CN107614108B - 使用集成阵列对核酸杂交热力学的多路分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在包含与固体表面附接的核酸探针的可寻址阵列的单个样品室中同时鉴别多个靶核酸序列的方法和装置。在系统的温度变化时，可在靶序列在阵列内的单个探针位置杂交后，实时生成并测量可寻址信号。这样生成的信号作为温度的函数随后可用于计算每个可寻址位置处的核酸杂交的性质，该可寻址位置最终用于估计靶核酸的序列。特别地，可使用集成半导体生物传感器阵列装置来测量可寻址信号。

Description

使用集成阵列对核酸杂交热力学的多路分析
交叉引用
本申请要求于2015年3月23日提交的美国专利申请号14/665,904的权益，该申请通过引用而整体并入本文。
背景技术
DNA-DNA杂交是测量脱氧核糖核酸(DNA)聚合物(多核苷酸)之间的序列相似性程度的分子生物学技术。其基本原理是DNA聚合物的结构单元，即核苷酸，包括能够与互补核碱基配对(A与T，和C与G)以形成氢键(A-T之间为两(2)个，而C-G之间为三(3)个)的特定含氮核碱基(鸟嘌呤“G”、腺嘌呤“A”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)。因此，具有互补序列的DNA部分具有彼此以及与DNA二聚体(双链DNA结构)结合(杂交)的亲和力。热力学特征杂交主要取决于DNA部分之间形成的氢键的总数和强度；即作为多个参数的函数的量，所述参数例如是互补核碱基(碱基)段、非互补间隙以及环境中阴离子和阳离子的浓度和种类。
DNA-DNA杂交的热力学特征是推断关于参与部分的序列信息的有力工具。提取此类信息的“黄金标准”方法是检测逐渐加热过程中双链和杂交DNA二聚体的解离特性的解链曲线分析(MCA)。随着温度升高，DNA-DNA复合物(通过多个氢键装配)变得较不稳定，并且链开始解离。因此，通过监测相对于温度杂交复合物的浓度，可评估作为温度的函数的复合物稳定性，并将其与靶序列(和氢键)中的改变相关联，并且例如鉴别单核苷酸多态性(“SNP”)或插入/缺失(“插入缺失”)。
发明内容
本文意识到与当前和先前的MCA技术相关的各种限制。起初，使用UV吸光度测量使得MCA成为可能(Ansevin等人,Biopolymers,1976)；然而，基于使用例如脱氧核糖核酸(DNA)嵌入荧光团如SYBR Green的荧光测量的技术在现今更常见(Wittwer C.T.等人,BioTechniques,22:130-138,1997；Ririe K.M.等人,Anal.Biochem,245:154-160,1997；Lipsky,R.H.等人,Clin.Chem.47:635-644,2001；以及Wittwer C.T.等人，US 7,785,776)。
虽然基于MCA的方法提供了测量杂交热力学的方法，但它们具有非常有限的多路化能力，即在单个反应室中分析多个同时发生的DNA杂交反应的能力。在例如嵌入染料的情况下，所测得的荧光信号基本是源于反应室中的单个杂交事件的所有信号的集合，因此当DNA部分具有相似的热力学特征时，或者当一个部分与其他部分相比具有显著更大的浓度和信号时，难以进行解读(decipher)。
在恒定温度下检测DNA杂交的水平也在鉴别特定序列中使用。DNA微阵列平台(有时称为基因芯片)通常基于该原理而运行(Schena M.,Shalon D.,Davis R.W.,Brown P.O.“Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray,”Science 2701995；(5235):467–470；以及Stoughton RB,“Applications ofDNA microarrays in biology,”Annu Rev Biochem.2005；74:53-82)。微阵列的优点是它们使用DNA杂交热力学以大规模平行的方式鉴别序列。然而，它们缺乏MCA方法的特异性。这是根本性的限制，其根源在于这样一个事实，即微阵列可在洗涤和成像之前在单个温度点(即样品在阵列上温育固定时间段的温度)测量杂交。虽然来自微阵列的数据仍可用于鉴别SNP或插入缺失，但其在热力学方面并不深入。一般来说，对于可在单个温度点在核酸靶标之间适当区分的微阵列，设计大量固定化探针也是困难的。当靶标的CG含量具有较大变化(>20％)或当靶标包含高度稳定的发夹单体结构时，这个问题变得尤其具有挑战性。
杂交的热力学测量可能涉及在杂交反应达到平衡后形成的杂交复合物的解离热力学性质的分析。在一些实例中，通过记录与杂交复合物的存在或不存在相关联的作为温度的函数的发射信号强度来进行热力学测量。热力学测量可能涉及杂交复合物的稳定性。这样的测量可适用于处于稳定或亚稳定平衡的系统。
相比之下，杂交的动力学测量可能涉及杂交反应的动力学分析，并且可通过记录在恒定温度下作为时间的函数的与杂交复合物的存在或不存在相关的发射信号强度来实现。动力学测量可涉及探针和核酸靶标形成杂交复合物的反应性。这样的测量可适用于处于从不平衡到平衡的过渡期的系统。
本发明提供了实时测量在单个反应室中同时发生的多个核酸杂交反应的热力学特性的方法、装置和系统。本文提供的各个实施方案可用于为诸如分子诊断、核酸(例如，DNA)鉴证和病原体基因型分型等应用创建独特的核酸检测平台。提供了可利用半导体集成生物传感器阵列来将所需的检测装置小型化和集成的其他实施方案。
本发明的一个方面提供了用于测定样品中是否存在靶核酸分子的方法，该方法包括(a)提供包含邻近样品室的集成传感器的芯片，其中所述样品室被配置为保持具有所述靶核酸分子的所述样品，并且其中所述集成传感器(i)具有包含选择性地与所述靶核酸分子偶联的探针的表面，以及(ii)检测来自所述样品的至少一种信号，该至少一种信号指示所述靶核酸分子的存在或不存在；(b)在允许所述探针选择性地与所述靶核酸分子偶联的条件下在所述样品室中提供所述样品；(c)当所述样品在所述样品室中时，使所述表面经受温度变化；(d)在使所述表面经受所述温度变化时，实时测量所述至少一种信号；以及(e)使用所述至少一种信号随所述温度变化的测量值生成信号相对于温度的数据。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述探针为寡核苷酸。在本文提供的方面的一些实施方案中，在允许所述寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交的条件下，在所述样品室中提供所述样品。在本文提供的方面的一些实施方案中，当与所述寡核苷酸杂交时，所述靶核酸分子的序列形成发夹环结构。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述集成传感器在所述芯片中的多个集成传感器的阵列中。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述阵列包含至少约100个集成传感器、至少约500个集成传感器、至少约1,000个集成传感器、至少约2,000个集成传感器、至少约5,000个集成传感器或至少约10,000个集成传感器。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一种信号选自光信号、电化学信号和静电信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一种信号为指示能量受体和能量供体对之间相互作用的光信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量受体猝灭所述能量供体的光活性。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量受体与所述靶核酸分子的一个或多个核苷酸偶联。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量受体为猝灭剂。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量供体与所述探针偶联。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量供体为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述相互作用不是福斯特共振能量转移(Forster resonance energy transfer，FRET)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一种信号为指示光学活性种类的活性的光信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述光学活性种类为嵌入剂。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述光学活性种类为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述检测包括测量所述至少一种信号相对于背景的增强。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述检测包括测量所述至少一种信号相对于背景的减弱。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述集成传感器进一步包括光检测器，并且在(d)中，采用所述光检测器测量所述至少一种信号。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述样品包含多种靶核酸分子。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述集成传感器为多个集成传感器的阵列的一部分，每个所述集成传感器检测所述多种靶核酸分子中的至少一种。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述芯片包含一个集成传感器和附加集成传感器，并且所述样品包含一种靶核酸分子和附加靶核酸分子，而所述附加集成传感器检测所述附加靶核酸分子。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述附加集成传感器包含选择性地与所述附加靶核酸分子偶联的附加探针。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述附加集成传感器检测指示所述附加靶核酸分子的存在或不存在的至少一种附加信号。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量受体为猝灭剂。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述能量供体为荧光团。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述探针经由连接体固定到所述表面上。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述连接体包含选自氨基酸、多肽、核苷酸和寡核苷酸的种类。
在本文提供的方面的一些实施方案中，当包含所述靶核酸分子的所述样品与所述芯片流体接触时，检测所述至少一种信号。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一种信号包括多种信号。所述多种信号可处于多个时间点和/或多个温度下。例如，可以以作为时间的线性或非线性函数的速率来改变温度，并可测量信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述温度变化是从第一温度到大于所述第一温度的第二温度。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述信号相对于温度的数据是解链曲线的一部分。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述光检测器包括互补金属氧化物半导体(CMOS)集成电路(IC)器件。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在(a)之前，(i)提供包含具有作为所述靶核酸分子的前体的模板核酸分子的生物样品、与所述模板核酸分子互补的至少一种引物以及聚合酶的反应混合物，以及(ii)在所述样品中产生所述靶核酸分子的条件下使所述反应混合物进行核酸扩增反应。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一种引物具有被选择用于鉴别所述靶核酸分子的序列中的单核苷酸多态性(SNP)的序列。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核酸扩增为聚合酶链反应(PCR)。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述核酸扩增为不对称核酸扩增。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述芯片与计算机处理器电耦合，所述计算机处理器从所述集成传感器电接收所述至少一种信号，并从所述至少一种信号确定所述靶核酸分子的存在或不存在。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述计算机处理器生成所述信号相对于温度的数据。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括在电子报告上输出所述信号相对于温度的数据。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述电子报告在用户的电子设备的用户界面上输出。在本文提供的方面的一些实施方案中，在(c)中，所述表面以约1℃/min至约20℃/min的平均速率经受所述温度变化。在本文提供的方面的一些实施方案中，在(c)中，与所述表面热连通的温度控制器使所述表面经受所述温度变化。
在本文提供的方面的一些实施方案中，当所述至少一种信号指示所述靶核酸分子的存在时，所述靶核酸分子以至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约99.99％的灵敏度进行检测。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括使用所述信号相对于温度的数据确定所述靶核酸分子的序列中的单核苷酸多态性(SNP)。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述芯片进一步包含不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括测量与所述对照探针相关联的至少一种对照信号或多种对照信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，将所述信号相对于温度的数据相对于所述至少一种对照信号的测量值进行归一化。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述芯片包含附加集成传感器，并且所述样品包含附加靶核酸分子，而所述附加集成传感器检测所述附加靶核酸分子。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述集成传感器进一步包含在所述表面下方的发射层和在所述发射层下方的光检测器，并且在步骤(d)中，所述光检测器测量在通过所述发射层透射(transmission)后来自所述样品的至少一种信号。
集成传感器可包含与具有探针的表面集成的检测器(例如，光检测器)，所述探针例如是选择性地与靶核酸分子杂交的探针或不与靶核酸分子选择性杂交的对照探针。在一些实例中，集成传感器包含作为单个单元的所述检测器和所述表面。
本发明的另一个方面提供了用于测定样品中是否存在靶核酸分子的方法，该方法包括(a)使具有至少一个集成传感器的杂交阵列经受温度变化，(b)在多个温度点测量来自具有所述至少一个集成传感器的所述杂交阵列的信号，以及(c)通过评估所述靶核酸分子在所述温度变化期间的所述多个温度点的解离特性，以至少约90％的灵敏度测定所述靶核酸分子的存在。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述灵敏度为至少约95％。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述杂交阵列具有多个集成传感器。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述至少一个集成传感器为光学传感器。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述杂交阵列包含第一集成传感器和第二集成传感器，而所述靶核酸分子包含第一靶核酸分子和第二靶核酸分子。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述第一集成传感器测量与所述第一靶核酸分子相关联的信号，而所述第二集成传感器测量与所述第二靶核酸分子相关联的信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述杂交阵列进一步包含对照传感器，所述对照传感器具有不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述方法进一步包括(i)在所述多个温度点采用所述对照传感器测量对照信号，以及(ii)评估所述靶核酸分子在所述多个温度点相对于所述对照信号的解离特性。
本发明的另一个方面提供了用于测定样品中是否存在靶核酸分子的系统，该系统包含：包含邻近样品室的集成传感器的芯片，其中所述样品室被配置为保持具有所述靶核酸分子的所述样品，并且其中所述集成传感器(i)具有包含选择性地与所述靶核酸分子偶联的探针的表面，以及(ii)检测来自所述样品的至少一种信号，该至少一种信号指示所述靶核酸分子的存在或不存在；计算机处理器，其与所述芯片耦合，并被编程用于(i)当所述样品在所述样品室中时，使所述表面经受温度变化；(ii)在使所述表面经受所述温度变化时测量所述至少一种信号；以及(iii)使用所述至少一种信号随所述温度变化的测量值生成信号相对于温度的数据。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述集成传感器在所述芯片中的多个集成传感器的阵列中。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述芯片进一步包含邻近所述样品室的对照传感器。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述对照传感器包含不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述对照传感器检测至少一种对照信号。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述计算机处理器进一步被编程用于(iv)在使所述对照探针经受所述温度变化时测量所述至少一种对照信号，以及(v)将所述信号相对于温度的数据相对于所述至少一种对照信号的测量值进行归一化。在本文提供的方面的一些实施方案中，芯片包含附加集成传感器，并且所述样品包含附加靶核酸分子。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述附加集成传感器检测指示所述附加靶核酸分子的存在的至少一种附加信号。
在本文提供的方面的一些实施方案中，所述阵列包含至少约100个集成传感器、至少约500个集成传感器、至少约1,000个集成传感器、至少约2,000个集成传感器、至少约5,000个集成传感器或至少约10,000个集成传感器。在本文提供的方面的一些实施方案中，所述阵列的单个集成传感器是可单独寻址的。
根据其中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案的以下详细描述，本发明的附加方面和优势将对本领域技术人员变得显而易见。如将认识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本发明。因此，附图和描述在本质上被认为是说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1示出了多路分析系统的示例性示意图；
图2示出了涉及能量供体和能量受体的探针和靶标相互作用的示例性示意图；
图3示出了涉及嵌入剂的探针和靶标相互作用的示例性示意图；
图4示出了涉及标记的靶标的探针和靶标相互作用的示例性示意图；
图5示出了解链曲线分析的示例性示意图；
图6示出了生物传感器阵列的示例性图像和示意图；
图7示出了生物芯片阵列电路的示例性示意图；
图8A示出了生物芯片阵列的示例性图像；
图8B示出了温度控制和解链曲线分析的示例性曲线图；
图8C示出了示例性的探针和靶序列；
图9示出了解链曲线分析的示例性曲线图以及示例性的探针和靶序列；
图10A示出了解链曲线分析的示例性曲线图；
图10B示出了示例性的荧光团-猝灭剂靶标和探针序列；以及
图11示出了被编程或以其他方式配置用于实现本文提供的方法的计算机控制系统的示例性示意图。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案均可使用。
如本文所用的术语“探针”通常是指可与特定靶核酸序列结合的分子种类或其他标志物。探针可以是任何类型的分子或颗粒。探针可包含分子，并且可直接或经由连接体分子与基底或其他固体表面结合。
如本文所用的术语“检测器”通常是指通常包含可检测信号的光学和/或电子组件的装置。
如本文所用的术语“突变”通常是指基因突变或序列变异，诸如点突变、单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、取代、转座、易位、拷贝数变异，或另一种基因突变、改变或序列变异。
如本文所用的术语“约”或“近”通常是指在指定量的+/-15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内。
如本文所用的术语“标记物”是指可与靶分子附接，以使得通过提供靶分子不固有的独特特征来使靶分子可区分且可追踪的特定分子结构。
如本文所用的术语“发夹”通常是指展现出被称为“环”的单链区域和被称为“茎”的双链区域的核酸(例如，脱氧核糖核酸)链。术语“发夹环结构”是指由共价连接的互补多核苷酸的杂交形成的分子茎和环结构。茎包含杂交的多核苷酸，而环是共价连接两个互补多核苷酸的区域。
如本文所用的术语“灵敏度”通常是指通过将正确鉴别的靶标的数目除以样品中存在的靶标总数而计算的测定(例如，方法、测试)的性能的统计量度。换句话说，本发明的灵敏度是指某测定正确地鉴别样品中所有靶核酸分子的能力。
本发明提供了能够实时地并且随着温度变化对核酸杂交反应进行多路检测的方法、装置和系统。本发明的方法、装置和系统可包含的组件包括但不限于：
1.样品室，其可包括存在待分析的多种自由移动的核酸靶标的水环境；
2.探针阵列，其可在固体表面上独立(或单独)可寻址的位置处包含多个核酸探针。探针阵列可与样品室接合。每个可寻址的位置(本文称为“像素”)可包含可特异性地与特定靶标杂交的多个相同的核酸序列(本文称为“探针”)；
3.温度控制器，其可测量样品室的温度并将该温度调节到预定值或特定值之间；以及
4.检测器，其可平行地测量在每个像素处生成的信号。随着杂交事件作为温度的函数进行，信号可与其附近的分子标记物的存在和活性相关。信号可以是离散的(例如，可单独解析的)信号。
探针阵列可包括各自具有一个或多个探针的可独立寻址的位置。阵列的给定可独立寻址位置处的探针可与阵列的其他可独立寻址位置处的探针不同。在一些情况下，阵列的一组位置的探针是相同的。该组位置的探针可与阵列的所有其他位置的探针不同。
本发明的方法、装置和系统可使用组装在一起的上述组件的变型来产生能够平行测量核酸杂交反应的系统。图1示出了多路分析系统的示例。核酸处于样品室(或反应室)中，其中它们可通过扩散和漂移过程移动，以与可寻址阵列的单个像素处的探针相互作用，并且如果热力学上有利的话则与所述探针杂交。温度控制器可将反应室的温度设定为各种预定值，以产生杂交事件的不相似和/或时变条件。同时，检测器可实时地并随温度变化测量每个像素处杂交事件的量(或量级)。所获得的数据随后用于评估探针核酸与靶核酸之间的相互作用的热力学特性。
反应室
反应室可包括封闭的储器。反应室可具有约10纳升(nL)至10毫升(mL)的容积。在一些情况下，反应室容积为约1微升(μL)至100μL。反应室容积可以为至少约10nL、100nL、1μL、10μL、100μL、1mL或10mL。
反应室可含有水溶液。反应室内的水溶液可包含基于盐水的缓冲溶液，诸如包含弱酸及其共轭碱的混合物的水溶液，反之亦然。该溶液可包含多种靶核酸序列(本文中称为“靶标”)。在该语境下使用的术语“核酸序列”或“核苷酸序列”是指具有期望了解其存在或量的给定核苷酸序列的核酸分子。核苷酸序列可包括核糖核酸(RNA)或DNA，或来源于RNA或DNA的序列。核苷酸序列的实例是对应于天然或合成的RNA或DNA的序列，包括基因组DNA和信使RNA。序列的长度可以是可扩增为核酸扩增产物或扩增子的任何长度，例如最长约20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、1,000、1,200、1,500、2,000、5,000、10,000个或多于10,000个核苷酸的长度。
在一些情况下，靶标可包括报道分子(本文中称为“标记物”)。标记物可包括一旦与核酸序列附接就提供该核酸分子不固有的独特特征的分子结构。实例为产生独特光学特征的标记物。
在一些实例中，使用光学标记物。光学标记物可用作发挥能量供体或能量受体的作用的单信号生成实体或双分子报道物的一部分。
受体和供体都可以是荧光团分子。荧光团是供体还是受体可基于其激发和发射光谱以及与其配对的荧光团。
能量供体/能量受体荧光团对的实例包括但不限于：青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)；Cy3和Cy5；荧光素和四甲基罗丹明；IAEDANS和荧光素；EDANS和dabcyl；荧光素和QSY 7或QSY 9染料；Alexa Fluor 350和Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 488和AlexaFluor 546、555、568、594或647；Alexa Fluor 546和Alexa Fluor 568、594或647；AlexaFluor 555和Alexa Fluor 594或647；Alexa Fluor 568和Alexa Fluor647；以及AlexaFluor 594和Alexa Fluor 85。
猝灭剂分子可与本发明的方法一起用作双报道物结构的受体。示例性的猝灭剂包括但不限于Black Hole Quencher Dyes(Biosearch Technologies)，诸如BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BHQ-10；QSY染料荧光猝灭剂(来自Molecular Probes/Invitrogen)，诸如QSY7、QSY9、QSY21、QSY35以及其他猝灭剂如Dabcyl和Dabsyl；Cy5Q和Cy7Q和Dark Cyanine染料(GE Healthcare)。可与上述猝灭剂结合使用的荧光团供体分子的实例包括但不限于，荧光剂，诸如Cy3B、Cy3或Cy5；DY-Quenchers(Dyomics)，诸如DYQ-660和DYQ-661；以及ATTO荧光猝灭剂(ATTO-TEC GmbH)，诸如ATTO 540Q、580Q、612Q。猝灭剂可以是受体。
光学标记物还可以是核酸嵌入剂染料(本文中称为嵌入剂)。实例包括但不限于溴化乙锭、YOYO-1、SYBR Green和EvaGreen。能量供体和能量受体之间、嵌入剂和能量供体之间或嵌入剂和能量受体之间的近场相互作用可导致独特信号的生成或信号幅度的变化。例如，这样的相互作用可导致猝灭(即从供体到受体的能量转移，其导致非辐射能量衰减)或福斯特共振能量转移(FRET)(即从供体到受体的能量转移，其导致辐射能量衰减)。
标记物的其他实例包括电化学标记物、静电标记物、比色标记物和质量标签。这样的标记物可与本发明的装置、方法和系统一起使用。
标记物可通过直接附接或通过经由一个或多个连接体(例如连接体分子)的附接而与靶分子偶联。在一些情况下，标记物通过静电相互作用与靶分子偶联，其可能不涉及与靶分子形成共价键。
靶分子(靶标)的标记可使用多种方法进行。在一些实例中，在使用标记的引物的核酸靶标的体外扩增(例如，通过PCR)期间将标记物化学附接。扩增可包括许多不同的分子复制或扩增方法，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、不对称PCR、多重PCR、巢式PCR、热启动PCR、递降PCR、RT-PCR和甲基化特异性PCR。扩增可以是等温的，且化学反应包括但不限于环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)。在扩增过程中，标记的引物被延伸以变成扩增子，导致生成的扩增子(即靶标)被标记。附接和/或缀合这类标记物的方法包括但不限于连接、生物素-链霉亲和素缀合、腙键、胺反应性标记物与氨基烯丙基dUTP的反应以及T4多核苷酸激酶(PNK)。在其他实例中，标记物与用于在扩增过程中生成扩增子的修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)附接。在这样的方法中，一种或多种类型的dNTP的一部分被化学修饰以具有与其附接的标记物，或在dNTP被并入延伸的核酸链之后包含可与标记物附接的化学结合位点。在一些情况下，该标记物为单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)结合分子。
在一些情况下，可通过PCR进行扩增。PCR可依赖于热循环，包括用于多核苷酸解链和多核苷酸的酶促复制的反应的反复加热和冷却的一个或多个循环。含有与靶多核苷酸的靶区域互补的序列的引物(短核酸片段)以及聚合酶(例如DNA或RNA聚合酶)可提供靶多核苷酸的选择性和重复扩增。引物可具有与感兴趣的序列互补的序列，诸如具有突变的序列或已被鉴别为使受试者易患给定疾病(例如癌症)的序列。随着PCR的进行，所生成的多核苷酸自身可用作复制的模板，开始进行靶多核苷酸模板被指数扩增的链式反应。
作为替代方案，扩增可以是不对称PCR，其可优先扩增双链多核苷酸模板中的一条多核苷酸链。该方法可以仅需对两条互补链中的一条进行扩增。在不对称PCR中，如上所述进行PCR，但具有与打算扩增的链互补的序列的引物过量。由于后来在限制性引物耗尽后反应中的缓慢(算数式)扩增，因此可能需要额外的PCR循环。在一些情况下，由于限制性引物浓度减少了中间反应，因此不对称扩增可使用具有比过量引物更高的解链温度(Tm)的限制性引物来维持反应效率。
扩增可以是等温扩增。等温扩增方法的一个实例是链置换扩增，也称为SDA，其可使用下列循环：引物序列对与靶序列的相反链退火，在dNTP的存在下的引物延伸以产生双链半硫代磷酸化引物延伸产物，内切核酸酶介导的半修饰限制性内切核酸酶识别位点的切口(nicking)，以及从切口的3'端开始的聚合酶介导的引物延伸以置换现有的链，并产生用于下一轮引物退火、切口和链置换的链，导致产物的几何扩增。参见例如美国专利号5,270,184和美国专利号5,455,166，每个专利均通过引用而整体并入本文。嗜热SDA(tSDA)可用基本相同的方法在较高温度下使用嗜热内切核酸酶和聚合酶。参见例如欧洲专利号0 684315，其通过引用而整体并入本文。
其他扩增方法的实例包括滚环扩增(RCA)(例如，Lizardi，“Rolling CircleReplication Reporter Systems”，美国专利号5,854,033)；解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如，Kong等人，“Helicase Dependent Amplification Nucleic Acids”，美国专利申请公开号US 2004-0058378A1)；以及环介导的等温扩增(LAMP)(例如，Notomi等人，“Process forSynthesizing Nucleic Acid”，美国专利号6,410,278)，上述各文献均通过引用而整体并入本文。在一些情况下，等温扩增利用通过RNA聚合酶从启动子序列开始的转录，诸如可并入寡核苷酸引物。基于转录的扩增方法可包括基于核酸序列的扩增，也称为NASBA(例如，美国专利号5,130,238)；依赖于使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)来扩增探针分子自身的方法(例如，Lizardi,P.等人(1988)Bio Technol.6,1197-1202)；自主序列复制(例如，Guatelli,J.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878；Landgren(1993)Trendsin Genetics 9,199-202；以及Lee,H.H.等人,Nucleic Acid AmplificationTechnologies(1997))；以及用于产生附加转录模板的方法(例如，美国专利号5,480,784和美国专利号5,399,491)，上述各文献均通过引用而整体并入本文。等温核酸扩增的其他方法包括使用含有非规范核苷酸(例如尿嘧啶或RNA核苷酸)的引物与在非规范核苷酸处切割核酸的酶(例如DNA糖基化酶或RNA酶H)的组合以使附加引物的结合位点暴露(例如，美国专利号6,251,639、美国专利号6,946,251和美国专利号7,824,890)，这些专利均通过引用而整体并入本文。等温扩增过程可以是线性或指数的。
探针阵列
探针可包括沉积的生物材料以产生点阵列。探针可包括根据其他技术合成、沉积或定位以形成阵列的材料。因此，为了方便起见，下文中根据这些技术中任一种形成的微阵列通常可统称为“探针阵列”。术语“探针”不限于以阵列形式固定的探针。相反，还可对于其他平行测定装置使用本文所述的功能和方法。例如，可对于可鉴别固定在珠子、光纤或其他基底或介质之上或之中的探针的探针组标识符来应用这些功能和方法。本文更详细地描述了各种探针阵列的结构。
在一些情况下，探针包含多核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可包括任何长度的核苷酸的聚合形式，该核苷酸或者是核糖核苷酸(RNA)或者是脱氧核糖核苷酸(DNA)。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语可包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。该术语还可包括修饰(诸如通过甲基化和/或通过加帽)，以及未修饰形式的多核苷酸。此外，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、作为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物。核酸可包含磷酸二酯键(即天然核酸)，核酸可包括可具有替代骨架的核酸类似物，该替代骨架包括例如磷酰胺(参见例如Beaucage等人,Tetrahedron 49(10):1925(1993)，和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(参见例如Briu等人,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))、O-甲基亚磷酰胺键(参见例如Eckstein,Oligonucleotides andAnalogues:A Practical Approach,Oxford University Press)以及肽核酸(PNA)骨架和键(参见例如Carlsson等人,Nature 380:207(1996))。核酸可包括其他核酸类似物，包括具有阳性骨架(参见例如Denpcy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995))、非离子骨架(参见例如美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等人,Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger等人,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等人,Nucleoside&Nucleotide 13:1597(1994)；第2章和第3章,ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modifications inAntisense Research”,Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编著；Mesmaeker等人,Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等人,J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖骨架(参见例如美国专利号5,235,033和5,034,506，以及第6章和第7章，ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modificationsin Antisense Research”,Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编著)的核酸类似物。核酸可包含一种或多种碳环糖(参见例如Jenkins等人,Chem.Soc.Rev.(1995)169-176页)。核糖-磷酸骨架的这些修饰可促进标记物的添加，或增加这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
在一些情况下，使用寡核苷酸作为探针。如本文所用的“寡核苷酸”可以包括单链核酸。寡核苷酸可以是2个核苷酸至约1000个核苷酸的长度。寡核苷酸可以是2个核苷酸至约500个核苷酸的长度。寡核苷酸可以是约10个核苷酸至约100个核苷酸的长度。寡核苷酸可以是约20个核苷酸至约50个核苷酸的长度。在本发明的方法、装置和系统中，探针可与固体基底附接。探针可直接或经由连接体与基底结合。连接体可包括例如氨基酸、多肽、核苷酸或寡核苷酸。
固体基底可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或这些的任意组合。基底可作为例如颗粒、线、沉淀物、凝胶、片、管、球体、容器、毛细管、垫、切片、膜、板、载玻片或半导体集成芯片中的一种或多种而存在。固体基底可以是平坦的或可具有其它的表面配置。例如，固体基底可含有发生合成或沉积的凸起或凹陷区域。在一些实例中，可选择固体基底以提供适当的光吸收特性。例如，基底可以是聚合的Langmuir Blodgett膜，功能化玻璃，Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅，半导体集成电路(IC)芯片的顶部电介质层，或者多种凝胶或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)亚乙烯基二氟化物、聚苯乙烯、聚碳酸酯中的任一种，或其组合。
所述多个探针可位于固体基底上的一个或多个可寻址区域(本文中称为“像素”)中。在一些情况下，固体基底包含至少约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000个或超过1,000,000个具有探针的像素。在一些情况下，固体基底包含至多约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000个或超过1,000,000个具有探针的像素。在一些情况下，固体基底包含约2、3、4、5、6或7-10、10-50、50-100、100-500、500-1,000、1,000-5,000、5,000-10,000、10,000-50,000、50,000-100,000、100,000-500,000、500,000-1,000,000个或超过1,000,000个具有探针的像素。
在一些情况下，具有不含探针的像素是有用的。这样的像素可用作对照点，以便提高测量的质量，例如通过使用与该点的结合来估计和校正非特异性结合。
在一些实例中，具有与另一像素相同的探针序列但物理上可能与所述另一像素不相邻或接近的冗余像素是有用的。通过这样的探针阵列获得的数据可能不太易受制造非理想情况和测量误差影响。
在一些情况下，除了并入靶标中的标记物之外，标记物还与像素内的探针相附接。在这样的系统中，捕获的靶标可导致两个标记物在像素中彼此紧密接近。如前所讨论的，特定标记物之间的相互作用可产生独特的可检测信号。例如，当靶标和探针上的标记物分别为可参与荧光共振能量转移(FRET)现象的荧光供体和受体部分时，可检测到FRET信号增强或信号猝灭。
温度控制器
温度控制器可对反应室中的溶液确立特定温度，和/或产生需要加热和/或冷却的温度曲线。温度控制器可包括使用温度传感器(诸如热敏电阻或热电偶)来测量温度，并且基于测量的温度，使用热装置(诸如Peltier装置或电阻加热器)向反应室添加热量或从反应室去除热量的反馈控制系统。温度控制器可包括用于去除热量的散热器。温度控制器可集成到阵列中。阵列的温度可通过单个像素、阵列区域或子区域或在整个阵列尺度上进行控制。
温度控制器可改变基底、反应室或阵列像素的温度。温度变化速率可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20℃/分钟。温度变化速率可以是至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20℃/分钟。温度变化速率可以是至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20℃/分钟。温度控制器可以以线性速率(例如5℃/秒)改变温度。或者，温度控制器可以以非线性速率改变温度。温度控制器可提高或降低温度。
检测器
本发明提供了可用于检测信号的检测器。这样的信号可用于核酸杂交热力学，诸如解链曲线分析。这样的检测器可以是用于测量光信号的光检测器、用于测量电化学信号的电化学检测器或用于测量电荷的静电检测器。
由检测器检测的信号可包括传达关于标记物的存在、不存在和/或数量的信息的信号，包括实时以及在扩增过程期间所有像素处标记物的活性水平。信号可以是光信号，诸如荧光或化学发光信号。信号可以是电信号，诸如电化学信号、静电信号、电阻、电容或电感。可对信号进行处理，包括相对于背景信号进行归一化。可实时检测信号。
光检测器的实例包括但不限于电荷耦合器件(CCD)阵列(包括冷却的CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)成像器、n型金属氧化物半导体(NMOS)、有源像素传感器(APS)或光电倍增管(PMT)。检测器还可包含波长选择性组件，如滤光器，以允许测量选择性波长。其他检测器的实例包括电极。
检测器可以以至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、90、120、150、180、210、240、270、300、400、500、1000、10,000次/分钟的速率进行取样(例如，获得测量值)。
检测器可包含光源。光源可用于例如激发荧光和/或比色标记物。光源可包含至少一个灯，诸如白炽灯、卤素灯、荧光灯、气体放电灯、电弧灯或发光二极管(LED)。光源可包括激光器。光源可产生特定的波长或特定范围的波长，诸如UV。光源可包括用于控制输出光谱、一种或多种波长的滤光器。光源可包括可单独或组合使用的属于相同或不同类型的多个光源。
检测器可包含各种光学元件，包括但不限于滤光器、透镜、准直器、镜子、反射器、分束器和扩散器。检测器可包含一种或多种滤光器，包括但不限于滤波器(例如，滤色器、UV滤光器、IR滤光器)、二向色滤光器和偏振滤光器。滤光器可包括可单独或组合使用的属于相同或不同类型的多个滤光器。检测器可包含用于去除图像畸变或像差的元件(例如，信号处理单元)，诸如桶形或鱼眼畸变、枕形畸变、胡须畸变、单色像差(例如，活塞、倾斜、散焦、球面像差、彗形像差、像散、像场弯曲、图像畸变)或色像差(例如，轴向、纵向、侧向、横向)。这样的元件可包含被编程用于实现用于部分或完全校正图像畸变的指令的计算机系统。例如，Brown畸变模型或Brown-Conrady模型可用于校正径向畸变和切向畸变。
在一些实例中，检测器可测量来自单个像素的发射光子。这些光子可与该区域的光学标记物的存在和/或活性相关联。
在一些情况下，检测器包含集成生物传感器阵列，其可使用CMOS集成电路(IC)制造工艺来构建(Plummer J.D.等人,“Silicon Technologies:Fundamentals,Practice,andModeling,”Prentice Hall Electronics and VLSI Series,2000)。在这样的系统(本文中称为“CMOS生物芯片”)中，探针阵列可放置在CMOS生物芯片的顶部。这样的系统的实例可见于例如美国专利公开号2010/0122904、2013/0345065、2014/0001341、2014/0318958、2014/0011710、2012/0168306、2013/0225441、2012/0077692、2007/0099198、2008/0081769、2008/0176757和2008/0039339，以及美国专利号8,637,436、8,048,626和8,518,329，上述各专利均通过引用而整体并入本文。
检测方法
可通过在特定像素处用能量供体(例如，荧光团)标记的固定化探针与用存在于反应室中的能量受体(例如猝灭剂)标记的靶标之间的相互作用来随着温度变化实时地进行核酸(例如，DNA)杂交反应的实时平行检测以评估杂交热力学。检测还可在类似的设定下通过嵌入剂与相互作用的探针和靶标之间的相互作用来进行。在任一情况下，反应室的温度通常是变化的，而光检测器连续地实时测量信号，以捕获单个像素处的杂交靶标的量并评估杂交反应在该给定温度下在该像素处是否是有利的。
本发明的方法可使用光学标记物诸如荧光和/或猝灭剂标记物来实施。然而，表示杂交反应的信号仅在可寻址阵列的像素处产生，并且局限于可寻址阵列的像素，同时包含所有靶标的反应体积产生最小限的背景光信号。这种独特的特性不但改善了可检测的信干比(或信噪比)，而且由于像素水平测量保持彼此独立使得多路化能力成为可能。尽管反应室和含水样品在它们中都是共享的。
具有供体探针的末端标记的靶标
探针和靶标可以均为末端标记的。例如，图2示出了在一端(例如5'-端)用能量受体标记物标记的核酸靶标。这样的靶标可以是例如其中引物用能量受体标记物标记的PCR反应的一个或多个扩增子。在方法A中，如图2中所示，在结合之前，探针上的供体荧光团在具有与该供体分子的激发(吸收)光谱匹配的波长的光激发源的存在下主动辐射信号。一旦探针与靶标杂交，则受体进入供体附近，并通过能量转移减少从供体标记的探针辐射的信号。在图2所示的方法B中，靶标与探针的杂交涉及在靶标中形成的发夹环，所述发夹环特别地将供体和受体放置得紧密接近。这种做法是为了确保供体和受体之间的有效相互作用，并且可通过使探针序列的3'-端部分地与受体标记物所在的靶标的5'-端匹配来实现。在这些情况的任一种情况下，可检测到靶标与探针杂交时产生的供体信号的减弱，并且该减弱与探针和靶标的杂交反应相关。
在一些实施方案中，受体可以是非辐射标记物，诸如猝灭剂分子。未标记的靶标
可构建其它靶标是未标记的设置。例如，图3示出了核酸靶标和与嵌入剂相互作用的探针，同时存在具有对嵌入剂激发(吸收)光谱具有特异性的波长的光激发源。在图3所示的方法A中，当存在具有未结合靶标的探针时，在反应室中存在并自由移动的嵌入剂分子是无活性的；一旦靶标与探针杂交，则杂交复合物内的嵌入剂就被激活，并且辐射出匹配嵌入剂的发射光谱的信号，指示该像素处的杂交。在图3所示的方法B中，用能够接受来自嵌入剂的能量的能量受体标记探针；一旦靶标与探针杂交，则来自激活的嵌入剂的能量就被能量受体收获。如果受体是荧光团，则辐射信号指示杂交(Howell,WM,Jobs,M和Brooks,AJ,“iFRET:an improved fluorescence system for DNA-melting analysis,”GenomeRes.2002年9月；12(9):1401-7)。在任一种情况下，检测到由靶标与探针附接触发的信号(分别来自嵌入剂或受体荧光团)增强，并且该增强与特定温度下探针与靶标之间的杂交相关。
标记的靶标
核酸靶标可由多种受体标记。这样的靶标可以是例如其中使用受体修饰的dNTP的PCR反应的一个或多个扩增子。图4示出了用供体标记的探针和具有多个能量受体标记物的靶标。在靶标杂交之前，探针标记物在具有与供体的激发(吸收)光谱匹配的波长的光激发源存在的情况下辐射信号。一旦发生杂交，则靶标上的能量受体可接受来自能量供体的能量，实质上使供体失活并猝灭其信号。可检测到当探针与靶标结合时产生的能量供体信号的减弱，并且该减弱与该温度下探针与靶标之间的杂交相关。
在一些实施方案中，受体可以是非辐射标记物，诸如猝灭剂分子。
生成平行解链曲线分析(MCA)的结果
本文所述的检测方法可用于进行平行DNA解链曲线分析(MCA)。如本发明进一步描述的，寡核苷酸探针与靶标之间的结合或杂交可导致单个像素中信号的变化。根据所使用的检测方法，信号的这样的变化可以是信号增强或信号减弱。可控制和改变条件以改变靶标与探针之间的杂交的量或速率。例如，可提高温度以减少靶标与探针之间的结合(即“解链”)。
MCA可用于检测不同探针的靶标杂交差异。例如，核酸靶标可包含序列差异(例如，SNP)，其可影响靶标与给定探针之间的结合。这些差异可作为在不同像素或不同实验的同个像素处的解链曲线的差异而被观察到。在另一个实例中，两个核酸靶标的长度可能不同，诸如来自插入或缺失(插入缺失)或不同数目的序列重复。可通过MCA检测该长度差异，例如通过改变靶核酸中的标记物与探针结合靶序列位置之间的长度。
图5示出了如何使用本发明的方法诸如使用具有供体探针的末端标记的靶标平行地进行MCA的示例。在该示例中，示出了来自三个像素的信号。这些像素中的两个包含在反应室中的具有拥有不相似匹配序列的匹配靶标(靶标1和靶标2)的探针，而第三个像素包含专门设计为不与样品中的任何序列杂交的探针。从这些像素生成的信号分别是信号1、信号2和对照。如图5的测量信号所示，随着温度升高以使靶标从探针“解链”，原始信号显示出信号1和信号2的非单调增强，但具有不同曲线(profile)。然而，由于例如供体荧光团的量子效率(例如，亮度)随着温度而降低，对照信号可能减弱。在归一化信号图中显而易见，一旦使用对照来校准所使用的荧光团的温度依赖性，则靶标1和靶标2杂交的MCA信号均变得更加明显，并且清楚地显示与靶标2相比靶标1曾经具有更稳定的结构。
集成检测器
本发明的方法可使用集成检测器来实现。使用集成生物传感器而不是常规检测设备的示例性优势是大小大幅减小和成本降低。此外，可使用可提供无与伦比的可靠性、大批量制造和可靠性的半导体集成电路(IC)微制造工艺如互补金属氧化物半导体(CMOS)来制造集成生物传感器阵列。可与本发明的集成生物传感器阵列一起使用的传感器的实例提供于美国专利公开号2010/0122904、2013/0345065、2014/0001341、2014/0318958、2014/0011710、2012/0168306、2013/0225441、2012/0077692、2007/0099198、2008/0081769、2008/0176757和2008/0039339，以及美国专利号8,637,436、8,048,626和8,518,329中，上述各专利均通过引用而整体并入本文。
在这样的布置中，每个传感器元件可以是可寻址的，并且可包含其自身的探针。这样的传感器元件可以是生物传感器。阵列可包含许多个单个生物传感器，诸如至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000或100000个集成生物传感器。阵列中单个生物传感器的密度可以是至少约100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个生物传感器像素/mm2。
阵列中的生物传感器可包括光传感器如光电二极管。每个生物传感器还可与温度控制元件，诸如加热器和温度传感器(例如，热电偶、热敏电阻)相关联。生物传感器阵列可包含光传感器与反应室或阵列像素之间的滤光器，诸如发射滤光器，例如描述于美国专利公开号2010/0122904、2013/0345065、2014/0001341、2014/0318958、2014/0011710、2012/0168306、2013/0225441和2008/0081769，以及美国专利号8,637,436和8,518,329中的滤光器，上述各专利均通过引用而整体并入本文。
例如，图6示出了包含32×32的光学生物传感器阵列(图6，右上)的光学CMOS集成生物传感器检测器(图6，左上)。每个光学生物传感器占据100μm×100μm的面积。光学生物传感器阵列具有3.2mm×3.2mm的总面积。每个生物传感器均包含集成的CMOS光电二极管传感器，并且发射滤光器位于CMOS集成传感器与相关阵列像素的反应室之间(图6，左下)。阵列的热量可由加热器进行控制(图6，右下)。
图7示出了用于光学CMOS生物芯片的示例性电路架构。1024个像素中的每一个均包含与光电二极管电路相关联的反应室(由发射滤光器隔开)。每个像素进一步包含加热器、数字控制器以及用于校准和数据收集的信号输入/输出。生物芯片进一步包含数字控制器。数字控制器与能够进行生物芯片像素的行/列选择的扫描模块接合，以用于接收数据。数字控制器还与能够控制芯片上温度的热控制器接合。电源管理系统为像素和热控制器提供电力。光学CMOS生物芯片的特征描述于例如美国专利公开号2010/0122904、2013/0345065、2014/0001341、2014/0318958、2014/0011710、2012/0168306，美国专利号8,518,329中，上述文献均通过引用而整体并入本文。
计算机控制系统
本发明提供了被编程用于实现本发明的方法的计算机控制系统。
图11示出了被编程或以其他方式配置用于进行化学分析如解链曲线分析的计算机系统1101。计算机系统1101可调节本发明的化学分析(例如，解链曲线分析)的各个方面，例如，温度、试剂处理和检测。计算机系统1101可以是相对于电子设备远程定位的用户或计算机系统的电子设备。该电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1101包含中央处理器(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1105，其可以是单核或多核处理器，或用于平行处理的多个处理器。计算机系统1101还包括存储器或存储器位置1110(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1115(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1120(例如，网络适配器)和外围设备1125，如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1110、存储单元1115、接口1120和外围设备1125通过通信总线(实线)如主板与CPU1105通信。存储单元1115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1101可在通信接口1120的辅助下可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1130。网络1130可以是因特网、互联网和/或外联网、或与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1130是电信和/或数据网络。网络1130可包含一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，如云计算。在一些情况下，网络1130可借助计算机系统1101实现对等网络，其可使耦合到计算机系统1101的装置作为客户端或服务器。
CPU 1105可执行一系列的机器可读指令，该机器可读指令可体现在程序或软件中。指令可存储于存储器位置，如存储器1110中。指令可被引导至CPU 1105，其随后可对CPU1105进行编程或以其他方式配置以实现本发明的方法。由CPU 1105执行的操作的实例可包括获取、解码、执行和写回。
CPU 1105可以是电路如集成电路的一部分。系统1101中的一个或多个其他组件可包括在电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1115可存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1115可存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1101可包括在计算机系统1101外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1101通信的远程服务器上的一个或多个附加数据存储单元。
计算机系统1101可通过网络1130与一个或多个远程计算机系统进行通信。例如，计算机系统1101可与用户(例如，实验室技术人员)的远程计算机系统进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如便携式PC)、板型或平板PC(例如，
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iPad、
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Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如
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iPhone、支持Android的装置、
Figure BDA0001477372860000264
)或个人数字助理。用户可经由网络1130访问计算机系统1101。
如本文所述的方法可通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统1101的电子存储位置，诸如存储器1110或电子存储单元1115上。该机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可由处理器1105执行。在一些情况下，代码可从存储单元1115检索并存储在存储器1110上，以便处理器1105迅速存取。在一些情况下，可排除电子存储单元1115，并且机器可执行指令存储在存储器1110上。
所述代码可被预编译并被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可在运行时进行编译。所述代码可以以可被选择用于使代码以预编译或编译方式执行的编程语言提供。
本文所提供的系统和方法的各方面，如计算机系统1101，可在编程中体现。该技术的各个方面可被认为是“产品”或“制品”，其通常为在机器可读介质类型中执行或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可存储于电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可使得软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个，例如从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如通过有线和光学陆上网络以及各种空中链路在本地设备之间的物理接口中使用的。携带这样的波的物理元件，如有线或无线链路、光链路等，还可被认为是携带该软件的介质。如本文所用的，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供用于执行的指令的任何介质。
因此，机器可读介质如计算机可执行代码可采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储装置等，诸如可用于实现图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的电线。载波传输介质可采取电或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间所生成的信号。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传输数据或指令的载波、传输这样的载波的电缆或链路、或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带到处理器用于执行。
计算机系统1101可包括电子显示器1135或与电子显示器1135进行通信，该电子显示器包括用于提供例如温度值、温度控制、检测器数据和流体处理的用户界面(UI)1140。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本发明的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。算法可在中央处理器1105执行时通过软件实现。该算法可例如控制阵列像素的温度并收集和处理数据。
实施例
实施例1-集成生物传感器阵列上的解链曲线分析(MCA)
使探针阵列与第一靶标和第二靶标接触，并且探针与靶标之间发生结合(参见例如图8)。使用芯片上的加热器使温度随时间增加，如图8B中所示(上图)，包括以下时间点：在t＝0分钟时T＝40℃，在t＝10分钟时T＝48℃，在t＝15分钟时T＝57℃，在t＝20分钟时T＝67℃，在t＝25分钟时T＝76℃，以及在t＝30分钟时T＝85℃(图8A)。集成生物传感器阵列阻挡激发信号并从阵列收集发射信号，并针对第一靶标(信号(1))和第二靶标(信号(2))产生归一化信号相对于温度的解链曲线(图8B，下图)。使用的探针和靶序列如图8C中所示。
该实验中的供体标记物是HEX，而受体(猝灭剂)是Iowa Black。
实施例2-集成生物传感器阵列上基于嵌入剂的解链曲线分析(MCA)
使探针阵列与第一靶标和第二靶标接触，并且在SYBR Green嵌入剂的存在下，探针与靶标之间发生结合(参见例如图9，右侧)。在探针与靶标之间不存在结合的情况下，嵌入剂无活性；当探针与靶标结合时，嵌入剂激活并发射信号。使用芯片上的加热器使温度随时间增加。集成生物传感器阵列阻挡激发信号并从阵列收集发射信号，并针对第一靶标(信号(1))和第二靶标(信号(2))产生归一化信号相对于温度的解链曲线(图9，曲线图)。使用的探针和靶序列如图9下方所示。
实施例3-集成生物传感器阵列上基于荧光团-猝灭剂的解链曲线分析(MCA)
使第一、第二、第三和第四探针阵列与第一、第二、第三、第四靶标接触，并且探针与靶标之间发生结合(参见例如图10A，右侧)。探针用能量供体进行末端标记，而靶标用能量受体进行末端标记。使温度随时间增加。生物芯片传感器从阵列收集信号，并针对第一靶标(信号1)、第二靶标(信号2)、第三靶标(信号3)和第四靶标(信号4)产生归一化信号相对于温度的解链曲线(图10A，曲线图)。使用的探针和靶序列如图10B中所示。
该实验中的供体标记物是HEX，而受体(猝灭剂)是Iowa Black。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。并不意在通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。虽然已经参考前述说明书对本发明进行了描述，但对本文的实施方案的描述和说明并不意在解释为限制意义。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于取决于多种条件和变量的本文所阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此，预期本发明还将涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (48)

1.一种用于测定样品中是否存在靶核酸分子的方法，该方法包括：
(a)提供包含邻近样品室的集成传感器的芯片，其中所述样品室被配置为保持具有所述靶核酸分子的所述样品，并且其中所述集成传感器(i)具有包含选择性地与所述靶核酸分子偶联的探针的表面，以及(ii)检测来自所述样品的至少一种光信号，该至少一种光信号指示所述靶核酸分子的存在或不存在；
(b)在允许所述探针选择性地与所述靶核酸分子偶联的条件下在所述样品室中提供所述样品；
(c)当所述样品在所述样品室中时，使所述表面经受温度变化；
(d)在使所述表面经受所述温度变化时，实时测量所述至少一种光信号，其中所述至少一种光信号指示能量受体和能量供体之间相互作用，所述能量受体与所述靶核酸分子偶联，所述能量供体与所述探针偶联；以及
(e)使用所述至少一种光信号随所述温度变化的测量值生成信号相对于温度的数据。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针为寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在允许所述寡核苷酸与所述靶核酸分子杂交的条件下，在所述样品室中提供所述样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中当与所述寡核苷酸杂交时，所述靶核酸分子的序列形成发夹环结构。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述集成传感器在所述芯片中的多个集成传感器的阵列中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述能量受体猝灭所述能量供体的光活性。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括测量所述至少一种光信号相对于背景的增强。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括测量所述至少一种光信号相对于背景的减弱。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述集成传感器进一步包括光检测器，并且其中在(d)中，采用所述光检测器测量所述至少一种光信号。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包含多种靶核酸分子，包括所述靶核酸分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述集成传感器为多个集成传感器的阵列的一部分，其中所述多个集成传感器中的每一个检测所述多种靶核酸分子中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述芯片包含附加集成传感器，其中所述样品包含所述靶核酸分子和附加靶核酸分子，并且其中所述附加集成传感器检测所述附加靶核酸分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述附加集成传感器包含选择性地与所述附加靶核酸分子偶联的附加探针。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述附加集成传感器检测指示所述附加靶核酸分子的存在或不存在的至少一种附加光信号。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述能量受体为猝灭剂。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述能量供体为荧光团。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述光检测器包含互补金属氧化物半导体(CMOS)器件。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针经由连接体固定到所述表面上。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述连接体包含选自氨基酸、多肽、核苷酸和寡核苷酸的种类。
20.根据权利要求1所述的方法，其中当包含所述靶核酸分子的所述样品与所述芯片流体接触时，检测所述至少一种光信号。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号相对于温度的数据是解链曲线的一部分。
22.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在(a)之前，(i)提供包含具有作为所述靶核酸分子的前体的模板核酸分子的生物样品、与所述模板核酸分子互补的至少一种引物以及聚合酶的反应混合物，以及(ii)在所述样品中产生所述靶核酸分子的条件下使所述反应混合物进行核酸扩增反应。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种引物具有对所述靶核酸分子的序列中的单核苷酸多态性(SNP)具有选择性的序列。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸扩增为不对称核酸扩增。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述芯片与计算机处理器电耦合，所述计算机处理器从所述集成传感器电接收所述至少一种光信号，并从所述至少一种光信号确定所述靶核酸分子的所述存在或不存在。
26.根据权利要求1所述的方法，其中在(c)中，所述表面以1℃/min至20℃/min的平均速率经受所述温度变化。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子以至少90％的灵敏度进行检测。
28.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用所述信号相对于温度的数据确定所述靶核酸分子的序列中的单核苷酸多态性(SNP)。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述芯片进一步包含对照传感器，所述对照传感器具有不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括(i)测量与所述对照探针相关联的至少一种对照信号，以及(ii)将所述信号相对于温度的数据相对于所述至少一种对照信号的测量值进行归一化。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述芯片包含附加集成传感器，其中所述样品包含所述靶核酸分子和附加靶核酸分子，并且其中所述附加集成传感器检测所述附加靶核酸分子。
32.根据权利要求1所述的方法，其中在(a)中，所述集成传感器进一步包含在所述表面下方的发射层和在所述发射层下方的光检测器，并且在(d)中，所述光检测器测量在通过所述发射层透射后来自所述样品的所述至少一种光信号。
33.一种用于测定样品中是否存在靶核酸分子的方法，该方法包括(a)使具有至少一个集成传感器的杂交阵列经受温度变化，(b)在多个温度点测量来自具有所述至少一个集成传感器的所述杂交阵列的光信号，以及(c)通过评估所述靶核酸分子在所述温度变化期间的所述多个温度点的解离特性，以至少90％的灵敏度测定所述靶核酸分子的存在，其中所述光信号指示能量受体和能量供体之间相互作用，所述能量受体与所述靶核酸分子偶联，所述能量供体与包括在所述杂交阵列中的探针偶联。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述灵敏度为至少95％。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述杂交阵列具有多个集成传感器。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一个集成传感器为光学传感器。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一个集成传感器包括第一集成传感器和第二集成传感器，并且其中所述样品包含所述靶核酸分子和附加靶核酸分子。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一集成传感器测量与所述靶核酸分子相关联的信号，而所述第二集成传感器测量与所述附加靶核酸分子相关联的信号。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述杂交阵列进一步包含对照传感器，所述对照传感器具有不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针。
40.根据权利要求39所述的方法，进一步包括(i)在所述多个温度点采用所述对照传感器测量对照信号，以及(ii)在所述多个温度点相对于所述对照信号评估所述靶核酸分子的所述解离特性。
41.一种用于测定样品中是否存在靶核酸分子的系统，该系统包含：
包含邻近样品室的集成传感器的芯片，其中所述样品室被配置为保持具有所述靶核酸分子的所述样品，并且其中所述集成传感器(i)具有包含选择性地与所述靶核酸分子偶联的探针的表面，以及(ii)检测来自所述样品的至少一种光信号，该至少一种光信号指示所述靶核酸分子的存在或不存在；
计算机处理器，其与所述芯片耦合，并被编程用于(i)当所述样品在所述样品室中时，使所述表面经受温度变化；(ii)在使所述表面经受所述温度变化时测量所述至少一种光信号；以及(iii)使用所述至少一种光信号随所述温度变化的测量值生成信号相对于温度的数据，其中所述至少一种光信号指示能量受体和能量供体之间相互作用，所述能量受体与所述靶核酸分子偶联，所述能量供体与所述探针偶联。
42.根据权利要求41所述的系统，其中所述集成传感器在所述芯片中的多个集成传感器的阵列中。
43.根据权利要求41所述的系统，其中所述芯片进一步包含邻近所述样品室的对照传感器，所述对照传感器包含不与所述靶核酸分子选择性偶联的对照探针，并且所述对照传感器检测来自所述样品的至少一种对照信号。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述计算机处理器进一步被编程用于(iv)在使所述对照探针经受所述温度变化时测量所述至少一种对照信号，以及(v)将所述信号相对于温度的数据相对于所述至少一种对照信号的测量值进行归一化。
45.根据权利要求41所述的系统，其中所述芯片包含附加集成传感器，并且其中所述样品包含附加靶核酸分子。
46.根据权利要求45所述的系统，其中所述附加集成传感器检测指示所述附加靶核酸分子的存在的至少一种附加光信号。
47.根据权利要求42所述的系统，其中所述阵列包含至少100个集成传感器。
48.根据权利要求42所述的系统，其中所述阵列的单个集成传感器是可单独寻址的。
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