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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Analysenträger zur
Bestimmung von biologischen Targets vom DNA- oder RNA-Typ. Dieser
Träger
und dieses Verfahren sind auf zahlreichen Gebieten anwendbar, insbesondere
in der Biologie für
die Sequenzierung von Genomen, für
die Erforschung (Bestimmung) von Mutationen, für die Entwicklung von neuen
Arzneimitteln und dgl.
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Stand der Technik
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In
den Verfahren und Analysenträgern
dieses Typs wird im Allgemeinen eine Vielzahl von Oligonucleotid-Sonden
verwendet, die mit den zu analysierenden biologischen Targets eine
Hybridisierung ergeben können.
Die Hybridisierung entspricht der paarweisen Anordnung (Paarung)
der Target-Stränge
mit den komplementären
DNA-Strängen,
d.h. den Sonden, die bei den auf dem Träger angegebenen Koordinaten
angeordnet sind. Zur Bestimmung der Art der Targets ist es somit
erforderlich, identifizieren zu können, welches die Stellen des
Trägers
sind und somit die Oligonucleotide sind, mit denen eine Hybridisierung
stattfindet.
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In
dem Dokument US-A-5 925 525 [1] ist die Hybridisierung von biologischen
Targets auf dem Träger mit
Hilfe eines fluoreszierenden Markers beschrieben, der mit den biologischen
Targets kombiniert ist. Nach dem Inkontaktbringen der markierten
Targets mit dem Analysenträger,
der die Oligosonden umfasst, und nach dem Waschen bestimmt man dann
die Stellen, an denen die Hybridisierung stattfindet, indem man
eine Erregung der Gesamtheit der fluoreszierenden Marker bewirkt,
gefolgt von einer Lokalisierung der Stel len durch Nachweis des von
den Markern emittierten Fluoreszenzlichtes. Die Stellen, für die ein
Fluoreszenzlicht nachgewiesen wird, sind diejenigen, an denen Marker-Moleküle fixiert
sind.
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Diese
Methode hat den Nachteil, dass vor dem Inkontaktbringen mit dem
Analysenträger
das biologische Target markiert werden muss, was bestimmte praktische
Probleme mit sich bringt bezüglich
der quantitativen Bestimmung und/oder der Ausbeute (Wirksamkeit)
der Markierung und der Zeitverzögerung,
um sie zu bewirken. Darüber
hinaus kompliziert die Markierung in einer gegebenen Stufe die Situation
und verhindert dadurch die Durchführung von dynamischen Messungen,
die auf eine Hybridisierungsreaktion folgen können.
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Eine
andere Methode zum Nachweis und zur Identifizierung einer Nucleinsäure (Target)
durch ihr Hybridisierungsvermögen,
wie in US-A-5 482 832 [2] beschrieben, besteht darin, diese Sonden
mit einem Enzym zu markieren und dann die durch ein Enzym markierten
Oligonucleotide mit den Targets in Kontakt zu bringen. Die Abtrennung
der nicht-hybridisierten Oligonucleotide von den Doppelsträngen erfolgt
durch Elektrophorese auf einem Gel. Der Nachweis und die Bestimmung
der Hybridisierung erfolgt nach der Wanderung durch Anfärben des
Gels mittels eines geeigneten Substrats.
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Diese
Methode auf einem Gel begrenzt die Anzahl der getesteten Targets
und erfordert somit die Fixierung von Enzymen auf den Oligonucleotid-Sonden, was bestimmte
Probleme und Gefahren mit sich bringen kann, wobei in bestimmten
Fällen
die Hybridisierung des Oligonucleotids mit dem komplementären Oligonucleotid
gestört
wird.
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In
EP-A-0 097 373 sind Oligonucleotid-Sonden beschrieben, die durch
einen Cofaktor markiert werden und die durch das entsprechende Enzym,
beispielsweise durch das Flavin und die Flavinreduktase, erkannt werden.
Diese Sonden werden für
den Nachweis von Nucleinsäuren
durch Hybridisierung verwendet.
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In
US-A-4 959 309 sind Oligonucleotid-Sonden beschrieben, die durch
einen Cofaktor markiert werden und die durch das entsprechende Enzym
erkannt werden. Die genannten Sonden können immobilisiert werden.
Diese Sonden werden für
den Nachweis von Nucleinsäuren
durch Hybridisierung verwendet.
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Diese
beiden Dokumente erwähnen
keine Signaländerung
bei einer Hybridisierung der Target-Moleküle.
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In
WO 01/63282 ist ein Analysenträger
beschrieben, der fixierte Oligonucleotide aufweist, die durch Flavin
oder eines seiner Derivate markiert sind. Die Oligonucleotide werden
für den
Nachweis von Nucleinsäuren
durch Hybridisierung verwendet. Die Fluoreszenz der markierten Oligonucleotide
ist nach der Hybridisierung geschwächt.
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Beschreibung
der Erfindung
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Analysieren von
biologischen Targets, bei dem Sonden verwendet werden, die einen
Marker (eine Markierung) tragen, der (die) enzymatisch aktivierbar
ist, bei denen jedoch die Fixierung eines Enzyms auf den Oligonucleotid-Sonden
nicht erforderlich ist.
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Erfindungsgemäß umfasst
das Verfahren zum Analysieren von biologischen Targets vom DNA-
oder RNA-Typ die folgenden Stufen:
- a) Inkontaktbringen
der zu analysierenden Targets mit Oligonucleotid-Sonden, die durch einen Cofaktor A eines
Enzyms E markiert sind, wobei der Cofaktor ein solcher ist, der
von dem Enzym E erkannt wird, wenn er an einem freien Oligonucleotid
fixiert ist, und der von dem Enzym E weniger erkannt wird, wenn
das Oligonucleotid, an dem er fixiert ist, mit einem komplementären Oligonucleotid
hybridisiert ist;
- b) Zugabe des Enzyms E, das dem Cofaktor A entspricht, und eines
Substrats S für
das Enzym E zu dem Reaktionsmedium, wobei das Substrat S durch das
Enzym E in eine Verbindung C umgewandelt wird;
- c) Messung eines Signals, das repräsentativ ist für die Aktivität des Enzyms
E auf dem Substrat S; und
- d) Vergleich dieses Signals mit dem Signal, das erhalten wird,
wenn man die Oligonucleotid-Sonden, die durch den Cofaktor A markiert
sind, mit dem Enzym E und dem Substrat S unter den gleichen Bedingungen, jedoch
in Abwesenheit der Targets, in Kontakt bringt, wobei die Differenz
zwischen den beiden Signalen die Anwesenheit von Targets anzeigt,
die komplementär
zu den Oligonucleotid-Sonden sind.
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Bei
diesem Verfahren nutzt man den Umstand aus, dass der Cofaktor A
mindestens von dem Enzym E erkannt wird, wenn die mit dem Cofaktor
A markierten Oligonucleotid-Sonden mit komplementären Targets hybridisiert
sind. Dabei nimmt die Aktivität
des Enzyms E auf dem Substrat S stark ab, wenn eine Hybridisierung
vorliegt.
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Um
einen signifikanten Vergleich für
die enzymatische Aktivität
des Enzyms A auf dem Substrat S zu erzielen, handelt es sich bei
dem Cofaktor A um einen solchen, der von dem Enzym A nicht mehr
oder fast nicht mehr erkannt wird, wenn die mit dem Cofaktor A markierten
Oligonucleotid-Sonden mit komplementären biologischen Targets hybridisiert
sind.
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Vorzugsweise
repräsentiert
das in der Stufe (c) gemessene Signal nur noch höchstens 50 % des Signals, das
in Abwesenheit der biologischen Targets erzielt wird.
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Die
vorliegende Erfindung basiert somit auf dem Prinzip, wonach man
ein Signal erhält,
das sich bei der Hybridisierung des markierten Oligonucleotids mit
einem komplementären
Oligonucleotid ändert.
Im Falle der vorliegenden Erfindung beruht die Änderung dieses Signals auf
der Verwendung eines Enzyms E, das dieses Signal auslöst, und
auf dem Verstärkungseffekt
des Enzyms auf die Intensität
dieses Signals, wodurch eine Verbesserung des Verhältnisses
zwischen dem Signal und dem Hintergrundrauschen möglich ist.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wählt man
vorzugsweise ein System aus Cofaktor A, Enzym E und Substrat S so
aus, dass es einen Nachweis des Abfalls der enzymatischen Aktivität mittels
eines optischen Signals erlaubt.
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Man
kann diesen Abfall der Aktivität
nachweisen durch Verwendung beispielsweise eines Substrats S, das
spezifische Licht- und/oder Fluoreszenz-Absorptionseigenschaften repräsentiert,
die verschieden sind von den Licht- und/oder Fluoreszenz-Absorptionseigenschaften
der Verbindung C, die durch Transformation des Substrats S unter
der Einwirkung des Enzyms E erhältlich
ist.
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Man
könnte
diesen Abfall der enzymatischen Aktivität auch nachweisen für den Fall,
dass die Umwandlungsverbindung C des Substrats spezifische Licht-
und/oder Fluoreszenz-Absorptionseigenschaften aufweist, indem man
ein optisches Signal misst, das für die Menge der gebildeten
Verbindung C repräsentativ ist.
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In
Abwesenheit des komplementären
Oligonucleotid-Targets erkennt das Enzym E den an der Oligonucleotid-Sonde
fixierten Cofaktor A und es kann eine enzymatische Aktivität gemessen
werden nach dem Inkontaktbringen der mit dem Cofaktor A markierten
Oligonucleotid-Sonde mit dem Enzym E und dem Substrat S. Die dabei
ablaufende enzymatische Reaktion entspricht dem folgenden Schema:
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Für den Fall,
dass das Substrat S ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge λ1 oder
ein Fluoreszenzemissionsmaximum bei einer Wellenlänge λ2 aufweist,
für welche
die Verbindung C keine Lichtabsorptions- oder Fluoreszenzemmisionseigenschaften
hat, kann man die enzymatische Aktivität bestimmen durch die Änderung
der optischen Dichte (ΔDO)
bei der Wellenlänge λ1 oder
durch die Änderung
der Fluoreszenz (Δfluo) bei
der Wellenlänge λ2 als
Funktion der Zeit.
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Wenn
die durch den Cofaktor A markierte Oligonucleotid-Sonde mit einem
komplementären
Oligonucleotid-Target hybridisiert ist, erkennt das Enzym E den
Cofaktor A nicht mehr oder fast nicht mehr und das Substrat S wird
nicht mehr oder fast nicht mehr in die Verbindung C umgewandelt.
Daraus resultiert, dass ΔDO/min
oder Δfluo/min
abnimmt.
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Vorzugsweise
verwendet man ein System aus Cofaktor A, Enzym E, Substrat S in
der Weise, dass diese Abnahme 50 bis 100 % des maximalen Wertes
von ΔDO/min
oder Δfluo/min
entspricht, der mit der Oligonucleotid-Sonde erhalten worden ist, die nur mit
A markiert worden ist, d.h. ohne komplementäres Oligonucleotid.
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Das
Erkennen des Cofaktors A, der an der Oligonucleotid-Sonde fixiert
ist, durch das Enzym E variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der
Basenpaare, die auf dem Oligonucleotid-Target vorhanden sind. Daraus resultiert
eine Beziehung zwischen ΔDO/min
oder Δfluo/min
in Abhängigkeit
von dieser Anzahl der Basenpaare. Dies erlaubt die Durchführung einer
genauen Analyse des Grades des Komplementarität zwischen dem zu analysierendeb
Oligonucleotid-Target und der markierten Oligonucleotid-Sonde.
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Darüber hinaus
kann der Nachweis von Hybridisierungen erzielt werden durch Messung
der Änderung eines
optischen Signals (der Änderung
von DO oder der Fluoreszenz), das mit dem Verbrauch des Substrats S
in Verbindung steht und durch die Wirkung eines Enzyms herbeigeführt wird.
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Darüber hinaus
können
der Verbrauch von S und die Amplitude des Signals unbedeutend gemacht werden
durch den Verstärkungseffekt,
der auf das Enzym zurückzuführen ist.
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Erfindungsgemäß ist es
auch wichtig, dass der Prozess der Erkennung zwischen dem Cofaktor
A und dem Enzym E nicht auf der Bildung einer kovalenten Bindung
zwischen diesen beiden Elementen beruht, d.h. dass der Cofaktor
A nicht auf kovalente Weise an dem Enzym A verankert ist, sodass
man diesen Verstärkungseffekt
erhalten kann.
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Bei
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
handelt es sich bei dem Cofaktor A um Flavin oder eines seiner Derivate.
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Im
Allgemeinen werden diese Verbindungen an Oligonucleotiden fixiert
mittels eines Abstandhalter-Armes, beispielsweise vom Typ -(CH
2)
n-, um Flavin-Oligonucleotid-Konjugate
zu ergeben. Eine Synthese von Konjugaten dieses Typs ist von C.
Frier et Coll. in "J.
Org. Chem.", 62,
1997, Seiten 3520–3528
[3], beschrieben. Diese Synthese besteht darin, dass man ein Flavin-Derivat an dem Oligonucleotid
fixiert unter Anwendung eines Phosphoramidit- oder H-Phosphonat-Kupplungsverfahrens,
wobei man von einem Derivat der Formel ausgeht:
worin n für eine ganze Zahl von 2 bis
8, beispielsweise für
die Zahl 6, steht.
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Die
Synthese-Strategie erlaubt die Einführung der Flavin-Gruppe auch
bei Anwendung von automatisierten Oligonucleotid-Syntheseverfahren.
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Das
Oligonucleotid wird durch eine Gruppe der Formel -(CH2)n-R1 markiert, in
der n für
eine ganze Zahl von 2 bis 8 steht und R' steht für eine Gruppe der Formel:
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Die
Enzyme E, die mit diesem Cofaktor verwendet werden können, können Flavoproteine
sein, unter denen verschiedene Oxydasen zu finden sind. Vorzugsweise
verwendet man erfindungsgemäß die NAD
(P) H-Oxydasen und NAD (P) H-Flavinoxydoreduktasen, die auch als
Flavin-Reduktasen bezeichnet werden.
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Als
beispielhafte NAD (P) H-Oxydase kann diejenige genannt werden, die
aus Hefe gewonnen wird und als Old Yellow Enzyme bezeichnet wird,
wie von J. Fisher et coll. in "Biochemistry", 1976, 15, Seiten 1054–1063 [4],
beschrieben.
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Als
beispielhafte Flavin-Reduktase kann diejenige genannt werden, wie
sie von F. Fieschi et al. in "J. Biol.
Chem.", 1995, 270,
Seiten 30392–30400
[5], beschrieben wird.
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Bei
den mit diesen Enzymen verwendbaren Substraten kann es sich um die
NADPH oder die NADH handeln.
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Die
Verwendung von Flavinen als Cofaktor ist sehr vorteilhaft, weil
es sich dabei um Moleküle
handelt, die als Cofaktoren der Flavin-Reduktasen agieren, d.h.
um lösliche
Enzyme, welche die Oxidation von NADPH oder NADH durch den Sauerstoff
der Luft nach dem folgenden Schema katalysieren:
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In
diesem Schema katalysiert die Flavin-Reduktase die Reduktion der
Flavine durch NAD(P)H. Die bei der Reaktion gebildeten reduzierten
Flavine reagieren anschließend
spontan mit dem Sauerstoff der Luft unter Bildung der Flavine im
Ausgangszustand. Auf diese Weise können zahlreiche Umwandlungszyklen
(Transformationszyklen) durchgeführt
werden, die einen großen
Verbrauch an NADPH oder NADH erlauben. Dieses enzymatische Verstärkungsphänomen erlaubt
die Erzielung starker Signale.
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Erfindungsgemäß ist die
Verwendung von NADPH oder NADH als Substrat besonders vorteilhaft,
weil diese Moleküle
eine charakteristische Licht-Absorption
und Fluoreszenz-Emission aufweisen, was bei ihren Oxidationsprodukten
NADP+ und NAD+ nicht
der Fall ist.
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Die
Fluoreszenz-Emissions-Eigenschaften von NADH werden insbesondere
beschrieben von Scott et coll. in "J. Am. Chem. Soc.", 92: 3, 11. Februar 1970, Seiten 687
bis 695 [6].
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Das
NADH weist somit eine maximale Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von
460 nm auf und es weist eine maximale Absorption bei einer Wellenlänge von
340 nm auf, während
sein Produkt der Umwandlung durch das Enzym NAD+ keine
Fluoreszenz und keine Absorption aufweist.
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Darüber hinaus
stellt die Flavinoxydoreduktase eine ausgezeichnetes Beispiel für ein Enzym
dar, das erfindungsgemäß verwendbar
ist. Es handelt sich dabei nämlich
ein monomeres Protein, das löslich,
stabil und leicht zu reinigen ist unter Verwendung eines sie im Überschuss
bildenden Stammes. Die Herstellung dieses Enzyms ist in der Literaturstelle
[5] beschrieben. Dieses Enzym erkennt ausschließlich den Isoalloxazin-Ring des
Flavins und es kann somit eine sehr große Anzahl von Flavin-Analoga,
die Modifikationen an der Ripityl-Kette aufweisen, wie z.B. in der
Literaturstelle [5] beschrieben, als Cofaktoren nicht verwendet
werden.
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Erfindungsgemäß wurde
gefunden, dass die an dem Oligonucleotid fixierte Flavin-Gruppe
durch die Flavin-Reduktase in der Weise erkannt wird, dass das Oligonucleotid-Flavin-Konjugat
immer einen Cofaktor darstellt, der es dem Enzym ermöglicht,
die Oxidation von NADPH oder von NADH zu katalytisieren und damit eine
Verminderung der Licht-Absorption bei 340 nm und eine Verminderung
der Fluoreszenz bei 460 nm auszulösen.
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Wenn
der Flavin-Cofaktor A nicht in einem gesättigten Zustand vorliegt in
Bezug auf die Konzentration des Enzyms E, ist die Änderung
von DO in Bezug auf die Fluoreszenz (ΔDO oder Δfluo) pro Zeiteinheit proportional
zur Menge des Flavin-Cofaktors A. Dies erlaubt eine quantitative
Bestimmung der mit dem Cofaktor A markierten Sonden.
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Erfindungsgemäß wurde
gefunden, dass dann, wenn ein Oligonucleotid-Flavin-Konjugat mit einem komplementären Oligonucleotid
hybridisiert worden ist, die Flavin-Gruppe von der Flavin-Reduktase
nicht mehr erkannt wird, da diese nicht mehr in der Lage ist, die
Oxidation von NADPH oder von NADH zu katalysieren und die Verminderung
der Absorption bei 340 nm und der Fluoreszenz bei 460 nm auszulösen.
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Infolgedessen
wird ohne Hybridisierung die Oligonucleotid-Flavin (Oligo-A)-Sonde nachgewiesen durch
Messung eines Signals, das besteht aus einer Verminderung der optischen
Dichte oder der Fluoreszenz pro Zeiteinheit oder pro festgelegtem
Zeitpunkt, wie z.B. 5 min. Dieses Signal neigt zu einer partiellen
oder vollständigen
Extinktion (ΔDO
oder Δfluo
nimmt ab oder wird im besten Fall Null) und dies in spezifischer
Weise, wenn keine Hybridisierung mit einem nicht markierten komplementären Target
vorliegt. Der Beweis einer Hybridisierung kann somit erbracht werden
durch Nachweis einer Veränderung
der Abnahme der optischen Dichte oder der Fluoreszenz-Emission.
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Ein
Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass diese gemessene Veränderung
des Signals nicht die Veränderung
der optischen Dichte oder der Fluoreszenz eines gegebenen Moleküls wiedergibt,
sondern mehrerer Moleküle
des Substrats S des Enzyms E bei Verwendung von A als Cofaktor.
Die enzymatische Reaktion erlaubt somit eine beträchtliche
Verstärkung
der Antwort.
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Bei
einer Ausführungsvariante
der Erfindung, die im Fall des Systems aus Flavin (Cofaktor A),
Flavinreduktase (Enzyme E) und NADH oder NADPH (Substrat) anwendbar
ist, kann man ein Signal erhalten, das repräsentativ für die enzymatische Aktivität des Enzyms
E ist, indem man ein zweites Enzym und einen Aldehyd verwendet,
wobei das zweite Enzym in der Lage ist, die Reaktion des reduzierten
Flavins mit dem Aldehyd oder Sauerstoff zu katalysieren, wobei diese
Reaktion begleitet ist von einer Lumineszenz, die repräsentativ ist
für die
Aktivität
des Enzyms E. Bei dem zweiten Enzym handelt es sich beispielsweise
um die Luciferase und der Aldehyd kann das Decanal sein.
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In
einer ersten Stufe wird dann, wie vorstehend beschrieben, das Substrat
S durch das erste Enzym E (Flavin-Reduktase) in die Verbindung C
umgewandelt unter Bildung des reduzierten Flavins. In einer zweiten Stufe
katalysiert das zweite Enzym (die Luciferase) die Reaktion des reduzierten
Flavins mit dem Aldehyd (RCHO) und Sauerstoff nach dem folgenden
Reaktionsschema: reduziertes Flavin
+ RCHO + O2 → RCOOH + oxidiertes Flavin
+ (Licht) (hν)
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Dies
entspricht einer Lumineszenz bei 490 nm.
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Diese
Reaktion wird beispielsweise beschrieben von Hastings et Coll. in "Advances in Microbial
Physiology", Band
26, 1985, Seite 235–291
[7] und von Zenno et Coll. in "J.
Bacteriol.", 1994,
Seite 3536–3543
[8].
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Das
auf diese Weise gebildete oxidierte Flavin kann von der Flavin-Reduktase dazu verwendet
werden, das Substrat S umzuwandeln, und kann erneut reduziert werden.
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Wenn
die Sonde mit einem komplementären
Target hybridisiert worden ist, laufen diese Reaktionen nicht mehr
ab und es entsteht kein Licht. Mit dem Oligoflavin erhält man dennoch
Licht, wenn keine Hybridisierung stattfindet und man erhält kein
Licht, wenn eine Hybridisierung stattfindet.
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Der
Nachweis der Hybridisierung durch Lumineszenz-Messungen ist vorteilhaft,
weil das Signal spezifisch an eine chemische Reaktion und nicht
an die Eigenschaften (Absorptions- oder Fluoreszenz-Eigenschaften)
der verwendeten Objekte (Mittel) die diesen eigen sind, gebunden
ist.
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Man
verfügt
daher über
eine sehr spezifische Sache, weil die Träger ein wenig fluoreszierend
sein können
und dadurch die Fluoreszenz-Messungen beeinflusst werden können. Dagegen
sind sie nicht chemilumineszierend.
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Bei
dieser Variante der Erfindung kann man die Flavin-Reduktase von
E. coli oder von V. harveyi und die Luciferase von V. harveyi verwenden.
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In
diesem Fall gibt man der mit Flavin markierten Sonde Flavin-Reduktase und Luciferase
sowie Decanal beispielsweise in einer Menge von 0,001 Vol-/Vol.%,
NADPH oder NADH in einer Menge von 200 μM und einen Phosphatpuffer,
pH 7,50 mM zu. Man misst die Lumineszenz mit einem handelsüblichen
Lumifotometer bei 490 nm. Wenn dieser Vorgang mit einem komplementären Oligonucleotid-Target
wiederholt wird, entsteht keine Lumineszenz.
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Erfindungsgemäß werden
die durch den Cofaktor A markierten Oligonucleotid-Sonden vorzugsweise auf
einem festen Träger
fixiert. Dieser feste Träger
kann mit Mikroküvetten
ausgestattet sein, in denen die Sonden fixiert werden.
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Ebenfalls
beschrieben in der Patentanmeldung wird ein Träger zur Analyse von biologischen
Targets vom DNA- oder RNA-Typ, der an einem festen Träger fixierte
Oligonucleotid-Sonden aufweist, der dadurch gekennzeichnet ist,
dass die Oligonucleotid-Sonden durch einen Cofaktor A eines Enzyms
E so markiert werden, dass der Cofaktor A, der an der Sonde fixiert
ist, von dem Enzym A erkannt wird, dass er jedoch weniger gut erkannt
wird von dem Enzym A, wenn die Oligonucleotid-Sonde mit einem komplementären Oligonucleotid
hybridisiert worden ist, wobei das Enzym E als solches ein Substrat
S oder eine Verbindung C zur Umwandlung dieses Substrats aufweist,
welches die Bestimmung der Aktivität des Enzyms E durch ein optisches
Signal ermöglicht, das
repräsentativ
ist für
den Verbrauch des Substrats S oder für die Bildung der Verbindung
C.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Cofaktor A um das Flavin oder eines seiner
Derivate.
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Die
Oligonucleotid-Sonde kann somit markiert werden durch eine Gruppe
der Formel -(CH2)n-R1, in der n für eine ganze Zahl von 2 bis
8 steht und R1 steht für eine Gruppe, die der folgenden
Formel entspricht:
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 stellt
eine Kurve dar, welche die Entwicklung der enzymatischen Aktivität der Flavin-Reduktase
als Funktion der zunehmenden Mengen eines komplementären Oligonucleotid-Targets
erläutert;
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die 2 erläutert die
enzymatische Aktivität,
die als Funktion der Anzahl der komplementären Basen des Oligonucleotid-Targets
bestimmt worden ist;
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die 3 zeigt
das Fluoreszenzemissionsspektrum von NADH;
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die 4 erläutert die Änderung
der Fluoreszenz-Intensität
von NADH in Gegenwart der Flavin-Reduktase und der Oligonucleotid-Sonde
allein (Gerade ISIS) oder der mit einem komplementären Oligonucleotid-Target
hybridisierten Oligonucleotid-Sonde (Gerade ISIS + ICAM-20);
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die 5 erläutert den
Einfluss der Anzahl der komplementären Basen eines Oligonucleotid-Targets, das
mit der mit Flavin markierten Oligonucleotid-Sonde hybridisiert worden ist, auf die Änderung
der Intensität der
Fluoreszenz von NADH, die durch die Aktivität der Flavin-Reduktase ausgelöst wurde;
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die 6 erläutert die
enzymatische Aktivität
der Flavin-Reduktase als Funktion der zunehmenden Mengen an mit
Flavin markierten Sonden.
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Detaillierte Beschreibung
von Ausführungsformen
der Erfindung
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In
den folgenden Beispielen werden die folgenden Oligonucleotide verwendet:
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1) Oligonucleotid-Flavin-Sonde
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- ISIS : SEQ ID Nr: 1
- 13'-ctctcccctt
caccaccccc-p-C6-Flavin
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2) komplementäre Targets
der Oligonucleotid-Flavin-Sonde
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- ICAM-20 : SEQ ID Nr.: 2
- 5'-gcctgatgag
aggggaagtg gtgggggaga catagcccca cc-3'
- ICAM-17 : SEQ ID Nr.: 3
- 5'-gcctgatgag
aggggaagtg gtggcccaga catagcccca cc-3'
- ICAM-14 : SEQ ID Nr.: 4
- 5'-gcctgatgag
aggggaagtg gattcccaga catagcccca cc-3'
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3) nicht-komplementäres Oligonucleotid
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- NC : SEQ ID Nr.: 5
- 5'-ctcatcgtgt
aaaaaaaaaa aggcagtact ggaagggcta attct-3'
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Die
Oligonucleotid-Flavin-Sonde ISIS wurde nach dem in der Literaturstelle
[6] beschriebenen Verfahren synthetisiert.
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In
diesen Beispielen verwendet man als Enzym E die nach dem in der
Literaturstelle [8] beschriebenen Verfahren herstellte Flavin-Reduktase.
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Die
Fluoreszenz-Emissions- und Erregungs-Spektren wurden aufgezeichnet
auf einem Spektrofluorometer LS 50B Perkin-Elmer, ausgestattet mit
einer pulsierenden Xenonquelle, einem Erregungs-Monochromator, einem
Emissions-Monochromator und einem Temperaturregelsystem.
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Beispiel 1
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In
diesem Beispiel wird die Entwicklung der enzymatischen Aktivität der Flavin-Reduktase
auf der Sonde ISIS (SEQ. ID: Nr. 1) als Funktion der zunehmenden
Mengen an komplementärem
Oligonucleotid-Target ICAM-20 (SEQ. ID Nr.: 2) untersucht.
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In
die Küvette
eines Varian-Cary-Spektrophotometers, ausgestattet mit einer Temperaturregel-Einrichtung,
führt man
ein Gesamtvolumen von 100 μl ein,
das umfasst die folgenden Verbindungen: 50 mM Tris HCl-Puffer, pH
7,5, 10 mM NaCl, 10 μM
ISIS-Sonde, 200 μM
NADH und 0,1 μM
Flavin-Reduktase sowie zunehmende Mengen an dem Oligonucleotid-Target
ICAM-20.
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In
einer ersten Stufe wird die Doppelhelix zwischen ISIS und ICAM-20
in dem Tris-Puffer in Gegenwart von NaCl bei Umgebungstemperatur
gebildet und NADH wird anschließend
zugegeben. Die Reaktion wird anschließend initiiert durch Zugabe
von 0,1 μM
Flavin-Reduktase (0,3 μg
pro Versuch). Darauf folgt einige Minuten lang Luft von 25 °C.
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Die
Oxidation von NADH wird durch elektronische Spektroskopie bei einer
Wellenlänge
von 340 nm, der charakteristischen Absorption von NADH, verfolgt.
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Die 1 erläutert die
Entwicklung der enzymatischen Aktivität der Flavin-Reduktase (in
nmol oxidiertes NADH min/mg Enzym) als Funktion der Anzahl der vorhandenen
Target ICAM-20-Äquivalente.
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Die
in der 1 dargestellten erhaltenen Ergebnisse zeigen,
dass die enzymatische Aktivität
schnell abnimmt, wenn die Anzahl der Äquivalente des Targets ICAM-20
zunimmt.
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Beispiel 2
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In
diesem Beispiel wird der Einfluss der Anzahl der komplementären Basen
des Targets auf die gemessene enzymatische Aktivität überprüft.
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In
diesem Beispiel wird die gleiche Arbeitsweise angewendet wie im
Beispiel 1, wobei man diesmal jedoch zusätzlich andere Target-Oligonucleotide,
bestehend aus ICAM-17 (SEQ. ID Nr.: 3), ICAM-14 (SEQ. ID Nr.: 4)
und NC (SEQ. ID Nr: 5), verwendet. Man verwendet in jedem Fall 10 Äquivalente
der Target-Oligonucleotide.
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Die
enzymatische Aktivität
wird wie in Beispiel 1 bestimmt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben und in der 2 dargestellt.
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Die 2 und
die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen, dass die enzymatische Aktivität (in nmol
oxidiertes NADH/min) stark abnimmt, wenn die Anzahl der komplementären Basen
des Target-Oligonucleotids zunimmt, da sie von 1700 auf 200 nmol
oxidiertes NADH/min abnimmt, wenn die komplementären Basen von 14 auf 20 zunehmen.
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Für den Fall,
dass die Oligonucleotid-Sonde allein verwendet wird, erhält man eine
enzymatische Aktivität
von 5 000 bis 5 800 nmol/min.
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Beispiel 3
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In
diesem Beispiel bestimmt man die Änderung der Fluoreszenz-Intensität von NADH
in Gegenwart der Flavin-Reduktase und der Sonde ISIS allein, die
mit Flavin markiert ist, und in Gegenwart der Sonde ISIS, die markiert
ist mit Flavin, das mit dem komplementären Oligonucleotid ICAM-20
hybridisiert worden ist.
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Die 3 erläutert das
Fluoreszenz-Emissionsspektrum von NADH bei einer Erregung bei 340
nm. In dieser Figur erkennt man, dass das Emissionsmaximum bei 460
nm liegt.
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In
diesem Beispiel verwendet man ein Gesamtvolumen von 400 μl, das enthält 50 mM
des Tris/HCl-Puffers, pH 7,6, 10 mM NaCl, 5 μM der Sonde ISIS, markiert mit
Flavin, 200 μM
NADH, in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 μM des komplementären Targets
ICAM-20, 10 Äquivalente.
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Die
Sonde ISIS wird allein oder zusammen mit ICAM-20 in Lösung gebracht.
Danach wird NADH zugegeben, dann wird die Reaktion bei 25 °C initi iert
durch Zugabe der Flavin-Reduktase (0,3 μg pro Versuch) entsprechend
0,1 μM.
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Die
Intensität
der Fluoreszenzeimission (I) von NADH wird als Funktion der Zeit
t (in s) bei 460 nm (der maximalen Emissionswellenlänge von
NADH) aufgezeichnet.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 4 dargestellt.
In dieser Figur entspricht die Gerade (ISIS) der Änderung
der Fluoreszenz-Intensität
bei der Sonde ISIS allein, die Gerade (ISIS + ICAM-20) erläutert die Änderung
der Fluoreszenz-Intensität
bei der Sonde ISIS, die mit ICAM-20 hybridisiert worden ist.
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In
der 4 stellt man fest, dass die Fluoreszenzemissions-Intensität der hybridisierten
Sonde in Abhängigkeit
von der Zeit sich praktisch nicht ändert.
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Beispiel 4
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In
diesem Beispiel bestimmt man die Änderung der Fluoreszenz-Intensität von NADH
als Funktion der Anzahl der Basenpaare des komplementären Targets.
Man führt
die gleiche Arbeitsweise durch wie in Beispiel 3, jedoch unter Verwendung
entweder des Targets ICAM-20 oder des Targets ICAM-17 oder des Targets ICAM-14
in einer Menge von 10 Äquivalenten
Target, bezogen auf die Sonde ISIS. Die Fluoreszenzemissions-Intensität I von
NADH, ausgedrückt
in willkürlichen
Einheiten, wird bei 460 nm für
eine Erregungs-Wellenlänge von
340 nm in Gegenwart von Flavin-Reduktase als Funktion der Zeit aufgezeichnet.
Die dabei erhaltenen Geraden I = f(t) erlauben die Bestimmung der Änderung
der Fluoreszenz pro min als Funktion der Anzahl der Basenpaare,
die in dem gebildeten Doppelstrang (Duplex) miteinander kombiniert
sind.
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Die
Tabelle 2 erläutert
die Änderung
der Fluoreszenzemissions-Intensität und die 5 erläutert diese Änderung
als Funktion der Anzahl der komplementären Basen des Target-Oligonucleotids.
In dieser Figur repräsentiert
der Wert 100 als willkürliche
Einheiten die Änderung
der Fluoreszenz-Intensität pro Zeiteinheit
im Falle des nicht-hybridisierten ISIS.
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Wenn
man die in der 5 erhaltenen Ergebnisse mit
denjenigen der 2 vergleicht, bei denen es sich
um eine Messung der optischen Dichte handelt, erkennt man, dass ähnliche
Ergebnisse erhalten werden.
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Beispiel 5
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In
diesem Beispiel bestimmt man die enzymatische Aktivität der Flavin-Reduktase unter Verwendung steigender
Konzentrationen der Sonde ISIS, die mit Flavin markiert worden ist.
Man führte
den Versuch in Abwesenheit von komplementären Oligonucleotiden durch,
indem man eine Lösung
von 50 mM Tris-Puffer, pH 7,6, 50 mM NaCl, 200 μM NADN und 0,05 g/l Flavin-Reduktase
verwendet. Man verwendet Mengen der Sonde ISIS, die von 0 bis 7 μM reichen.
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Die 6 erläutert die
enzymatische Aktivität
als Anzahl der Nanomole von oxidiertem NADH pro min als Funktion
der Konzentration (in μM)
der Sonde ISIS. Man stellt fest, dass die enzymatische Aktivität mit der Konzentration
der Sonde ISIS, d.h. mit der Konzentration an Flavin, zunimmt.
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Zitierte Literaturstellen
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- [1] US-A-5 925 525,
- [2] US-A-5 482 832,
- [3] C. Frier et Coll., "J.
Org. Chem.", 62,
1997, Seiten 3520–3528,
- [4] J. Fisher et Coll., "Biochemistry", 15, 1976, Seiten
1054–1063,
- [5] F. Fieschi et Coll. "J.
Biol. Chem.", 270,
1995, Seiten 20392–20400,
- [6] Scott et Coll., "J.
Am. Chem. Soc.",
92: 3, 11. Februar 1970, Seiten 687 bis 695
- [7] Hastings et Coll., "Advances
in Microbial Physiology",
Band 26, 1085, Seiten 235–291
- [8] Zenno et Coll., "J.
Bacteriol.", 1994,
Seiten 3536–3543.
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