し、ＤＮＡインターカレーターがこの２本鎖ＤＮＡにインターカレートし、蛍光を発する。ＰＣＲ後、ドロップレット検出部７０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口７１９からドロップレットを、オイル供給口７１８からオイル７１３を添加する（Ｓ８０６）。ドロップレット検出部７０３において、ドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ８０７）。温調装置７２２によりドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３を４０℃から９５℃まで昇温し、ＤＮＡインターカレーターの蛍光強度を測定する（Ｓ８０８）。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで、昇温によるＤＮＡインターカレーターの蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点がＴｍとして算出される（Ｓ８０９）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以下および／またはＴｍが所定の範囲外のドロップレットを、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと判定する（Ｓ８１０）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上およびＴｍが所定の範囲内のドロップレットをカウントする（Ｓ８１１）。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数をモニターに表示する（Ｓ８１２）。なお、所定の蛍光強度の閾値およびＴｍの所定の範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。
　用いる検体は特に限定されないが、検出対象のＤＮＡを含む試料であればよく、動植物の体液や組織、細胞、排泄物などの生体試料や、土壌サンプルなど真菌や細菌などが含まれる試料が例示できる。体液としては血液、唾液、髄液などが例示でき、血液中には存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）や血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が含まれる。組織としては、外科手術や生検法によって得られた疾患の患部（例えば、乳房や肝臓などのがん組織）が例示できる。すでに固定された組織でもよく、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（ＦＦＰＥ）でもよい。細胞としては、生検法によって採取した患部またはその付近の細胞や、血液中を循環する血中循環腫瘍細胞などが例示できる。これらの検体の前処理は特に限定されず、生体や環境などから採取後、懸濁液に添加してホモジネートしたり、あるいは溶解液で溶解させたりしたものをそのまま用いてもよいが、それらに含まれる核酸を抽出したり、精製したものを用いることが好ましい。
　オイルはドロップレットを構成するＰＣＲ反応液に不溶性もしくは難溶性である化学的に不活性な物質であり、また、ＰＣＲのような高温での温度変化に対して安定である物質が好ましく、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイルなどが使用可能である。フッ素系オイルとしては、例えばＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎやＨｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｒなどが挙げられる。フッ素系オイルは、炭素鎖が長いほうが揮発性が低いので好ましい。また、フッ素系オイルは比重が１．７超であり、ＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重１に比べて重いため、作製したドロップレットはオイルに浮く。シリコーン系オイルとしては、例えばＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅやＴｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙｓｉｌｉｃａｔｅなどが挙げられる。シリコーン系オイルはフッ素系オイルと異なり、比重が０．９８程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重に近く、作製したドロップレットはオイル中に均一に分散する。炭化水素系オイルとしては、例えばミネラルオイルや流動パラフィン、ヘキサデカンなどが挙げられる。炭化水素系オイルは比重が０．８４程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重よりも軽いため、作製したドロップレットはオイルに沈む。
　このオイルは、界面活性剤を添加して用いてもよい。ここで界面活性剤の種類は特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００などが適用可能である。
　次に、ＤＮＡインターカレーターの代わりに、モレキュラービーコンのような蛍光標識プローブを用いてＴｍ測定を行う方法の一例を、図９に示すフローチャートを参考にしながら説明する。ＤＮＡを含む生体試料由来の検体をＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブ、デオキシリボヌクレオチド類、ｐＨ緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ９０１）。蛍光標識プローブには、例えば、遊離状態で存在するときは、ステムループ構造を形成し、テンプレートＤＮＡにアニールして蛍光色素とクエンチャーが離れて蛍光を発するモレキュラービーコンを用いることができる。ドロップレット作製用カートリッジ７０５のＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液導入口７１６に添加する（Ｓ９０２）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５をＰＣＲ測定装置７２１のドロップレット作製部７０１にセットする。オイル供給口７１５からオイル７１３を、ＰＣＲ反応液導入口７１６からオイル７１２を添加する（Ｓ９０３）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口７１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ７０６に移動し、貯蔵される（Ｓ９０４）。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ７０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ９０５）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、伸長工程においてＤＮＡが増幅するとともに、蛍光標識プローブが多くＤＮＡにアニールして蛍光色素とクエンチャーが離れ、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、ドロップレット検出部７０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口７１９からドロップレットを、オイル供給口７１８からオイル７１３を添加する（Ｓ９０６）。ドロップレット検出部７０３において、ドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ９０７）。温調装置７２２によりドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３を４０℃から９５℃まで昇温し、蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ９０８）。測定された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで、昇温による蛍光標識プローブの蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点がＴｍとして算出される（Ｓ９０９）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以下および／またはＴｍが所定の範囲外であるドロップレットを、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと判定する（Ｓ９１０）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上およびＴｍが所定の範囲内のドロップレットをカウントする（Ｓ９１１）。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数をモニターに表示する（Ｓ９１２）。なお、蛍光強度の所定の閾値および所定のＴｍの範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。
　図１０および図１１は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図１０に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされたドロップレットの数が表示されてもよいし、図１１に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされたドロップレットの割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図１０や図１１のようなドロップレットの数や割合だけでなく、図１下のような緑色の蛍光強度、黄色の蛍光強度およびＴｍの３軸でドロップレットの計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、蛍光標識プローブの蛍光強度またはＴｍに対するドロップレットの数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度の閾値および／またはＴｍの範囲の設定を変えて、蛍光強度の閾値内及びＴｍの範囲内にあるドロップレットの数を再度カウントすることもできる。
（３）プログラム
　本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。
　本実施例では、ＤＮＡインターカレーターを用いて、ドロップレット内のＤＮＡのＴｍを測定した結果を示す。
　まず、鎖長が１６、２３、７８ｂｐの二本鎖ＤＮＡを用意した。次に、二本鎖ＤＮＡの最終濃度が０．２μＭ、０．４μＭ、０．８μＭになるように、バッファーと混合した。バッファーは、塩化カリウムや塩化マグネシウムなどの塩、及びＤＮＡインターカレーターとして、ＥｖａＧｒｅｅｎを含むように調整した。
　この反応液と界面活性剤を含むフッ素系オイルを用いて、マイクロ流路により直径２０μｍのドロップレットを作製した。高さ０．１ｍｍ、幅１ｍｍの平板キャピラリーの中に作製したドロップレットを封入した。温調ステージの上に平板キャピラリーを置き、顕微鏡下で昇温したときの単一のドロップレットの蛍光強度変化を観察した。
　図１２Ａは、２３ｂｐの二本鎖ＤＮＡとＥｖａＧｒｅｅｎを含むドロップレットの昇温に伴う蛍光強度変化をグラフにした結果である。昇温に伴い、ドロップレットの蛍光強度は減少した。図１２Ｂは、図１２Ａの結果をもとに、横軸に温度、縦軸に蛍光強度の一次微分の負の値をプロットしたものであり、極大値をＴｍ値とする。表１に、鎖長および濃度の異なる二本鎖ＤＮＡを含むドロップレットのＴｍ測定結果とバルクでのＴｍ測定結果をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１より明らかであるが、ドロップレットのＴｍ測定結果とバルクでのＴｍ測定結果はよく一致しており、ＤＮＡの鎖長が長くなるにしたがってＴｍ値は高くなり、Ｔｍ値はＤＮＡ濃度が異なってもほぼ変わらない。
　このように、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットであっても、Ｔｍ測定によりドロップレット内のＤＮＡの種類が同定できる。従って、蛍光標識プローブの色と蛍光強度に加え、ＰＣＲ増幅産物のＴｍを測定することで、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットを測定装置により見分け、その結果によって解析対象データを補正することにより、測定再現性および測定精度の向上を図ることができる。
　本発明によって、ドロップレットを用いた新たなＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することができるようになった。
１０１　野生型の遺伝子を含むドロップレット 
１０２　変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット 
１０３　変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット 
１０４　空のドロップレット
２０１　野生型の遺伝子を含むドロップレット
２０２　変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット
２０３　変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット
２０４　空のドロップレット
３０１　対象遺伝子を含むドロップレット
３０２　対象遺伝子を含まないドロップレット
３０３　マイクロ流路
３０４　光源
３０５　フィルター
３０６　フォトマルチプルメーター
３０７　ＣＣＤ
３０８　レンズ
３０９　ダイクロイックミラー
３１０　ドロップレット検出用カートリッジ
３１１　ドロップレット
３１２　温調装置
４０１　野生型の遺伝子を含むドロップレット 
４０２　変異型Ａの遺伝子を含むドロップレット 
４０３　変異型Ｂの遺伝子を含むドロップレット 
４０４　空のドロップレット
４０５　ドロップレットａ
４０６　ドロップレットｂ 
４０７　ドロップレットｃ 
５０１　ＤＮＡ
５０２　ＤＮＡインターカレーター
５０３　Ｔｍ 
６０１　ＤＮＡ
６０２　蛍光標識プローブ
６０３　蛍光色素
６０４　クエンチャー
６０５　Ｔｍ 
７０１　ドロップレット作製部
７０２　サーマルサイクラー
７０３　ドロップレット検出部
７０４　モニター
７０５　ドロップレット作製用カートリッジ
７０６　マイクロチューブ
７０７　ドロップレット検出用カートリッジ
７０８～７１１　ポンプ
７１２　オイル
７１３　オイル
７１４　廃液溜め
７１５　オイル供給口
７１６　ＰＣＲ反応液導入口
７１７　ドロップレット排出口
７１８　オイル供給口
７１９　ドロップレット導入口
７２０　廃液排出口
７２１　ＰＣＲ測定装置
７２２　温調装置
７２３　液溜
７２４　制御部

Claims (13)

  1. 　オイル中にあり、ＤＮＡと、前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、
    　前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、
    　前記ドロップレット内で、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、
    　を含むＤＮＡ検出方法。
  2. 　前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有し、
    　前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光色素の蛍光強度の変化に基づいて、前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度が測定される、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
  3. 　オイル中にあり、ＤＮＡと、ＤＮＡインターカレーターと、を含んだドロップレットにおいて、前記ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出法であって、
    　前記ドロップレット内で、核酸増幅反応によって、前記ＤＮＡを増幅する第１の工程と、
    　前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、
    　前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、
    　を含むＤＮＡ検出方法。
  4. 　複数の前記ドロップレットが平面配置されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
  5. 　前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
  6. 　オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットは前記ＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含有し、
    　前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、
    　前記ドロップレット内で前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度を測定する第２の工程と、を含み、
    　第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第２の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法。
  7. 　オイル中にあるドロップレット内の特定のＤＮＡの含有の有無を判定するＤＮＡ判定方法であって、前記ドロップレットはＤＮＡインターカレーターを含有し、
    　前記ドロップレット内で核酸増幅反応を行う第１の工程と、
    　前記ドロップレットの昇温時に、前記ＤＮＡインターカレーターから放出される蛍光強度を測定する第２の工程と、
    　前記ドロップレットの昇温に伴った前記蛍光強度の変化に基づいて、前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する第３の工程と、を含み、
    　第１の工程で増幅産物が検出できない場合、および／または第３の工程で融解温度が所定の範囲外であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有しないと判定する、ＤＮＡ判定方法。
  8. 　前記増幅産物が検出でき、かつ前記融解温度が所定の範囲内であった場合に、前記ドロップレット内に前記ＤＮＡが含有していたと判定する、請求項６または７に記載のＤＮＡ判定方法。
  9. 　オイル中のドロップレット内のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、
    　　前記オイル中の前記ドロップレットを加温するための加温部と、
    　　前記オイル中の蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターからの蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、
    　　前記ドロップレットの昇温に伴う前記蛍光強度の変化から前記蛍光標識プローブと前記ＤＮＡとの融解温度または前記ＤＮＡの二重鎖の融解温度を算出する計算部と、
    を備えるＤＮＡ検出装置。
  10. 　前記オイル中のドロップレット内のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備える、請求項９のＤＮＡ検出装置。
  11. 　前記ドロップレット内のＤＮＡの有無を表示するモニターを備える、請求項７または８に記載のＤＮＡ検出装置。
  12. 　ＤＮＡ検出装置に、請求項１～５のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法または請求項６～８のいずれか１項に記載のＤＮＡ判定方法を行わせるためのプログラム。
  13. 　前記ＤＮＡ検出装置は、請求項９～１１のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置である、請求項１２に記載のプログラム。
     
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