CN1461350A - 包含mosfet分子检测芯片和采用该芯片的分子检测装置以及使用该装置的分子检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在微量流体通道的侧壁上包括金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)的分子检测芯片，及包括该分子检测芯片的分子检测装置。本发明还提供一种分子检测方法，特别是利用该分子检测装置鉴定分子探针的固定和目标样品与分子探针的结合的方法，以及核酸突变的检测方法和装置。在微量流体通道的侧壁上直接形成MOSFET，使分子检测芯片的高度集成更容易。另外，探针直接固定在门电极的表面，确保该分子检测芯片可以检测探针的固定，并确保目标分子原位偶合在所述的探针上。

Description

包含MOSFET分子检测芯片和采用该芯片的分子检测装置 以及使用该装置的分子检测方法
技术领域
本发明涉及一种在微量流体通道的侧壁上包括金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)的分子检测芯片，以及采用该分子检测芯片的分子检测装置。同时，本发明涉及采用该分子检测装置的分子检测方法，更具体地，本发明涉及定量检测分子探针的固定或者分子探针与目标样品的结合的方法。本发明还涉及检测核酸突变的装置，以及利用该核酸突变检测装置检测核酸突变的方法，所述装置是通过将包括加热器和热传感器的热控制和检测单元并入分子检测装置而构成的。
背景技术
由基因组计划完成的人类DNA序列的公开加速了有关各种核酸及核酸编码的蛋白质的功能的研究，同时，增加了对生物传感器的需求，以便容易检测核酸和蛋白质等生物分子。
美国专利4,238,757，4,777,019，5,431,883，及5,827,482公开了能够利用电信号感知生物分子的生物传感器。美国专利4,238,757公开了设计成具有源极和漏极的场效应晶体管(FET)，包括对特定抗原具有特异性的抗体层。利用FET，从漏极电流随时间的变化中可以测得样品溶液中的抗原浓度。
美国专利4,777,019公开了一种FET，其中横跨参杂的源极与漏极区形成门电极，并将与要测量的目标核苷酸互补的核苷酸结合在该门电极的顶部。
美国专利5,431,883公开了一种FET，其中形成了酞菁染料(一种能够通过与化学物质的反应变成具有导电性的有机绝缘材料)的薄膜，以连接门电极和漏电极。
美国专利5,827,482公开了一种生物传感器，其包括两个并联的FET，每个FET具有各自的结合了对不同材料敏感的分子受体的门电极，以便提高灵敏度。
但是，目前可利用的生物传感器均形成传统的平面表面的FET，每个FET均具有源极、漏极和位于平面基材表面的通道层，因此限制了生物传感器的高度集成。另外，难于选择性地将生物分子探针固定在有限的区域上。因此，在FET的制造中，需采用单独的制造设备才能将探针固定在FET上。然而，所得探针只是很弱地固定在FET上，所以不能以高灵敏度检测出与目标分子的结合。另外，检测探针的固定需要大量的时间，从而增加了检测目标分子所耗费的总体时间。
因此，对于新的生物传感器的需求日益增加，该生物传感器容易高度集成，保证稳定地固定探针并原位确认探针的固定，而且能够以高灵敏度检测目标分子的结合。
生物芯片是指具有牢固地固定在基材上的生物分子探针(如要分析的DNA、蛋白质等)的芯片，并且用于基因表达图谱、基因缺陷、蛋白质图谱、反应模式的分析。根据探针的固定类型，生物芯片可以分为探针固定在固体基材表面的微阵列(microarray)芯片和探针固定在微量通道上的“芯片实验室”型芯片(lab-on-a-chip)，并且可以根据探针的种类分成DNA芯片、蛋白质芯片等。
目前可得到的多数DNA芯片是根据点样(spotting)或光刻技术制造的。DNA芯片是利用化学键，通过将能够与目标DNA反应的DNA单链作为探针固定在特定的基材上而制备的，并通过反应检测目标DNA。在这种DNA芯片的制造中，探针DNA的固定极大地影响产品的可靠性和再现性，因而需要精确地控制。然而，时下使用的技术不能精确地确定所固定的生物分子的数量。
常规的点样芯片或光刻芯片可在制造过程中根据体积将探针的数量调整到一定的水平，但是当作为诊断疾病的商业性产品使用时，具有较差的准确性和可再现性。尤其是研究特定DNA的表达时，需要更准确地固定探针DNA。尽管需要准确的固定技术，但是由于制造过程中的技术问题和成本问题，目前尚未建立准确的固定技术。
为了克服传统的问题，本发明人进行了研究并完成了本发明，其中利用DNA芯片中的MOSFET传感器测量DNA芯片的电流-电压特性，致使可以准确地检测探针DNA的固定与杂交。结果，可以在不增加制造成本的情况下制得商用的能够同时测量探针DNA的固定与杂交的DNA芯片。
核酸的单核苷酸多态性(SNP，个体间人类DNA的单碱基对变异)是最常见的DNA序列多态性(大约1/1000个碱基)。SNP影响个体的免疫系统，因而可以用于诊断、治疗和预防遗传疾病。所以，需要一种迅速和方便的检测SNP的方法，该SNP起源于个体或种族的遗传差异和免疫力。
普通SNP检测方法的基础是双链DNA的温度依赖性分离。双链DNA在温度大于95℃时分离成两个单链。基于这种特性，可以鉴定变异DNA的序列。但是，该方法的每个步骤需要分立的系统和装置，而且不能应用于通过准确和精密的温度控制而进行的实时DNA分离和即时检测。
标题为“实施温控反应和分析的集成设备和系统”的美国专利6,171,850公开了利用热交换器控制各个反应器的内部和外部温度。反应系统包括加热器和至少一个热交换器。该反应体系的核心内容仅在于多个反应器的温度控制。此外，热交换器的内含物不利于DNA的检测和流体通道特性的提高。
标题为“控制微通道中流体参数的电流”的美国专利6,174,676公开了不同类型的加热器和装有电控加热器与冷却器的流体通道。该专利仅限于PCR的温控装置，没有描述用于检测DNA双链体的温度依赖性分离的装置。
标题为“DNA解链仪(meltometer)”的美国专利5,683,657公开了一种核酸分析装置，包括携带缓冲液同时将其保持预定温度的温控室，控制温控室温度的加热和冷却单元，以及用荧光材料在Tm温度下标记热变性双链DNA并对其进行检测的标记和检测单元。在DNA解链仪中，DNA检测单元与温控室是分开的，从而使整个系统复杂化，并导致检测步骤中的迟滞。
针对这些问题，本发明人根据双链DNA在温度升高时分离成两个单链的事实开发了一种DNA突变(SNP)检测装置，该装置确保以不同方式检测DNA和调节温度。根据本发明，无论DNA是否分离，均可以利用放置在流体通道上的DNA检测单元对其进行实时的鉴定。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种分子检测芯片，其容易高度集成，并且能够在短时间内原位检测探针的固定和目标分子的结合。
本发明的第二个目的是提供一种制备所述分子检测芯片的方法。
本发明的第三个目的是提供一种采用所述分子检测芯片的分子检测装置。
本发明的第四个目的是提供一种利用所述分子检测装置定量检测分子探针的固定的方法。
本发明的第五个目的是提供一种利用所述分子检测装置定量检测分子探针和目标样品的结合的方法。
本发明的第六个目的是提供一种新的核酸突变检测装置，其中通过微制造(microfabrication)技术在微量流体通道中形成至少一个热控制和监测单元，从而可以通过准确和精密的温度控制实时地检测DNA突变。
本发明的第七个目的是提供一种利用所述核酸突变检测装置有效地检测核酸突变(单核苷酸多态性，SNP)的方法。
为了实现本发明的第一个目的，本发明提供一种分子检测芯片，该芯片包括：半导体基材；形成于半导体基材中并用作分子样品流动通路的微量流体通道，及位于微量流体通道侧壁上的金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)。
在本发明中，术语“微量流体通道的侧壁”包括凸钝角和底部以及微量流体通道的实际侧壁。
优选MOSFET的门电极由薄的金(Au)层形成。优选硫醇取代的探针以自装配的单层固定在门电极的表面上。
为了实现本发明的第二个目的，本发明提供一种制备分子检测芯片的方法，该方法包括在半导体基材的表面上形成氧化物层。下一步，通过蚀刻半导体基材的表面形成至少具有一个凸钝角的微量流体通道，并用杂质离子对微量流体通道的侧壁进行参杂，以形成杂质扩散区。MOSFET的通道区是利用蚀刻溶液蚀刻形成于微量流体通道侧壁上的杂质扩散区的一部分而界定的。氧化物层形成于通道区上，并利用金(Au)在通道区上形成门电极，进而得到本发明的分子检测芯片。
优选通道区的界定是通过沿着至少一个凸钝角选择性地蚀刻杂质扩散区而进行的。在通道区的界定中，优选通过测量电流水平随施加到半导体基材上的反向偏压的变化来确定蚀刻的终止点。
为了实现本发明的第三个目的，本发明提供一种分子检测装置，该分子检测装置包括：基材；形成于基材表面的分子样品加载单元；至少一个一端与分子样品加载单元相连并且用作分子样品流动通路的微量流体通道；以及与微量流体通道的另一端相连且其上固定了分子探针的MOSFET传感器。
优选MOSFET传感器通过本发明的分子检测芯片来实现。这种情况下，优选分子检测芯片单独地由包括基材，分子样品加载单元，及微量流体通道的分子检测组件(kit)制备，然后将其安装在位于分子检测组件的微量流体通道末端的芯片安装区上。
本发明还提供一种分子样品检测方法，该方法包括通过形成于分子检测装置基材表面上的分子样品加载单元提供分子探针。下一步，将分子探针固定在MOSFET的门电极的表面上，所述MOSFET形成于分子检测装置的微量流体通道的侧壁上，该微量流体通道的一端与分子样品加载单元相连，而另一端则与MOSFET相连，从而通过样品加载单元提供的分子探针沿微量流体通道移动至MOSFET中。此后，测量门电极的电流-电压特性。通过分子样品加载单元提供目标分子样品之后，目标分子样品一边通过分子检测装置的流体通道移动一边与分子探针进行反应。最终，测量门电极的电流-电压特性，以便根据电流-电压特性相对于加载目标分子样品之前的测量结果的变化，检测目标分子样品。
优选该分子检测方法还包括下列步骤：在将分子探针固定在门电极的表面上之后，通过向分子样品加载单元中加入清洗液来除去未固定在门电极上的分子探针；以及在目标分子样品与分子探针反应之后，通过向分子样品加载单元中加入清洗液来除去未与分子探针反应的目标分子样品。
在本发明中，分子探针或目标分子样品可以包括核酸，蛋白质，酶底物，佐剂，及寡糖。优选核酸包括单链脱氧核糖核酸(DNA)，单链核糖核酸(RNA)，及单链肽核酸(PNA)。优选蛋白质包括细胞膜受体激动剂，细胞膜受体拮抗剂，毒素，病毒表位，激素，肽，酶，及单克隆抗体。更优选分子探针为单链核酸，目标分子样品为能够与分子探针杂交的单链核酸。
本发明的分子检测芯片及装置的优点在于容易高度集成并且能够检测探针的固定和目标分子与探针的原位偶联。
为实现本发明第四个目的，本发明提供一种量化分子探针的固定的方法，该方法包括：在上述分子检测装置的分子样品加载单元中提供分子探针；通过使分子探针沿微量流体通道移动，将分子探针固定在MOSFET传感器的门电极的表面上；及测量门电极的电流-电压特性。
为了实现本发明的第五个目的，本发明提供量化分子探针与目标分子样品结合的方法，该方法包括：(a)在上述分子检测装置的分子样品加载单元中提供分子探针；(b)通过使分子探针沿微量流体通道移动，将分子探针固定在MOSFET传感器的门电极的表面上；(c)测量门电极的电流-电压特性；(d)将目标分子样品提供给分子样品加载单元；(e)通过使目标分子样品沿微量流体通道移动，将目标分子样品结合到固定在MOSFET传感器的门电极表面上的分子探针上；及(f)测量门电极的电流-电压特性，并将测量结果与在步骤(c)中测得的电流-电压特性相比较。
根据本发明，通过测量分子检测装置中MOSFET传感器的门电极的电流-电压特性，可以定量地测量探针的固定以及目标样品与所固定的探针的杂交。DNA芯片可以定量地测量探针核酸如单链脱氧核糖核酸(DNA)、单链核糖核酸(RNA)和单链肽核酸(PNA)的固定，以及目标核酸与探针核酸的杂交。
为了实现本发明的第六个目的，本发明在微量流体通道中装配加热器，热传感器，及形成MOSFET传感器的DNA传感器，以便依据温度分离和检测DNA。本发明利用加热器和热传感器调节影响DNA结构的温度，同时，又可以实时地检测DNA是单链还是双链。
具体地，本发明提供一种检测核酸突变的装置，该装置包括：基材；形成于基材表面的样品加载单元；直接与样品加载单元相连并用作样品流动通路的微量流体通道；以及至少一个热控制和检测单元，其形成于微量流体通道中，并包括固定核酸的MOSFET传感器、加热器和热传感器。
优选加热器和热传感器与MOSFET传感器相邻，并且用于控制对于固定在MOSFET传感器上的核酸来说是十分重要的温度，而MOSFET传感器则在所固定的核酸的解链温度Tm下检测变性的或复性的双链核酸。
在本发明中，MOSFET作为传感器用于检测双链核酸分离之前和之后的电荷变化。
优选MOSFET位于微量流体通道的侧壁或凸钝角上。与目前公开的于平面上制造的基于FET的生物分子传感器不同，本发明的生物分子传感器通过整体显微机械加工和扩散形成三维(3D)的MOSFET传感器，并且设置在微量流体通道的凸钝角上。将具有这种结构的生物分子传感器置于核酸的流动通路中，从而降低了包括传感器的检测单元所占用的面积又显著地缩短了检测时间。这样就可以在小的空间中方便地安装更多的传感器。
根据本发明，用作DNA传感器的MOSFET的特征在于，在源极和漏极区包括薄的金(Au)层，其上固定了自我排列的硫醇取代型核酸的单层。具体地，MOSEF传感器具有两个源极和漏极传感器，每个均依次涂布了薄的氧化物层和Au层，从而得到MOS结构。对Au层具有选择性亲和力的硫醇基团附着在核酸分子的末端，使得硫醇取代的核酸分子吸附在Au层上。硫醇取代的核酸分子吸附在Au层的表面，作为自组装(self-assembled)的单层(SAM)。SAM是指以规则的图案自发地排列在基材表面并与基材形成化学键的有机单层。这样，为了形成SAM，无需再另外制造设备。目前可利用的生物分子传感器不能为生物分子提供限定的结合部位，并且结合力弱。但是，在本发明中采用的将硫醇取代的生物分子以SAM形式选择性地吸附在Au上，可以消除现有生物分子传感器的缺点。另外，硫醇取代的生物分子直接吸附在传感器的表面，提供了优异的检测反应之前和之后的电荷变化的性能。
此外，本发明的特征还在于固定在MOSFET传感器上的核酸包括单链DNA，单链RNA，及单链肽核酸(PNA)。单链核酸作为与通过样品加载单元注入的目标核酸杂交的探针。优选各MOSFET传感器上固定离散的核酸序列。
在本发明中，加热器的作用是升高热控制与检测单元的温度，热传感器的作用是控制加热器的运转。优选加热器和热传感器靠近MOSFET传感器，以有效地控制严重影响吸附在MOSFET传感器上的核酸的温度。
为实现本发明的第七个目的，本发明提供一种检测核酸突变的方法，该方法包括：将单链核酸探针固定在MOSFET传感器的门电极的表面上；将对所固定的单链核酸探针产生响应的目标核酸注入样品加载单元中，并沿微量流体通道将目标核酸移动至MOSFET传感器；使目标核酸与固定在MOSFET传感器上的单链核酸探针杂交；逐步升高温度，以将杂交的双链核酸分离成两个单链；及测量MOSFET传感器的门电极的电流-电压特性。
在本发明的检测核酸突变的方法中，在低温核酸杂交之后，逐步升高温度，以检测核酸突变。位于微量流体通道中的热控制与检测单元通过准确与精密的温度调节，确保实时的核酸突变检测。
作为选择，本发明还提供一种检测核酸突变的方法，该方法包括：将单链核酸探针固定在MOSFET传感器的门电极的表面上；将对所固定的单链核酸探针产生响应的目标核酸注入样品加载单元中，并沿微量流体通道将目标核酸移动至MOSFET传感器；保持目标核酸与单链核酸探针不发生杂交的温度；逐步降低温度，以使单链核酸复性成杂交的双链核酸；及测量MOSFET传感器的门电极的电流-电压特性。这种情况下，在高温核酸变性之后，逐步降低温度，以检测核酸突变。
本发明的检测核酸突变的装置和方法可以有效地检测核酸突变，特别是单核苷酸多态性(SNP)。双链DNA在96℃或更高的温度下变性为两个单链。变性温度高于碱基对正确匹配的杂交所需的温度，低于碱基对错误匹配的杂交所需的温度。据此，通过微电子机械系统(micro-electro mechanicalsystem，MEMS)技术制备其中的反应温度可以调节的微型热控制与检测系统。如果在本发明的系统中，将分散的核酸序列固定在实现MOSFET传感器功能的各个DNA传感器上，则可以利用相应的温度控制单元，通过检测发生核酸变性时的温度来评估核酸的SNP。
附图说明
图1是本发明分子检测装置的优选实施方案的透视图；
图2是本发明优选实施方案的分子检测芯片的局部顶视图；
图3是图2的分子检测芯片(金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)传感器)之一的局部透视图；
图4是图2的分子检测芯片的电流-电压(I-V)特性的曲线图；
图5至图9是说明本发明优选实施方案中分子检测芯片的制备方法各个步骤的透视图；
图10是说明将探针固定在分子检测芯片的门电极上的视图；
图11是利用本发明的点样或光刻技术固定探针DNA的检测装置的优选实施方案的视图；
图12是本发明的检测探针DNA与目标DNA杂交的方法的优选实施方案的视图；
图13是本发明核酸突变检测装置的优选实施方案的视图，其中热控制与检测单元位于微量流体通道底部；
图14是本发明的核酸突变检测装置的另一优选实施方案的视图，其中热控制与检测单元的MOSFET(其上面固定了核酸)形成于微量流体通道的侧壁或凸钝角上，而且具有加热器和热传感器的热控制与检测单元位于微量流体通道的上方；
图15示出了用于本发明核酸突变检测装置的热控制与检测单元中的MOSFET的制备；
图16是电流随着固定在本发明生物芯片上的探针DNA的量而变化的图；及
图17是电流随着本发明的探针DNA与目标DNA的杂交而变化的图。
具体实施方式
下面将参照附图更全面地说明本发明的分子检测芯片，采用该分子检测芯片的分子检测装置，制备分子检测芯片的方法，以及采用该分子检测装置的分子检测方法。但是，本发明可以多种不同的形式实施，不能认为本发明仅限于本文所述的实施方案；相反，给出这些实施方案的原因是为了使本公开更加详尽和完整，并且全面地将本发明的构思转达给本领域的技术人员。在附图中，为了清楚起见，层的厚度被放大了，而且相同的附图标记始终代表相同的组成部分。
图1是本发明优选实施方案的分子检测装置的透视图。参照图1，分子检测装置包括分子检测组件10和安装在分子检测组件10上的分子检测芯片(未示出)。分子检测组件10包括至少一个形成于基材15表面的样品加载单元20，其通过流体通道30与芯片安装区40相连。确保流体通道30的宽度和深度足够大，以便允许样品通过毛细作用流动。在图1中，附图标记50代表样品分配器，附图标记55代表分子样品。
尽管在图1中没有说明，但是分子检测组件10包括多种电装置，其可以通过电信号与安装在芯片安装区40上的分子检测芯片通讯。
在图1的实施方案中，虽然将分子检测芯片描述成可与分子检测组件10拆分，但是它也可以附着在分子检测组件10上进行测量。作为选择，在需要时，可将分子检测芯片构建在分子检测组件10中。
图2是本发明优选实施方案的分子检测芯片的局部顶视图，该分子检则芯片将要安装在图1之分子检测组件10的芯片安装区40中。参照图2，每个分子检测芯片包括与流体通道30的一端相连的微量流体通道30′(流体通道30的另一端与图1之分子检测组件10的相应的样品加载单元20相连)；及样排放单元60，其与微量流体通道30′的相反的一端相连。源极150S，漏极150D，及门电极150G形成于分子检测芯片的表面，互连器(interconnect)150连接到源极150S或漏极150D上。
下面将参照图3(其为图2的分子检测芯片之一的局部透视图)更详细地描述图2所示之本发明优选实施方案的分子检测芯片的结构。
参照图3，作为样品流动通路的微量流体通道105形成于半导体基材100的表面上。四个金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)形成于微量流体通道105的侧壁上。本发明的分子检测芯片可以包括至少一个MOSFET。每个MOSFET包括通过杂质离子参杂形成于微量流体通道105的侧壁上的源极区120S和漏极区120D，以及由源极区120S和漏极区120D界定在微量流体通道105的凸钝角上的通道区130。门电极150G形成于每一通道区130中，其间有门电极绝缘层132。门电极150G优选由薄的金(Au)层形成，致使目标分子与之偶联的探针牢固地固定成自组装的单层。用于将源极区120S和漏极区120D分别连接到源极150S和漏极150D上的互连器140均形成于基材100的表面上。
图3的分子检测芯片的电流-电压(I-V)特性曲线示于图4中。如图4中所示，本发明优选实施方案的分子检测芯片具有MOSFET的正常的电特性。
下面将参照图5至图9来说明制备图3所示的分子检测芯片的方法。参照图5，氧化硅层102形成于半导体基材100上，厚度为1.5～2.0μm。优选半导体基材100为具有(100)取向的平面的n-型硅基材。
下一步，如图6所示，通过光刻法在半导体基材100中形成具有至少一个凸钝角的微量流体通道105。需要至少一个凸钝角的原因将在后续的工艺中描述。在图6的优选实施方案中，虽然所形成的微量流体通道105在直线a-a′的方向上较长而在直线b-b′的方向上较短，但其长度足以形成至少一个凸钝角，应当理解，在需要时，微量流体通道105也可以在直线b-b′的方向上延伸，以便形成双向交叉的微量流体通道。
下一步，如图7所示，基材100的整个表面用杂质离子参杂。用p-型杂质离子对基材100进行参杂。例如，可以1016～1018个原子/cm2的浓度对基材100进行硼参杂。根据氧化物相对于天然氧化硅层厚度的去除速度，通过控制植入条件如温度和时间，可以仅在微量流体通道105的侧壁上而不是底部进行杂质离子参杂。通过后续的扩散过程，杂质扩散区110仅形成于微量流体通道105的侧壁上，如图7B所示，其为图7A的局部放大图。
利用蚀刻溶液蚀刻所得到的图7B的结构。优选使用氢氧化三乙基铵(TMAH)溶液作为蚀刻溶液。由于仅选择性地蚀刻微量流体通道105的凸钝角，所以杂质扩散区110部分地露出，在微量流体通道105的角上形成开放的区域作为通道区130，如图8A所示。结果形成源极区120S，漏极区120D，及通道区130。
在微量流体通道105的凸钝角上进行选择性蚀刻的原因在于这样的事实，即一个区域和另一个与蚀刻溶液接触的区域的晶体取向不同，如图8B所示。微量流体通道105的底面与原始的硅基材100一样，由取向为(100)的平面构成，而所蚀刻的微量流体通道105的侧壁则由取向为(111)的平面组成。因此，应以预定的角度选择性地蚀刻微量流体通道105上会合了取向为(111)的平面的凸钝角。
通过施加反向偏压来蚀刻基材100，可以很容易地检测出杂质扩散区110是否露出并形成通道区130。当缩短杂质扩散区110时，尽管在杂质扩散区110上施加反向偏压，电流仍不流动。但是，只要通过蚀刻在微量流体通道105的角上露出杂质扩散区110，电流就开始流动。根据电流的变化可以很容易地确定蚀刻的终止点。
最后，在其中已经形成了源极区120S、漏极区120D和通道区130的基材100上形成门电极绝缘层132，并形成门电极150G，如图9所示。门电极绝缘层132由厚度为300～800的氧化硅层构成。门电极150G形成薄的金(Au)层，以便其上容易固定高密度的探针。优选在形成薄的Au层之前，先形成薄的铬(Cr)层，以便提高由Au制成的门电极150G对门电极绝缘层132的附着力。通过一般的方法形成互连器140，以连接源极区120S或漏极区120D，以及源极150S和漏极150D，从而形成分子检测芯片。
下面参照图1和图3说明采用本发明的分子检测装置的分子检测方法。最初，用水虎鱼(piranha)溶液(比例为3∶1的H2SO4与S2O的混合物)清洗分子检测芯片的表面，然后用去离子水清洗，紧接着用氮气干燥并用UV臭氧进行处理。结果，从芯片表面除去了有机物。以清洗芯片表面相同的方式，清洗分子检测组件10的表面。待清洗步骤结束后，将图3的分子检测芯片安装在图1的分子检测组件10的芯片安装区40上。下一步，将探针样品加到图1的样品加载单元20中。使用其末端具有硫醇基团的探针样品。探针样品通过毛细作用，沿着与样品加载单元20相连的图1的流体通道30移动。当探针样品通过与每个流体通道30相连的微量流体通道105时，其以自组装的单层，固定在每个MOSFET的门电极150G的顶部上，所述MOSFET形成于图3的微量流体通道105的侧壁上。被固定在门电极150表面上的样品探针如图10所示。当探针以自组装的单层固定在由Au构成的门电极150G的顶部时，采用硫醇基团作为连接物(linker)。在图10中，附图标记210代表硫醇基团，附图标记220代表探针。以硫醇210为连接物，将探针以自组装的单层选择性地固定在由Au制成的门电极150G上，这种选择性固定致使所固定的探针具有高度稠密的和良好排列的结构，以及牢固的结合力，如图10所示。结果，通过后续的反应步骤，可与目标分子保持稳定的偶联。
适宜的探针可以包括对目标分子产生响应的核酸，蛋白质，酶底物，佐剂，及寡糖。可以使用单链脱氧核糖核酸(DNA)，单链核糖核酸(RNA)，或者单链胎核酸(PNA)作为核酸。适宜的蛋白质包括细胞膜受体激动剂，细胞膜受体拮抗剂，毒素，病毒表位，激素，肽，酶，及单克隆抗体。
待探针固定在门电极150G上之后，测量流经门电极150G的电压和电流。
下一步，将目标样品加到图1的样品加载单元20中。目标样品是指来源于活的有机体的生物分子样品和合成的样品。目标样品沿着与样品加载单元20相连的流体通道30移动，并最终通过与流体通道30相连的分子检测芯片(图3)的微量流体通道105。目标样品在经过微量流体通道105的同时，与图10的探针220发生反应。
测量门电极150G上的电流-电压(I-V)特性，并通过测量样品与探针结合前后I-V特性的变化，确定目标样品是否与探针偶联。
为了检测另一样品，需要将用过的探针从由Au制成的门电极150G上除去。用过的探针可以通过用水虎鱼溶液(比例为3∶1的H2SO4与S2O的混合物)清洗门电极150G而除去。
下一步，对于新的目标样品，重复与上述相同的过程，利用对目标样品产生应答的探针检测所述的目标样品。
根据本发明，可以极高的再现性很容易地将探针以自组装的单层固定在门电极150G上。也很容易在检测另一样品时将探针分离。因此，本发明的分子检测装置的优点在于可以很容易地使用多种探针。
根据本发明，MOSFET传感器可以形成于微量流体通道的侧壁上，如图3所示，也可以位于一般平面形生物芯片表面的下面。图11示出了一种利用安装在DNA芯片表面下方的MOSFET传感器，测量固定在DNA芯片上的DNA量的检测系统。在图11中，(A)示出了利用点样或光刻技术制备的DNA芯片，(B)示出了一个点样的放大区域，及(C)示出了MOSFET传感器的结构，包括源极区250S，漏极区250D，及沉积在门电极区250G的金(Au)薄膜。
图12示出了定量每个点样区中所固定的探针DNA和目标DNA的检测系统。在图12中，(A)仅示出了固定在DNA芯片的Au区域上(即MOSFET传感器的表面)的单链探针DNA，及(B)示出了与目标DNA杂交的探针DNA。
在点样芯片或光刻芯片的制备中，通常使用玻璃作为基材。在本发明中，优选使用硅晶片作为基材。与玻璃相比，硅晶片具有电特性又具有良好的机械性能，因而可应用于具有良好特性的DNA固定和检测系统。由于将硫醇取代的基团附着在探针DNA的末端，所以该探针DNA可以而且只能选择性地固定在硅晶片中形成图案的Au区上。
图13示出了本发明优选实施方案的核酸突变检测装置，其中多个热控制与检测单元放置在微量流体通道的底部，其中每个热控制与监测单元均包括MOSFET传感器300，加热器400，及热传感器500。在图13中，箭头表示流体流动的方向，自MOSFET传感器300延伸出来的线为DNA链。具体地，(a)表示正确匹配的DNA杂交体，而(b)、(c)和(d)则表示错误匹配的DNA杂交体。
图14示出了本发明另一优选实施方案核酸突变检测装置，其中每个热控制与检测单元的MOSFET传感器均具有电极300E和Au门电极300G，将这样的传感器放置在微量流体通道的侧壁或凸钝角上，而微加热器400′和微-热传感器500′则安装在微量流体通道的上方。
现将参照下面的实施例，更详细地阐述本发明。给出下面实施例的目的是阐述本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：分子检测装置或核酸突变检测装置的制备
1.微量流体通道的形成
一般地，可以利用与微组装技术相适应的方法和材料装配本发明的分子检测装置或核酸突变检测装置的主体。例如，分子检测装置或核酸突变检测装置的主体可以包括利用各种聚合物通过注塑形成的聚合物部件，或者多种由硅、玻璃等形成的平面形晶体基材。在由例如氧化硅、玻璃或硅制成的晶体基材中，可以通过蚀刻、研磨、钻孔等技术形成各种各样的孔或通道。这些材料和方法与半导体相关产业中广泛使用的微制造技术兼容。可利用的微制造技术包括例如电沉积，低压气相沉积，光刻，蚀刻，激光钻孔等。
在本发明的核酸突变检测装置的微装配中，光刻技术更适于基材的蚀刻。例如，将基材用光刻胶覆盖，并通过光刻模板使其暴露于电磁射线，以形成光刻胶图案，其反映了将要在分子检测装置或突变检测装置中形成的腔室和/或通道。蚀刻曝光的基材，形成所需的孔或通道。下一步，将其上形成了孔和/或通道的基材覆盖并粘结至另一平面基材。适宜的光刻胶包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)及其衍生物，电子束保护层如聚(烯烃砜)等。
优选分子检测装置或核酸突变检测装置的主体可以如此形成：使利用例如塑料注塑形成的部件与蚀刻过的平面氧化硅或硅基材结合。例如，样品加载单元可以通过注塑形成；而微量流体通道或孔，热控制与检测单元则可以通过微制造技术中的蚀刻法形成于平面的玻璃、氧化硅、硅芯片或硅基材中。
2.DNA检测单元(传感器)的形成
图15示出了将要安装在微量流体通道的凸钝角上的DNA检测单元(MOSFET传感器)的制备。注入样品加载单元中的核酸沿着微量流体通道移动至传感器的检测部位。首先，湿法蚀刻n-型的硅基材，接着进行硼扩散，在所蚀刻的侧壁上形成p-型的硅区。通过湿法蚀刻，将硼参杂的区域分成源极区和漏极区。为了形成MOSFET结构，在源极区和漏极区上形成薄的氧化物层，并将铬(Cr)沉积在氧化物层上，以便提高对Au的附着力。下一步，将Au沉积在Cr层上。将硫醇取代的核酸探针固定在传感器的表面上。硫醇取代的核酸仅选择性地以自组装的单层(SAM)结合在传感器表面的Au层上。本发明的分子检测装置或核酸突变检测装置的DNA检测单元是这样制备的：在MOSFET的DNA传感器上形成薄的Au层，然后将硫醇取代的核酸固定在Au层上。可以极好的再现性，很容易地形成附着在Au层上的硫醇取代的核酸的SAM。另外，硫醇基团的各种对立末端具有广泛的应用。与其它的SAM相比，硫醇取代的核酸的SAM更稠密，排列得更好，而且由于牢固的结合力而在形成SAM之后的各种反应中更稳定。
3.热控制单元的形成
通过包括加热器和热传感器就形成了热控制单元，其可控制DNA检测单元(构成MOSFET传感器)的温度，该温度影响附着在DNA检测单元上的核酸的结构。
可以采用本领域中公知的薄膜型电阻加热器作为加热器。加热器可以通过在微量流体通道的下面、上面或内部沉积与电源相连的金属薄膜来形成。作为热传感器，可以使用产生温控电动势(EMF)的双金属热电偶，电阻温度计或热敏电阻，包括温控电阻材料、IC热传感器、石英温度计等。
实施例2：探针DNA固定的定量化
为了定量化探针DNA的固定，将图3的芯片安装在图1的分子检测组件10的芯片安装区40上，并施加电压。将在5′-端具有取代的硫醇基的合成DNA探针(5′-硫醇-GTTCTTCTCATCATC-3′)分别以20μL，40μL，80μL，及160μL的体积加到样品加载单元20中，并测量电流随时间的变化。
结果示于图16中。如图16所示，随着加到传感器中的探针DNA的量增加，流经传感器漏极与源极之间的电流的下降水平按比例地增加。结果，电流下降水平在20μL探针DNA时为14μA(图16A)，在40μL探针DNA时为17μA(图16B)，在80μL探针DNA时为20μA(图16C)。当大于80μL探针DNA时，电流下降水平不再增加(图16D)。
因此，通过测量流经传感器的门电极的电流水平，可以定量地测量固定在DNA芯片上的探针DNA。探针DNA的定量化提供了DNA芯片中有关与目标DNA的反应的基本数据。
实施例3：探针DNA与目标DNA杂交的定量化
为了定量化探针DNA与目标DNA的杂交，在图3的“实验室”型芯片上施加电压，并依次加载5′-端具有取代硫醇基团的合成DNA探针(5′-硫醇-GTTCTTCTCATCATC-3′)和具有与合成DNA探针互补的序列的目标DNA。然后，测量电流随时间的变化。
将图3的芯片安装在图1的分子检测组件10的芯片安装区40上，并通过施加电压测量流经芯片的电流。下一步，将磷酸盐缓冲溶液注入分子检测组件10的样品加载单元20中。随着磷酸盐缓冲溶液的注入，持续地对电流进行测量。就在加注缓冲液之后，电流水平增加，如图17的标记A所示。下一步，电流水平稳定约30分钟。然后将5′-端具有取代硫醇基团的15个碱基对(bp)的合成DNA(5′-硫醇-GTTCTTCTCATCATC-3′)探针加到样品加载单元20中。加载探针DNA之后，电流水平降低，如图17的标记B所示。这表明，探针DNA已经以自组装的单层固定在图3的由Au制成的门电极150G的表面上。因而，可以原位检测探针DNA的固定。持续观测电流的变化，直至检测到足够的电流降，即大约3小时，然后将去离子水加到相同的加载单元20中，以除去游离的未固定的探针DNA和磷酸盐缓冲液。下一步，通过样品加载单元20提供tris-EDTA缓冲液，并保留约1小时，同时监测电流水平的变化，以便为探针和目标DNA提供最佳的杂交条件。待电流水平降至与图17的标记C相对应的水平后，将与探针DNA互补的目标DNA加到样品加载单元20中，然后测量电流水平。如图17所示，将目标DNA加到芯片中之后，芯片的电流水平下降了。因而，可以原位检测目标DNA与探针DNA之间的杂交。
<工业实用性>
将本发明的分子检测芯片设计成微量流体通道侧壁上具有MOSFET，因此可以在提高检测灵敏度的同时，将分子检测芯片高度集成。另外，探针以自组装的单层直接固定在门电极的表面上，这使分子检测芯片可以检查探针的固定以及目标分子与探针的原位偶联。固定成自组装的单层的探针提供了具有高度再现性的稠密和稳定的偶联结构。为了检测另一样品，所固定的探针可以很容易地分离。该分子检测装置提供可靠的检测结果，并且可以通过选择性地使用适宜的探针检测各种目标分子。
根据本发明，可以利用构建在生物芯片上的MOSFET传感器，定量地测量固定在该生物芯片上的探针。另外，还可以定量地测量探针与目标样品的结合。对于DNA芯片，可以利用MOSTET传感器同时准确测量探针DNA的固定及其与目标DNA的杂交。因此，可以在不增加制造成本的情况下制造商用的DNA芯片。
另外，根据本发明，加热器、热传感器和DNA传感器均构建在微量流体通道中，因此可以实时地检测基于温度的核酸变性。可以有效地检测多种类型的核酸突变，特别是单核苷酸多态性(SNP)。
检测变性DNA序列的传统方法需要单独的设备以及根据温度分离DNA螺旋并检测的机械用具。利用传统方法难于检测通过准确和精密的温度控制而分离的DNA。根据本发明，热控制与检测单元布置在微量流体通道中，所以，仅需将DNA样品注入微量流体通道中并通过准确和精密地调节温度就可以实时地检测DNA突变。整个微量流体通道中的温度分布更均匀，从而提高了检测结果的可靠性。

Claims (20)

1.一种分子检测芯片，其包括：
半导体基材；
作为分子样品的流动通路并形成于半导体基材中的微量流体通道，及
位于微量流体通道侧壁上的金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)。
2.权利要求1的分子检测芯片，其中所述MOSFET的门电极是由薄的金(Au)层形成的。
3.权利要求2的分子检测芯片，其中硫醇取代的探针以自装配的单层固定在门电极的表面。
4.权利要求1的分子检测芯片，其中所述分子样品包括核酸，蛋白质，酶底物，佐剂，或者寡糖。
5.权利要求4的分子检测芯片，其中所述核酸包括单链脱氧核糖核酸(DNAs)，单链核糖核酸(RNAs)，或者单链肽核酸(PNAs)。
6.权利要求4的分子检测芯片，其中所述蛋白质包括细胞膜受体激动剂，细胞膜受体拮抗剂，毒素，病毒表位，激素，肽，酶，或者单克隆抗体。
7.一种制备分子检测芯片的方法，该方法包括：
在半导体基材的表面形成氧化物层；
通过蚀刻半导体基材的表面，形成至少具有一个凸钝角的微量流体通道；
通过用杂质离子参杂微量流体通道的侧壁，形成杂质扩散区；
利用蚀刻溶液蚀刻形成于微量流体通道侧壁上的杂质扩散区的一个部分，从而界定金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)的通道区；
在通道区上形成氧化物层；及
利用金(Au)在通道区上形成门电极。
8.权利要求7的方法，其中所述通道区的界定是通过沿至少一个凸钝角选择性地蚀刻杂质扩散区来进行的。
9.权利要求7的方法，其中在通道区的界定中，蚀刻的终止点是通过测量电流水平随施加到半导体基材上的反向偏压的变化而确定的。
10.一种分子检测装置，其包括：
基材；
形成于基材表面的分子样品加载单元；
至少一个微量流体通道，其具有与分子样品加载单元相连的一端，并且用作分子样品的流动通路；及
金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)传感器，其与微量流体通道的另一端相连，而且其上面固定了分子探针。
11.权利要求10的分子检测装置，其中所述金属氧化物硅场效应晶体管传感器是利用权利要求1～6中任一项的分子检测芯片来实现的。
12.一种用于鉴定分子探针的固定的方法，该方法包括：
将分子探针提供给权利要求10或11的分子检测装置的分子样品加载单元；
通过使分子探针沿微量流体通道移动，将分子探针固定在金属氧化物硅场效应晶体管传感器的门电极的表面上；及
测量门电极的电流-电压特性。
13.一种用于鉴定分子探针与目标分子样品结合的方法，该方法包括：
(a)将分子探针提供给权利要求10或11的分子检测装置的分子样品加载单元；
(b)通过使分子探针沿微量流体通道移动，将分子探针固定在金属氧化物硅场效应晶体管传感器的门电极的表面上；
(c)测量门电极的电流-电压特性；
(d)将目标分子样品加到分子样品加载单元中；
(e)通过使目标分子样品沿微量流体通道移动，将目标分子样品结合在固定于金属氧化物硅场效应晶体管传感器的门电极表面上的分子探针上；及
(f)测量门电极的电流-电压特性，并将测量结果与在步骤(c)中测量的电流-电压特性进行比较。
14.权利要求13的鉴定方法，其中对探针核酸与目标核酸的杂交进行定量测量。
15.一种检测核酸突变的装置，其包括：
基材；
形成于基材表面的样品加载单元；
用作样品流动通路的、与样品加载单元直接相连的微量流体通道；及
至少一个形成于微量流体通道中的热控制和检测单元，其包括用于核酸固定的金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)传感器，加热器，及热传感器。
16.权利要求15的核酸突变检测装置，其中所述金属氧化物硅场效应晶体管传感器是利用权利要求1～6中任一项的分子检测芯片来实现的。
17.权利要求15的核酸突变检测装置，其中所述加热器和热传感器与金属氧化物硅场效应晶体管传感器相邻，并且用来控制对于核酸在金属氧化物硅场效应晶体管传感器上的固定而言是十分重要的温度，而所述金属氧化物硅场效应晶体管传感器则用于在所固定的核酸的解链温度Tm时检测变性的或复性的双链核酸。
18.一种检测核酸突变的方法，该方法包括：
将单链核酸探针固定在金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)传感器的门电极的表面上；
将对所固定的单链核酸探针产生响应的目标核酸注入样品加载单元中，并沿微量流体通道将目标核酸移动至金属氧化物硅场效应晶体管传感器；
使目标核酸与固定在金属氧化物硅场效应晶体管传感器上的单链核酸探针杂交；
逐步升高温度，以将杂交的双链核酸分离成两个单链；及
测量金属氧化物硅场效应晶体管传感器的门电极的电流-电压特性。
19.一种检测核酸突变的方法，该方法包括：
将单链核酸探针固定在金属氧化物硅场效应晶体管(MOSFET)传感器的门电极的表面上；
将对所固定的单链核酸探针产生响应的目标核酸注入样品加载单元中，并沿微量流体通道将目标核酸移动至金属氧化物硅场效应晶体管传感器；
保持目标核酸与单链核酸探针不发生杂交的温度；
逐步降低温度，以使单链核酸复性成杂交的双链核酸；及
测量金属氧化物硅场效应晶体管传感器的门电极的电流-电压特性。
20.权利要求18或19的方法，其中对核酸的单核苷酸多态性进行检测。
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