DE10328624A1

DE10328624A1 - Verfahren zur Hybridisierung

Info

Publication number: DE10328624A1
Application number: DE10328624A
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Kirchner; Christoph Dr. Gauer
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Advalytix AG
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2005-01-20

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung, bei dem zumindest ein Bereich auf einem Substrat, der zur Hybridisierung funktionalisiert ist, mit einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht wird, die Moleküle enthält, deren Hybridisierungsverhalten mit dem zumindest einen funktionalisierten Bereich untersucht werden soll. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, die Höhe der Hybridisierungslösung über dem funktionalisierten Bereich derart einzustellen, daß sie größer oder gleich der Diffusionslänge der Hybridisierungsmoleküle in der Hybridisierungslösung während der Reaktionszeit ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung, bei dem zumindest ein Bereich auf einem Substrat, der zur Hybridisierung funktionalisiert ist, mit einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht wird, die Moleküle enthält, deren Hybridisierungsverhalten mit dem zumindest einen funktionalisierten Bereich untersucht werden soll.

Zum Beispiel bei der Untersuchung von biologischem Material werden heutzutage oftmals Microarrays eingesetzt. Derartige Microarrays sind auf einem Substrat, z. B. einem Mikroskop-Objektträger gebildete Spots in regelmäßiger Anordnung. Die einzelnen Spots sind für Hybridisierungsreaktionen funktionalisiert. Dazu befinden sich an den Spots Fängermoleküle, z. B. cDNA, DNA-Stränge, Oligonukleotide, PCR-Produkte (Polymerase-Chain-Reaction). Die Spots haben in der Regel einen Durchmesser von 80 μm bis 150 μm, wobei der Abstand zweier benachbarter Spots in etwa 150 μm bis 250 μm beträgt. Die Spots können auf dem Substrat z. B. mit Hilfe herkömmlicher „Spotter" aufgebracht werden.

Derartige Microarraytechnologie ist z. B. in M. Schena und R. W. Davis (1999) „Genes, Genomes and Chips" in „DNA-Microarrays – A Practical Approach", Editor: M. Schena, Oxford University Press, beschrieben. Ein Microarray wird in der Regel mit einem (Mikroskop-)Deckglas abgedeckt, so daß sich ein Spalt zwischen Substrat und Deckglas bildet. Zwischen Substrat und Deckglas wird eine Hybridisierungslösung eingebracht, die Material enthält, das mit einzelnen oder mehreren der funktionalisierten Spots Hybridisierungsreaktionen eingehen kann. Zum Beispiel nach einem Waschschritt verbleiben an den funktionalisierten Spots hybridisierte Moleküle aus der Flüssigkeit auf dem Substrat zurück, die z. B. in bekannter Weise mit Hilfe von Fluoreszenzmeßmethoden oder anderen detektiert werden können. So ist Information über das Material in der Hybridisierungslösung bzw. über das Hybridisierungsverhalten erhältlich.

Dabei ist das kleine Reaktionsvolumen bei der Hybridisierung z. B. von DNA-Arrays ein Hauptvorteil. Das Volumen der Hybridisierungslösung beträgt etwa 15 μl bis 100 μl. In dem Spalt wird die Flüssigkeit z. B. von Kapillarkräften zusammengehalten, so daß sich auf diese Weise sehr kleine Reaktionsvolumina ausbilden lassen. Die typischen Flächen für solche Reaktionskammern richten sich nach der Größe der verwendeten Deckgläser (z. B. 18 mm × 18 mm, 22 mm × 22 mm, 22 mm × 60 mm). Die sehr geringe Spalthöhe von oftmals unter 50 μm ermöglicht eine relativ hohe Konzentration der zu hybridisierenden Moleküle, wodurch die Reaktion beschleunigt wird und das Reaktionsgleichgewicht sich schnell einstellt. Dennoch ist nur ein geringes Probenvolumen notwendig.

Zwischen den äußeren Spots des Microarrays und der seitlichen Begrenzung der Reaktionskammer gibt es im allgemeinen einen Bereich von 1 mm bis 2 mm Breite, in dem keine Spots liegen, um Randeffekte bei der Hybridisierung zu verhindern. Daraus folgt, daß selbst für ein kleines Microarray von nur 2 × 2 Spots eine Fläche von etwa 1 mm × 1 mm bis 2 mm × 2 mm benötigt wird, wobei die Spalthöhe etwa 50 μm bis 100 μm beträgt. Das Verhältnis von Länge bzw. Breite des Reaktionsvolumens zu seiner Höhe ist somit etwa bei bekannten Verfahren 20 bis 40 : 1. Der Randbereich im Reaktionsfeld ohne Spots dient auch dazu, die Plazierung des Deckgläschens weniger kritisch zu machen, die sonst auf etwa 100 μm genau sein müßte.

Ein vergleichbares Verhältnis von Länge bzw. Breite zu Höhe der Reaktionskammer findet man auch in mikrofluidischen Systemen, in denen ein Hybridisierungsschritt integriert ist. Strukturen von 100 μm Tiefe lassen sich leicht mechanisch durch Fräsen, Hot Embossing, Einbringen eines O-Rings oder einer Silikondichtung mechanisch realisieren. Auch bei einer solchen Geometrie muß ein Randbereich ohne Spots vorgesehen sein, damit Wandeinflüsse unkritisch sind.

Bei der Hybridisierung von doppelsträngigen Nukleinsäuren (PCR-Produkte, genomische DNA), von denen ein Strang gegen gespottete Fängermoleküle hybridisiert werden soll, die in Spots auf Oberflächen angeordnet sind, muß man im Gegensatz zur bei Microarrays gängigen Hybridisierung von cDNA-Molekülen beachten, daß PCR-Produkte doppelsträngig vorliegen. In der Hybridisierungslösung findet daher immer eine Konkurrenzreaktion zur Hybridisierung mit den an der Oberfläche gebundenen Fängermolekülen statt, nämlich die Renaturierung des Doppelstranges in der Lösung. Es kann so immer nur ein Teil der vorhandenen DNA-Moleküle mittels der Fängermoleküle an der Oberfläche binden. Das jeweilige Verhältnis von an der Oberfläche hybridisierenden Molekülen zu in Lösung renaturierenden Molekülen ist dabei abhängig von der jeweiligen Bindungskonstanten, der jeweiligen Konzentration, der Geometrie und der Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion. Da bei DNA-Microarrays auf der Oberfläche oft Oligonukleotide verwendet werden, ist die Bindungskonstante des daran hybridisierten Stranges meist sehr viel kleiner als die des kompletten PCR-Produkts, das man hybridisieren will, da Oligonukleotide etwa zehnmal kürzer als PCR-Produkte sind und somit zehnmal weniger Bindungsstellen aufweisen.

Um den Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuren durch Hybridisierung sensitiver zu machen, sind mehrere Verfahren bekannt. Generell wird hierbei die Reassoziation des Doppelstranges verhindert, verlangsamt oder aber der nicht benötigte Einzelstrang selektiv entfernt. Beispiele für den ersten Fall sind externe zyklische Denaturierung mit stufenweiser Hybridisierung zur Signalanreicherung, Zugabe von Blocking-Molekülen zur Verhinderung der Reassoziation in Lösung oder asymmetrische PCR zur überwiegenden Synthese des gewünschten Stranges während PCR (Erdogan F, Kirchner R, Mann W, Ropers HH, Nuber UA, Nucleic Acids Res. 29 (2001) E36). Im zweiten Fall wird der nicht benutzte Strang entweder enzymatisch abgebaut oder mittels Affinitätsmarkierung und Abtrennung der Reaktion entzogen (Erdogan F, Kirchner R, Mann W, Ropers HH, Nuber UA, Nucleic Acids Res. 29 (2001) E36). Beide Methoden haben den Nachteil, aufwendig und unvollständig zu sein. Zusätzlich verliert man bei jedem zusätzlichen Reaktionsschritt immer auch etwas vom erwünschten Zielstrang.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Hybridisierung anzugeben, bei dem die Hybridisierungsergebnisse verbessert werden.

Erfindungsgemäß wird dazu die Höhe der Hybridisierungslösung über dem zur Hybridisierung funktionalisierten Bereich des Substrates derart eingestellt, daß sie größer oder gleich der Diffusionslänge der Hybridisierungsmoleküle in der Hybridisierungslösung während der Reaktionszeit ist. Mit Reaktionszeit ist im vorliegenden Text die gewählte Experimentierdauer bezeichnet, während der die Hybridisierungslösung mit der Substratoberfläche in Kontakt ist.

Die Hybridisierungsreaktion läuft diffusionskontrolliert ab, so daß die Anzahl der Moleküle entscheidend ist, die in der für die entsprechende Reaktionszeit möglichen maximalen Diffusionsentfernung befindlich sind. Ist die Diffusionslänge größer als z. B. die Höhe der Hybridisierungslösung oberhalb des funktionalisierten Bereiches, so verschlechtert sich die Hybridisierung an der Oberfläche, da das Volumen, aus dem Moleküle in der typischen Reaktionszeit zu dem funktionalisierten Bereich gelangen können, kleiner ist.

Erhöht man jedoch erfindungsgemäß die Höhe der Hybridisierungslösung über dem funktionalisierten Bereich derart, daß sie größer als die oder gleich der Diffusionslänge ist, wird die Hybridisierung an der Oberfläche deutlich begünstigt, da alle Moleküle innerhalb einer Halbkugel des Diffusionsradius um den funktionalisierten Bereich mit den Molekülen auf dem funktionalisierten Bereich binden können. Typische Diffusionslängen z. B. für PCR-Produkte von einigen 100 Basen Länge sind einige 100 μm bis zu wenigen Millimetern bei einer Hybridisierungsreaktionszeit von etwa einer Stunde. Bei längeren Hybridisierungszeiten bzw. kürzeren Molekülen vergrößern sich diese Werte entsprechend. Die Erfinder haben festgestellt, daß man bei einer Hybridisierung mit gleichem Volumen und gleicher Konzentration einmal in der herkömmlichen flachen Geometrie (Fläche im Millimeterbereich, Schichtdicke im Mikrometerbereich) und einmal in einer erfindungsgemäßen Geometrie (Fläche im Millimeterbereich, Schichtdicke im Millimeterbereich) im letzteren Fall deutlich höhere Signale, bzw. Signale bei Konzentrationen, die in der flachen Geometrie nicht nachzuweisen sind, erhält.

Wird die Lösung während der Reaktion aktiv gemischt bzw. in Bewegung gesetzt, so ist der in der Reaktionszeit zurücklegbare Weg der betrachteten Moleküle länger als in einem Fall ohne eine solche aktive Mischung. Der Begriff „Diffusionslänge" soll in einem solchen Fall so verstanden werden, dass er die mittlere Distanz des von den betrachteten Hybridisierungsmolekülen in der Reaktionszeit zurücklegten Weges beschreibt.

Besonders bevorzugt ist die Einstellung der Höhe der Hybridisierungslösung über dem funktionalisierten Bereich etwa so hoch wie die Diffusionslänge in der Hybridisierungslösung. So können einerseits alle überhaupt in der Lösung befindlichen Moleküle den funktionalisierten Bereich in der Reaktionszeit erreichen und andererseits steht die optimale Anzahl Moleküle für die Reaktion zur Verfügung.

Bei einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens werden die Dimensionen des Volumens der Hybridisierungslösung in allen drei Raumrichtungen ausgehend vom Zentrum des funktionalisierten Bereiches bzw. vom Zentrum der von den funktionalisierten Bereichen bedeckten Fläche gleich gewählt. Die optimale Geometrie ist eine Halbkugel, deren Radius in etwa der Diffusionslänge entspricht, wobei der funktionalisierte Bereich im Mittelpunkt der die Halbkugel auf ei ner Seite begrenzenden Kreisfläche ist. Ebenso kann aber auch z. B. eine etwa kubische Geometrie gewählt werden.

Ist die Fläche mit dem einen oder den mehreren funktionalisierten Bereichen größer als die Diffusionslänge, so sollte das Verhältnis von Höhe zu Breite bzw. Länge des Volumens der Hybridisierungslösung zwischen 1 : 1 und 1 : 3 betragen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit mehreren nebeneinander angeordneten funktionalisierten Bereichen in Form eines Microarrays zum Einsatz kommen. Ein Array z. B. aus vier Spots mit einem typischen Spotabstand von 250 μm und einem Durchmesser von 100 μm belegt eine Fläche von 300 μm plus einen Randbereich von zumindest 200 μm, der eine gewisse mechanische Toleranz beim Zusammenbau des Systems gewährleistet. Die Gesamtfläche beträgt somit bei diesem Beispiel 500 μm × 500 μm. Erfindungsgemäß wird die Höhe des Volumens bei einem solchen Beispiel zu 500 μm gewählt und nicht zu 50 μm bis 100 μm, wie bei bekannten Verfahren.

Sollen größere Microarrays untersucht werden, werden diese vorteilhafterweise in kleinere Subarrays unterteilt, die getrennt untersucht werden und die Möglichkeit bieten, daß das Volumen der Hybridisierungslösung oberhalb des zu untersuchenden Subarrays in allen drei Raumrichtungen in etwa der Diffusionslänge der Moleküle in der betrachteten Hybridisierungslösung während der Reaktionszeit entspricht. Eine solche Verfahrensführung bietet den weiteren Vorteil, daß die Distanz, die ein bestimmtes Molekül in der Hybridisierungslösung zurücklegen muß, um zu seinem Bindungspartner auf einem funktionalisierten Bereich zu gelangen, kürzer ist als im Fall des größeren Gesamtarrays. Zum Beispiel bei der vorteilhaften Anwendung für PCR-Produkte bedeutet das, daß die Bindung der PCR-Produkte an der Oberfläche gegenüber einer spezifischen Bindung mit dem Komplementären in der flüssigen Phase begünstigt wird.

Die optimale Größe der einzelnen Subarrays wird abhängig von der Diffusionslänge der betrachteten Moleküle, der Größe der funktionalisierten Bereiche, der Anzahl der funktionalisierten Bereiche, der Distanz zwischen den einzelnen funktionalisierten Bereichen, der Zahl der Bindungsstellen in einem funktionalisierten Bereich und von der Konzentration des PCR-Produkts in der Lösung gewählt und kann z. B. empirisch bestimmt werden.

Bei einer besonders günstigen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Hybridisierungsvolumen durch Deckel und/oder Wände begrenzt, die zusätzlich zu den funktionalisierten Bereichen auf dem Substrat ebenfalls mit funktionalisierten Bereichen versehen sind, um die durchschnittliche Entfernung der Moleküle in der Hybridisierungslösung zu den einzelnen funktionalisierten Bereichen zu minimieren und die Hybridisierung so weiter effizienter zu machen.

Bei einer besonderen Verfahrensführung wird die Hybridisierungslösung in Form eines freien Tropfens auf eine Oberfläche mit einem oder mehreren funktionalisierten Bereichen gebracht, der z. B. durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird. Gegen Verdampfung kann ein solcher Tropfen z. B. mit Öl abgedeckt werden. Ein solcher Tropfen kann entweder nur einen oder eine kleine Anzahl von funktionalisierten Bereichen bedecken. Ein solcher Tropfen, dessen Volumen so eingestellt wird, daß der Radius in etwa der Diffusionslänge entspricht, hat auf der Oberfläche eine Halbkugelform. Zudem sind unerwünschte Randeffekte reduziert, da die Begrenzung der Hybridisierungslösung durch Luft bzw. eine Ölschicht gebildet wird und keinen Festkörper umfaßt.

Besonders vorteilhaft kann das Verfahren zur Untersuchung von PCR-(Polymerase-Chain-Reaction)-Produkten oder genomischer DNA eingesetzt werden.

Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden anhand der beiliegenden Figuren im Detail erläutert. Dabei zeigt in schematischer und nicht notwendigerweise maßstabsgetreuer Darstellung:
1: einen Aufbau zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem vergrößerten Ausschnitt,
2: einen anderen Aufbau zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, und
3: einen weiteren Aufbau zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
1 zeigt einen experimentellen Aufbau zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Auf einem Mikroskop-Slide 1 befinden sich in herkömmlicher Weise aufgebrachte Spots 9, die mit Fängermolekülen funktionalisiert sind, die eine Hybridisierungsreaktion eingehen können. Die Anordnung dieser Spots 9 ist in Form eines regelmäßigen Microarrays z. B. mit einem Abstand p von 250 μm und einem Durchmesser d von 100 μm, wie es in dem vergrößerten Bereich der 1 angedeutet ist. Die Spots 9 befinden sich in einem Bereich 3 mit Randbereichen 5 und bilden ein entsprechendes Reaktionsfeld.
Oberhalb des so gebildeten Microarrays befindet sich ein Deckgläschen 7 in einem Abstand S. Zwischen dem Mikroskop-Slide 1 und dem Deckgläschen 7 befindet sich die Hybridisierungslösung, die hier der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist. Entweder wird diese durch ihre Kapillarkräfte zusammengehalten oder durch entsprechende Begrenzungen, die in 1 ebenfalls nicht dargestellt sind, gehalten. Die Spaltdicke S wird so eingestellt, daß sie in etwa der Diffusionslänge der Moleküle in der zu untersuchenden Hybridisierungslösung während einer typischen Reaktionszeit entspricht. Bei einer besonders vorteilhaften Verfahrensführung ist die Breite bzw. die Länge des Reaktionsvolumens derart gewählt, daß es in allen drei Raumrichtungen in etwa gleich groß ist. So ist einerseits gewährleistet, daß während der typischen Reaktionszeit ein Molekül der Hybridisierungsflüssigkeit von jedem Ort des Hybridisierungsflüssigkeitsvolumens zu jedem Spot 9 gelangen könnte, und andererseits steht für die Reaktion die optimale Anzahl von Molekülen zur Verfügung, nämlich alle Moleküle, die in irgendeiner Raumrichtung maximal eine Diffusionslänge entfernt sind. Zudem ist sichergestellt, daß in allen Raumrichtungen über dem funktionalisierten Bereich Moleküle aus dem Bereich einer Diffusionslänge für eine Reaktion zur Verfügung stehen.
Im Gegensatz dazu stehen bei herkömmlichen Verfahren weniger Moleküle zur Verfügung, da in dem flachen Spalt in der Höhendimension die Diffusionslänge nicht ausgenutzt wird.
Sollen größere Felder von funktionalisierten Bereichen untersucht werden, so empfiehlt es sich, diese Felder in einzelne Subarrays aufzuteilen, wie es in 2 schematisch angedeutet ist. Die einzelnen Subarrays werden behandelt wie das Microarray der 1. Auf einzelnen Slides 10 sind wiederum funktionalisierte Bereiche 9 aufgebracht, die unterschiedlich sein können. Deckgläschen 70 sind wiederum im Abstand von zumindest einer Diffusionslänge von den Slides 10 entfernt angeordnet. Auch in 2 sind entsprechende Halterungen und seitliche Begrenzungen nicht gezeigt. Ein beispielhaft gezeigtes Molekül 11 zwischen dem Slide 10 und dem Deckgläschen 70 kann während der typischen Reaktionszeit von jedem beliebigen Ort des Hybridisierungsvolumens zu jedem Spot 9 gelangen. Auf diese Weise können mehrere Subarrays anstelle eines großen Arrays untersucht und parallel behandelt werden.
3 zeigt eine Geometrie für eine Verfahrensführung, bei der auch das Deckgläschen als Substrat 1 ausgebildet ist und Spots 9 eines entsprechenden Microarrays enthält. Ein beispielhaft gezeigtes Molekül 11 kann während der typischen Reaktionszeit zu jedem Spot 9 gelangen. Durch die zusätzliche Anordnung von entsprechend funktionalisierten Spots 9 sowohl an dem Substrat als auch an den Deckgläschen wird die Anordnung kompakter und die Anzahl der Hybridisierungsspots 9 kann dennoch groß gehalten werden.
Mit der erfindungsgemäßen Änderung der Geometrie des Hybridisierungsvolumens kann eine deutliche Verbesserung der Hybridisierungsergebnisse erreicht werden. Die Wahl der Höhe des Hybridisierungsvolumens derart, daß sie größer oder gleich der Diffusionslänge ist, begünstigt die Hybridisierung an der Oberfläche deutlich, da alle Moleküle innerhalb einer Halbkugel des Diffusionsradius um den funktionalisierten Spot mit Molekülen auf dem Spot binden können.
Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren für PCR-Produkte anwenden.

Claims

Verfahren zur Hybridisierung, bei dem zumindest ein Bereich auf einem Substrat, der zur Hybridisierung funktionalisiert ist, mit einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht wird, die Hybridisierungsmoleküle enthält, deren Hybridisierungsverhalten mit dem zumindest einen funktionalisierten Bereich untersucht werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß die Höhe (S) der Hybridisierungslösung über dem zumindest einen funktionalisierten Bereich (3, 9) derart eingestellt wird, daß sie größer oder gleich der Diffusionslänge der Hybridisierungsmoleküle (11) in der Hybridisierungslösung während der Reaktionszeit ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form des Volumens der Hybridisierungslösung derart eingestellt wird, daß sich die Hybridisierungslösung in allen drei Raumrichtungen etwa gleich weit vom Zentrum des funktionalisierten Bereiches (9) bzw. vom Zentrum der von den funktionalisierten Bereichen bedeckten Fläche (3) erstreckt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen der Hybridisierungslösung etwa die Form einer Halbkugel aufweist, deren Radius etwa der Diffusionslänge während der Reaktionszeit entspricht, und der funktionalisierte Bereich (9, 3) bzw. die funktionalisierten Bereiche im Zentrum der Grundfläche der Halbkugel angeordnet ist bzw. sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere funktionalisierte Bereiche (9) in Form eines Arrays (3) mit der Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Microarray funktionalisierter Bereiche (9) eingesetzt wird und das Microarray in mehrere Subarrays aufgeteilt wird, die mit einzelnen Hybridisierungslösungsvolumina in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Flüssigkeitsvolumen von einem Spalt oberhalb des zumindest einen funktionalisierten Bereiches (3, 9) begrenzt wird, dessen Höhe (S) größer oder gleich der Diffusionslänge in der Reaktionszeit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridisierungslösungsvolumen zusätzlich zu dem Substrat (1) von einer oder mehr Begrenzungsflächen eingegrenzt wird, die ebenfalls mit funktionalisierten Bereichen (9) versehen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridisierungslösungsvolumen ein durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltener Tropfen auf der Oberfläche des Substrates ist.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Untersuchung von Hybridisierungsreaktionen von PCR-(Polymerase-Chain-Reaction)-Produkten oder genomischer DNA.