ES2440572T3

ES2440572T3 - Aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico, usando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) para detectar el pH

Info

Publication number: ES2440572T3
Application number: ES10174104.9T
Authority: ES
Inventors: Christofer Toumazou; Chung-Pei Ou
Original assignee: DNAE Group Holdings Ltd
Current assignee: DNAE Group Holdings Ltd
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: JP2010519914A; EP2129792A1; EP2129792B1; JP5368321B2; ATE479780T1; CN101743319A; WO2008107014A1; DE602007008953D1; CN101743319B

Abstract

Un aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico en una muestra, que comprende: unsustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra, y más de unacámara de reacción que contiene un ISFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.

Description

Aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico, usando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET) para detectar el pH 5

Campo de la invención

La presente invención se refiere al control cuantitativo en tiempo real de la amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación mediada por transcripción o

10 reacción en cadena de la ligasa, empleando un transistor de efecto de campo sensible a iones (ISFET, Ion Sensitive Field Effect Transistor) sensible a pH para detectar la liberación de protones resultante de la extensión de cebadores a medida que avanza la amplificación. Para esta finalidad, la invención proporciona un aparato de detección que incluye un ISFET sensible a pH.

15 Antecedentes de la invención

La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR o RT-PCR) se ha convertido en un estándar de hecho para la amplificación de pequeñas cantidades de ADN o ARN, por ejemplo, para la clonación de secuencias de genes, pruebas forenses y pruebas genéticas para mutaciones relacionadas con enfermedades. La

20 mayoría de las realizaciones de qPCR requieren sondas marcadas (por ejemplo, tintes fluorescentes) para detectar amplicones. La qPCR descrita en la presente memoria evita la necesidad de usar sondas marcadas. En cambio, se basa en un ISFET sensible a pH que detecta la liberación de protones resultado del ciclo de la PCR y por lo tanto puede realizarse en una microplaca.

25 Como se informó en la Solicitud de Patente Internacional Publicada WO 03/073088, los autores de la presente invención descubrieron anteriormente que los ISFET podían usarse para controlar la liberación de protones asociada con la inserción de nucleótidos individuales en el extremo de una cadena oligonucleotídica. El control de inserciones de nucleótidos individuales mediante un ISFET sensible a pH puede utilizarse en la secuenciación de ADN basada en la secuenciación de ADN del método de Sanger convencional y en la identificación de variantes alélicas, por

30 ejemplo, polimorfismos mononucleotídicos (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms), que dependen de la detección de la extensión de cebadores oligonucleotídicos diseñados hacia sitios de ácido nucleico específicos diana. La presente invención surge de la concienciación adicional de los inventores de que los protones también son un producto de la PCR y que, por tanto, la qPCR puede realizarse mediante control ISFET de la liberación de protones, preferentemente en una cámara de reacción de bajo volumen.

35 El documento WO2005/075638 describe el uso de un GenFET con una sonda inmovilizada para detectar un gen diana, que si está presente, produce un ácido nucleico cargado en contacto con la superficie. Toda la matriz GENFET se expone a un volumen que contiene una muestra que contiene el gen.

40 Resumen de la invención

Por lo tanto, se describe un método de control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra que comprende una mezcla de amplificación de ácido nucleico tamponada para la amplificación de la secuencia diana si está presente en la muestra, caracterizado por que dicho control es por medio de la detección de cambio de pH

45 resultante de la liberación de protones en presencia de la secuencia diana según avanza la amplificación más allá de un umbral de número de ciclos para la capacidad tampón de la muestra a superar, dicha detección que emplea un aparato de detección que comprende un ISFET que tiene una superficie detectora se expone a la mezcla y dispuesta para generar una señal de salida eléctrica en respuesta al cambio de pH en dicha superficie de transistor y medios para detectar una señal de salida eléctrica del ISFET. Para conseguir el grado de sensibilidad requerido en

50 la detección, la amplificación se realizará preferentemente en pequeños (preferentemente nano) volúmenes y a una capacidad de tampón baja de tal manera que el número de protones liberados conduce a un cambio rápido en el pH a medida que se supera la capacidad del tampón de la muestra. Por tanto, dicho método puede realizarse ventajosamente en un nanoreactor con un ISFET sensible a pH integrado proporcionado en un dispositivo o microplaca microfluídicos.

55 En un primer aspecto, la presente invención proporciona un aparato de detección para el control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra que comprende un sustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra y más de una cámara de reacción conteniendo SFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.

60 Preferentemente una superficie de detección de uno o más ISFET está provista de una capa de nitruro de silicio. De manera preferente, el aparato de detección comprende adicionalmente uno o más detectores de temperatura y, en una opción preferida, los detectores de temperatura pueden estar dispuestos para controlar uno o más elementos térmicos para controlar la temperatura de la muestra.

65 Las cámaras de reacción reciben preferentemente la muestra en o sobre una base, o el aparato comprende adicionalmente canales para recibir la muestra en o en una base. Cámaras de reacción de 1 pl a aproximadamente 10 μl contienen dicha muestra y superpuestos los uno o más ISFET.

5 La muestra puede hacerse fluir a través de un canal o una cámara de un dispositivo microfluídico y, a medida que fluye, se somete consecutivamente a diferentes temperaturas mediante las que se realiza el termociclado para la PCR. La muestra puede hacerse fluir a través de una cámara o un canal que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura adecuadas para dicho termociclado. La muestra puede hacerse fluir a través de un canal que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura previstas en la base de dicho dispositivo microfluídico, siendo dichas zonas adecuadas para las repeticiones sucesivas a lo largo del canal de las etapas de desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión de cebadores de la PCR.

Preferentemente, para detectar el cambio de pH de la muestra en diferentes posiciones a lo largo de dicho canal, se emplea más de un ISFET. La muestra puede moverse hacia atrás y hacia adelante en una microcámara entre zonas

15 de temperatura requeridas para el termociclado y dicho ISFET se proporciona en una pared de dicha cámara. Preferentemente, al menos uno de: un electrodo de referencia, un FET de referencia que tiene una capa no enzimática unida, y un detector de conductividad; se integran después con el sustrato de silicio.

Adicionalmente, el aparato de detección puede comprender reactivos para la amplificación de ADN. Los reactivos pueden ser ADN, incluyendo opcionalmente sondas de captura de ADN diana en la muestra, inmovilizados sobre perlas. Los reactivos también pueden deshidratarse y situarse dentro de una cámara de reacción o disponerse para introducirse en la cámara de reacción con la muestra.

El documento WO 03/054225 describe (véase la Figura 3, página 15-16) un sistema en el que la hibridación se

25 realiza en una zona rebajada creada por la capa de grabado 7. El volumen restante permite que el fluido se mezcle libremente a su alrededor. Por tanto, la técnica anterior describe a lo sumo una cámara, que es el volumen encerrado por encima de la matriz de detectores.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones específicas de la invención se describirán ahora a modo de ejemplo solo con referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La Figura 1 muestra los cambios de pH que se producen durante la extensión de la cadena de ADN usando un 35 medio de reacción tamponado.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un transistor de efecto de campo como el previamente utilizado para la secuenciación de ADN.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de un par de transistores de efecto de campo como el previamente empleado para la secuenciación de ADN.

La Figura 4 es una representación esquemática de resultados obtenidos usando el par de transistores de efecto de campo para la determinación de la secuencia de ADN de tipo Sanger en un molde de ADN empleando todos

45 los dNTP requeridos y un solo ddNTP en la mezcla de reacción.

La Figura 5 muestra diagramáticamente el ciclo de la PCR resultante en la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana.

La Figura 6 muestra la liberación de protones mediante extensión de ADN controlada aplicando la invención para la determinación de la secuencia de ADN.

La Figura 7 muestra resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa simulada usando ISFET sensible a pH.

55 La Figura 8 es un diagrama esquemático de un dispositivo microfluídico que contiene un ISFET incorporado en una cámara de reacción de bajo volumen para realizar la qPCR.

La Figura 9 es una vista esquemática adicional de un dispositivo microfluídico para realizar el control de la PCR con una muestra estacionaria en una cámara/pocillo de reacción (19) con cubierta (20). El elemento térmico (21) puede calentar y enfriar la microplaca a cada temperatura requerida en la secuencia para el termociclado de la muestra.

La Figura 10 muestra una vista en planta y en sección transversal de un dispositivo microfluídico para realizar el control de la PCR de acuerdo con la invención en la que la muestra fluye a través de un canal microfluídico (22), 65 por ejemplo, en una plataforma de acrílico o Perspex (plexiglas), que atraviesa consecutivamente zonas de una base de microplaca de silicio (23) mantenida a diferentes temperaturas para la desnaturalización del ADN,

hibridación del cebador a la diana y extensión del cebador respectivamente. Se muestran las tres zonas de temperatura para el termociclado de la muestra para la PCR.

La Figura 11 es una vista esquemática de un dispositivo microfluídico alternativo para controlar la PCR de 5 acuerdo con la invención en el que la muestra se mueve hacia atrás y hacia adelante en una cámara entre diferentes zonas de temperatura para realizar el termociclado requerido.

Descripción detallada

ISFET sensibles a pH

Como se ha indicado anteriormente, el documento WO 03/073088 enseña el uso de ISFET sensibles a pH para la secuenciación de ADN de tipo Sanger basándose en el hecho de que la incorporación de bases de nucleótidos a una cadena creciente de ADN conduce a la liberación de iones de hidrógeno (véase la Figura 6). Los resultados 15 mostrados en la Figura 1 demuestran la reacción de extensión del ADN y su efecto sobre el pH. El pH se midió usando una disposición de electrodo de vidrio, con mediciones del valor absoluto del pH tomadas cada 30 segundos. ISFET capaces de detectar inserciones de nucleótidos individuales en el extremo de una cadena de nucleótidos en crecimiento durante dicha extensión de ADN se proponen ahora igualmente para controlar la amplificación de ácido nucleico. Como se ha descrito anteriormente, un ISFET de este tipo puede, por ejemplo, estar provisto de una capa de nitruro de silicio sensible a iones cuya parte superior es una capa de polimerasa. El ISFET puede detectar cambios de pH rápidos y tiene una tasa de respuesta inmediata medida que está entre 1 ms de un cambio de pH [Woias et al., ’Modelling the short-time response of ISFET sensors’, Sensors and Actuators B, 24-25 (1995), 211217]. Las reacciones de seguimiento que se producen después de la inserción de nucleótidos son dependientes del pH y por lo tanto el consumo neto o la producción de iones de hidrógeno dependen del pH en el que se produce la

25 reacción. Generalmente, la reacción se realiza en el intervalo de pH 6 a 8,5, por ejemplo de 7 a 7,5. En este intervalo, los iones de hidrógeno se liberan en general durante la inserción de nucleótidos.

En la Figura 2 se muestra un ISFET sensible al pH como el que puede usarse para controlar la extensión de ADN o la amplificación de ácido nucleico. Como se describe en el documento WO 03/073088, este ISFET comprende una capa dieléctrica de óxido de silicio 1, una capa sensible química de nitruro de silicio 2 y una interfaz de enzima/electrolito 3. Las capas 1, 2 y la interfaz 3 se localizan entre una fuente 4 y un drenaje 5 (la configuración convencional de un FET). El FET se proporciona en una microplaca de silicio, que está encapsulada en resina epoxi para protegerla de la mezcla de reactivos. La resina epoxi ayuda a proteger el FET de la hidratación y migración de carga [Matsuo y Esashi, ’Methods of ISFET fabrication’, Sensors and Actuators, 1 (1981) 77-96]. La propia entrada

35 del FET no está cubierta por resina epoxi de tal manera que puede sumergirse en la mezcla de reactivos.

La interfaz de enzima/electrolito 3 mostrada en la Figura permite utilizar la sensibilidad de iones de la capa de nitruro de silicio 2 para la secuenciación de ADN o la detección de protones para controlar la amplificación de ácido nucleico. El FET funciona mediante la producción de un intercambio de iones con carga entre la superficie de la capa sensible química 2 y el medio de reacción (es decir la interfaz de enzima/electrolito 3):

SiOH E+-SiO-+ H+ SiOH2+ +-SiOH + H+ SiNH3+ +-SiNH2 + H+

45 La inclusión de nitruro de silicio es ventajosa porque proporciona una mayor sensibilidad y más rápida a los cambios de pH en comparación con la que se obtendría en ausencia del nitruro de silicio. Además, el nitruro de silicio ayuda a proteger el FET de la hidratación y migración de carga.

Una respuesta no Nernstiana representa la sensibilidad inmediata del FET, que surge de una unión rápida dependiente de protones y de una no unión de iones cargados en la superficie de nitruro de silicio de entrada aislante, que da como resultado una variación reproducible en la caída de tensión a través de la capa de nitruro de silicio 2. La variación de la caída de voltaje a través de la capa de nitruro de silicio 2 se correlaciona con cambios de pH. La caída de tensión se controla usando circuitos de instrumentación, permitiendo de este modo la detección de

55 inserciones de nucleótidos individuales. La tensión medida se conoce como tensión de banda plana.

La interfaz de enzima/electrolito 3 se deposita sobre la capa de nitruro de silicio usando un método de ligamiento enzimático conocido [Starodub et al., ’Optimisation methods of enzyme intergration with transducers for analysis of irreversible inhibitors’, Sensors and Actuators B 58 (1999) 420-426]. El método comprende presilanizar la capa de nitruro de silicio 2 usando solución de aminosilano, y a continuación, activar la superficie usando glutaraldehído. Después, se deposita una gota de solución tampón/enzima polimerasa sobre la capa de nitruro de silicio 2 y se deja secar durante aproximadamente media hora para formar la capa enzimática 3.

La realización mostrada en la Figura 2 utiliza un electrodo de referencia 6 para proporcionar una medición de

65 cambios de pH. El electrodo de referencia es relativamente grande y difícil de fabricar. Una realización alternativa no utiliza un electrodo de referencia, sino que utiliza un segundo FET que tiene la misma construcción que el primer FET, pero se proporciona con una capa de unión no enzimática en lugar de la capa enzimática 3. Esta configuración es ventajosa ya que proporciona una medición diferencial que da lugar a una proporción de señal con respecto a ruido mejorada.

5 En la Figura 3 se ilustra una realización alternativa adicional y también se ha descrito previamente en el documento WO 03/073088 pero únicamente en el contexto del control de la extensión de ADN. La configuración de esta realización se basa en una construcción conocida [Wong and White, ’A self- Contained CMOS Integrated pH Sensor, Electron Devices meeting IEEE 1988] que previamente se ha utilizado para controlar la variación lenta gradual de pH. La realización comprende un primer amplificador operacional 10 al que se conecta la fuente del primer FET 11 (el primer FET tiene la capa enzimática unida), y un segundo amplificador operacional 12 al que se conecta la fuente del segundo FET 13 (el segundo FET no tiene ninguna enzima unida al FET). Los drenajes del primer y segundo FET están conectados a una fuente de corriente fija (no mostrada). Las salidas del primer y segundo amplificador operacional se pasan a un amplificador diferencial 14, que amplifica la diferencia entre las salidas para generar una señal de salida Vsalida. La retroalimentación negativa del amplificador diferencial 14 pasa a un electrodo de metal

15 noble 15 que se encuentra en la mezcla de reactivos. El amplificador operacional 14 genera una tensión de salida que mantiene la misma tensión aplicada a los FET 11, 13 a pesar de los cambios de la concentración de hidrógeno. La realización mostrada en la Figura 13 es ventajosa porque permite la racionalización de la fabricación de los FET 11, 13 y de los amplificadores operacionales 10, 12, 15.

Los FET 11, 13 pueden disponerse para formar la primera fase de los amplificadores operacionales 10, 12. Esto se hace para cada amplificador operacional reemplazando un FET convencional de un par de cola larga situado en la entrada del amplificador operacional, con el primer o segundo FET 11, 13. Esto es ventajoso porque permite que el primer y segundo FET forme parte del circuito de amplificación.

25 En la Figura 4 se muestra un ejemplo esquemático de una tensión de banda plana detectada usando la realización mostrada en la Figura 3 para la secuenciación de AD. La tensión de banda plana consiste en impulsos que representan los cambios de pH asociados con la inserción de nucleótidos y disminuciones que corresponden a la inserción de ddNTP y terminación de la cadena. El número de impulsos locales antes de una disminución más grande determina el número de bases presentes antes de la terminación en una base conocida; la magnitud de la disminución más grande es dependiente de la relación de ddNTP: dNTP utilizada en la mezcla de reactivos y es importante debido a la dependencia de la longitud de lectura para esa disminución. A través de la repetición del proceso cuatro veces en diferentes cámaras de reacción que contienen cada uno de los cuatro ddNTP por separado, se define la secuencia completa.

35 A continuación se exponen las etapas utilizadas para fabricar el FET sensible a iones:

SUSTRATO DE SILICIO PURIFICADO ADICIÓN DE DOPANTE: PRODUCCIÓN DE SUSTRATO DE TIPO p OXIDACIÓN DE LA SUPERFICIE: GENERACIÓN DE LA CAPA DE SiO2 DEFINICIÓN DE FUENTE/DRENAJE E IMPLANTACIÓN DEPOSICIÓN DE NITRURO DE SILICIO USANDO LPCVD* FORMACIÓN POR CONTACTO PASIVACIÓN

45 *Deposición Química de Vapor a Baja Presión (Low Pressure Chemical Vapour Deposition)

Los FET, y en particular los mostrados en la Figura 3, y las fases de amplificación pueden reemplazarse o combinarse con transistores PMOS.

Control de amplificación de ácido nucleico

Un FET sensible al pH en un formato de dispositivo de detección como se muestra en la Figura 2 o 3 también puede emplearse ventajosamente para controlar la amplificación de ácido nucleico de acuerdo con usos del presente aparato. Dicho uso de un FET sensible al pH se describirá adicionalmente a continuación con referencia a la

55 realización de la qPCR. Sin embargo, se apreciará que puede emplearse un FET sensible al pH de la misma manera para controlar cualquier forma de amplificación de ácido nucleico incluyendo amplificación mediada por transcripción (AMT) o reacción en cadena de la ligasa (LCR).

La PCR es un proceso de amplificación de un fragmento de ADN bicatenario en el que se proporcionan cebadores para la hibridación a cada cadena de ADN para dirigir una secuencia específica de interés para la amplificación durante un número de ciclos del proceso de amplificación. Como se muestra en la Figura 5, en un ciclo de PCR hay tres fases. Estas se efectúan a través de ciclos térmicos en presencia de los componentes necesarios para la extensión del cebador que incluye una ADN polimerasa resistente al calor de la siguiente manera:

65 - desnaturalización: el ADN bicatenario molde se separa en dos cadenas sencillas debido a la rotura de los enlaces de hidrógeno que conectan las dos cadenas de ADN, por ejemplo, a 95 ºC;

-: hibridación: la secuencia de interés se define por dos cebadores oligonucleotídicos que se hibridan a las cadenas sencillas del ADN molde, realizado, por ejemplo, a 55 ºC;

-: extensión: la ADN polimerasa en presencia de los dNTP extiende cada cebador, por ejemplo, a 72 ºC.

5 En la fase de extensión del ciclo, los protones se liberan como consecuencia de la adición de bases a cada cebador. Es esta liberación de protones la que se utiliza como la base para la cuantificación en tiempo real de producto de PCR de acuerdo con los usos del presente aparato. Como se ha indicado anteriormente, la superficie de detección ISFET estará expuesta a la mezcla de amplificación tamponada, preferentemente en una cámara o canal de reacción de bajo volumen, por ejemplo, una cámara o un canal de un dispositivo microfluídico. Por tanto, ventajosamente puede emplearse, por ejemplo, una cámara o un pocillo de reacción de bajo volumen, por ejemplo, de un volumen de 1 pl a aproximadamente 10 μl. En esta cámara o pocillo puede superponerse un ISFET como se muestra en la Figura 8 en el que el ISFET (16) se integra en la base (17) de la cámara o pocillo de reacción (18) y se proporcionan microcanales para el suministro de la muestra y la salida de la cámara. La cámara puede calentarse y enfriarse entre las temperaturas de hibridación y desnaturalización (por ejemplo entre 55 y 95 ºC) durante el

15 termociclado de la PCR. Los reactivos para la amplificación, tales como los cebadores y los dNTP, pueden secarse ya sea dentro de la cámara de reacción o introducirse con la muestra. Si la secuencia diana está presente, entonces esto puede determinarse por la disminución de pH superior a un determinado umbral a medida que avanzan los ciclos de la PCR. Si la secuencia diana no está presente, los cebadores no se hibridarán con el ADN molde y no se producirá la extensión del cebador que libera protones de manera que no hay cambio significativo del pH. Debido a la presencia de tampón en la mezcla de amplificación, el cambio de pH resultante del ciclo de la PCR se contrarrestará inicialmente por la acción tampón. Sin embargo, como se muestra en la Figura 7, una vez que se supera la capacidad tamponante, un cambio rápido en el pH será medible. El número de ciclos antes de que el cambio de pH pase a un umbral determinado dependerá de la concentración del molde de ADN, a mayor concentración menos ciclos permitiendo por lo tanto la cuantificación de ADN molde calibrando el número de ciclos

25 de PCR para alcanzar el umbral frente a cargas molde conocidas.

Como se ha descrito anteriormente, en una sola microplaca microfluídica puede proporcionarse un número de cámaras que contienen ISFET. Esto puede ser de particular beneficio, por ejemplo, cuando se desea la amplificación de repeticiones cortas en tándem (STR, Short Tandem Repeats) para la huella genética del ADN o cuando se desea amplificar múltiples muestras de ADN de la misma fuente o de fuentes diferentes para ensayos genéticos, o amplificar diferentes sitios de una cadena de ADN. El ISFET alojado en una cámara microfluídica, puede ser una parte integral de una microplaca, tal como una microplaca de silicio con elementos térmicos resistentes sobre la microplaca y detectores de temperatura para controlar la temperatura para la hibridación y extensión del ADN. Dicha microplaca también puede proporcionar un electrodo de referencia y detectores de conductividad integrados.

35 La fabricación de una o de una serie de cámaras del reactor de nanolitros de silicio con accionadores (calentadores) integrados para el control de la PCR se ha descrito, por ejemplo, en Iordanov et al. ’Sensorised nanoliter reactor chamber for DNA multiplication, IEEE (2004) 229-232. Cada una de las cámaras así fabricadas (véase la Figura 9) podría estar provista de un ISFET integrado para el control de la amplificación de ácido nucleico de acuerdo con los usos del presente aparato. Como señalaron Iordanov et al. en su artículo antes citado, el silicio no tratado y los materiales relacionados con silicio convencional son inhibidores de la Taq polimerasa. Por tanto, cuando se emplea silicio o un material relacionado con silicio, por ejemplo, silicio germanio o silicio rígido (en lo sucesivo, en el presente documento, todos estos materiales se denominarán sustrato de silicio) para la fabricación de una cámara o un canal de microplaca para la amplificación de ácido nucleico, generalmente estará cubierta con materiales para

45 impedir la reducción de la eficacia de la polimerasa por el silicio, tales como SU8, polimetil-metacrilato (PMMA), Perspex™ o vidrio.

La pasivación de la superficie de las microplacas de silicio-vidrio microfabricadas para la PCR también la describen Shoffner et al. en Nucleic Acid Res. (1996) 24, 375-379. En sus estudios, se fabricaron microplacas de silicio utilizando procedimientos convencionales de fotolitografía y grabado a una profundidad de 115 μm. Cubiertas de vidrio Pyrex™ se colocaron en la parte superior de cada microplaca de silicio y el silicio y el vidrio se unieron anódicamente. Se investigaron diversos tipos de pasivaciones de superficie con vistas a mejorar la eficacia de la amplificación de la PCR con termociclado en la cámara proporcionada. Se encontró una superficie de silicio oxidado (SiO2) para dar amplificaciones consistentes comparables con reacciones realizadas en un tubo de PCR

55 convencional. Dicha superficie también puede ser favorecida en la fabricación de un dispositivo microfluídico para realizar la amplificación de ácido nucleico con un detector ISFET de pH. Para un mayor análisis de la pasivación de la superficie en la fabricación de dispositivos microfluídicos PCR puede hacerse referencia a Zhang et al. ’PCR microfluidic devices for DNA amplification’ in Biotechnology Advances (2006) 24, 243-284. Como se describe en este artículo de revisión, como una alternativa a la pasivación de la superficie estática por recubrimiento de sustrato, puede ser posible incluir un agente de pasivación en la muestra (pasivación dinámica).

Como una alternativa a las cámaras de reacción de bajo volumen, como se describe anteriormente para efectuar el control de la PCR de una muestra estacionaria, la muestra para el control de la PCR puede hacerse fluir a través de un canal o de una cámara de un dispositivo microfluídico y a medida que fluye se somete consecutivamente a 65 diferentes temperaturas mediante las cuales se realiza el termociclado de la PCR. De este modo, por ejemplo, la muestra puede hacerse fluir a través de un canal o de una cámara que atraviesa consecutivamente zonas de diferente temperatura adecuadas para las fases de desnaturalización, hibridación del cebador y expresión del cebador de la PCR, por ejemplo, un canal en un dispositivo microfluídico, por ejemplo, un dispositivo de microplaca de silicio, que atraviesa consecutivamente zonas de diferente temperatura proporcionadas en la base adecuadas para repeticiones sucesivas a lo largo del canal de las fases de desnaturalización, hibridación del cebador y 5 extensión del cebador de la PCR. Dichas estructuras microfluídicas para realizar la amplificación de ácido nucleico de flujo continuo en una microplaca las describen, por ejemplo, Auroux et al. en ’Minaturised nucleic acid analysis’ Lab Chip (2004) 4, 534-546 y pueden combinarse con el control de amplificación ISFET. Estructuras microfluídicas de este tipo, como se ilustra en las Figuras 10 y 11, pueden fabricarse mediante el uso de técnicas de microfabricación convencionales utilizando, por ejemplo, fotolitografía para definir la red de fluidos y después una 10 etapa de grabado al ácido o deposición para crear el canal o los canales necesarios, por ejemplo en un PMMA, acrílico, Perspex™ o sustrato de vidrio. Para cubrir los canales puede superponerse o no una placa con cubierta de vidrio o de PMMA o de otro material. La base del canal (o canales) puede estar formada por la unión de un sustrato a una microplaca de silicio con ISFET y detectores de temperatura integrados así como elementos térmicos o bomba de calor (Peltier), de tal manera que la mezcla de reacción esté en contacto directo con estos detectores y 15 accionadores, y puede incluir o no circuitos para el control de la temperatura. Como alternativa, la base del canal (o canales) puede estar formada por un ISFET que aloja una placa de circuito impreso (PCB, Printed Circuit Board) y detectores de temperatura de tal manera que estos están en contacto directo con la mezcla de reacción. La superficie de la PCB tendrá que nivelarse para proporcionar una base plana sobre la cual pueda superponerse la plataforma microfluídica. La PCB también puede contener elementos térmicos o bomba de calor, circuitos de interfaz

20 detectora y de control de temperatura. Reactivos presentes dentro del canal o cámara microfluídica serán los de la mezcla de amplificación tamponada, incluyendo los cebadores seleccionados por su capacidad para hibridarse con la diana en sitios adecuados para la amplificación de la secuencia seleccionada, la enzima (o enzimas) requerida para la amplificación y los cuatro dNTP en exceso.

25 Por lo tanto, en una realización para el control de la PCR con termociclado, la muestra para la amplificación de ácido nucleico se hace fluir a través de un canal microfluídico (22) (por ejemplo, microfabricado en una plataforma de acrílico, PMMA o Perspex) sobre un sustrato (23), por ejemplo, un sustrato de silicio de una microplaca de silicio, y a medida que fluye atraviesa consecutivamente zonas de temperatura proporcionadas en el sustrato o en la base adecuadas para las repeticiones sucesivas a lo largo del canal de las fases de desnaturalización, hibridación y

30 extensión de la cadena, por ejemplo, 95 ºC para la desnaturalización, 55 ºC para la hibridación del cebador con la diana y 72 ºC para la extensión del cebador con repetición posterior (véase la Figura 10). De esta manera, se realiza la amplificación continua a través de flujo y puede controlarse mediante uno o más ISFET incrustados en la base. Puede preferirse emplear detectores ISFET en un número de posiciones a lo largo del canal de un dispositivo, como se describe anteriormente, para la PCR de flujo continuo de tal manera que puede realizarse el análisis de la

35 PCR en tiempo real a medida que avanza la amplificación.

Para calentar la mezcla de reacción pueden usarse elementos térmicos en la microplaca, tales como resistencias de polisilicio, utilizando el efecto de calentamiento de Joule de potencia disipada en una resistencia cuando se hace pasar la corriente a través de ella (P=I2R). El enfriamiento puede conseguirse a través de la disipación de calor a 40 través del sustrato de silicio y la plataforma microfluídica, lo cual es posible debido a los pequeños volúmenes de mezcla de reacción implicados, así como la disipación térmica eficaz de la base de la microplaca de silicio. Como alternativa, podría implementarse, de manera conocida, un elemento Peltier de bomba de calor en la microplaca tanto para calentar como para enfriar. La uniformidad de la temperatura es muy importante para impedir gradientes térmicos en la microplaca, tanto por el bien de la mezcla de reacción como por el bien del ISFET y de otro circuito en

45 la microplaca. Esto puede conseguirse con una disposición apropiada de los elementos térmicos.

El control de temperatura puede conseguirse mediante un controlador (PID) proporcional-integral derivado, que es uno de los sistemas más comunes de control de retroalimentación de bucle cerrado. Para calcular el nivel de calentamiento necesario se utilizan errores entre la temperatura medida y la temperatura diana. El cálculo de este 50 nivel de salida se realiza basándose en el error real directamente (proporcional), el historial del error (integral) y el error futuro previsto sobre la base de su tasa de cambio (derivada). De manera similar, un controlador PI estabilizaría la temperatura basándose en los valores reales e históricos del error, como describen Iordanov et al. (2004) citados anteriormente. Como alternativa, podrían implementarse técnicas, tales como modulación de anchura de impulso o coeficiente de utilización. En estas técnicas, la salida del calentador no se ajusta por amplitud sino por

55 tiempo durante el cual el calentador está activado (“on”) como un porcentaje de un periodo de tiempo fijo. El tiempo de activación (“on”) es inversamente proporcional al error entre la temperatura medida y la temperatura diana, de manera que, a medida que se acerca a la temperatura diana, el tiempo de activación (“on”) del elemento térmico también se reduce.

60 Como alternativa puede seleccionarse tener un sistema de movimiento alternativo (véase la Figura 11) por el cual la mezcla de amplificación se mueve hacia atrás y hacia adelante en una microcámara entre las zonas de temperatura requeridas para el termociclado. Se apreciará que la amplificación de ácido nucleico resultante de dicha PCR por desplazamientos de la muestra en la microplaca (descrita en el artículo de revisión de Auroux et al. mencionado anteriormente) puede controlarse proporcionando un ISFET en una pared de la cámara microfluídica.

65 Para detalles adicionales acerca de dispositivos microfluídicos para PCR, que pueden modificarse para detección ISFET de acuerdo con la invención, de nuevo puede hacerse referencia a Zhang et al. (2006) Biotech. Adv. 24, 243

284. Como se comenta en este artículo de revisión, aunque dichos dispositivos pueden tener preferentemente forma de microplacas de silicio, pueden emplearse otros materiales para el sustrato de la microplaca, tal como vidrio,

5 diversos polímeros y cerámicas. Como una alternativa al calentamiento por contacto para el termociclado, pueden emplearse diversos métodos de calentamiento que no sean por contacto, como también se comenta en el mismo artículo de revisión, incluyendo, a modo de ejemplo, calentamiento con aire caliente, la utilización de luz IR, calentamiento con láser, calentamiento por inducción e irradiación de microondas.

Aunque los sistemas de PCR descritos anteriormente están diseñados para conseguir el termociclado, se conocen diversas técnicas isotérmicas de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, amplificación por desplazamiento de una sola cadena (SSDA, Single Strand Displacement Amplification) y la amplificación de ADN o ARN usando dichas técnicas también pueden controlarse por detección ISFET de acuerdo con los usos del presente aparato.

15 Aparatos

Se apreciará que, en un aspecto de la invención, se proporciona un aparato de detección para el control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra, en el que dicho aparato comprende una cámara o un canal para recibir la muestra en o sobre una base, por ejemplo, un sustrato de silicio, y uno o más de ISFET sensibles a pH se disponen para el control de la amplificación de ácido nucleico en dicha cámara o canal, dicha base tal y como se presenta en dicha cámara o canal tiene un recubrimiento para mejorar la eficacia de la amplificación, es decir, dicha base se ha sometido a pasivación de la superficie como se ha indicado anteriormente. La cámara o el canal generalmente se proporcionarán en un dispositivo microfluídico. El dispositivo microfluídico puede tener cualquier forma como se ha indicado anteriormente. Sin embargo la necesidad de la pasivación de la superficie de la base

25 puede evitarse por selección de material de base o, si se emplea pasivación dinámica, como ya se ha indicado anteriormente.

Por tanto, la invención proporciona más generalmente un aparato de detección para el control de la amplificación de ácido nucleico en una muestra en el que dicho aparato comprende un dispositivo microfluídico en el que se proporciona una cámara o un canal para recibir la muestra en o sobre una base, por ejemplo, un sustrato de silicio, y uno o más ISFET sensibles a pH se disponen para el control de la amplificación de ácido nucleico en dicha cámara o canal. Puede proporcionarse una cámara o un pocillo de reacción de bajo volumen, como se ha indicado anteriormente, para el control de la PCR en una muestra estacionaria o una cámara o un canal para PCR de flujo continuo. Pueden proporcionarse otras cámaras o canales para el control simultáneo de muestras múltiples. Como

35 se ha indicado anteriormente, la base puede incluir elementos térmicos y detectores de temperatura para el termociclado de la muestra.

Control de la extensión del ADN sobre perlas

Tanto se usa un ISFET sensible a pH para la secuenciación de ADN como para la amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, qPCR, como una alternativa a la extensión de ADN realizada sobre ADN inmovilizado en la superficie del ISFET, la extensión del ADN puede producirse sobre perlas. El uso de perlas puede combinarse ventajosamente con el uso de un ISFET que se sitúa en un plano horizontal en la parte inferior de la cámara o canal de reacción, por ejemplo, como se muestra en la Figura 8, de tal manera que las perlas se colocan cerca de la superficie de 45 detección del ISFET. Las perlas pueden seleccionarse de tal manera que solo la colocación gravitacional lleve a las perlas cerca de la superficie de detección del ISFET. Como alternativa, pueden emplearse perlas magnéticas/metálicas y magnéticamente atraídas cerca de la superficie de detección del ISFET. Las perlas pueden ser partículas esféricas sintetizadas a partir de cualquier material adecuado para la fijación de ADN, por ejemplo, sílice, poliestireno, agarosa o dextrano. El tamaño de las perlas puede ajustarse para ayudar a la colocación gravitacional y de acuerdo con la necesidad de impedir el bloqueo de la cámara de reacción y de los puertos de entrada y salida. Las perlas pueden lavarse fuera de la superficie detectora usando agua o solución tampón. La unión del ADN a las perlas puede conseguirse usando métodos convencionales, por ejemplo, funcionalización de la superficie de la perla. Puede emplearse un espaciador. La cobertura de la perla se controla ajustando la relación de ADN y perla. Cuando se está utilizando un ISFET sensible a pH para la secuenciación de ADN o control de la

55 amplificación de ácido nucleico y hay menos restricción de tamaño, entonces, pueden emplearse preferentemente, por ejemplo, perlas de sílice (por ejemplo, de aproximadamente 200 nm de diámetro) y ADN inmovilizado directamente sobre las perlas o inmovilizado después de la modificación de las perlas para proporcionar un grupo carboxílico funcional. Como alternativa pueden emplearse, de manera conveniente, por ejemplo, perlas de plástico (por ejemplo, microperlas de plástico de aproximadamente 1 μm). Cuando se está empleando el ISFET para controlar la amplificación de ácido nucleico, las perlas pueden llevar sondas de ADN que capturan ADN diana en la muestra.

Uso de sondas de ADN inmovilizadas sobre el ISFET

65 Como una alternativa al uso de perlas, sondas de ADN para la captura de ADN diana pueden estar unidas directa o indirectamente al ISFET. Dicha inmovilización de sondas de ADN puede conseguirse usando técnicas bien conocidas para la inmovilización de sondas de ADN sobre una superficie sólida, por ejemplo, técnicas tales como las bien conocidas de la técnica de micromatrices de ADN. Por tanto, la inmovilización de sondas de ADN sobre el ISFET puede conseguirse por síntesis de oligonucleótidos in situ (por litografía u otros medios).

5 Preparación de la muestra para la amplificación

La inmovilización de sondas diana, como se ha indicado anteriormente, puede favorecerse particularmente cuando la muestra contiene tanto ácido nucleico diana como ácido nucleico no deseado. La inmovilización de la sonda será de tal manera que se permita la separación de la diana de cualquier ácido nucleico o de proteínas de interferencia no deseados. Mediante el uso de sondas inmovilizadas para unir la diana en estrecha proximidad con la superficie detectora del ISFET puede conseguirse beneficio aumentando la relación de señal con respecto a ruido localizando el cambio de pH producido por la amplificación de ácido nucleico.

El ADN para amplificación puede proceder de diversas fuentes, tales como un frotis bucal, una muestra de sangre o

15 células cultivadas. La preparación de la muestra para el control de la amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede incluir una o dos de las etapas de concentración de células y liberación del ácido nucleico necesario para la amplificación a partir de las células, por ejemplo, una secuencia de ADN clonada. Estas etapas pueden realizarse por separado desde el dispositivo para la amplificación de ácido nucleico o integrarse en parte del mismo dispositivo, por ejemplo una microplaca de PCR como se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico liberado para la amplificación puede, por ejemplo, purificarse adicionalmente mediante la unión a micropartículas (perlas) como se ha descrito anteriormente. Por tanto, la extracción y purificación de ADN diana de una muestra biológica puede realizarse en la misma microplaca de la PCR empleando un método de microplaca en laboratorio (LOC, Lab-on- the Chip) adecuado, tal como el sistema de perlas magnéticas irradiado por láser (LIMBIS) como describen Lee et al., en ’Microchip-based one step DNA extraction and real time PCR in one chamber for rapid

25 pathogen identification’, Lab Chip (2006) 6, 886-895.

Kits

También se describen kits para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra por amplificación de ácido nucleico por ejemplo, qPCR, que comprenden un dispositivo de detección que comprende una cámara o un canal de reacción y un ISFET sensible al pH para el control de la amplificación de ácido nucleico en dicha cámara o canal de reacción, como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, tal como un dispositivo de detección en forma de una microplaca microfluídica, donde se proporcionan cebadores para dicha amplificación en la cámara o canal de reacción o por separado dentro del kit. Los cebadores pueden proporcionarse junto con sondas oligonucleotídicas

35 inmovilizadas sobre perlas para el ácido nucleico diana. Como se ha indicado anteriormente, la cámara o canal de reacción del dispositivo de detección puede tener otros reactivos deshidratados dentro de la cámara de reacción, incluyendo ADN polimerasa y los dNTP necesarios para la extensión del cebador.

Las siguientes referencias proporcionan información anterior adicional relevante para la invención:

Shakhov y Nyrén, ’A Sensitive and Rapid Method for Determination of Pyophosphate Activity’, Acta Chem. Scand. B 36 (1982) 689-694;

R. Buck, ’Electrochemistry of Ion-Selective Electrodes’, Sensors and Actuators (1981) 1, 197-260;

45 Victorova et al, ’New substrates of DNA polymerases’, FEBS Let. (1999) 453, 6-10; y

Hanazato et al., ’Integrated Multi-Biosensors Based on an Ion-sensitive Field-Effect Transistor Using Photolithographic Techniques’, IEEE Transactions on Electron Devices (1989) 36, 1303- 1310.

El siguiente ejemplo describe con más detalle la simulación del cambio de pH con ciclos de PCR de la amplificación de ADN y cómo esto puede utilizarse para la detección ISFET de amplificación de la diana.

Ejemplo

55 La Figura 7 muestra el cambio de pH con ciclos de PCR para una amplificación de PCR típica que emplea una mezcla de amplificación de Tris HCl 10 μM, pH 7,5, dNTP 0,4 mM, MgCl2 2 mM, KCl 50 mM, BSA al 0,05 % p/v, 1 U por μl de Taq polimerasa, 1 μM de par de cebadores PCR y molde de ADN preparado (150-150.000 copias). El amplicón hipotético tiene 200 pares de bases y cada incorporación de dNTP libera un protón. El valor del pH de partida es de 7,5. Dada la concentración de Tris y de dNTP, puede determinarse la capacidad del tampón en cada valor de pH. El cambio de pH teórico puede determinarse por el número de protones liberados de la reacción y la capacidad del tampón al pH en el que se produce la reacción.

Como se ha indicado anteriormente, el número de ciclos antes de que el cambio de pH pase a un umbral

65 determinado dependerá de la concentración del molde de ADN, a mayor concentración menos ciclos permitiendo por lo tanto la cuantificación de ADN molde calibrando el número de ciclos de PCR para alcanzar el umbral frente a cargas molde conocidas.

Cálculo del cambio de pH teórico

5 En una versión simplificada de la reacción, una reacción de extensión sencilla puede describirse de la siguiente manera:

(1): HP3O10-3- nucleósido + ADN- 3’OH => H2P2O72- +ADN- O- PO (O -)- O- nucleósido

(2): H2P2O72- => HP2O73- + H+

10 En (1) se muestra el equilibrio del elemento inmediato de la reacción de inserción de nucleótidos, dando como resultado una cadena de ADN extendida y pirofosfato con una carga neta de -2 (pKa1 y pKa2). En el intervalo de pH de 6 a 8,5, algún pirofosfato tendrá el tercer protón (pKa3) disociado como se muestra en (2), dando como resultado una disminución en el pH.

15 pKa de pirofosfatos:

pka1 ∼ 0,83 pKa2 ∼ 1,96 20 pKa3 ∼ 6,68 pKa4 ∼ 9,39

El cálculo del cambio de pH como la función de ciclo de PCR en una versión simplificada:

donde dn es el aumento de la base y dpH es el cambio de valor de pH.

donde [HA]0 es la concentración total de la sustancia química tampón, tal como TrisHCl, dNTP, ADN; Ka es la constante de disociación del protón del producto químico; [H+] es la concentración de protones.

Dado el valor de pH inicial de la reacción de 7,5, se puede calcular la capacidad tampón total de la mezcla de reacción de 150 copias de ADN, TrisHCl 10 μM y dNTP 400 μM,

Después, puede calcularse una nueva capacidad tampón basándose en el nuevo valor de pH de partida y el cambio 40 de pH esperado dada la cantidad de protones producida.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un aparato de detección para controlar la amplificación de ácido nucleico en una muestra, que comprende: un

sustrato de silicio que integra uno o más elementos térmicos dispuestos para calentar una muestra, y más de una 5 cámara de reacción que contiene un ISFET, cada una con un ISFET para medir el pH de dicha muestra.
2. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que una superficie de detección de los ISFET está provista de una capa de nitruro de silicio.

10 3. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que adicionalmente comprende uno o más detectores de temperatura.
4. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los detectores de temperatura se disponen

para controlar el uno o más elementos térmicos para controlar la temperatura de la muestra. 15
5.

Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cámaras de reacción de 1 pl a aproximadamente 10 μl contienen dicha muestra y superpuestos los ISFET.
6.

Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se hace fluir la muestra a través de las

20 cámaras de reacción del dispositivo microfluídico, y a medida que la muestra fluye se somete consecutivamente a diferentes temperaturas de tal manera que se obtiene un ciclado térmico para la PCR.
7. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha muestra se hace fluir a través de las

cámaras de reacción de tal manera que atraviesa consecutivamente diferentes zonas de temperatura adecuadas 25 para dicho termociclado.
8. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha muestra se desplaza hacia atrás y hacia adelante en las cámaras de reacción entre las zonas de temperatura requeridas para el termociclado y proporcionándose dicha ISFET en una pared de cada una de dichas cámaras.
9. Un aparato de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente integra con el sustrato de silicio al menos uno de: un electrodo de referencia, un FET de referencia que tiene una capa unida no enzimática y un detector de conductividad.

35 10. Un aparato de detección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende reactivos para la amplificación de ADN.
11. Un aparato de detección de acuerdo con la reivindicación 10, siendo los reactivos ADN, comprendiendo

opcionalmente sondas para capturar el ADN diana en la muestra, y estando inmovilizados sobre perlas. 40
12. Un aparato de detección de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo adicionalmente reactivos para la amplificación de ADN, estando dichos reactivos deshidratados y situados en una cámara de reacción o dispuestos para introducirse en la cámara de reacción con la muestra deshidratada en el interior de la cámara de reacción o para introducirse con la muestra.