CN116497097A - 用于执行数字pcr的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于定量靶核酸的系统和方法。包含靶核酸的样本分离成包含至少一个靶核酸分子的第一多个反应体积和不含靶核酸分子的第二多个反应体积。所述反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸。在所述多个反应体积的至少一部分，对扩增的指标进行检测或测量。基于所述检测或测量，对所述靶核酸进行定量。在停止所述扩增测定之后，能够加热所述多个反应体积，并且能够检测或测量所述反应体积的至少一部分的所述扩增的指标的变化。

Description

用于执行数字PCR的系统和方法
本申请是申请号为201680062614.X、申请日为2016年9月29日、发明名称为“用于执行数字PCR的系统和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2015年9月29日的美国临时专利申请号62/234,158的权益，该文献全文以引用方式并入本文。
引言
数字PCR(dPCR)是常规聚合酶链反应(PCR)方法的一种改进，可用于直接定量并克隆扩增核酸(包括DNA、cDNA、甲基化DNA、RNA等)。dPCR和传统PCR之间的一个区别在于测量核酸量的方法。在dPCR中，样本被分离为大量单独的样本体积或部分，并且在每个样本部分单独进行相应的PCR反应。这种分离允许对非常少量的核酸进行灵敏的测量。已经证明，dPCR可用于研究基因序列的变异，诸如拷贝数变异或点突变。
在dPCR中，样本被分隔，使得样本中待评估的单个核酸分子限于局部并且集中在许多分离的区域内。虽然在常规PCR中分子的起始拷贝数量与扩增循环的数量成比例，但是dPCR不依赖于测定扩增循环的次数来测定初始样本量。相反，初始样本被分隔成大量相对较小的样本部分，其中包含一个拷贝或大约一个拷贝，或者不包含核酸模板或靶标的拷贝。因此，每个分隔的样本部分的特征可在于用于包含至少一种类型的靶核酸分子的“0”或“1”，从而分别导致阴性(“0”)或阳性(“1”)PCR反应。通过这种方式分隔样本可以使用Poisson统计提供了对初始样本中分子的估算值。然而，根据产生的“0”和“1”的数量，这种估算值的准确度有所不同。
需要改善dPCR过程中获得的信息和数据以及基于此类信息的分析，以便提高由dPCR获得的结果的准确度。例如，用于区分最初包括单个样本单元的分隔的样本与那些包含多于一个样本单元的样本的技术可以提供更准确的dPCR结果。
发明内容
本发明的实施例整体涉及用于定量一种或多种核酸的系统和方法。在某些实施例中，样本或反应溶液被分离、分散或分配成与样本反应装置、流体装置、样本固持器或其他此类装置相关联的多个样本反应体积或反应位点。所述多个样本反应体积可包括第一多个样本反应体积或反应位点和第二多个样本反应体积，其中第一多个样本反应体积各自包含一个分子或大约一个分子，并且第二多个样本反应体积各自不包含靶核酸分子。所述多个样本反应体积或反应位点经受扩增测定，该扩增测定使用例如至少一种引物或一种探针或指示染料，其中扩增测定被构造成用于扩增靶核酸。在扩增测定过程中，可以检测或测量存在于任意多个样本反应体积中的靶核酸所呈现的扩增的指标。在停止扩增测定后，可以对多个样本反应体积进行进一步处理，例如加热样本反应体积并且检测或测量反应体积的指标。在一些实施例中，指标也可以在扩增测定的一个或多个循环过程中进行检测或测量。样本反应体积可以包括分离的样本(例如，核酸样本)以及用于支持扩增反应的一种或多种试剂。所述一种或多种试剂可以在将样本装载到反应体积或反应位点中之前或之后掺入到样本中。
在某些实施例中，在扩增测定完成后，可以在多个样本反应体积的至少一部分的第一温度处对扩增的指标进行第一检测或测量，其中指标提供了扩增产物的存在和/或量的指示。任选地，在扩增测定完成后，可以在不同于第一温度的一个或多个附加温度处(例如，在高于第一温度的一个或多个温度处)对指标进行一种或多种附加检测或测量。任选地，也可以在扩增测定的一个或多个循环过程中对指标进行一种或多种检测或测量，例如在扩增的两个或更多个循环中在相同的预先确定的测定温度处进行检测或测量，其中测定温度可以高于第一温度。
以下描述中将部分阐述另外的目的、特征和/或优点，并且所述目的、特征和/或优点将部分从本说明书中显而易见，或者可通过对本发明和/或权利要求的实践习得。这些目的和优点中的至少一部分可通过所附权利要求书中特别指出的元件和组合来实现和获得。
应当理解，前文大体描述以及以下详细描述仅为示例性和解释性的，并不限制权利要求；相反，权利要求应当结合其全部范围(包括等同形式)来确定。
附图简略说明
本发明可单独通过下文具体实施方式或通过下文具体实施方式与附图的结合进行理解。所含附图用于提供对本发明的进一步理解，并且该附图并入以及构成本说明书的一部分。附图示出了本教导内容的一个或多个示例性实施例，并且与描述一起用于解释特定的原理和操作。
图1A示出根据本发明的一个实施例的一种系统。
图1B示出根据本发明的一个实施例用于检测靶核酸的扩增的示例性技术。
图2A-2B示出执行扩增的示例性方法，其中包括解链阶段。
图3A-3D示出利用检测技术执行扩增的示例性方法。
图4示出在间隔的温度处采集的例示性、假想性示例性扩增检测数据的图。
图5示出例示性、假想性示例性实时扩增检测测量的图。
图6A和图6B示出例示性、假想性示例性实时扩增检测测量的图，其中包括发射角。
图7A和图7B示出例示性、假想性示例性解链阶段检测测量的图。
图8示出例示性、假想性示例性解链阶段检测测量的散点图。
图9示出根据本文所述的各种实施例包括多个反应位点的芯片。
图10示出根据本文所述的各种实施例的计算机系统的框图。
图11示出根据本文所述的各种实施例的示例性仪器的框图。
具体实施方式
本说明书以及示出示例性实施例的附图不应视为是限制性的。在不脱离本说明书和权利要求书的范围(包括等同形式)的前提下，可以进行各种机械、组成、结构、电和操作改变。在一些情况下，未详细示出或描述众所周知的结构和技术，以免使本发明难以理解。两个或更多个附图中类似的标号表示相同或相似的元件。此外，参考一个实施例详细描述的元件及其相关特征可以在任何可行的情况下包括在其中没有明确示出或描述它们的其他实施例中。例如，如果一种元件参考一个实施例详细描述而没有参考第二个实施例进行描述，则该元件可以仍被声称为包括在第二个实施例中。
在本说明书和所附权利要求中，除非另有说明，否则表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求中使用的其他数值在所有情况下都应理解为使用“约”一词进行修饰(如果它们未经修饰的话)。因此，除非指明是相反情况，否则下文说明书和所附权利要求中提出的数值参数是可能根据所寻求获得的所需特性而改变的近似值。至少，而且并非试图将等同原则的适用范围限制在权利要求书的范围内，每个数值参数至少应该根据所报告有效数字的数量，通过应用普通舍入技术来解释。
应注意，除非明确地并且好不含糊地限于一个指示物，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在非限制性的，使得对列表中项目的表述并不排除可被替换或添加至所列项目的其他类似项目。
如本文所用，术语“生物样本”或“样本”意指包含本文描述或暗示的本发明的各种实施例的使用者、制造商或经销商感兴趣的一种或多种生物分子、化学品、组分和/或化合物(例如，核酸、DNA分子或RNA分子)的材料或物质或溶液。样本可以包括但不限于DNA序列(包括无细胞DNA)、RNA序列、基因、寡核苷酸、氨基酸序列、蛋白质、生物标志物或细胞(例如，循环肿瘤细胞)或任何其他合适的靶生物分子中的一者或多者。如本文所用，术语“样本溶液”是指包含至少一个样本的液体或流体。
如本文所用，术语“试剂”是指包含与样本结合使用以便促进生物测定、测试、处理或实验(例如，PCR测定、测试、处理或实验)的化学品或化合物的材料或物质(例如，呈固体和/或液体形式)。试剂可包含至少一种核苷酸、至少一种寡核苷酸、至少一种引物、至少一种聚合酶、至少一种盐、至少一种缓冲剂、至少一种染料(例如，对照染料和/或结合染料)、至少一种标记物、至少一种探针、至少一种增强剂、至少一种酶、至少一种洗涤剂和/或至少一种封闭剂的组合。试剂可包含至少一种主混合物(MMx)，该主混合物包含例如至少一种聚合酶、至少一种核苷酸、至少一种盐、至少一种缓冲剂、至少一种染料(例如，对照染料和/或结合染料)和/或至少一种增强剂。在一些情况下，MMx可包括一种或多种DNA结合染料(例如，SYBR染料)或其他化学品。
如本文所用，术语“反应溶液”、“反应混合物”和“反应构建”(reaction build)是指包含生物样本和一种或多种试剂两者的溶液或混合物。反应溶液、反应混合物或反应构建可与PCR(例如，qPCR、dPCR、多重dPCR)、胎儿诊断、病毒检测、量化标准物、基因分型、测序、测序验证、突变检测、转基因生物检测、罕见等位基因检测和/或拷贝数变异等中的一者或多者结合使用。
如本文所用，“指标”意指由样本产生的物理、电、磁、化学和/或光学性质或光学效应，其可以用于确定靶核酸是否存在和/或测定、测量或估计靶核酸的量。指标可以包括发光(例如，荧光、化学发光、生物发光)、颜色、透射率、不透明度、反射率、或极化、pH、电荷、表面电势、电流或电压变化中的一者或多者。
如本文所用，术语“扩增产物”意指通过扩增测定或过程产生的任何产物，例如，在PCR测定或过程中(例如，在qPCR或dPCR测定或过程中)产生的数量增加的靶核酸分子或其他核酸分子。如本文所用，“扩增指标”意指由样本产生的物理、电、磁、化学和/或光学性质或光学效应，其可以用于在生物测定、测试、处理或实验(例如，PCR测定、测试、处理或实验)中确定靶核酸扩增是否存在和/或测定、测量或估计靶核酸扩增的量。扩增指标可以包括发光(例如，荧光、化学发光、生物发光)、颜色、透射率、不透明度、反射率、或极化、pH、电荷、表面电势、电流或电压变化中的一者或多者。
聚合酶链反应(PCR)可以包含热循环过程，其中使用加热和冷却循环来提供核酸解链和核酸酶促复制的重复循环。许多PCR方法使用热循环，该热循环包括将PCR样本交替加热和冷却至一系列确定的温度步骤。这些热循环步骤可首先用于在称为解链的过程中在高温下物理分离核酸，例如分离核酸双螺旋中的两条链。在较低温度下，然后将每条链用作聚合酶合成中的模板以在退火阶段和延伸阶段选择性地扩增靶分子。示例性聚合酶包括热稳定的聚合酶，例如Taq聚合酶。PCR的选择性来源于在特定的热循环条件下使用与待扩增的核酸区域互补的引物。引物(短核酸片段)包含与靶区域互补的序列以及聚合酶，用于实现选择性和重复扩增。
参见图1A，在本发明的某些实施例中，用于检测或定量样本或样本溶液中的核酸的系统或仪器10包括基座和/或外壳20。基座和/或外壳20包括或者被构造成用于接收、容纳或保持反应装置25。反应装置25包括或者被构造成用于提供多个样本反应体积30，所述多个样本反应体积30接收、容纳、保持和/或分离样本或样本溶液的全部或一部分。任选地，系统10还可包括温度控制器35诸如热循环仪等(例如，用于执行qPCR测定)。
另外参见图10，系统10还可包括计算机系统1000。根据各种实施例，可以配置或采用计算机系统1000来执行处理功能，其中可以利用温度控制器35(当存在时)。计算系统1000可包括一个或多个处理器，诸如处理器或电子处理器1004。例如，处理器1004可使用通用或专用处理引擎，诸如微处理器、控制器或其他控制逻辑部件以实施。
在某些实施例中，执行数字扩增技术。例如，数字扩增技术可以包括数字PCR(dPCR)测定、处理、实验或测试，其中样本或反应溶液被分离、分散或分配成与反应装置、流体装置、样本固持器或其他此类装置相关联的多个样本反应体积或反应位点。所述多个样本反应体积可包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，其中第一多个样本反应体积各自包含一个分子或大约一个分子，并且第二多个样本反应体积各自不包含靶核酸分子。所述多个样本反应体积或反应位点经受扩增测定，该扩增测定使用例如至少一种引物或一种探针或指示染料，其中扩增测定被构造成用于扩增靶核酸。在dPCR测定过程中，可以检测或测量存在于任意多个样本反应体积中的靶标的指标。类似于其他类型的PCR，dPCR可通过将分隔的样品反应体积暴露于设计用于扩增靶核酸的扩增测定中而进行，所述分隔的样品反应体积包含用于扩增的试剂。例如，可以执行热循环，使得模板核酸在反应体积内扩增，该反应体积包括模板核酸分子的一个初始拷贝或大约一个拷贝。
为了定量核酸扩增，可以检测反应体积所表现出的扩增指标。在根据本发明的一些示例性实施例中，可以使用一种或多种荧光染料或探针，使得所述染料或探针与核酸结合并且表现出荧光以指示核酸的存在。
例如，扩增的靶核酸可使用可检测的核酸结合剂进行检测，所述可检测的核酸结合剂可为例如插入剂或非插入剂。如本文中所用，插入剂是能够非共价插入到双链核酸分子的堆叠碱基对之间的试剂或部分。非插入剂是不插入到双链核酸分子中的试剂。核酸结合剂可直接地或间接地产生可检测信号。该信号可使用例如荧光或吸光度直接地可检测，或使用例如可检测地受与双链核酸的接近性影响的任何合适的部分或配体间接地可检测，例如连接到核酸结合剂的被取代的标记部分或结合配体。核酸结合剂在结合到双链核酸时通常产生可与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。举例来说，例如溴化乙锭的插入剂在插入到双链DNA中时发出的荧光比在结合到单链DNA、RNA或在溶液中时强烈(参见例如美国专利号5,994,056；6,171,785；和6,814,934)。相似地，放线菌素D在结合到单链核酸时发出红色荧光，并且在结合到双链核酸时发出绿色荧光。并且在另一个实例中，已经报道了光反应性的补骨脂素4-氨基甲基-4-5',8-三甲基补骨脂素(AMT)在插入到双链DNA中之后表现出在长波长下的吸收和荧光减少(Johnston etal.Photochem.Photobiol.33:785-791(1981)(Johnston等人，《光化学和光生物学》，第33卷第785-791页(1981年)))。例如，美国专利号4,257,774描述了荧光插入剂(例如，乙锭盐、道诺霉素(daunomycin)、麦帕克林(mepacrine)和吖啶橙、4',6-二脒基-α-苯基吲哚)与DNA的直接结合。非插入剂(例如，小沟结合物诸如赫斯特33258、偏端霉素(distamycin)、纺锤菌素(netropsin))也可以是适用的。例如，赫斯特33258(Searle,et al.Nucleic AcidsRes.18:3753-3762(1990)(Searle等人，《核酸研究》，第18卷第3753-3762页(1990年)))随靶标量的增加而表现出改变的荧光。示例性可检测DNA结合剂可以包括例如吖啶衍生物(例如，吖啶同型二聚体、吖啶橙、吖啶黄、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、原黄素)、放线菌素(例如，放线菌素D(Jain,et al.J.Mol.Biol.68:1-10(1972)(Jain等人，《分子生物学杂志》，第68卷第1-10页(1972年))，7-氨基-放线菌素D(7-AAD))、安曲霉素、金胺、苯胺蓝(azure B)、BOBOTM-1、BOBOTM-3、BO-PROTM-1、BO-PROTM-3、色霉素(例如，A3)、结晶紫、花青染料、DAPI(et al.Nucleic Acids Res.6:3519-3534(1979)(/>等人，《核酸研究》，第6卷第3519-3534页(1979年)))、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、道诺霉素偏氨霉素(例如，偏端霉素D)如美国专利号7,387,887中所述的染料、玫瑰树碱、乙锭盐(例如，溴化乙锭、乙锭均二聚体-1、乙锭均二聚体-2、二氢乙锭(也称为氢化乙锭)、单叠氮乙锭)、氟香豆素，如美国专利号4,257,774中所述的荧光嵌入剂，/>(美国缅因州罗克兰的康伯司生物科学罗克兰公司(Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.))、碘化己锭(hexidium iodide)、赫斯特33258(Searle等人(如上))、赫斯特33342、赫斯特34580、乙菲啶(homidium)、羟芪巴脒、JO-JO-1、JO-PROTM-1、LDS 751、LOLO-1、LO-PROTM-1、孔雀石绿、麦帕克林(mepacrine)、光神霉素、纺锤菌素、尼氏物质(Nisslsubstance)、4’,6-二脒基-α-苯基吲哚、原黄碱、POPOTM-1、POPOTM-3、PO-PROTM-1、碘化丙锭、钌多吡啶基、塞夫隆染料(Sevron dye)(例如，亮红2B、亮红4G、亮红B、橙、黄L)、SYBR 101、SYBR 102、SYBER 103、/>金、/>绿I(美国专利号5,436,134和5,658,751)、绿II、/>蓝、/>绿、/>橙、/>1、/>11、13、/>14、/>15、/>16、/>17、/>18、/>20、21、/>22、/>23、/>24、/>25、/>40、/>43、44、/>45、/>59、/>60、/>61、/>62、/>63、64、/>80、/>81、/>82、/>83、/>84、/>85、噻唑橙(美国威斯康星州密尔沃基的奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.))、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-2、TOTOTM-3、 YOYO-1以及/>(美国俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)，等等。
绿I(参见例如美国专利号5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927)例如已被用于通过在存在染料的情况下扩增靶序列来监测扩增(例如，PCR)反应，用被染料吸收的波长的光激发生物样本并且检测生物样本发射的光。应该理解，使用/>绿染料作为示例给出，并且许多此类染料可用于本文所述的方法中。如本领域的技术人员将了解，其它核酸结合剂也可以是合适的。
在某些实施例中，在数字扩增测定中检测或测量扩增指标可以在扩增反应的终点处执行。可以在完成一个或多个热循环后，在环境温度下检测或测量数字扩增。在其他时间(诸如在扩增过程中和/或解链阶段)检测扩增的指标以便更好地测定产生的扩增子可能是有利的。
图1B示出的图示出本发明所设想的各种扩增检测方案，例如在扩增测定过程中或扩增后(即，扩增测定完成后)。例如，控制dPCR扩增的反应位点或反应体积所表现出的扩增指标可以在这些反应位点或反应体积中的每个中经受检测。如图1B，检测点102对应于上述环境温度下的终点检测。
在一个示例性实施例中，可通过实时检测方案来监测反应位点中发生的扩增指标，该实时检测方案在dPCR扩增测定过程中采集检测数据。例如，可以在热循环过程或程序期间的预定点处(例如，在热循环过程或程序的一个或多个循环的预定温度下)获得每个反应位点的检测数据。图1B中的检测点104以图形方式示出扩增过程中此类实时检测的采集过程。如图所示，在这种实时技术下，扩增指标的检测依靠在相同温度例如60℃下的多个PCR热循环采集的检测数据。在至少一个示例性实施例中，在PCR循环的总数的每个循环中发生实时检测。在其它示例性实施例中，根据预先确定的循环模式(基于用于扩增或任何其他合适的循环的试剂)，实时检测发生在循环的子集期间(例如，预先确定的子集、用户可选择的子集或基于检测结果的动态子集)。
在一个示例性实施例中，本发明设想在执行了扩增测定和端点读数后对反应位点执行解链阶段。在此类解链阶段，在预先确定的时间内以恒定速率加热反应位点中的样本反应体积，并检测扩增指标的变化。例如，可以在一段时间诸如10分钟、15分钟、30分钟、1小时或任何其他合适的时间段内以恒定速率加热多个样本反应体积。在加热过程中，可以检测样本反应体积中扩增指标的变化，并且可以识别指标的变化。例如，在加热过程中，核酸分子的键可以断开以导致离解。该离解可以触发表现出的扩增指标的变化(减小)。
使用各种解链阶段检测技术的各种示例性扩增后测量如图1B中的106、018和110中所示。检测点106包括预先确定的温度诸如60℃下的单点检测，其中检测发生在扩增后的解链阶段。例如，随着每个反应体积中的样本的温度升高至60℃，可以检测每个反应体积所表现出的扩增指标并确定其变化。检测点108对应于在多个预先确定的目标温度下的间隔检测，例如从60℃开始并且随着加热继续而处于特定的更高温度下。检测点110对应于解链阶段预先确定的时间内的快速检测技术。
在示例性实施例中，检测点102的结果可以与检测点104、检测点106、检测点108和/或检测点110的结果中的一者或多者结合。可以对组合的结果进行分析，以改善或增强dPCR检测或测定结果的准确度。例如，组合的结果可用于校正或消除由感兴趣的目标物(例如，由引物二聚体产生)以外的物质或分子产生的对指标信号的贡献。应当理解，并非所有的各种技术104、106、108、110都需要执行以改善或增强dPCR测定结果的准确度，而是可以利用一种或多种技术并以各种组合来帮助改善或增强dPCR扩增检测或测定结果的准确度。
图2A、图2B、图3A、图3B和图3C示出各种示例性方法，这些方法可用于基于如图1B所示的检测技术中的一者或多者采集的数据来定量分析靶核酸的dPCR扩增。
图2A-2B示出根据本发明的实施例用于执行dPCR的示例性方法。本文所述的方法可采用各种不同的反应装置来执行，所述反应装置包括但不限于：样本芯片、电子芯片、电路板、TLDA卡、游离溶液中的小滴、平坦表面上的小滴、温度梯度上的小滴、毛细管或流动系统中的小滴、具有单独腔室的微流体装置、384孔或更高密度的微量滴定板、反应孔阵列、基底中的通孔阵列或任何其他合适的反应装置。该方法可包括如本领域的普通技术人员所熟知的用于dPCR的任何检测技术(例如，光学检测或电检测)。可用于实施本文所述的dPCR检测方法的各种示例性装置如下文所详述。
在图2A的202A处，样本被分离、分散或分配到多个样本反应体积中。例如，多个样本反应体积可以被分离，使得第一多个样本反应体积包含靶核酸的至少一个分子，并且第二多个样本反应体积不含靶核酸的分子。样本可以通过稀释过程被分离，使得每个样本反应体积包含靶核酸的一个拷贝、靶核酸的大约一个拷贝或者不含靶核酸的拷贝。在一个实施例中，分离的样本反应体积可包括用于扩增靶核酸分子的一种或多种试剂。可以在分离之前或分离之后，将一种或多种试剂结合、混合或添加至样本中。
在一个示例性实施例中，多个样本反应体积可以分散到图9的样本固持器900等上，如下文所详述，尽管可以使用各种其他反应装置来分离样本反应体积或实施如本文所述和/或本领域中已知的扩增检测技术。因此，样本反应体积可以分散在样本固持器900的多个反应位点(例如，通孔或孔)之间。
在204A处，对多个样本反应体积进行扩增测定。例如，多个样本反应体积可以同时经受扩增测定，其中扩增测定被设计用于扩增靶核酸以产生扩增产物(即，一个或多个扩增子)。该测定可以利用至少一种引物、探针和/或染料以及一种酶，诸如TaqmanTM测定或任何其他合适的测定，如本领域的普通技术人员所熟知的。因此，样本反应体积包含样本部分和用于扩增和检测的试剂。
在一些实施例中，测定可包括两种探针，诸如FAMTM染料标记的探针和染料标记的探针，并且可利用基于每种染料的扩增检测测量以便测定扩增的一种或多种靶核酸的量。例如，基于每种染料标记的探针，样本反应体积可以表现出多种扩增指标。测定还可包括多种引物，诸如/>引物。在一个实施例中，一种/>引物可以与靶序列重叠(即，针对特定等位基因的引物)，而一种/>引物可以不与靶序列重叠(即，针对特定位点的引物)。一些具体实施可利用标准引物而非用于针对特定位点的引物的/>引物。在一些实施例中，可以使用多重测定，其中针对多个等位基因的引物可以生成具有单个针对特定位点的引物的扩增子。
在一些实施例中，测定可以包括具有针对特定靶标的3'域和针对非靶标的5'尾巴的引物以生成具有经调节的目标解链温度的扩增子。在另一个实例中，测定可以包括具有针对特定靶标的3'域和通用5'尾巴的引物以生成具有经调节的目标解链温度的扩增子。在该实例中，测定制剂可以利用通用引物，使得初始扩增由针对特定靶标的域(例如，针对特定靶标的3'域)引起，而进一步扩增可由通用引物引起。这些扩增子随后可以通过目标解链温度得到区分。在一些实施例中，测定可以包括引物，这些引物被设计用于识别扩增反应，该扩增反应涉及正常(野生型)核酸和非正常(突变型)核酸。测定还可以包括因为，这些因为被设计用于识别特定类型的突变体(即，单核苷酸多态性(SNP)和扩增子内位点的插入缺失)。例如，识别可以基于用于产生的扩增子的目标解链温度。在一些实施例中，已知的加标浓度的使用也可以用于识别。各种实施例可以利用引物、非/>(标准)引物或任何合适的组合。
在一个示例性实施例中，经受扩增测定的多个样本反应体积可以经受多个PCR步骤，诸如热循环，如本文所述。例如，样本反应体积的温度可以提高以物理分离靶核酸的链(即，核酸分子的链)。然后可以降低温度，并且每条链可以用作通过酶(即聚合酶)合成的模板以选择性扩增靶核酸，例如在PCR过程的退火和延伸阶段。在一个实施例中，可以执行多个PCR循环，导致靶核酸分子的扩增。
在206A处，可以检测或测量多个样本反应体积所呈现的扩增指标。例如，扩增指标可以由控制核酸分子的扩增(例如，靶核酸分子的扩增)的多个样本反应体积中的每个呈现出来。
在一个实施例中，可以使用一种或多种染料，所述染料在结合到双链核酸时发荧光，并且这种荧光可作为扩增指标进行检测。例如，核酸结合剂(染料)在结合到双链核酸时可以产生能够与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。可以使用荧光检测器例如安装在容纳分离的样本反应体积的芯片上的荧光检测器来检测荧光，或者可以以任何其他合适的方式进行检测。
在一个示例性实施例中，可以检测第一温度下多个反应体积中的每个的扩增指标。例如，对扩增指标的初始检测可以发生在反应体积处于第一温度时，该第一温度根据各种示例性实施例可以为环境温度。图4示出示例性、假想性检测结果的图。样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)可以用y轴上的“特性”属性来表示，并且温度可以用x轴来表示。因此，在环境温度下检测的由反应体积呈现的扩增指标在图4的图中示出。
在208A处，执行解链阶段，例如在停止204A处的扩增测定之后来执行。在解链阶段，可以在预先确定的时间内以恒定速率加热多个样本反应体积，并且基于加热来识别样本反应体积的指标的变化。例如，可以在一段时间诸如10分钟、15分钟、30分钟、1小时或任何其他合适的时间段内以恒定速率加热多个样本反应体积。在加热过程中，可以检测样本反应体积中扩增指标(例如，荧光)的结果，并且可以识别指标的变化。例如，在样本反应体积的加热过程中，核酸分子的键可以断开以导致离解。该离解触发了样本反应体积所表现出的扩增指标的变化(例如，减小)。例如，在结合到双链核酸分子时发荧光以产生扩增指标的一种或多种染料可以在分离发生离解时停止产生此类指标(或产生较少的指标)。
在一个实施例中，可以在解链过程中的一系列间隔处检测样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)。如上文所述，图1B的检测点108示出此类间隔检测方案，并且图4还示出例示性、假想性示例性检测结果的图，其中可以在各种目标温度下对指标进行检测。在一个实施例中，目标温度可以基于温度间隔(例如，5℃、10℃等)，或者可以为一组预先确定的目标温度。在图4中，目标温度包括55℃、65℃、75℃、85℃和95℃。在每个目标温度下，可对多个反应体积的每一者中的反应进行检测，使得可以识别扩增指标的变化。例如，可以对环境温度下检测的结果(例如，初始检测)与在55℃下检测得到的结果进行比较。比较结果表明，来自多个反应体积的一组样本反应体积在环境温度和55℃(例如，在解链开始时)之间表现出扩增指标的下降。相似地，在目标温度55℃和65℃、65℃和75℃、75℃和85℃以及85℃和95℃下检出的结果之间的比较表明，样本反应体积的扩增指标降低。
在一个实施例中，可以在解链过程中快速检测样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)的结果。例如，检测可以以间距密集的间隔发生，使得可以生成连续的数据函数。如上文所述，图1B的检测点110示出此类快速检测方案。在分析快速检测的结果时，可以确定由多个反应体积表现出的指标的趋势。例如，分析显示出一种趋势，即来自多个反应体积的一组样本反应体积随着解链继续而表现出扩增指标的减小(例如，反应体积的温度提高)。趋势可类似于通过在解链期间的间隔检测过程中比较所确定的结果。在一个实例中，类似于间隔检测方法的目标温度的温度之间的趋势，诸如环境温度和55℃、55℃和65℃、65℃和75℃、75℃和85℃以及85℃和95℃之间，可基于分析来确定。
在一个示例性实施例中，快速检测也可以识别特定温度下(例如，除间隔检测的目标温度以外的温度)的趋势。例如，在解链过程中，温度(或温度窗口)可触发由反应体积表现出的指标的显著变化(例如，超出阈值的变化)。快速检测能够通过分析指标的变化来识别这些温度或温度窗口。因此，快速检测方法可以为分析提供更高的灵敏度。
在210A处，靶核酸的扩增可基于初始检测的指标以及所检出的指标的变化来定量。例如，反应体积在环境温度下表现出的指标可以指示每个反应体积在PCR过程中发生的扩增的程度。然而，并非所有检出的扩增产物均为靶核酸的扩增的结果。换句话讲，反应体积在环境温度下呈现的指标可以指示除靶核酸以外的来源的扩增，或者可以由一些其他来源触发，但错误地被检测为靶核酸的扩增产物。此类错误检测的扩增产物可包括例如引物二聚体、错掺、灰尘/碎屑、样本核酸或其他各种来源。如本文所用，术语“错误的扩增产物”意指由并非靶核酸的核酸分子产生的扩增产物。解链的执行和所检测的结果的后续分析能够鉴定并非期望的靶核酸的扩增的结果的指标。在考虑与一些其他来源相关的指标后，能够以更高的准确度对靶核酸的扩增进行定量。
在一个实施例中，单点检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点106所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)和用于单点检测的预先确定的温度下(例如，检测点106)的检测结果来确定。图4中所识别的变化402中的一者可包括基于单点检测所识别的变化。
例如，在该温度下检出的变化可包括进一步分离表现出由核酸扩增触发的扩增指标的反应体积与不具有此类扩增指标的反应体积。表现出一些扩增指标的反应体积可以发生减小，使得结果的背景噪音降低。例如，在使用染料诸如SYBR染料(或其他嵌入染料)产生扩增指标时，由于染料的非特异性设计，染料可以与各种反应产物(例如，核酸)结合。因此，背景噪音(例如，荧光)可以由结合到并非反应产物的anilities或者结合到并非预期的反应产物的产物的染料引起。在一个实施例中，表现出扩增指标的反应体积可以基于进一步分离与不表现出扩增指标的反应体积区分开，并且靶核酸的扩增可以基于辨别的反应体积得到更准确的定量。
在一个实施例中，间隔检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点108所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)和用于间隔检测的预先确定的温度下(例如，检测点108)的检测结果来确定。
在一个实施例中，可以分析所识别的多个反应体积的指标的变化，以确定由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标。例如，基于特定的靶核酸，可以确定预期解链温度(或预期解链温度范围)，使得预期靶核酸将在该温度下发生解链。因此，反应体积基于靶核酸的扩增所表现出的指标预期将在预期解链温度或温度范围内减小(例如，预期反应体积表现出的荧光在预期解链温度下将降低)。预期解链温度可以对于靶核酸、扩增过程中所用的扩增测定、特定引物以及任何其他合适的扩增因素具有特异性。在一个实例中，可以使用经验分析来确定靶核酸(使用特定扩增测定进行扩增)的预期解链温度(例如，可以对扩增的靶核酸分子加热直至离解，并且发生离解的温度可以为解链温度)。
在一个实施例中，在解链的执行过程中，可以在各种温度间隔下进行指标检测。图4示出基于间隔的温度的例示性、假想性示例性检测结果的图。在一个实例中，此处靶核酸的预期解链温度可以包括70℃，或者预期解链温度范围可以包括65℃至75℃。
在温度75℃下检测所识别的变化404可以指示由靶核酸的扩增所触发的指标的变化。由于靶核酸的预期解链温度包括70℃或介于65℃至75℃之间的范围，在75℃下检测的指标的减小对应于由靶核酸的扩增所触发的指标。例如，指标406示出由反应体积表现出的一个或多个指标，其中在75℃下检测期间，指标减小(例如，荧光降低)。因此，定量多个反应体积在65℃和75℃之间表现出的指标减小(例如，所识别的变化404)能够对由dPCR扩增得到的扩增子进行定量(扩增的靶核酸的量)。
在温度85℃下检测所识别的变化408可以指示由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标的变化。由于靶核酸的预期解链温度包括70℃或介于65℃至75℃之间的范围，在85℃下检测的指标的减小对应于由其他来源触发的指标。在温度95℃下检测的指标410也对应于由靶核酸序列的扩增以外的来源触发的指标。在此类高温下，预期核酸将解链，因此指标410可以对应于来源如灰尘，或可能导致指标持续超过特定温度阈值的一些其他来源。
在一个实施例中，在解链的执行过程中，还可以代替设定值间隔检测或除设定值间隔检测之外快速检测指标。例如，快速检测方案可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点110所示。通过这种方式，所识别的变化可基于环境温度下的检测结果(例如，检测点102)和解链温度范围内快速检测的结果(例如，检测点110)来确定。
类似于间隔检测分析，在各种温度下识别的多个反应体积的指标变化可以与靶核酸的预期解链温度进行比较。例如，在靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下表现出变化(例如，下降)的指标可以对应于除靶核酸扩增以外的来源(例如，这些指标可以由靶核酸扩增以外的来源触发)。另一方面，在靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)下表现出变化(例如，下降)的指标可以对应于靶核酸扩增(例如，这些指标可以由靶核酸扩增触发)。
在一个实施例中，基于在解链阶段检出的指标的变化，可以对由扩增过程引起的靶核酸的扩增产物的量进行定量。例如，扩增产物的量可以与预期解链温度(或预期解链温度范围)下检出的指标的变化(例如，检出的荧光的降低)成正比。在一个实施例中，定量可以基于识别由靶核酸扩增以外的来源触发的指标。例如，可以确定在预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下表现出变化(例如，下降)的指标对应于靶核酸扩增以外的来源。因此，在定量靶核酸的扩增时，这些指标可能得到低估。
在一个实施例中，预期解链温度(或预期解链温度范围)下检出的指标的变化可以确认预期扩增，并且靶核酸的扩增可基于这些确认的指标进行定量。例如，Poisson模型可以与样本反应体积的总数和非扩增样本反应体积的总数(使用预期解链温度下的指标变化进行区分)一起使用，以计算每个样本反应体积的平均反应次数。结果可除以每个样本反应体积的平均体积，对于在预期解链温度或温度范围下解链的反应产物，得到单位体积的拷贝数。
图2B示出根据本发明的至少一个示例性实施例使用多重执行数字扩增(dPCR)的一种示例性方法。本文所述的方法可以用样本芯片、包括通孔的电路板、或用本领域的普通技术人员所熟悉的用于dPCR的任何其他合适的装置和检测方案来执行。
在图2B的202B处，样本被分离、分散或分配到多个样本反应体积中。在一个示例性实施例中，样本可以包含两种或多种不同的靶核酸。例如，该方法的dPCR过程可以包括多重扩增，使得对多于一种靶核酸进行扩增。多个样本反应体积可以被分离，使得第一多个样本反应体积包含一种靶核酸的至少一个分子，并且第二多个样本反应体积不含靶核酸的分子。样本可以通过稀释过程被分离，使得每个样本反应体积包含核酸模板或靶标的一个拷贝、大约一个拷贝或者不含核酸模板或靶标的拷贝。在一个实施例中，分离的样本反应体积可以包括用于扩增一种或多种靶核酸分子的多种试剂。可以在分离之前或分离之后将试剂结合到样本中。
在一个示例性实施例中，多个样本反应体积可以分散到类似于图9的样本固持器900的样本固持器上，如下文所详述。因此，样本反应体积可以分散在芯片900的多个反应位点(例如，多个孔或通孔)之间。在一个实施例中，电路板可以包括多个通孔，并且多个样本反应体积可以分散在多个通孔之间。
再次参见图2B，在204B处，对多个样本反应体积进行扩增测定。例如，多个样本反应体积可以同时经受多重扩增测定，其中多重扩增测定被设计用于扩增多种靶核酸以产生扩增产物(即，一个或多个扩增子)。多重测定可以包括至少一种探针、一种引物和一种酶，诸如TaqmanTM测定或任何其他合适的测定。在一个示例性实施例中，多重测定包括对于多种类型的靶核酸中的每个具有特异性的试剂(例如，引物和/或探针)，使得每个靶核酸序列在存在于反应位点中时，可以通过暴露于测定而被扩增。多重测定的试剂(例如，引物和/或探针)可以被设计成使得每种靶核酸被扩增，并且所得的扩增子随后可以基于目标解链温度加以区分。在一些情况下，扩增子预期的目标解链温度可以基于用于扩增靶核酸的设计的引物对。多重测定可以被设计用于两种、三种、四种或更多靶核酸，并且所得的扩增子可基于解链结果加以区分，如本文所述。
在一些实施例中，多重测定可包括两种探针，诸如FAMTM染料标记的探针和染料标记的探针，并且可利用基于每种染料的扩增检测结果以便测定扩增的一种或多种靶核酸的量。例如，基于每种染料标记的探针，样本反应体积可以表现出多种扩增指标。多重测定还可包括多种引物，诸如/>引物。在一个实施例中，一种/>引物可以与靶序列重叠(即，针对特定等位基因的引物)，而一种/>引物可以不与靶序列重叠(即，针对特定位点的引物)。一些具体实施可利用标准引物而非用于针对特定位点的引物的/>引物。在一些实施例中，可以使用多重测定，其中针对多个等位基因的引物可以生成具有单个针对特定位点的引物的扩增子。
在一些实施例中，多重测定可以包括具有针对特定靶标的3'域和针对非靶标的5'尾巴的引物以生成具有经调节的目标解链温度的扩增子。在另一个实例中，多重测定可以包括具有针对特定靶标的3'域和通用5'尾巴的引物以生成具有经调节的目标解链温度的扩增子。在该实例中，测定制剂可以利用通用引物，使得初始扩增由针对特定靶标的域(例如，针对特定靶标的3'域)引起，而进一步扩增可由通用引物引起。这些扩增子随后可以通过目标解链温度得到区分。在一些实施例中，多重测定可以包括引物，这些引物被设计用于识别扩增反应，该扩增反应涉及正常(野生型)核酸和非正常(突变型)核酸。测定还可以包括因为，这些因为被设计用于识别特定类型的突变体(即，SNP和扩增子内位点的插入缺失)。例如，识别可以基于用于产生的扩增子的目标解链温度。在一些实施例中，已知的加标浓度的使用也可以用于识别。各种实施例可以利用引物、非/>(标准)引物或任何合适的组合。在一个实施例中，经受多重扩增测定的多个样本反应体积还可以经受多个扩增步骤，诸如热循环，如本文所述。例如，样本反应体积的温度可以提高以物理分离靶核酸的链(即，核酸分子的链)。然后可以降低温度，并且每条链可以用作通过酶(即聚合酶)合成的模板以选择性扩增靶核酸，例如在扩增过程的退火和延伸阶段。在一个实施例中，可以执行多个扩增循环，导致靶核酸分子的扩增。
在206B处，可以检测或测量多个样本反应体积所呈现的扩增指标。例如，扩增指标可以由控制核酸分子的扩增(例如，靶核酸分子中的一者的扩增)的多个样本反应体积中的每个呈现出来。
在一个实施例中，可以使用一种或多种染料，所述染料在结合到双链核酸时发荧光，并且这种荧光可作为扩增指标进行检测。例如，核酸结合剂(染料)在结合到双链核酸时可以产生能够与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。可以使用荧光检测器例如安装在容纳分离的样本反应体积的芯片上的荧光检测器来检测荧光，或者可以以任何其他合适的方式进行检测。在一个示例性实施例中，可以在第一温度下检测多个反应体积呈现的扩增的一个或多个指标。例如，初始检测可以包括在反应体积处于第一温度时的多个样本反应体积扩增的指标，根据各种示例性实施例，所述第一温度可以是环境温度。图1B的检测点102可示出在环境温度下由多个反应位点呈现的指标的检测。
在208B处，执行解链阶段，例如在停止204A处的扩增测定之后来执行。在解链阶段，在预先确定的时间内以恒定速率加热多个样本反应体积，并且基于加热来识别多个样本反应体积的指标的变化。例如，可以在一段时间诸如10分钟、15分钟、30分钟、1小时或任何其他合适的时间段内以恒定速率加热多个样本反应体积。在加热过程中，可以检测多个样本反应体积中扩增指标(例如，荧光)的结果，并且可以识别指标的变化。
在一个实施例中，可以在解链过程中的一系列间隔处检测多个样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)。图1B的检测点108示出此类间隔检测算法。在一个实施例中，指标可以在基于温度间隔的各种目标温度下(例如，5℃、10℃等)或者在预先确定的一组目标温度下进行检测。在每个目标温度下，可对多个反应体积的每一者中的反应进行检测，使得可以识别扩增指标的变化。例如，结果可以类似于图4中单定位点数字扩增所示的检测结果。
在一个实施例中，可以在解链过程中快速检测多个样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)的结果，使得可以生成连续函数。图1B的检测点110示出此类快速检测算法。在分析快速检测的结果时，可以确定由多个反应体积表现出的指标的趋势。例如，分析显示出一种趋势，即来自多个反应体积的一组样本反应体积随着解链继续而表现出扩增指标的减小(例如，反应体积的温度提高)。趋势可类似于通过在解链期间的间隔检测过程中比较所确定的结果。
在210A处，靶核酸的扩增可基于初始检测的指标以及所检出的指标的变化来定量。例如，反应体积在环境温度下表现出的指标可以指示在扩增过程中每个反应体积中发生的扩增的程度，但是并非所有检出的扩增产物都是靶核酸中的一者的扩增结果。换句话讲，反应体积在环境温度下呈现的指标可以指示除靶核酸中一者以外的来源的扩增，或者可以由一些其他来源触发，但错误地被检测为扩增产物。此类错误检测的扩增产物可包括例如引物二聚体、错掺、灰尘/碎屑或其他各种来源。
此外，在一个示例性实施例中，由靶核酸中的一者的扩增所触发的反应位点所表现出的扩增指标无法基于扩增的特定靶核酸进行识别。换句话讲，在多重数字扩增过程中，由预期扩增子触发的扩增指标对于靶核酸中的一者不具有特异性，因此无法确定触发扩增指标的靶核酸。解链的执行和所检测的结果的后续分析能够识别并非靶核酸的扩增结果的指标并且识别对于多种靶核酸中的每一者具有特异性的指标。在考虑与一些其他来源相关的指标后，能够以更高的准确度对每种靶核酸的扩增进行定量。
在一个实施例中，间隔检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点108所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)和用于间隔检测的预先确定的温度下(例如，检测点108)的检测结果来确定。
在一个实施例中，可以分析所识别的多个反应体积的指标的变化，以确定由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标。例如，基于特定的靶核酸，可以确定预期解链温度(或预期解链温度范围)，使得预期扩增靶核酸将在该温度下发生解链。因此，反应体积基于靶核酸的扩增所表现出的指标预期将在预期解链温度或温度范围中的一者下减小(例如，预期反应体积表现出的荧光在预期解链温度中的一者下将降低)。
在一个实例中，第一类型的靶核酸的预期解链温度可以为60℃，或者预期解链温度范围为55℃至65℃，并且第二类型的靶核酸的预期解链温度可以为70℃，或者预期解链温度范围可以为65℃至75℃。因此，在60℃下或介于55℃至65℃之间识别的扩增指标的变化可以指示由第一类型的靶核酸的扩增所触发的指标的变化。相似地，在70℃下或介于65℃至75℃之间识别的扩增指标的变化可以指示由第二类型的靶核酸的扩增所触发的指标的变化。在其他温度或温度范围内识别的指标变化可以指示由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标的变化。
在一个实施例中，在解链的执行过程中，还可以代替设定值间隔检测或除设定值间隔检测之外快速检测指标。例如，快速检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点110所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)的检测结果和解链温度下(例如，检测点110)快速检测的结果来确定。
类似于间隔检测分析，在各种温度下识别的多个反应体积的指标变化可以与多种靶核酸的预期解链温度进行比较。例如，在靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下表现出变化(例如，下降)的指标可以对应于除靶核酸扩增以外的来源(例如，这些指标可以由靶核酸扩增以外的来源触发)。另一方面，在靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)下表现出变化(例如，下降)的指标可以对应于靶核酸扩增(例如，这些指标可以由靶核酸扩增触发)。
在一个实施例中，基于在解链过程中检出的指标的变化，可以对由扩增过程引起的靶核酸的扩增产物进行定量。例如，第一类型靶核酸的扩增产物可以与在该第一类型靶核酸的解链温度(或预期解链温度范围)下检出的指标变化(例如，检出的荧光的降低)成正比，并且第二类型靶核酸的扩增产物可以与在该第二类型靶核酸的解链温度(或预期解链温度范围)下检出的指标变化(例如，检出的荧光的降低)成正比。在一个实施例中，定量可以基于识别由靶核酸扩增以外的来源触发的指标。例如，可以确定在预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下表现出变化(例如，下降)的指标对应于靶核酸扩增以外的来源。因此，在定量靶核酸的扩增时，这些指标可能得到低估。
在一个实施例中，所测量的解链温度的聚集可以用于识别靶核酸扩增并且定量扩增的靶核酸。例如，可以测量特定温度下(或一定温度范围内)与多个样本反应体积相关联的多个扩增指标的减小，以确定这些指标的解链温度，如本文所述。这些测量的解链温度可以聚集，例如，基于计算得到的欧几里得距离和/或计算得到的轮廓值的簇，使得可以确定具有类似解链温度的指标的簇。参考HRM Experiments,Using MeltDoctorTM HRM Reagentsand High Resolution Melt Software v3.0(使用MeltDoctorTM HRM试剂和高分辨率熔解曲线软件v3.0进行HRM实验)，生命技术公司(Life Technologies)，2010年，其中综述了在使用可用软件工具进行熔解时聚集的轮廓得分的使用。本领域的普通技术人员将认识到，存在用于对数据进行聚类的各种附加的技术，其可以被实施以获得用于本发明的实施例的簇。因此，可以识别一种或多种簇，其中包括具有相似的解链温度的扩增指标。
在一些实施例中，当测定的指标处于所识别的解链温度的簇时，扩增指标可以被确认指示靶核酸扩增。例如，基于所识别的簇的测量的解链温度(或解链温度范围)与第一靶核酸的预期解链温度之间的比较，第一识别的簇可以与第一靶核酸相关联。相似地，基于所识别的簇的测量的解链温度(或解链温度范围)与第二靶核酸的预期解链温度之间的比较，第二识别的簇可以与第二靶核酸相关联。在此类实施例中，可以基于识别的指标的解链温度簇确认每种靶核酸的指标。在一些实施例中，可以确定不处于所识别的簇中的一者范围内的指标不包括扩增的靶核酸。因此，在定量靶核酸的扩增时，这些指标可能得到低估。
在一个实施例中，可以基于通过每种靶核酸的聚集所确认的扩增指标(如本文所述)或者基于每种靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)确认的扩增指标，对每种靶核酸的扩增进行定量。例如，Poisson模型可以与样本反应体积的总数和非扩增样本反应体积的总数(使用预期解链温度下的指标变化或并非簇的一部分的指标进行区分)一起使用，以计算每个样本反应体积的平均反应次数。结果可除以每个样本反应体积的平均体积，对于在预期解链温度或温度范围下解链的反应产物，得到单位体积的拷贝数。
图3A-3D示出用于执行dPCR的另一种示例性方法。本文所述的方法可以用如下文所详述的样本芯片、包括通孔的电路板、或用任何其他合适的装置诸如本文所述的示例性装置来执行。例如，图3A-3D可以描述使用终点检测方案与图1B所示的实时检测、单点检测、间隔检测和快速检测中的一者或多者结合来执行dPCR并且定量靶核酸的方法。
在图3A的302A处，样本被分离、分散或分配到多个样本反应体积中。例如，多个样本反应体积可以被分离，使得第一多个样本反应体积包含靶核酸的至少一个分子，并且第二多个样本反应体积不含靶核酸的分子。样本可以通过稀释过程被分离，使得每个样本反应体积包含核酸模板或靶标的一个拷贝、大约一个拷贝、或者不含核酸模板或靶标的拷贝、靶核酸的拷贝或更少。在一个实施例中，样本反应体积可以在约1aL至50μL的范围内。在其他实施例中，反应体积可以为约1nL、1pL、33nL或任何其他合适的体积。
在一个示例性实施例中，多个样本反应体积可以分散到类似于图9的样本固持器900的样本固持器上，如下文所详述，尽管可以使用各种其他装置来分离样本反应体积或实施如本文所述的扩增检测技术。因此，样本反应体积可以分散在样本固持器900的多个反应位点(例如，孔或通孔)之间。
在304A处，对多个样本反应体积进行扩增测定。例如，多个样本反应体积可以同时经受扩增测定，其中扩增测定被设计用于扩增靶核酸以产生扩增产物(即，扩增子)。测定可以包括至少一种探针、一种引物和一种酶，诸如TaqmanTM测定或任何其他合适的测定。
在一个实施例中，图3A的方法可以转入图3B的306B，其中实时检测可用于定量靶核酸扩增。例如，图1B的检测点104可以示出数字扩增过程中的实时检测，并且该实时检测可用于定量靶核酸的扩增。
在一个实施例中，图3A的方法可以转入图3C的316C，其中解链阶段可用于定量靶核酸扩增。例如，图1B的检测点106、检测点108和检测点110中的一者或多者可以示出用于检测扩增指标的检测方案，并且该检测可用于定量靶核酸的扩增。
在一个实施例中，图3A的方法可以转入图3D的328D，其中发射角可用于定量靶核酸扩增。例如，图1B的检测点106、检测点108和检测点110中的一者或多者可以示出用于检测扩增指标的检测方案，并且该检测可用于定量靶核酸的扩增。
图3B示出用于数字扩增(例如，dPCR测定)过程中的扩增指标的实时检测方案的示例性元素。在306B处，可以在预先确定的扩增测定温度下对多个样本反应体积中的每一者进行多次扩增指标的测量，同时对这些反应体积进行扩增测定。例如，反应体积表现出的扩增指标可以指示扩增产物的存在(例如，靶核酸分子的扩增)。
在一个实施例中，可以使用一种或多种染料，所述染料在结合到双链核酸时发荧光，并且这种荧光可作为扩增指标进行检测。例如，核酸结合剂(染料)在结合到双链核酸时可以产生能够与当相同试剂在溶液中或结合到单链核酸时所产生的信号相区别的可检测信号。可以使用荧光检测器例如安装在容纳分离的样本反应体积的芯片上的荧光检测器来检测荧光，或者可以以任何其他合适的方式进行检测。在一个实施例中，经受扩增测定的多个样本反应体积还可以经受多个PCR步骤，诸如热循环，如本文所述。在一个示例性实施例中，可以在每个PCR循环过程中在预先确定的扩增测定温度下进行多次测量。图5示出扩增指标的例示性、假想性示例性测量结果的图。所测得的多个样本反应体的扩增指标由y轴上的“特性”属性来表示，并且PCR热循环表示在x轴上。
再次参见图3B，在308B处，可以基于获得的测量结果确定多个样本反应体积的定量循环(Cq)或循环阈值(Ct)。Cq值可以为其中可测得扩增指标的循环，并且Ct可以为其中测量的扩增指标达到阈值(例如，预先确定的阈值)的值。例如，参考图5，由线502表示的反应体积具有大致相同的Ct值。线504表示具有后一个Ct值的反应体积，并且线506表示具有最新Ct值的附加反应体积。在一个实施例中，Cq值(例如，测得的一次循环的指标值)可以在循环过程中预先确定的点处的每个循环、多个预先确定的循环或基于任何合适的时段来确定。
在利用多重测定的实施例中，试剂可以被实施为表现出多个扩增指标。例如，多重测定可以包括两个探针，诸如FAMTM染料标记的探针和染料标记的探针，并且每个探针可以被设计用于基于多个靶核酸中的一者表现出扩增指标。在一些实施例中，基于FAM染料标记的探针的扩增指标可以与基于VIC染料标记的探针的扩增指标在不同波长处发荧光。因此，测量的指标(例如，荧光)可以基于发射的波长与特定靶核酸相关联。在这些实施例中，基于测量的指标的波长，测量的Cq或Ct值可以归因于特定靶核酸。
在310B处，可以将测定的Cq或Ct值与预期Cq或Ct值进行比较。例如，基于实施的特定扩增测定以及靶核酸，可以确定预期Cq值或预期Ct值。可以对基于测量结果确定的反应体积表现出的指标的Cq或Ct值与预期CQ或Ct值进行比较。
在利用多个扩增指标的实施例中，测得的Cq或Ct值可以与特定靶核酸相关联，并且比较可包括比较相关联的Cq或Ct值与相关联的靶核酸的预期Cq或Ct值。例如，第一靶核酸可以与发出第一波长的荧光的扩增指标相关联，并且第二靶核酸可以与发出第二波长的荧光的扩增指标相关联。每种靶核酸的Cq或Ct值可以基于发出每个波长的荧光的来确定，并且所确定的Cq或Ct值可以与预期的与所测定的值相关联的靶核酸的值Cq或Ct值进行比较。在步骤312B处，可以基于比较来检测错误的扩增。例如，预期的Ct值可以匹配(或基本上匹配)由线502表示的反应体积所表现出的指标的Ct值。因此，由线502表示的反应体积的所测量的扩增指标可以指示靶核酸的扩增。另一方面，由线504和线506表示的反应体积的Ct值不匹配预期的Ct值。因此，所测量的由线504和线506表示的反应体积的扩增指标指示由靶核酸以外的来源的扩增或由一些其他来源(例如，引物二聚体、灰尘、错掺或任何其他合适的来源)触发的扩增的检测以及由扩增的靶核酸的实际检测。所测定的Cq值和预期的Cq值可以类似地实施以检测错误的扩增。
在利用多种扩增指标的实施例中，与特定靶核酸相关联的Ct或Cq值(例如，基于所测量的指标的波长以测定Ct或Cq值)可以用于检测错误的扩增。例如，第一组Ct或Cq值可以与第一靶核酸相关联，并且第二组Ct或Cq值可以与第二靶核酸相关联。作为与第一靶核酸相关联的扩增指标的结果(例如，基于波长)，第一靶核酸的第一组Ct或Cq值和预期Ct或Cq值之间的比较可用于检测错误的扩增。相似地，作为与第二靶核酸相关联的扩增指标的结果，第二靶核酸的第二组Ct或Cq值和预期Ct或Cq值之间的比较可用于检测错误的扩增。因此，根据所表现出的指标的波长，可以与预期Ct或Cq值中的一者进行比较以识别错误的扩增(或基于除扩增的靶核酸以外的来源表现出的指标)。
在图3B的314B处，可以对扩增过程所引起的靶核酸的扩增产物进行定量。例如，扩增的量可以与所测量的反应体积的扩增指标成正比，该反应体积包括与预期Cq或Ct值基本上类似的Cq或Ct值。在一个实施例中，还可以基于识别由靶核酸扩增以外的来源所触发的所测量的扩增指标进行定量。例如，包括与预期Cq或Ct值基本上不匹配的Cq或Ct值的反应体积可以包括测量的对应于靶核酸扩增以外的来源的测量的扩增指标。因此，在定量靶核酸的扩增时，所测量的这些反应体积的扩增指标可能得到低估。
在利用多重测定的实施例中，可以对多个靶核酸中的每一者的扩增产物进行定量。例如，第一靶核酸的扩增产物的量可以与所测量的与第一靶核酸相关联的扩增指标成正比，该第一靶核酸包括的Cq或Ct值基本上类似于第一靶核酸的预期Cq或Ct值。第二靶核酸的扩增产物的量可以相似地得到定量。基本上不匹配靶核酸中的每一者的预期Cq或Ct值的反应体积所表现出的指标可以包括所测量的对应于靶核酸扩增以外的来源的扩增指标。
在一个实施例中，所测量的包括基本上类似于预期Cq或Ct值(对于至少一种靶核酸)的Cq或Ct值的反应体积的扩增指标可以确认预期的扩增，并且靶核酸的扩增可以基于这些确认的指标进行定量。例如，Poisson模型可以与样本反应体积的总数和非扩增样本反应体积的总数(使用基本上类似于预期Cq或Ct值的Cq或Ct值进行区分)一起使用，以计算每个样本反应体积的平均反应次数。结果可除以每个样本反应体积的平均体积，对于包括类似于预期Cq或Ct值的Cq或Ct值的反应产物，得到单位体积的拷贝数。
图3C示出利用解链阶段和检测数字扩增后的指标的示例性方法。在316C处，使反应体积经受扩增测定后，可以对多个样本反应体积中的每个在第一温度下进行扩增指标的第一组测量。在一个实施例中，可以在第一温度扩增后(例如，环境温度)对多个样本反应体积中的每一者测量扩增指标。例如，该组第一测量可以包括图1B的终点检测102，在执行扩增测定后在环境温度下进行测量。
在一个实施例中，所测量的扩增指标可以基于结合到双链核酸的嵌入染料(例如，染料)，如本文所述。在一些实施例中，在实时检测扩增核酸中测量的指标(例如，基于Cq或Ct值或基于发射角分析)可以不同于解链阶段分析所测量的指标。例如，实时检测技术可以利用基于非嵌入染料或探针的指标，这些指标不可用于解链分析。在其他实施例中，在各种检测技术中，所测量的指标可以保持一致。
在318C处，可以在高于第一温度的扩增后温度下对扩增指标进行至少一组附加测量。例如，对扩增指标的初始测量可以包括在反应体积在扩增(例如，PCR扩增)后处于第一温度(例如，环境温度)时测量样本反应体积的特性。图4示出例示性、假想性示例性检测结果的图。样本反应体积的扩增指标(例如，荧光)可以用y轴上的“特性”属性来表示，并且温度可以用x轴来表示。因此，在环境温度下测得的所测量的多个反应体积的扩增指标在图4的图中示出。
在一个实施例中，可以在一段时间诸如10分钟、15分钟、30分钟、1小时或任何其他合适的时间段内以恒定速率加热样本反应体积。在加热过程中，多个样本反应体积表现出的扩增指标可以测量至少一次，并且在一些实施例中测量多次。
在一个实施例中，多个样本反应体积表现出的扩增指标可以在加热过程中以一系列间隔进行测量。例如，图4示出例示性、假想性示例性检测结果的图，其中可以在各种目标温度下测量扩增指标。在一个实施例中，目标温度可以基于温度间隔(例如，5℃、10℃等)，或者可以包括一组预先确定的目标温度。在每个目标温度下，可以测量扩增指标，使得可以识别指标的变化。
在一个实施例中，由多个样本反应体积表现出的扩增指标可以在加热过程中以间距密集的间隔进行测量。在分析快速测得的特性中，可以确定由多个反应体积表现出的扩增指标的趋势。例如，分析显示出一种趋势，即来自多个反应体积的一组样本反应体积随着温度提高而表现出扩增指标的减小。趋势可类似于通过在温度提高期间的间隔检测过程中比较所确定的结果。
在一个实施例中，快速检测可以识别特定温度下(例如，除间隔检测的目标温度以外的温度)的趋势。例如，温度(或温度窗口)可触发由反应体积中的一部分表现出的扩增指标的显著变化(例如，超出阈值的变化)。快速检测能够通过分析扩增指标的变化来识别这些温度或温度窗口。因此，快速检测方法可以为分析提供更高的灵敏度。
在320C处，所识别的扩增指标的变化可以与扩增后温度的变化相关联。例如，再次参见图4，所识别的变化404可以与温度75℃相关联，并且所识别的变化408可以与温度85℃相关联。所识别的变化402可以包括多种变化，并且每种变化可以与温度55℃和65℃中的一者相关联，如图所示。
在一个实施例中，在加热过程中，可以快速测量扩增指标。类似于间隔检测分析，所识别的各种温度下的多个反应体积的所测量的扩增指标的变化可以与每个温度的变化相关联。
在322C处，可以对相关联的温度与预期解链温度进行比较。例如，基于实施的特定扩增测定和靶核酸，可以预先确定预期解链温度(或预期解链温度范围)，使得预期靶核酸将在该温度下发生解链。可以对基于进行的测量的扩增指标的变化相关联的温度与预期解链温度进行比较。
在324C处，可以基于比较来识别错误的扩增。在一个实施例中，可以分析所识别的多个反应体积的扩增指标的变化，以确定由靶核酸的扩增以外的来源所触发的变化。反应体积基于靶核酸的扩增所表现出的扩增指标的变化预期将在预期解链温度或温度范围内减小(例如，预期反应体积表现出的荧光在预期解链温度下将降低)。例如，此处靶核酸的预期解链温度可以为70℃，或者预期解链温度范围可以为65℃至75℃。
在一个实施例中，单点检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点106所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)和用于单点检测的预先确定的温度下(例如，检测点106)的检测结果来确定。所识别的变化402中的一者可以包括基于单点检测所识别的变化。
例如，在这些温度下检出的变化可以包括进一步分离表现出由核酸扩增触发的扩增指标的反应体积与不具有此类扩增指标的反应体积。表现出一些扩增指标的反应体积可以发生减小，使得结果的背景噪音降低。例如，在使用染料诸如SYBR染料(或其他嵌入染料)产生扩增指标时，由于染料的非特异性设计，染料可以与各种反应产物(例如，核酸)结合。因此，背景噪音(例如，荧光)可以由结合到非特异性染料的反应产物引起。在一个实施例中，表现出扩增指标的反应体积可以基于进一步分离与不表现出扩增指标的反应体积区分开，并且靶核酸的扩增可以基于辨别的反应体积得到更准确的定量。
在一个实施例中，间隔检测算法可以与终点检测(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点108所示。例如，所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)和用于间隔检测的预先确定的温度下(例如，检测点108)的检测结果来确定。图4可以示出基于间隔检测的变化402(如上文所述)、404和406。
与温度75℃相关联的所识别的变化404可以指示由靶核酸的扩增所触发的指标的变化。由于靶核酸的预期解链温度包括70℃或介于65℃至75℃之间的范围，在75℃下检测的所表现出的指标的减小对应于由靶核酸的扩增所触发的指标。与温度85℃相关联的所识别的变化408可以指示由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标的变化。由于靶核酸的预期解链温度包括70℃或介于65℃至75℃之间的范围，在85℃下检测的变化对应于由其他来源触发的指标。在温度95℃下测量的扩增指标410也对应于由靶核酸的扩增以外的来源触发的指标。在此类高温下，预期核酸将解链，因此指标410可以对应于如灰尘之类的来源，或可能导致指标持续超过特定温度阈值的一些其他来源。
在一个实施例中，在加热过程中，还可以代替设定温度点间隔测量或除设定温度点间隔测量之外快速测量指标。例如，快速测量算法可以与终点测量(例如，在环境温度下)一起使用，如上文所述的图1B的检测点110所示。所识别的变化可基于环境温度下(例如，检测点102)的检测结果和解链温度下快速检测的结果(例如，检测点110)来确定。
例如，靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下的指标变化(例如，下降)可以对应于除靶核酸扩增以外的来源(例如，由靶核酸扩增以外的来源触发的指标)。另一方面，靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)下的指标变化(例如，下降)可以对应于靶核酸扩增(例如，由靶核酸扩增触发的指标)。
在326C处，可以对扩增过程所引起的靶核酸的扩增产物的量进行定量。例如，反应体积在环境温度下表现出的指标可以指示每个反应体积中发生的扩增的程度，但是并非所有扩增都可以包括靶核酸。换句话讲，反应体积在环境温度下表现出的扩增指标可以指示除靶核酸以外的来源的扩增，或者可以由一些其他来源触发。这些来源可以包括例如引物二聚体、错掺、灰尘或任何其他合适的来源。加热的执行和所测量的特性的后续分析能够识别并非靶核酸的扩增的结果的指标。在考虑与一些其他来源相关的指标后，能够以更高的准确度对靶核酸的扩增进行定量。
在一个实施例中，可以分析所识别的多个反应体积的指标的变化，以确定由靶核酸的扩增以外的来源所触发的指标。例如，基于特定的靶核酸，可以确定预期解链温度(或预期解链温度范围)，使得预期靶核酸将在该温度下发生解链。因此，反应体积基于靶核酸的扩增所表现出的指标预期将在预期解链温度或温度范围内减小(例如，预期反应体积表现出的荧光在预期解链温度下将降低)。
在一个实施例中，扩增可以与预期解链温度(或预期解链温度范围)下检出的指标的变化(例如，检出的荧光的降低)成正比。在一个实施例中，定量还可以基于识别由靶核酸扩增以外的来源触发的指标。例如，可以确定在预期解链温度(或预期解链温度范围)以外的温度下表现出变化(例如，下降)的扩增指标对应于靶核酸扩增以外的来源。因此，在定量靶核酸的扩增时，这些指标可能得到低估。
在一个实施例中，所测量的解链温度的聚集可以用于识别靶核酸扩增并且定量扩增的靶核酸。例如，可以测量特定温度下(或一定温度范围内)与多个样本反应体积相关联的多个扩增指标的减小，以确定这些指标的解链温度，如本文所述。这些测量的解链温度可以聚集，例如，基于计算得到的欧几里得距离和/或计算得到的轮廓值的簇，使得可以确定具有类似解链温度的指标的簇。参考HRM Experiments,Using MeltDoctorTM HRM Reagentsand High Resolution Melt Software v3.0(使用MeltDoctorTM HRM试剂和高分辨率熔解曲线软件v3.0进行HRM实验)，生命技术公司(Life Technologies)，2010年，其中综述了在使用可用软件工具进行熔解时聚集的轮廓得分的使用。本领域的普通技术人员将认识到，存在用于对数据进行聚类的各种附加的技术，其可以被实施以获得用于本发明的实施例的簇。因此，可以识别一种或多种簇，其中包括具有相似的解链温度的扩增指标。
在一些实施例中，当测定的指标处于所识别的解链温度的簇时，扩增指标可以被确认指示靶核酸扩增。例如，基于所识别的簇的测量的解链温度(或解链温度范围)与第一靶核酸的预期解链温度之间的比较，第一识别的簇可以与第一靶核酸相关联。相似地，基于所识别的簇的测量的解链温度(或解链温度范围)与第二靶核酸的预期解链温度之间的比较，第二识别的簇可以与第二靶核酸相关联。在此类实施例中，可以基于识别的指标的解链温度簇确认每种靶核酸的指标。在一些实施例中，可以确定不处于所识别的簇中的一者范围内的指标不包括扩增的靶核酸。因此，在定量靶核酸的扩增时，这些指标可能得到低估。
在一个实施例中，可以基于通过每种靶核酸的聚集所确认的扩增指标(如本文所述)或者基于每种靶核酸的预期解链温度(或预期解链温度范围)确认的扩增指标，对每种靶核酸的扩增进行定量。例如，Poisson模型可以与样本反应体积的总数和非扩增样本反应体积的总数(使用预期解链温度下的指标变化或并非簇的一部分的指标进行区分)一起使用，以计算每个样本反应体积的平均反应次数。结果可除以每个样本反应体积的平均体积，对于在预期解链温度或温度范围下解链的反应产物，得到单位体积的拷贝数。
图3D示出在数字扩增过程中用于识别扩增的发射角检测方案的示例性元素。在328D处，可以在预先确定的扩增测定温度下对多个样本反应体积中的每一者进行多次扩增指标的测量，同时对这些样本反应体积进行扩增测定。例如，样本反应体积表现出的扩增指标可以指示扩增产物的存在(例如，靶核酸分子的扩增)。
在一个实施例中，对多个样本反应体积中的每一者所执行的多次扩增指标测量可以类似于图3B的306B。例如，可以使用一种或多种染料和/或探针，所述染料和/或探针在结合到双链核酸时发荧光，并且这种荧光可作为扩增指标进行检测。可以使用成角度的荧光检测器检测来自分离的反应体积的荧光，从而检测荧光。在一个实施例中，经受扩增测定的多个反应体积还可以经受多个PCR步骤，诸如热循环，如本文所述。在一个示例性实施例中，可以在每个热循环过程中在预先确定的扩增测定温度下进行多次测量。
图6A和图6B示出扩增指标的例示性、假想性示例性测量结果的图。图600A和图600B示出扩增过程中在不同循环数量下的多次测量的发射角分析。在一个实施例中，可以在循环过程中预先确定的点处的每个循环、多个预先确定的循环或基于任何合适的时段进行测量。
在一些实施例中，样本反应体积可以表现出多种扩增指标。例如，多种染料和/或探针可以被实施，使得样本反应体积基于发生于样本反应体积中的扩增反应而表现出一种或多种指标。在一些实施例中，第一指标可以指示第一靶核酸的扩增，而第二指标可以指示第二靶核酸的扩增。例如，图600A和图600B可以示出利用两种探针(例如，FAMTM和探针)或任何其他合适的探针和/或染料的反应的扩增结果。这里，在x轴上示出测量的基于第一探针的扩增指标，并且在y轴上示出测量的第二探针的扩增指标。在一个实施例中，第一探针可以被设计用于扩增第一靶核酸，而第二探针可以被设计用于扩增第二靶核酸。
在之前进行过多次测量的实施例中，例如在图3D的方法之前执行的图3B的方法的实施例中，可以省略步骤328D。例如，基于在图3B的方法中进行的测量，多次测量的数据可用，因此可以对该数据进行分析，如本文所述，而无需获得附加测量。
再次参见图3D，在330D处，可以基于在各个循环中进行的测量来确定多个样本反应体积中的每一者所测量的指标的发射角。例如，图6A的图600A示出在扩增过程的第一循环中采集的扩增指标的测量值，并且图6B的图600B示出在扩增过程的第二循环中采集的扩增指标的测量值，其中第二循环处于第一循环后的一定时间处。在一个实施例中，第一循环可以为扩增过程的循环27，并且第二循环可以为扩增过程的循环40。
在一个实施例中，对于进行测量的每次循环(例如，在图3D的328D处或进行实时测量的任何之前的元素处)，可以存储该循环处多个样本反应体积中的每一者的指标测量值。这里，在循环27处进行处测量在图6A的图600A中示出，并且在循环40处进行处测量在图6B的图600B中示出。
可以分析每个测量的循环的测量结果以确定每个反应体积的发射角(或轨线)。例如，可以对与给定测量的循环处的反应体积相关联的测量的数据点与基准点(例如，原点(0,0))进行比较，由此使得可以确定角度。在一些实施例中，可以基于tan-1函数和数据点的x值和y值来确定给定数据点的特定角度。在扩增期间(例如，在总循环中或最多预先确定的循环下)，可以对每个反应体积(例如，每个数据点)的每个测量的循环处确定的角度进行平均(或平滑化)，由此使得可以确定由单个反应体积测量的指标的发射角。在一些实施例中，可以使用回归分析或通过一些其他合适的方式来计算确定的给定反应体积的发射角的斜率。
在一个实施例中，图6A的图600A示出在循环27处多个样本反应体积的示例性测量值602A。在该实例中，测量的扩增指标的值尚未分离以使得可以区分这些值或者使得可以区分确定的样本反应体积的发射角。在一个实施例中，图6B的图600B示出在循环40处多个样本反应体积的示例性测量值。在该实例中，指标已经分离，使得可以区分这些值或者使得可以区分确定的样本反应体积的发射角。因此，与图600A和图600B中示出的数据点相关联的样本反应体积可以包括所确定的发射角。
再次参见图3D，在332D处，可以对所确定的发射角进行分析以确定多个样本反应体积之间的差异和相似性。在一个实施例中，图6B中的数据点604B可以示出对多个样本反应体积的测量结果，该测量结果共享循环40处类似的指标测量结果并且共享类似的确定的发射角(例如，在最多循环40的每个测量的循环处进行的测量)。相似地，数据点606B可以示出对多个样本反应体积的测量结果，该测量结果共享循环40处类似的指标测量结果并且共享类似的确定的发射角。基于循环40处的一个或两个指标测量结果和/或计算得到的发射角，这些数据点可以形成聚类，如本文所述或使用已知的聚类算法实现。在一个实施例中，可以基于计算得到的斜率对发射角进行比较，其中当第一发射角的计算斜率处于第二发射角的计算斜率的阈值内时，可以宣告具有相似的角度。
在一个实施例中，所确定的发射角和/或计算得到的斜率可以确认样本反应体积所表现出的指标是否对应于第一靶核酸、第二靶核酸或两者的扩增。例如，在图6A和图6B的图600A和图600B中，在x轴上示出测量的基于第一探针的扩增指标，并且在y轴上示出测量的基于第二探针的扩增指标。在一个实施例中，第一探针可以被设计用于扩增第一靶核酸，而第二探针可以被设计用于扩增第二靶核酸。因此，处于第一范围内(例如，约60°至90°)的发射角可以确认数据点是基于第一靶核酸的扩增。相似地，处于第二范围内(例如，约0°至30°)的发射角可以确认数据点是基于第二靶核酸的扩增。处于第三范围内(例如，约30°至60°)的发射角可以确认数据点是基于第一靶核酸和第二靶核酸两者的扩增。
在一些实施例中，发射角分析可以将与这些数据点相关联的样本反应体积标识为包含一种或多种靶核酸的经验证的靶核酸扩增。例如，与聚集的数据点604B相关联的样本反应体积可以被标识为基于该簇的发射角包含经验证的扩增的第一靶核酸。相似地，与聚集的数据点604B相关联的样本反应体积可以被标识为基于该簇的发射角包含经验证的扩增的第一靶核酸和扩增的第二靶核酸。
数据点608B可示出对两个样本反应体积进行的测量，这两个样本反应体积在循环40处共享类似的指标测量，并且共享类似的所确定的发射角，但是这些样本反应体积可能不与其他样本反应体积共享这些值。例如，数据点604B和数据点606B各自形成簇，而数据点608B不形成簇。在一些实例中，这些值可以指示假扩增指标。例如，发射角分析可以将与这些数据点相关联的样本反应体积标识为包含脱靶扩增子(除扩增的靶核酸以外的来源的扩增子)。如参考图3A-3C所述的检测技术可以与发射角分析一起实施以进一步确认这些样本反应体积是否包含脱靶扩增子。
在一个实施例中，数据点610B可以示出在循环40处对样本反应体积进行的测量，该样本反应体积与其他样本反应体积不同。例如，在循环40处得到的与数据点610B相关联的样本反应体积的测量值可以与在循环40处得到的与数据点604B和数据点606B相关联的样本反应体积簇的测量值不同。然而，所确定的与数据点610B相关联的反应体积的发射角可以类似于所确定的与数据点604B相关联的样本反应体积簇的发射角。该确定可以基于所确定的发射角的比较斜率，如本文所述。在该实施例中，类似的发射角可以指示与数据点610B相关联的样本反应体积包含扩增的靶核酸，该扩增的靶核酸符合与数据点604B相关联的样本反应体积簇。
在循环40处测量的这些数据点的结果差异可能是由于检测技术故障而非扩增错误(例如，脱靶扩增)。例如，用于产生扩增指标的试剂可以少量存在，或者扩增检测过程中可能存在其他问题。在一个实施例中，发射角分析可以将与数据点610B相关联的样本反应体积表示为包含经验证的靶核酸扩增，该靶核酸扩增符合与数据点604B相关联的样本反应体积簇。如参考图3A-3C所述的检测技术可以与发射角分析一起实施以进一步确认该样本反应体积是否包含扩增的靶核酸。
在一个实施例中，数据点612B还可以示出在循环40处对样本反应体积进行的测量，该样本反应体积与其他样本反应体积不同。例如，在循环40处得到的与数据点612B相关联的样本反应体积的测量值可以与在循环40处得到的与数据点604B和数据点606B相关联的样本反应体积簇的测量值不同。然而，所确定的与数据点612B相关联的样本反应体积的发射角可以类似于所确定的与数据点606B相关联的样本反应体积簇的发射角。在该实施例中，共享的发射角可以指示与数据点612B相关联的样本反应体积包含扩增的靶核酸，该扩增的靶核酸符合与数据点606B相关联的样本反应体积簇。
在循环40处测量的结果差异也可能是由于检测技术故障而非扩增错误(例如，脱靶扩增)。发射角分析可以将与数据点612B相关联的样本反应体积表示为包含经验证的靶核酸扩增，该靶核酸扩增符合与数据点606B相关联的样本反应体积簇。如参考图3A-3C所述的检测技术可以与发射角分析一起实施以进一步确认该样本反应体积是否包含扩增的靶核酸。
再次参见图3D，在334D处，可以基于确定的发射角和附加的扩增数据识别错误的扩增。例如，数据点610B和数据点612B可以各自包含关于与这些数据点相关联的样本反应体积是否包含扩增的靶核酸的矛盾因素。对于这些数据点，在循环40处进行的测量的聚类可以指示错误的扩增，而分析的发射角可以指示目标扩增(靶核酸的扩增)。这里，有关样本反应体积的附加数据，诸如通过图3B的方法确定的Cq或Ct值或者通过图3C的方法确定的解链曲线值，可用于确定样本反应体积是否包含扩增的靶核酸。
图7A的图700A示出基于来源于解链技术(例如图2A、图2B或图3C的方法所述的解链方法)的数据的多个样本反应体积的解链曲线。线型基于本文所述的识别技术描绘了曲线的类型(例如，扩增(实线)、未扩增(点线)、确定为可疑(虚线))。图7B的图700B示出图7A的图700A所示的解链曲线的一阶导数。这里，线型也基于本文所述的识别技术或其他合适的识别技术描绘了曲线的类型(例如，扩增(实线)、未扩增(点线)、确定为可疑(虚线))。
图8示出数据点的散点图，其描绘了对多个样本反应体积执行解链之前测量的扩增指标的值。在该显示中，基于来自解链检测技术的数据对数据点进行了分类。例如，与样本反应体积表现出的扩增指标相关联的解链温度可用于对相关联的数据点进行分类。这里，数据点被分类为非扩增(例如，在解链之前和扩增之后未检出扩增指标或检出极少的)、无清晰的解链曲线(例如，基于解链的技术未识别出明确的解链温度)和基于阴影的解链温度(例如，与数据点相关联的样本反应体积表现出的测量指标的解链温度对应于阴影和随附的温度键)。
在一个实施例中，由解链曲线分析得到的识别结果(例如，扩增的、未扩增的或可疑的)可以与发射角分析结合使用，以确认样本反应体积是否包含扩增的靶核酸或错误的(或脱靶)扩增(或发出错误的扩增指标)。将发射角检测技术与解链检测技术相结合时，可以基于样本反应体积的预期解链温度与测量的解链温度之间的比较来确认。例如，可使用基于与图6B的数据点610B和数据点612B相关联的样本反应体积的解链曲线图进行识别，以便确认样本反应体积的扩增状态。
在一个实施例中，利用实时检测技术进行识别，如参考图3B所述，可以与发射角分析结合使用，以确定样本反应体积是否包含扩增的靶核酸或错误的(或脱靶)扩增(或发出错误的扩增指标)。这里，确认可以基于样本反应体积的预期Cq或Ct值与测量的Cq或Ct值之间的比较。例如，可使用基于与图6B的数据点610B和数据点612B相关联的样本反应体积的预期Cq或Ct值与测量的Cq或Ct值进行识别，以便确认样本反应体积的扩增状态。
在一个实施例中，解链曲线图、基于预期Cq或Ct值的实时检测技术以及基于确定的发射角的检测技术可以组合使用，以便确定样本反应体积的扩增状态。例如，可以利用这些技术中的两种或更多种的组合以得出扩增状态。在另一个实施例中，当每种检测技术将样本反应体积识别为包含扩增的靶核酸时(例如，所有三种技术均确认样本反应体积包含扩增的靶核酸)，可以确定样本反应体积包含扩增的靶核酸。
在实施多重测定的实施例中，确认可以对特定的靶核酸具有特异性。例如，解链曲线图、基于预期Cq或Ct值的实时检测技术和基于确定的发射角的检测技术可以各自将扩增指标与多个靶核酸中的一者关起来。因此，可以实施组合以确定样本反应体积的扩增状态以及样本反应体积中存在的特定的扩增靶核酸(如果有的话)。
在一个示例性实施例中，靶核酸扩增的定量可以基于实时检测方法(如图3B所示)和解链检测技术(如图3C所示)两者。例如，靶核酸的定量可以基于终点检测(如图1的检测点102所示)以及实时检测(如图1的检测点104所示)、单点检测(如图1的检测点106所示)、、间隔检测(如图1的检测点108所示)和快速检测(如图1的检测点110所示)中的一者或多者。在示例性实施例中，使用实时检测技术和/或解链阶段技术(如结合图3B和图3C所述)识别错误扩增和准确的靶核酸扩增错误可用于定量靶核酸的扩增。例如，基于扩增的靶核酸的类型、扩增测定、分析所需的时间/通量以及任何其他合适的考虑因素，可以选择将终点分析与实时检测中的一者或多者和解链阶段的组合。
在一个实施例中，扩增测定过程中扩增指标的实时检测(如图3所示)也可用于测定在数字扩增之前存在于反应体积中的分子数量。例如，基于对多个反应体积的扩增指标的实时测量，可以确定每个反应体积在dPCR扩增之前包括零、一种还是多于一种靶核酸分子。
在一些实施例中，可以使用染料或探针的组合，使得样本反应体积表现出多种扩增指标。例如，样本反应体积可以包括检测试剂，使得第一扩增指标可以基于第一染料或探针指示第一靶核酸的扩增，第二扩增指标(不同于第一扩增指标)可以指示基于第二染料或探针的第二靶核酸的扩增，并且第三扩增指标(不同于第一扩增指标或第二扩增指标)可以指示基于第三染料或探针的第三靶核酸。在该实例中，可以基于本文所述的实时检测技术、发射角检测技术和解链检测技术测量和分析特定的扩增指标，使得可以实现单独的第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸的扩增产物的定量。
在一些实施例中，可实施第一探针和第二探针，其中第一探针被设计用于指示第一靶核酸的扩增，并且第二探针被设计用于指示第二靶核酸的扩增。第一扩增指标和第二扩增指标可用作实时检测技术(即，基于预期Cq或Ct值和测量的Cq或Ct值)和/或发射角检测技术的一部分。此外，染料可以与第一探针和第二探针一起使用，使得可以执行解链阶段以便实施解链检测技术。单独的第一靶核酸和第二靶核酸的扩增产物的定量可以使用技术组合来实现。
在各种实施例中，样本固持器可以具有多个样本位点或体积，这些样本位点或体积被配置用于接收多个样本反应体积。样本固持器的一些示例可以包括但不限于：多孔板诸如标准微量滴定96孔板、384孔板，微卡，通孔阵列，或基本上平坦的固持器诸如玻璃或塑料滑片。在样本固持器的各种实施例中，反应位点可以包括凹陷、凹痕、脊、通孔以及它们的组合，在样本固持器的表面上形成规则或不规则阵列。
参见图9，在某些实施例中，样本固持器、制品、芯片、装置、基底、滑片或板900包括基底902，该基底902包含位于基底902中或基底902上的多个反应位点或反应室904。多个反应位点904可以包括多个通孔、孔、表面凹痕、经处理的表面区域等。在某些实施例中，样本固持器900可以包括制品。除此之外或另选地，样本固持器900可以包括微流体装置，该微流体装置例如还可包括多个通道或路径，这些通道或路径用于将试剂和/或检测溶液转移至反应位点904。在其他实施例中，反应位点904包括多个小滴或小珠，并且样本固持器900可包括一个或多个腔室和/或通道，这些腔室和/或通道包含小滴或小珠904中的一部分或全部。在此类实施例中，小滴或小珠可以形成乳液，其中小滴或小珠中的一部分或全部包含至少一种多核苷酸或核苷酸序列中的一个或多个靶标。在反应位点904包括小珠的情况下，小珠可任选地包括附加的光学标记或标签。可以每次一个或成组(包含一个或多个小滴或小珠)地检查、监测或测量小滴或小珠，例如使用根据实施例的成像系统来实现。
反应位点904可以包括反应体积，这些反应体积位于基底902种形成的孔或凹痕内，溶液斑点分布于基板或其他类型的反应室或形式的表面910上，诸如样本或溶液位于测试位点或微流体系统的体积内，或位于小珠或小球内部或上部。
反应位点904可以被构造成用于通过毛细管作用提供足够的表面张力以吸取包含感兴趣的生物组分的相应量的液体或样本。样本固持器900可具有如以下专利中的任一项所公开的一般形式或构造：美国专利6,306,578；7,332,271；7,604,983；7,6825,65；6,387,331；或6,893,877，这些专利全文以引用方式并入本文中，如同在此进行完整阐述。基底902可以是平板或包括适合于特定应用、测定或实验的任何形式。基底可以包括在制造技术中已知的各种材料中的任一者，包含但不限于金属、玻璃、陶瓷、硅等。另外或替代地，基底902可以包含聚合材料，例如丙烯酸酯类、苯乙烯类、聚乙烯、聚碳酸酯和聚丙烯材料。基底902和反应部位904可以通过机械加工、注塑模制、热压成形、激光钻孔、光刻等中的一或多者形成。
根据本教导内容的各种实施例，每个反应位点904可具有约1.3纳升的体积。另选地，每个反应位点的体积可以小于1.3纳升。这可以通过例如减小反应位点904的直径和/或样本固持器的厚度来实现。例如，每个反应室904可以具有小于或等于1纳升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升或小于或等于10皮升的体积。在其他实施例中，反应位点904中的一部分或全部的体积在1纳升至20纳升的范围内。
在一些实施例中，反应位点904为通孔。在这些实例中，每个通孔具有约1.3纳升的体积。另选地，每个通孔的体积可以小于1.3纳升。这可以通过例如减小通孔的直径和/或样本固持器的厚度来实现。例如，每个通孔可以具有小于或等于1纳升、小于或等于100皮升、小于或等于30皮升或小于或等于10皮升的体积。在其他实施例中，通孔中的一部分或全部的体积在1纳升至20纳升的范围内。
在各种实施例中，反应位点904的密度可以为每平方毫米至少100个反应位点。在其他实施例中，可以存在更高密度的反应室。例如，芯片100内反应位点904的密度可以大于或等于每平方毫米150个反应位点、大于或等于每平方毫米200个反应位点、大于或等于每平方毫米500个反应位点、大于或等于每平方毫米1000个反应位点、大于或等于每平方毫米10000个反应位点。
在一些实施例中，反应位点904包括多个通孔。因此，样本固持器内通孔的密度可以大于或等于每平方毫米150个通孔、大于或等于每平方毫米200个通孔、大于或等于每平方毫米500个通孔、大于或等于每平方毫米1000个通孔、大于或等于每平方毫米10000个通孔。
在一些实施例中，反应体积可以使用通孔、孔或小滴进行分散。反应体积的示例性体积范围为1aL至50μL。在其他实施例中，反应体积可以为约1nL、1pL、33nL或任何其他合适的体积。
在某些实施例中，表面910可包含疏水性材料，例如美国专利申请公布号2006/0057209或2006/0105453中所述，这两件专利申请全文以引用方式并入本文中，其如同被完整陈述。在此类实施例中，反应位点904可包含吸收水或其他液体溶液的亲水性材料。一系列此类亲水区域可以包括疏水表面上的亲水性岛状物，并且可以使用各种微加工技术中的任一种在基底902上或内部形成，所述微加工技术包括但不限于沉积、等离子体、掩模方法、转印、丝网印刷、点样等。
样本固持器900也可包括标识符918。在该实例中，标识符918可以为字母-数字序列。然而，应该认识到，标识符可以为根据本文所述的各种实施例的另一种类型的符号或字符。标识符918可以为例如条形码、QR码、符号、数字序列、RFID标识符或字母序列。此外，尽管标识符918显示在样本固持器900的右下角，但是根据本文所述的各种实施例，只要位置已知并且存储在系统的存储器中，则标识符918可以位于样本固持器上的任何位置。
图10为示出计算机系统1000的框图。执行实验的仪器(例如，图1A所示的系统或仪器10以及如上文所述)可以连接至示例性计算系统
1000。根据各种实施例，参考图9和图11所述的仪器可以与计算系统
1000一起使用。计算系统1000可包括一个或多个处理器，诸如处理器1004。例如，处理器1004可使用通用或专用处理引擎，诸如微处理器、控制器或其他控制逻辑部件以实施。在本实例中，处理器1004连接至一条总线1002或其他通信媒介。
计算系统1000可包括用于传达信息的总线1002或其他通信机构，以及与总线1002耦合以用于处理信息的处理器1004。
计算系统1000还包括存储器1006，其可以是随机存取存储器(RAM)或其他动态内存，所述存储器与总线1002耦合以便存储有待通过处理器1004执行的指令。存储器1006还可用于在执行将由处理器1004执行的指令的过程中存储临时变量或其他中间信息。计算系统1000还包括耦合到总线1002用于存储处理器1004的静态信息和指令的只读存储器(ROM)
1008或其他静态存储设备。
计算系统1000还可包括存储设备1010，如磁盘、光盘或固态驱动器(SSD)，其被提供并耦合于总线1002以用于存储信息和指令。存储设备1010可包括介质驱动器和可移动存储接口。介质驱动器可包括支持固定或移动存储介质的驱动器或其他机构，如硬盘驱动器、软盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、CD或DVD驱动器(R或RW)、闪盘驱动器或其他可移动或固定介质驱动器。如这些示例所示，存储介质可包括计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质中具有特定的计算机软件、指令或数据。
在替代实施例中，存储设备1010可包括用于允许计算机程序或其他指令或数据加载到计算系统1000上的其他类似工具。此类工具可包括诸如可移动存储单元和接口，例如程序盒式存储器和盒式存储器接口、移动存储器(例如，闪速存储器或其他可移动存储模块)和存储器插槽，以及用于允许将软件和数据从存储设备1010传送至计算系统100的其他移动存储单元和接口。
计算系统1000还可包括通信接口1018。通信接口1018可用于允许软件和数据在计算系统1000和外部设备之间传输。通信接口1018的实例可包括调制解调器、网络接口(例如以太网或其他NIC卡)、通信端口(例如USB端口、RS-232C串行端口)、PCMCIA插槽和PCMCIA卡、蓝牙等。通过通信接口1018传送的软件和数据可以是能够由通信接口1018接收的电子、电磁、光学及其他信号的形式。这些信号可以由通信接口1018通过诸如无线介质、线材或线缆、光纤、或其他通信介质的信道来发送和接收。信道的一些示例包括电话线、蜂窝电话链路、RF链路、网络接口、局域网或广域网及其他通信信道。
计算系统1000可以经由总线1002耦合到显示器1012，如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，以用于向计算机用户显示信息。例如，包括字母数字键及其他键的输入设备1014耦合到总线1002，该设备用于将信息和命令选择传输至处理器1004。输入设备还可以是具有触摸屏输入功能的显示器，例如LCD显示器。
应了解，为清楚起见，以上说明已经参考不同功能单元和处理器描述了实施例。然而，显而易见的是，在不脱离本发明的情况下可使用不同的功能单元、处理器或域之间任何合适的功能分布。例如，示出的由独立的处理器或控制器执行的功能可以由相同的处理器或控制器来执行。因此，对特定功能单元的引用仅应视为对提供所述功能的合适装置的引用，而非指示一个严格的逻辑或物理结构或组织。如上所述，根据各种实施例可利用的仪器包括但不限于聚合酶链反应(PCR)仪器。图11为示出扩增仪器1100的框图，根据此框图可实施本教导内容的实施例。扩增仪器1100可包括加热的盖子1110，该加热的盖子1110被置于芯片或消耗品中所容纳的多个样本1112上(例如)。在各种实施例中，消耗品可是具有多个样品区域的玻璃或塑料滑片，其样本区域具有介于样本区域和加热的盖子1110之间的盖子。消耗品的一些示例可能包括但不限于：多孔板，诸如标准微量滴定96孔板、384孔板或微卡；或者基本上平坦的固持器，诸如玻璃或塑料滑片。在消耗品的各种实施例中，反应位点可以包括凹陷、凹痕、脊以及它们的组合，在消耗品的表面上形成规则或不规则阵列。扩增仪器的多种实施例包括样品块1114、用于加热和冷却的元件1116、热交换器1118、控制系统1120和用户界面1122。根据本教导内容的热块组件的各种实施例包括图11所示的扩增仪器1100的部件1114-1118。
实时扩增仪器1100具有光学系统1124。在图11中，光学系统1124可具有发射电磁能量的照明源(未示出)、用于接收来自消耗品的样本1112的电磁能量的光学传感器、检测器或成像器件(未示出)、用于将电磁能量从每个DNA样本引导至成像器件的光学器件1140。对于图11中的扩增仪器1100和图11中的实时扩增仪器1100的实施例，控制系统1120可用于控制该检测系统、加热的盖子和热块组件的功能。控制系统1120可以由最终用户通过图8中的实时扩增仪器1100和图11中的实时扩增仪器1100的用户界面进行访问。另外，计算系统1000，如图10所示，可用于控制图11中的扩增仪器1100的功能以及用户界面功能。另外，图10的计算机系统1000可提供数据处理、显示和报告准备功能。此类仪器控制功能可局部专用于扩增仪器，或者图10的计算机系统1000可提供对控制、分析和报告功能中的一部分或全部的远程控制，如随后所详述。
作为如上所述的用于在固定样本中进行核酸扩增监测的低反应体积腔室的替代选择，可以使样本流过微流体装置的通道或腔室，并且随着其流动，其可以连续经受不同温度，从而实现热循环。因此，例如可以使样本流过通道或腔室，该通道或腔室连续通过适合于变性、引物退火和引物延伸的扩增阶段的不同温度区，例如微流体装置中的通道，诸如硅芯片器件，其连续通过设置在基部的不同温度区域，该基部适于沿变性、引物退火和引物延伸阶段的通道连续重复。用于在芯片上执行连续流核酸扩增的此类微流体结构如以下文献所述：Auroux et al.,Minaturised Nucleic Acid Analysis Lab Chip(2004)4,534-546(Auroux等人，微型核酸分析实验室芯片(2004年)，第4卷第534-546页)。此类结构可以通过使用标准的微加工技术来制造，例如使用光刻来限定流体网络，然后限定蚀刻或沉积步骤以形成所需的一个或多个通道，例如在PMMA、丙烯酸、PerspexTM或玻璃基底中。玻璃或PMMA或其他材料中的盖板可以被覆盖或不被覆盖以覆盖通道。一个或多个通道的基部可以通过结合到硅芯片和温度传感器的基底以及加热或热泵(帕尔帖)元件来形成，使得反应混合物与这些传感器和致动器直接接触，并且可以包括或不可以包括温度控制电路。
另选地，一个或多个通道的基部可以由印刷电路板(PCB)外壳温度传感器形成，使得它们与反应混合物直接接触。PCB也可以容纳加热或热泵元件、传感器接口和温度控制电路。存在于微流体通道或腔室内的试剂可以是缓冲扩增反应混合物的那些，其可以包括选择的能够在适于扩增所选序列的位点与靶点杂交的引物、扩增所需的一种或多种酶以及过量的所有四种dNTP。
温度控制可以通过比例积分微分(PID)控制器来实现，该控制器是最常见的闭环反馈控制系统之一。然后可以使用测量的温度与目标温度之间的错误计算所需的加热程度。可以基于电流误差直接计算该输出电平(比例)，基于误差历史(积分)计算，并且基于其变化率(导数)的预测未来误差来计算。相似地，PI控制器可以基于误差的当前和历史值使温度稳定，如Iordanov等人(2004年)所述(如上)。另选地，可以实施诸如脉宽调制或占空比等技术。
或者该技术可以选择为具有往复式系统，由此扩增混合物在所需的温度区之间的微型腔室中前后移动以进行热循环。作为用于热循环的接触加热的替代方案，也可以采用各种非接触加热方法，同样如同一综述文章中所述，例如包括热空气介导加热、利用IR光、激光介导加热、诱导加热和微波辐射。
在一个实施例中，可类似地执行基于流动的解链。例如，包含扩增产物的样本可以被设置成沿温度梯度的轴线流动并且由检测器诸如荧光检测器来监测。如本文所述，当样本流经温度梯度时，可以检测到扩增指标(例如荧光)的变化。基于样本沿着梯度的位置和沿着梯度的已知温度条件，检测到的扩增指标的变化可能与特定的解链温度(或温度窗口)相关联。样本可以使用装置诸如芯片或电路板以及通道来流动，如本文结合基于流动的PCR扩增所述。温度梯度可使用一个或多个加热器来实现，如本文结合基于流动的PCR扩增所述。
在根据本发明的示例性实施例中，数字核酸扩增(例如，dPCR)可以使用包括一系列反应位点或腔室的微加工芯片来执行，样本被引入装置时被分离成单独的反应体积(样本部分)。在此类装置中，在经受扩增测定时，包括例如热循环的各个阶段，样本部分保留在其单独的反应位点或腔室中。
在其他实施例中，反应体积可以使用小滴分散。例如，可使用装置例如通过吸取样本和油通过喷嘴生成多个小滴。在一个实施例中，这些小滴可以为约1nL。然后可以转移用于热循环的小滴，使得可实现PCR扩增。例如，可以将小滴转移至具有反应位点和腔室的PCR板或芯片，并且热循环仪可以用于使小滴循环通过扩增阶段。然后可以使小滴暴露于读取器以便确定扩增结果。例如，PCR板或芯片可以装载到读取器上，该读取器从每个反应位点或腔室吸取液滴并使它们暴露于读取器(诸如测量荧光的检测器)。
在另一个实施例中，在生成小滴后，可以采用基于流动的技术执行热循环。例如，可以使小滴流过通道或腔室，该通道或腔室连续通过适合于变性、引物退火和引物延伸的扩增阶段的不同温度区，例如微流体装置中的通道，诸如硅芯片器件，其连续通过设置在基部的不同温度区域，该基部适于沿变性、引物退火和引物延伸阶段的通道连续重复。相似地，然后可以使小滴暴露于读取器以便确定扩增结果。
为执行所述的解链分析，可以将小滴装载到诸如板或芯片的装置上，并且可以使用加热器来系统地加热小滴，如本文结合分散于反应位点或腔室内执行的解链所述。在另一个实施例中，可以使小滴沿温度梯度向下流动，同时还暴露于检测器诸如荧光检测器，如本文结合基于流动的解链执行实施例所述。在此类构型中，已知温度可以沿梯度与位置相关联，并且其中扩增指标沿梯度变化(例如，减小)的位置可用于确定解链温度。
本领域的技术人员将认识到，上述特征可以以各种方式组合以形成根据本发明的示例性实施例的多种变型形式，并且在不脱离本发明和权利要求的范围的前提下，可以对本发明所公开的示例性实施例的构型和方法进行各种修改。本领域的技术人员还将认识到，相对于本文的一个示例性实施例公开的各种特征可以与其他示例性实施例进行适当修改后使用，即使这些组合在本发明中未予以明确公开。

Claims (46)

1.用于检测和/或定量核酸的方法，所述方法包括：
将包含靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述靶核酸的分子；
使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸；
对于所述多个样本反应体积的所述样本反应体积中的至少一部分，检测或测量扩增的指标；
停止所述扩增测定；并且
在停止所述扩增测定后，加热所述多个样本反应体积，并且对于所述样本反应体积的所述至少一部分中的两个或更多个样本反应体积，检测或测量所述扩增的指标。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括沿反应装置的温度梯度的轴线设置所述样本反应体积。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本反应体积在所述加热过程中沿温度梯度设置，其中所述扩增的指标中的变化各自与温度的变化相关联，所述温度的变化对应于沿所述温度梯度的相应位置。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：
在加热过程中，通过检测沿温度梯度的多个位置处的所述多个样本反应体积中存在的所述扩增的指标的一种或多种变化来生成所检测的数据的连续函数。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样本反应体积容纳在多个单独的反应室中。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括：
基于所述变化对所述靶核酸的所述扩增进行定量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述扩增的指标的所述变化包括在所述加热过程中单个预先确定的温度或用户可选择的温度处检测所述扩增的指标的所述变化。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括：
将所述扩增的指标的所述变化与温度的变化的关联起来；
基于所述温度的变化，识别错误的扩增或确认预期的扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其中识别错误的扩增还包括：
将与每个变化相关联的所述温度的变化与预期的解链温度或解链温度的簇进行比较；并且
基于所述比较识别所述错误的扩增。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述预期的解链温度是基于用于扩增和所述靶核酸的所述扩增测定。
11.根据权利要求9所述的方法，其中
与样本反应体积的变化相关联的温度的所述变化指示存在于所述样本反应体积中的核酸分子的解链温度，并且
预期的温度变化指示所述扩增测定的预期扩增子以及靶核酸分子的预期解链温度。
12.根据权利要求7-11所述的方法，其中所述温度中的每个是所述分离的样本中的一者的温度、包含所述分离的样本的反应装置的温度或者包含所述反应装置的样本块的温度中的至少一者。
13.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：
在所述加热过程中以预先确定的间隔检测所述多个样本反应体积中呈现的所述扩增的指标中的一种或多种变化，其中所述一种或多种变化各自与对应于在检测到所述变化时的相应间隔的温度的变化相关联。
14.根据权利要求1所述的方法，其中对于所述多个样本反应体积，检测所述扩增的指标中的变化还包括：
在加热过程中，通过检测多个不同时间的所述扩增的指标中的至少一部分的一种或多种变化来生成所检测的数据的连续函数。
15.根据权利要求1所述的方法，其中容纳在所述第一多个样本反应体积中的所述靶核酸的所述至少一个分子包括两种不同靶核酸、三种不同靶核酸或四种不同靶核酸中的靶核酸的至少一个分子。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括
基于所述多个样本反应体积的所述扩增的指标的所述变化，对所述两种靶核酸中的每一者的所述扩增进行定量。
17.用于检测和/或定量样本中的核酸的分析方法，所述方法包括：
将包含靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述靶核酸的分子；
使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸以产生扩增产物；
在所述经受扩增测定之后并且在所述样本反应体积的第一温度处，对于所述多个样本反应体积的相应的样本反应体积的扩增的指标进行第一组测量；
基于所述第一组测量，检测和/或测量每个样本反应体积的所述扩增产物的量；以及
以下项中的至少一者：
在所述经受扩增测定的过程中进行一组所述扩增指标的附加测量，其中对于热循环过程的一个或多个循环，在预先确定的测定温度处或附近进行所述至少一组附加的测量；或者
在进行所述第一组测量之后，对于所述多个样本反应体积的至少一部分，对所述扩增的指标进行至少一种扩增后测量。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一温度和/或所述预先确定的测定温度为(a)所述分离的样本中的一者的温度、(b)包含所述分离的样本的反应装置的温度或者(c)包含所述反应装置的块的温度中的至少一者。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种扩增后测量在高于所述第一温度的温度下进行。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述扩增的指标包括所述样本反应体积的荧光。
21.根据权利要求17所述的方法，其中进行所述一组附加测量还包括：将所述附加测量中的每个与定量循环值关联起来；
将与所述附加测量相关联的所述定量循环值与所述扩增测定的预期定量循环值进行比较；并且
基于所述比较识别错误的扩增产物。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括：
基于所述一组附加测量对所述样本中的所述靶核酸进行定量。
23.根据权利要求17所述的方法，其中在扩增后温度高于所述第一温度时，进行一组附加测量还包括：
基于所述一组附加测量，识别所述扩增的指标的一种或多种变化；
将所述至少一种变化与扩增后温度关联起来；
将与所述至少一种变化相关联的所述扩增后温度与所述靶核酸的预期解链温度或解链温度的簇进行比较；并且
基于所述比较识别错误的扩增产物。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括：
基于所述一组附加测量和所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述靶核酸进行定量。
25.根据权利要求17所述的方法，其中在所述扩增后温度高于所述第一温度时，对所述多个样本反应体积的至少一部分的所述扩增的指标进行至少一种其他测量，还包括：
在不同的扩增后温度下，对所述多个样本反应体积的至少一部分的所述扩增的指标进行多种其他测量，其中所述扩增后温度高于所述第一温度；
基于所述测量，识别所述扩增的指标的多种变化；
将所识别的变化中的每一者与扩增后温度关联起来；
将与所述变化的每一者相关联的所述扩增后温度与所述靶核酸的预期温度进行比较；
基于所述比较识别错误的扩增产物；并且
基于对所述扩增的所述指标的测量和所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述靶核酸进行定量。
26.用于检测和/或定量样本中的核酸的分析方法，所述方法包括：
将包含靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述靶核酸的分子；
使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述靶核酸以产生扩增产物；
在所述经受扩增测定的过程中，并且在预先确定的温度下，对于所述多个样本反应体积的至少一部分的扩增的第一指标进行多种测量；
基于对所述扩增的指标的所述测量，检测和/或测量每个样本反应体积的所述扩增产物的量；并且
在所述经受扩增测定之后，对于所述多个样本反应体积的至少一部分的扩增的第二指标进行至少两种测量，其中所述至少两种测量中的第一者在第一温度下进行，并且所述至少两种测量中的第二者在高于所述第一温度的第二温度下进行。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述预定温度、所述第一温度和/或所述第二温度中的每个为(a)所述分离的样本中的一者的温度、(b)包含所述分离的样本的反应装置的温度或者(c)包含所述反应装置的块的温度中的至少一者。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增的第一指标由非嵌入染料产生，并且所述扩增的第二指标由嵌入染料产生。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述扩增的第一指标由染料标记的探针产生，所述染料标记的探针配置为指示所述靶核酸的扩增。
30.根据权利要求26所述的方法，还包括：
基于所述至少两种测量，识别所述扩增的指标的一种或多种变化；
将所述至少一种变化与扩增后温度关联起来；
将与所述至少一种变化相关联的所述扩增后温度与所述靶核酸的预期解链温度进行比较；并且
基于所述比较识别错误的扩增产物。
31.根据权利要求30所述的方法，还包括：
基于对所述扩增的第二指标的测量和所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述靶核酸进行定量。
32.根据权利要求30所述的方法，其中对所述扩增的指标进行多种测量还包括：
将所述多个样本体积的所述扩增的第一指标的所述测量与定量循环值关联起来；
将与所述多种测量相关联的所述定量循环值与所述扩增测定的预期定量循环值进行比较；并且
基于所述比较识别错误的扩增产物。
33.根据权利要求32所述的方法，还包括：
基于对所述扩增的第一指标的测量、对所述扩增的第二指标的测量和所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述靶核酸进行定量。
34.用于检测和/或定量样本中的核酸的分析方法，所述方法包括：
将包含至少三种靶核酸的样本分离在多个样本反应体积中，其中所述多个样本反应体积包括第一多个样本反应体积和第二多个样本反应体积，所述第一多个样本反应体积各自包含所述至少三种靶核酸的至少一个分子，并且所述第二多个样本反应体积各自不含所述至少三种靶核酸的分子；
使所述多个样本反应体积经受扩增测定，其中所述扩增测定配置为扩增所述至少三种靶核酸以产生扩增产物；
在预先确定的扩增测定温度下所述经受扩增测定过程中，对与所述多个样本反应体积的所述至少三种靶核酸中的第一者和第二者相关联的至少两种扩增的指标进行多种测量；
基于对扩增的所述至少两种指标的所述测量，检测和/或测量每个样本反应体积的所述扩增产物的量；
在所述经受扩增测定之后，对于所述多个样本反应体积的至少一部分的所述至少三种靶核酸中的第三者相关联的扩增的第三指标进行至少两种测量，其中所述至少两种测量中的第一者在第一温度下进行，并且所述至少两种测量中的第二者在高于所述第一温度的第二温度下进行；并且
基于对所述扩增的所述第一指标、第二指标和第三指标的测量，对所述样本中的所述至少三种靶核酸进行定量。
35.根据权利要求34所述的方法，还包括
基于对所述扩增的至少两种指标进行多种测量，测定所述多个样本反应体积的发射角，其中在所述经受扩增测定的过程的多次循环中对所述扩增的至少两种指标进行测量。
36.根据权利要求35所述的方法，其中测定所述多个样本反应体积的发射角还包括：
测定对应于对给定样本反应体积进行所述多种测量的数据点的线的斜率，其中所述数据点包括在给定循环中进行对于所述扩增的两种指标中的每一者的测量值，并且所述线包括横跨多次循环的数据点。
37.根据权利要求36所述的方法，还包括：
将所测定的所述样本反应体积的斜率与所述至少三种靶核酸的预期斜率或样本反应体积的聚集斜率进行比较；并且
基于所述比较识别错误的扩增产物。
38.根据权利要求36所述的方法，还包括：
基于对所述扩增的所述第一指标、第二指标和第三指标的测量以及所识别的错误的扩增产物，对所述样本中的所述至少三种靶核酸进行定量。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述的温度中的每个是所述分离的样本中的一者的温度、包含所述分离的样本的反应装置的温度或者包含所述反应装置的块的温度中的至少一者。
40.用于检测或定量样本中的核酸的系统，所述系统包括：
反应装置；
电子处理器；
存储器，所述存储器包括用于执行至少一部分方法1-39的指令；
输入/输出装置，所述输入/输出装置包括输入装置和显示器；
其中所述电子处理器执行所述指令并且在所述显示器上显示一种或多种靶核酸的量。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述存储器为随机存取存储器。
42.用于检测或定量样本中的核酸的系统，所述系统包括：
电子处理器；
存储器，所述存储器包括用于执行至少一部分方法1-39的指令；
输入/输出装置，所述输入/输出装置包括输入装置和显示器；
其中所述电子处理器执行所述指令并且在所述显示器上显示有关一种或多种靶核酸的检测的信息。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述存储器为随机存取存储器。
44.用于检测或定量样本中的核酸的系统，所述系统包括：
反应装置，所述反应装置配置为容纳或提供来自包含核酸的样本溶液的多个样本反应体积；
电子处理器；
温度控制器；
存储器，所述存储器包括用于下列操作的指令：(1)检测或测量所述样本反应体积的至少一部分的扩增的指标，(2)加热所述多个样本反应体积，以及(3)检测或测量所述样本反应体积的所述至少一部分中的一者或多者的所述扩增的指标；
输出装置，所述输出装置包括显示器；
其中所述电子处理器执行所述指令并且显示(1)所述扩增的指标的检测和/或量和/或(2)所述样本反应体积的至少一部分中的一者或多者的所述扩增的指标的所述变化中的至少一者。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述存储器为随机存取存储器。
46.根据权利要求1所述的方法，其中检测或测量扩增的指标包括对于所述样本反应体积的至少一部分的每一者检测或测量一种扩增的指标。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018119443A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 The Regents Of The University Of California Method and device for digital high resolution melt
JP6754301B2 (ja) * 2017-01-05 2020-09-09 株式会社日立製作所 ドロップレットデジタルｐｃｒの測定方法および測定装置
EP3743211A4 (en) 2018-01-22 2021-11-24 Luminex Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE ANALYSIS OF DISCRETE MELT
EP4293673A3 (en) * 2018-01-24 2024-03-27 Sniper (Suzhou) Life Technology Co., LTD Detection instrument for digital pcr and quantitative detection method for digital pcr
US20220411858A1 (en) * 2019-11-29 2022-12-29 Mgi Tech Co., Ltd. Random emulsification digital absolute quantitative analysis method and device

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4257774A (en) 1979-07-16 1981-03-24 Meloy Laboratories, Inc. Intercalation inhibition assay for compounds that interact with DNA or RNA
EP0487218B1 (en) 1990-10-31 1997-12-29 Tosoh Corporation Method for detecting or quantifying target nucleic acid
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5436134A (en) 1993-04-13 1995-07-25 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5658751A (en) 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
US8900811B2 (en) * 2000-11-16 2014-12-02 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for generating thermal melting curves in a microfluidic device
US7387887B2 (en) 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US7587279B2 (en) * 2004-07-06 2009-09-08 Genomic Health Method for quantitative PCR data analysis system (QDAS)
US20060057209A1 (en) 2004-09-16 2006-03-16 Predicant Biosciences, Inc. Methods, compositions and devices, including microfluidic devices, comprising coated hydrophobic surfaces
US20060105453A1 (en) 2004-09-09 2006-05-18 Brenan Colin J Coating process for microfluidic sample arrays
CA2673748C (en) * 2007-01-29 2016-08-16 Scientific Institute Of Public Health (Iph) Transgenic plant event detection
JP5368321B2 (ja) 2007-03-02 2013-12-18 ディ・エヌ・エイ・エレクトロニクス・リミテッド 固相ｐＨ検出を用いたｑＰＣＲ
JP2011530305A (ja) * 2008-08-12 2011-12-22 ストークス バイオ リミテッド デジタルｐｃｒのための方法
US10351905B2 (en) * 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
EP2569449A4 (en) * 2010-05-14 2013-12-04 Life Technologies Corp IDENTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
US20130273547A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-17 Samsung Techwin Co., Ltd. Method to determine and correct baseline and to characterize pcr amplification kinetics
AU2013249123A1 (en) * 2012-04-19 2014-12-11 Life Technologies Corporation Method of performing digital PCR
CN109486902B (zh) * 2012-04-19 2023-02-28 生命技术公司 核酸扩增
US9970052B2 (en) * 2012-08-23 2018-05-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with a generic reporter
EP3372612A1 (en) * 2013-03-15 2018-09-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with a generic reporter
CN108291251A (zh) * 2015-09-22 2018-07-17 生命技术公司 用于核酸分析的系统和方法

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