CN101743319B

CN101743319B - 使用固态pH传感器的qPCR

Info

Publication number: CN101743319B
Application number: CN200780052692.2A
Authority: CN
Inventors: C·图马佐; S·普鲁修撒曼
Original assignee: DNAE Group Holdings Ltd
Current assignee: DNAE Group Holdings Ltd
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2027-03-02
Also published as: JP2010519914A; WO2008107014A1; EP2129792A1; EP2129792B1; DE602007008953D1; JP5368321B2; ES2440572T3; ATE479780T1; CN101743319A

Abstract

包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)的pH传感器在进行核酸扩增的实时检测/定量中的应用，例如，基于检测引物延伸阶段的质子释放的聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增。

Description

使用固态pH传感器的qPCR

技术领域

本发明涉及一种通过使用pH敏感性的离子敏感场效应晶体管(ISFET)来监测扩增过程中的引物延伸阶段的质子释放，从而对核酸扩增进行定量的实时监测方法，例如，聚合酶链式反应(PCR)的扩增、连接酶链式反应或转录介导的扩增。本发明还提供了用于此目的的包括pH敏感性的离子敏感场效应晶体管(ISFET)的传感装置。

背景技术

定量实时聚合酶链式反应(qPCR或RT-PCR)已经成为实际上用于小量DNA或RNA扩增的标准方法，例如，用于克隆基因序列、法医检测以及与疾病有关的突变的遗传检测。qPCR的最具体的实施方式需要标记的探针(例如，荧光染料)以监测扩增子。此处公开的qPCR取消了对标记的探针的需要。替代地，本方法依赖于对PCR循环导致的质子释放具有感应的pH敏感性的离子敏感场效应晶体管(ISFET)，并由此可以在芯片上进行。

如在公布的国际专利申请WO03/073088中所报道的，发明人先前发现ISFETs可以用于监测与寡核苷酸链末端处的单个核苷酸插入有关的质子释放。通过pH敏感性的ISFETs对单个核苷酸插入的监测可以用于基于常规桑格(Sanger)DNA测序法的DNA测序并可以用于识别等位突变体，例如，依赖于检测靶向特异性核酸位点而设计的寡核苷酸引物的延伸的单核苷酸多态性(SNPs)。本发明得自于发明人进一步认识到质子也是PCR产物，因此qPCR也可以通过监测质子释放的离子敏感场效应晶体管(ISFET)来实现，优选在低反应体积的室内进行。

发明内容

因此，本发明的一方面提供了一种监测样品中核酸扩增的方法，所述样品含有当样品中存在目标(target)序列的情况下用于扩增目标序列的核酸扩增缓冲混合物，其特征在于，所述监测是检测在目标序列的存在下当扩增开始超过所述样品的缓冲能力能够克服的循环数阈值时由于质子释放而产生的pH值的变化，所述检测使用了传感装置，该传感装置包括具有传感表面的离子敏感场效应晶体管(ISFET)和用于检测来自离子敏感场效应晶体管(ISFET)的电子输出信号的设备，所述传感表面暴露于所述样品并且被配置成能够响应在所述晶体管表面的pH值变化而产生电子输出信号。为了在监测中获得需要的敏感度，优选在小体积(更优选纳米级体积)内以及在低缓冲能力下进行扩增，从而使释放的质子的数目导致pH值的快速变化(当超过样品的缓冲能力时)。因此，这种方法可以方便地在整合有设置在微流体(microfluidic)设备或芯片内的pH敏感性的ISFET的纳米级反应器中实施。

附图说明

通过举例的方式并结合以下附图对本发明的具体实施方式进行描述，其中：

图1显示了使用缓冲的反应介质在DNA链延伸过程中发生的pH值变化。

图2为先前用于DNA测序的场效应晶体管的示意图。

图3为先前用于DNA测序的成对的场效应晶体管的示意图。

图4显示了使用成对的场效应晶体管对DNA模板进行桑格(Sanger)类型的DNA序列测定的结果示意图，在反应混合物中使用全部所需的dNTPS和单个ddNTP。

图5图示地显示了导致目标核酸序列的扩增的PCR循环。

图6显示了在DNA序列测定中使用本发明物而监测到的通过DNA延伸产生的质子释放。

图7显示了使用ISFET pH传感器的模拟实时定量PCR的结果。

图8为显示了在用于进行qPCR的小体积反应室内包括嵌入的ISFET的微流体设备的示意图。

图9为另一种微流体设备的示意图，所述微流体设备用于对具有盖板20的反应室/孔19内的固定样品进行PCR监测。通过加热元件21可以对芯片进行加热，并且能够依次地被冷却至各种需要的温度以用于所述样品的热循环。

图10显示了根据本发明的用于进行PCR监测的微流体设备的平面图和截面图，其中，所述样品流经微流体通道22，例如，进入丙烯酸或甲基丙烯酸甲酯平台，所述样品连续地穿过维持在分别用于DNA变性、引物杂交至标靶上以及引物延伸的不同温度下的硅芯片基底23的区域。显示了用于样品进行PCR的热循环的三个温度区域。

图11为显示了根据本发明的用于监测PCR的替换性微流体设备的示意图，其中，样品在反应室内的不同温度区域之间来回地移动，以达到需要的热循环。

具体实施方式

pH敏感性的ISFETs

如上文所述，WO 03/073088教导了依赖于向延伸中的DNA链掺入核苷酸碱基而导致氢离子释放的事实，在桑格(Sanger)类型的DNA测序法中使用pH敏感性的ISFETs(见图6)。图1显示的结果证实了DNA的延伸反应以及对pH值的影响。使用玻璃电极装置监测pH值，每30秒检测一次pH的绝对值。同样提供了能够检测DNA延伸过程中在延伸中的核苷酸链末端的单个核苷酸插入的ISFETs，以监测核苷酸的扩增。如上文所述，例如，此类ISFETs可以设置有离子敏感性的氮化硅层，该氮化硅层的顶部为聚合酶层。所述ISFET能够检测快速的pH变化并且检测到的即刻应答速率(immediate response rate)为1ms的pH变化[Woias等，′Modelling theshort-time response of ISFET sensors′，Sensors and Actuators B，24-25(1995)，211-217]。随后的成功插入核苷酸的反应是pH依赖性的，因此，氢离子的净消耗或生成取决于发生反应的pH值。通常，所述反应在pH为6-8的范围内进行，例如，7-7.5。在这个范围内，在核苷酸插入的过程中氢离子全部释放。

如图2所示，pH敏感性ISFET可以用于监测DNA的延伸或核酸的扩增。正如在WO03/073088中所描述的，ISFET包括氧化硅电介质层1、氮化硅化学敏感性层2以及酶/电解质界面3。所述层1、层2以及界面3位于源(source)4和漏(drain)5之间(场效应晶体管的常规构型)。所述场效应晶体管(FET)设置在硅芯片上，该硅芯片被环氧树脂包裹以保护该芯片免受试剂混合物的影响。所述环氧树脂有助于保护FET免受水合作用以及电荷迁移的影响[Matsuo和Esashi，′Methods of ISFET fabrication′，Sensors andActuators，1(1981)77-96]。FET门本身不被环氧树脂所覆盖，以使其能够浸渍在所述试剂混合物中。

如图2中所示，酶/电解质界面3使氮化硅层2的离子敏感性可被用于DNA测序或用于监测核苷酸扩增的质子检测。所述FET的功能通过在化学敏感性的层2的表面与反应介质(例如，酶/电解质界面3)之间产生带电荷离子的交换来实现：

SiOH←→SiO^-·+H⁺

SiOH₂ ⁺←→SiOH+H⁺

SiNH₃ ⁺←→SiNH₂+H⁺

包括氮化硅是有益的，因为与不具有氮化硅相比它能够提供增加的且更加快速的对pH变化的敏感性。此外，氮化硅有助于保护FET免受水合作用以及电荷迁移的影响。

非-能斯脱响应(non-Nernstian response)考虑了FET的即刻敏感性，所述响应源自带电离子在绝缘门氮化硅表面处的快速的质子依赖性的结合与释放，这将导致氮化硅层2中电压下降(voltage drop)的可重复性变化。氮化硅层2中下降的变化与pH的变化有关。使用测试电路(instrumentationcircuitry)监测所述下降，从而实现了对单个核苷酸插入的检测。检测的电压就是平带电压(flatband voltage)。

酶/电解质界面3通过已知的酶联法(enzyme linkage method)沉积在所述氮化硅层上[Starodub等，Optimisation methods of enzyme intergration withtransducers for analysis of irreversible inhibitors′，Sensors and Actuators B 58(1999)420-426]。该方法包括使用氨基硅烷溶液(aminosilane solution)使氮化硅层2预硅烷化，然后使用戊二醛激活所述表面。然后在氮化硅层2上沉积缓冲液/聚合酶的酶溶液，并干燥约半个小时以形成酶层3。

如图2所示的实施方式使用了参比电极6，以对pH的改变进行检测。所述参比电极相对较大并且难以制备。一种替换性的实施方式并不使用参比电极，而是替代性地使用与第一个FET具有相同结构的第二个FET，但该第二个FET具有非酶联层来替代酶层3。这种构造是有益的，因为这种构型能够提供改善信噪比的差动检测(differential measurement)。

在先前的WO 03/073088中描述了如图3所示的另一个替换性的实施方式，但仅仅用于监测DNA的延伸。这种实施方式的构造基于已知的结构[Wong和White，′A self-Contained CMOS Integrated pH Sensor，ElectronDevices meeting IEEE 1988]，这种结构先前被用于监测pH的逐渐的缓慢变化。该实施方式包括：连接第一FET11源的第一操作放大器10(所述第一FET具有酶联层)；连接第二FET13源的第二操作放大器12(所述第二FET不具有FET的酶联层)。所述第一FET和第二FET的漏(drains)与固定的电源相连(未示出)。从所述第一操作放大器和第二操作放大器中的输出传到差动放大器14中，该差动放大器14能够放大输出之间的差异，以产生输出信号V_out。从差动放大器14产生的负反馈传到位于试剂混合物中的贵金属电极15。所述操作放大器14产生输出电压，该输出电压能够保持施用于FET11、FET13上的电压不变，尽管氢浓度发生了改变。如图3所示的实施方式是有益的，因为它使FET11、FET13以及操作放大器10、12、15的制造更加合理。

FET11、FET13可以被配置为形成第一阶段的操作放大器10、12。通过使用第一FET11或第二FET13来替换位于所述操作放大器的输入端的长尾对的常规FET，可以对各个操作放大器进行上述操作。这样是有益的，因为这可以使第一和第二FET形成放大电路的部分。

使用了如图3所示的用于DNA测序的实施方式检测平带电压的示例性例子如图4所示。平带电压包括：表示与核苷酸插入有关的pH变化的脉冲(pulses)；与ddNTP插入以及链终止有关的下降(drops)。先于较大下降的局部脉冲的数量决定了在已知碱基位置终止之前存在的碱基的数量；较大下降的量级取决于试剂混合物中所用的ddNTP∶dNTP的比例，并且由于依赖于所述下降来读取长度，因此较大下降是十分重要的。通过分别在含有四种ddNTP的每一种的不同的反应室内重复该过程四次，描绘了完整的序列。

用于制造离子敏感性的FET的步骤如下所示：

纯化的硅基质

掺杂剂的添加：p-型基质的制备

表面氧化：SiO₂层的产生

源/漏的定义和植入

使用LPCVD^*的氮化硅的沉积

接触形成

钝化作用

^*低压化学气相沉积

FETs以及特别是图3所示的和扩增期间的FETs可以被PMOS晶体管替换或者与PMOS晶体管相结合。

核酸扩增的监测

根据本发明，如图2或3中所示的传感器形式的pH敏感性FET还可以用于监测核酸扩增。在下文中将参考进行的qPCR对pH敏感性的FET的使用进行进一步的描述。然而，应该理解的是，pH敏感性的FET可以以相同的方式用于监测任何形式的核酸扩增，包括转录介导的扩增(TMA)或连接酶链式反应(LCR)。

PCR是扩增双链DNA片段的过程，其中，使用引物与每个DNA链杂交以在扩增过程的多个循环中靶向所扩增的特定目的序列。如图5所示，PCR循环存在3个阶段。在存在如下用于引物延伸的必需组分(包括耐热性的DNA聚合酶)的情况下通过热循环实现上述三个阶段：

-变性：由于连接两个DNA链的氢键断裂，双链模板DNA分离成两个单链，例如，在95℃；

-退火：通过与单链的模板DNA杂交的两个寡核苷酸引物确定目的序列，例如，在55℃下进行；

-延伸：在存在dNTPs的情况下DNA聚合酶延伸各个引物，例如，在72℃。

在所述循环的延伸阶段中，在各引物上添加碱基而引起质子释放。此种质子释放是作为本发明的实时定量PCR产品的基础。如上所述，ISFET的传感表面将暴露在缓冲的扩增混合物中，优选在小体积反应室或通道内，例如，微流体设备的室或通道内。因此，可以利用有益的小体积反应室或孔，例如，体积为约1pl至约10μl。这可以涵盖如图8所示的ISFET，其中，ISFET16嵌入在反应室或孔18的基底(base)17中，并且提供微通道用于样品递送及从室内向外的排出。所述室能够在退火温度和变性温度之间被加热和冷却以用于PCR的热循环(例如，在55-95℃之间)。用于扩增的试剂(例如，引物和dNTPs)可以以干燥形式存在于反应室内或者随样品引入。如果存在目标序列，则可以在PCR循环进行中通过pH降低超过确定的阀值来确定所述目标序列。如果不存在目标序列，则引物将不与模板DNA退火并且将不发生释放质子的引物延伸从而使pH不发生显著的改变。由于在扩增混合物中存在缓冲液，由PCR循环导致的pH变化最初将由缓冲反应所平息。然而，一旦超出此缓冲能力时，将检测到如图7所示的pH的急剧变化。pH值变化超过给定的阀值前的循环数将取决于DNA模板的浓度，浓度越高则循环越少，因此，能够通过相对于已知模板达到阀值时的PCR循环数进行校准来定量模板DNA。

多个如上文所述的包括ISFET的室可以设置在单独的微流体芯片上。对于例如需要扩增短串联重复序列(STRs)以用于DNA指纹识别(fingerprinting)，或者希望从相同的来源或不同的来源中扩增多个DNA样品以用于遗传检测，或者扩增一个DNA链的不同位点的情况，上述设置是特别有益的。位于微流体室的ISFET可以为芯片的整合部分，例如，具有控制DNA杂交和延伸的温度的芯片上的电阻加热元件和温度传感器的硅芯片。这种芯片还可以具有整合的参比电极和导电性传感器。

在例如Iordanov等的“Sensorised nanoliter reactor chamber for DNAmultiplication，IEEE(2004)229-232”中描述了用于PCR监测的具有整合的调节器(加热器)的一个硅纳升反应室或者硅纳升反应室阵列的制造。由此制造的反应室(见图9)每一个均可以与整合的ISFET一起用于根据本发明的核苷酸扩增的检测。如，Iordanov等所关注的，在上文提到的他们的文章中，未处理的硅和与标准硅有关的材料为Taq聚合酶的抑制剂。因此，当使用硅或与硅有关的材料(例如，硅锗或应变硅(下文中将所有的这些材料称为硅基质(substrate))制造核苷酸扩增的微芯片(microchip)室或通道时，上述材料通常覆盖有防止聚合酶的效力被硅降低的材料，例如，SU8、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、Perspex^TM或玻璃。

用于PCR的微制造的硅-玻璃芯片的表面钝化作用也可以如Shoffner等在“核苷酸研究，(1996)24，375-379”所描述的。在他们的研究中，使用标准的光刻(photolithographic)操作来制造硅芯片，硅芯片被蚀刻的深度为115μm。Pyrex^TM玻璃盖板被设置在每个硅芯片的顶部，并且硅和玻璃是阳极结合的。通过设置的室内的热循环，研究了多种类型的表面钝化作用来改善PCR的扩增效率。与常规的PCR管中进行的反应相比，发现氧化的硅表面(SiO₂)能够提供一致的扩增。这种表面在制备根据本发明的用于进行核苷酸扩增的具有ISFET pH传感器的微流体设备中也是有益的。为了进一步讨论PCR微流体设备的制造中的表面钝化，可以参考Zhang等的“PCRmicrofluidic devices for DNA amplification′in Biotechnology Advances(2006)24，243-284”。如上述综述中所描述的，通过基质涂层来替换静态的表面钝化作用，可以包括样品中的钝化试剂(动态钝化)。

当作为如上文所述的用于在静态样品中进行PCR监测的小反应体积室的一种替换时，用于PCR监测的样品可以流经微流体设备的通道或室，所述样品流经不同的温度区从而实现了PCR的热循环。因此，例如，所述样品可以流经连续地经过适合于变性、引物退火以及引物延伸的PCR阶段的不同的温度区的通道或室，例如，微流体设备(例如，硅芯片设备)中的通道，所述微流体设备中的通道连续地经过在基底上提供的适合于沿着通道不断地重复的变性、引物退火和引物延伸的PCR阶段的不同温度区。用于在芯片上进行连续的流动核酸扩增的此类微流体的结构，例如，在Auroux等“Minaturised nucleic acid analysis′Lab Chip(2004)4，534-546”中描述，并且这种微流体结构可以与用于监测扩增的ISFET结合。如图10和11所示的这种类型的微流体结构可以通过使用标准的微制造技术来进行制造，例如，使用光刻来确定流体框架，然后进行蚀刻或沉积以形成需要的一个或多个通道，例如在PMMA、丙烯酸、Perspex^TM或玻璃基质上。玻璃或PMMA或其他材料的盖板可以覆盖或不覆盖所述通道。所述通道的基底可以通过基质与硅芯片的结合来形成，所述硅芯片具有整合的ISFET和温度传感器以及加热器或热泵(Peltier)元件，从而使反应混合物直接与这些传感器和调节器接触，并且这些元件可以包括或不包括用于温度控制的电路。选择性地，所述一个或多个通道的基底可以通过具有ISFET和温度传感器的印刷电路板(PCB)来形成，从而使反应混合物与这些ISFET和温度传感器直接的接触。PCB的表面必需是水平的，从而使它能够提供平面的基底，其中微流体平台可以覆盖在所述平面基底上。所述PCB还可以包括加热器或热泵元件、传感器界面以及温度控制电路。存在于微流体通道或室内的试剂可以是缓冲的扩增混合物中的试剂，包括能够在适合于所选序列扩增的位点与目标进行杂交的引物、扩增需要的酶以及过量的所有四种dNTP。

因此，在本发明的监测热循环PCR的一种实施方式中，用于核酸扩增的样品流经微流体通道22(例如，在丙烯酸、PMMA或甲基丙烯酸甲酯平台上微制造的)，该通道22位于基质23上(例如，硅芯片的硅基质)，所述样品连续地流经设置在基质或基底上的适于沿通道长度连续重复的变性、退火和链延伸的阶段的温度区域，例如，95℃变性、55℃下使引物与标靶杂交、72℃引物延伸，重复进行(见图10)。在这种情况下，能够实现连续的流动扩增，并且可以根据本发明通过嵌入在基底上的一个或多个ISFETs来监测扩增。优选在沿着上文描述的用于连续的流动PCR的设备的通道的多个位置处使用ISFET检测器，从而实现扩增过程的实时PCR分析。

当通有电流时(P＝I²R)利用电阻器中消耗电力的焦耳热效应，可以使用位于芯片上的加热元件(例如多晶硅电阻器)来加热反应混合物。通过硅基质和微流体平台的热消散可以实现冷却，这是可能的因为含有小体积的反应混合物以及所述硅芯片基底有效的热消散作用。选择性地，用于加热和冷却的位于芯片上的Peltier热泵元件可以以已知的方式植入。对反应混合物以及ISFET和其它芯片上的电路来说，温度均匀对避免芯片上的热梯度是十分重要的。通过加热元件的合理排列可以获得上述效果。

通过比例-积分-微分(PID)控制器能够进行温度控制，所述比例-积分-微分控制器是一种最普通的闭环反馈控制系统。检测温度与目标温度之间的误差用于计算需要加热的水平。这种输出水平的计算是基于直接的当前误差(比例)、历史误差(积分)、以及基于其变化率的预计的未来的误差(微分)来进行的。相似地，如Iordanov等(2004)(同上)所描述的，基于当前的以及历史的误差值，PI控制器可以使温度稳定。选择性地，可以使用包括脉冲宽度调节或周期性暂停(duty-cycling)在内的技术。在这些技术中，加热器的输出并不通过振幅来调整，而是通过加热器开启的时间来调整，该时间以一段固定时间的百分比来表示。开启的时间与检测的温度和目标温度之间的误差成反比，只要接近目标温度，即减少加热元件开启的时间。

可以选择性地选择往返系统(见图11)，其中，扩增混合物在微室中的热循环所需的温度区域之间来回地移动。应该理解的是，这种在芯片上的样品分流(shunting)PCR(在上述Auroux等人的综述中描述)进行的核酸扩增可以通过提供的位于微流体室的壁上的ISFET来进行监测。

关于用于PCR的微流体设备的进一步的细节可以修改以用于本发明的ISFET传感器，参考文献可见Zhang等的“(2006)Biotech.Adv.24243-284”。如该综述中所讨论的，这种设备优选采用硅芯片的形式，也可以使用用于芯片基质的其它材料，例如玻璃、多种聚合物和陶瓷。作为对用于热循环的接触加热的替换，还可以使用该综述中讨论的其它非接触性加热方法，包括举例方式的热空气介导的加热，利用IR光，激光介导的加热，诱导加热和微波辐射。

当发计上述PCR系统以实现热循环时，已知多种等温的核酸扩增技术，例如，单链取代扩增(SSDA)，并且使用这些技术的DNA或RNA扩增同样可以通过根据本发明的ISFET检测来监测。

装置

应当理解的是，本发明的另一个方面提供了用于监测根据本发明的样品中的核酸扩增的传感装置，其中，该装置包括在基底(例如，硅基质)中或上的用于接收样品的室或通道；并且配置有一个或多个pH敏感性的ISFET以用于监测在所述室或通道中的核酸扩增，当存在于所述室或通道中时，所述基底具有涂层以提高扩增效率，例如，使所述基底发生上文描述的表面钝化。所述室或通道通常设置在微流体设备中。所述微流体设备可以为上文所述的各种形式。然而，通过选择基底的材料或者如果通过上文描述的动态钝化，则可以避免进行基底表面钝化的需要。

因此，本发明还提供了用于监测样品中的核酸扩增的更普及的传感设备，其中，该设备包括微流体设备，在该微流体设备的基底(例如硅基质)上或中具有用于接收样品的室或通道；并且在所述室或通道内配置有一个或多个pH敏感性的ISFETs以用于监测核酸的扩增。可以提供如上文所讨论的低反应体积的室或孔以监测静态样品中的PCR或者提供室或通道用于监测连续的流动PCR。可以提供另外的室或通道以同时监测多个样品。如上所述，所述基底可以包括用于样品热循环的加热元件和温度传感器。

在珠子(beads)上的DNA延伸的监测

无论pH敏感性的ISFET是否用于DNA测序或核酸的扩增(例如，qPCR)，作为ISFET表面上固定的DNA的DNA延伸的替代，DNA延伸可以发生在珠子(beads)上。珠子与位于反应室或通道底部的水平平板上的ISFET的结合使用是有益的(例如，如图8所示)，从而使珠子沉在ISFET传感表面的附近。选择珠子，从而仅通过重力使珠子沉在ISFET传感表面的附近。选择性地，也可以使用磁性/金属珠子而由于磁性落在ISFET传感表面的附近。所述珠子可以为由任何适合粘附DNA的材料(例如，硅、聚苯乙烯、琼脂糖或葡聚糖)合成的球状颗粒。可以调整珠子的大小以帮助重力沉降并与符合需要从而避免反应室以及入口和出口的阻塞。使用水或缓冲溶液可以将所述珠子从传感器表面清洗掉。使用常规的方法可以使DNA连接在珠子上，例如，珠子表面的功能化。可以使用间隔物。通过调整DNA结合于珠子上的比例，可以控制珠子的覆盖度。当在DNA测序或核酸扩增的监测中使用pH敏感性ISFET并且没有尺寸的限定时，优选使用例如硅珠子(例如，约200nm直径)，并且DNA直接固定在珠子上或固定在经修饰以提供羧基功能基团的珠子上。例如，可以替换性地方便地使用塑料的珠子(例如，约1μm的塑料微珠)。当使用ISFET来监测核酸的扩增时，所述珠子可以携带能够捕获样品中的目标DNA的探针DNA。

固定在ISFET上的DNA探针的应用

作为使用珠子的替换，用于捕获目标DNA的DNA探针可以直接连接或间接连接在ISFET上。使用已知的在固体表面上固定DNA探针的技术可以实现这种DNA探针的固定化，例如，DNA微列阵领域公知的技术。因此，通过原位-寡核苷酸合成(通过平板印刷(lithography)或其他方法)可以在ISFET上实现DNA探针的固定。

用于扩增的样品的制备

当样品中含有目标核酸和不期望的核酸的情况下，特别优选进行如上所述的目标探针的固定化。探针的固定化可以从任何不期望的核酸或干扰蛋白中分离出目标物。通过使用固定探针将目标物置于临近ISFET传感表面，可以实现增加信噪比的优点，所述信噪比是由核酸扩增所引起的pH变化局部化而产生的。

用于扩增的DNA可以来自于多种来源，例如，口腔擦拭、血液样品或培养的细胞。根据本发明，用于监测核酸扩增的样品的制备可以包括浓缩细胞的步骤和从细胞中释放扩增所需的核酸(例如，克隆的DNA序列)的步骤中的一个或两个步骤。这些步骤可以从用于核酸扩增的设备中分离出来进行，或者整合在相同设备的一部分中，例如，上述PCR芯片。例如，释放的用于扩增的核酸可以通过结合在上述微颗粒(珠子)上而被进一步的纯化。因此，如果使用合适的芯片上的实验室(LOC)方法进行PCR，例如，在Lee等的“Microchip-based one step DNA extraction and real time PCR in onechamber for rapid pathogen identification′，Lab Chip(2006)6，886-895”描述的激光辐射的磁性珠子系统(LIMBIS)，从生物样品中提取并纯化目标DNA可以在同一芯片上进行。

试剂盒

在本发明的另一个方面，提供了通过核酸的扩增(例如qPCR)来检测样品中的目标核酸序列的试剂盒，其中，该试剂盒包括传感设备(例如，微流体芯片形式的传感设备)，该传感设备包括反应室或反应通道以及用于监测上述反应室或反应通道中的核酸扩增的pH敏感性ISFET，其中，在所述反应室或反应通道内或者独立地在试剂盒中提供了用于扩增的引物。所述引物可以与用于目标核酸的珠子固定的寡核苷酸探针一起提供。如上所述，所述传感设备的反应室或反应通道可以具有其它位于反应室内的干燥的试剂(包括用于引物延伸的DNA聚合酶和需要的dNTP)。

以下参考文献提供了与本发明有关的额外的背景信息：

Shakhov and Nyren，′A Sensitive and Rapid Method for Determination ofPyophosphate Activity′，Acta Chem.Scand.B 36(1982)689-694；

R.Buck，′Electrochemistry of Ion-Selective Electrodes′，Sensors andActuators(1981)I，197-260；

Victorova et al，′New substrates of DNA polymerases′，FEBS Let.(1999)453，6-10；

Hanazato et al.，′Integrated Multi-Biosensors Based on an Ion-sensitiveField-Effect Transistor Using Photolithographic Techniques′，IEEE Transactionson Electron Devices(1989)36，1303-1310.

以下实施例更加详细地描述了通过DNA扩增的PCR循环模拟的pH值的变化，以及该pH值的变化如何用于对目标扩增的ISFET检测。

实施例

图7显示了通过用于典型的PCR扩增的PCR循环的pH值的变化，所述PCR扩增使用了包括以下物质的扩增混合物：10μM Tris HCl，pH 7.5、0.4mM dNTPs、2mM MgCl₂、50mM KCl、0.05％w/v BSA、1U/μl Taq聚合酶、1μM PCR引物对、以及准备的DNA模板(150-150,000个拷贝)。假定的扩增子是200个碱基对，每个dNTP的插入均释放一个质子。起始的pH值为7.5。由Tris和dNTP的给定浓度，可以确定各pH值处的缓冲能力。通过反应中释放的质子数以及反应发生时的pH值处的缓冲能力可以确定理论的pH值变化。

如上所述，在pH值变化超过给定的阀值之前的循环数将取决于DNA模板的浓度，浓度越高则循环数越少，从而能够通过相对于已知模板来校准达到所述阀值时的PCR循环数来定量模板DNA。

理论pH值变化的计算

在简化版本的反应中，单独的延伸反应可以如下所述：

(1)HP₃O₁₀ ^-3-核苷+DNA-3′OH＝＞H₂P₂O₇ ^2-+DNA-O-PO(O^-)-O-核苷

(2)H₂P₂O₇ ^2-＝＞HP₂O₇ ^3-+H⁺

核苷酸插入反应的即刻元素平衡如(1)所示，产生了延伸的DNA链和具有带-2电荷的焦磷酸盐(pKa₁和pKa₂)。在6-8.5的pH值范围内，一些焦磷酸盐将具有三个质子(pKa₃)，如(2)所示，导致pH的降低。

焦磷酸盐的pKa：

pKa₁～0.83

pKa₂～1.96

pKa₃～6.68

pKa₄～9.39

pH值变化的计算如简式中的PCR循环的函数：

缓冲能力

β = \frac{dn}{dpH}

其中，dn为碱基的增加，dpH为pH值的变化。

此外，

β \approx 2.303 \frac{{[HA]}_{0} K_{a} [H^{+}]}{{(K_{a} + [H^{+}])}^{2}}

其中，[HA]₀为缓冲化合物的总浓度，例如，TrisHCL、dNTP、DNA；Ka为化合物质子的解离常数；[H⁺]为质子浓度。

反应的给定初始pH值为7.5，可以计算出含有150个拷贝的DNA、10μMTriHCl和400μM dNTP的反应混合物的总缓冲能力，

β＝β_Tris+β_dNTP＝1.08×10^-4M(DNA浓度可以忽略)

然后，

p H_{2} = p H_{1} + β \times dn

= 7.5 + \frac{dn}{1.08 {\times 10}^{- 4}}

然后，基于新的起始pH值以及根据产生的质子的量预计的pH值变化来计算新的缓冲能力。

Claims

1.一种监测样品中核酸扩增的方法，所述样品含有当样品中存在目标序列的情况下用于扩增该目标序列的核酸扩增缓冲混合物，其特征在于，所述监测包括检测在目标序列的存在下当扩增开始超过所述样品的缓冲能力能够被克服的循环数阈值时由于质子释放而产生的pH值的变化，所述检测使用了传感装置，该传感装置包括具有传感表面的离子敏感场效应晶体管和用于检测来自离子敏感场效应晶体管的电子输出信号的设备，所述传感表面暴露于所述样品并且被配置成能够响应所述晶体管表面的pH值变化而产生电子输出信号。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸扩增为聚合酶链式反应扩增。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述离子敏感场效应晶体管具有氮化硅层。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述氮化硅层上设置有DNA聚合酶连接层。

5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的方法，其中，使用了参比电极。

6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的方法，其中，将用于扩增的目标核酸捕获于珠子上并且所述核酸扩增发生在临近所述离子敏感场效应晶体管的传感表面的珠子上。

7.根据权利要求1-5中的任意一项所述的方法，其中，用于扩增的目标核酸通过固定在所述离子敏感场效应晶体管上的探针而被捕获。

8.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述离子敏感场效应晶体管的传感表面暴露于位于体积为1pl至约10μl的低体积反应室中的所述样品。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应室位于微流体设备中，该微流体设备还包括含有所述离子敏感场效应晶体管的一个或多个同样的室，由此能够对多于一个样品中的核酸扩增同时进行监测。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述反应室位于芯片上，该芯片包括位于芯片上的电阻加热元件和温度传感器，由此能够对所述室进行加热和冷却以用于PCR热循环。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述芯片还包括位于芯片上的温度控制电路。

12.根据权利要求2所述的方法，其中，使用于PCR监测的所述样品流过微流体设备的通道或室并且使所述样品在流动时连续地流经不同的温度，从而实现PCR的热循环。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，使所述样品流经连续地通过适用于所述热循环的不同温度区的室或通道。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，使所述样品流经连续地通过设置在所述微流体设备基底的不同温度区的通道，所述温度区适用于沿着通道连续重复的变性、引物退火和引物延伸的PCR阶段。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，为了感应沿着所述通道的不同位置处的样品的pH值的变化，使用多于一个的离子敏感场效应晶体管。

16.根据权利要求12或13所述的方法，其中，为了进行热循环，所述样品在微室中在需要的温度区之间来回地移动，并且所述离子敏感场效应晶体管设置在所述室的壁上。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸扩增为等温的核酸扩增。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法是通过监测核酸扩增来检测目标核酸的方法，其中在所述缓冲能力被克服时产生的pH的变化的检测与所述目标核酸的检测有关。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，用以达到所述循环数阀值的扩增的循环数用于定量所述样品中存在的目标序列的量。

20.一种用于监控样品中核酸扩增的传感装置，其中，该装置包括整合有设置用于加热样品的一个或多个加热元件的硅基质以及用于检测样品pH的一个或多个离子敏感场效应晶体管。

21.根据权利要求20所述的传感装置，其中，该装置还包括氮化硅化学敏感性层。

22.根据权利要求20或21所述的传感装置，其中，该装置还包括一个或多个温度传感器。

23.根据权利要求22所述的传感装置，其中，设置的所述温度传感器用于控制所述一个或多个加热元件以控制杂交和延伸的温度。

24.根据权利要求20或21所述的传感装置，其中，该装置还包括一个或多个微流体设备的通道或室，以接受基底内或基底上的样品。

25.根据权利要求24所述的传感装置，其中，所述基底具有涂层以提高扩增效率。

26.根据权利要求20所述的传感装置，其中，含有所述样品的1pl至约10μl的反应室覆盖在一个或多个的离子敏感场效应晶体管上。

27.根据权利要求20所述的传感装置，其中，使所述样品流过微流体设备的通道或室，并使所述样品在流动时连续地流经不同的温度，从而实现PCR的热循环。

28.根据权利要求27所述的传感装置，其中，使所述样品流经连续地通过适用于所述热循环的不同温度区的室或通道。

29.根据权利要求28所述的传感装置，其中，使所述样品流经连续地通过设置在所述微流体设备基底的不同温度区的通道，所述温度区适用于沿着通道连续重复的变性、引物退火和引物延伸的PCR阶段。

30.根据权利要求29所述的传感装置，其中，为了感应沿着所述通道的不同位置处的样品的pH值的变化，使用多于一个的离子敏感场效应晶体管。

31.根据权利要求27或28所述的传感装置，其中，为了进行热循环，所述样品在微室中需要的温度区之间来回地移动，并且所述离子敏感场效应晶体管设置在所述室的壁上。

32.根据权利要求20、21和26-30中任意一项所述的传感装置，其中，所述硅基质还整合有参比电极、具有非酶联层的参比晶体管和导电性传感器中的至少一种。

33.根据权利要求20、21和26-30中任意一项所述的传感装置，其中，该传感装置还包括用于DNA扩增的试剂，一部分所述试剂被固定在离子敏感场效应晶体管的表面和/或固定在珠子上。

34.根据权利要求33所述的传感装置，其中，所述试剂是干燥的且被固定在反应室中或者设置成随样品引入到反应室中的形式。

35.一种用于通过核酸扩增来检测样品中的目标核酸序列的试剂盒，该试剂盒包括传感设备，该传感设备包括反应室或反应通道、以及用于监测上述反应室或反应通道中的核酸扩增的权利要求1中所述的pH敏感性的离子敏感场效应晶体管，其中，在所述反应室或反应通道内或者独立地在试剂盒中提供了用于所述扩增的引物。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述传感设备为微流体设备的形式。