DE60105399T2

DE60105399T2 - Analyse von biologischen zielmolekülen unter verwendung eines einen fluoreszenzmarker tragenden biochips

Info

Publication number: DE60105399T2
Application number: DE60105399T
Authority: DE
Inventors: Marc Cuzin; Philippe Peltie; Marc Fontecave; Jean-Luc Decout; Cecile Dueymes
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Current assignee: Universite Joseph Fourier Grenoble 1; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: EP1413630A1; JP2003529751A; FR2805348B1; AU2001235742A1; US6861515B2; ATE275641T1; EP1413630B1; WO2001063282A2; EP1266030A2; CA2399258A1; JP4729226B2; US20030165914A1; WO2001063282A3; EP1266030B1; ATE541050T1; FR2805348A1; DE60105399D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Analysenträger oder "Biochip", der vorgesehen ist für die Bestimmung von biologischen Targets vom DNA- oder RNA-Typ.
Dieser Analysenträger ist auf zahlreichen Gebieten anwendbar, insbesondere in der Biologie für die Sequenzierung von Genomen, für die Suche nach Mutationen, für die Entwicklung von neuen Arzneimitteln und dgl.
Stand der Technik
Ein Analysenträger dieses Typs umfasst eine Vielzahl von Oligonucleotid-Sonden, die eine Hybridisierung mit den zu analysierenden biologischen Targets bewirken können. Die Hybridisierung entspricht der Paarung von Target-Strängen mit komplementären DNA-Strängen, die auf dem Träger angeordnet sind. Zur Bestimmung der Natur der Targets ist es somit erforderlich, die Stellen des Trägers und damit die Oligonucleotide lokalisieren zu können, die eine Hybridisierung bewirkt haben.
In dem Dokument "Médecine/Sciences", Band 13, Nr. 11, 1997, Seiten 1317–1324 [1], sind Analysenträger dieses Typs beschrieben.
Üblicherweise bestimmt man die Hybridisierung von biologischen Targets auf dem Träger mit Hilfe eines fluoreszierenden Markers, der nach der Extraktion der interessierenden Zonen (Lysis und gegebenenfalls Amplifikation) mit den biologischen Targets kombiniert wird.
Nach dem Inkontaktbringen der markierten Targets mit dem die Oligosonden aufweisenden Analysenträger bestimmt man die Stellen, an denen eine Hybridisierung stattgefunden hat, indem man die Gesamtheit der fluoreszierenden Marker erregt und anschließend die Stellen abliest, um das durch die Marker emittierte Fluoreszenzlicht nachzuweisen. Die Stellen, an denen ein Fluoreszenzlicht nachweisbar ist, sind diejenigen, an denen Target-Moleküle fixiert sind. Lesesysteme (Bestimmungssysteme), die für verschiedene Biochips geeignet sind, sind beispielsweise in US-A-5 578 832 [2] und in US-A-5 646 411 [3] beschrieben.
Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die Markierung des biologischen Targets vor seinem Inkontaktbringen mit dem Analysenträger durchgeführt werden muss, was bestimmte praktische Probleme mit sich bringt, was die Quantifizierung und/oder Ausbeute der Markierung und die Verzögerung, um sie durchzuführen, angeht. Darüber hinaus führt die Markierung in einer gegebenen Stufe zu einer Fixierung der Situation und verhindert die anschließende Durchführung von dynamischen Messungen, mit denen eine Hybridisierungsreaktion verfolgt werden kann.
Es sei auch darauf hingewiesen, dass die Herstellung der Analysenträger oder "Biochips" nach verschiedenen Verfahren erfolgt, bei denen allen das Problem der Endkontrolle der Qualität der erhaltenen Träger auftritt.
Die Menge der Sonden, die auf dem Träger, auf den Stellen (sites) des Trägers oder den Plots oder in in diesem Träger vorgesehenen Vertiefungen abgeschieden worden sind, bringt das Problem der wirksamen Kontrolle der Anwesenheit der Oligosonden mit sich. Es gibt bis heute kein Verfahren, um die auf einem Analysenträger, der beispielsweise aus Silicium, aus Glas oder aus einem Kunststoff, wie z. B. Nylon, hergestellt ist, abgeschiedenen oder in situ gebildeten Oligosonden genau zu quantifizieren und zu lokalisieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein Analysenträger oder Biochip, der unter besten Bedingungen die Kontrolle vor der Herstellung gewährleistet und sie nach der Herstellung erleichtert und die Bestimmung der Stellen des Trägers, auf denen eine Hybridisierung stattgefunden hat, empfindlicher macht.
Erfindungsgemäß umfasst der Analysenträger eine Vielzahl von Oligonucleotiden, die auf diesem Träger fixiert sind, und er ist dadurch gekennzeichnet, dass jedes der genannten Oligonucleotide durch eine fluoreszierende Verbindung so markiert ist, dass die Fluoreszenz eines durch diese Verbindung markierten Oligonucleotids verringert (geschwächt) wird nach der Hybridisierung dieses markierten Oligonucleotids mit einem komplementären Oligonucleotid, wobei die fluoreszierende Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon.
Die Schwächung (Verringerung) der Fluoreszenz besteht in einer Veränderung der Intensität (Stärke) der Fluoreszenz.
Mit einem solchen Analysenträger ist es nicht mehr erforderlich, die zu analysierenden Targets zu markieren, weil die Lokalisierung der Hybridisierungsstellen nachgewiesen werden kann durch Bestimmung der Veränderung der Fluoreszenz, die erhalten wird bei der Hybridisierung an den betreffenden Oligonucleotid-Stellen.
Erfindungsgemäß verwendet man vorzugsweise eine fluoreszierende Verbindung, die eine durch die Hybridisierung verminderte (geschwächte) Intensität (Stärke) der Fluoreszenz aufweist. Vorzugsweise stellt diese Verminderung (Schwächung) 30 bis 99% der Intensität der Fluoreszenz vor der Hybridisierung dar.
Fluoreszierende Verbindungen, welche diese Eigenschaften aufweisen, können beispielsweise bestehen aus Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon. Solche Verbindungen können über einen Abstandhalter-Arm, beispielsweise vom Typ -(CH₂)_n-, an Oligonucleotiden fixiert werden zur Bildung von Flavin (Deazaflavin)-Oligonucleotid-Konjugaten. Eine Synthese von Konjugaten dieses Typs wird von C. Frier et al in "J. Org. Chem.", 62, 1997, Seiten 3520–3528 [4], beschrieben.
Diese Synthese besteht darin, dass man ein Flavin-Derivat auf dem Oligonucleotid nach einem Phosphoramidit- oder H-Phosphonat-Kupplungsverfahren fixiert, wobei man von einem Derivat der Formel ausgeht:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 8, beispielsweise die Zahl 6, darstellt.
Die Synthese-Strategie erlaubt die Einführung der Flavin-Gruppe, z. B. durch Anwendung von automatisierten Oligonucleotid-Syntheseverfahren. Man kann diese Synthese auch anwenden zur Herstellung von Oligonucleotid-Deazaflavin-Konjugaten.
Das Oligonucleotid wird somit durch eine Gruppe der Formel -(CH₂)_n-R¹ markiert, in der n steht für eine ganze Zahl von 2 bis 8 und R¹ steht für eine Gruppe, die einer der folgenden Formeln entspricht:
Die Verwendung von Flavin, von Deazaflavin oder Derivaten davon als fluoreszierende Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft.
Die Flavine stellen nämlich Moleküle dar, die eine starke, sehr charakteristische gelb-grüne Fluoreszenz aufweisen. Das Fluoreszenz-Erregungsspektrum ist identisch mit dem Absorptionsspektrum für sichtbares Licht mit zwei Maxima bei 374 und 446 nm und ihr Fluoreszenz-Emissionsspektrum besteht aus einer breiten Bande mit einem Maximum bei etwa 520 nm. Die Deazaflavine absorbieren Licht bei etwa 320 und 396 nm und weisen höhere Fluoreszenz-Intensitäten (Emission bei 452 nm) auf als die Flavine.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass die Verankerung (Kupplung) von Flavin an einem Oligonucleotid diese Fluoreszenz-Eigenschaften in einem wässrigen Medium nicht signifikant verändert, wobei die Erregungs- und Emissionsmaxima sowie die Intensitäten die gleichen sind für das freie Flavin selbst und für das Oligonucleotid-Flavin-Konjugat.
Andererseits besteht bis zu einer Konjugat-Konzentration von 100 μmol/L eine ausgezeichnete Linearität zwischen der Fluoreszenz-Intensität und der Konzentration.
Es muss jedoch auf einen Einfluss des Salzes auf die Fluoreszenz-Intensität, d. h. auf den Umstand hingewiesen werden, dass steigende NaCl-Konzentrationen einen zunehmenden Einfluss auf die Extinktion "Auslöschung" der Fluoreszenz der Flavine haben. Das gleiche gilt für die Konjugate. Dies muss berücksichtigt werden, weil die Hybridisierung NaCl-Konzentrationen von 0,1 bis 1 M erfordert, um die Duplex-Bildung (Kombination eines Oligonucleotids mit seinem komplementären Oligonucleotid) zu fördern.
Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, dass dann, wenn ein Oligonucleotid-Flavin-Konjugat mit einem Äquivalent seines komplementären Oligonucleotid-Targets inkubiert wird, 90 bis 100% der für das Flavin spezifischen Fluoreszenz verschwinden.
Dieser Effekt wird erfindungsgemäß ausgenutzt, um das Auslesen der Hybridisierungsstellen aus den Biochips zu erleichtern.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Analyse von biologischen Targets durch Inkontaktbringen dieser Targets mit einem Analysenträger, der eine Vielzahl von Oligonucleotiden umfasst, und durch Bestimmen einer oder mehrerer Hybridisierungen zwischen den Targets und den Oligonucleotiden des Trägers, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass jedes der Oligonucleotide des Trägers durch eine fluoreszierende Verbindung, ausgewählt aus Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon, markiert wird, die eine Änderung der Fluoreszenz bei der Hybridisierung des markierten Oligonucleotids mit dem komplementären Oligonucleotid hervorruft, und dass man die Oligonucleotide des Trägers, die hybridisiert worden sind, durch Messung der Fluoreszenz bestimmt, die jedem Oligonucleotid des Trägers vor und nach dem Inkontaktbringen des Trägers mit den Targets entspricht.
In diesem Verfahren verwendet man somit den erfindungsgemäßen Analysenträger, der die vorstehend beschriebenen Charakteristika aufweist.
Bei einer Variante dieses Verfahrens markiert man darüber hinaus die Targets mit einer zweiten fluoreszierenden Verbindung, deren Emissions-Wellenlänge verschieden ist von derjenigen der fluoreszierenden Verbindung der Oligonucleotide oder der ersten fluoreszierenden Verbindung und man kontrolliert die Oligonucleotide, deren Fluoreszenz sich verändert hat, durch Messung der Fluoreszenz dieser zweiten Verbindung.
In diesem Fall wird die fluoreszierende Verbindung der Oligonucleotide des Trägers oder die erste fluoreszierende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon und die zweite fluoreszierende Verbindung wird ausgewählt aus stabilen Fluorophoren, die auf DNA-Chips verwendet worden sind und vorzugsweise im sichtbaren Bereich emittieren (Rhodamin, CY3, CY5 und dgl.), die beispielsweise gegenüber dem Flavin eine Rot-Verschiebung aufweisen.
Mit dem erfindungsgemäßen Analysenträger, dessen Oligonucleotide mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert sind, kann man besser die Qualität des Trägers kontrollieren.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Kontrolle eines Analysenträgers, der eine Vielzahl von Oligonucleotiden aufweist, die auf diesem Träger fixiert sind, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die fixierten Oligonucleotide Oligonucleotide darstellen, die mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert sind, und dass man die Menge der auf dem Träger fixierten Oligonucleotide lokalisiert und bestimmt durch Messung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Verbindung.
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung, die selbstverständlich die Erfindung nur erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen hervor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 stellt eine Kurve dar, welche die Entwicklung der Intensität der Fluoreszenz des T11-Deazaflavin-Konjugats als Funktion der Anzahl der Äquivalente des Poly A-Targets (SEQ ID Nr. 1) erläutert.
Die 2 stellt eine Kurve dar, welche die Entwicklung der Intensität der Fluoreszenz des T11-Flavin-Konjugats als Funktion der Anzahl der Äquivalente des Poly A Targets (SEQ ID Nr. 1) erläutert.
Die 3 zeigt die Fluoreszenz-Spektren, die erhalten werden durch Hybridisierung des SEQ ID Nr. 12-Flavin-Konjugats mit dem komplementären Oligonucleotid (SEQ ID Nr. 13) für steigende Zugaben von Äquivalenten der komplementären Sequenz.
Die 4 erläutert die Entwicklung des Verhältnisses der Intensitäts-Fluoreszenzen I₀/I als Funktion der Konzentration [Q] an fluoreszierender Verbindung im Falle einer dynamischen Extinktion.
Die 5 zeigt die Entwicklung des Verhältnisses der Fluoreszenz-Intensitäten I₀/I als Funktion der Konzentration [Q] an fluoreszierender Verbindung im Falle einer statischen Extinktion.
Die 6 erläutert die Entwicklung des Verhältnisses I₀/I als Funktion der Konzentration [Q] an fluoreszierender Verbindung im Falle einer kombinierten statischen und dynamischen Extinktionswirkung.
Die 7 stellt eine Kurve dar, welche die Entwicklung von I₀/I als Funktion der Konzentration [Q] an Flavin im Falle der durch die 3 dargestellten Spektren erläutert.
Die 8 stellt eine Kurve dar, welche die Entwicklung der Schein-Konstanten K_app als Funktion der Konzentration [Q] an Flavin im Falle der Spektren der 3 erläutert.
Detaillierte Beschreibung der Ausführungsform
In den folgenden Beispielen werden die folgenden Oligonucleotide verwendet:
Target T₁₁ (SEQ ID Nr. 1)
5' ctcatcgtgt aaaaaaaaaa aggcagtact ggaagggcta attct 3'
Target T₁₆ (SEQ ID Nr. 2)
5' ctcatcgtga attctaaaaa aaaaaaaaaa agctagcggc agtac 3'
Komplementäres Oligonucleotid zur SEQ ID Nr: 1 (SEQ ID Nr. 3):
3' gagtagcaca tttttttttt tccgtcatga ccttcccgat taaga 5'
Komplementäres Oligonucleotid zur SEQ ID Nr: 2 (SEQ ID Nr. 4)
3' gagtagcact taagattttt tttttttttt tcgatcgccg tcatg 5'
Oligonucleotid HIV (SEQ ID NR. 5)
5'-ttttc^mettttg gggggt-3'
Doppelstrang des Targets HIV (SEQ ID Nr: 6 und 7).
5' cagtcccccc ttttctttta aaaagtggct aagatctac 3' (SEQ ID Nr: 6)
3' gtcagggggg aaaagaaaat ttttcaccga ttctagatg 5' (SEQ ID Nr: 7)
Beispiel 1
In diesem Beispiel stellt man die Flavin-Oligonucleotid T₁₁- und Flavin-Oligonucleotid T₁₆-Konjugate her, indem man der in dem Dokument [4] beschriebenen Arbeitsweise folgt unter Verwendung des Flavin-Derivats F1 der Formel (I) mit n = 6. Man erhält auf diese Weise das Konjugat (SEQ ID Nr: 8) der Formel:
Man stellt auf die gleiche Weise ein Flavin-T16-Konjugat (SEQ ID Nr. 9) der Formel her:
Schließlich stellt man das HIV-Flavin-Konjugat her unter Verwendung des Flavin-Derivats der Formel (I) mit n = 6:
(SEQ ID Nr: 10) der Formel:
Auf die gleiche Weise stellt man das T₁₁-Deazaflavin-Konjugat DF1 (SEQ ID Nr: 11) der Formel her:
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird der Einfluss der Anwesenheit eines anderen (weiteren) Oligonucleotids auf die Fluorescenzemission des T11-Flavin-Konjugats (SEQ ID Nr: 8) untersucht.
Zu diesem Zweck bringt man in einem Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 7,0 mit 0,1 mM-1 M NaCl) 0,1 bis 10 μmol/L des T11-Flavin-Konjugats mit 1 Äquivalent Oligonucleotid (SEQ ID Nr. 1) zusammen.
Man führt eine Erregung bei 460 nm durch und misst die Fluoreszenz-Emission in der Umgebung von 540 nm.
Unter diesen Bedingungen macht die Fluoreszenz-Emission nicht mehr als 5% der mit dem T11-Flavin-Konjugat allein gemessenen Emission aus.
Man wiederholt diesen Arbeitsgang in Gegenwart des Oligonucleotids (SEQ ID Nr. 3), d. h. des komplementären Oligonucleotids zu SEQ ID Nr. 1. Unter diesen Bedingungen macht die Fluoreszenz-Emission 98% der Fluoreszenz-Emission des T11-Flavin-Konjugats aus. Die Anwesenheit dieses Oligonucleotids hatte somit keinen Einfluss auf die Fluoreszenz-Emission des T₁₁-Flavin-Konjugats.
Wenn man diesen Arbeitsgang erneut wiederholt unter Zugabe von 1 Äquivalent des Oligonucleotids SEQ ID Nr. 1 und von 1 Äquivalent des Oligonucleotids SEQ ID Nr. 3 unter den Bedingungen, bei denen sich kein Duplex bilden kann, stellt die Fluoreszenz-Emission 6% der Fluoreszenz-Emissions des Konjugats allein dar.
Es ist somit klar, dass die Anwesenheit des komplementären Targets (SEQ ID Nr. 1) zu dem Oligonucleotid T₁₁ zu einem Verschwinden von 90 bis 100% der für das Flavin spezifischen Fluoreszenz führt.
Beispiel 3
Man führt die gleichen Versuche mit dem T16-Flavin-Konjugat (SEQ ID Nr. 9) durch entweder in Gegenwart des Targets T₁₆ (SEQ ID Nr. 2) oder in Gegenwart des Oligonucleotids (SEQ ID Nr. 4), das komplementär zu SEQ ID Nr. 2 ist, oder in Gegenwart der Mischung der beiden Oligonucleotide SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 4 unter den Bedingungen, bei denen sich kein Duplex bilden kann.
Man erhält dabei die folgenden Ergebnisse:
Wie im Falle des Beispiels 2 führt somit die Anwesenheit des Targets (SEQ ID Nr. 2) des Oligonucleotids T₁₆ zu einer Auslöschung der Fluoreszenz des Flavins wegen der Hybridisierung zwischen dem Target und dem Oligonucleotide T₁₆.
Beispiel 4
In diesem Beispiel werden die Eigenschaften des Oligonucleotids HIV, das mit dem Flavin (SEQ ID Nr. 10) konjugiert ist, in Gegenwart des durch die SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7 gebildeten Duplex HIV getestet.
Unter diesen Bedingungen stellt die Fluoreszenz-Emission 90% der anfänglichen Emission dar. Es hat keine Hybridisierung zwischen dem F1-HIV-Konjugat und dem Duplex stattgefunden, da das Target HIV bereits hybridisiert worden ist.
Die Beispiele 2 bis 4 zeigen somit, dass die Extinktion der Fluoreszenz spezifisch ist für die Bildung eines Duplex zwischen dem Oligonucleotid-Flavin-Konjugat und dem komplementären Oligonucleotid aus den folgenden Gründen:

1) Eine Erhöhung der Temperatur, die zu einer Destabilisierung des Duplex und zu einer Verschiebung des Gleichgewichts: Doppelstrang → Einfachstränge führt, lässt die Fluoreszenzintensität ansteigen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Fluoreszenz-Spektroskopie somit ein gutes Verfahren zur Bewertung der Bindungskonstanten bei einer gegebenen Temperatur darstellt. Eine neue Absenkung der Temperatur führt zu einer erneuten Abnahme der Fluoreszenzintensität.
2) Die Zugabe eines Oligonucleotids, das nicht-komplementär zu dem Konjugat ist, führt nicht zu einer Abnahme der Fluoreszenz.
3) Die Zugabe eines Doppelstranges, der komplementär zu dem Konjugat ist, zu einer Lösung des Oligonucleotid-Flavin-Konjugats unter Bedingungen, die zur Bildung eines Triplex führen, führt nicht zu einer Extinktion der Fluoreszenz, wie dies aus dem Beispiel 4 hervorgeht.
4) Wenn das Target eine komplementäre RNA ist, stellt man ebenfalls eine Abnahme der Fluoreszenz, jedoch in einem geringeren Umfang, fest.

Es sei noch darauf hingewiesen, dass das Dublett gg, das benachbart zu der Sequenz A₁₁ des Oligonucleotids SEQ ID Nr. 1 ist, das an der Paarung nicht teilnimmt, nicht erforderlich ist, da identische Ergebnisse erhalten wurden mit Oligonucleotiden, die identisch zu SEQ ID Nr. 1 sind, die jedoch anstelle von gg die Sequenzen gc, cg und cc enthielten.
Beispiel 5
In diesem Beispiel wurde der Einfluss der Anwesenheit des Target-Oligonucleotids SEQ ID Nr. 1 bei Konzentrationen von 1 bis 1,5 Äquivalenten auf 1 Äquivalent des T₁₁-Deazaflavin-Konjugats (SEQ ID Nr. 11) auf die Fluoreszenz des Deazaflavins des Konjugats untersucht. Man arbeitete unter den gleichen Bedingungen wie in den Beispielen 2, 3 und 4.
Die 1 erläutert die erhaltenen Ergebnisse, d. h. die Entwicklung der Intensität der Fluoreszenz bei 452 nm in Abhängigkeit von der Anzahl der Äquivalente des Poly A Targets (SEQ ID Nr. 1).
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird der gleiche Versuch wie in Beispiel 5 durchgeführt, diesmal verwendete man jedoch als Konjugat das T₁₁-Flavin-Konjugat (SEQ ID Nr. 8).
Die 2 erläutert die erhaltenen Ergebnisse, d. h. die Intensität der Fluoreszenz bei 520 nm in Abhängigkeit von der Anzahl der Äquivalente des Poly A-Targets (SEQ ID Nr. 1).
Ein Vergleich zwischen den 1 und 2 zeigt, dass die Fluoreszenz-Abstände (-Verschiebungen) bei dem Deazaflavin stärker sind, das daher empfindlicher ist.
Beispiel 7
In diesem Beispiel wurde die Stabilität des T₁₁-Flavin-Komplexes (SEQ ID Nr. 8) mit der komplementären SEQ ID Nr. 1 untersucht. Es wurden Gel-Retardierungs-Versuche und Versuche zur Messung der Fusionstemperatur Tm durchgeführt. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit eines Flavins oder eines Deazaflavins am Ende eines Oligonucleotids diesem eine beträchtlich höhere Stabilität ge genüber dem Komplex, den dieses Oligonucleotid mit dem komplementären Oligonucleotid bildet, verleiht.
Beispielsweise führt bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 M die Sequenz T₁₁ zu einem Komplex mit dem Oligonucleotid SEQ ID Nr. 1 mit einer Tm von 23°C (37°C bei 1 M NaCl), während das T₁₁-Flavin-Konjugat (SEQ ID Nr. 8) mit SEQ ID Nr. 1 einen Komplex mit einer Tm von 28°C (42°C bei 0,1 M NaCl) ergibt.
Gel-Retardierungs-Versuche zeigen, dass die Bildung des Duplex viel geringere Mengen an T11-Flavin-Konjugat (SEQ ID Nr. 8) erfordert als das Oligonucleotid T₁₁ ohne Flavin.
Es wurden ähnliche Ergebnisse mit dem T₁₆-Flavin-Konjugat (SEQ ID Nr. 9) und dem Target (SEQ ID Nr. 2), bezogen auf T₁₆ ohne Flavin, gefunden.
Die Untersuchung von Oligonucleotid-Flavin-Konjugaten (SEQ ID Nr. 8 und 9) zeigt eine durchaus interessante Eigenschaft dieser Moleküle:

– die Anwesenheit von Flavin stabilisiert die Assoziation dieses Konjugats mit dem komplementären Oligonucleotid durch einen noch kaum verstandenen Mechanismus (Wasserstoffbindungen zwischen dem Flavin und den Nucleinbasen, Stapelbildung ...),
– diese Assoziation führt zu einer sehr starken Abnahme der Fluoreszenz (Extinktion in bestimmten Fällen),
– diese Extinktion der Fluoreszenz ist sehr spezifisch: sie entsteht nur, wenn das Konjugat sich in Gegenwart des komplementären Oligonucleotids befindet unter den Bedingungen der Duplex-Bildung.

Beispiel 8
In diesem Beispiel wird ein Konjugat, das aus einem 20-Mer-Oligonucleotid und Flavin gebildet ist (SEQ ID Nr. 12):
mit dem komplementären Oligonucleotid (SEQ ID Nr. 13):
ctagcctgat gagaggggaa gtggtggggg agacatagcc
in steigender Konzentration in Kontakt gebracht unter den gleichen Bedingungen wie denjenigen der Beispiele 2 bis 4 und man misst das Fluoreszenzspektrum um 520 nm herum im Spektrofluorimeter.
Die Erregungs-Wellenlänge beträgt 446 nm und die dem Flavin entsprechende maximale Emission beträgt 520 nm.
Man führt eine sofortige Messung, dann 5 min später, jedesmal mit einer höheren Konzentration an dem komplementären Target (SEQ ID Nr. 13) durch.
Die 3 erläutert die Fluoreszenzspektren, die erhalten werden ohne komplementäres Oligonucleotid, dann mit 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,2 und 1,4 Äquivalenten des komplementären Oligonucleotids SEQ ID Nr. 13.
Ausgehend von einer Anfangsintensität von 318 in Abwesenheit des Targets (des komplementären Oligonucleotids) stellt man eine Extinktion der Fluoreszenz in einem Verhältnis von etwa 20 fest, wenn man das Komplementär-Target in einen leichten Überschuss bringt.
Die Extinktion kann verschiedenen Prozessen entsprechen, bei denen es sich handeln kann entweder um eine Energieübertragung oder um eine Extinktion durch Kollision ("Kollisionsauslöschung") oder um die Bildung eines Komplexes ("statische Auslöschung"), die der Sonden-Target-Hybridisierung entspricht.
Die Extinktion durch Kollision oder die "Kollisionsauslöschung" tritt auf, wenn eine Kollision zwischen der fluoreszierenden Verbindung (Flavin) und dem Auslöschungs-Oligonucleotid in der Konzentration [Q] auftritt. Sie wird beschrieben durch das Stern-Volmer-Gesetz, das der folgenden Gleichung entspricht: I0/I = 1 + hqτ0[Q]worin h_q die Extinktionskonstante und τ₀ die Lebensdauer der Fluoreszenz darstellen.
Die Stern-Volmer-Konstante ist wie folgt definiert: KD = hqτ0.
In diesem Fall beträgt einerseits die Lebensdauer τ und I₀/I = τ₀/τ und andererseits hat die Temperatur die Wirkung, dass das Phänomenon zunimmt, KD steigt, wenn die Temperatur zunimmt.
Die 4 erläutert die Entwicklung von I₀/I und von τ₀/τ als Funktion von [Q]. Wenn man die Temperatur erhöht, steigt die Steigung der Geraden.
Im Falle einer Extinktion durch Komplexbildung, d. h. in dem Fall, der uns hier interessiert, handelt es sich bei der Sonden/Target-Hybridisierung um eine "statische Auslöschung", wobei das Stern-Volmer-Gesetz wie folgt lautet: I0/I = 1 + Ksτ0[Q]worin K_s die Assoziationskonstante darstellt.
Die 5 erläutert die Entwicklung von I₀/I als Funktion von [Q]. In diesem Fall nehmen τ₀/τ = 1 und die Steigung ab, wenn die Temperatur zunimmt, was normal ist, da eine Zunahme der Temperatur eine partielle Denaturierung des Komplexes hervorruft, somit der Fluorophor, der ausgelöscht worden ist, freigesetzt wird.
Bei den meisten Fällen findet man, wie in der 6 dargestellt, eine kombinierte Wirkung aus "statischer und dynamischer Auslöschung", was sich in einer positiven Krümmung in Richtung auf die y-Achse äußert. Die Stern-Volmer-Relation muss dann wie folgt modifiziert werden: I0/I = 1 + (Kd + Ks)[Q] + KdKs[Q]2
Wenn man zu den in der 3 erläuterten Fluoreszenzspektren zurückkehrt und wenn man das Gesetz I₀/I als Funktion von [Q], ausgehend von diesen Spektren, verfolgt, findet man tatsächlich eine positive Krümmung (Kurve) und nicht eine Gerade, was sich in der gleichzeitigen Anwesenheit einer "statischen und dynamischen Auslöschung" äußert, wie dies aus der 7 hervorgeht.
Die 8 erläutert die Änderung von K_app als Funktion der Konzentration [Q] in Äquivalenten, ausgehend von den Ergebnissen der 3.
Man verankert an dem Target einen zweiten Fluorophor, der keiner "Auslöschung" unterliegt und stark verschoben ist in Bezug auf die Fluoreszenz-Wellenlänge gegenüber der fluoreszierenden Verbindung. Dieser Fluorophor kann gleichzeitig erregt werden und zeigt die effekte Anwesenheit des Hybridisierungskomplexes an.
Man kann insbesondere einen Fluorophor wie CY3 verwenden, der eine Erregungswellenlänge von 543,5 nm und eine Emissionswellenlänge von 580 nm aufweist. Er kann mit einem Scanner nachgewiesen werden unter Verwendung eines grünen HeNe-Lasers einer geringen Stärke (1 mW), wie dies in einem Biochip-Lesesystem durchgeführt wird.
Diese doppelte Markierung, d. h. diejenige des auf dem Biochip fixierten Oligonucleotids mit Hilfe einer ersten fluoreszierenden Verbindung, wie z. B. Flavin, und diejenige der zu bestimmenden Targets durch eine zweite fluoreszierende Verbindung, wie z. B. CY3, bietet unleugbare Vorteile gegenüber einer traditionellen einfachen Markierung.
Bei der Immobilisierung der Sonden auf dem Biochip erlaubt nämlich die Anwesenheit von Flavin eine Kontrolle der Qualität der Sonden vor der Hybridisierung, wobei man ein Gesamtbild des Chips in der Weise herstellt, sodass alle Stellen fluoreszieren, die Sonden aufweisen. Es besteht dann die Möglichkeit, die Fehler des Chips (ein inhomogenes Bild in Bezug auf die Fluoreszenz-Intensität) zu kartographieren; es gibt auch die Möglichkeit, von einer Redundanz zu profitieren, indem man den gleichen Sonden-Typ mit mehreren aneinandergrenzenden Stellen zusammenbringt.
In der Hybridisierungsphase stellt man eine Abnahme der Fluoreszenz an den betreffenden Stellen mit einer Ablesung bei 520 nm fest, indem man eine Erregung um 400 bis 450 nm herum durchführt. Eine Ablesung von CY3 erlaubt dann die Auflösung der Nicht-Spezifität, da nur die hybridisierten Komplexe das Target CY3 zusammen mit der Abnahme der Fluoreszenz aufweisen.
Der Vorteil von sehr unterschiedlichen Wellenlängenbereichen beruht darin, dass die Erregung bei 400 bis 450 nm praktisch keine Fluoreszenz von CY3 hervorruft, weil man sehr weit entfernt ist von dessen Absorptionsbande (maximale Absorption bei 550 nm).
Ein interessanter Parameter, der in Betracht gezogen werden kann, ist die Lebensdauer, die, wie vorstehend angegeben, nicht variiert bei der Komplexbildung, die jedoch im Falle einer "dynamischen Auslöschung" stark variiert. Man kann dadurch die beiden konkurrierenden Phänome leicht voneinander trennen: die "Kollisions-Auslöschung" und die "Bildung von Hybriden", die allein interessant ist.
Ein anderer Parameter, der verfolgt werden kann, ist die Entwicklung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur. In einem traditionellen "Chip" liest man nämlich die Fluoreszenz bei einer gegebenen Temperatur ab. Die Erhöhung der Temperatur hat die Wirkung, dass die nicht-spezifischen Hybridisierungen (Denaturierungen) "zerbrechen", sie hat aber auch den lästigen Effekt, dass sie die Fluoreszenz des Komplexes stark verringert (da die Mengenausbeute der Fluoreszenz abnimmt, wenn die Temperatur ansteigt). Im Falle einer "statischen Auslöschung" wurde festgestellt, dass die Erhöhung der Temperatur dagegen die Fluoreszenz der schlecht hybridisierten Komplexe wieder herstellt, da eine "Freisetzung" des incriminierten Fluorophors auftritt.
Die sorgfältige Assoziation einer Ablesung mit zwei Markern (Flavin + traditioneller Fluorophor), die Kontrolle der Temperatur, sogar die Messung der Lebensdauer, erlaubt es, die Bildung der Hybride vollständig zu verfolgen und selbst die verschiedenen Konstanten (die Stern-Volmer-Konstante, die Assoziations-Konstante, ja sogar die Berechnung der Radien der Wirkungsbereiche) zu berechnen.
Zitierte Literaturstellen

[1 ] Médecine/Sciences, Band 13, Nr. 11, 1997, Seiten 1317–1324
[2] US-A-5 578 832
[3] US-A-5 646 411
[4] C. Frier et al, "J. Org. Chem.", 62, 1997, Seiten 3520–3528.

Claims

Analysenträger, der eine Vielzahl von auf diesem Träger fixierten Oligonucleotiden aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass jedes der genannten Oligonucleotide mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert ist, deren Fluoreszenz sich ändert bei der Hybridisierung jedes markierten Oligonucleotids mit einem komplementären Oligonucleotid, wobei die fluoreszierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon.
Träger nach Anspruch 1, bei dem die Fluoreszenzänderung in einer Änderung der Intensität (Stärke) der Fluoreszenz besteht.
Träger nach Anspruch 2, bei dem die fluoreszierende Verbindung eine durch die Hybridisierung verminderte Intensität der Fluoreszenz aufweist.
Träger nach Anspruch 3, bei dem die Fluoreszenzverminderung 30 bis 99% der Intensität der Fluoreszenz vor der Hybridisierung darstellt.
Träger nach Anspruch 1, bei dem das Oligonucleotid mit einer Gruppe der Formel -(CH₂)_n-R¹ markiert ist, in der n für eine ganze Zahl von 2 bis 8 und R¹ für eine Gruppe mit einer der folgenden Formeln stehen:
Träger nach Anspruch 5, bei dem n für die Zahl 6 steht.
Verfahren zur Kontrolle eines Analysenträgers, der eine Vielzahl von auf diesem Träger fixierten Oligonucleotiden aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den fixierten Oligonucleotiden um Oligonucleotide handelt, die mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert sind, und dass die Menge der auf dem Träger fixierten Oligonucleotide lokalisiert und bestimmt wird durch Messung der Fluoreszenz der fluoreszierenden Verbindung, wobei die fluoreszierende Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe Flavin, Deazaflavin und Derivaten davon.
Verfahren zum Analysieren von biologischen Targets durch Inkontaktbringen dieser Targets mit einem Analysenträger, der eine Vielzahl von Oligonucleotiden aufweist, und durch Bestimmung einer oder mehrerer Hybridisierungen zwischen den Targets und den Oligonucleotiden des Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Analysenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet und dass man die Oligonucleotide des Trägers, mit denen eine Hybridisierung stattgefunden hat, bestimmt durch Messung der Fluoreszenz, die jedem Oligonucleotid des Trägers vor und nach dem Inkontaktbringen des Trägers mit den Targets entspricht.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man darüber hinaus die Targets mit einer zweiten fluoreszierenden Verbindung markiert, deren Emissionswellenlänge verschieden ist von derjenigen der fluoreszierenden Verbindung der Oligonucleotide oder der ersten fluoreszierenden Verbindung und dass man die Oligonucleotide kontrolliert, bei denen eine Änderung der Fluoreszenz aufgetreten ist, durch Messung der Fluoreszenz dieser zweiten Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die zweite fluoreszierende Verbindung ausgewählt wird unter stabilen Fluorophoren, die in Bezug auf das Flavin eine Rotverschiebung aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, bei dem man die Intensität der Fluoreszenz der ersten Verbindung durch Spektrometrie misst.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem es sich bei der zweiten fluoreszierenden Verbindung um CY₃ handelt, deren Erregungswellenlänge 543,5 nm beträgt und deren Emissionswellenlänge 580 nm beträgt.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem man die Anwesenheit dieser zweiten Verbindung mit einem Scanner bestimmt, in dem ein HeNe-Laser verwendet wird.