JP2003529751A - 蛍光マーカーを含むバイオチップを用いた生物学的ターゲットの分析 - Google Patents
蛍光マーカーを含むバイオチップを用いた生物学的ターゲットの分析Info
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Abstract
Description
「バイオチップ」を目的とする。
異の研究、新しい医薬の開発において、その適用が見出される。
ーションを生じることができる複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。ハイ
ブリダイゼーションは、支持体上の相補的DNA鎖とターゲット鎖のペアリング
に相当する。したがって、ターゲットの性質を決定するために、支持体上のどの
部位が、したがってどのヌクレオチドがハイブリダイゼーションを生じるかを位
置決定し得ることが必要である。
プの分析支持体を記載している。
領域の抽出(溶解及び潜在的増幅)の後に、生物学的ターゲットと結合される蛍
光マーカーを用いて、決定される。
ハイブリダイゼーションが起こった部位を、蛍光マーカーのセットの励起を行な
い、その部位を読み取り、マーカーによる蛍光の再発光を検出することにより決
定する。蛍光が検出される部位は、ターゲット分子を固定した部位である。種々
のバイオチップに適合した読み取りシステムが、記載されており、例えばUS-A-5
578832[2]及びUS-A-5646411[3]に記載されている。
であるという欠点を有する。これは、標識の定量化及び/又は効率と、実施する
ため許される時間に関し、実用的な問題を有する。さらに、与えられた工程での
標識がその状況を固定し、ハイブリダイゼーション反応の後の動的測定を行なう
ことを妨げる。
制御のすべての問題を有する種々の方法により行なわれることが特記される。
空隙に付着したプローブの量は、オリゴヌクレオチドの存在の有効な制御の問題
を有する。現在のところ、正確に、例えば、ケイ素、ガラスまたはプラスチック
、例えばナイロンからなる分析支持体上に、付着したまたは原位置形成されたオ
リゴプローブを定量し、位置決定する方法は存在していない。
ダイゼーションがおこった支持体の部位の決定を容易にし、より感受性にする析
支持体、またはバイオチップを目的とする。
クレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々は蛍光化合物により標識され
て、この化合物により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光が、この標識された
オリゴヌクレオチドと、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
の後に減衰されるようになっていることを特徴とする。
クトルシフトからなるものでよい。
ない。その理由は、ハイブリダイゼーション部位の位置決定が、対象となるオリ
ゴヌクレオチド部位上でのハイブリダイゼーションの時に得られる蛍光の変化を
チェックすることにより検出できるためである。
蛍光化合物がより好ましく用いられる。より好ましくは、この減衰は、ハイブリ
ダイゼーションの前の蛍光強度の30乃至99%に相当する。
それらの誘導体の中から選ばれる。そのような化合物は、例えば、タイプ−−−
(CH2)n−−−などのスペーシングアームを介してオリゴヌクレオチド上に固
定し、フラビン(デアザフラビン)−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを得る
ことができる。このタイプのコンジュゲートの合成は、J.Org.Chem.,C.Frierら
、62,1997,3520-3528頁[4]により記載されている。 この合成は、式:
ヌクレオチド上に、フラビンの誘導体を固定することからなる。
クレオチド合成法を含む。この合成は、オリゴヌクレオチドデアザフラビンコン
ジュゲートの製造のためにも用いることができる。
は2乃至8の整数であり、R1は以下の式
特に興味深いものである。
蛍光励起スペクトルは、可視光の吸収スペクトルと同一であって、374と44
6ナノメートルに2つの最大波長を有し、それらの蛍光発光スペクトルは、52
0ナノメートル付近に最大を有する広いバンドからなる。デアザフラビンは、3
20と396ナノメートル付近を吸収し、フラビンより強い蛍光強度を示す(4
52ナノメートルで発光)。
これらの蛍光特性、励起と発光の最大を有意には変化させず、フリーのフラビン
とオリゴヌクレオチド−フラビンコンジュゲートで強度も同じであることが発見
された。
度との間に優れた直線性がある。
濃度が、フラビンの蛍光の励起「クエンチング」の増加効果を有するという事実
を示すことが必要である。これはコンジュゲートでも同じである。このことは特
記されるべきである。その理由は、ハイブリダイゼーションが、二重鎖の形成(
オリゴヌクレオチドがその相補的オリゴヌクレオチドと結合)を促進するために
、0.1乃至1MのNaCl濃度を必要とするためである。
の相補的ターゲットオリゴヌクレオチドとインキュベートされるとき、90乃至
100%のフラビンの特異的蛍光が消失することが発見された。
部位の読み取りを容易にする。
む分析支持体に接触させることと、この支持体のオリゴヌクレオチドとターゲッ
トとの間の1回または複数のハイブリダイゼーションを決定することによる、生
物学的ターゲットの分析方法において、支持体の各オリゴヌクレオチドが、相補
的オリゴヌクレオチドと標識化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションで蛍光変化を呈する蛍光化合物により標識され、ハイブリダイゼーション
を生じる支持体のオリゴヌクレオチドが、ターゲットと支持体との接触の前後で
、支持体の各オリゴヌクレオチドに対応する蛍光の測定により決定されることを
特徴とする方法も目的とする。
れる。
ドの蛍光化合物、又は第1の蛍光化合物の波長と異なる、第2の蛍光化合物でも
標識され、蛍光の変化を生じたオリゴヌクレオチドが、この第2の化合物の蛍光
の測定により制御される。
が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体から選ばれ、第2の蛍光化
合物が、DNAチップで用いられる安定な蛍光体、好ましくは可視で発光するも
の(ローダミン、CY3、CY5、など)、例えばフラビンに対して赤色へシフト
している安定な蛍光体から選ばれる。
、支持体の質の制御も可能である。
む分析支持体の制御方法であって、固定されたオリゴヌクレオチドは、蛍光化合
物により標識されたオリゴヌクレオチドであり、支持体上に固定されたオリゴヌ
クレオチドの量は位置決定され、蛍光化合物の蛍光の測定により決定されること
を特徴とする方法も目的とする。
なるであろう。これらは単に例示的なものであり、これで本発明が網羅されるも
のではない。
ヌクレオチドT16コンジュゲートが、式(I)(n=6)のフラビンF1の誘導
体を用いて文献[4]に記載された手法にしたがって、調製される。こうして、
式:
のフラビンF1の誘導体を用いて調製される。 同様に、式:
対する、他のオリゴヌクレオチドの存在の影響を調べる。
トリス−HClバッファー中に、1当量のオリゴヌクレオチド(配列番号1)存
在下、0.1乃至10μモル/LのT11−フラビンコンジュゲートを入れる。
光が測定される。
定した発光の5%を超えるものではない。
的オリゴヌクレオチド存在下で再開する。これらの条件において、蛍光発光は、
T11−フラビンコンジュゲートの蛍光発光の98%に相当する。したがってこの
オリゴヌクレオチドの存在は、T11−フラビンコンジュゲートの蛍光発光に影響
を及ぼさない。
号3をを添加することによってこの操作を再開するとき、二重鎖が形成できない
条件下で、蛍光発光は、コンジュゲート単独の蛍光発光の6%に相当する。
在がフラビンの特異的蛍光の90乃至100%の消失をもたらすことが明白であ
る。
い条件下で、T16ターゲット(配列番号2)存在下、または配列番号2に相補す
るオリゴヌクレオチド(配列番号4)存在下、または配列番号2と配列番号4の
2つのオリゴヌクレオチドの混合物存在下において、同じ実験を行なう。 以下の結果が得られる。
の間のハイブリダイゼーションにより、ターゲット(配列番号2)とT16オリゴ
ヌクレオチドの存在が、フラビンの蛍光の消失をもたらす。
オチド(配列番号10)の特性を、配列番号6と配列番号7により形成されたH
IV二重鎖の存在下で、テストする。
ターゲットはすでにハイブリダイゼーションを起していたので、F1−HIVコ
ンジュゲートと二重鎖との間のハイブリダーゼーションはなかった。
ンジュゲートと相補的オリゴヌクレオチドと間の二重鎖の形成に特異的であるこ
とを示す。その理由は以下の通りである。
鎖は、バックアップする蛍光の強度を生じる。したがって、蛍光分光法は、与え
られた温度における結合定数を評価するために、優れた方法である。温度の新た
な降下は、再び蛍光の強度を減少させる。
たらさない。
ゴヌクレオチド−フラビンコンジュゲートへの溶液への添加は、実施例4で示さ
れるように、蛍光の消失をもたらさない。
度は低い。
は、このggに変えて配列gc、cg及びccを含む配列番号1と同じオリゴヌ
クレオチドでも同じ結果が得られたので、ペアリングに関与せず必要でないこと
が特記される。
濃度範囲において、ターゲットオリゴヌクレオチド配列番号1の存在の影響を調
べる。実施例2,3,4と同じ条件が用いられた。
の関数として、452ナノメートルにおける蛍光強度の進展を示す。
番号8)を用いる以外は、実施例5と同じ実験を行なう。
の関数として、520ナノメートルにおける蛍光強度の進展を示す。
蛍光の偏差がより有意であることを示す。
の安定性を調べる。ゲル減速度の実験と融合温度Tmの測定を行なう。こうして
、オリゴヌクレオチド末端でのフラビン又はデアザフラビンの存在が、このオリ
ゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドとともに形成する複合体に、安定性
において有意な増加を与えることを示すことが可能であった。
号1と、Tm23℃(1MNaClにおいて37℃)の複合体をもたらすが、T11 −フラビンコンジュゲート(配列番号8)は、配列番号1とTm28℃(0.
1M NaClにおいて42℃)の複合体を形成する。
と比べて、ずっと少ない量のT11−フラビンコンジュゲート(配列番号8)しか
必要としないことを示す。
とターゲット(配列番号2)で同様の結果が見られた。
、これらの分子の全体の興味深い特性を明らかにする。 −フラビンの存在は、まだあまり解明されていない機構(フラビンとヌクレオチ
ド延期との間の水素結合、スタッキング、・・・)により、相補的オリゴヌクレ
オチドとのこのコンジュゲートの結合を安定化する。 −この結合は蛍光において非常に有意な減少をもたらす(ある場合は消失)。 −蛍光のこの消失は、非常に特異的である:コンジュゲートが、二重鎖の形成の
条件下、相補的オリゴヌクレオチド存在下にあるときだけ起こる。
コンジュゲート(配列番号12):
ートルの付近での蛍光スペクトルをスペクトルフルオロメーターで測定した。
ナノメートルである。
)のより高い濃度で、実施する。
.8、1、1.2及び1.4当量の相補的オリゴヌクレオチド配列番号13を用
いて得られた蛍光スペクトルを示す。
から出発して、約20の比の蛍光の減光が、相補的ターゲットが少し過剰なとき
に観察される。
ローブ−ターゲットハイブリダイゼーションに相当する複合体形成(「静的クエ
ンチング」)のいずれかであることができる種々の工程に対応することができる
。
[Q]の減光するオリゴヌクレオチドとの間に衝突があるときにおこる。以下の
式に相当するStern-Volmerの法則により、記載されている。 I0/I=1+hqτ0[Q] (式中Hqは減光定数を表し、τ0は蛍光寿命である)
が増加するとき、KD増加の現象を増大する効果を有する。
るとき、右からの傾きが増加する。
ーゲットハイブリダイゼーション、すなわち「静的クエンチング」の場合、 St
ern-Volmerの法則は: I0/I=1+Ks[Q] (式中、Ksは結合定数である) となる。
るとき、τ0/τ=1で、傾きは減少する。これは通常のことである。その理由
は、温度上昇は複合体の部分的変性を起こし、消えていた蛍光が発散されるため
である。
され、それはy軸に対して、正の曲率で表される。Stern-Volmerの関係は、以下
の通り修正されるべきである: I0/I=1+(Kd+Ks)[Q]+KdKs[Q]2
の関数として法則I0/Iをたどるなら、実際に、正の曲率で直線でないものが
見出され、図7で示されるように、それは静的及び動的クエンチングの同時存在
が表される。
シフトしており、ターゲットに結合している。こうして、この蛍光は、協同して
励起されることができ、ハイブリダイゼーション複合体の有効な存在を解明する
。
トルの励起波長と580ナノメートルの発光波長を有する。低パワー(1mW)
緑色HeNeレーザーを用いて、バイオチップ読み取り装置で行なったように、
スキャナーで可視化することができる。
オチップ上に固定化されオリゴヌクレオチドの二重の標識、及びCY3などの第
2の蛍光化合物により決定されるターゲットの二重の標識は、単純な従来の標識
に対して、優れた利点を有する。
位がプローブの蛍光を有するようにチップの全画像を作製することにより、ハイ
ブリダイゼーション前のプローブの質の制御を可能にする。そして、チップの欠
点をマップすることが可能である(蛍光強度の不均一な画像);いくつかの隣接
する部位上に同じタイプのプローブを置くことにより、重剰性を利用することも
できる。
起するが、520ナノメートルの読み取りに関する部位で蛍光の減少が観察され
る。ついで、ハイブリダイズされた複合体だけが蛍光の減少と協同したCY3タ
ーゲットを有しているであろうから、CY3の読み取りが、非特異性の分析を可
能にする。
吸収)、これは、波長の非常に異なる範囲の有意性が、あらゆる目的での400
−450ナノメートルでの励起が、CY3蛍光を生成しないという事実に存在す
る。
の形成の時間で変化しないが、動的クエンチングの場合で強く変化する。競合に
おける2つの現象は、したがって、衝突クエンチングと、単独で興味深いハイブ
リッドの形成が容易に分離できる。
る。実際に、従来の「チップ」において、蛍光は、与えられた温度で読み取られ
る。温度を上昇することは、非特異的ハイブリダイゼーションを「破壊する」効
果(変性)を有するが、複合体の蛍光を減少するという問題のある効果(温度が
増加するとき蛍光の量子収率が減少するため)も有する。静的クエンチングの場
合、反対に、原因となる蛍光の「解放」が存在するために、温度進展が、あまり
ハイブリダイズしていない複合体の蛍光を回復することががみられた。
きる結合、温度制御、そして寿命の測定も、ハイブリッドの形成を完全に追跡す
ること、そして種々の定数(Stern-Volmer定数、結合定数、そして作用の球の半
径の計算も)を計算することも可能にする。
、コンジュゲートT11−デアザフラビンの蛍光強度の進展を示す曲線である。
、コンジュゲートT11−フラビンの蛍光強度の進展を示す曲線である。
ゴヌクレオチド(配列番号13)と、コンジュゲート配列番号12−フラビンの
ハイブリダイゼーションにより得られる蛍光スペクトルを示す。
、蛍光強度I0/Iの比の進展を示す。
、蛍光強度I0/Iの比の進展を示す。
合物の濃度[Q]の関数として、蛍光強度I0/Iの比の進展を示す。
]の関数として、進展I0/Iを示す曲線である。
]の関数として、みかけの定数Kappの進展を示す曲線である。
Claims (15)
- 【請求項1】 複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらのオリゴヌクレオ
チドがその上に固定されている分析支持体において、前記オリゴヌクレオチドの
各々は蛍光化合物により標識されて、この化合物により標識されたオリゴヌクレ
オチドの蛍光が、この標識されたオリゴヌクレオチドと、相補的オリゴヌクレオ
チドとのハイブリダイゼーションの後に減衰されるようになっていることを特徴
とする分析支持体。 - 【請求項2】 蛍光の減衰が、蛍光強度の変化、蛍光の時定数の変化、又は
蛍光の波長のシフトからなる請求項1記載の支持体。 - 【請求項3】 蛍光化合物が、ハイブリダイゼーションにより減衰される蛍
光強度を呈する、請求項2記載の分析支持体。 - 【請求項4】 減衰が、ハイブリダイゼーション前の蛍光強度の30乃至9
9%に相当する請求項3記載の支持体。 - 【請求項5】 蛍光化合物が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘
導体の中から選ばれる請求項3又は4記載の支持体。 - 【請求項6】 オリゴヌクレオチドが、式−(CH2)n−R1(nは2乃至
8の整数であり、R1は以下の式: 【化1】 【化2】 のうちの一方に相当する基を表す)の基により標識されている、請求項5記載の
支持体。 - 【請求項7】 nが6である請求項6記載の支持体。
- 【請求項8】 複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらのオリゴヌクレオ
チドがその上に固定されている分析支持体の制御方法において、固定されたオリ
ゴヌクレオチドが、蛍光化合物により標識されたオリゴヌクレオチドであり、支
持体上に固定されたオリゴヌクレオチドの量が、蛍光化合物の蛍光の測定により
、位置決定され測定されることを特徴とする方法。 - 【請求項9】 蛍光化合物が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘
導体から選ばれる請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 生物学的ターゲットを複数のオリゴヌクレオチドを含む分
析支持体に接触させることと、この支持体のオリゴヌクレオチドとターゲットと
の間の1回または複数のハイブリダイゼーションを決定することによる、生物学
的ターゲットの分析方法において、請求項1乃至7のいずれか1項記載の分析支
持体が用いられ、ハイブリダイゼーションを生じる支持体のオリゴヌクレオチド
が、ターゲットと支持体とを接触させる前後で、支持体の各オリゴヌクレオチド
に対応する蛍光の測定により決定されることを特徴とする方法。 - 【請求項11】 前記ターゲットは、その発光波長が、オリゴヌクレオチド
の蛍光化合物、又は第1の蛍光化合物の発光波長と異なる、第2の蛍光化合物で
も標識され、蛍光の変化を生じたオリゴヌクレオチドが、この第2の化合物の蛍
光の測定により制御される請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 前記支持体のオリゴヌクレオチドの蛍光化合物、又は第1
の蛍光化合物が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体から選ばれ、
第2の蛍光化合物がフラビンに対して赤色へシフトしている安定な蛍光体から選
ばれる、請求項10または11記載の方法。 - 【請求項13】 前記第1の化合物の蛍光強度が、分光法により測定される
、請求項10乃至12のいずれか1項記載の方法。 - 【請求項14】 前記第2の蛍光化合物は、その励起波長が543.5ナノ
メートルで、その発光波長が580ナノメートルであるCY3である請求項11
記載の方法。 - 【請求項15】 この第2の化合物の存在が、HeNeレーザーを用いたス
キャナーで決定される、請求項14記載の方法。
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