DE102007031710B3

DE102007031710B3 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden in einer Probe

Info

Publication number: DE102007031710B3
Application number: DE200710031710
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth; Sonja Mohry
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2007-07-06
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2027-07-07
Also published as: WO2009007008A1

Abstract

Eine Vorrichtung (1) zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden (2, 3) einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden (4) einer dritten Ligandenart in einer Probe hat einen Biosensor (5), der einen Träger (6) aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden (8) und zweite Nukleinsäuresonden (9) immobilisiert sind. Die ersten Nukleinsäuresonden (8) sind bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden (2, 3) der ersten und zweiten Ligandenart und die zweiten Nukleinsäuresonden (9) sind bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden (4) der dritten Ligandenart. Die Länge der ersten Nukleinsäuresonden (8) beträgt maximal 25 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden (9) minimal 35 Nukleotide. Die Vorrichtung (1) hat eine Temperiereinrichtung, eine Messeinrichtung zum Erfassen von Messwerten für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) und der zweiten Nukleinsäuresonden (9) sowie eine mit der Messeinrichtung und einem Datenspeicher (14) für Referenzwerte verbundene Auswerteeinrichtung (13).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart in einer Probe, wobei ein Träger bereitgestellt wird, auf dem erste Nukleinsäuresonden und zweite Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, und wobei die ersten Nukleinsäuresonden und die zweiten Nukleinsäuresonden jeweils bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden der ersten und zweiten Ligandenart sind. Außerdem betrifft die Erfindung eine Vorrichtung mit einem Biosensor, der einen Träger aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden und zweite Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, wobei die ersten Nukleinsäuresonden bindungsspezifisch für Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sind. Dabei wird unter einer Punktmutation eine Abweichung in einer einzigen Nukleinsäurebase des Nukleinsäurestrangs des Nukleinsäure-Liganden verstanden.
Aus H. -P. Lehr et al., Real-Time Detection of Nucleic Acid Interactions by Total Internal Reflection Fluorescence, Analytical Chemistry, Vol. 75, No. 10, May 15, 2003, Seiten 2414–2420 ist ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart in einer Probe bekannt. Dabei wird ein Biosensor bereitgestellt, der als Träger einen optischen Wellenleiter hat, der ein Einkoppelfenster aufweist, durch das eine mittels eines Lasermoduls erzeugte optische Strahlung eingekoppelt wird. An der Oberfläche des Wellenleiters sind erste und zweite Teststellen vorgesehen, die seitlich voneinander beabstandet sind. An den ersten Teststellen sind 15-mer Oligonukleotide und an den zweiten Teststellen 17-mer Oligonukleotide jeweils Im Evaneszenzfeld der in den Wellenleiter eingekoppelten optischen Strahlung immobilisiert. Die 15-mer Oligonukleotide sind für einen in der Probe enthaltenen ersten Nukleinsäure-Liganden (Wildtyp) und die 17-mer Oligonukleotide für einen in der Probe enthaltenen zweiten Nukleinsäure-Liganden (Mutant) bindungsspezifisch. Zum Nachweis der ersten und zweiten Nukleinsäure-Liganden wird die Probe bei einer Temperatur von 20°C derart mit den Teststellen in Kontakt gebracht, dass die ersten Nukleinsäure-Liganden an die 15-mer Oligonukleotide und die zweiten Nukleinsäure-Liganden an die 17-mer Oligonukleotide binden können. Die so erhaltenen Liganden-Sonden-Komplexe werden mit Cy5-Streptavidin markiert. Das Cy5-Streptavidin wird durch das evaneszente Feld der in den Wellenleiter eingekoppelten Strahlung zur Aussendung einer Lumineszenzstrahlung angeregt. Diese wird mit Hilfe einer CCD-Kamera ortsaufgelöst für die einzelnen Teststellen gemessen. Danach wird die Temperatur im Minutentakt in Schritten von 2°C von 20°C auf 80°C erhöht. Nach jeder Temperaturerhöhung wird jeweils für jede Teststelle erneut die Lumineszenzstrahlung gemessen. Mit den so erhaltenen Messwerten wird für jeden Nukleinsäure-Liganden eine sogenannte Schmelzkurve erstellt. Mit Hilfe der Schmelzkurven ist es möglich, zu überprüfen, ob in der Probe Nukleinsäure-Liganden, die sich durch eine Einzelpunkt-Mutation voreinander unterscheiden, enthalten sind. Ein Nachteil des Verfahrens besteht jedoch darin, dass es nur eine relativ geringe Nachweisempfindlichkeit für die in der Probe enthaltenen Nukleinsäure-Liganden ermöglicht.
Aus WO 2006/055299 A2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine Nukleinsäure-Liganden enthaltende Probe erhitzt wird und bei dem die Änderung der optischen Eigenschaften der Probe in Abhängigkeit von der Temperatur gemessen wird. Mit dem Verfahren kann der Schmelzpunkt eines in Lösung befindlichen DNA-Doppelstrangs ermittelt werden. Das Verfahren ist jedoch nicht dazu geeignet, die Schmelzpunkte von mindestens zwei an eine Festphase gebundenen DNA-Doppelsträngen zu bestimmen.
Aus US 6 503 711 B1 sind Sonden für Fluoreszenz-DNA-Messungen bekannt. An eine Lichtleitfaser werden Rezeptoren immobilisiert, um eine Eintauchsonde zu bilden. Die Sonde wird in eine Lösung eingetaucht, die eine zu den Sonden komplementäre DNA enthält. Wenn die DNA die Sonden kontaktiert, hybridisiert sie an die Sonden. Mit Hilfe der Lichtleitfaser wird eine Anregungsstrahlung zu den Sonden geleitet, die in Abhängigkeit von der Bindung der DNA an die Sonde eine Fluoreszenzstrahlung induziert. Die Lösung mit der Sonde wird erwärmt, um eine Schmelzkurve aufzuzeichnen. Dadurch sind geringe Unterschiede in der DNA unterscheidbar. Die Eintauchsonde ist jedoch nicht dazu geeignet, die Schmelzpunkte von mindestens zwei an eine Festphase gebundenen DNA-Doppelsträngen zu bestimmen.
Es besteht deshalb die Aufgabe, ein Verfahren und einen Biosensor der eingangs genannten Art zu schaffen, die eine weitergehende Untersuchung der Probe ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart in einer Probe, wobei ein Träger bereitgestellt wird, auf dem erste Nukleinsäuresonden und zweite Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, wobei die ersten Nukleinsäuresonden bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden der ersten und zweiten Ligandenart und die zweiten Nukleinsäuresonden bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden der dritten Ligandenart sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden maximal 25 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden minimal 35 Nukleotide beträgt, umfassend folgende Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit den ersten Nukleinsäuresonden und den zweiten Nukleinsäuresonden, derart, dass die Nukleinsäure-Liganden an die ersten Nukleinsäuresonden und die zweiten Nukleinsäuresonden jeweils spezifisch hybridisieren können, wenn die Nukleinsäure-Liganden in der Probe enthalten sind,
b) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden abhängigen ersten Messwerts bei einer ersten Temperatur, die es ermöglicht, die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen aufrecht zu erhalten,
c) Einstellen einer zweiten Temperatur, die höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde,
d) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden abhängigen zweiten Messwerts und wenigstens eines von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden abhängigen dritten Messwerts,
e) Vergleich des ersten und zweiten Messwerts mit Referenzwerten und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs ermitteln, ob die Nukleinsäure-Liganden der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind,
f) Bestimmung der Konzentration der Nukleinsäure-Liganden der dritten Ligandenart in der Probe mit Hilfe des dritten Messwerts.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass mit Hilfe einer kurzen Nukleinsäuresonde mit einer Länge von maximal 25 Nukleotiden auf einfache Weise nachgewiesen werden kann, ob ein nicht mutierter Nukleinsäure-Ligand und/oder ein eine Einzel-Punktmutation aufweisender Nukleinsäure-Ligand in der Probe enthalten ist. Dabei wird davon Gebrauch gemacht, dass Nukleinsäure-Liganden an eine kurze Nukleinsäuresonde nur mit relativ geringer Bindungsenergie hybridisieren und dass die Bindung durch Temperaturerhöhung leicht wieder aufgelöst werden kann. Dabei erfolgt die Auflösung der Bindung zwischen der ersten Nukleinsäure sonde und dem ersten Nukleinsäure-Liganden einerseits und dem zweiten Nukleinsäure-Liganden andererseits bei unterschiedlichen Temperaturen. Im Unterschied dazu hybridisieren Nukleinsäure-Liganden an lange Nukleinsäuresonden, die eine Länge von minimal 35 Nukleotiden aufweisen, mit einer höheren Bindungsenergie. Dadurch ist es möglich, die zweite Temperatur derart zu wählen, dass zwar die bei der ersten Temperatur eventuell vorhandene Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden zum größten Teil aufgelöst wird, eine eventuell vorhandene Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden aber im Wesentlichen erhalten bleibt. Bei der ersten Temperatur eventuell vorhandene unspezifische Bindungen von Nukleinsäuren an die zweiten Nukleinsäuresonden lösen sich aufgrund ihrer geringen Bindungsenergie bei der zweiten Temperatur auf. Somit kann die im Vergleich zur Sensitivität der kurzen Nukleinsäure-Liganden deutlich höhere Sensitivität der langen Nukleinsäure-Liganden dazu genutzt werden, die Konzentration der zweiten Nukleinsäure-Liganden in der Probe mit großer Präzision zu bestimmen. Die Nukleinsäuresonden können DNA- und/oder RNA-Sonden sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, mit nur einem einzigen Biosensor eine Probe auf Punktmutation(en) und Genexpression(en) zu untersuchen.
Vorteilhaft ist, wenn bei der ersten Temperatur ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden abhängiger vierter Messwert erfasst und mit einem Vergleichswert verglichen wird. Die anhand der ersten, zweiten und dritten Messwerte gewonnen Aussagen über das Vorhandensein und die Konzentration der Nukleinsäure-Liganden in der Probe können dann mit Hilfe des vierten Messwerts auf Plausibilität überprüft werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stimmt ein Abschnitt der Basensequenz der zweiten Nukleinsäuresonden mit der Basensequenz des ersten Nukleinsäuresonden überein. Der erste oder zweite Nukleinsäure-Ligand kann in diesem Fall identisch mit dem dritten Nukleinsäure-Ligand sein, so dass mit Hilfe des dritten Messwerts die Konzentration des ersten oder zweiten Nukleinsäure-Ligands ermittelt werden kann.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird auch durch ein Verfuhren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sowie zum Bestim men der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart in einer Probe gelöst, bei dem ein Träger bereitgestellt wird, auf dem erste Nukleinsäuresonden, zweite Nukleinsäuresonden und dritte Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, wobei sich die zweiten Nukleinsäuresonden jeweils durch eine Nukleinsäurebase von den ersten Nukleinsäuresonden unterscheiden, wobei die ersten Nukleinsäuresonden für die Nukleinsäure-Liganden der ersten Ligandenart, die zweiten Nukleinsäuresonden für die Nukleinsäure-Liganden der zweiten Ligandenart und die dritten Nukleinsäuresonden für die Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart bindungsspezifisch sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden und der zweiten Nukleinsäuresonden jeweils maximal 25 Nukleotide und die Länge der dritten Nukleinsäuresonden minimal 35 Nukleotide beträgt, umfassend folgende Schritte:

a) Inkontaktbringen der Probe mit den ersten Nukleinsäuresonden, den zweiten Nukleinsäuresonden und den dritten Nukleinsäuresonden, derart, dass die Nukleinsäure-Liganden spezifisch an die Nukleinsäuresonden hybridisieren können, wenn die Nukleinsäure-Liganden in der Probe enthalten sind,
b) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden abhängigen ersten Messwerts bei einer Temperatur, die es ermöglicht, die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen aufrecht zu erhalten,
c) Erfassung wenigstens eines von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden abhängigen zweiten Messwerts bei einer Temperatur, die es ermöglicht, die Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen aufrecht zu erhalten,
d) Erhöhen der Temperatur auf einen Wert, der höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde und die Schmelztemperatur der mindestens einen zweiten Nukleinsäuresonde,
e) Erfassung zumindest eines von der Hybridisierung der dritten Nukleinsäuresonden abhängigen dritten Messwerts,
f) Vergleich des ersten und zweiten Messwerts mit Referenzwerten und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs ermitteln, ob die Nukleinsäure-Liganden der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind,
g) Bestimmung der Konzentration, welche die Nukleinsäure-Liganden der dritten Ligandenart in der Probe aufweisen, mit Hilfe des dritten Messwerts.

Bei diesem Verfahren sind also zwei unterschiedliche kurze Nukleinsäuresonden vorhanden, von denen die eine für Nukleinsäure-Liganden der ersten Ligandenart und die andere für Nukleinsäure-Liganden der zweiten Ligandenart bindungsspezifisch ist. Dadurch ist es möglich, die für den Nachweis der ersten und zweiten Nukleinsäure-Liganden benötigten ersten und zweiten Messwerte bei derselben Temperatur zu messen. Diese Temperatur wird so gewählt, dass eine eventuell vorhandene Hybridisierung der ersten und zweiten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen aufrechterhalten bleibt. Das kann dadurch erreicht werden, dass die Temperatur kleiner gewählt wird als die Schmelztemperatur der ersten und der zweiten Nukleinsäuresonden. Der dritte Messwert wird bei einer Temperatur erfasst, bei der eine unspezifische Bindungen von Nukleinsäuren an die dritten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen vermieden wird. Auch mit diesem Verfahren kann mit nur einem einzigen Biosensor eine Punktmutation und eine Genexpression der Probe untersucht werden.
Vorteilhaft ist, wenn bei der zweiten Temperatur ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden abhängiger vierter Messwert und/oder ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden abhängiger fünfter Messwert erfasst und diese Messwerte mit Vergleichswerten verglichen werden. Die anhand der ersten, zweiten und dritten Messwerte gewonnen Aussagen über das Vorhandensein und die Konzentration der Nukleinsäure-Liganden in der Probe kann dann mit Hilfe des vierten und/oder fünften Messwerts auf Plausibilität überprüft werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung stimmt ein Abschnitt der Basensequenz der dritten Nukleinsäuresonden mit der Basensequenz der ersten Nukleinsäuresonden oder der der zweiten Nukleinsäuresonden überein. Der erste oder zweite Nukleinsäure-Ligand kann in diesem Fall identisch mit dem dritten Nukleinsäure-Ligand sein, so dass mit Hilfe des dritten Messwerts die Konzentration des ersten oder zweiten Nukleinsäure-Ligands ermittelt werden kann.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden an die ersten Nukleinsäuresonden eine erste Lumineszenzstrahlung und/oder in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden an die zweiten Nukleinsäuresonden eine zweite Lumineszenzstrahlung erzeugt und/oder in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden an die dritten Nukleinsäuresonden eine dritte Lumineszenzstrahlung erzeugt, wobei der erste Messwert in Abhängigkeit von der ersten Lumineszenzstrahlung und/oder der zweite Messwert in Abhängigkeit von der zweiten Lumineszenzstrahlung und/oder der dritte Messwert in Abhängigkeit von der dritten Lumineszenzstrahlung detektiert wird. Dabei kann die Emission der Lumineszenzstrahlung durch eine chemische Reaktion und/oder eine optische Anregungsstrahlung angeregt werden.
Gegebenenfalls ist es sogar möglich, dass die Lumineszenzstrahlung durch Anregung eines optischen Markers in einem evaneszenten elektromagnetischen Feld erzeugt wird. Dies kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass die Nukleinsäure-Liganden direkt auf der Oberfläche eines eine optische Strahlung führenden Wellenleiters immobilisiert sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach dem Erfassen des dritten Messwerts der Biosensor derart erhitzt, dass die Hybridisierung der Nukleinsäuresonden aufgelöst wird, und danach wird das erfindungsgemäße Verfahren mit demselben Biosensor erneut durchgeführt. Der Biosensor kann also wieder verwendet werden. In vorteilhafter Weise werden durch das Inkontaktbringen des Biosensors mit der Probe eventuelle an der Oberfläche des Trägers befindliche frei Radikale gesättigt, so dass nach dem Auflösen der Hybridisierung bei der erneuten Durchführung des Verfahrens ein unspezifische Bindung von Liganden an den Träger weitestgehend vermieden wird. Das Verfahren ermöglicht dadurch eine hohe Messgenauigkeit.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird ferner gelöst durch eine Vorrichtung mit einem Biosensor, der einen Träger aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden und zweite Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, wobei die ersten Nukleinsäuresonden bindungsspezifisch für Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sind, wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden maximal 25 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden minimal 35 Nukleotide beträgt, wobei die zweiten Nukleinsäuresonden bindungsspezifisch für Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart sind, mit einer Temperiereinrichtung, mit einer zum Erfassen von Messwerten für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden und der zweiten Nukleinsäuresonden ausgestalteten Messeinrichtung, und mit einer mit der Messeinrichtung und einem Datenspeicher für Referenzwerte verbundenen Auswerteeinrichtung.
Mit Hilfe der Temperiereinrichtung und der Messeinrichtung können dann ein erster Messwert für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden bei einer Temperatur, bei der eine eventuell vorhandene Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen erhalten bleibt, ein zweiter Messwert für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden bei einer Temperatur, die höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde, und ein dritter Messwert für die Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden gemessen werden. Die so erhaltenen Messwerte können dann an die Auswerteeinrichtung übermittelt werden, um die ersten und zweiten Messwerte mit den Referenzwerten zu vergleichen und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Nukleinsäure-Liganden der ersten und zweiten Ligandenart in der Probe zu schließen. In der Auswerteeinrichtung kann außerdem aus dem dritten Messwert und ggf. mindestens einer im Datenspeicher abgelegten Kenngröße die Konzentration des dritten Liganden in der Probe bestimmt werden. Die Messeinrichtung, die Auswerteeinrichtung und der Datenspeicher können ggf in einen Halbleiterchip integriert sein. Die Nukleinsäuresonden sind vorzugsweise kovalent auf dem Träger immobilisiert.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird ferner gelöst durch eine Vorrichtung mit einem Biosensor, der einen Träger aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden, zweite Nukleinsäuresonden und dritte Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, wobei sich die zweiten Nukleinsäuresonden jeweils durch eine Nukleinsäurebase von den ersten Nukleinsäuresonden unterscheiden, wobei die ersten Nukleinsäuresonden für Nukleinsäure-Liganden einer ersten Ligandenart, die zweiten Nukleinsäuresonden für Nukleinsäure-Liganden einer zweiten Ligandenart, die sich durch eine Punktmutation von der ersten Ligandenart unterscheidet, und die dritten Nukleinsäuresonden für die Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart bindungsspezifisch sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden und der zweiten Nukleinsäuresonden jeweils maximal 25 Nukleotide und die Länge der dritten Nukleinsäuresonden minimal 35 Nukleotide beträgt, mit einer Temperiereinrichtung, mit einer zum Erfassen von Messwerten für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden, der zweiten Nukleinsäuresonden und der dritten Nukleinsäuresonden ausgestalteten Messeinrichtung sowie mit einer mit der Messeinrichtung und einem Datenspeicher für Referenzwerte verbundenen Auswerteeinrichtung. Der Biosensor ist bevorzugt als DNA-Microarray ausgestaltet.
Mit Hilfe der Temperiereinrichtung und der Messeinrichtung können dann ein erster Messwert für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden bei einer Temperatur, bei der eine eventuell vorhandene Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden im Wesentlichen erhalten bleibt, ein zweiter Messwert für eine entsprechende Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden gemessen werden. Ein dritter Messwert für die Hybridisierung der dritten Nukleinsäuresonden kann bei einer Temperatur gemessen werden, die höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde und die Schmelztemperatur der mindestens einen zweiten Nukleinsäuresonde. Die so erhaltenen Messwerte können dann an die Auswerteeinrichtung übermittelt werden, um die ersten und zweiten Messwerte mit den Referenzwerten zu vergleichen und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Nukleinsäure-Liganden der ersten und zweiten Ligandenart in der Probe zu schließen. In der Auswerteeinrichtung kann außerdem aus dem dritten Messwert und ggf. im Datenspeicher abgelegten Kenngrößen die Konzentration des dritten Liganden in der Probe bestimmt werden.
Vorteilhaft ist, wenn unterhalb der ersten Nukleinsäuresonden, der zweiten Nukleinsäuresonden und/oder der dritten Nukleinsäuresonden jeweils ein optischer Sensor zum Detektieren von in Abhängigkeit von der Hybridisierung der betreffenden Nukleinsäuresonden erzeugter Lumineszenzstrahlung angeordnet ist. Die Lumineszenzstrahlung kann dann direkt an den Nukleinsäuresonden und somit mit entsprechend großer Sensitivität gemessen werden.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist der Träger eine optische Wellenleiterschicht mit einem Einkoppelfenster für eine Anregungsstrahlung auf, wobei die ersten Nukleinsäuresonden, die zweiten Nukleinsäuresonden und/oder die dritten Nukleinsäuresonden direkt auf der Wellenleiterschicht immobilisiert sind. Die Emission der Lumineszenzstrahlung kann dann durch das evaneszente Feld der im Wellenleiter geführten Anregungsstrahlung erfolgen.
Nachfolgend sind Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt:
1 eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Nukleinsäure-Liganden enthaltenden Probe, mit einem Träger der mehrere Teststellen aufweist, an denen Nukleinsäuresonden immobilisiert sind,
2 einen Teillängsschnitt durch ein erstes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung,
3 eine graphische Darstellung von Schmelzkurven von Nukleinsäure-Sonden, wobei auf der Abszisse die Temperatur T und auf der Ordinate das normierte Messsignal aufgetragen ist,
4 einen Teillängsschnitt durch ein zweites Ausführungsbeispiel der Vorrichtung. und
5 eine graphische Darstellung von Schmelzkurven von Nukleinsäure-Sonden, wobei auf der Abszisse die Temperatur T und auf der Ordinate das normierte Messsignal aufgetragen ist.
Eine in 1 im Ganzen mit 1 bezeichnete Vorrichtung zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden 2 einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation M davon unterscheidenden Nukleinsäure-Liganden 3 einer zweiten Ligandenart sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden einer dritten Ligandenart 4 in einer Probe hat einen Biosensor 5 der einen Träger 6 aufweist, der eine an seine Oberfläche angrenzende eine optische Wellenleiterschicht 7 hat. Die Wellenleiterschicht ist bevorzugt eine Polymerschicht. Sie kann aber auch aus Glas bestehen.
An der Oberfläche der Wellenleiterschicht 7 sind voneinander beabstandete Teststellen angeordnet. An einer ersten Teststelle sind erste Nukleinsäuresonden 8 und an einer zweiten Teststelle zweite Nukleinsäuresonden 9 immobilisiert. Um die Übersichtlichkeit der Zeichnung zu verbessern, sind in 2 vereinfacht nur zwei erste Nukleinsäuresonde 8 und eine zweite Nukleinsäuresonde 9 dargestellt.
Die Nukleinsäuresonden 8, 9 sind bevorzugt über eine in der Zeichnung nicht näher dargestellte, nicht hybridisierende Zwischenschicht mit der Wellenleiterschicht 7 verbunden. Die Zwischenschicht kann eine Nucleinsäuresequenz, wie z. B. Thymidin und/oder PEG enthalten. Sie kann aber auch ein anderes Polymer aufweisen. Die Herstellung derartiger Biosensoren ist beispielsweise aus US 6 921 669 B2 und WO 2002/10752 A grundsätzlich bekannt.
Die ersten Nukleinsäuresonden 8 sind bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden 2 der ersten Ligandenart und für die Nukleinsäure-Liganden 3 zweiten Ligandenart. Die zweiten Nukleinsäuresonden 9 sind bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden 4 der dritten Ligandenart. Die Nukleinsäure-Liganden 2, 3, 4 können DNA- oder RNA-Liganden sein.
Die Länge der ersten Nukleinsäuresonden 8 beträgt 20 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden 9 beträgt 40 Nukleotide. In der Zeichnung sind aus Gründen der Übersichtlichkeit weniger Nukleotide dargestellt. Wie in 3 erkennbar ist, haben die zweiten Nukleinsäuresonden 9 wegen ihrer größeren Länge die eine höhere Schmelztemperatur T_m2 als die Schmelztemperatur T_m1 der ersten Nukleinsäuresonden 8. Unter einer Schmelztemperatur wird die Temperatur verstanden, bei der das Messsignal 50% des Messignals bei maximaler Hybridisie rung der betreffenden Nukleinsäuresonde 8, 9 beträgt. In 3 ist die Schmelzkurve der ersten Nukleinsäuresonden 8 mit 16a und die Schmelzkurve der zweiten Nukleinsäuresonden 9 mit 16b bezeichnet.
Die Vorrichtung 1 hat außerdem eine in der Zeichnung nicht näher dargestellte Temperiereinrichtung, mit der an den Nukleinsäuresonden 8, 9 unterschiedliche Temperaturen eingestellt werden können.
Zum Erzeugen einer Anregungsstrahlung für einen optischen Marker, der zur Markierung der Hybrdisierungsstellen der Nukleinsäuresonden 8, 9 dient, ist eine optische Strahlungsquelle 10 vorgesehen. Die Strahlungsquelle 10 ist einem Einkoppelfenster 11 der Wellenleiterschicht 7 zugewandt. Durch das Einkoppelfenster 11 wird die Anregungsstrahlung derart in die Wellenleiterschicht 7 eingekoppelt, dass an den Grenzflächen der Wellenleiterschicht 7 Totalreflexion auftritt. Die mit dem Marker markierten hybridisierten Nukleinsäuresonden 8, 9 sind im Evaneszenzfeld der in der Wellenleiterschicht 7 geführten Anregungsstrahlung angeordnet. Durch die Anregungsstrahlung werden die Marker zur Aussendung einer Lumineszenzstrahlung angeregt. Die evaneszente Anregung eines Markers ist aus WO 2006/24314 A als solches bekannt bekannt und wird auch als „TIRF-Verfahren" (Total Internal Reflection Fluorescence) bezeichnet. Wenn die Nukleinsäuresonden 8, 9 DNA-Sonden sind, kann der optische Marker beispielsweise Cy5-dUTP sein. Bei RNA-Sonden kann als Marker Cy5-UTP verwendet werden.
Zum Detektieren der Lumineszenzstrahlung sind unter den einzelnen Teststellen optische Sensoren 12a, 12b in den Träger 6 integriert. Die Sensoren 12a, 12b sind mit einer Auswerteeinrichtung 13 verbunden.
Zum Untersuchen der Probe wird diese zunächst derart mit den ersten Nukleinsäuresonden 8 und den zweiten Nukleinsäuresonden 9 in Kontakt gebracht, dass die Nukleinsäure-Liganden 2, 3, 4 spezifisch an die Nukleinsäuresonden 8, 9 hybridisieren können, wenn sie in der Probe enthalten sind. Hybridisierte Nukleinsäuresonden 8, 9 werden mit dem Marker markiert und danach werden auf dem Träger 6 eventuell noch vorhandene frei Marker und/oder freie Nukleinsäureliganden 2, 3,4 durch einen Spülvorgang von dem Träger 6 entfernt.
Dann wird mit Hilfe der Temperiereinrichtung eine Temperatur T₁ eingestellt, bei der die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 im Wesentlichen aufrechterhalten wird. Die Temperatur T₁ ist kleiner als die Schmelztemperatur T_m1 mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde 8 und kann beispielsweise 40°C betragen. Mit Hilfe des Sensors 12a wird mindestens ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 abhängiger erster Messwert erfasst. Die Schmelztemperatur T_m1 kann experimentell oder durch Berechnung mittels der sogenannten 4+2 Formel ermittelt werden. Diese besagt, dass sich die Schmelztemperatur einer Nukleinsäuresonde 8, 9 durch jede G- und C-Base, welche die Nukleinsäuresonde 8, 9 aufweist, jeweils um 4°C und durch jede A- und T-Base jeweils um 2°C erhöht. Die Basensequenz der Nukleinsäuresonden 8, 9 kann beispielsweise einer Gen-Datenbank entnommen werden.
Nun wird eine zweite Temperatur T₂ eingestellt, die höher ist als die Schmelztemperatur T_m1 mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde 8. Diese Temperatur kann beispielsweise 70°C betragen. Nachdem sich die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonde 8 aufgrund der Wärmeeinwirkung überwiegend aufgelöst hat, werden mit Hilfe des Sensors 12a mindestens ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 abhängiger zweiter Messwert und mit Hilfe des Sensors 12b mindestens ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden 8 abhängiger dritter Messwert erfasst.
Die ersten und zweiten Messwerte werden mittels der Auswerteeinrichtung 13 mit Referenzwerten verglichen, die in einem mit der Auswerteeinrichtung 13 verbundenen Datenspeicher 14 abgelegt sind. Die Referenzwerte können experimentell ermittelt werden. In Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs wird ermittelt, ob die Nukleinsäure-Liganden 2 der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden 3 der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind.
In der Auswerteeinrichtung 13 wird außerdem die Konzentration der Nukleinsäure-Liganden 4 der dritten Ligandenart mit Hilfe des dritten Messwerts und einer im Datenspeicher 14 abgelegten Kenngröße, die beispielsweise durch Kalibration bestimmt werden kann, berechnet. Die Ergebnisse der Auswertung können an einer in der Zeichnung nicht näher dargestellten, mit der Auswerteeinrichtung verbundenen Ausgabegerät, wie zum Beispiel einem Monitor und/oder Drucker, zur Anzeige gebracht werden.
Bei einem in 4 gezeigten weiteren Ausführungsbeispiel sind auf dem Träger 6 an einer ersten Teststelle erste Nukleinsäuresonden 8, an einer zweiten Teststelle zweite Nukleinsäuresonden 9 und an einer dritten Teststelle dritte Nukleinsäuresonden 15 auf der Wellenleiterschicht 7 immobilisiert. Die zweiten Nukleinsäuresonden 7 unterscheiden sich jeweils durch eine Nukleinsäurebase B von den ersten Nukleinsäuresonden 8 und stimmen im Übrigen mit diesen überein. Die ersten Nukleinsäuresonden 7 sind für die Nukleinsäure-Liganden 2 der ersten Ligandenart, die zweiten Nukleinsäuresonden 8 für die Nukleinsäure-Liganden 3 der zweiten Ligandenart und die dritten Nukleinsäuresonden 15 für die Nukleinsäure-Liganden 4 einer dritten Ligandenart bindungsspezifisch. Die Länge der ersten Nukleinsäuresonden 2 und der zweiten Nukleinsäuresonden 3 beträgt jeweils 20 Nukleotide und die Länge der dritten Nukleinsäuresonden 15 beträgt 40 Nukleotide.
Zum Untersuchen der Probe wird diese derart mit den Nukleinsäuresonden 8, 9, 15 in Kontakt gebracht, dass die Nukleinsäure-Liganden 2, 3, 4 spezifisch an die Nukleinsäuresonden 8, 9, 15 hybridisieren können, wenn die entsprechenden Nukleinsäure-Liganden 2, 3, 4 in der Probe enthalten sind. Hybridisierte Nukleinsäuresonden 8, 9, 15 werden mit dem Marker markiert und danach werden auf dem Träger 6 eventuell noch vorhandene frei Marker und/oder freie Nukleinsäureliganden 2, 3, 4 durch einen Spülvorgang von dem Träger 6 entfernt.
Dann wird mit Hilfe der Temperiereinrichtung eine Temperatur T₁ eingestellt, bei der die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 und der zweiten Nukleinsäuresonden 9 im Wesentlichen aufrechterhalten wird. Bei dieser Temperatur werden mit Hilfe eines ersten Sensors 12a ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 abhängiger erster Messwert und mit Hilfe eines zweiten Sensors 12b ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden 9 abhängiger zweiter Messwert erfasst.
Dann wird die Temperatur mit Hilfe der Temperiereinrichtung auf einen Wert T₂ erhöht, der höher ist als die Schmelztemperatur T_m1 mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde 8 und die Schmelztemperatur T_m2 wenigstens einer zweiten Nukleinsäuresonde 9 und kleiner ist als die Schmelztemperatur T_m3 mindestens einer dritten Nukleinsäuresonde 15. In 5 ist die Schmelzkurve der ersten Nukleinsäuresonden 8 mit 16a, die Schmelzkurve der zweiten Nukleinsäuresonden 9 mit 16b und die Schmelzkurve der dritten Nukleinsäuresonden 15 mit 16c bezeichnet.
Die Temperatur T₂ kann beispielsweise 70°C betragen. Die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonde 8 und der zweiten Nukleinsäuresonde 9 löst sich dabei aufgrund der Wärmeeinwirkung überwiegend auf (siehe 5). Außerdem werden eventuell vorhandene unspezifische Bindungen von Nukleinsäuren an die dritte Nukleinsäuresonden 15 aufgelöst.
Dann werden mit Hilfe eines dritten Sensors 12b ein von der Hybridisierung der dritten Nukleinsäuresonden 15 abhängiger dritter Messwert, mit Hilfe des ersten Sensors 12a ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden 8 abhängiger vierter Messwert und mit Hilfe des zweiten Sensors 12b ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden 9 abhängiger fünfter Messwert erfasst.
Die ersten, zweiten, vierten und fünften Messwerte werden mittels der Auswerteeinrichtung 13 mit Referenz- bzw. Vergleichswerten verglichen, die in dem Datenspeicher 14 abgelegt sind. In Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs wird ermittelt, ob die Nukleinsäure-Liganden 2 der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden 3 der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind.
In der Auswerteeinrichtung 13 wird außerdem die Konzentration der Nukleinsäure-Liganden 4 der dritten Ligandenart mit Hilfe des dritten Messwerts und einer im Datenspeicher 14 abgelegten Kenngröße berechnet.

Claims

Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden (2, 3) einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden (4) einer dritten Ligandenart in einer Probe, wobei ein Träger (6) bereitgestellt wird, auf dem erste Nukleinsäuresonden (8) und zweite Nukleinsäuresonden (9) immobilisiert sind, wobei die ersten Nukleinsäuresonden (8) bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden (2, 3) der ersten und zweiten Ligandenart und die zweiten Nukleinsäuresonden (9) bindungsspezifisch für die Nukleinsäure-Liganden der dritten Ligandenart (4) sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden (8) maximal 25 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden (9) minimal 35 Nukleotide beträgt, umfassend folgende Schritte: a) Inkontaktbringen der Probe mit den ersten Nukleinsäuresonden (8) und den zweiten Nukleinsäuresonden (9), derart, dass die Nukleinsäure-Liganden (2, 3, 4) an die ersten Nukleinsäuresonden (8) und die zweiten Nukleinsäuresonden (9) spezifisch hybridisieren können, wenn die Nukleinsäure-Liganden (2, 3, 4) in der Probe enthalten sind, b) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) abhängigen ersten Messwerts bei einer ersten Temperatur (T₁), die es ermöglicht, die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) im Wesentlichen aufrecht zu erhalten, c) Einstellen einer zweiten Temperatur (T₂), die höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde (8), d) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) abhängigen zweiten Messwerts und wenigstens eines von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden (9) abhängigen dritten Messwerts, e) Vergleich des ersten und zweiten Messwerts mit Referenzwerten und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs ermitteln, ob die Nukleinsäure-Liganden (2) der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden (3) der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind, f) Bestimmung der Konzentration der Nukleinsäure-Liganden (4) der dritten Ligandenart in der Probe mit Hilfe des dritten Messwerts.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der ersten Temperatur (T₁) ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden (9) abhängiger vierter Messwert erfasst und mit einem Vergleichswert verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Abschnitt der Basensequenz der zweiten Nukleinsäuresonden (9) mit der Basensequenz des ersten Nukleinsäuresonden (8) übereinstimmt.
Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Liganden (2) einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart (3) sowie zum Bestimmen der Konzentration von Nukleinsäure-Liganden (4) einer dritten Ligandenart in einer Probe, wobei ein Träger (6) bereitgestellt wird, auf dem erste Nukleinsäuresonden (8), zweite Nukleinsäuresonden (9) und dritte Nukleinsäuresonden (15) immobilisiert sind, wobei sich die zweiten Nukleinsäuresonden (9) jeweils durch eine Nukleinsäurebase von den ersten Nukleinsäuresonden (8) unterscheiden, wobei die ersten Nukleinsäuresonden (8) für die Nukleinsäure-Liganden (2) der ersten Ligandenart, die zweiten Nukleinsäuresonden (9) für die Nukleinsäure-Liganden (3) der zweiten Ligandenart und die dritten Nukleinsäuresonden (15) für die Nukleinsäure-Liganden (4) einer dritten Ligandenart bindungsspezifisch sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden (2) und der zweiten Nukleinsäuresonden (3) jeweils maximal 25 Nukleotide und die Länge der dritten Nukleinsäuresonden (4) minimal 35 Nukleotide beträgt, umfassend folgende Schritte: a) Inkontaktbringen der Probe mit den ersten Nukleinsäuresonden (8), den zweiten Nukleinsäuresonden (9) und den dritten Nukleinsäuresonden (15), derart, dass die Nukleinsäure-Liganden (2, 3, 4) spezifisch an die Nukleinsäuresonden hybridisieren können, wenn die Nukleinsäure-Liganden (2, 3, 4) in der Probe enthalten sind, b) Erfassung mindestens eines von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) abhängigen ersten Messwerts bei einer Temperatur (T₁), die es ermöglicht, die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) im Wesentlichen aufrecht zu erhalten, c) Erfassung wenigstens eines von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden (9) abhängigen zweiten Messwerts bei einer Temperatur (T₁), die es ermöglicht, die Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden (9) im Wesentlichen aufrecht zu erhalten, d) Erhöhen der Temperatur auf einen Wert (T₂), der höher ist als die Schmelztemperatur mindestens einer ersten Nukleinsäuresonde (8) und die Schmelztemperatur der mindestens einen zweiten Nukleinsäuresonde (9), e) Erfassung zumindest eines von der Hybridisierung der dritten Nukleinsäuresonden (15) abhängigen dritten Messwerts, f) Vergleich des ersten und zweiten Messwerts mit Referenzwerten und in Abhängigkeit vom Ergebnis dieses Vergleichs ermitteln, ob die Nukleinsäure-Liganden (2) der ersten Ligandenart und/oder die Nukleinsäure-Liganden (3) der zweiten Ligandenart in der Probe enthalten sind, g) Bestimmung der Konzentration, welche die Nukleinsäure-Liganden (4) der dritten Ligandenart in der Probe aufweisen, mit Hilfe des dritten Messwerts.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei der zweiten Temperatur (T₂) ein von der Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) abhängiger vierter Messwert und/oder ein von der Hybridisierung der zweiten Nukleinsäuresonden (9) abhängiger fünfter Messwert erfasst und diese Messwerte mit Vergleichswerten verglichen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Abschnitt der Basensequenz der dritten Nukleinsäuresonden (15) mit der Basensequenz der ersten Nukleinsäuresonden (8) oder der zweiten Nukleinsäuresonden (9) übereinstimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden (2) an die ersten Nukleinsäuresonden (8) eine erste Lumineszenzstrahlung und/oder in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden (3) an die zweiten Nukleinsäuresonden (9) eine zweite Lumineszenzstrahlung erzeugt wird und/oder in Abhängigkeit von der Bindung der Nukleinsäure-Liganden (4) an die dritten Nukleinsäuresonden (15) eine dritte Lumineszenzstrahlung erzeugt wird, und dass der erste Messwert in Abhängigkeit von der ersten Lumineszenzstrahlung und/oder der zweite Messwert in Abhängigkeit von der zweiten Lumineszenzstrahlung und/oder der dritte Messwert in Abhängigkeit von der dritten Lumineszenzstrahlung detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lumineszenzstrahlung durch Anregung eines optischen Markers in einem evaneszenten elektromagnetischen Feld erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Erfassen des dritten Messwerts der Biosensor (5) derart erhitzt wird, dass die Hybridisierung der Nukleinsäuresonden (8, 9, 15) aufgelöst wird, und dass das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 danach erneut mit dem Biosensor (5) durchgeführt wird.
Vorrichtung (1) mit einem Biosensor (5), der einen Träger (6) aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden (8) und zweite Nukleinsäuresonden (9) immobilisiert sind, wobei die ersten Nukleinsäuresonden (8) bindungsspezifisch für Nukleinsäure-Liganden (2, 3) einer ersten Ligandenart und einer sich durch eine Punktmutation davon unterscheidenden zweiten Ligandenart sind, wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden (8) maximal 25 Nukleotide und die Länge der zweiten Nukleinsäuresonden (9) minimal 35 Nukleotide beträgt, wobei die zweiten Nukleinsäuresonden (9) bindungsspezifisch für Nukleinsäure-Liganden (4) einer dritten Ligandenart sind, mit einer Temperiereinrichtung, mit einer zum Erfassen von Messwerten für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8) und der zweiten Nukleinsäuresonden (9) ausgestalteten Messeinrichtung, und mit einer mit der Messeinrichtung und einem Datenspeicher (14) für Referenzwerte verbundenen Auswerteeinrichtung (13).
Vorrichtung (1) mit einem Biosensor (5), der einen Träger (6) aufweist, auf dem zumindest erste Nukleinsäuresonden (8), zweite Nukleinsäuresonden (9) und dritte Nukleinsäuresonden (15) immobilisiert sind, wobei sich die zweiten Nukleinsäuresonden (9) jeweils durch eine Nukleinsäurebase von den ersten Nukleinsäuresonden (8) unterscheiden, wobei die ersten Nukleinsäuresonden (8) für Nukleinsäure-Liganden (2) einer ersten Ligandenart, die zweiten Nukleinsäuresonden (9) für Nukleinsäure-Liganden (3) einer zweiten Ligandenart, die sich durch eine Punktmutation von der ersten Ligandenart unterscheidet, und die dritten Nukleinsäuresonden (15) für die Nukleinsäure-Liganden (9) einer dritten Ligandenart bindungsspezifisch sind, und wobei die Länge der ersten Nukleinsäuresonden (8) und der zweiten Nukleinsäuresonden (9) jeweils maximal 25 Nukleotide und die Länge der dritten Nukleinsäuresonden (15) minimal 35 Nukleotide beträgt, mit einer Temperiereinrichtung, mit einer zum Erfassen von Messwerten für die Hybridisierung der ersten Nukleinsäuresonden (8), der zweiten Nukleinsäuresonden (9) und der dritten Nukleinsäuresonden (15) ausgestalteten Messeinrichtung sowie mit einer mit der Messeinrichtung und einem Datenspeicher (14) für Referenzwerte verbundenen Auswerteeinrichtung (13).
Vorrichtung (1) nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb der ersten Nukleinsäuresonden (8), der zweiten Nukleinsäuresonden (9) und/oder der dritten Nukleinsäuresonden (15) jeweils ein optischer Sensor (12a, 12b, 12c) zum Detektieren von in Abhängigkeit von der Hybridisierung der betreffenden Nukleinsäuresonden (8, 9, 15) erzeugter Lumineszenzstrahlung angeordnet ist.
Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (6) eine optische Wellenleiterschicht (7) mit einem Einkoppelfenster (11) für eine Anregungsstrahlung aufweist, und dass die ersten Nukleinsäuresonden (8), die zweiten Nukleinsäuresonden (9) und/oder die dritten Nukleinsäuresonden (15) direkt auf der Wellenleiterschicht (7) immobilisiert sind.