EP1784500A1 - Verfahren zum analysieren von punktmutationen - Google Patents

Verfahren zum analysieren von punktmutationen

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Publication number
EP1784500A1
EP1784500A1 EP04764692A EP04764692A EP1784500A1 EP 1784500 A1 EP1784500 A1 EP 1784500A1 EP 04764692 A EP04764692 A EP 04764692A EP 04764692 A EP04764692 A EP 04764692A EP 1784500 A1 EP1784500 A1 EP 1784500A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
dna
probe
chip
sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04764692A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Holger Dr. Klapproth
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Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1784500A1 publication Critical patent/EP1784500A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides

Definitions

  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • many genetic diseases such as e.g.
  • SNPs can be detected by means of PCR or sequencing of the corresponding ⁇ s.
  • sequencing is not that easy or at least much more expensive.
  • areas of the gene in the DNA sequencer are no longer evaluable. If several possible SNPs are present on a gene, the analysis by means of PCR becomes very difficult and again very expensive.
  • oligonucleotide microarrays are on these microarrays diverse short DNA fragments (oligonucleotides) bound, in which the center of the strand is the base that is complementary to the sought SNP. Due to the resulting differences in the melting points with the DNA of the analyte, it can now be determined whether the 100% complementary DNA has bound or not.
  • the usual detection lies in the comparison of the signal strengths between the perfect matches (100% complementary) and the SNP mismatches (about 5% false binding). These analyzes were mostly performed by hybridizing the DNA to the chips at a fixed temperature, and then the binding intensity was measured and compared. If a large number of SNPs are analyzed simultaneously on one chip, it is almost impossible to adapt all probes to the same analysis temperature, since, in addition, the methods for calculating the melting point for DNA hybrids do not correspond to the measured values.
  • Such methods can be especially determined by determining the Generate the melting point of the hybrids on the chip.
  • suitable for this purpose are devices with which these analyzes can be carried out real-time, such as, for example, the ATR reader, which has been developed by the Fraunhofer ⁇ esellschat (FH ⁇ -IPM) (see FIG. 1).
  • the ATR reader analysis method proves to be relatively expensive, since the melting curves of the nucleic acids are analyzed in order to determine the so-called melting points (Tm) of the nucleic acid hybrids.
  • Tm melting points
  • the melting points of DNA probes must be calculated and subsequently determined experimentally. In particular, this technique makes the design of the chips relatively difficult for many probes per chip.
  • the invention describes the surprising finding that for the analysis of SNPs on ATR chips no probe design in the true sense is necessary, but sufficient, these probes in a preselected length, which preferably does not differ too much from probe to probe, and then the Include melting point curve respectively. Subsequently, the curves of the wild-type probes, which are also referred to below as wt probes, and with the probes of the possibly occurring mutants are compared. This comparison is achieved by the subtraction of the melting point curve of the Wildi ⁇ p probe from the melting point curve of one or more mutations. The result is shown as a graph (see FIG. 2). The location of this curve now indicates which genotype is present. A reliable allocation is achieved, above all, by comparison with reference data.
  • the base to be examined is located in the middle of the DNA probe sequence.
  • the chip is heated in stages of 1 0 C, for example, 30 0 C to 80 0 C.
  • the signal is recorded and stored on each probe. To As a result, reaching the upper selected temperature range, a complete melting point curve is recorded.
  • the data of the variations to be examined are then compared with the data of the so-called wild-type sequence. For this purpose, the data of the variations are subtracted from the data of the wild-type sequence. If the DNA analyzed is homozygous for the wild type, the resulting curve will have positive values in the region of the melting point of the DNA, but at least significantly more positive values than in the case of a heterozygous sample. If the sample is heterozygous, the resulting curve will ideally approach a straight line along the zero point. If the sample for the mutated DNA is homozygous, the melting point at the probe of the mutated DNA (where there is 100% binding) is higher than the melting point at the wild-type probe (there is no 100% binding). Consequently, the curve which is calculated by subtracting the melting curves is characterized by a deflection in the direction of the negative y-axis. The location of these curves explicitly describes the composition of the sample DNA with respect to the mutation to be studied.
  • the sensors are preferably waveguide chips, which may be object carrier-shaped chips into which the excitation light for a TIRF excitation is coupled via an edge. But it can also be chips that are created in the form of thin-film waveguides.
  • Such thin film waveguide chips are e.g. Tantalum pentoxide-coated glass substrate carriers into which the light is coupled via optical gratings.
  • DNA probe molecules are preferably formed on such chips via chemical adhesion promoters, such as e.g. Bonded silane or polymer coatings. Such compounds are described, for example, in EP 1 132 739 B1.
  • DNA probes suitable for binding to such surfaces are preferably provided with a polythymidine spacer consisting of at least 10 thymidine molecules.
  • the probe molecules are preferably covalently coupled. Suitable methods for this purpose are described in WO 00/43539 A2.
  • the preparation of suitable samples and the marking is described, for example, in WO 01/53822 and Lehr (Lehr 2002).
  • the surface of the support is coated with a UV-reactive polymer.
  • This polymer is then passed through Irradiation of the coated support covalently coupled to UV light on the surface.
  • polymer supports such polymer thin layers can be applied by dipcoating in a dilute solution (analogous to EP 176422 A1)
  • DNA molecules can be applied to these surfaces by means of polythymidine spatters and UV crosslinkers, particular preference being given to copolymers having a limited hydrophilicity
  • a polymer of methacrylic acid, styrene, and benzophenone methacrylate is provided with these properties, and of course, other copolymers, and in particular, block copolymers, are also suitable
  • it is expedient to silanize these substrates beforehand in order to improve the adhesion of the polymer layers Such silanization is described, for example, in EP 1 1 32 739 B1 and in US Pat
  • Suitable supports for analysis may also be integrated systems (DE 10 245 435 A2, such as CMOS chips with additionally applied waveguide structures). These waveguides are preferably located above the opto-sensors and are connected to the optochip by means of a thin layer of a substrate of lower optical density than the waveguide.
  • the biomolecules are applied to polymer polymer thin-film waveguides.
  • Such waveguides consist of a carrier polymer with a low optical density and a waveguide terpolymer with a high optical density.
  • a carrier polymer with a low optical density for example, a polymer used in the manufacture of plastic eyeglass lenses. Suitable polymers of correspondingly low optical density are sufficiently known to the person skilled in the art.
  • the chip is rinsed after a measurement with buffer and heated so that the bound nucleic acids are largely removed. After that, the chip can be used again. In addition to heating, the chip can also be regenerated by denaturing agents, such as 0.1% NaOH.
  • This method also makes it possible to hybridize the chip with reference nucleic acids so as to calibrate each chip before, during or after the measurement. In this way it is possible to compare the measured values of different experiments with one another and to calculate out individual differences, which may be due, for example, to the production of the chips. Furthermore, this method allows the quality control of the chips during use and allows the determination of whether a chip is still suitable for further experiment or not.
  • chips are used for such experiments in which the initial hybridization can not be completely resolved, such chips can be saturated by blocking with an unlabeled sample that binds to all nucleic acid probes, so that hybridized after the actual experiment and the detachment Samples no residual fluorescence signal remains.
  • Detection of mutation H63D of Haemochromatose gene mutation H63D The base exchange of a cytosine for a ⁇ uanine (C ⁇ G, transversion) at position 187 in exon 2 of the HFE gene leads to an amino acid exchange of a histidine to aspartic acid at position 63 of the HFE protein. This mutation is referred to in the literature as H63D (Feder et al 1996).
  • the mutation H63D involves the replacement of a cytosine by a guanine by a transversion.
  • a pyrimidine is replaced by a purine base and there is a steric hindrance at the site of base mismatch. Since no binding can form in the base mismatches present in transversions, these are easier to detect.
  • the probes for detecting the mutation H63D carry at a central point of the specific sequence a C (wt probe) or a ⁇ (mut probe).
  • the sample DNA carries a ⁇ (wt sample, H63D (+ / +)), a C (mut sample, H63D (- / -)), 50% ⁇ and 50% C, respectively (het sample; H63D (+/-)).
  • oligonucleotides On PMMA carriers of dimension 7 ⁇ x25xl mm with a lateral edge of 70 ° for coupling the excitation light are printed with a top-spot printer or other suitable device (Lehr 2002) oligonucleotides.
  • the pressure buffer used is a 5% DMSO solution in water.
  • the oligonucleotides are present in a concentration of 10 ⁇ M.
  • the oligonucleotides consist of a recognition sequence of the target DNA of 17 nucleotides in length and the desired mutation in the middle of the sequence. At the 5 'end of the oligonucleotide is a polythymidine strand of at least 10 nucleotides in length.
  • the freshly printed chips are irradiated for 10 minutes in a UV crosslink oven (Stratalinker, Stratagene) for 10 minutes with UV light having a wavelength of 260 nm. Subsequently, with water to which a detergent is added (0.1% SDS) thoroughly rinsed rinsed with distilled water and blown dry in a stream of nitrogen.
  • a detergent 0.1% SDS
  • chips were made with a 17mer probe pair (63_17wt and ⁇ 3_17mut).
  • the chips were hybridized in the TIRF measuring instrument with DNA samples of the different types a) Wf sample, b) mut sample, c) het sample), stained and the dissociation behavior of the probe pair was measured.
  • the fluorescence intensities at the Wt and mut probe were observed over a temperature range of 20 ° C-80 ° C in 2 ° C increments and shown in the following diagrams.
  • the DNA purification was carried out from 10 ml of human blood by means of the nucleon extraction and purification kit from Amersham Biotech.
  • the absorption of UV radiation of wavelength 260 and 280 nm was measured by a nucleic acid solution, against the respective solvent, in a spectrophotometer.
  • a A 2 ⁇ o unit corresponds to a double-stranded DNA concentration of 50 ⁇ g / ml and a single-stranded DNA concentration of 33 ⁇ g / ml.
  • the ratio of absorbances at 260 and 280 nm is an indicator of the purity of the DNA. It assumes a value of 1.8 with optimum purity.
  • the primers store at a temperature which is close to the melting temperature Tm of the primer is applied to the single-stranded DNA.
  • modified nucleotides can also be incorporated into the PCR.
  • the nucleotides may e.g. Fluorescent dyes or biotin, biotinylated nucleotides being much easier and more efficient to incorporate than e.g. Cy5-labeled nucleotides.
  • biotin! ⁇ -dUTP incorporated into the DNA.
  • the biotin-dUTP was incorporated instead of dTTP.
  • direct Cy-5 dUTP can also be installed.
  • PCR products were used which were prepared with a thioate-modified primer and an unmodified primer. These PCR products were mixed in a volume of 25 .mu.l with 1 ul 17 gene exonuclease from Amersham and incubated at 37 ° C for 30 min. To complete the reaction, the batch was heated at 85 ° C for 10 min.
  • the hybridization was carried out by adding the amplified sample in hybridization buffer to the measuring field of the sensor chip.
  • the hybridization solution was added directly to a hybridization cuvette in the TIRF meter. Subsequently, the carriers in the hybridization cuvette of the TIRF apparatus were rinsed for several seconds with commercially available washing buffer.
  • the staining of the bound biotinylated PCR fragments was carried out by incubation with a streptavidin-Cy5 conjugate.
  • the stock solution was taken up according to manufacturer's instructions in dyeing buffer. This was added directly into the hybridization cuvette of the TIRF meter.
  • Fig. 1 describes the TIRF measuring optics.
  • Laser light from a semiconductor laser diode (1) is focused by a lens (2) (3) and blasted onto the coupling edge of a TIRF measuring chip (4).
  • biomolecules (5, 6) labeled with a luminescent dye.
  • the luminescent dyes are excited and emit luminescent light (5,7), which can be collected by means of suitable detectors.
  • Luminescent dyes which are outside the evanescent field are not excited by luminescent dyes ( ⁇ ) and accordingly emit no light.
  • the fluorescent light (7) can be recorded by means of commercially available CCD or CMOS cameras.
  • Fig. 2 shows the analysis according to the invention of three experiments in comparison to each other.
  • the temperature in ° C and on the ordinate the signal difference on a 17mer probe pair (mutation H ⁇ 3D in hybridization with different enenolypenes) are plotted.
  • the analyte used was a DNA containing only wild-type alleles.
  • the chip When the temperature is reached, the chip is recorded with the camera and the image of the fluorescence is stored. Subsequently, the signal of the fluorescence images of different temperature levels is evaluated. For this purpose, the signal sity at the points where the probes are immobilized quantified. At the same time, reference points on the chip are evaluated on which fluoreszenz ⁇ labeled DNA is immobilized. This signal decreases when the chip is heated (because the fluorescence signal is reduced by heat). This decrease is determined on a percentage basis and the recorded signal curves are corrected by this decrease. After correction, the signal of the probe of the desired mutation is now subtracted from the probe of wild-type DNA. The result is plotted as a graph.
  • the middle curve represents the case when both wild-type DNA and mutated DNA are present in the analyte.
  • the curve then ideally forms a straight line along the zero point.
  • the lower curve now represents the case when only mutated DNA is present in the analyte.
  • the difference in the binding curve of wild-type DNA to the binding curve of the mutated DNA is negant, since the mutated DNA binds to the wild-type probe at a much lower binding energy than it binds to the probe of the mutated DNA sequence.

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen von Punktmutationen mit sogenannten DNA-Microarrays und TIRF-Fluoreszenzanregung. Dabei wird die Bindung von Nukleinsäuren an kurze DNA-Sonden auf einem Microarray bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Aus dem Messwerten werden Schmelzpunktkurven generiert und die Differenz der Schmelzpunktkurven zwischen der Sonde für die Wildtyp-DNA und der Sonde für die entsprechende mutierte-DNA generiert. Die Lage dieser Kurven lässt nun eine eindeutige Entscheidung zu, ob es sich um eine Homozygote DNA, oder eine heterzygote DNA für diese Punktmutation handelt und welche Art der Homozygotie vorliegt,

Description

Verfahren zum Analysieren von Punktmutationen
Stand der Technik
Bei einer Vielzahl von Analysen des Genoms, z.B. des menschlichen Genoms, spielen sogenannte Einzelpunktmutationen (engl. : Single nucleotide poly- morphisms = SNPs) eine bedeutende Rolle. So sind viele genetisch bedingte Erkrankungen wie z.B. hereditäre Haemochromatose auf solche SNPs zurückzufuh¬ ren. Im einfachsten Fall lassen sich solche SNPs mittels PCR oder Sequenzieren des entsprechenden θens nachweisen. Liegen die Bereiche von Interesse aber weiter auf dem Gen auseinander als nur ein paar hundert Basenpaare, so ist dies mittels Sequenzieren nicht mehr so einfach möglich oder zumindest wesentlich teurer. Bei komlexeren Mutationen kann es zudem dazu kommen, dass Bereiche des Gens im DNA-Sequencer nicht mehr auswertbar sind. Liegen auf einem Gen mehrere mögliche SNPs vor so wird die Analyse mittels PCR sehr schwierig und auch wieder¬ um sehr teuer.
So gab es schon lange Bestrebungen die Analyse von SNPs zu parallelisieren. Ein solches Verfahren stellen z.B. die Oligonukleotid-Microarrays dar, Auf diesen Microarrays sind diverse kurze DNA-Fragmente (Oligonukleotide) gebunden, bei denen sich in der Mitte des Stranges die Base befindet, die für den gesuchten SNP komplementär ist. Aufgrund der daraus resultierenden Unterschiede in den Schmelzpunkten mit der DNA des Analyten kann man nun feststellen ob die 100 % komplementäre DNA gebunden hat oder nicht. Die übliche Erkennung liegt im Vergleich der Signalstärken zwischen den perfect matches (100% komplementär) und des SNP-mismatches (ca 5% Fehlbindung). Diese Analysen wurden zumeist durch Hybridisieren der DNA an die Chips bei einer festen Temperatur durchgeführt und anschließend wurde dann die Bindungsintensität gemessen und verglichen. Wird eine Vielzahl von SNPs auf einem Chip gleichzeitig analysiert, so ist es fast nicht möglich alle Sonden auf die gleiche Analysetemperatur anzupassen, vor da allem auch die Methoden zur Berechnung des Schmelzpunktes für DNA-Hybride nicht den gemessenen Werten entsprechen.
Aus diesem Grund braucht man bessere Methoden um große Mengen an SNPs sicher zu messen. Solche Methoden lassen sich vor allem durch Bestimmung des Schmelzpunktes der Hybride auf dem Chip generieren. Ideal sind dazu Geräte geeignet mit denen diese Analysen realtime durchgeführt werden können, wie z.B. der ATR-Reader, der von der Fraunhofer θesellschat (FHΘ-IPM) entwickelt worden ist (siehe Fig. 1). Allerdings zeigt sich die Methode der ATR-Readeranalyse als relativ aufwendig, da hierbei die Schmelzkurven der Nukleinsäuren analysiert werden, um dabei die sogenannten Schmelzpunkte (Tm) der Nukleinsäurehybride zu ermitteln. Dazu müssen die Schmelzpunkte von DNA-Sonden berechnet werden und anschließend experimentell nachbestimmt werden. Insbesondere wird durch diese Technik das Design der Chips bei vielen Sonden pro Chip relativ schwierig.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beschreibt den überraschenden Befund, dass zur Analyse von SNPs auf ATR-Chips kein Sondendesign im eigentlichen Sinne notwendig ist, sondern es ausreicht, diese Sonden in einer vorgewählten Länge, die sich vorzugsweise von Sonde zu Sonde nicht zu sehr unterscheidet, und dann die Schmelzpunktkurve jeweils aufzunehmen. Anschließend werden die Kurven der Wildtypsonden, die nachstehend auch als wt-Sonden bezeichnet werden, und mit den Sonden der eventuell auftretenden Mutanten verglichen. Dieser Vergleich wird durch die Substraktion der Schmelzpunktkurve der Wildiγp-Sonde von der Schmelzpunktkur¬ ve einer oder mehrerer Mutationen erreicht. Das Ergebnis wird als Graph darge¬ stellt (siehe Fig. 2). Die Lage dieser Kurve gibt nun an, welcher Genotyp vorliegt. Eine sichere Zuordnung ist vor allem durch den Vergleich mit Referenzdaten zu errei¬ chen. Dies führt insbesondere bei der Verwendung von Sequenzen, die zur Analyse auf einem normalen DNA-Microarray nicht geeignet sind, zu entscheidenden Vorteilen bei der Analyse. Die Nachweissicherheit für Punktmutationen wird signifi¬ kant erhöht und die Analyse ist sehr einfach zu automatisieren. Außerdem lassen sich somit Chips viel schneller entwickeln, da keine Anpassung an parallele Analysen, die bei einer festgelegten Hybridisierungstemperatur arbeiten, stattfindet. Somit reicht es aus, die Sonden mit einer fixen Länge zu berechnen und auf dem ATR-Chip zu immobilisieren (bzw. zu synthetisieren).
Vorzugsweise befindet sich die zu untersuchende Base (Mutation) in der Mitte der DNA-Sondensequenz. Bei der Verwendung eines dermaßen hergestellten Chips genügt es nun, die Proben-DNA welche vorzugsweise mit einem Fluorophoren markiert sein muss, an den Chip zu hybridisieren. Anschließend wird der Chip in Stufen von 10C von beispielsweise 300C auf 800C erwärmt. Nach jedem Tempera¬ turschritt wird das Signal an jeder Sonde aufgezeichnet und abgespeichert. Nach Erreichen des oberen gewählten Temperaturbereiches ist folglich eine komplette Schmelzpunktkurve aufgenommen.
Die Daten der zu untersuchenden Variationen (Mutationen) werden dann mit den Daten der sog. Wildtyp-Sequenz verglichen. Dazu werden die Daten der Variatio¬ nen von den Daten der Wildtyp-Sequenz substrahiert. Ist die analysierte DNA homozygot für den Wildtyp so wird resultierende Kurve im Bereich des Schmelz¬ punktes der DNA positive Werte aufweisen, zumindest aber signifikant positivere Werte als im Falle einer heterozygoten Probe. Ist die Probe heterozygot so wird die resultierende Kurve idealerweise sich einer Geraden entlang des Nullpunktes annähern. Ist die Probe für die mutierte DNA homozygot so ist der Schmelzpunkt an der Sonde der mutierten DNA (dort liegt eine 100%ige Bindung vor) höher als der Schmelzpunkt an der Sonde für den Wildtyp (dort liegt keine 100%ige Bindung vor). Folglicherweise ist die Kurve, die durch Substraktion der Schmelzkurven errechnet wird, durch einen Ausschlag in Richtung der negativen y-Achse gekennzeichnet. Die Lage dieser Kurven beschreibt explizit die Zusammensetzung der Proben-DNA bezüglich der zu untersuchenden Mutation.
Diese Art der Untersuchung findet bevorzugt in einem Apparat statt, wie er z.B. in der EPOOOl 248948 beschrieben wird. Die Sensoren sind bevorzugt Wellenleiterchips bei denen es sich um objektträgerförmige Chips handeln kann, in die über eine Kante das Anregungslicht für eine TIRF-Anregung eingekoppelt wird. Es kann sich dabei aber auch um Chips handeln, die in Form von Dünnfilmwellenleitern geschaffen sind. Solche Dünnfilmwellenleiterchips sind z.B. Tantalpentoxid beschichtete Glasob- jektträger in die das Licht über optische Gitter eingekoppelt wird. DNA- Sondenmoleküle werden auf solchen Chips vorzugsweise über chemische Haft¬ vermittler wie z.B. Silane oder Polymerbeschichtungen gebunden. Solche Verbin¬ dungen sind beispielsweise in der EP 1 132 739 Bl beschrieben. Verfahren zur Beschichtung von Trägern mit Polymerschichten sind beispielsweise in der EP 1 176422 Al beschrieben. Zur Bindung an solche Oberflächen geeignten DNA- Sonden werden vorzugsweise mit einem Polythymidin-Spacer, der aus mindestens 10 Thymidinmolekülen besteht, versehen. Die Sondenmoleküle werden bevorzugt kovalent gekoppelt. Dazu geeignete Methoden werden in der WO 00/43539 A2 beschrieben. Die Herstellung von geeigneten Proben und die Markierung ist beispielsweise in der WO 01 /53822 und bei Lehr (Lehr 2002) beschrieben.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung wird die Oberfläche des Trägers mit einem UV-reaktiven Polymer beschichtet. Dieses Polymer wird dann durch Bestrahlung des beschichteten Trägers mit UV-Licht auf der Oberfläche kovalent gekoppelt. Auf Polymerträgern können solche Polymerdünnschichten durch „Dipcoating" in einer verdünnten Lösung (analog EP l 176422 Al) aufgebracht werden. DNA-Moleküle können auf diesen Oberflächen mittels Polythymidinspa- cern und UV-Crosslinken aufgebracht werden. Besonders bevorzugt sind dabei Copolymere mit einer beschränkten Hydrophilie, negativ geladenen Gruppen und Benzophenongruppen zum Verbinden der Poymerschicht mit der Oberfläche. Beispielsweise ist ein Poylmer aus Metacrylsäure, Styrol und Benzophenonmethacry- lat mit diesen Eigenschaften versehen. Selbstverständlich sind auch andere Copolymere und im Besonderen Blockcopolymere geeignet. Sollen diese Polymer¬ schichten auf θlas oder andere anorganische Substrate aufgebracht werden, so ist es sinnvoll, diese Substrate vorher zu silanisieren, um die Hatung der Polymerlagen zu verbessern. Eine solche Silanisierung ist z.B. in der EP 1 1 32 739 Bl und in der
EP 1 176422 Al beschrieben.
Geeignete Träger zur Analyse können auch integrierte Systeme (DE 10 245 435 A2, wie z.B. CMOS-Chips mit zusätzlich aufgebrachten Wellenleiterstrukturen) sein. Diese Wellenleiter befinden sich bevorzugt über den Optosensoren und sind mittels einer dünnen Schicht aus einem Substrat von geringerer optischer Dichte als der Wellen- leiter mit dem Optochip verbunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsförm sind die Biomoleküle auf Polymer- Polymer Dünnfilmwellenleitern aufgebracht. Solche Wellenleiter bestehen aus einem Trägerpolymer mit einer geringen optischen Dichte und einem Wellenlei- terpolymer mit einer hohen optischen Dichte. So z.B. einem Polymer, wie es zur Herstellung von Kunststoffbrillengläsern benutzt wird. Geeignete Polymere von entsprechend geringer optischer Dichte sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird der Chip nach einer Messung mit Puffer gespült und erhitzt so dass die gebundenen Nukleinsäuren weitgehend entfernt werden. Danach kann der Chip erneut verwendet werden. Neben Erhitzen kann der Chip auch durch denaturierende Agenzien, wie z.B. 0,1 % NaOH regene¬ riert werden. Dieses Verfahren ermöglicht es auch, den Chip mit Referenznuklein¬ säuren zu hybridisieren, um so jeden Chip vor, während oder nach der Messung zu kalibrieren. Auf diese Weise ist es möglich, die Messwerte von verschieden Experi¬ menten miteinander zu vergleichen und individuelle Unterschiede, die z.B. in der Herstellung der Chips begründet liegen können, herauszurechnen. Weiterhin ermöglicht dieses Verfahren die Qualitätskontrolle der Chips während des Einsatzes und erlaubt die Feststellung, ob ein Chip noch für weitere Experiment geeignet ist oder nicht.
Sollten für solche Experimente Chips verwendet werden, bei denen die initiale Hybridisisierung nicht vollständig aufgelöst werden kann, so können solche Chips durch Blockieren mit einer unmarkierten Probe, die an alle Nukleinsäuresonden bindet, abgesättigt werden, so dass nach dem eigentlichen Experiment und der Ablösung der hybridisierten Proben kein Restfluoreszenzsignal zurückbleibt.
Beispiele
Detektion der Mutation H63D des Haemochromatosegens Mutation H63D: Der Basenaustausch eines Cytosin gegen ein θuanin (C→G; Transversion) an Position 187 im Exon 2 des HFE-Θens führt zu einem Aminosäureaustausch eines Histidin zu Asparaginsäure an Position 63 des HFE-Proteins. Diese Mutation wird in der Literatur als H63D bezeichnet (Feder et al 1996).
Bei der Mutation H63D handelt es sich mit dem Austausch eines Cytosins gegen ein Guanin um eine Transversion. Dabei wird eine Pyrimidin- gegen eine Purinbase ausgetauscht und es kommt zu einer sterischen Hinderung an der Stelle der Basenfehlpaarung. Da sich bei den bei Transversionen vorliegenden Basenfehl- paarungen auch keine Bindung ausbilden kann, sind diese leichter detektierbar.
Die Sonden zur Detektion der Mutation H63D tragen an zentraler Stelle der spezifi¬ schen Sequenz ein C (wt-Sonde) bzw. ein θ (mut-Sonde). Die Proben-DNA trägt an der entsprechenden Stelle ein θ (wt-Probe; H63D (+/+)), ein C (mut-Probe; H63D (-/-)) bzw. zu 50% ein θ und 50% ein C (het-Probe; H63D (+/-)).
Daraus ergeben sich bei der Detektion folgende Basenpaarungen bzw. Fehlpaa¬ rungen an zentraler Stelle der Sondenpaare:
Bei Hybridisierung mit einer wt-Probe:
- wtSonde-wtProbe: Csθ - mutSonde-wfProbe: θ θ
Bei Hybridisierung mit einer mut-Probe:
- wtSonde-mutProbe: C C
- mutSonde-mutProbe: G≡C Bei Hybridisierung mit einer het-Probe: (eiwα gleiche Signαlintensität an wt- und mut-Sonde)
- wϊSonde-wtProbe (und wtSonde-mutProbe): G≡θ (und C C) - mutSonde-mutProbe (und mutSonde-wtProbe): Θ≡C (und θ G)
1) Herstellen der Sensorchips
Auf PMMA Träger der Dimension 7όx25xl mm mit einer seitlichen Kante von 70° zum Einkopplen des Anregungslichtes werden mit einem Top-Spot Drucker oder einem anderen geeigneten Gerät (Lehr 2002) Oligonukleotide aufgedruckt. Als Druckpuffer wird eine 5%ige DMSO Lösung in Wasser verwendet. Die Oligonukleoti¬ de liegen dabei in einer Konzentration von 10 μM vor. Die Oligonukleotide beste¬ hen aus einer Erkennungssequenz der Ziel-DNA von 17 Nukleotiden Länge und der gesuchten Mutation in der Mitte der Sequenz. An dem 5'-Ende des Oligonukleoti- des befindet sich ein Polythymidinstrang vonmindestens 10 Nukleotiden Länge. Zum Immobilisieren der Oligonukleotide werden die frisch bedruckten Chips für 10 Minuten in einem UV-Crosslink-Ofen (Stratalinker, Stratagene) für 10 Minuten mit UV-Licht einer Wellenlänge von 260 nm bestrahlt. Anschließend mit Wasser dem ein Detergenz zugesetzt ist (0,1 % SDS) gründlich gespült mit destilliertem Wasser nachgespült und im Stickstoffstrom trockengeblasen.
2) Schmelzkurven für die Mutation H63D
Zur Messung der Schmelzkurven zur Detektion der Mutation H63D wurden Chips mit einem 17mer Sondenpaar (63_17wt und ό3_17mut) hergestellt. Die Chips wurden im TIRF-Meßgerät mit DNA-Proben der verschiedenen Ausprägungen a) Wf- Probe, b) mut-Probe, c) het-Probe) hybridisiert, gefärbt und das Dissoziationsverhal¬ ten von dem Sondenpaar gemessen. Die Fluoreszenzintensitäten an der Wt- und mut-Sonde wurden dazu über ein Temperaturspektrum von 20°C-80°C in 2°C- Schritten beobachtet und in den folgenden Diagrammen dargestellt.
3) DNA-Aufreinigung aus Blut
Die DNA-Aufreinigung wurde aus 10ml humanem Blut mittels des „nucleon extracti- on and purification kit" der Firma Amersham Biotech durchgeführt.
4) Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration
Zur genauen Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen wurde die Absorption von UV-Strahlung der Wellenlänge 260 und 280nm durch eine Nukleinsäurelösung, gegen das jeweilige Lösungsmittel, in einem Spektralphotometer gemessen. Eine A2όo-Einheit entspricht dabei einer Doppelstrang-DNA-Konzentration von 50μg/mt und einer Einzelstrang-DNA-Konzentration von 33μg/ml. Das Verhältnis der Absorp¬ tionen bei 260 und 280nm ist ein Indikator für die Reinheit der DNA. Er nimmt bei optimaler Reinheit einen Wert von 1,8 an.
5) Amplifizieren und Markieren der DNA
Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction PCR) (Mullis et al.,198ό). Mit Hilfe der PCR ist es möglich, aus einer geringen Menge an DNA einen gezielten Abschnitt zwischen zwei bekannten Sequenzen zu vervielfältigen. Hierzu sind zwei Oligonukleotidprimer nötig, die gegenläufig an die komplementären Stränge einer bekannten DNA-Sequenz binden. Des weiteren müssen neben der zu amplifizie- renden Sequenz die Nukleotide dATP, dCTP, dθTP und dTTP zugegeben werden sowie die Taq-Polymerase, die in der Lage ist, den DNA-Strang von den Primern aus zu verlängern.
Grundlegende Schritte der PCR sind:
- Denaturierunqsphase; hier wird die doppelsträngige DNA bei 94-950C zu Einzelsträngen aufgeschmolzen.
- Annealingphase: Die Primer lagern sich bei einer Temperatur, die nahe der Schmelztemperatur Tm der Primer liegt an die einzelsträngige DNA an.
- Extensionsphase: Bei 72°C erfolgt die Verlängerung der Primer und dadurch die Synthese eines DNA-Doppelstrangs mit Hilfe der Taq-Polymerase und den zuge¬ setzten Nukleotiden. Durch Wiederholung dieser 3 Schritte bis zu 50 mal ist es möglich eine sehr hohe Kopienzahl des gewünschten Sequenzabschnittes zu erhalten.
ό) Markierung der PCR mittels Biotin
In die PCR können neben den natürlich vorkommenden Nukleotiden auch modifi¬ zierte Nukleotide eingebaut werden. Den Nukleotiden können z.B. Fluoreszenzfarb- stoffe oder Biotin angehängt sein, wobei sich biotinylierte Nukleotide sehr viel einfacher und effizienter einbauen lassen als z.B. Cy5-markierfe Nukleotide. Um das PCR-Produkt auf dem Chip mit Streptavidin-Cy5 nachweisen zu können, wurde Biotin-! ό-dUTP in die DNA eingebaut. Dabei wurde das Biotin-dUTP anstelle von dTTP eingebaut. Wahlweise kann auch direct Cy-5 dUTP eingebaut werden.
7) PCR-Ansatz für die biotinylierte Multiplex-PCR zur Detektion von Hämochromato- se-Ansatzt in einem Volumen von 25μl. Zur Amplifikation wurde ein Standardpro¬ gramm für kurze DNA-Amplikons verwendet: Template DNA 10OnM
Primerl Fw 075μM
Primerl Rev 075μM Primer2Fw 075μM
Primer2Rev 0,5 μM dNTP's (ohne dπP) O7I mM aTTP 0708mM
BiotindUTP O7OOmM MgCI2 275mM l OxPuffer l :10 Verd.
HotStarTaq 0725U
7) Herstellen von DNA-Einzelsträngen Zur Herstellung von DNA-Einzelsträgen wurden PCR-Produkte verwendet, die mit einem thioatmodifizierten Primer und einem nicht-modifizierten Primer hergestellt wurden. Diese PCR-Produkte wurden in einem Volumen von 25μl mit 1 μl 17 Gen ό Exonuklease der Firma Amersham versetzt und 30min bei 37°C inkubiert. Zum Beenden der Reaktion wurde der Ansatz für 10min bei 85°C erhitzt.
8) Hybridisierung
Die Hybridisierung erfolgte durch die Zugabe der ampliflzierten Probe in Hybridisie- rungspuffer auf das Meßfeld des Sensorchips. Die Hybridisierungslösung wurde im TIRF-Meßgerät direkt in eine Hybridisierungsküvette gegeben. Anschließend wurden die Träger in der Hybridisierungsküvette des TIRF-Θeräts für einige Sekunden mit handelsüblichen Waschpuffer gespült.
9) Färbung
Das Anfärben der gebundenen biotinylierten PCR-Fragmente erfolgte durch Inkubation mit einem Streptavidin-Cy5-Konjugat. Die Stammlösung wurde nach Herstellerangaben in Färbepuffer aufgenommen. Diese wurde direkt in die Hybridi¬ sierungsküvette des TIRF-Meßgeräts gegeben.
10) Fluoreszenzmessung Der Träger wurden im Analysator mit Laserlicht bestrahlt. Der verwendete Fluores¬ zenzfarbstoff Cy5 (siehe Fig. 1) absorbiert laut Herstellerangaben (Amersham Biotech) bei λmax=649nm und emittiert bei λmaχ=ό70nm, Das emittierte Licht wurde mit einer CCD-Kamera aufgenommen und das entstandene Bild mit den einzelnen Fluoreszenzpunkten ausgewertet. Die Umwandlung von graphischen Daten der Fluoreszenzintensitäten in Zahlenwerte wurde mit einem kommerziell verfügbaren Computerprogramm durchgeführt.
1 1) Analyse von Schmelzkurven
Zur Analyse von Schmelzkurven wurden alle Schritte in der Hybridisierungsküvette im Analysegerät durchgeführt. Die Hybridisierung der amplifizierten, biotinylierten, einzelsträgigen DNA-Probe erfolgte bei 200C für 15min-2h an die Sonden des Sensorchips. Unter diesen wenig stringenten Bedingungen wird die Probe mit hoher Hybridisierungseffizienz an den Chip gebunden. In der darauffolgenden Färbereak¬ tion wurden die an die Sonden gebundenen biotinylierten Proben-DNA-Fragmente mit einer Streptavidin-Cy5-Lösung für 5min angefärbt. Darauf erfolgte unter graduel¬ ler Temperaturerhöhung durch die Aufnahme vieler Einzelbilder.
Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 beschreibt die TIRF-Messoptik. Laserlicht aus einer Halbleiterlaserdiode (1) wird durch eine Linse (2) fokussiert (3) und auf die Einkoppelkante eines TIRF-Messchips (4) gestrahlt. Auf der Oberfläche dieses Chips befinden sich Biomoleküle (5,6), die mit einem Lumineszenzfärbstoff markiert sind. Innerhalb des evaneszenten Feldes werden die Lumineszenzfarbstoffe angeregt und geben Lumineszenzlicht ab (5,7), das mittels geeigneter Detektoren aufgefangen werden kann. Lumineszenzfarbstof¬ fe, die ausserhalb des evaneszenten Feldes sind, werden Lumineszenzfarbstoffe nicht angeregt (ό) und geben dementsprechend kein Licht ab. Das Fluoreszenzlicht (7) kann mittels handelsüblicher CCD- oder CMOS- Kameras aufgezeichnet werden.
Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Analyse von drei Experimenten im Vergleich zueinander. Dabei sind auf der Abszisse die Temperatur in °C und auf der Ordinate die Signaldifferenz an einem 17mer Sondenpaar (Mutation Hό3D bei Hybridisie- rung mit verschiedenen θenolypen) aufgetragen. Bei der oberen Kurve wurde als Analyt eine DNA verwendet, die nur Wildtyp-Allele enthält. Durch Vergleich der Schmelzpunktkurven die an den Sonden für die Wildlyp-DNA und die zu untersu¬ chende mutierte DNA aufgenommen wurden erhält man eine Differenzenkurve. Um diese zu erhalten wird, zuerst die aufgenommene Schmelzpunktkurve errech- net. Dazu wird der hybridiserte Chip von 20°C auf 800C in Schritten von 2°C erhitzt. Bei Erreichen der Temperatur wird der Chip mit der Kamera aufgenommen und das Bild der Fluoreszenz abgespeichert. Anschließend wird das Signal der Fluores¬ zenzbilder verschiedener Temperaturstufen ausgewertet. Dazu wird die Signalinten- sität an den Punkten, an denen die Sonden immobilisiert sind, quantifiziert. Gleich¬ zeitig werden Referenzpunkte auf dem Chip ausgewertet an denen fluoreszenz¬ markierte DNA immobiliert ist. Dieses Signal nimmt beim Erhitzen des Chips ab (da das Fluoreszenzsignal durch Wärme reduziert wird). Diese Abnahme wird prozen- tual bestimmt und die aufgenommenen Signalkurven werden um diese Abnahme korrigiert. Nach erfolgter Korrektur wird nun das Signal der Sonde der gesuchten Mutation von der Sonde der Wildlyp-DNA subtrahiert. Das Ergebnis wird als Graph aufgetragen. Die mittlere Kurve stellt den Fall dar, wenn im Analyt sowohl Wildlyp- DNA als auch mutierte DNA vorhanden ist. Die Kurve bildet dann im Idealfall eine Gerade entlang des Nullpunktes. Die untere Kurve stellt nun den Fall dar, wenn im Analyt nur mutierte DNA vorhanden ist. Die Differenz der Bindungskurve von Wildlyp- DNA zur Bindungskurve der mutierten DNA ist negantiv, da die mutierte DNA mit wesentlich geringerer Bindungsenergie an die Wildtyp-Sonde bindet, als diese an die Sonde der mutierten DNA-Sequenz bindet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuren, umfassend
(a) Messen der Schmelzkurve eines Nukleinsäurehybrides einer Proben- nukleinsäure mit einer ersten Nukleinsäuresonde,
(b) Messen der Schmelzkurve eines Nukleinsäurehybrides einer Proben- nukleinsäure mit einer zweiten Nukeinsäuresonde, welche sich von der ersten Nukleinsäuresonde um mindestens einen Nukleotid unterschei¬ det aber zur ersten Nukleinsäuresonde zu mindestens 80% homolog ist
(c) mathematischer Vergleich der Schmelzkurve aus (b) von der Schmelz- kurve aus (a) und
(d) Vergleich des Ergebnisses aus (c) mit Referenzwerten für die möglichen Zusammensetzungen der Nukleinsäureproben.
2. Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuren, umfassend
(a) Messen der Schmelzkurve eines Nukleinsäurehybrides einer Probennukleinsäure mit einer ersten Nukleinsäuresonde;
(b) Messen der Schmelzkurve eines Nukleinsäurehybrides einer
Probennukleinsäure mit einer zweiten Nukeinsäuresonde; welche sich von der ersten Nukleinsäuresonde um mindestens einen Nukleotid unterscheidet; aber zur ersten Nukleinsäuresonde zu mindestens 80% homolog ist;
(c) mathematischer Vergleich der Schmelzkurve aus (b) von der Schmelz¬ kurve aus (a),
(d) Vergleich des Ergebnisses aus (c) mit Referenzwerten für die möglichen Zusammensetzungen der Nukleinsäureproben und
(e) Festlegen eines Befundes aufgrund der erhobenen Daten.
3. Verfahren zur Bestimmung der Identität einer Nukleinsäure, dadurch ge¬ kennzeichnet dass
(a) die Schmelzpunktkurve der Bindung einer Referenznukleinsäure identi- scher Sequenz an eine Nukleinsäuresonde aufgenommen wird,
(b) die Schmelzpunktkurve der zu untersuchenden Nukleinsäure an einer Nukleinsäuresonde identischer Sequenz aufgenommen wird, und
(c) die beiden Schmelzpunktkurven mathematisch verglichen werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der die Daten mittels eines beheizbaren TIRF-Θerätes gewonnen werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäuresonden kovalent auf Oberfläche eines Wellenleiters gebunden sind.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Nuklein¬ s sääuurreessoonnddeenn auf einem Polymer oder einer Polymerschicht kovalent ge- bunden sind.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen auf dem Wellenleiterchip eine Vielzahl von Nukleinsäuresonden aufgebracht ist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Wellenleiterchip nach Durchführung eines Experimentes von der gebunde¬ nen Nukleinsäure befreit wird und zu weiteren Experimenten verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei denen der Wellenleiterchip mit einer Referenznukleinsäure hybridisiert wird, um Ver¬ gleichswerte für die nachfolgenden Messungen zu haben.
10. Verfahren zur Reduktion unspezifischer Signale auf DNA-Chips, dadurch gekennzeichnet dass
(a) ein DNA-Chip mit einer unmarkierten Probe, die an die Nukleinsäuresonden auf dem Chip bindet hybridisiert wird, (b) die Hybridisierung wieder aufgelöst wird, und
(c) dieser DNA-Chip anschließend zu weiteren Hybridisierungsexperimen- ten mit markierter DNA verwendet wird.
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