JP5368321B2 - 固相pH検出を用いたqPCR - Google Patents
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Description
本発明は、pH感受性イオン感応電界効果トランジスタ(ISFET)を用いて増幅の結果としてプライマー伸長法から生じるプロトン放出を検出することによる、核酸増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、リガーゼ連鎖反応または転写媒介増幅、の定量的リアルタイムモニタリングに関する。本発明は、この目的のためのpH感受性ISFETを含む検出機器を提供するものでもある。
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCRまたはRT−PCR)はDNAまたはRNAの少量の複製、例えば遺伝子配列のクローニング、疾患に関連付けられた変異のための法医学的検査および遺伝学的検査、のための業界標準になっている。qPCRのほとんどの形態は標識されたプローブ(例えば、蛍光染料)を単位複製配列を検出するために必要とする。ここで開示されたqPCRは、標識プローブの必要性を避けている。それは、代わりにPCRサイクルの結果によって生じるプロトン放出のpH感受性ISFET検出によるものであり、チップ上で行なうことができる。
前記測定は、超えられるべきサンプルの緩衝能に対する閾値サイクル数より多い増幅の結果としての、標的配列の存在下におけるプロトン放出から生じるpH変化を検出することによって行なわれ、
前記検出は検出機器を採用し、
前記検出機器は、前記検出サンプルに晒された検出表面を有し、かつ前記トランジスタ表面におけるpH変化に応じた電気的出力信号を発生するように配置されたISFET、および、該ISFETからの電気的出力信号を検出するための手段を含む
ことを特徴とする測定方法が提供される。
pH感受性ISFET
上述のように、WO03/073088は、成長中のDNA鎖へのヌクレオチド塩基の結合が水素イオンの放出を生じることに基づいて(図6参照)、サンガー型のDNAシークエンシングのためにpH感受性ISFETを用いることを教示する。図1に示された結果は、DNA伸長反応とそのpHにおける効果を実証する。pHはガラス電極配置を用いて測定され、30秒毎の絶対値が測定された。そのようなDNA伸長の間に成長するヌクレオチド鎖の末端における個々のヌクレオチド挿入を測定することのできるISFETは、核酸増幅測定のために同様に提供される。上述のように、係るISFETは、例えば、その最上部がポリメラーゼの層であるイオン感受性窒化シリコン層とともに備え付けられる。該ISFETは、迅速なpH変化を検出でき、かつ、pH変化の1ms以内で測定された即時の応答速度を有している[Woias et al.,‘Modelling the short-time response
of ISFET sensors’, Sensors and Actuators B, 24-25(1995), 211-217]。ヌクレオチド挿入に続くフォローアップ反応はpH依存性であり、したがって、水素イオンの正味の消費または生産は、反応が起こるところのpHに依存する。一般に、該反応は、6から8.5、例えば、7から7.5、のpH範囲で行なわれる。この範囲では、水素イオンはヌクレオチド挿入の間全体的に遊離している。
SiOH ←→SiO-+H+
SiOH2 + ←→SiOH+H+
SiNH3 + ←→SiNH2+H+
窒化シリコンを含むことは、窒化シリコンがない場合に得られるよりも、pH変化に対する増加されたより早い感受性を提供できるため有利である。また、窒化シリコンはFETを水素化および電荷移動から保護するのに役立つ。
を含んでいる。第1および第2のFETのドレインは固定の電流源(示していない)に接続されている。第1および第2の演算増幅器からの出力は差動増幅器14へ移動され、出力信号VOUTを生じる出力の間の差を増幅する。差動増幅器14からのネガティブフィードバックは試薬混合物中に位置する貴金属電極15へ送られる。演算増幅器14は、水素濃度の変化にもかかわらずFET11,13へ同じ電圧を供給し続ける出力電圧を生じる。図3に示される実施形態は、FET11,13および演算増幅器10,12,15の製作を合理化することができるため有利である。
精製シリコン基板
ドーパントの添加:p型基板の製造
表面酸化:SiO2層生成
電源/ドレイン定義および植込み
LPCVD*を用いた窒化シリコン堆積
接触形成
パッシベーション
* 低圧化学蒸着
FETおよび特に図3に示されるもの、および増幅ステージは、PMOSトランジスタに置き換えまたは結合されてもよい。
図2または3に示されるような検出デバイス形式におけるpH感受性FETは、本発明によって核酸増幅を測定することを好適に採用してもよい。pH感受性FETのそのような使用は、qPCRを行なうことに関連してさらに以下に記載される。しかしながら、pH感受性FETは、転写介在増幅(TMA)またはリガーゼ連鎖反応(LCR)を含む核酸増幅のいずれかの形式を測定するのと同じ方法を採用することが好ましい。
・変性:二重鎖鋳型DNAは2つのDNA鎖を結合する水素結合を破壊することにより、例えば、95℃において、2つの一本鎖に分離される;
・アニーリング:重要な塩基配列は、例えば55℃で実行される鋳型DNAの一本鎖へ
のハイブリダイズをする2つのオリゴヌクレオチドプライマーによって決定される;
・伸長:DNAポリメラーゼはdNTPsの存在下で各々のプライマーを伸長する、例えば72℃において
サイクルの伸長ステージにおいて、プロトンは各々のプライマーへの塩基の添加の結果として放出される。それは、本発明に基づいたPCR産物のリアルタイム定量のための基礎として用いられるこのプロトン放出である。上述したように、ISFET検出表面は緩衝化された増幅混合物に晒され、好ましくは、低容量反応チャンバまたは流路、例えばマイクロ流体デバイスのチャンバまたは流路中に配される。このように、例えば、低容量反応チャンバまたはウェルは好適に採用されることができ、例えば容量が1pLから約10μLのものである。これはISFETの上に図8に示すように設けられてもよく、ここではISFET(16)反応チャンバまたはウェル(18)の基体(17)に設けられ、マイクロ流路はサンプル輸送およびチャンバからの排出のために設けられる。チャンバは、PCR温度サイクルのためのアニーリングおよび変性温度の間(例えば、55および95℃の間)において加熱および冷却されることができる。プライマーおよびdNTPsなどの増幅のための試薬は,反応チャンバ内で乾燥されサンプルとともに導入されてもよい。標的塩基配列が存在する場合は、それからPCRサイクルの進行のある閾値を超えたpH降下により決定されることができる。標的塩基配列が存在しない場合は、プライマーは鋳型DNAにアニールせず、プロトン放出プライマー伸長は起こらないためpHの大きな変化が得られない。増幅混合物中のバッファの存在により、PCRサイクルによって生じるpH変化はまず緩衝作用によって計測される。しかしながら、一度、緩衝能が打ち消されると、図7に示されるようにpHの迅速な変化が測定される。pH変化が一定の閾値を通過する前のサイクルの数は、DNA鋳型の濃度に依存し、濃度が高いほどサイクルは少なくなり、公知の鋳型負荷に対する閾値に達するPCRサイクルの数を算出することにより鋳型DNAの定量が可能とされている。
深さにエッチングされた。パイレックス(登録商標)ガラスカバーが各々のシリコンチップの最上部上に配置され、該シリコンおよびガラスは陽極接合された。いくつかのタイプの表面パッシベーションは供給されたチャンバ内での温度サイクルによるPCR増幅降下の改善の観点で調査された。酸化されたシリコン表面(SiO2)は従来のPCRチューブ内で行なわれる反応と比較して一貫した増幅が得られることがわかった。そのような表面は本発明に基づくISFETpH検出を備えた核酸増幅を実行するためのマイクロ流体デバイスの製作においても有利である。PCRマイクロ流体デバイスの製作における表面パッシベーションのさらなる議論のために参照文献としてZhangら‘PCR microfluidic devices for DNA amplification’in Biotechnology Advances (2006) 24, 243-が挙げられる。概観した論文に記載されるように、基材コーティングによる静的表面パッシベーションの代わりとして、サンプル中にパッシベーション剤を含むことができるようにしてもよい(直接的パッシベーション)。
成され基体に設けられた1つ以上のISFETを用いて本発明に従って測定されてもよい。それはリアルタイムPCR分析が増幅手順として達成されるように連続的フローPCRのための上記デバイスの流路に沿った多数の位置においてISFET検出器が設けられることが好ましい。
本発明のさらなる一態様において、本発明に従ったサンプルにおける核酸増幅の測定のための検出装置が提供され、上記装置は基体、例えばシリコン基材、の中または上にサン
プルを受入れるためのチャンバまたは流路を含んでおり、1つ以上のpH感受性ISFETが上記チャンバまたは流路内の核酸増幅の測定のために配置され、上記チャンバまたは流路内に存在する上記基体が増幅降下を改善するためのコーティングを有し、すなわち上記基体は上述のような表面パッシベーションを受ける。マイクロ流体デバイスは、上述のような如何なる形態も取り得る。基体の表面パッシベーションの必要性は、しかしながら、基体材料を選択することにより、または既に上述したような動的パッシベーションを採用する場合は避けることができる。
pH感受性ISFETがDNAシークエンシングのために使用されようと、ISFET表面に固定化されたDNA上のDNA伸長の代わりとして核酸増幅、例えばqPCR、のために用いられようと、DNA伸長はビーズ上で起こる。ビーズの使用は例えば図8に示されるように、反応チャンバまたは流路の底の水平面に配されたISFETと好適に結び付けることができ、ビーズはISFET検出表面の付近に定着する。ビーズは重力的定着のみでビーズがISFET検出表面付近に運ばれるようなものが選択されることができる。また、磁石/金属のビーズが選択され、磁気的にISFET検出表面付近に引込まれてもよい。ビーズはDNAの付着のためのどのような適切な材料、例えばシリカ、ポリスチレン、アガロースまたはデキストラン、から合成された球状粒子であってもよい。ビーズのサイズは重力沈降を助けるように、および、反応チャンバおよびポート入口および出口の妨害物を避けるための必要性と合致するように調整されていてもよい。ビーズは水または緩衝液を用いてセンサ表面から洗い流されることができる。ビーズへのDNAの結合は従来の方法、例えばビーズ表面の機能化、を用いて達成してもよい。スペーサを採用してもよい。ビーズの被覆率はビーズに対するDNAの比を調整することにより制御される。pH感受性ISFETがDNAシークエンシングまたは核酸増幅の測定に用いられ、より小さいサイズの制約がある場合、例えば、シリカビーズ(例えば直径約200nm)、および、ビーズに直接的に固定化された、またはカルボキシル基を有する官能基を供給するための次のビーズの修飾体に固定化されたDNAを好適に採用することができる。例えば、プラスチックビーズ(例えば約1μmのプラスチックマイクロビーズ)を好適に採用することができる。ISFETを核酸増幅の測定のために採用する場合、ビーズはサンプル中の標的DNAを捕捉するプローブDNAを運ぶことができる。
ビーズの使用の代わりとして、標的DNAの捕捉のためのDNAプローブは直接的または間接的にISFETに結合されていてもよい。そのようなDNAプローブの固定化は固体表面へのDNAプローブの固定化のための周知の方法、例えばDNAマイクロアレイ技術において周知のそのような技術、を用いることにより達成されてもよい。このように、ISFET上のDNAプローブ固定化はインサイチューオリゴヌクレオチド合成により(リソグラフィまたは他の方法により)達成されてもよい。
上述のような標的プローブの固定化はサンプルが標的核酸と標的以外の核酸の両者を含む場合に好ましい。プローブの固定化は標的以外の核酸または緩衝タンパク質からの標的の分離を可能とするためにそのようにされる。固定化プローブを用いて標的をISFET検出表面に近接させておくことにより、核酸増幅によって生じるpH変化が一定範囲に抑えられ、ノイズに対する信号の比の増加という利益を達成してもよい。
本発明のさらなる態様において、サンプル中の標的核酸塩基配列を核酸増幅、例えばqPCR、によって検出するためのキットが提供され、反応チャンバまたは流路を含む検出デバイスおよび上述のような上記反応チャンバまたは流路内の核酸増幅の測定のためのpH感受性ISFET、例えばマイクロ流体チップの形成におけるそのような検出デバイス、を含んでおり、上記増幅のためのプライマーは反応チャンバまたは流路内またはキットとは別に備えられている。プライマーは、標的核酸用のビーズ固定化オリゴヌクレオチドプローブとともに備えられていてもよい。上述のように、検出デバイスの反応チャンバまたは流路はDNAポリメラーゼを含む反応チャンバ内で乾燥された他の試薬およびプライマー伸長のための必要なdNTPsを有していてもよい。
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図7は、10μM Tris HCl、pH7.5、0.4mM dNTPs、2mM
MgCl2、50mM KCl、0.05w/v%BSA、1U/μL Taqポリメラーゼ、1μM PCRプライマーペア、および、準備されたDNA鋳型(150〜15
0,000コピー)の複製混合物を採用する典型的なPCR増幅のためのPCRサイクルでのpH変化を示す。仮定上の単位複製配列は200塩基対であり、各々のdNTPの結合は1つのプロトンを放出する。初期pH値は7.5である。TrisおよびdNTPの濃度を考慮すると、各々のpH値における緩衝能を決定することができる。理論的pH変化は反応から放出されたプロトンの数および反応が起こるpHにおける緩衝能によって決定することができる。
簡易化されたバージョンの反応において、一重伸長反応は以下のように記載することができる:
(1) HP3O10 -3−ヌクレオシド+DNA−3’OH=>H2P2O7 2-+DNA−O−PO(O-)−O−ヌクレオシド
(2) H2P2O7 2-=>HP2O7 3-+H+
ヌクレオチド挿入反応の即時の成分均衡が(1)に示され、伸長されたDNA鎖および正味荷電−2のピロリン酸(pKa1およびpKa2)が得られる。6から8.5のpH範囲において、いくつかのピロリン酸は(2)に示されるように第3のプロトン(pKa3)を解離させ、pHの低下をもたらす。
pKa1〜0.83
pKa2〜1.96
pKa3〜6.68
pKa4〜9.39
簡易化されたバージョンにおけるPCRサイクルの機能としてのpH変化の計算:
β=βTris+βdNTP=1.08×10-4M(DNA濃度は無視できる)
そして、
Claims (30)
- サンプル中にある場合の標的配列の増幅のための緩衝化された核酸増幅混合物を含むサンプルにおける、核酸増幅の測定方法であって、
前記測定は、超えられるべきサンプルの緩衝能に対する閾値サイクル数より多い増幅の結果としての、標的配列の存在下におけるプロトン放出から生じるpH変化を検出することによって行なわれ、
前記検出は検出機器を採用し、
前記検出機器は、前記検出サンプルに晒された検出表面を有し、かつ前記トランジスタ表面におけるpH変化に応じた電気的出力信号を発生するように配置されたISFET、および、該ISFETからの電気的出力信号を検出するための手段を含む
ことを特徴とする測定方法。 - 前記核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅である、請求項1に記載の方法。
- 前記ISFETは、窒化シリコン層を備えている、請求項1または2に記載の方法。
- DNAポリメラーゼ酵素固定層を前記窒化シリコン層の上に備えた、請求項3に記載の方法。
- 参照電極が設けられた、請求項1から4のいずれかに記載の記載の方法。
- 増幅のための標的核酸がビーズ上に捕捉され、前記ISFET検出表面の付近に運び込まれた該ビーズ上で核酸増幅が起こる、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 増幅のための標的核酸が、前記ISFET上に固定されたプローブによって捕捉される、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記ISFET検出表面が、1pLから10μLの低容量反応チャンバ内の前記サンプルに晒される、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記反応チャンバは、1つ以上のサンプルにおいて核酸増幅が同時的に測定され得る前記ISFETを含む、さらに1つ以上の別のチャンバを含むマイクロ流体デバイス内にある、請求項8に記載の方法。
- 前記反応チャンバは、抵抗オンチップヒータ部および温度センサを含むチップ上にあり、前記チャンバはPCR温度サイクルのために加熱または冷却されることができる、請求項8に記載の方法。
- 前記チップはさらにオンチップ温度制御回路を含む、請求項10に記載の方法。
- PCR測定用の前記サンプルは、マイクロ流体デバイスの流路またはチャンバを通して流れるようにされており、PCRのための温度サイクルが達成されるように流れながら連続して異なる温度に晒される、請求項2に記載の方法。
- 前記サンプルは、前記温度サイクルに適した異なる温度領域を連続的に横断するチャンバまたは流路を通して流れるようにされている、請求項12に記載の方法。
- 前記サンプルは、前記マイクロ流体デバイスの基体に備えられた異なる温度領域を連続的に横断するチャンネルを通して流れるようにされており、前記領域は、変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCRステージの流路に沿っての連続的反復に適したものである、請求項13に記載の方法。
- 前記流路に沿った異なる位置においてサンプルのpH変化を検出するために1以上のISFETが備えられた、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルは、マイクロチャンバ内の温度サイクルのために必要とされる温度領域の間を後方および前方に移動し、前記ISFETは前記チャンバの壁に備えられた、請求項12または13に記載の方法。
- 前記核酸増幅は等温核酸増幅である、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸を核酸増幅のモニタリングによって検出する方法であり、前記緩衝能が超えられた時点での前記pH変化が前記標的核酸の検出に相関する、請求項1に記載の方法。
- 前記閾値サイクル数に達するために用いられる増幅サイクル数が、前記サンプル中に存在する前記標的配列の量を定量するために用いられる、請求項1に記載の方法。
- サンプルを加熱するために配置された1つ以上の発熱体と、サンプルのpHを測定するためのISFETを各々有する2つ以上のISFET含有反応チャンバとが一体化されたシリコン基材を含む、
サンプル中の核酸増幅測定用の検出装置。 - 前記ISFETの検出表面は窒化シリコン層で提供される、請求項20に記載の検出装置。
- さらに、1つ以上の温度センサーを含む、請求項20または21に記載の検出装置。
- 前記温度センサーは、前記サンプルの温度を制御するために、前記1つ以上の発熱体を制御するように配置される、請求項22に記載の検出装置。
- 前記反応チャンバが、前記シリコン基材の中または上で前記サンプルを受け入れるか、または、
前記検出装置が、前記シリコン基材の中または上で前記サンプルを受け入れるための流路を含む、請求項20〜23のいずれかに記載の検出装置。 - 前記サンプルを含む1pL〜10μLの低容量反応チャンバが、前記ISFET上に設けられた、請求項20に記載の検出装置。
- 前記サンプルは、マイクロ流体デバイスの流路または反応チャンバを通して流れるようにされており、PCRのための温度サイクルが達成されるように連続して異なる温度に晒される、請求項20に記載の検出装置。
- 前記サンプルは、前記温度サイクルに適した異なる温度領域を連続的に横断する反応チャンバまたは流路を通して流れるようにされている請求項26に記載の装置。
- 前記サンプルは前記マイクロ流体デバイスの基体に備えられた異なる温度領域を連続的に横断する流路を通して流れるようにされており、前記領域は変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のPCRステージの流路に沿っての連続的反復に適したものである請求項27に記載の装置。
- 前記流路に沿った異なる位置においてサンプルのpH変化を検出するために1以上のISFETが備えられた請求項28に記載の装置。
- 前記サンプルは反応チャンバ内の温度サイクルのために必要とされる温度領域の間を後方および前方に移動し、前記ISFETは前記反応チャンバの各々の壁に備えられた請求項26または27に記載の装置。
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