JP2023531964A - 生体試料を分析するためのシステム及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、核酸同定のための方法及びシステムを提供する。核酸分子の同定は、複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成することと、二本鎖核酸分子を変性させることと、１つ以上の変性プロファイルを生成するために変性のシグナルを検出することとを含み得る。１つ以上の変性プロファイルは、核酸分子を同定するために使用可能であり得る。本明細書に記載の方法及びシステムは、単一の分析からの複数の核酸分子の同定を提供することができる。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０４２，３５３号の利益を主張し、これは、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

政府所有権の声明
本発明は、国立がん研究所によって授与された中小企業技術革新研究（Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）助成金番号１Ｒ４３ＣＡ２２１５９７－０１Ａ１の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

マイクロ流体デバイスは、小規模な流体を取り扱う構造を含むデバイスである。典型的には、マイクロ流体デバイスはサブミリメートル規模で動作し、マイクロリットル、ナノリットル、又はより少量の流体を取り扱う。マイクロ流体デバイスの１つの用途は、分析物分析、例えばデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）である。複数のパーティションを備えたマイクロ流体デバイスは、ｄＰＣＲに有用であり得る。未知の試料のＰＣＲ増幅率を１セットの既知のｑＰＣＲ標準の率と比較することによって鋳型を定量化する定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とは異なり、ｄＰＣＲは、より高い感度、より高い精度、及びより高い再現性を提供することができる。

ゲノム研究者及び臨床医にとって、ｄＰＣＲは、まれな変異株の検出、コピー数多型の定量化、及び次世代シーケンシングライブラリの定量化において特に強力である。無細胞ＤＮＡ及びウイルス量の定量化を用いるリキッドバイオプシーのための臨床の場における潜在的な使用は、ｄＰＣＲ技術の価値を更に高める。既存のｄＰＣＲソリューションでは、エラストマーのバルブアレイ、シリコン貫通孔アプローチ、及び油滴のマイクロ流体のカプセル化が使用されてきた。利用可能なｄＰＣＲプラットフォームの数が増えているにもかかわらず、ＰＣＲ増幅サイクルの数を数えることに依拠しているより古いｑＰＣＲ技術と比較すると、ｄＰＣＲは不利な状況であった。スループット、使いやすさ、性能、及びコストの組み合わせは、ｄＰＣＲが市場においてより採用されるための主な障壁である。

本明細書では、１つ以上の分析物を検出、同定、又は定量化するために有用であり得る方法及びシステムが提供される。本開示は、試料調製、核酸増幅、分析物分析、多重分析物分析、又はそれらの任意の組み合わせのための方法、システム、及びデバイスを提供する。本明細書に記載の方法、システム、及びデバイスは、他のシステム及び方法と比較して、コスト又は複雑さを低減して分析物の検出、同定、又は定量化を可能にすることができる。

一態様では、本開示は、核酸同定のための方法であって、（ａ）複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成するために複数の核酸分子を使用することであって、（ｉ）複数の二本鎖核酸分子の第１のサブセットが、複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み、（ｉｉ）複数の二本鎖核酸分子の第２のサブセットが、複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子に対応する第２の配列を含む第２の二本鎖核酸分子を含み、追加の配列を含まない、使用することと、（ｂ）複数の二本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子を変性させることと、（ｃ）複数の変性プロファイルを生成するために、変性を示すシグナルを検出することであって、ｉ．複数の変性プロファイルのうちの第１の変性プロファイルが、第１の二本鎖核酸分子の変性に由来し、ｉｉ．複数の変性プロファイルのうちの第２の変性プロファイルが、第２の二本鎖核酸分子の変性に由来し、ｉｉｉ．第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとが異なる、検出することと、（ｄ）複数の核酸分子のうちのある核酸分子を同定するために、複数の変性プロファイルを処理することと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）の前に、複数の核酸分子及び複数のフォワードプライマーを複数のチャンバに提供することを更に含む。いくつかの実施形態において、複数のフォワードプライマーが、（ｉ）第１の核酸分子の少なくとも一部に相補的な第１の領域、及び、第１の核酸分子に相補的でなく、追加の配列に対応する第２の領域を含む第１のフォワードプライマーと、（ｉｉ）第２の核酸分子の少なくとも一部に相補的な第２のフォワードプライマーと、を含む。いくつかの実施形態において、複数のフォワードプライマーが、ユニバーサルプライマーではない。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）の前に、複数の第１の伸長産物を生成するために、複数のフォワードプライマーをプライマー伸長反応に供することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）の前に、複数の第１の伸長産物を複数のリバースプライマーと接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、複数のリバースプライマーが、ユニバーサルプライマーである。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）の前に、複数の第２の伸長産物を生成するために、複数のリバースプライマーをプライマー伸長反応に供することを更に含む。いくつかの実施形態において、複数の第２の伸長産物が、複数の二本鎖核酸分子である。

いくつかの実施形態において、本方法は、シグナルを検出するために、複数のチャンバの少なくとも一部をイメージングすることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、シグナルを検出するために、複数のチャンバをイメージングすることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、二本鎖核酸分子を変性させるために、複数の二本鎖核酸分子を制御された加熱に供することを更に含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子が、シグナルの由来である挿入色素を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸分子が、シグナルの由来である複数の異なる挿入色素を含む。いくつかの実施形態において、シグナルが、光シグナルである。いくつかの実施形態において、複数のチャンバのうちのあるチャンバが、約５００ピコリットル以下の容積を有する。いくつかの実施形態において、チャンバの容積が、約２５０ピコリットル以下である。いくつかの実施形態において、複数のチャンバが、約１，０００以上のチャンバを含む。いくつかの実施形態において、複数のチャンバが、約１０，０００以上のチャンバを含む。

別の態様において、本開示は、核酸同定のためのシステムであって、核酸分子を同定するためのシグナルを収集及び処理するように構成されている検出ユニットと、検出ユニットに動作可能に結合されている１つ以上のプロセッサと、を備え、１つ以上のプロセッサが、個々に又は集合的に、（ｉ）複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成するために複数の核酸分子を使用することであって、（ｉ）複数の二本鎖核酸分子の第１のサブセットが、複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み、（ｉｉ）複数の二本鎖核酸分子の第２のサブセットが、複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子に対応する第２の配列を含む第２の二本鎖核酸分子を含み、追加の配列を含まない、使用することと、（ｉｉ）複数の二本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子を変性させることと、（ｉｉｉ）複数の変性プロファイルを生成するために、変性を示すシグナルを検出することであって、（Ａ）複数の変性プロファイルのうちの第１の変性プロファイルが、第１の二本鎖核酸分子の変性に由来し、（Ｂ）複数の変性プロファイルのうちの第２の変性プロファイルが、第２の二本鎖核酸分子の変性に由来し、（Ｃ）第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとが異なる、検出することと、（ｉｖ）複数の核酸分子のうちのある核酸分子を同定するために、複数の変性プロファイルを処理することと、を行うようにプログラムされているか又は別様に構成されている、システムを提供する。

いくつかの実施形態において、複数のチャンバのうちのあるチャンバが、約５００ピコリットル以下の容積を有する。いくつかの実施形態において、チャンバの容積が、約２５０ピコリットル以下である。いくつかの実施形態において、複数のチャンバが、約１，０００以上のチャンバを含む。いくつかの実施形態において、複数のチャンバが、約１０，０００以上のチャンバを含む。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、複数のチャンバの少なくとも一部をイメージングするように構成されている。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、複数のチャンバをイメージングするように構成されている。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、約１５ミリメートル（ｍｍ）×約１５ｍｍ以上の視野を有するカメラを備える。いくつかの実施形態において、視野が、約５０ｍｍ×約７５ｍｍ以上である。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサを備えるカメラを備える。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、カメラと複数のチャンバとの間に配設されているテレセントリックレンズを更に備える。いくつかの実施形態において、検出ユニットが、光シグナルを収集するように構成されている光学ユニットを含む。いくつかの実施形態において、光学ユニットが、４つ以上のチャネルを備え、各チャネルが、異なる波長の光を収集するように構成されている。

いくつかの実施形態において、システムが、複数のチャンバアレイを備える基板を受け入れるように構成されており、複数のチャンバアレイのうちのあるチャンバアレイが、複数のチャンバを含む。いくつかの実施形態において、基板が、少なくとも４つのチャンバアレイを備える。いくつかの実施形態において、チャンバアレイが、別のチャンバアレイから流体的に隔離されている。いくつかの実施形態において、システムが、プレートを受け入れるように構成されており、プレートが、上記基板を含む複数の基板を保持するように構成されている。いくつかの実施形態において、システムは、１つ以上のプロセッサに動作可能に結合されている熱ユニットを更に備え、熱ユニットが、複数のチャンバの温度を制御するように構成されている。いくつかの実施形態において、１つ以上のプロセッサが、熱ユニットに、二本鎖核酸分子を変性させるために複数のチャンバを制御された加熱に供するように指示する。いくつかの実施形態において、熱ユニットが、熱電温度制御ユニットを含む。

本開示の追加の態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明されている、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなるであろう。認識されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において修正することができる。したがって、図面及び説明は、本質的に例示的なものと考えられるべきであり、限定的なものとして考えられるべきではない。

参照による組み込み
本明細書に言及される全ての公開物、特許、及び特許出願は、各個別の公開物、特許、又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、明細書は任意のそのような矛盾する資料に取って代わり、及び／又は優先するように意図されている。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の、特徴及び利点のより良好な理解は、例示的な実施形態について記載し、本発明の原理が利用されている以下の詳細な説明、並びに添付の図面（本明細書の「図（ｆｉｇｕｒｅ）」及び「図（ＦＩＧ．）」も同様に）を参照することにより得られるであろう。

ポリメラーゼ連鎖反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、デジタルポリメラーゼ連鎖反応による核酸分析の比較例を示す図である。 統合デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）プラットフォームの例を使用して、試料として処理するためのワークフローの例を示す図である。 図３Ａ～３Ｇは、ｄＰＣＲの例示的な消耗品及び例示的なシステムから生成された例示的なデータを示す図である。図３Ａは、複数のマイクロ流体アレイを備える例示的なマイクロ流体デバイスを示す図である。 例示的な消耗品の走査型電子顕微鏡画像を示す図である。 試料デジタル化及びマイクロ流体アレイ全体にわたる一貫性の例を示す図である。 例示的な消耗品の４チャネルイメージングの一例を示す図である。 例示的な消耗品及び統合システムからの例示的なアッセイ結果を示す図である。 例示的な消耗品及び統合システムからの別の例示的なアッセイ結果を示す図である。 例示的な消耗品及び統合システムからの別の例示的なアッセイ結果を示す図である。 図４Ａ及び４Ｂは、ｄＰＣＲパーティションのリアルタイム分析の例を示す図である。図４Ａは、陽性パーティションのリアルタイムＰＣＲ曲線の例を示す図である。 非特異的増幅を起こしやすいアッセイの陽性曲線の例示的なリアルタイムＰＣＲ曲線を示す図である。 核酸同定の例示的なプロセスの概略図である。 方法及びシステムの性能を決定するためのワークフローの例を示す図である。 図７Ａ～７Ｃは、システム性能を実証する例示的なプロセスを示す図である。図７Ａは、試料中の核酸分子を定量化及び精製する例示的な試料調製ワークフローを示す図である。 試料分配及び変性プロファイルの例を示す図である。 試料中の分析物を同定するための融解曲線の例示的なデータベース比較を示す図である。 パネルベースの呼吸器病原体の例示的な変性プロファイルを示す図である。 図９Ａ～９Ｃは、例示的な統合システムの例示的な設計パラメータを示す図である。図９Ａは、全プレートイメージング装置の例示的な標的パラメータを示す図である。 例示的なマイクロ流体アレイ及び視野を示す図である。 例示的な統合システムから生成された例示的な画像を示す図である。 イメージングのための例示的な光学モジュールを示す図である。 ｄＰＣＲのための例示的な統合システムを示す図である。 本明細書で提供される方法を実施するようにプログラムされ、又は他の方法で構成されたコンピュータシステムを示す図である。 例示的なアッセイのために４つの異なる温度で取得された例示的な蛍光画像の例を示す図である。 ３つの異なる試料標的の融解プロファイルの例を示す図である。 図１５Ａ～１５Ｅは、微生物種同定のための例示的な融解曲線分析の例を示す図である。図１５Ａは、細菌種のライブラリの例示的な融解プロファイルの例を示す。 選択された数のバチルス細菌種の例示的な融解プロファイルを示す図である。 選択された数のブドウ球菌種の例示的な融解プロファイルを示す図である。 門によって組織化された細菌種のヒートマップを示す図である。 別の例示的なヒートマップを示す図である。

本発明の様々な実施形態が本明細書において示され、かつ記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されていることは、当業者には明らかであろう。多くの変化形、変更、及び置換が、本発明から逸脱することなく、当業者には思いつき得る。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が採用され得ることを理解されたい。

「少なくとも～」、「～より大きい」、又は「～以上」という用語が、一連の２つ以上の数値のうちの最初の数値の前にある場合は常に、「少なくとも～」、「～より大きい」、又は「～以上」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、１、２、又は３以上は、１以上、２以上、又は３以上と同等である。

「～を超えない」、「～より小さい」、又は「～以下」という用語が、一連の２つ以上の数値のうちの最初の数値の前にある場合は常に、「～を超えない」、「～より小さい」、又は「～以下」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、３、２、又は１以下は、３以下、２以下、又は１以下と同等である。

本明細書で使用される「試料」という用語は、概して、分析物を含むか、又は含むことが疑われる任意の試料を指す。例えば、試料は、１つ以上の分析物を含む生体試料であり得る。生体試料は、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、痰、便、及び涙から得ることができる（例えば、抽出若しくは単離される）か、又はそれらを含み得る。生体試料は、流体試料又は組織試料（例えば、皮膚試料）であり得る。いくつかの例では、試料は、全血などの無細胞体液から得られる。このような場合、試料は、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、試料は、循環腫瘍細胞、がんバイオマーカー、又は両方を含み得る。いくつかの例では、試料は、環境試料（例えば、土、廃棄物、周囲空気など）、工業試料（例えば、あらゆる工業プロセスからの試料）、及び食品試料（例えば、乳製品、野菜製品、及び肉製品）である。試料は、マイクロ流体デバイスに装填する前に処理されてもよい。例えば、試料は、細胞を溶解する、タンパク質を精製する、又は試薬を含めるために処理されてもよい。代替的に、又は加えて、試料は、マイクロ流体デバイスに装填する前に処理されてもよい。

本明細書で使用される場合、「流体の」又は「マイクロ流体の」という用語は、交換可能に使用され得、概して、チャンバのアレイと流体連通している少なくとも１つのチャネルを含む、チップ、エリア、デバイス、物品、又はシステムを指し得る。チャネルは、約１０ミリメートル（ｍｍ）以下、約５ｍｍ以下、約４ｍｍ以下、約３ｍｍ以下、約２ｍｍ以下、約１．５ｍｍ以下、約１ｍｍ以下、約７５０マイクロメートル（μｍ）以下、約５００μｍ以下、約２５０μｍ以下、約１００μｍ以下、又はそれ未満以下の断面寸法を有し得る。チャンバは、約１００マイクロリットル（μＬ）以下、５０μＬ以下、２５μＬ以下、１０μＬ以下、５μＬ以下、１μＬ以下、５００ナノリットル（ｎＬ）以下、２５０ｎＬ以下、１００ｎＬ以下、５０ｎＬ以下、２５ｎＬ以下、１０ｎＬ以下、５ｎＬ以下、１ｎＬ以下、５００ピコリットル（ｐＬ）以下、２５０ｐＬ以下、１００ｐＬ以下、５０ｐＬ以下、２５ｐＬ以下、１０ｐＬ以下、５ｐＬ以下、１ｐＬ以下、又はそれ未満以下の容積を有し得る。

本明細書で使用される場合、「流体」という用語は、概して、液体又は気体を指す。流体は、定義された形状を維持できず、観察可能な時間枠の間に流れて、流体が入れられる容器を満たす。したがって、流体は、流れることができる任意の好適な粘度を有し得る。２つ以上の流体が存在する場合、各流体は、任意の流体（例えば、液体、ガスなど）の中から独立して選択され得る。

本明細書で使用される場合、「分配する」という用語は、概して、複数の部分への分割若しくは分散、又は共有を指す。例えば、分配された試料は、他の試料から隔てられた試料である。試料の分配を可能にする構造の例には、ウェル、チャンバ、液滴、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

本明細書で使用される場合、「加圧ガス抜き」又は「加圧脱気」という用語は、交換可能に使用され得、一般に、圧力差の適用を通じて、気体（例えば、空気、窒素、酸素など）をデバイス（例えば、マイクロ流体デバイス）のチャネル又はチャンバからチャネル又はチャンバの外部環境へと除去又は排出することを指す。圧力差は、チャネル又はチャンバと、チャネル又はチャンバの外部環境との間に適用され得る。圧力差は、デバイスへの１つ以上の入口への圧力源の適用、又はデバイスの１つ以上の表面への真空源の適用によって提供され得る。加圧ガス抜き又は加圧脱気は、チャネル又はチャンバの１つ以上の側面を覆うフィルム又は膜を通して可能にすることができる。

「少なくとも～」、「～より大きい」、又は「～以上」という用語が、一連の２つ以上の数値のうちの最初の数値の前にある場合は常に、「少なくとも～」、「～より大きい」、又は「～以上」という用語は、その一連の数値の各数値に適用される。例えば、１、２、又は３以上は、１以上、２以上、又は３以上と同等である。

本明細書では、１つ以上の分析物（例えば、核酸分子）を検出、同定、又は定量化するために有用であり得る方法及びシステムが提供される。本開示は、試料調製、核酸増幅、分析物分析、多重分析物分析、又はそれらの任意の組み合わせのための方法、システム、及びデバイスを提供する。本明細書に記載の方法、システム、及びデバイスは、他のシステム及び方法と比較して、コスト又は複雑さを低減して分析物の検出、同定、又は定量化を可能にすることができる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、試料中の特定の少量の核酸分子をより大量（例えば、研究に十分な量）にｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅することを表す。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して、核酸試料の相対的な定量化を行うことができる。デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、３８４ウェルプレートから油中水型乳剤を使用した液滴ベースのプラットフォームまで、様々なプラットフォームにおいて、稀な対立遺伝子の検出に使用することができる。デジタルＰＣＲでは、試料の希釈を利用して、パーティションあたり１つ未満の核酸テンプレートを含む多数のパーティションを生成することができる。次いで、テンプレートの増幅に成功したパーティションの数をカウントすることによって、テンプレートの総数を定量化することができる。複数のテンプレートを有するパーティションを計上するために、ポアソン統計を適用することができる。未知の試料のＰＣＲ増幅率を１セットの既知の標準の率と比較することによってテンプレートを定量化するｑＰＣＲとは異なり、ｄＰＣＲによる定量化は、より高い感度、より高い精度、及びより高い再現性を有することができる。

いくつかの例では、ＰＣＲプラットフォームは、分析物（例えば、核酸分子）の検出、同定、又は定量化のための他の技法と連携して使用され得る。例えば、融解曲線分析（ＭＣＡ）は、挿入蛍光色素を使用して、加熱中の二本鎖核酸分子（例えば、ＰＣＲ産物又はアンプリコン）の変性特性を評価することができる。精密な温度制御により、高分解能融解（ＨＲＭ）は、例えば、メチル化分析、突然変異スキャニング、及びジェノタイピングなど、核酸配列のわずかな差を検出することができる。プローブベースの融解技術は、シーケンシング及び改善された多重化を更に補完することができる。ｄＰＣＲと同様に、試料をパーティションごとに１つ未満のテンプレートに希釈することにより、異なるアンプリコンの融解曲線を各パーティションで明確に区別し、バルク溶液での融解曲線分析の平均化効果を回避することができる。デジタル融解曲線分析（ｄＭＣＡ）は、例えば、細菌デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列プロファイリング、がん液体生検のための分子不均一性の簡易プロファイリング、Ｋｉｒｓｔｅｎ Ｒａｓ １（ＫＲＡＳ）ジェノタイピングなど、様々な用途に有用であり得る。図１に示すように、二本鎖核酸分子の温度依存性解離を利用することにより、ｄＭＣＡは別の次元（例えば、温度）を提供して、核酸の同定及び定量化のための定量化正確度及び多重性を更に改善することができる。

ＭＣＡの実装とデジタルプラットフォーム（ｄＰＣＲプラットフォームなど）との統合には、多くの課題があり得る。例えば、試薬デジタル化、効果的で一貫した熱サイクリング、及びイメージングの統合は困難な場合がある。例えば、定量化に高い統計的信頼性を提供するための多数のパーティション（例えば、１０，０００超）、ラボオートメーション機器との統合による高スループット、低コストで拡張性の高い製造、及び蒸発防止など、ｄＭＣＡの消耗品を効果的に実装するには、多くの考慮事項がある。融解ベースの化学物質と消耗品との統合も困難な場合がある。例えば、選択されたプラスチックと組み合わせて選択された挿入染料を使用すると、染料がプラスチック材料に非特異的に吸着する可能性がある。

現在のＭＣＡの手法では、ｄＭＣＡの課題に対処できない可能性がある。例えば、熱サイクリングとイメージングとを同時に行うためにシリコンスルーホールアレイを使用すると、スループットが制限され（例えば、実験ごとに１つの試料に制限される場合がある）、半導体処理のコストの点で製造可能性が低くなる場合がある。別の手法は、少なくとも部分的にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から形成されたマイクロ流体デバイスを使用することができる。ただし、ＰＤＭＳから形成されたマイクロ流体デバイスは、製造再現性が低い場合があり、試薬の蒸発を防ぐことができず（例えば、熱サイクリング中に相当量の試薬が蒸発する可能性がある）、化学的適合性が限られている場合がある。

本開示は、ｄＭＣＡの課題に対処するための方法及びシステムを提供する。本明細書に記載の方法及びシステムは、試料を分配するためにマイクロ流体アレイを使用することができる。マイクロ流体アレイは、試薬分配のために半透膜又は圧力透過膜で密閉された、行き止まり射出成形マイクロチャンバアレイを含むことができる。例えば、各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年４月４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２５８７３号、２０１７年１１月１６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６２０７８号、２０１９年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６５２８７号を参照されたい。本明細書に記載の方法及びシステムは、ｑＰＣＲと同様の使いやすさ、データ点あたりの低いコスト、及び高いスループットを備えたデジタル融解曲線分析を提供し得る。

本明細書に記載のシステムは、統合ｄＰＣＲプラットフォームを含み得る。ｄＰＣＲプラットフォームは、ｄＰＣＲに使用される様々なプロセス、例えば、試薬の分配、反応混合物の熱サイクリング、及びデータの取得を単一の機器に統合することができる。これにより、ｄＰＣＲワークフローがｑＰＣＲのワークフローを複製することができる可能性があり、計装設計者にとって、ｑＰＣＲ計装と比較して信頼性が向上し、コストが削減される。例えば、図２に示すように、ユーザが反応混合物を消耗品プレートに装填し、プレートを機器に配置し、試料処理プログラムを開始するように、プロセスを完全に自動化することができる。例えば、試料は、溶液２００において提供され得る。試料は、複数の核酸分子を含み得る。溶液２００は、空気圧モジュール又は他の流体操作モジュールを含む流体フローシステムを介してマイクロ流体デバイス２１０に提供され得る。マイクロ流体デバイス２１０は、試料の分配を提供するマイクロ流体アレイであってもよい。マイクロ流体デバイス２１０は、試料を分配するための単一のアレイ、又は試料を分配するための複数のアレイを含み得る。マイクロ流体デバイス２１０は、分析システム２２０に装填され得る。分析システム２２０は、試料を処理及び分析するように構成されている完全に統合された分析プラットフォームであってもよい。代替的に、又は加えて、分析システム２２０は、マイクロ流体デバイス２１０を含んでもよく、試料は、流体デバイス２１０に分配するために分析システムに提供されてもよい。試料処理に続いて、分析システム２２０は、試料を分析し（例えば、検出ユニットを使用して、試料に由来するシグナルを収集することによって）、シグナルを処理して、１つ以上のデータ出力２３０を生成することができる。システムは、ベンチトップシステム（例えば、約２フィート（ｆｔ）×２ｆｔ×２ｆｔのハウジングサイズを有する）であってもよい。システムは、パーティションの複数のアレイを含むマイクロ流体デバイス（例えば、１６個のパーティションアレイを備えるデバイス）を介した走査を可能にする光学モジュールを備える検出ユニットを含み得る。図３Ａは、アレイ当たり２０，０００個のパーティション（例えば、チャンバ）を有する１６個のマイクロ流体アレイを備える例示的なマイクロ流体デバイスを示す。１６個のアレイを有するマイクロ流体アレイは、１６個の異なる試料を同時に処理することを可能にすることができる。検出ユニットは、試料処理及び分析中にリアルタイム検出（例えば、イメージング）を可能にすることができる。

マイクロ流体アレイと統合分析プラットフォームとの組み合わせにより、単純な試料処理及び分析を可能にし、他の方法及びシステムと比較して向上した一貫性を提供することができる。例えば、確率論的マイクロ流体液滴生成メカニズムを利用してバルク反応を分配するか、又は正の流体変位に依存するプラットフォームとは異なり、マイクロ流体アレイ消耗品は、図３ＢのＳＥＭ画像に示されるようなナノリットル容積パーティションの精密な容積と総数の両方を含む、固定された射出成形マイクロチャンバアレイを使用することができる。デバイス形状を使用してパーティションを精密に定義すると、プラットフォームをより柔軟にし、試薬の変動に対してよりロバストにすることができる。例えば、図３Ｃは、３つの異なるマスターミックス－アッセイ組み合わせで実施された３つの実験からの分析された全パーティションの例を示す。９つのプレート（合計１４４アレイ）にわたって、試料あたりの平均合計分析パーティションは２０，４１２個であり、変動係数は０．６８％である。マスターミックス、アッセイ、及び実行全体にわたるこの非常に一貫性のあるパーティション数は、分配プロセスの安定性及びサイト間の一貫性を示すことができる。一例では、機器は、図３Ｄに示すように、試料中の４つの異なる標的の分析及び定量化を可能にする４つの異なる光チャネルをサポートすることができる。消耗品は防湿層として機能することができる熱可塑性物質（例えば、シクロオレフィンポリマー）から作成することができるため、プロセス全体で試薬の蒸発をほとんど又はまったくないようにすることができる。追加の例示的なデータを図３Ｅ～図３Ｇに示す。図３Ｅは、参照物質ダイナミックレンジ定量化を含むウェットラボで検証されたデータのための例示的なシステムを使用する例を示す。図３Ｆは、１０，０００コピー／マイクロリットル（コピー／μＬ）～０．１コピー／μＬのＢＣＲ－Ａｂｌ ＥｕｒｏＳｔａｎｄａｒｄ定量化のための例示的なシステムを使用する例を示す。図３Ｇは、０．１％までのＴａｑＭａｎ ｄＰＣＲ液体生検希少対立遺伝子画分アッセイのための例示的なシステムを使用する例を示す。

本明細書に記載の方法及びシステムは、従来のＰＣＲ熱サイクリング中又はポストＰＣＲ融解中の任意の時点でｄＰＣＲパーティションの蛍光分析を可能にするｄＰＣＲプラットフォームを更に提供し得る。これは、リアルタイム測定ではなく、ｄＰＣＲ液滴又はパーティションのエンドポイント分析を提供する現在のｄＰＣＲプラットフォームに比べて大きな利点である。例えば、非特異的な増幅及び汚染物質は、偽陽性のパーティションを引き起こす可能性がある。エンドポイント分析を使用するｄＰＣＲプラットフォームでは、偽陽性を真陽性と区別することはできない。代替的に、本明細書に記載のシステムでは、個々のパーティションのリアルタイムＰＣＲ動態を監視して、偽真陽性間の区別を可能にしてもよい。例えば、陽性パーティションの蛍光が期待されるＰＣＲ増幅動態に適合しない場合、このパーティションは偽陽性と考えられ、分析から除外され得る。図４Ａは、例示的な統合システムからの例示的なＳＭＡアッセイの増幅動態を示す。この例では、蛍光画像は、全てのサイクルではなく、ＰＣＲ中の所定のサイクルにおいて取得される。撮影される画像の数を減らすことによって、分析及び分析の複雑さが軽減される可能性がある。図４Ａの個々の線は、サイクルにわたる個々のパーティションの蛍光を表す。図４Ｂは、問題のある非特異的増幅を伴う例示的なアッセイを示す。個別のリアルタイム分析により、後期サイクル増幅動態を有するパーティションが明らかになり得る。これらのパーティションには非特異的増幅がある可能性があり、したがって、偽陽性と考えられ、分析から除外され得る。リアルタイムｄＰＣＲ分析の使用は、任意の閾値処理の必要性を排除するために使用することもできる。例えば、期待されるＰＣＲ増幅動態を有するパーティションは陽性と考えられ、その他は全て陰性と考えられる。そのため、ｄＰＣＲ動態のリアルタイム処理は、全体的なｄＰＣＲ分析を改善するとともに、自動化することができる。

一例では、本明細書に記載の方法及びシステムは、デジタルバイオロジー（例えば、単一細胞、単一タンパク質、及び単一核酸分析）に使用することができる。デジタルバイオロジーは、科学の分解能を大幅に向上させた。デジタルゲノミクスでは、試薬を分配することで標準曲線が不要になり、したがって、再現性が大幅に向上する。更に、阻害剤などのバックグラウンド物質も分配され得、反応の特異性及び感度が向上する。現在のｄＰＣＲプラットフォームは、多重化に蛍光プローブを利用する場合があるが、デジタル融解曲線分析はサポートしていない。ｄＰＣＲプラットフォームに融解曲線分析機能を追加し、二本鎖核酸変性の温度依存性を利用することによって、アンプリコン融解シグネチャを評価して非特異的増幅からの偽陽性及びシグナルを排除することができるため、定量化正確度を向上させることができる。更に、別のモダリティである融解温度（Ｔｍ）を追加して、異なる標的を多重化し、データ点あたりのコストを更に削減し、ゲノムバイオマーカーのパネルを高い正確度、精度、感度、及び再現性で定量化することができる。したがって、本明細書に記載されている方法及びシステムは、高性能で使いやすく、手頃な価格のデジタルバイオロジープラットフォームを提供することができ、このプラットフォームは、デジタルゲノミクスの採用を加速し、医療に肯定的な影響を与えることができる。

核酸同定のための方法
一態様では、本開示は、核酸同定のための方法を提供する。本方法は、複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成するために複数の核酸分子を使用することと、二本鎖核酸分子を変性させることと、複数の変性プロファイルを生成するために二本鎖核酸分子の変性を示すシグナルを検出することと、少なくとも１つの核酸分子を同定するために変性プロファイルを処理することとを含み得る。複数の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の第１のサブセット及び二本鎖核酸分子の第２のサブセットを含み得る。二本鎖核酸分子の第１のサブセットは、第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み得る。複数の二本鎖核酸分子は、第２の二本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸分子の第２のサブセットを含み得る。第２の二本鎖核酸分子は、第２の核酸分子に対応する第２の配列を含み得、追加の配列を含まない。第１の二本鎖核酸分子は、変性を受けて第１の変性プロファイルを生成し得、第２の二本鎖核酸分子は、変性を受けて第２の変性プロファイルを生成し得る。第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとは異なり、区別可能であり得る。追加の配列は、第１の二本鎖核酸分子の変性プロファイルを変調して、第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとの間の区別を可能にするか、又は増強し得る。

核酸同定のための例示的な方法を図５に示す。この方法は、１つ以上の標的核酸配列を含む試料を提供することを含み得る。一例では、試料は、第１の標的核酸配列及び第２の標的核酸配列を含み得る。第１の標的核酸配列及び第２の標的核酸配列は、異なる対立遺伝子、遺伝子、配列などであってもよい。一例では、核酸標的は対立遺伝子（例えば、対立遺伝子「Ａ」及び対立遺伝子「Ｂ」）であり、方法は、試料とともに、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプライマー増幅のための試薬を提供することを含み得る。フォワードプライマーは、対立遺伝子特異的プライマーであり得る。フォワードプライマーのうちの１つ以上は、それが特異的である核酸配列にアニーリングしない（例えば、相補的でない）テール又は核酸配列を含み得る。テール又は非相補的核酸配列は、プライマーの５’末端に位置し得る。この方法は、フォワードプライマーを伸長し、標的核酸配列（例えば、対立遺伝子Ａ及び対立遺伝子Ｂに対応する）を増幅するために、プライマー伸長反応を実施することを含み得る。標的配列にアニーリングしないテール又は核酸配列を含むフォワードプライマーは、標的核酸分子に相補的でテール配列を含む核酸分子を生成し得る。テール又は追加の配列のないフォワードプライマーは、標的核酸配列に相補的な配列を生成し得る。拡張フォワードプライマーは、１つ以上のコンセンサスドメインを含み得る。この方法は、標的核酸配列のコピーを生成するためにコンセンサスドメインにアニーリングすることができるリバースプライマー（例えば、ユニバーサルリバースプライマー）を使用することを更に含み得る。第２のプライマー伸長反応を行って、標的核酸分子のコピーである追加の増幅産物を生成することができる。テール又は追加の配列を含む対立遺伝子特異的フォワードプライマーの場合、標的核酸分子のコピーも、テール又は追加の配列の領域を含み得る。標的核酸分子の二本鎖コピーは、（例えば、熱サイクリングを介して）変性させることができ、変性中に二本鎖核酸分子の鎖の分離から生成されるシグナルを生成する。変性シグナルを使用して、標的核酸配列の変性プロファイルを生成することができる。特定の変性プロファイルの存否を使用して、存否を同定するか、又は試料中の核酸分子を同定することができる。標的核酸配列間の配列の差に応じて、変性プロファイルは少なくとも部分的に重複するか、又は解決が困難な場合がある。したがって、テール配列を追加することによって、変性プロファイルが互いに区別可能であり得るように、変性プロファイル間の差を許容又は増強するために、１つ以上の標的核酸分子の変性プロファイルがシフト又は変更することができる。

二本鎖核酸分子は、複数のチャンバ内で生成され得る。代替的に、二本鎖核酸分子はバルク溶液中で生成されてもよく、バルク溶液は複数のチャンバに分配されてもよい。一例では、試料は、複数のチャンバを備えるマイクロ流体デバイスに提供され、複数のチャンバに分配される。試料は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、又はそれ以上の標的核酸分子を含み得る。一例では、試料は、少なくとも１０個の標的核酸分子を含む。別の例では、試料は、少なくとも１５個の標的核酸分子を含む。別の例では、試料は、少なくとも２０個の標的核酸分子を含む。いくつかの例では、標的核酸分子は、一本鎖又は二本鎖核酸分子であってもよい。場合によっては、標的核酸分子は環状である。標的核酸分子は、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。試料は、約１つの核酸分子が各チャンバに提供されるように希釈され得る。試料は、様々なアッセイ試薬及び構成要素とともにチャンバに提供され得る。例えば、試料は、複数のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びポリメラーゼ連鎖反応のための試薬とともに提供され得る。

一例では、試料は、複数のフォワードプライマーとともに複数のチャンバに提供される。複数のフォワードプライマーは、ユニバーサルプライマーであってもよく、又は、標的特異的プライマーであってもよい。一例では、複数のフォワードプライマーはユニバーサルプライマーではなく、標的特異的プライマーである。標的特異的プライマーは、標的特異的プライマーが非標的配列にアニーリングしないように、特異的標的と相補的な配列を有し得る。フォワードプライマーは、単一の領域を含むか、又は複数の領域を含んでもよい。一例では、フォワードプライマーは、標的核酸分子に対して配列相補性を有する単一の領域を含む。別の例では、フォワードプライマーは複数の領域を含み、少なくとも１つの領域は標的核酸分子に対して配列相補性を有し、少なくとももう１つの領域又はテール配列は標的核酸分子に対して配列相補性を有しない（例えば、非相補配列）。非相補配列は、標的核酸分子にアニーリングしないものであり得る。テール又は非相補配列は、追加の配列（例えば、変性プロファイルを変更又はシフトするために二本鎖核酸分子に追加される配列）に対応し得る。テール又は非相補配列は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であり得る。例えば、テール又は非相補配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。追加の配列は、プライマー伸長反応のうちの１つ以上を介して（例えば、テール若しくは非相補配列を含むプライマーを使用して）、又は標的核酸分子若しくはその誘導体に対応するテール若しくは非相補配列を二本鎖核酸分子に連結することによって、追加されてもよい。ヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体が含まれ得る。テール又は非相補配列は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ブリッジ核酸（ＢＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（ＴＯ、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ以上のサブユニットを含み得る。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又はそれらの変異体を含むことができる。ヌクレオチドは、成長している核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含むことができる。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又はより相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵのうちの１つに特異的であるか、又はプリン（すなわち、Ａ若しくはＧ、又はそれらの変異体）又はピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ、若しくはＵ、又はそれらの変異体）に相補的である、任意の他のサブユニットであり得る。

フォワードプライマーは、標的核酸分子にアニーリングすることができる。アニーリングされたフォワードプライマーは、プライマー伸長反応に供され得る。プライマー伸長反応は、標的核酸分子に相補的な順方向プライマーの伸長産物（例えば、第１の伸長産物）を生成し得る。一例では、フォワードプライマーはテール配列又は非相補配列を含み、伸長産物はテール又は非相補配列を更に含み得る。

この方法は、フォワードプライマーの伸長生成物を複数のリバースプライマーと接触させることを更に含んでもよい。複数のリバースプライマーは、ユニバーサルプライマー又は標的核酸特異的プライマーを含んでもよい。一例では、複数のリバースプライマーはユニバーサルプライマーを含む。別の例では、複数のリバースプライマーはユニバーサルプライマーであり、フォワードプライマーの伸長産物はユニバーサルプライマーに相補的なコンセンサス配列を含む。別の例では、複数のリバースプライマーは標的核酸分子に特異的である。リバースプライマーは、フォワードプライマーの伸長産物にアニーリングされ得る。リバースプライマーは、プライマー伸長反応に供され得る。プライマー伸長反応は、複数のリバースプライマー伸長産物（例えば、第２の伸長産物）を生成し得る。リバースプライマー伸長産物は、変性プロファイルを生成するために変性される二本鎖核酸分子であり得る。リバースプライマー伸長産物（例えば、第２の伸長産物）は、標的核酸分子のコピーを含み得る。一例では、フォワードプライマーはテール又は非相補配列を含み、リバースプライマーから生成される標的核酸配列のコピーは、テール又は非相補配列に相補的な追加配列を含み得る。

この方法は、本明細書の他の箇所で説明されている任意のマイクロ流体デバイスを提供することを含み得る。マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つのチャネルを含み得る。チャネルは、入口、出口、又は入口と出口の両方を含むことができる。一例では、チャネルは、単一の入口又はポートを含み、出口又は二次ポートを含まない。別の例では、チャネルは、入口及び出口ポートを含む。マイクロ流体デバイスは、チャネルに接続された複数のパーティション（例えば、チャンバ）を更に備え得る。チャンバは、複数の吸い上げ開口部によってチャネルに接続され得る。マイクロ流体デバイスは、薄膜がチャネル、複数のチャンバ、複数の吸い上げ開口部、又はそれらの任意の組み合わせをキャップするような、マイクロ流体デバイスの表面に隣接して配設された薄膜（例えば、熱可塑性薄膜）によってシールされ得る。試薬、試料、又はその両方は、チャネルの入口に加えられ得る。流体デバイスは、試薬又は試料とマイクロ流体デバイスとの間に第１の圧力差を提供することによって充填され得、試薬又は試料を流体デバイスに流入させる。チャネルと複数のチャンバとの間に第２の圧力差を加えて試薬又は試料を複数のチャンバ内に移動させ、複数のチャンバ内のガスを薄膜に通過させることにより、試薬又は試料がチャンバに分配され得る。あるいは、又はそれに加えて、流体デバイスは、ガス抜き又は脱気を可能にするように構成されている第２のチャネルを含んでもよい。第２のチャネルは、複数のチャンバに隣接して配設され得る。第２の圧力差は、第１の圧力差よりも大きくてもよい。流体をチャンバ内に導入することなく、流体をマイクロチャネルに導入するために、入口と出口との間に第３の圧力差が加えられ得る。第３の圧力差は、第２の圧力差よりも小さくてもよい。試薬は、試料の前、後、又は同時に添加されてもよい。試薬はまた、別の方法によってデバイスの１つ以上のパーティションに提供されてもよい。例えば、試薬は、１つ以上のパーティションを薄膜で覆う前に、１つ以上のパーティション内に堆積され得る。追加の例では、複数のパーティションは、パーティションとともに乾燥された試薬を含むことができ、試料を提供することによって、乾燥した試薬を可溶化することができる。

デバイスの入口又は出口は、存在する場合、空気圧ポンプ又は真空システムと流体連通していてもよい。空気圧ポンプ又は真空システムは、本開示のシステムの構成要素であってもよく、又は別個のものであってもよい。試薬又は試料の充填及び分配は、流体デバイスの様々な特徴全体に圧力差を加えることによって実行され得る。試薬又は核酸分子の充填及び分配は、チャンバとチャネルとの間のバルブを使用せずに実行されて、試薬又は核酸分子を隔て得る。例えば、チャネルの充填は、装填される試薬又は試料とチャネルとの間に圧力差を加えることによって実行され得る。この圧力差は、試薬若しくは核酸分子を加圧するか、又はチャネルに真空を適用することによって達成され得る。チャンバを充填することは、チャネルとチャンバとの間に圧力差を加えることによって実行され得る。これは、チャネルを加圧するか、又はチャンバに真空を適用することによって達成され得る。試料又は試薬の分配は、流体とチャネルとの間に圧力差を加えることによって実行され得る。この圧力差は、流体を加圧するか、又はチャネルに真空を適用することによって達成され得る。

マイクロ流体デバイスは、異なる印加圧力差の下で異なる透過特性を有し得る薄膜又は第２のチャネル（例えば、ガス抜きチャネル）を含んでもよい。例えば、薄膜又は第２のチャネルは、より小さな大きさの圧力差であり得る第１の圧力差及び第３の圧力差（例えば、低圧）において気体流を妨げ得る。薄膜又は第２のチャネルは、より大きな大きさの圧力差であり得る第２の圧力差（例えば、高圧）において気体流を許容し得る。第１及び第３の圧力差は、同じであってもよく、又は異なっていてもよい。第１の圧力差は、入口又は出口の試薬とマイクロ流体デバイスとの間の圧力の差であり得る。マイクロ流体デバイスの充填中、試薬の圧力は、マイクロ流体デバイスの圧力よりも高くてもよい。流体デバイスの充填中、試薬と流体デバイスとの間の圧力差（例えば、低圧）は、約８ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）以下、約６ｐｓｉ以下、約４ｐｓｉ以下、約２ｐｓｉ以下、約１ｐｓｉ以下、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、流体デバイスの充填中、試薬とマイクロ流体デバイスとの間の圧力差は、約１ｐｓｉ～約８ｐｓｉであり得る。いくつかの例では、流体デバイスの充填中、試薬とマイクロ流体デバイスとの間の圧力差は、約１ｐｓｉ～約６ｐｓｉであり得る。いくつかの例では、マイクロ流体デバイスの充填中、試薬とマイクロ流体デバイスとの間の圧力差は、約１ｐｓｉ～約４ｐｓｉであり得る。流体デバイスは、試薬と流体デバイスとの間に、約２０分以下、約１５分以下、約１０分以下、約５分以下、約３分以下、約２分以下、約１分以下、又はそれ未満以下の圧力差を加えることによって充填され得る。

充填されたマイクロ流体デバイスは、チャネル、吸い上げ開口部、チャンバ、又はそれらの任意の組み合わせ内に試料又は１つ以上の試薬を有し得る。チャンバ内への試料又は１つ以上の試薬の埋め戻しは、流体デバイスの充填時に発生し得るか、又は第２の圧力差を加えている間に発生し得る。第２の圧力差（例えば、高圧）は、チャネルと複数のチャンバとの間の圧力の差に対応し得る。第２の圧力差を加えている間、より高圧領域の第１の流体（例えば、気体又は液体）は、より低圧領域の第２の流体（例えば、気体）を、薄膜を通して流体デバイスから押し出し得る。第１及び第２の流体は、液体又はガスを含み得る。液体は、水性混合物又は油性混合物を含み得る。第２の圧力差は、チャネルを加圧することによって達成され得る。あるいは、又は加えて、第２の圧力差は、チャンバに真空を適用することによって達成され得る。第２の圧力差を加えている間、チャネル内の核酸分子又は試薬はチャンバに流入し得る。更に、第２の圧力差を加えている間に、吸い上げ開口部、チャンバ、及びチャネル内に閉じ込められたガスは、薄膜を通して、又はチャンバの１つ以上の壁を通して、第２のチャネル（例えば、ガス抜きチャネル）を通じて放出され得る。チャンバの埋め戻し及びガス放出の間、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約６ｐｓｉ以上、約８ｐｓｉ以上、約１０ｐｓｉ以上、約１２ｐｓｉ以上、約１４ｐｓｉ以上、約１６ｐｓｉ以上、約１８ｐｓｉ以上、約２０ｐｓｉ以上、又はそれ以上であり得る。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約２０ｐｓｉである。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約１８ｐｓｉである。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約１６ｐｓｉである。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約１４ｐｓｉである。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約１２ｐｓｉである。いくつかの例では、チャンバの埋め戻し中、チャンバとチャネルとの間の圧力差は、約８ｐｓｉ～約１０ｐｓｉである。チャンバは、約５分超、約１０分超、約１５分超、約２０分超、約２５分超、約３０分超、又はそれ以上、圧力差を加えることによって、埋め戻され、ガス放出され得る。

複数のチャンバは、約１，０００以上のチャンバ、５，０００以上のチャンバ、１０，０００以上のチャンバ、２０，０００以上のチャンバ、３０，０００以上のチャンバ、４０，０００以上のチャンバ、５０，０００以上のチャンバ、１００，０００以上のチャンバ、又はそれ以上のチャンバを有してもよい。一例では、マイクロ流体デバイスは、約１０，０００～３０，０００のチャンバを有してもよい。別の例では、マイクロ流体デバイスは、約１５，０００～２５，０００のチャンバを有してもよい。一例において、複数のチャンバが、約１，０００以上のチャンバを含む。別の例において、複数のチャンバが、約１０，０００以上のチャンバを含む。チャンバは、円筒形状、半球形状、又は円筒形状及び半球形状の組み合わせであり得る。代替的に、又はそれに加えて、チャンバは立方体の形状であってもよい。チャンバは、約５００μｍ以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、８０μｍ以下、６０μｍ以下、３０μｍ以下、１５μｍ以下、又はそれ未満以下の断面寸法を有してもよい。一例では、チャンバは、約２５０μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。別の例では、チャンバは、約１００μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。別の例では、チャンバは、約５０μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。チャンバの容積は任意であってもよい。チャンバは、マイクロ流体デバイス全体にわたって同じ容積を有してもよく、又は容積が異なってもよい。チャンバは、約１０００ピコリットル（ｐＬ）以下、９００ｐＬ以下、８００ｐＬ以下、７００ｐＬ以下、６００ｐＬ以下、５００ｐＬ以下、４００ｐＬ以下、３００ｐＬ以下、２００ｐＬ以下、１００ｐＬ以下、７５ｐＬ以下、５０ｐＬ以下、２５ｐＬ以下、又はそれ未満のピコリットル以下の容積を有してもよい。チャンバは、約２５ｐＬ～５０ｐＬ、２５ｐＬ～７５ｐＬ、２５ｐＬ～１００ｐＬ、２５ｐＬ～２００ｐＬ、２５ｐＬ～３００ｐＬ、２５ｐＬ～４００ｐＬ、２５ｐＬ～５００ｐＬ、２５ｐＬ～６００ｐＬ、２５ｐＬ～７００ｐＬ、２５ｐＬ～８００ｐＬ、２５ｐＬ～９００ｐＬ、又は２５ｐＬ～１０００ｐＬの容積を有してもよい。一例では、チャンバは、５００ｐＬ以下の容積を有する。別の例では、チャンバは、約２５０ｐＬ以下の容積を有する。別の例では、チャンバは、約１００ｐＬ以下の容積を有する。

試料の分配は、試薬内の指示薬の存在によって確認され得る。指示薬は、検出可能な部分を備える分子を含み得る。検出可能な部分は、放射性種、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、比色標識、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。放射性種の非限定的な例には、³Ｈ、¹⁴Ｃ、²²Ｎａ、³²Ｐ、³³Ｐ、³⁵Ｓ、⁴²Ｋ、⁴⁵Ｃａ、⁵⁹Ｆｅ、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、又は²⁰³Ｈｇが含まれる。蛍光標識の非限定的な例には、蛍光タンパク質、光学活性色素（例えば、蛍光色素）、有機金属フルオロフォア、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。化学発光標識の非限定的な例には、ウミホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼなどのルシフェラーゼクラスの酵素が含まれる。酵素標識の非限定的な例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、又は他の標識が含まれる。

指示薬分子は蛍光分子であってもよい。蛍光分子には、蛍光タンパク質、蛍光色素、及び有機金属フルオロフォアが含まれ得る。指示薬分子はタンパク質フルオロフォアであってもよい。タンパク質フルオロフォアには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、スペクトルの緑色領域で蛍光を発する蛍光タンパク質、一般に５００～５５０ナノメートルの波長を有する光を放射する）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ、スペクトルのシアン領域で蛍光を発する蛍光タンパク質、一般に４５０～５００ナノメートルの波長を有する光を放射する）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ、スペクトルの赤色領域で蛍光を発する蛍光タンパク質、一般に６００～６５０ナノメートルの波長を有する光を放出する）が含まれ得る。タンパク質フルオロフォアの非限定的な例には、ＡｃＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、ＡｍＣｙａｎ、ＡｍＣｙａｎ１、ＡＱ１４３、ＡｓＲｅｄ２、ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＢＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣＦＰ、ＣＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｃｏｐＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｄＫｅｉｍａ－Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ｄｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＤｓＲｅｄ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥｏｓＦＰ、ＥＹＦＰ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＪＲｅｄ、Ｋａｔｕｓｋａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ２、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ｍＥＣＦＰ、ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、Ｍｉｄｏｒｉ－ＩｓｈｉＣｙａｎ、ｍＫｅｉｍａ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｍＲｕｂｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｇＢＦＰ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴｅａｌ、ｍＴｏｍａｔｏ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＷａｓａｂｉ、ＰｈｉＹＦＰ、ＲｅＡｓＨ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＳｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ－Ｔ、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｔｏｐａｚ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ、及びＺｓＹｅｌｌｏｗ１の、突然変異体並びにスペクトル変異体が含まれる。

指示薬分子は蛍光色素であってもよい。蛍光色素の非限定的な例には、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＲｂｌｕｅ、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲｇｏｌｄ、エチジウムブロマイド、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン及びアクリジン、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムモノアジド、ＡＣＭＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、７－ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルバミジン、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ－１、ＰＯＰＯ－３、ＹＯＹＯ－１、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－１、ＴＯＴＯ－３、ＪＯＪＯ－１、ＬＯＬＯ－１、ＢＯＢＯ－１、ＢＯＢＯ－３、ＰＯ－ＰＲＯ－１、ＰＯ－ＰＲＯ－３、ＢＯ－ＰＲＯ－１、ＢＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－５、ＪＯ－ＰＲＯ－１、ＬＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－１、ＹＯ－ＰＲＯ－３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｏｌｄ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲＤＸ、ＳＹＴＯ－４０、ＳＹＴＯ－４１、ＳＹＴＯ－４２、ＳＹＴＯ－４３、ＳＹＴＯ－４４、ＳＹＴＯ－４５（青）、ＳＹＴＯ－１３、ＳＹＴＯ－１６、ＳＹＴＯ－２４、ＳＹＴＯ－２１、ＳＹＴＯ－２３、ＳＹＴＯ－１２、ＳＹＴＯ－１１、ＳＹＴＯ－２０、ＳＹＴＯ－２２、ＳＹＴＯ－１５、ＳＹＴＯ－１４、ＳＹＴＯ－２５（緑）、ＳＹＴＯ－８１、ＳＹＴＯ－８０、ＳＹＴＯ－８２、ＳＹＴＯ－８３、ＳＹＴＯ－８４、ＳＹＴＯ－８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ－６４、ＳＹＴＯ－１７、ＳＹＴＯ－５９、ＳＹＴＯ－６１、ＳＹＴＯ－６２、ＳＹＴＯ－６０、ＳＹＴＯ－６３（赤）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ－フィコエリトリン、Ｃｙ－２、Ｃｙ－３、Ｃｙ－３．５、Ｃｙ－５、Ｃｙ５．５、、Ｃｙ－７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｐｈａｒ－Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩ、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎＩＩ、ＳｙｂｒＧｏｌｄ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ、７－ＡＡＤ、エチジウムホモダイマーＩ、エチジウムホモダイマーＩＩ、エチジウムホモダイマーＩＩＩ、ウンベリフェロン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ダンシルクロリド、ユウロピウム及びテルビウムを含むものなどの蛍光性ランタニド錯体、カルボキシテトラクロロフルオレセイン、５若しくは６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（若しくは６－）ヨードアセトアミドフルオレセイン、５－｛［２（及び３）－５－（アセチルメルカプト）－スクシニル］アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ－フルオレセイン）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、５若しくは６カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、７－アミノ－メチル－クマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、８－メトキシピレン－１；３；６－トリスルホン酸三ナトリウム塩、３；６－ジスルホナート－４－アミノ－ナフタルイミド、フィコビリタンパク質、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、及び７９０色素、ＤｙＬｉｇｈｔ３５０、４０５、４８８、５５０、５９４、６３３、６５０、６８０、７５５、及び８００色素、並びにその他のフルオロフォアが含まれる。

指示薬分子は有機金属フルオロフォアであってもよい。有機金属フルオロフォアの非限定的な例には、ランタニドイオンキレートが含まれ、その非限定的な例には、トリス（ジベンゾイルメタン）モノ（１，１０－フェナントロリン）ユウロピウム（ＩＩＩ）、トリス（ジベンゾイルメタン）モノ（５－アミノ－１，１０－フェナントロリン）ユウロピウム（ＩＩＩ）、及びＬｕｍｉ４－Ｔｂクリプテートが含まれる。

マイクロ流体デバイスは、核酸分子、増幅反応のための成分（例えば、プライマー、ポリメラーゼ、及びデオキシリボヌクレオチド）、指示薬分子、及び増幅プローブなどの１つ以上の増幅試薬で充填され得る。増幅反応は、本明細書に記載されるように、複数のマイクロチャンバ又はそのサブセットの熱サイクリングを含み得る。核酸増幅の検出は、マイクロ流体デバイス又はそのサブセットの複数のチャンバからシグナルを収集する（例えば、イメージングする）ことによって実行され得る。核酸分子は、核酸分子の増幅に成功したマイクロチャンバを数え、ポアソン統計を適用することによって定量化され得る。核酸分子は、パーティションが１つ以下の核酸分子を含むように分配され得る。あるいは、又はそれに加えて、パーティションは、複数の核酸分子を含み得る。核酸分子はまた、増幅反応全体を通して異なる時点で収集されるシグナルを処理することによって定量化され得る。例えば、核酸増幅反応の各熱サイクル（例えば、各増幅サイクル）中に１つ以上のシグナルを収集することができ、シグナルを使用して、例えばリアルタイム又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ又はｑＰＣＲ）におけるように増幅速度を決定することができる。核酸増幅及び定量化は、単一の統合されたユニットで、例えば、デバイスの所与のパーティション又は複数のパーティションのサブセット内で実行され得る。いくつかの例では、核酸増幅をリアルタイムで検出及び監視することができる。

様々な核酸増幅反応を用いて、試料中の核酸分子を増幅し、増幅産物を生成し得る。核酸標的の増幅は、一次的、指数関数的、又はそれらの組み合わせであり得る。核酸増幅法の非限定的な例には、プライマー伸長、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写、等温増幅、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅、及び多重置換増幅が含まれる。増幅反応の増幅産物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ＤＮＡ分子を含む試料については、任意のＤＮＡ増幅方法が採用され得る。ＤＮＡ増幅方法には、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、重複伸長ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、及びリガーゼ連鎖反応が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡ増幅は、一次的、指数関数的、又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。本明細書に記載のように、ＤＮＡ増幅はまた、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、又は定量的デジタルＰＣＲ（ｑｄＰＣＲ）によって達成されてもよい。

核酸増幅に使用される試薬には、重合酵素、リバースプライマー、フォワードプライマー、及び増幅プローブが含まれ得る。重合酵素の例には、核酸ポリメラーゼ、転写酵素、又はリガーゼ（すなわち、結合の形成を触媒する酵素）が含まれるが、これらに限定されない。重合酵素は、天然に存在するか、又は合成され得る。ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼΦ２９（ｐｈｉ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼＰｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、Ｅｘ－Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ－Ｔａｗポリメラーゼ、ＳｓｏポリメラーゼＰｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、ＭｔｈポリメラーゼＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有するクレノウ断片ポリメラーゼ、並びにそれらの変異体、改変された産物、及び誘導体が含まれる。ホットスタートポリメラーゼの場合、約９２℃～９５℃の温度で約２分～１０分の期間の変性が用いられ得る。

核酸増幅反応は、増幅プローブを含み得る。増幅プローブは、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブであってもよい。増幅プローブは、増幅産物とハイブリダイズされたとき、光学活性であり得る。増幅プローブは、核酸増幅が進行するにつれて検出可能であってもよい。核酸分子を含む複数のパーティションから収集されるシグナル（例えば、光シグナル）の強度は、パーティションに含まれる増幅産物の量に比例し得る。例えば、特定のパーティションから収集されるシグナルは、その特定のパーティションにおける増幅産物の量に比例し得る。プローブは、本明細書に記載の光学活性な検出可能な部分（例えば、色素）のいずれかに連結され得、更に会合した色素の光学活性を遮断することができるクエンチャーを含み得る。検出可能な部分として有用であり得るプローブの非限定的な例には、ＴａｑＭａｎプローブ、ＴａｑＭａｎＴａｍａｒａプローブ、ＴａｑＭａｎＭＧＢプローブ、Ｌｉｏｎプローブ、ロックされた核酸プローブ、又は分子ビーコンが含まれる。プローブの光学活性を遮断するのに有用であり得るクエンチャーの非限定的な例には、ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）、ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ及びＲＱｑｕｅｎｃｈｅｒ、又はＩｎｔｅｒｎａｌＺＥＮＱｕｅｎｃｈｅｒが含まれる。あるいは、又は加えて、プローブ又はクエンチャーは、本開示の方法の文脈において有用である任意のプローブであり得る。

増幅プローブは、二重標識蛍光プローブであってもよい。二重標識プローブは、核酸と連結した蛍光レポーター及び蛍光クエンチャーを含み得る。蛍光レポーター及び蛍光クエンチャーは、互いに近接して位置決めされ得る。蛍光レポーター及び蛍光クエンチャーが近接していることにより、蛍光レポーターの光学活性を遮断し得る。二重標識プローブは、増幅される核酸分子に結合し得る。増幅中、蛍光レポーター及び蛍光クエンチャーは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって切断され得る。増幅プローブから蛍光レポーター及びクエンチャーを切断することにより、蛍光レポーターがその光学活性を取り戻し、検出が可能になり得る。二重標識蛍光プローブは、最大励起波長が約４５０ナノメートル（ｎｍ）、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｎｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、又はそれ以上、及び最大発光波長が約５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｎｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、又はそれ以上を有する５’蛍光レポーターを含み得る。二重標識蛍光プローブはまた、３’蛍光クエンチャーを含み得る。蛍光クエンチャーは、約３８０ｎｍ～５５０ｎｍ、３９０ｎｍ～６２５ｎｍ、４７０ｎｍ～５６０ｎｍ、４８０ｎｍ～５８０ｎｍ、５５０ｎｍ～６５０ｎｍ、５５０ｎｍ～７５０ｎｍ、又は６２０ｎｍ～７３０ｎｍの蛍光発光波長をクエンチし得る。

核酸増幅は、熱サイクルの複数のサイクル（例えば、複数の増幅サイクル）を含み得る。任意の好適な数のサイクルが実行され得る。実行されるサイクルの数は、約５超、約１０超、約１５超、約２０超、約３０超、約４０超、約５０超、約６０超、約７０超、約８０超、約９０超、約１００超サイクル、又はそれ以上であり得る。実行されるサイクルの数は、検出可能な増幅産物を得るためのサイクルの数に依存し得る。例えば、ＰＣＲ（例えば、ｄＰＣＲ、ｑＰＣＲ、又はｑｄＰＣＲ）中に核酸増幅を検出するために必要なサイクルの数は、約１００以下、約９０以下、約８０以下、約７０以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２０以下、約１５以下、約１０以下、約５以下のサイクル、又はそれ未満であり得る。核酸増幅をリアルタイムで監視することができる。一例において、核酸増幅は、実施されたサイクル数の関数として監視される。核酸増幅を監視することによって、偽陽性の検出を可能にすることができる。例えば、期待される増幅傾向に従わないパーティションは、偽陽性を生成する可能性がある。偽陽性は、追加の分析から除外することができる。核酸増幅を増幅サイクル数の関数として監視することにより、収集されるデータの量を削減し、分析速度を向上させることを可能にすることができる。核酸増幅反応は、２、４、６、８、１０、１２、１５、２０、又はそれ以上のサイクルごとに監視することができる（例えば、シグナルを収集することができる）。一例では、増幅シグナルは、少なくとも１サイクルおきに収集される。別の例では、増幅シグナルは、少なくとも４サイクルごとに収集される。別の例では、増幅シグナルは少なくとも１０サイクルごとに収集される。

この方法は、二本鎖核酸分子を変性させることを更に含んでもよい。二本鎖核酸分子は、熱エネルギー、酸又は塩基（例えば、水酸化ナトリウム処理）、有機溶媒、塩、又はそれらの任意の組み合わせを使用して変性されてもよい。二本鎖核酸分子の変性は、可逆的（例えば、熱変性による）又は不可逆的（例えば、塩又は有機溶媒による）であってもよい。一例では、二本鎖核酸分子は熱エネルギーによって変性される。変性温度は、例えば、核酸分子、使用される試薬、及び反応条件に応じて変化し得る。

二本鎖核酸分子は、核酸分子又はその誘導体の制御された加熱によって熱変性され得る。一例では、二本鎖核酸分子は複数のパーティションに配設され、パーティションは制御された加熱を受ける。制御された加熱には、抵抗加熱、放射加熱、伝導加熱、対流加熱、熱電加熱、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。熱変性は、所与の時間期間にわたる約６０℃～７０℃、６０℃～８０℃、６０℃～９０℃、６０℃～１００℃、６０℃～１１０℃、７０℃～８０℃、７０℃～９０℃、７０℃～１００℃、７０℃～１１０℃、８０℃～９０℃、８０℃～１００℃、８０℃～１１０℃、９０℃～１００℃、９０℃～１１０℃、又は１００℃～１１０℃の温度への二本鎖核酸分子の制御された加熱を含み得る。一例では、二本鎖核酸分子は、所定の時間にわたる約６０℃から約９０℃までの制御された加熱を受けることができる。別の例では、二本鎖核酸分子は、所定の時間にわたる約６５℃から約８５℃までの制御された加熱を受けることができる。熱変性は、所与の時間期間にわたる約６０℃、６５℃、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、又はそれ以上の温度への二本鎖核酸分子の制御された加熱を含み得る。

熱変性の持続時間は、例えば、特定の核酸分子、使用される試薬、及び反応条件に応じて変化し得る。熱変性の持続期間は、約３００秒以下、２４０秒、１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、又は１秒であり得る。代替的に、変性の持続期間は、約１２０秒以下、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、又は１秒であり得る。

デバイスの複数のパーティションのサブセットの制御された加熱は、任意の有用な速度で、任意の有用な温度範囲にわたって実行され得る。例えば、制御された加熱は、少なくとも約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、又は約９５℃、又はそれ以上のより低い温度から行うことができる。制御された加熱は、少なくとも約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、若しくは約１００℃、又はそれ以上の上限温度まで行うことができる。温度は、任意の有用な増分で上昇させることができる。例えば、温度は、少なくとも約０．０１℃、約０．０５℃、約０．１℃、約０．２℃、約０．３℃、約０．４℃、約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、若しくは約１０℃、又はそれ以上上昇させることができる。制御された加熱は、均一又は等間隔の温度増分で行われ得る。例えば、温度は、核酸分子の有意な融解が気体される範囲（では約０．１℃上昇させることができ例えば、細粒度測定）、核酸分子の有意な融解が期待されない範囲では約１℃上昇させることができる（例えば、粗粒度測定）。制御された加熱は、少なくとも約０．０００１℃／秒、約０．０００２℃／秒、約０．０００３℃／秒、約０．０００４℃／秒、約０．０００５℃／秒、約０．０００６℃／秒、約０．０００７℃／秒、約０．０００８℃／秒、約０．０００９℃／秒、約０．００１℃／秒、約０．００２℃／秒、約０．００３℃／秒、約０．００４℃／秒、約０．００５℃／秒、約０．００６℃／秒、約０．００７℃／秒、約０．００８℃／秒、約０．００９℃／秒、約０．０１℃／秒、約０．０２℃／秒、約０．０３℃／秒、約０．０４℃／秒、約０．０５℃／秒、約０．０６℃／秒、約０．０７℃／秒、約０．０８℃／秒、約０．０９℃／秒、約０．１℃／秒、約０．２℃／秒、約０．３℃／秒、約０．４℃／秒、約０．５℃／秒、約０．６℃／秒、約０．７℃／秒、約０．８℃／秒、約０．９℃／秒、約１℃／秒、約２℃／秒、約３℃／秒、約４℃／秒、及び約５℃／秒、又はそれ以上などの任意の有用な速度において実施されてもよい。制御された加熱プロセスを実行する熱ユニット（例えばヒータ）は、所与の温度を任意の有用な期間にわたって維持することができる。例えば、所与の温度を、少なくとも約１秒、約２秒、約３秒、約４秒、約５秒、約６秒、約７秒、約８秒、約９秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約４５秒、約６０秒、約７０秒、約８０秒、約９０秒、約１００秒、約１１０秒、約１２０秒、約１３０秒、約１４０秒、約１５０秒、約１６０秒、約１７０秒、約１８０秒、約１９０秒、約２００秒、約２１０秒、約２２０秒、約２３０秒、約２４０秒、約２５０秒、若しくは約３００秒、又はそれ以上にわたって維持することができる。

この方法は、二本鎖核酸分子の変性中にシグナルを収集することを更に含んでもよい。シグナルは、光シグナル、電気シグナル、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。一例では、収集されるシグナルは光シグナルである。光シグナルの収集は、マイクロ流体デバイスのパーティション又はマイクロ流体デバイスのパーティションの一部をイメージングすることを含み得る。シグナルは、任意の選択された時点で複数のパーティションのサブセットから収集され得る。例えば、シグナルは、少なくとも約１秒ごと、約２秒ごと、約３秒ごと、約４秒ごと、約５秒ごと、約６秒ごと、約７秒ごと、約８秒ごと、約９秒ごと、約１０秒ごと、約２０秒ごと、約３０秒ごと、約４５秒ごと、約６０秒ごと、約７０秒ごと、約８０秒ごと、約９０秒ごと、約１００秒ごと、約１１０秒ごと、約１２０秒ごと、約１３０秒ごと、約１４０秒ごと、約１５０秒ごと、約１６０秒ごと、約１７０秒ごと、約１８０秒ごと、約１９０秒ごと、約２００秒ごと、約２１０秒ごと、約２２０秒ごと、約２３０秒ごと、約２４０秒ごと、約２５０秒ごと、若しくは約３００秒ごと、又はそれ以上収集することができる。あるいは、又はそれに加えて、選択された温度間隔においてシグナルを収集されてもよい。例えば、シグナルは、約５℃以下、４℃以下、３℃以下、２．５℃以下、２℃以下、１．５℃以下、１℃以下、０．５℃以下、０．２５℃以下、又はそれ未満以下の温度間隔において収集されてもよい。シグナルは、マイクロ流体デバイス又はその複数のパーティション（例えば、マイクロチャンバ）のサブセットから収集する（例えば、画像を取得する）ことができる。シグナルを収集することは、デバイス又はその複数のパーティションのサブセットの画像を取得することを含むことができる。単一のマイクロチャンバ、マイクロチャンバのアレイ、又は同時にマイクロチャンバの複数のアレイからシグナル（例えば、画像）が収集され得る。シグナルは、マイクロ流体デバイスの本体を通して、マイクロ流体デバイスの薄膜を通して、又はその両方を通して収集され得る。マイクロ流体デバイスの本体は、実質的に光学的に透明であり得る。代替的に、マイクロ流体デバイスの本体は、実質的に光学的に不透明であってもよい。同様に、薄膜は、実質的に光学的に透明であり得る。代替的に、マイクロ流体デバイスの本体は、実質的に光学的に不透明であってもよい。

この方法は、挿入色素を使用することを更に含んでもよい。挿入色素は、検出可能なシグナルを生成し得る。この方法は、単一タイプの挿入色素（例えば、第１の発光波長を有する蛍光色素）の使用を含み得るか、又は複数のタイプの挿入色素（例えば、複数の発光波長を有する複数の蛍光色素）の使用を含み得る。この方法によって生成される検出可能なシグナルは、生蛍光単位、相対蛍光単位、コピー数（ｃｐ）、体積に対するコピー数（例えば、ｃｐ／μＬ）、増幅の臨界閾値（Ｃｔ）、増幅サイクル、濃度、絶対数、微分レポーター、任意の単位、又はそれらの任意の組み合わせとして提示又は読み取ることができる。挿入色素は、核酸分子の増幅中に核酸分子に挿入することができる。挿入色素は、二本鎖核酸分子と非特異的に相互作用又は結合することができる。挿入色素と二本鎖核酸分子との会合により、挿入色素の検出可能な蛍光が可能になり得る。核酸分子の変性は、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルを消滅させるか、又は別様に消失させ得る。挿入染料の非限定的な例には、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲｂｌｕｅ、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲｇｏｌｄ、エチジウムブロマイド、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマニン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン、ＬＣＧＲｅｅｎ、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

この方法は、収集されたシグナルを処理して、核酸分子の変性プロファイルを生成することを更に含んでもよい。あるいは、又はそれに加えて、収集されたシグナルを処理して、１つ以上の二本鎖核酸分子を含む個々のパーティションの変性プロファイルを生成することができる。収集されたシグナルの処理は、シグナル対温度曲線又はシグナル対濃度曲線（例えば、塩基、塩、又は有機溶媒変性の）などの変性曲線（例えば、変性プロファイル）を生成するためにシグナルを使用することを含み得る。シグナルは、光学シグナル（例えば、蛍光強度）又は非光学シグナル（例えば、電気シグナル）を含み得る。シグナルを処理することは、変性温度又は変性剤濃度を決定するために、変性曲線の負の一次導関数をプロットすることを更に含み得る。シグナルを処理することは、融解曲線分析を実施して、核酸分子又は複数の核酸分子の変性プロファイル又は解離特性（例えば、融解温度）を決定することを更に含み得る。挿入色素は、二本鎖核酸分子と会合したときにシグナルを生成することができる。二本鎖核酸分子が変性してランダムコイルを形成すると、挿入色素が一本鎖核酸分子から解離し、シグナルが減少するか又はゼロになり得る。

二本鎖核酸分子は、別の二本鎖核酸分子とは異なる変性プロファイルを有し得る。例えば、第１の二本鎖核酸分子は、第１の変性プロファイルを生成し得、第２の二本鎖核酸分子は、第２の変性プロファイルを生成し得る。第１の変性プロファイルは、第１の標的核酸分子の検出、同定、又は定量化を可能にし、第２の変性プロファイルは、第２の標的核酸分子の検出、同定、又は定量化を可能にする。場合によっては、収集されたシグナルを処理することは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の異なる標的核酸分子に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の二本鎖核酸分子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の変性プロファイルを生成することを含んでもよい。場合によっては、標的核酸分子は、単一の試料又は複数の試料において提供される。二本鎖核酸分子の変性プロファイルは、核酸分子を構成する核酸塩基、核酸分子の長さ（例えば、塩基の数）、核酸分子を構成するヌクレオチドのタイプ（例えば、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなど）、核酸分子の濃度、又はそれらの任意の組み合わせに依存し得る。二本鎖核酸分子は、別の二本鎖核酸分子とは異なり得る。第１の二本鎖核酸分子の変性プロファイルは、テール又は非相補配列を有するフォワードプライマーを使用して調節又はシフトされ得る。テール又は非相補配列は、テール又は非相補配列の長さ又はそこに存在する核酸塩基を変更することによって、二本鎖核酸分子の変性プロファイルを変更することができる追加の核酸塩基を二本鎖核酸に付加することができる。二本鎖核酸分子と別の二本鎖核酸分子との間の差により、二本鎖核酸分子を変性プロファイルによって別の二本鎖核酸分子から区別することができる。二本鎖核酸分子の変性プロファイルの特性（例えば、融解温度、変性濃度など）は、別の二本鎖核酸分子の変性プロファイルと少なくとも約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、３０％、４０％、又はそれ以上異なり得る。例えば、二本鎖核酸分子の融解温度は、別の二本鎖核酸分子の融解温度と少なくとも約０．５％異なり得る。別の例において、二本鎖核酸分子の融解温度は、別の二本鎖核酸分子の融解温度と少なくとも約１％異なり得る。別の例において、二本鎖核酸分子の融解温度は、別の二本鎖核酸分子の融解温度と少なくとも約２％異なり得る。別の例において、二本鎖核酸分子の融解温度は、別の二本鎖核酸分子の融解温度と少なくとも約５％異なり得る。

一例では、二本鎖核酸分子の変性プロファイルは、二本鎖核酸分子の融点を含み、別の二本鎖核酸分子の変性プロファイル（例えば、融点）と異なる。二本鎖核酸分子の融点は、別の二本鎖核酸分子の融点と少なくとも約０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．８℃、１℃、１．５℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、８℃、１０℃、又はそれ以上異なり得る。一例において、二本鎖核酸分子の融点は、別の二本鎖核酸分子の融点と少なくとも約０．２５℃異なり得る。別の例において、二本鎖核酸の融点は、別の二本鎖核酸分子の融点と少なくとも約０．５℃異なり得る。融点は、核酸分子の一次導関数プロットから導き出すことができる。あるいは、又は加えて、融解曲線減算を使用して、核酸分子の融解点を別の核酸分子から区別し、したがってある分析物の同一性を別の分析物から区別することができる。

本明細書に記載の方法及びシステムは、様々なアッセイを使用して評価することができる。一例では、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）アッセイを使用して、方法及び統合システムを評価することができる。図６は、機器性能を検証するための例示的なソフトウェアワークフローを示している。この例では、融解曲線分析中に、温度は６０℃から９０℃までの間で毎秒０．０５℃の割合で上昇し得る。各温度ステップにおいて、全てのデジタル反応チャンバを含む画像を取得することができる。生融解曲線は、ユーザ定義のパラメータを用いるＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙ平滑化フィルタによって平滑化され得、その後、内部キャリブレータの融解温度（Ｔｍ）が全てのチャンバから得られるプロファイル全体にわたって整列されるように、温度調整による補間が行われる。チャンバ間の変動（例えば、光シグナルと温度の両方）の較正及び曲線平滑化の後、融解曲線を正規化して、温度依存バックグラウンド蛍光変化の寄与を、ＤＮＡ融解に関連する真の蛍光シグナルから切り離すことができる。統合システムは、ブランク検出限界、検出限界、及び定量限界に基づく検出感度、定量化、及び再現性を含む、様々なパラメータについて評価することができる。ブランク検出限界は、テンプレートなしのコントロール又はＤＮＡテンプレートなしのＰＣＲ試薬のいずれかを使用して決定することができ、ブランク試料から観察される平均シグナルとして決定することができる。検出限界は、段階希釈したＤＮＡ試料のゲノムコピー数を使用して決定できる。ゲノムコピーの信頼できる定量化された最低数は、複製において測定される標準偏差に依存し得る。定量限界は、ゲノムＤＮＡの０．００１／パーティション～１／パーティション（例えば、４ディケード）の定量化によって決定することができる。

本明細書に記載の方法は、様々な実験プロセスに使用することができる。例えば、方法及びシステムの性能は、精製ＤＮＡ試料を使用して実証することができる。ＤＮＡ試料を評価して、試料の粗ＤＮＡ濃度を決定することができる。ＤＮＡ試料は、マスターミックスアッセイ、ブロードベースＰＣＲアッセイの試薬、及び挿入色素と組み合わせることができる。図７Ａ～図７Ｃは、システム性能を実証するための例示的なプロセスを示す。図７Ａは、試料中のＤＮＡを定量化及び精製するための例示的な試料調製ワークフローの例を示す。試料分配、標的増幅、及び変性は、本明細書の他の箇所に記載されているように行うことができる。例示的な分配及び変性プロファイルを図７Ｂに示す。図７Ｃに示されるように、融解曲線マッチングのために、較正済み正規化融解曲線がソフトウェアから取得され得、既知の試料からの融解曲線のデータベースに渡されて、未知の試料をマッチングして同定することができる。分類器（例えば、単純ベイズ分類器）を使用して、可能なクラスごとに事後確率を出力することができる。この例では、クラスはそれぞれの融解曲線に対応する既知の生物ラベルであり、事後確率は試料がそのクラスに属する確率であり得る。分類器は、ベイズの定理を適用することができ、クラスの事前確率Ｐ（Ｃ）と、所与のクラスの観測確率Ｐ（Ｘ｜Ｃ）であり得る尤度関数との積である。ここで、尤度関数は、融解曲線間の類似性の測度として説明することができる。形状の類似性を更に計上するために、モデルはヒルベルト変換を使用して曲線を畳み込むことができる。次に、曲線を元の値、並びに、試料曲線及びクラス曲線の変換からの複素値と比較して、それらの間の距離を決定することができる。最も高い事後確率は、試料がその生物である可能性が最も高いことを示し得る。

本明細書に記載の方法及び統合プラットフォームは、プローブベースの変性曲線の生成に使用することができる。プローブベースの変性曲線を使用して、多重性を改善することができる。図８は、プローブベースの技術がパネルベースの呼吸器病原体検出に使用される例を示している。プローブベースの多重化を使用して融解温度を決定することができるが、バルク反応における多重化は標的間のＰＣＲ増幅効率に影響を与える可能性があり、標準曲線との相関が非常に困難になるため、標的を正確に定量化することができない場合がある。統合ｄＰＣＲプラットフォームにおいてアッセイを実行することにより、融解曲線を使用した多重定量化が可能になり得る。更に、ｄＰＣＲプラットフォームと統合されたプローブベースの変性曲線の生成は、感染症及び腫瘍学の患者ケアに影響を与える可能性がある、費用対効果が高く、高感度の複数遺伝子患者の縦断監視アプリケーションを提供する可能性がある。

核酸同定のためのシステム及びデバイス
別の態様において、本開示は、核酸同定のためのシステムを提供する。システムは、検出ユニット及び１つ以上のプロセッサを含むことができる。検出ユニットは、核酸分子を同定するためのシグナルを収集及び処理するように構成することができる。１つ以上のプロセッサは、検出ユニットに動作可能に結合され得、本明細書の他の箇所で説明される方法を実行するように個別に又は集合的にプログラム又は別様に構成され得る。例えば、プロセッサは、複数のチャンバ内で複数の核酸分子から複数の二本鎖核酸分子を生成することと、二本鎖核酸分子を変性させることと、複数の変性プロファイルを生成するために二本鎖核酸分子の変性を示すシグナルを検出することと、少なくとも１つの核酸分子を同定するために変性プロファイルを処理することとを行うようにプログラム又は構成することができる。複数の二本鎖核酸分子は、二本鎖核酸分子の第１のサブセット及び二本鎖核酸分子の第２のサブセットを含み得る。二本鎖核酸分子の第１のサブセットは、第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み得る。複数の二本鎖核酸分子は、第２の二本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸分子の第２のサブセットを含み得る。第２の二本鎖核酸分子は、第２の核酸分子に対応する第２の配列を含み得、追加の配列を含まない。第１の二本鎖核酸分子は、変性を受けて第１の変性プロファイルを生成し得、第２の二本鎖核酸分子は、変性を受けて第２の変性プロファイルを生成し得る。第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとは異なり、区別可能であり得る。追加の配列は、第１の二本鎖核酸分子の変性プロファイルを変調して、第１の変性プロファイルと第２の変性プロファイルとの間の区別を可能にするか、又は増強し得る。

システムは、本明細書の他の箇所で説明されている方法のいずれかを実施するように構成することができ、又は実施することができる。システムは、本明細書の他の箇所で説明されているデバイス、試薬、又は構成要素のいずれかを使用することができる。

システムは、マイクロ流体デバイスを更に含むことができる。マイクロ流体デバイスは、複数のパーティション（例えば、パーティションのアレイ）を含むことができる。核酸分子は、複数の核酸分子のうちの１つであってもよく、システムは、複数の核酸分子を分配のためにマイクロ流体デバイスに提供することができる。システムは、核酸分子を増幅し、核酸分子をパーティション内の変性条件に供するように更に構成することができる。

本開示のマイクロ流体デバイスは、消耗デバイス（例えば、単一試料の分析又は処理などの単回使用のために設計された）又は再利用可能デバイス（例えば、複数の試料の分析又は処理などの複数回使用のために設計された）であってもよい。デバイスに含まれる材料の選択は、デバイスが１回使用されるか又は複数回使用されるかを反映し得る。例えば、消耗デバイスは、再利用可能なデバイスよりも安価な材料を含むことができる。同様に、製造プロセスは、デバイスの用途に合わせて調整することができる。例えば、消耗デバイスの製造プロセスは、より少ない廃棄物の生成又はより低コストの製造を含むことができる。再利用可能なデバイスは、同じデバイスを使用した複数の試料の分析又は処理を容易にするために、洗浄可能又は滅菌可能である場合がある。例えば、再利用可能なデバイスは、滅菌に適した高温に耐えることができる材料を含むことができる。消耗デバイスは、そのような材料を含んでもよく、又は含まなくてもよい。

マイクロ流体デバイスは、流体流路を含むことができる。流体流路は、１つのチャネル又は複数のチャネルを含み得る。流体流路は、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０又はそれ以上のチャネルを含むことができる。各チャネルは、互いに流体的に分離することができる。あるいは、又はそれに加えて、複数のチャネルは互いに流体連通していてもよい。チャネルは、第１の端部及び第２の端部を含むことができる。第１の端部及び第２の端部は、単一の入口ポートに接続され得る。単一の入口ポートに接続された第１の端部及び第２の端部を有するチャネルは、入口ポートを通ってチャネルに入る流体を、チャネルの第１の端部及び第２の端部を通じて誘導することができるように、円形又はループ状の構成であってもよい。あるいは、第１の端部及び第２の端部が異なる入口ポートに接続されてもよい。あるいは、第１の端部が入口ポートに接続されてもよく、第２の端部が出口ポートに接続されてもよい。あるいは、第１の端部が入口ポートに接続されてもよく、第２の端部は閉鎖端又は行き止まりであってもよい。流体流路は、複数のパーティション（例えば、チャンバ）を含んでもよい。流体流路又はチャンバは、流体の流れを停止若しくは阻害するため、又はチャンバを隔離するためのバルブを含まなくてもよい。

デバイスは、長寸法及び短寸法を含むことができる。長寸法は、約２０センチメートル（ｃｍ）以下、１５ｃｍ以下、１０ｃｍ以下、８ｃｍ以下、６ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、１ｃｍ以下、又はそれ未満以下であり得る。デバイスの短寸法は、約１０ｃｍ以下、８ｃｍ以下、６ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、１ｃｍ以下、０．５ｃｍ以下、又はそれ未満以下であり得る。一例では、デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス）の寸法は、約７．５ｃｍ×２．５ｃｍである。チャネルは、マイクロ流体デバイスの長寸法に実質的に平行であり得る。代替的に、又はそれに加えて、チャネルは、マイクロ流体デバイスの長寸法に対して実質的に垂直（例えば、デバイスの短寸法に対して平行）であってもよい。代替的に、又はそれに加えて、チャネルは、マイクロ流体デバイスの長寸法に対して実質的に平行でも実質的に垂直でもない場合がある。チャネルとマイクロ流体デバイスの長寸法との間の角度は、少なくとも約５°、１０°、１５°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、又は９０°であり得る。一例では、チャネルは単一の長いチャネルである。代替的に、又はそれに加えて、チャネルは屈曲部、湾曲部、又は角度を有してもよい。チャネルは、約１００ミリメートル（ｍｍ）以下、７５ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、４０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、８ｍｍ以下、６ｍｍ以下、４ｍｍ以下、２ｍｍ以下、又はそれ未満以下の長寸法を有し得る。チャネルの長さは、マイクロ流体デバイスの外形の長さ又は幅によって拘束され得る。チャネルは、約５００マイクロメートル（μｍ）以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、８０μｍ以下、６０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、又はそれ未満以下の深さを有し得る。チャネルは、約５００μｍ以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、又はそれ未満以下の断面寸法（例えば、幅又は直径）を有し得る。

いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約８０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約６０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約４０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約２０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１００μｍ×深さ約１０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約８０μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約６０μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約４０μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約２０μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１０μｍ×深さ約１００μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約８０μｍ×深さ約８０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約６０μｍ×深さ約６０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約４０μｍ×深さ約４０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約２０μｍ×深さ約２０μｍであり得る。いくつかの例では、チャネルの断面寸法は、幅約１０μｍ×深さ約１０μｍであり得る。

チャネルの断面形状は、円形、楕円形、三角形、正方形、又は長方形を含むがこれらに限定されない、任意の好適な断面形状であり得る。チャネルの断面積は、チャネルの長さに沿って一定であり得る。あるいは、又はそれに加えて、チャネルの断面積は、チャネルの長さに沿って変化し得る。チャネルの断面積は、約５０％～１５０％、約６０％～１２５％、約７０％～１２０％、約８０％～１１５％、約９０％～１１０％、約９５％～１００％、又は約９８％～１０２％で変化し得る。チャネルの断面積は、約１０，０００平方マイクロメートル（μｍ²）以下、７，５００μｍ²以下、５，０００μｍ²以下、２，５００μｍ²以下、１，０００μｍ²以下、７５０μｍ²以下、５００μｍ²以下、４００μｍ²以下、３００μｍ²以下、２００μｍ²以下、１００μｍ²以下、又はそれ未満以下であってもよい。

チャネルは、単一の入口又は複数の入口を有することができる。入口は同じ直径を有し得るか、又はそれらは異なる直径を有し得る。入口及び出口は、約２．５ミリメートル（ｍｍ）以下、２ｍｍ以下、１．５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、０．５ｍｍ以下、又はそれ未満以下の直径を有し得る。

デバイスは、複数のチャンバを含んでもよい。複数のチャンバは、チャンバのアレイであってもよい。デバイスは、チャンバの単一のアレイ又はチャンバの複数のアレイを含み得、チャンバの各アレイは、他のアレイから流体的に分離される。チャンバのアレイは、一列で、格子構成で、交互のパターンで、又は任意の他の構成で、配置され得る。マイクロ流体デバイスは基板上に生成され、基板は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上のチャンバアレイを有し得る。一例では、基板は、チャンバの少なくとも４つのアレイを含んでもよい。基板は、消耗品プレートにおいて提供されてもよい。消耗品プレートは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、６つ、８つ、１０、１２、１５、２０、又はそれ以上の基板を保持するように構成され得るか、又は保持し得る。一例では、消耗品プレートは少なくとも４つの基板を保持する。チャンバのアレイは同一であってもよく、又は、チャンバのアレイが異なっていてもよい（例えば、チャンバの数又は構成が異なる）。チャンバのアレイは、全て同じ外形寸法を有し得るか（すなわち、チャンバのアレイの全ての特徴を包囲する、チャンバのアレイの長さ及び幅）、又はチャンバのアレイは、異なる外形寸法を有し得る。チャンバのアレイは、約１００ｍｍ以下、７５ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、４０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、８ｍｍ以下、６ｍｍ以下、４ｍｍ以下、２ｍｍ以下、１ｍｍ以下、又はそれ未満以下の幅を有し得る。チャンバのアレイは、５０ｍｍ以上、４０ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、８ｍｍ以上、６ｍｍ以上、４ｍｍ以上、２ｍｍ以上、１ｍｍ以上、又はそれ未満以上の長さを有し得る。一例において、アレイの幅は、約１ｍｍ～１００ｍｍ、又は約１０ｍｍ～５０ｍｍであり得る。一例において、アレイの長さは、約１ｍｍ～５０ｍｍ、又は約５ｍｍ～２０ｍｍであり得る。

チャンバのアレイは、約１，０００以上のチャンバ、５，０００以上のチャンバ、１０，０００以上のチャンバ、２０，０００以上のチャンバ、３０，０００以上のチャンバ、４０，０００以上のチャンバ、５０，０００以上のチャンバ、１００，０００以上のチャンバ、又はそれ以上のチャンバを有してもよい。一例では、マイクロ流体デバイスは、約１０，０００～３０，０００のチャンバを有してもよい。別の例では、マイクロ流体デバイスは、約１５，０００～２５，０００のチャンバを有してもよい。チャンバは、円筒形状、半球形状、又は円筒形状及び半球形状の組み合わせであり得る。代替的に、又はそれに加えて、チャンバは立方体の形状であってもよい。チャンバは、約５００μｍ以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、８０μｍ以下、６０μｍ以下、３０μｍ以下、１５μｍ以下、又はそれ未満以下の断面寸法を有してもよい。一例では、チャンバは、約２５０μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。別の例では、チャンバは、約１００μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。別の例では、チャンバは、約５０μｍ以下の断面寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有する。

チャンバの深さは、約５００μｍ以下、２５０μｍ以下、１００μｍ以下、８０μｍ以下、６０μｍ以下、３０μｍ以下、１５μｍ以下、又はそれ未満であってもよい。一例では、チャンバは、約３０μｍの断面寸法及び約１００μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約３５μｍの断面寸法及び約８０μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約４０μｍの断面寸法及び約７０μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約５０μｍの断面寸法及び約６０μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約６０μｍの断面寸法及び約４０μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約８０μｍの断面寸法及び約３５μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバは、約１００μｍの断面寸法及び約３０μｍの深さを有し得る。別の例では、チャンバとチャネルとは同じ深さを有する。別の実施形態では、チャンバとチャネルとは異なる深さを有する。

チャンバの容積は任意であってもよい。チャンバは、マイクロ流体デバイス全体にわたって同じ容積を有してもよく、又は容積が異なってもよい。チャンバは、約１０００ピコリットル（ｐＬ）以下、９００ｐＬ以下、８００ｐＬ以下、７００ｐＬ以下、６００ｐＬ以下、５００ｐＬ以下、４００ｐＬ以下、３００ｐＬ以下、２００ｐＬ以下、１００ｐＬ以下、７５ｐＬ以下、５０ｐＬ以下、２５ｐＬ以下、又はそれ未満のピコリットル以下の容積を有してもよい。チャンバは、約２５ｐＬ～５０ｐＬ、２５ｐＬ～７５ｐＬ、２５ｐＬ～１００ｐＬ、２５ｐＬ～２００ｐＬ、２５ｐＬ～３００ｐＬ、２５ｐＬ～４００ｐＬ、２５ｐＬ～５００ｐＬ、２５ｐＬ～６００ｐＬ、２５ｐＬ～７００ｐＬ、２５ｐＬ～８００ｐＬ、２５ｐＬ～９００ｐＬ、又は２５ｐＬ～１０００ｐＬの容積を有してもよい。一例では、チャンバは、５００ｐＬ以下の容積を有する。別の例では、チャンバは、約２５０ｐＬ以下の容積を有する。別の例では、チャンバは、約１００ｐＬ以下の容積を有する。

チャネルの容積は、チャンバの総容積よりも小さくてもよく、等しくてもよく、又はより大きくてもよい。一例では、チャネルの容積は、チャンバの総容積未満である。チャネルの容積は、チャネルの総容積の９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、又はそれ未満以下であってもよい。

デバイスは、チャネルとチャンバとの間に配設されている吸い上げ開口部を更に含んでもよい。吸い上げ開口部は、チャネルを複数のチャンバに接続する複数の吸い上げ開口部のうちの１つであってもよい。吸い上げ開口部は、チャネルとチャンバとの間の流体連通を提供するように構成され得る。吸い上げ開口部の長さは、デバイス（例えば、マイクロ流体デバイス）全体にわたって一定であってもよく、又は変化してもよい。吸い上げ開口部は、約１５０μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、２５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又はそれ未満以下の長寸法を有してもよい。吸い上げ開口部の深さは、約５０μｍ以下、２５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又はそれ未満以下であってもよい。吸い上げ開口部は、約５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又はそれ未満以下の断面寸法を有してもよい。

吸い上げ開口部の断面形状は、円形、楕円形、三角形、正方形、又は長方形を含むがこれらに限定されない、任意の好適な断面形状であり得る。吸い上げ開口部の断面積は、吸い上げ開口部の長さに沿って一定であり得る。あるいは、又はそれに加えて、吸い上げ開口部の断面積は、吸い上げ開口部の長さに沿って変化し得る。吸い上げ開口部の断面積は、チャンバへの接続部における吸い上げ開口部の断面積よりも、チャネルへの接続部における方が大きくなり得る。あるいは、チャンバへの接続部における吸い上げ開口部の断面積は、チャネルへの接続部における吸い上げ開口部の断面積よりも大きくてもよい。吸い上げ開口部の断面積は、約５０％から１５０％、６０％から１２５％、７０％から１２０％、８０％から１１５％、９０％から１１０％、９５％から１００％、又は９８％～１０２％。吸い上げ開口部の断面積は、約２，５００μｍ²以下、１，０００μｍ²以下、７５０μｍ²以下、５００μｍ²以下、２５０μｍ²以下、１００μｍ²以下、７５μｍ²以下、５０μｍ²以下、２５μｍ²以下、又はそれ未満以下であってもよい。チャネルへの接続部における吸い上げ開口部の断面積は、チャネルの断面積以下であり得る。チャネルへの接続部における吸い上げ開口部の断面積は、チャネルの断面積の約９８％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、又はそれ未満以下であってもよい。吸い上げ開口部は、チャネルに対して実質的に垂直であってもよい。あるいは、又はそれに加えて、吸い上げ開口部はチャネルに対して実質的に垂直でない。吸い上げ開口部とチャネルとの間の角度は、少なくとも約５°、１０°、１５°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、又は９０°であってもよい。

マイクロ流体デバイスは、チャネル、チャンバ、吸い上げ開口部、又はそれらの任意の組み合わせの加圧ガス抜き又は脱気を可能にするように構成され得る。加圧ガス抜き又は脱気は、加圧ガス抜き又は脱気を可能にするように構成されているフィルム又は膜によって提供され得る。あるいは、又はそれに加えて、チャンバ、チャネル、又はその両方に隣接して配設されている第２のチャネル（例えば、ガス抜きチャネル）によって、加圧ガス抜き又は脱気を提供することができる。第２のチャネルは、圧力閾値を超える加圧ガス抜き又はガス抜きを可能にすることができる。フィルム又は膜は、圧力閾値を超える気体に対して透過性であってもよい。フィルム又は膜は、水性流体、油、又は他の溶媒などであるがこれらに限定されない液体に対して透過性でなくてもよい（例えば、不透過性又は実質的に不透過性である）。チャネル、チャンバ、吸い上げ開口部、又はそれらの任意の組み合わせが、フィルム又は膜を含み得る。一例では、チャンバは気体透過性フィルム又は膜を含み、チャネル又は吸い上げ開口部は気体透過性フィルム又は膜を含まない。別の例では、チャンバ及び吸い上げ開口部は気体透過性フィルム又は膜を含み、チャネルは気体透過性フィルム又は膜を含まない。別の例では、チャンバ、チャネル、及び吸い上げ開口部は気体透過性フィルム又は膜を含む。

フィルム又は膜は薄膜であってもよい。フィルム又は膜はポリマーであってもよい。フィルムは、熱可塑性フィルム又は膜であってもよい。フィルム又は膜はエラストマー材料を含まなくてもよい。気体透過性フィルム又は膜は、流体流路、チャネル、チャンバ、又はそれらの任意の組み合わせを覆うことができる。一例では、気体透過性フィルム又は膜はチャンバを覆う。別の例では、気体透過性フィルム又は膜はチャンバ及びチャネルを覆う。フィルムの気体透過性は、昇圧によって誘発され得る。フィルム又は膜の厚さは、約５００マイクロメートル（μｍ）以下、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下、５０μｍ以下、２５μｍ以下、又はそれ未満以下であり得る。一例では、フィルム又は膜は、約１００μｍ以下の厚さを有する。別の例では、フィルム又は膜は、約５０μｍ以下の厚さを有する。別の例では、フィルム又は膜は、約２５μｍ以下の厚さを有する。フィルム又は膜の厚さは、約０．１μｍ～約２００μｍ、０．５μｍ～約１５０μｍ、又は２５μｍ～１００μｍであり得る。一例では、フィルム又は膜の厚さは、約２５μｍ～１００μｍである。膜の厚さは、膜の製造可能性、膜の通気性、ガス放出される各チャンバ又はパーティションの容積、利用可能な圧力、又は分配若しくはデジタル化プロセスを完了するための時間によって選択され得る。

フィルム又は第２のチャネルは、異なる印加圧力差の下で従業員の異なる透過特性であるように構成され得る。例えば、薄膜又は第２のチャネルは、第１の圧力差（例えば低圧）において気体不透過性であり、第２の圧力差（例えば高圧）において少なくとも部分的に気体透過性であり得る。第１の圧力差（例えば、低圧差）は、約８ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）以下、６ｐｓｉ以下、４ｐｓｉ以下、２ｐｓｉ以下、１ｐｓｉ以下、又はそれ未満以下であり得る。一例では、フィルム又は膜は、４ｐｓｉ未満の圧力差で気体に対して実質的に不透過性である。第２の圧力差（例えば、高圧差）は、約１ｐｓｉ以上、２ｐｓｉ以上、４ｐｓｉ以上、６ｐｓｉ以上、８ｐｓｉ以上、１０ｐｓｉ以上、１２ｐｓｉ以上、１４ｐｓｉ以上、１６ｐｓｉ以上、２０ｐｓｉ以上、又はより高い値以上であり得る。一例では、フィルム又は膜は、４ｐｓｉ以上の圧力で実質的に気体透過性である。

システムは、マイクロ流体デバイスを受容又は保持するように構成されているホルダを含み得る。ホルダは、デバイスを保持するための棚、レセプタクル、又はステージであってもよい。一例では、ホルダは移送ステージである。移送ステージは、マイクロ流体デバイスを入れ、マイクロ流体デバイスを保持し、マイクロ流体デバイスを出すように構成され得る。マイクロ流体デバイスは、本明細書の他の箇所に記載されている任意のデバイスであり得る。移送ステージは、１つ以上の座標で静止し得る。あるいは、又はそれに加えて、移送ステージは、Ｘ方向、Ｙ方向、Ｚ方向、又はそれらの任意の組み合わせに移動することが可能であり得る。移送ステージは、単一のマイクロ流体デバイスを保持することが可能であり得る。あるいは、又はそれに加えて、移送ステージは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のマイクロ流体デバイスを保持することが可能であり得る。

システムは、処理ユニットを含むことができる。処理ユニットは、空気圧モジュール、真空モジュール、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。処理ユニットは、複数のパーティション又はチャンバ内で核酸分子を増幅するように構成され得る。処理ユニットは、マイクロ流体デバイスの入口ポートと流体連通するように構成され得る。処理ユニットは、複数の入口ポートに接続できる複数の接続点を有し得る。処理ユニットは、一度にチャンバの単一のアレイ、又は並行してチャンバの複数のアレイを充填、埋め戻し、かつ分配することが可能であり得る。処理ユニットは、真空モジュールと組み合わされた空気圧モジュールであってもよい。処理ユニットは、加圧ガス抜き又は脱気のためにマイクロ流体デバイスに増加した圧力を提供し得るか、又はマイクロ流体デバイスに真空を提供し得る。

システムは、熱ユニットを更に備えることができる。熱ユニットは、１つ以上のプロセッサに動作可能に結合され得る。熱ユニットは、抵抗加熱、放射加熱、伝導加熱、対流加熱、熱電加熱、又はそれらの任意の組み合わせを提供するように構成することができる。一例において、熱ユニットが、熱電温度制御ユニットを含む。熱ユニットは、マイクロ流体デバイスのチャンバと熱的連通するように構成され得る。熱ユニットは、チャンバの単一のアレイの温度を制御するように、核酸分子の熱変成を可能にするためにチャンバの複数のアレイの温度を制御するように構成され得る。チャンバのアレイは、熱ユニットによって個別にアドレス指定可能であり得る。例えば、熱ユニットは、チャンバの全てのアレイにわたって同じ熱的プログラムを実行し得、又はチャンバの異なるアレイに対して異なる熱的プログラムを実行し得る。熱ユニットは、マイクロ流体デバイス又はマイクロ流体デバイスのチャンバと熱的連通することができる。熱ユニットは、マイクロ流体デバイスを加熱又は冷却することができる。マイクロ流体デバイスの１つ以上の表面は、熱ユニットと直接的に接触することができる。代替的に、又はそれに加えて、熱モジュールとマイクロ流体デバイスとの間に熱伝導性材料を配設することができる。熱ユニットは、変動が約２℃、１．５℃、１℃、０．９℃、０．８℃、０．７℃、０．６、０．５℃、０．４℃、０．３℃、０．２℃、０．１℃、又はそれ以下になるように、マイクロ流体デバイスの表面全体にわたる温度を維持することができる。熱ユニットは、温度設定点の約±０．５℃以内、０．４℃以内、０．３℃以内、０．２℃以内、０．１℃以内、０．０５℃以内、又はより近いように、マイクロ流体デバイスの表面の温度を維持することができる。

システムは、検出ユニットを更に含むことができる。検出モジュールは、電子検出又は光学検出を提供することができる。一例では、検出ユニットは、光学検出を提供する光学ユニットである。光学ユニットは、複数の波長の光を放射かつ検出するように構成され得る。発光波長は、使用される指示薬及び増幅プローブの励起波長に対応し得る。放射される光は、約４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｎｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、又はそれらの任意の組み合わせの最大強度を有する波長を含み得る。検出される光は、約５００ｎｍ、５２５ｎｍ、５５０ｎｍ、５７５ｎｍ、６００ｎｍ、６２５ｎｍ、６５０ｎｍ、６７５ｎｍ、７００ｎｍ、又はそれらの任意の組み合わせの最大強度を有する波長を含み得る。光学ユニットは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上よりも多い波長の光を放射するように構成され得る。光学ユニットは、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上よりも多い波長の光を検出するように構成され得る。１つの放射された光の波長は、指示薬分子の励起波長に対応し得る。別の放射された光の波長は、増幅プローブの励起波長に対応し得る。１つの検出された光の波長は、指示薬分子の発光波長に対応し得る。別の検出された光の波長は、チャンバ内の反応を検出するために使用される増幅プローブに対応し得る。光学ユニットは、チャンバのアレイのセクションをイメージングするように構成され得る。あるいは、又はそれに加えて、光学ユニットは、チャンバのアレイ全体を単一の画像で画像化し得る。一例では、光学ユニットは、デバイスのビデオを撮影するように構成される。

検出ユニットは、消耗品プレートからデータを捕捉するように構成されている静止イメージングユニットを含むことができる。図９Ａは、イメージングユニットの例示的な設計パラメータを示す。イメージングユニットは、複数のチャンバ（例えば、消耗デバイス）の少なくとも一部又は消耗デバイス全体をイメージングするように構成され得る。イメージングユニットによってイメージングされる消耗デバイスの量は、イメージングデバイスの視野によって決定され得る。イメージングユニットは、約１５ミリメートル（ｍｍ）×１５ｍｍ、１５ｍｍ×２０ｍｍ、１５ｍｍ×２５ｍｍ、１５ｍｍ×５０ｍｍ、１５ｍｍ×７５ｍｍ、１５ｍｍ×１００ｍｍ、２０ｍｍ×２０ｍｍ、２０ｍｍ×２５ｍｍ、２０ｍｍ×５０ｍｍ、２０ｍｍ×７５ｍｍ、２０ｍｍ×１００ｍｍ、２５ｍｍ×２５ｍｍ、２５ｍｍ×５０ｍｍ、２５ｍｍ×７５ｍｍ、２５ｍｍ×１００ｍｍ、５０ｍｍ×５０ｍｍ、５０ｍｍ×７５ｍｍ、５０ｍｍ×１００ｍｍ、７５ｍｍ×７５ｍｍ、７５ｍｍ×１００ｍｍ、又は１００ｍｍ×１００ｍｍ以上の視野を有することができる。一例では、イメージングユニットの視野は、約１５ｍｍ×１５ｍｍ以上である。別の例では、イメージングユニットの視野は、約５０ｍｍ×７５ｍｍ以上である。別の例では、イメージングユニットの視野は、約７５ｍｍ×１００ｍｍ以上である。イメージングモジュールは、単一の画像によって消耗品プレート全体からデータを捕捉できる広い視野を備えた静止カメラを含むことができる。図９Ｂは、例示的な消耗品プレート全体をイメージングするための例示的な視野を示し、図９Ｃは、例示的なイメージングユニットから撮影された例示的な画像を示す。機械的公差を計上し、球面収差を最小限に抑えるために、視野は１００ｍｍｘ７５ｍｍであってもよく、これは、消耗品の１６パーティションユニットのイメージングを十分なマージンで提供することができる。他の技術的努力には、安定性及び再現性を向上させるための可動部品の最小化、並びにコストの最適化が含まれ得る。

イメージングユニットは、レンズ及びセンサを含むことができる。１００ｍｍ×７５ｍｍの視野では、多くのレンズはｄＰＣＲに十分な画質及び均一性を提供しない場合がある。レンズはテレセントリックレンズであってもよい。テレセントリックレンズを使用すると、視差エラーが解消又は減少し得る。例えば、視野角がゼロの場合、画像の歪みを最小限に抑えて均一性を向上させ、パーティションの発見を可能にする鮮鋭な焦点遷移を示すことができる。センサ側では、１００ｍｍ×７５ｍｍの視野にわたって１０μｍ／ピクセルの解像度を達成するために、対角線が１インチを超え、１億ピクセルを超える大面積の相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサを使用できる。例えば、Ｃａｎｏｎ １２０ＭＰ ＣＭＯＳセンサは、解像度及び検出限界を達成するための実行可能な選択肢である可能性がある。均一な励起のために、プレートの側面からの斜め照明、又はテレセントリックレンズを通じた直立落射照明の２つの手法を使用することができる。例えば、斜め照明は、高電力密度の発光ダイオード（ＬＥＤ）によって提供され得る。高輝度白色光ＬＥＤと特定色ＬＥＤとの２つの異なるＬＥＤ励起戦略を使用することができる。５つの最も一般的なＰＣＲ色素ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びＣｙ５をサポートするには、励起フィルタ及び発光フィルタ、並びにダイクロイックミラー（斜め照明アーキテクチャが選択されていない限り）を使用することができる。図１０は、例示的なイメージングユニットを示す。イメージングユニットは、高出力ＬＥＤアレイ、ＣＭＯＳセンサを備えたカメラ、１つ以上の励起フィルタ及び発光フィルタ、又はテレセントリックレンズを含むことができる。励起フィルタ及び発光フィルタは、カメラとテレセントリックレンズの間に配設することができる。テレセントリックレンズは、カメラと消耗品プレートとの間に配設することができる。光学モジュールが目標仕様を満たしていることを確認するために、様々な濃度の色素（例えば、１５０ナノモル（ｎＭ）、１００ｎＭ、５０ｎＭ、及びネガティブコントロールとして０ｎＭ）をプレートに装填することができる。プレートはブレッドボードを有する画像であり、シグナル対雑音比はＡＳＴＭ Ｅ５７９規格（蛍光検出限界）に基づいて計算される。

図１１Ａ及び図１１Ｂは、ｄＰＣＲのための統合システムの例示的な模式図を示す。図１１Ａは、ｄＰＣＲのための統合システムの例示的な側面図を示す。統合システムは、ＰＣＲのための熱制御モジュール、試薬デジタル化のための空気圧制御モジュール、及びプレート全体の４色走査のための光学モジュールを含んでもよい。システムの構成要素は、垂直統合することができる。４色走査は、４つのチャネルを有する光学エンジンによって提供され、各チャネルは異なる波長の光を収集するように構成されている。機器はモジュール式であってもよく（例えば、全てのユニットが互いに物理的に独立し得る）、他のサブシステムに影響を与えることなくユニットを置換又は交換することができる。モジュール式設計により、機器開発の時間及びリスクを低減することができる。図１１Ｂは、全プレートイメージングユニットの例を示す。作動距離の長いイメージングユニットを使用すると、走査動作が不要になり、走査イメージングユニットを備えた同様の機器と比較して、システムの全幅を縮小することができる。

システムは、ロボットアームを更に含むことができる。ロボットアームは、マイクロ流体デバイスの位置を移動、変更、又は構成することができる。あるいは、又はそれに加えて、ロボットアームは、システムの他の構成要素（例えば、処理ユニット又は検出ユニット）を配置構成又は移動させてもよい。検出ユニットは、カメラ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラ）及びフィルタキューブを含み得る。フィルタキューブは、励起光の波長又はカメラによって検出される光の波長を変更又は修正することができる。処理ユニットは、マニホールド（例えば、空気圧マニホールド）又は１つ以上のポンプを備えることができる。マニホールドは、マニホールドがマイクロ流体デバイスに接触しないように直立位置にあってもよい。直立位置は、マイクロ流体デバイスを装填又はイメージングするときに使用できる。マニホールドは、マニホールドがマイクロ流体デバイスと接触するように下向き位置にあってもよい。マニホールドは、流体（例えば、試料及び試薬）をマイクロ流体デバイスに装填するために使用され得る。マニホールドは、マイクロ流体デバイスに圧力を加えて、デバイスを適所に保持するか、又は使用中の反り、曲がり、若しくは他の応力を防止することができる。一例では、マニホールドは下向きの圧力を加え、熱ユニットに対してマイクロ流体デバイスを保持する。

システムは、１つ以上のコンピュータプロセッサを更に含むことができる。１つ以上のコンピュータプロセッサは、処理ユニット、ホルダ、熱ユニット、検出ユニット、ロボットアーム、又はそれらの任意の組み合わせに動作可能に結合され得る。一例では、１つ以上のコンピュータプロセッサは、処理ユニットに動作可能に結合される。１つ以上のコンピュータプロセッサは、処理ユニットに、核酸分子の分配、核酸分子の増幅、核酸分子の変性、又はそれらの任意の組み合わせを指示するように、個別に又は集合的にプログラムすることができる。１つ以上のコンピュータプロセッサは、核酸分子の変性を示すシグナルを収集するように検出ユニットに指示するように、個別に又は集合的にプログラムするか又は別様に構成することができる。１つ以上のコンピュータプロセッサは、核酸分子の変性プロファイルの生成、分析物を同定又は定量化するための変性プロファイルの使用、又はそれらの任意の組み合わせを行うように、個別に又は集合的にプログラムするか又は別様に構成することができる。

１つ以上のプロセッサは、１つ以上のソフトウェアプログラムを実装するように構成され得る。ソフトウェアは、ウェブベースのユーザインターフェースであってもよい。ウェブベースのユーザインターフェースは、継続的な改善の実装を可能にするとともに、リモートサービス及びサポートを容易にする。プロトコルエンジン、画像処理、デジタル融解曲線分析の３つのユーザインターフェースモジュールを使用することができる。プロトコルエンジンは、フロントエンドプロセス（例えば、ｄＰＣＲ）及びバックエンドプロセス（例えば、ｄＭＣＡ）における変動性を提供し得る。プロトコルエンジンにより、ユーザは、試薬デジタル化プロトコル（例えば、圧力及び時間）、熱サイクリングプロトコル（例えば、サイクル数、温度及び時間）、取得する画像の数、融解プロセスプロトコル（例えば、温度開始及び終了点、ランプレート及び間隔）、及びイメージングプロトコル（例えば、ＬＥＤ出力、フィルタセット、及び露出時間）を変更することができる。プロトコルは、アクティブな接続された外部コンピュータとは無関係に機器が動作するように、コンパイルして機器にロードすることができる。画像処理について、生画像を分析のために最適化し、表示することができる。ユーザは、画像スタッキング（例えば、複数の色のオーバーレイ）、画像演算（例えば、減算）、アレイ識別割り当て、及び自動アレイステンシルなどの様々なツールを使用することが可能であり得る。出力は、インデックス、単位、行、列、総強度、及び品質管理（ＱＣ）フラグなど、各パーティションのパラメータを有する解釈可能な．ｔｘｔ又は．ｃｓｖファイルであってもよい。イメージングソフトウェアは、３２０，０００個のチャンバ（１６個のユニット×１ユニットあたり２０ｋ個のチャンバ）の自動セグメンテーション、未使用のセンサ領域の切り出し、視野全体の潜在的な不均一な加熱又は照明によって引き起こされるチャンバ間のシグナル変動の正規化に使用することができる。デジタル融解曲線分析は、分配カウント、ポアソン統計モデル、希釈係数の考慮事項、リアルタイム曲線、融解曲線又は融解曲線の導関数、及びレポートの形式でエクスポートするための実験ノートを提供することができる。ユーザが既知の誤った特徴（例えば、ローカルバックグラウンド又はレポータチャネル強度の外れ値によって識別される）を手動で除外することができるように、分配レビュー（例えば、生画像の検査）及び特徴フラグなどの品質管理ツールを実装することができる。機械学習アルゴリズムｔ－ＳＮＥ（例えば、ｔ分布確率的近隣埋め込み）を使用して、同様の融解曲線をクラスタ化することができる。各プレートは３００，０００を超える融解曲線を提供することができるため、同一の実験で４つのプレートを実行することにより、１００万を超える訓練データセットを機器に提供して、呼び出し精度を大幅に向上させることができる。更に、ウェブベースのアプリケーションにより、データ分析及びアルゴリズム開発を継続し、継続的にレビューし、最新の機能及びアプリケーションツールで更新することができる。

コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図１２は、分析物を分析及び同定するために、本明細書の他の箇所に記載された方法を実施するようにプログラム又は別様に構成されたコンピュータシステム１２０１を示す。コンピュータシステム１２０１は、例えば、試料の（例えば、チャンバへの）分配、試料の増幅、試料の変性、及び変性中のシグナルの検出など、分析物（例えば、核酸分子）の処理及び分析の様々な態様を調節することができる。コンピュータシステム１２０１は、ユーザの電子デバイス、又は電子デバイスに対して遠隔に位置するコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、移動式電子デバイスであり得る。

コンピュータシステム１２０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」ともいう）１２０５を含み、これは、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム１２０１はまた、メモリ若しくはメモリ場所１２１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット１２１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース１２２０（例えば、ネットワークアダプタ）、並びにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶デバイス、及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１２２５を含む。メモリ１２１０、記憶ユニット１２１５、インターフェース１２２０、及び周辺デバイス１２２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１２０５と通信している。記憶ユニット１２１５は、データを格納するためのデータ記憶ユニット（又はデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１２０１は、通信インターフェース１２２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１２３０に動作可能に結合することができる。ネットワーク１２３０は、インターネット、インターネット及び／若しくはエクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び／若しくはエクストラネットであり得る。ネットワーク１２３０は、場合によっては、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク１２３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク１２３０は、場合によっては、コンピュータシステム１２０１の助けを借りて、ピアツーピアネットワークを実施することができ、これにより、コンピュータシステム１２０１に結合されているデバイスがクライアント又はサーバとして動作することが可能になり得る。

ＣＰＵ１２０５は、プログラム又はソフトウェアで具体化することができる一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ１２１０などのメモリ場所に格納され得る。命令は、ＣＰＵ１２０５に指示され得、それによって、その後、本開示の方法を実施するようにＣＰＵ１２０５をプログラム又は他の方法で構成することができる。ＣＰＵ１２０５によって実行される動作の例には、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックが含まれ得る。

ＣＰＵ１２０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム１２０１の１つ以上の他の構成要素を回路に含めることができる。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。

記憶ユニット１２１５は、ドライバ、ライブラリ、及び保存されたプログラムなどのファイルを格納することができる。記憶ユニット１２１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザプリファレンス及びユーザプログラムを格納することができる。コンピュータシステム１２０１は、場合によっては、イントラネット又はインターネットを介してコンピュータシステム１２０１と通信しているリモートサーバ上に位置するなど、コンピュータシステム１２０１の外部にある１つ以上の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。

コンピュータシステム１２０１は、ネットワーク１２３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１２０１は、ユーザのリモートコンピュータシステム（例えば、携帯電話、ラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、又は他のユーザデバイス）と通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート若しくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）ＧａｌａｘｙＴａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又はパーソナルデジタルアシスタントが含まれる。ユーザは、ネットワーク１２３０を介してコンピュータシステム１２０１にアクセスすることができる。

本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ１２１０又は電子記憶ユニット１２１５などのコンピュータシステム１２０１の電子的記憶場所に格納された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能又は機械読み取り可能コードは、ソフトウェアの形式で提供できる。使用中、コードはプロセッサ１２０５によって実行できる。場合によっては、コードは、記憶ユニット１２１５から検索することができ、プロセッサ１２０５による容易なアクセスのためにメモリ１２１０に格納することができる。状況によっては、電子記憶ユニット１２１５を除外することができ、機械実行可能命令がメモリ１２１０上に格納される。

コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械で使用するために事前にコンパイルかつ構成することができるか、又は実行時にコンパイルすることができる。コードは、コードを事前コンパイル済み又はコンパイル済みの様式で実行できるように選択できるプログラミング言語で提供できる。

コンピュータシステム１２０１など、本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで具体化することができる。技術の様々な態様は、典型的には、機械（又はプロセッサ）の実行可能コード及び／又は機械可読媒体のタイプで実行若しくは具体化される関連データの形式の「製品」又は「製造品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）、又はハードディスクなどの電子記憶ユニットに格納できる。「記憶」タイプの媒体は、いかなる時にもソフトウェアプログラミングに対して非一時的な記憶装置を提供し得る、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、又はそれらの関連するモジュールのいずれか又は全てを含むことができる。ソフトウェアの全部又は一部は、時には、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを介して通信される場合がある。そのような通信は、例えば、あるコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータへの、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を搭載し得る別のタイプの媒体には、有線及び光地上通信線ネットワークを通して、並びに様々なエアリンク上で、ローカルデバイス間の物理インターフェース全体に使用されるような、光波、電波、及び電磁波が含まれる。有線若しくは無線リンク、又は光リンクなどの、そのような波を運ぶ物理要素はまた、ソフトウェアを搭載する媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためのプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。

したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示すデータベースなどを実装するために使用され得るものなど、任意のコンピュータなどの記憶デバイスのうちのいずれかなどの光ディスク又は磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを備えるワイヤを含む、銅線、及び光ファイバが含まれる。搬送波伝送媒体は、無線周波（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されたものなどの、電気シグナル若しくは電磁気シグナル、又は音波若しくは光波の形態をとり得る。そのため、一般的な形態のコンピュータ可読媒体には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、データ若しくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがそこからプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取る任意の他の媒体が含まれる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを、実行のためにプロセッサに搬送することに関与し得る。

コンピュータシステム１２０１は、例えば、システム動作パラメータ、システム、サブシステム、又は様々なユニット（例えば、検出ユニット、フローユニットなど）のうちの１つ以上のステータス、又は分析パラメータ及び結果を提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）１２４０を備える電子ディスプレイ１２３５を含むか、又はそれと通信することができる。ＵＩの例には、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）及びｗｅｂベースのユーザインターフェースが含まれるが、これらに限定されない。

本開示の方法及びシステムは、１つ以上のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央処理装置１２０５による実行時にソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、変性シグナルを処理して、分析物（例えば、核酸分子）の同定又は定量化を提供することができる。

実施例１：多重化アッセイ
マイクロ流体アレイ消耗品及び統合システムは、ＳＭＮ１コピー数（例えば、ＳＭＡ症例の９０％以上に見られる遺伝子）、ＳＭＮ２コピー数（例えば、予後において重要な遺伝子）、及びＲＰＰＨ１（参照遺伝子）を単一のアッセイに統合する、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）新生児健診のための概念実証多重化アッセイに使用される。ｄＭＣＡアッセイは、５０～７５塩基対に及び、５つのプライマーによって生成される、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２、及びＲＰＰＨ２を標的とする３つのアンプリコンを使用する。ＳＭＮ１とＳＭＮ２との間の相同性が高い配列のため、エクソン７のスプライシング部位を標的とする対立遺伝子特異的プライマーを使用して２つの遺伝子を区別する。ＳＭＮ１はヌクレオチド８０４にアデニンを含み、ＳＭＮ２は同じ位置にチミンを含む。ＳＭＮ１「Ａ」対立遺伝子特異的プライマーは、ＳＭＮ２テンプレートからのＰＣＲ産物を増幅せず、ＳＭＮ２「Ｔ」対立遺伝子特異的プライマーについて、その逆も同様である。フォワードプライマーの５’末端に可変長のテールを追加すると、融解温度分離が増加し、２つの標的を更に区別することができる。２つのプライマーは、内部コピー数コントロールとして２つのコピーを有する高度に保存されたＲＰＰＨ１遺伝子を増幅するために使用される。この設計は、ユタ大学で開発されたμＭｅｌｔソフトウェアによって検証されており、３つの異なる融解ピーク（７１℃、７６℃、及び８１℃）が予測される。更に、ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ－Ｂｌａｓｔ及びＵＣＳＣ Ｉｎ－Ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲツールを使用したプライマー特異性も実施した。

プライマーセットには、ＥｖａＧｒｅｅｎ二本鎖ＤＮＡ挿入色素及びＢｉｏｔｉｕｍの２ｘ ＭａｓｔｅｒＭｉｘが含まれる。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａのヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が標的である。ｄＭＣＡ試薬混合物は、パーティションあたり約１コピーの最終ｇＤＮＡ濃度で調製される。５９℃から９５℃の間で４０サイクルの熱サイクルの後、５９℃から９５℃まで０．２℃／秒の分解能でアンプリコン融解が行われる。図１３は、４つの異なる温度で得られた例示的な蛍光画像を示し、６５℃から８５℃までの３つのアンプリコンの融解を実証している。ランダムに選択された２００のパーティションからの例示的な融解曲線（蛍光シグナルの微分）を図１４に示す。例示的な融解曲線は、３つの異なる標的ＳＭＮ１ １４０１、ＳＭＮ２ １４０２、及びＲＰＰＨ１ １４０３を表す複数の融解温度を示す。

実施例２：大規模な種の同定
保存されたプライマーの単一対を使用した広範なＰＣＲは、関心のある潜在的な配列バリアントの偏りのない増幅を可能にすることができる。これを融解曲線分析（ＭＣＡ）と組み合わせることで、それらの融解プロファイルに基づくアンプリコン配列の同時「フィンガープリンティング」を可能にすることができる。１６塩基長のアンプリコン（１６Ｓ）に由来する融解曲線は、より短いアンプリコンに由来するものよりも二相性の曲線プロファイルを与えるが、融解温度範囲が狭く、プロファイルの多様性が限られているため、広範な種レベルの同定での使用が制限される場合がある。ＭＣＡでは、融解温度及び曲線形状は、配列、ＧＣ含有率、長さ、融解ドメイン、及び配列相補性の関数である。１６Ｓ－２３Ｓ ｒＤＮＡ間の細菌の内部転写スペーサ（ＩＴＳ）配列は、その隣接遺伝子よりも進化的に制約されていない可能性があり、種レベルの系統発生学的区別の強化を可能にすることができる。更に、複数の融解ドメインを有するその固有のゲノム内配列の不均一性は、複雑な融解曲線形状に寄与し、アッセイ形式を簡素化する単一の系統発生遺伝子座として適している。ｑＰＣＲ－ＨＲＭを実行するために８９の異なる細菌種のアーカイブされたライブラリを使用して、種の同定を強化するために、図１５Ａに示すように、ＩＴＳアンプリコンが、１６Ｓアンプリコンと比較して、複数のピーク及びはるかに広い融解温度範囲を備えた豊富な融解曲線プロファイルを生成することが実証されている。同じ属の近いメンバは、それらの１６Ｓ曲線によって区別できない場合があり、ＩＴＳ曲線に基づいて視覚的に区別される場合がある。それぞれ、バチルス種及びブドウ球菌種の例を示す図１５Ｂ及び１５Ｃを参照されたい。図１５Ｄのヒートマップに示されるように、ＩＴＳ ｒＤＮＡの予備配列分析は、標的種に対する十分な識別力を示唆している。図１５Ｅに示されるように、１６Ｓに適用される同じ分析は、有意に低い識別力を達成し得る。融解曲線データの統計的解釈のための方法も開発されており（例えば、単純ベイズ（ｎＢ）曲線分類アルゴリズム）、一つ抜き交差検証を使用して、ライブラリ内の８９の細菌種を区別する際に９５％を超える正確度を達成することができる。スタンフォード病院の患者から得られた２，０００を超える「分子フィンガープリント」を含む開発されたデータベースは、ＩＴＳ領域の広範なＰＣＲ及びそれに続く融解曲線分析を使用して、ｄＭＣＡプラットフォームの性能をベンチマークするために使用することができる。

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明が、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることを意図するものではない。本発明は、前述の明細書を参照して説明されてきたが、本明細書の実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。多くの変化形、変更、及び置換が、本発明から逸脱することなく、当業者は思いつくであろう。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成、又は相対的な比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施することにおいて採用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、そのような代替案、修正、変化形、又は等価物も網羅するものと想定される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの等価物が、それによって網羅されることが意図される。

Claims (39)

1. 核酸同定のための方法であって、
   （ａ）複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成するために複数の核酸分子を使用することであって、（ｉ）前記複数の二本鎖核酸分子の第１のサブセットが、前記複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み、（ｉｉ）前記複数の二本鎖核酸分子の第２のサブセットが、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子に対応する第２の配列を含む第２の二本鎖核酸分子を含み、前記追加の配列を含まない、使用することと、
   （ｂ）前記複数の二本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子を変性させることと、
   （ｃ）複数の変性プロファイルを生成するために、前記変性を示すシグナルを検出することであって、
   ｉ．前記複数の変性プロファイルのうちの第１の変性プロファイルが、前記第１の二本鎖核酸分子の変性に由来し、
   ｉｉ．前記複数の変性プロファイルのうちの第２の変性プロファイルが、前記第２の二本鎖核酸分子の変性に由来し、
   ｉｉｉ．前記第１の変性プロファイルと前記第２の変性プロファイルとが異なる、検出することと、
   （ｄ）前記複数の核酸分子のうちのある核酸分子を同定するために、前記複数の変性プロファイルを処理することと、を含む、方法。
2. （ａ）の前に、前記複数の核酸分子及び複数のフォワードプライマーを前記複数のチャンバに提供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記複数のフォワードプライマーが、（ｉ）前記第１の核酸分子の少なくとも一部に相補的な第１の領域、及び、前記第１の核酸分子に相補的でなく、前記追加の配列に対応する第２の領域を含む第１のフォワードプライマーと、（ｉｉ）前記第２の核酸分子の少なくとも一部に相補的な第２のフォワードプライマーと、を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記複数のフォワードプライマーが、ユニバーサルプライマーではない、請求項３に記載の方法。
5. （ａ）の前に、複数の第１の伸長産物を生成するために、前記複数のフォワードプライマーをプライマー伸長反応に供することを更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
6. （ａ）の前に、前記複数の第１の伸長産物を複数のリバースプライマーと接触させることを更に含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記複数のリバースプライマーが、ユニバーサルプライマーである、請求項６に記載の方法。
8. （ａ）の前に、複数の第２の伸長産物を生成するために、前記複数のリバースプライマーをプライマー伸長反応に供することを更に含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記複数の第２の伸長産物が、前記複数の二本鎖核酸分子である、請求項８に記載の方法。
10. 前記シグナルを検出するために、前記複数のチャンバの少なくとも一部をイメージングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記シグナルを検出するために前記複数のチャンバをイメージングすることを更に含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記二本鎖核酸分子を変性させるために、前記複数の二本鎖核酸分子を制御された加熱に供することを更に含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記二本鎖核酸分子が、前記シグナルの由来である挿入色素を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記二本鎖核酸分子が、前記シグナルの由来である複数の異なる挿入色素を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記シグナルが、光シグナルである、請求項１に記載の方法。
16. 前記複数のチャンバのうちのあるチャンバが、約５００ピコリットル以下の容積を有する、請求項１に記載の方法。
17. 前記チャンバの前記容積が、約２５０ピコリットル以下である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記複数のチャンバが、約１，０００以上のチャンバを含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記複数のチャンバが、約１０，０００以上のチャンバを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 核酸同定のためのシステムであって、
    核酸分子を同定するためのシグナルを収集及び処理するように構成されている検出ユニットと、
    前記検出ユニットに動作可能に結合されている１つ以上のプロセッサと、を備え、前記１つ以上のプロセッサが、個々に又は集合的に、
    （ｉ）複数のチャンバ内で複数の二本鎖核酸分子を生成するために複数の核酸分子を使用することであって、（ｉ）前記複数の二本鎖核酸分子の第１のサブセットが、前記複数の核酸分子のうちの第１の核酸分子に対応する第１の配列及び追加の配列を含む、第１の二本鎖核酸分子を含み、（ｉｉ）前記複数の二本鎖核酸分子の第２のサブセットが、前記複数の核酸分子のうちの第２の核酸分子に対応する第２の配列を含む第２の二本鎖核酸分子を含み、前記追加の配列を含まない、使用することと、
    （ｉｉ）前記複数の二本鎖核酸分子の二本鎖核酸分子を変性させることと、
    （ｉｉｉ）複数の変性プロファイルを生成するために、前記変性を示すシグナルを検出することであって、
    （Ａ）前記複数の変性プロファイルのうちの第１の変性プロファイルが、前記第１の二本鎖核酸分子の変性に由来し、
    （Ｂ）前記複数の変性プロファイルのうちの第２の変性プロファイルが、前記第２の二本鎖核酸分子の変性に由来し、
    （Ｃ）前記第１の変性プロファイルと前記第２の変性プロファイルとが異なる、検出することと、
    （ｉｖ）前記複数の核酸分子のうちのある核酸分子を同定するために、前記複数の変性プロファイルを処理することと、を行うようにプログラムされているか又は別様に構成されている、システム。
21. 前記複数のチャンバのうちのあるチャンバが、約５００ピコリットル以下の容積を有する、請求項２０に記載のシステム。
22. 前記チャンバの前記容積が、約２５０ピコリットル以下である、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記複数のチャンバが、約１，０００以上のチャンバを含む、請求項２０に記載のシステム。
24. 前記複数のチャンバが、約１０，０００以上のチャンバを含む、請求項２３に記載のシステム。
25. 前記検出ユニットが、前記複数のチャンバの少なくとも一部をイメージングするように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
26. 前記検出ユニットが、前記複数のチャンバをイメージングするように構成されている、請求項２５に記載のシステム。
27. 前記検出ユニットが、約１５ミリメートル（ｍｍ）×約１５ｍｍ以上の視野を有するカメラを備える、請求項２５に記載のシステム。
28. 前記視野が、約５０ｍｍ×約７５ｍｍ以上である、請求項２７に記載のシステム。
29. 前記検出ユニットが、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサを備えるカメラを備える、請求項２０に記載のシステム。
30. 前記検出ユニットが、前記カメラと前記複数のチャンバとの間に配置されているテレセントリックレンズを更に備える、請求項２９に記載のシステム。
31. 前記検出ユニットが、光シグナルを収集するように構成されている光学ユニットを含む、請求項２０に記載のシステム。
32. 前記光学ユニットが、４つ以上のチャネルを備え、各チャネルが、異なる波長の光を収集するように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
33. 前記システムが、複数のチャンバアレイを備える基板を受け入れるように構成されており、前記複数のチャンバアレイのうちのあるチャンバアレイが、前記複数のチャンバを含む、請求項２０に記載のシステム。
34. 前記基板が、少なくとも４つのチャンバアレイを備える、請求項３３に記載のシステム。
35. 前記チャンバアレイが、別のチャンバアレイから流体的に隔離されている、請求項３３に記載のシステム。
36. 前記システムが、プレートを受け入れるように構成されており、前記プレートが、前記基板を含む複数の基板を保持するように構成されている、請求項３３に記載のシステム。
37. 前記１つ以上のプロセッサに動作可能に結合されている熱ユニットを更に備え、前記熱ユニットが、前記複数のチャンバの温度を制御するように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
38. 前記１つ以上のプロセッサが、前記熱ユニットに、前記二本鎖核酸分子を変性させるために前記複数のチャンバを制御された加熱に供するように指示する、請求項３７に記載のシステム。
39. 前記熱ユニットが、熱電温度制御ユニットを含む、請求項３７に記載のシステム。

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