DE69637065T2

DE69637065T2 - Die bestimmung von nukleinsäuren und nukleinsäure-einheiten

Info

Publication number: DE69637065T2
Application number: DE69637065T
Authority: DE
Inventors: Duncan Polwarth GRAHAM; Adrian Matthew Linacre; Calum Hugh Bearsden MUNRO; William Ewan Smith; Nigel Dean Dalry WATSON; Peter Cyril White
Original assignee: University of Strathclyde
Current assignee: University of Strathclyde
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2016-07-26
Also published as: EP0871774B1; JP4071278B2; AU6623896A; EP0871774A1; US6127120A; JPH11510385A; DE69637065D1; GB9517955D0; WO1997005280A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit sowie zur Analyse der Sequenz von Ziel-Nucleinsäuren in einer Probe. Außerdem betrifft die Erfindung chemische Komplexe zur Verwendung in solchen Verfahren, ein Reagenzien-Set zur Verwendung bei der Durchführung der Verfahren und bestimmte neue Verbindungen zur Verwendung in den Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Nachweis von Nucleinsäuren
Es gibt viele Situationen, in denen es notwendig ist, die Gegenwart von Nucleinsäuren, wie z.B. DNA und RNA, oder ihrer konstitutiven Nucleotide qualitativ oder quantitativ zu bestimmen. Beispiele für solche Situationen umfassen medizinische Diagnosen (z.B. den Nachweis von infektiösen Agenzien wie Bakterien und Viren, die Diagnose von vererbten und erworbenen genetischen Krankheiten und die Bestimmung von Gewebetypen), forensische Tests bei polizeilichen Ermittlungen und Vaterschaftsstreitigkeiten und natürlich die allgemeineren Bemühungen, menschliche und tierische Gene zu sequenzieren.
Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren sind schon bekannt. Verfügbare Verfahren umfassen beispielsweise:

a) Fluoreszenzspektroskopie – diese ist technisch sehr anspruchsvoll, wenn eine hohe Empfindlichkeit erreicht werden soll. Bei biologischen Tests gestaltet sich ihre Verwendung aufgrund der Autofluoreszenz der Analyten häufig kompliziert.
b) Radioaktive Markierung – diese erfordert ebenfalls hohe technische Fertigkeiten, ist aber meist weniger empfindlich als Fluoreszenzspektroskopie. Außerdem bringt sie auch die offensichtlichen Gefahren mit sich, die bei der Handhabung von radioaktiven Materialien auftreten.
c) Chemilumineszenz – obwohl dieses Verfahren relativ rasch durchgeführt werden kann und die Probleme der Autofluoreszenz und der Notwendigkeit der Handhabung von toxischen Substanzen umgeht, ist es leider relativ unempfindlich, aber trotzdem technisch anspruchsvoll.

Ein Nachteil vieler bekannter Verfahren ist, dass große Mengen des Ziel-Analyts erforderlich sind, d.h. ihre relativ geringe Empfindlichkeit. In den oben angeführten Situationen ist das Ziel häufig einfach nicht in ausreichend hohen Konzentrationen verfügbar. Folglich muss das verfügbare Ziel-Material amplifiziert werden, bevor seine Gegenwart genau nachgewiesen werden kann.
Auch zur Amplifikation einer Nucleinsäure sind Verfahren bekannt. Das häufigste ist die allgemein bekannte „Polymerasekettenreaktion" („PCR"). Alternativ dazu kann die Ziel-Nucleinsäure auch in einen biologischen Vektor, wie z.B. ein Plasmid, einen Phagen oder dergleichen, kloniert werden, der dann in eine (typischerweise bakterielle) Wirtszelle insertiert wird. Die Vermehrung des Wirts wird zugelassen, und der gewünschte Vektor wird nach einem geeigneten Zeitraum aus der Wirtszelle „geerntet".
Durch die Erfordernis einer Amplifikation wird ein Nachweisverfahren natürlich komplizierter, kostspieliger und zeitaufwändiger und erhöht die Wahrscheinlichkeit von Fehlern und von Verunreinigungen des Ziel-Materials.
Deshalb besteht Bedarf an einem Nucleinsäure-Nachweisverfahren, das für geringe Ziel-Konzentrationen empfindlich ist und vorzugsweise direkt an einer nichtamplifizierten Probe durchgeführt werden kann. Genau diesen Bedarf spricht die vorliegende Erfindung an.
Surface-Enhanced-Raman-Streuung
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das auf den Prinzip der „Surface-Enhanced-Raman-Streuung" (SERS) und auf einer Modifikation dieses Prinzips, die als SERRS (Surface-Enhanced-Resonanz-Raman-Streuung) bekannt ist, basiert. Diese Prinzipien sind schon bekannt und umfassend dokumentiert und wurden schon früher beim Nachweis und bei der Analyse von verschiedenen Ziel-Materialien eingesetzt.
Kurz gesagt entsteht ein Raman-Spektrum, wenn auf einen Analyten einfallendes Licht aufgrund von Anregung von Elektronen im Analyten gestreut wird. „Ramanstreuung" findet statt, wenn ein angeregtes Elektron auf einen anderen Energiezustand zurückkehrt als aus dem es gekommen ist – dies führt zu einer Veränderung der Wellenlänge des gestreuten Lichts und erzeugt eine Reihe von Spektrallinien mit sowohl höherer als auch niedrigerer Frequenz als die des einfallenden Lichts. Das gestreute Licht kann orthogonal zum einfallenden Strahl nachgewiesen werden.
Normale Raman-Linien sind relativ schwach, und Raman-Spektroskopie ist deshalb im Vergleich mit anderen verfügbaren Nachweisverfahren zu unempfindlich, um bei chemischen Analysen von Nutzen zu sein. Auch bei fluoreszierenden Materialien, bei denen die breiten Fluoreszenzemissionsbanden (die ebenfalls orthogonal zum einfallenden Licht nachgewiesen werden) dazu neigen, die schwächeren Raman-Emissionen zu überdecken, war Raman-Spektroskopie erfolglos.
Eine modifizierte Form der Raman-Spektroskopie, die auf „Surface-Enhanced"-Raman-Streuung (SERS) basiert, erwies sich jedoch als empfindlicher und somit als umfassender einsetzbar. Der Analyt, dessen Spektrum aufgezeichnet wird, ist eng mit einer aufgerauten Metalloberfläche assoziiert. Dies führt zu einer deutlichen Steigerung der Nachweisempfindlichkeit, wobei die Wirkung umso stärker ist, je näher der Analyt an der „aktiven" Oberfläche liegt (die optimale Position liegt in der ersten Molekülschicht um die Oberfläche, d.h. bis etwa 20 nm von der Oberfläche entfernt).
Die Theorie hinter dieser Oberflächen-Verbesserung ist noch nicht gänzlich geklärt, es wird jedoch angenommen, dass sich die höheren Valenzelektronen des Analyten mit Pools von Elektronen (bekannt als „Plasmone") in Vertiefungen auf der Metalloberfläche assoziieren. Wenn einfallendes Licht die Analytelektronen anregt, wird die Wirkung auf die Plasmone übertragen, die viel größer sind als die den Analyt umgebende Elektronenwolke, und dies führt zu einer Verstärkung des Ausgangssignals, oft um einen Faktor von mehr als 10⁶. Fluoreszenz wird auch gequencht, was zu klareren Raman-Spektren führt und die Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen als nachweisbare Analyten erlaubt. Im Allgemeinen bedeutet die Signalverstärkung, dass ein viel größerer Bereich von Analyten brauchbar nachgewiesen werden kann als unter Verwendung von normaler Raman-Spektroskopie. Weiters bedeutet die Verstärkung, dass eine weniger starke Lichtquelle notwendig ist, um die Analytmoleküle anzuregen.
Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit kann durch die Durchführung bei der Resonanzfrequenz des Analyten erreicht werden (in diesem Fall wird üblicherweise ein Farbstoff an das Ziel von Interesse gebunden). Die Verwendung einer kohärenten Lichtquelle, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs abgestimmt ist, ergibt eine 10³- bis 10⁵fache Steigerung der Empfindlichkeit. Dies wird als „Resonanz-Raman-Streuungsspektroskopie" bezeichnet.
Wenn die Oberflächenverstärkungswirkung und die Resonanzwirkung kombiniert werden, um eine „Surface-Enhanced-Resonanz-Raman-Streuung" oder SERRS zu erhalten, ist die resultierende Steigerung der Empfindlichkeit und Störungsunempfindlichkeit mehr als additiv. Außerdem scheint die Empfindlichkeit nicht so entscheidend vom Orientierungswinkel des Analyts in Bezug auf die Oberfläche abzuhängen, wie das bei SERS alleine der Fall ist. Ein SERRS-Signal kann leichter von Verunreinigungen und Hintergrund unterschieden werden und schwankt im Allgemeinen weniger in Abhängigkeit von lokalen Bedingungen (z.B. Ionenstärke oder pH, wenn eine Analyse in Lösung durchgeführt wird). SERRS ist somit ein überraschend empfindliches Nachweisverfahren; in vielen Fällen scheint es zumindest genauso gut wie, wenn nicht besser als, Fluoreszenzspektroskopie zu sein (siehe z.B. C. Rodger et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 791-799 (1996)).
SERRS kann auch selektiv verwendet werden, um mehrere Analyten nachzuweisen, ohne dass diese vorher getrennt werden müssen, wie dies bei einer Fluoreszenzspektroskopie notwendig wäre (siehe C.H. Munro et al., in: Analyst 120, 993-1003 (April 1995)).
Stand der Technik in Bezug auf SERS und SERRS
SERS und SERRS wurden in der Vergangenheit zum Nachweis verschiedenster Spezies eingesetzt. Beispiele für relevante Dokumente bezüglich des Stands der Technik umfassen:
J.C. Rubim et al., Appl. Spectroscopy 47, 80-84 (1993) – Herstellung von SERS-aktiven Messingoberflächen und SERS-Nachweis von Benzotriazol.
H. Wilson et al., J. Raman Spectroscopy 25, 899-901 (1994) – SERS-Nachweis von auf einer Silberkolloidoberfläche abgelagertem Benzotriazol.
C.H. Munro et al., J. Phys. Chem. 99, 879-885 (1995) – Verwendung von SERRS zum Nachweis eines Azofarbstoffs, Solvent Yellow 14, und Erläuterung der beteiligten Mechanismen.
C.H. Munro et al., Analyst 120, 993-1003 (April 1995) – SERRS-Nachweis von sauren Monoazofarbstoffen.
J. Clarkson et al., J. Raman Spectroscopy 22, 771-775 (1991) – Die Auswirkungen eines Lösungsmittels auf den SERS-Nachweis von organischen Spezies auf Silberkolloidoberflächen.
US 4.674.878 (Vo-Dinh) – Wege zur Herstellung von SERS-Substraten und Beispielsspektren für verschiedene organische Verbindungen (aber keine Nucleinsäuren). Die Nachweisempfindlichkeit bei Nanogramm- und Subnanogrammmengen sind angegeben.
US 5.400.136 (Vo-Dinh) – Spezielle Beschichtungen für SERS-aktive Oberflächen. In den Beispielen werden relativ starke Laser als Lichtquelle eingesetzt, was einen relativ niedrigen Empfindlichkeitswert vermuten lässt. Wiederum gibt es keine Verweise auf Nucleinsäuren als Ziel-Analyte.
J.M. Bello et al., Anal. Chem. 62, 2437-2441 (1990) – Die Verwendung von faseroptischen Sensoren zum Erhalt von SERS-Spektren. Nachweisgrenzen von nicht weniger als ~10^–7 M sind für eine Reihe von organischen Verbindungen angeführt.
K. Kneipp et al., Appl. Spectroscopy 49, Nr. 6, 780-784 (1995) – Nachweis von relativ geringen Konzentrationen (~10^–16 M) des Farbstoffs Rhodamin 6G unter Verwendung von SERRS. Es sollte bedacht werden, dass dieser Farbstoff wahrscheinlich anders mit einer SERRS-aktiven Oberfläche wechselwirkt als eine Raman-markierte Nucleinsäure.
SERS und SERRS wurden auch beim Nachweis von DNA und RNA erwähnt. Die nachgewiesenen Konzentrationen waren jedoch relativ hoch. Dies lässt vermuten, dass Verfahren nach dem Stand der Technik nicht empfindlich genug waren, um nichtamplifizierte Proben nachzuweisen.
Die folgenden Dokumente sind für die Verwendung von SE(R)RS zum Nachweis von Nucleinsäuren relevant:
T.M. Cotton et al., J. Raman Spectroscopy 22, 729-742 (1991) – Hier wird ein Überblick über die Anwendungen von SERS- und SERRS-Spektroskopie in biologischen Systemen gegeben. Der Nachweis von DNA wird erwähnt, und mögliche Probleme werden erläutert. Es gibt keine Angaben über die Nachweisempfindlichkeit, die bei DNA-Analysen erreicht werden kann.
US 5.306.403 (Vo-Dinh) – Hier wird der Nachweis von DNA durch Markierung mit einem Farbstoff und Adsorption des resultierenden Komplexes an eine SERS-aktive Oberfläche vorgeschlagen. Es gibt jedoch keine ausführbare Offenbarung eines Verfahrens mit ausreichender Empfindlichkeit, das ohne vorherige DNA-Amplifikation verwendet werden könnte. Die meisten der Beispiele beziehen sich auf den Nachweis von isolierten Farbstoffen und nicht auf einen Farbstoff-DNA-Komplex (der sich, wie nachstehend erläutert, unter SERS-Bedingungen ganz anders verhalten würde) – in diesen Beispielen beträgt die minimale Farbstoffkonzentration in den untersuchten Lösungen 0,05 mg/ml, was wahrscheinlich dem Nachweis von zwischen ~10⁷ und 10¹¹ Molekülen entspricht. Nur ein Beispiel wird für den Nachweis eines (sehr kurzen) Oligonucleotids, das mit Aminoacridin markiert ist, angeführt; in diesem Beispiel sind aber keinerlei Konzentrationsdaten angegeben.
Vo-Dinh et al., Anal. Chem. 66, 3379-3383 (1994) – In diesem Dokument wird über den Nachweis von DNA unter Verwendung von SERS berichtet, aber nur in relativ hohen Konzentrationen (10¹⁹ M oder mehr; obwohl es unmöglich ist, genaue Berechnungen vorzunehmen, ist es unwahrscheinlich, dass weniger als ~10⁵ Moleküle eines Ziels im angeführten Beispiel nachgewiesen wurden). Diese Nachweisniveaus und der Verweis auf die Verwendung von PCR in der Schlussfolgerung des Dokuments zeigen, dass das geoffenbarte Verfahren zur Detektion von nichtamplifizierten DNA-Proben immer noch ungeeignet wäre.
US 5.266.498 , US 5.376.556 und US 5.445.972 (Tarcha et al.) – Hier wird der Nachweis eines Analyts durch SERS beschrieben, indem ein analytvermittelter Ligandenbindungsvorgang überwacht wird. Ein „Fangreagens" wird hergestellt, indem ein SERS-markiertes Bindungselement, das für den Ziel-Analyt spezifisch ist, an eine SERS-aktive Oberfläche gebunden wird. Die Bindung des spezifischen Bindungselements an den Analyt in einer Prüfprobe führt zu einer nachweisbaren Veränderung im SERS-Spektrum für das Fangreagens. Nucleotidsequenzen werden kurz als mögliche Analyte erwähnt, aber die Dokumente enthalten keine Beispiele dafür und keine Erklärungen darüber, wie eine geeignete Empfindlichkeit erreicht werden könnte, besonders für nichtamplifizierte Nucleotidproben.
K. Kneipp et al., J. Molecular Structure 145, 173-179 (1986) – SERS-Nachweis von DNA auf Silbersolen. Die DNA-Konzentration in den Versuchen ist ~μg ml^–1; die Möglichkeit, Nanogramm-Mengen von DNA nachzuweisen, wird ebenfalls erwähnt.
J. Flemming et al., Studia Biophysica 130, 45-50 (1989) – Wiederum SERS-Nachweis von DNA auf Silberkolloidoberflächen bei Konzentrationen von μg ml^–1.
F. Ni et al., Anal. Chem. 62, 1958-1963 (1990) – Untersucht die Möglichkeit der Kombination von SERS-Spektroskopie mit einer Fließinjektionsanalyse, um RNA-Basen in relativ hohen (~10^–4 M) Konzentrationen nachzuweisen.
R. Sheng et al., Anal. Chem. 63, 437-442 (1991) – Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie in Kombination mit SERS zum Nachweis von nanomolaren Mengen von Nucleinsäurebasen. Empfindlichkeitseinschränkungen werden erläutert sowie auch mögliche Wege, um diese zu überwinden.
K. Kneipp et al., J. Molecular Structure 244, 183-192 (1991) – SERS-Nachweis von verschiedenen Nucleinsäuren, einschließlich DNA und RNA, in Konzentrationen von nicht weniger als ~10 μg ml^–1.
K. Kneipp et al., Appl. Spectroscopy 48, 951-955 (1994) – Nah-Infrarot-SERS-Nachweis der DNA-Base Adenin, adsorbiert an Silber- oder Goldkolloidpartikel. Die niedrigste nachgewiesene Basenkonzentration ist 10^–7 M.
Somit haben frühere Versuche die Tatsache gemeinsam, dass relativ große Mengen eines Nucleinsäureanalyts eingesetzt wurden. Bisher wurde noch in keinem eine ausreichend hohe Empfindlichkeit erreicht, die den Nachweis von nichtamplifizierten Nucleinsäureproben (d.h. den Nachweis von vielleicht 1-100 Molekülen in einer Probe) ermöglichen würde.
Dass SERS und SERRS nie für die Verwendung beim Nachweis von nichtamplifizierten Nucleinsäuren vorgeschlagen wurden, ist zumindest teilweise auf die offensichtlichen Schwierigkeiten beim Erreichen einer geeigneten Empfindlichkeit zurückzuführen. Diese Schwierigkeiten sind zum Teil auf Probleme zurückzuführen, die spezifisch für Nucleinsäuren sind, wobei die Probleme folglich in allgemeinerer Literatur über SE(R)RS nicht aufgegriffen werden.
Fachleute, die Nucleinsäuren oder Nucleinsäureeinheiten nachweisen wollen, würden deshalb annehmen, dass SE(R)RS-Spektroskopie die notwendige Empfindlichkeit oder Störungsunempfindlichkeit fehlt, vor allem ohne Ziel-Amplifikation. Der Bedarf an einem alternativen Nachweisverfahren, das zur Verwendung mit sehr niedrigen Konzentrationen eines Ziels geeignet ist, bleibt also bestehen, und ein solches wird durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
Aussagen der Erfindung
Gemäß ihrem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte (in beliebiger geeigneter Reihenfolge) umfasst:

a) das Bilden eines primären Komplexes zwischen einer aktiven Markierung von Surface-Enhanced-(Resonanz-)Raman-Spektroskopie (SE(R)RS) und einem beliebigen in der Probe vorhandenen Ziel, gegebenenfalls über eine Zielbindungsspezies, bei der es sich um eine(n) Nucleinsäure-Sonde oder -Primer handelt, die/der in der Lage ist, an zumindest einen Teil des Ziels selektiv zu hybridisieren;
b) das Herstellen einer Nachweisprobe, in welcher der primäre Komplex, oder ein sekundärer Komplex, der die Markierung und die Zielbindungsspezies enthält und di rekt vom primären Komplex herrührt, mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche assoziiert ist; und
c) den Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit des primären oder sekundären Komplexes in der Nachweisprobe (und somit des Ziels in der ursprünglichen Probe) durch Erhalt und Analyse eines SE(R)RS-Spektrums für die Nachweisprobe; worin eines oder mehrere der folgenden Merkmale verwendet werden:
i) die Einführung eines monomeren oder eines polymeren Polyamins in die Nachweisprobe vor dem Nachweis;
(ii) die Modifikation des Ziels und/oder der in der Zielbindungsspezies enthaltenen Nucleinsäure vor dem Nachweis auf eine Art und Weise, die dessen/deren Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche fördert oder erleichtert;
(iii) den Einschluss einer chemisorptiv-funktionellen Gruppe, die eine Lewis-Base ist, in die SE(R)RS-aktive Markierung.

In der Nachweisprobe ist die Konzentration des im primären Komplex vorhandenen Ziels oder der in der Zielbindungsspezies im sekundären Komplex enthaltenen Nucleinsäure nicht höher ist als 10^–10 mol pro Liter.
Das Ziel, die Markierung, der primäre Ziel-Markierung-Komplex, die Zielbindungsspezies, der sekundäre Komplex und die SE(R)RS-aktive Oberfläche sind nachstehend genauer beschrieben. Konzentrationen in der Nachweisprobe beziehen sich auf Konzentrationen in der Probe, die tatsächlich untersucht wird, d.h. im Falle einer Flüssigphasenuntersuchung auf die Probe, von der direkt ein SE(R)S-Spektrum aufgenommen wird, oder im Falle einer Festphasenuntersuchung auf die Probe, die auf eine SE(R)RS-aktive Oberfläche aufgetragen wird, um ein Spektrum zu erhalten.
Klarerweise gibt es aufgrund von praktischen Einschränkungen keine Untergrenze für die Konzentration der Nucleinsäuren/Nucleinsäureeinheiten, die mithilfe der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann. Diese kann beispielsweise zweckdienlich unter Verwendung von Nachweisproben durchgeführt werden, die weniger als 100 Kopien, beispielsweise weniger als 50 Kopien oder vielleicht weniger als 20 Kopien oder weniger als 10 Kopien oder insbesondere weniger als 5 Kopien, der relevanten Nucleinsäure oder Nucleinsäureeinheit enthalten. Natürlich kann auch der Nachweis von pikomolaren (10^–10 bis 10^–12 mol pro Liter) oder femtomolaren (10^–13 bis 10^–15 mol pro Liter) oder geringeren, möglicherweise viel geringeren, eventuell attomolaren (10^–16 bis 10^–18 mol pro Liter), Konzentrationen oder noch geringerer Mengen avisiert sein.
Das Verfahren kann selbstverständlich auch eingesetzt werden, um die Abwesenheit des Ziels in der Probe festzustellen, indem die gleichen Schritte durchgeführt werden und die Abwesenheit des relevanten primären oder sekundären Komplexes in der Nachweisprobe nachgewiesen wird.
Wie oben erläutert wurde weder SERS noch SERRS in der Vergangenheit zum Nachweis von Nucleinsäuren in so niedrigen Konzentrationen, d.h. in Konzentrationen, die wahrscheinlich nichtamplifizierte Proben eines Zielmaterials darstellen, eingesetzt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht solch einen Nachweis, indem die Empfindlichkeit von herkömmlichen SE(R)RS-Verfahren stark erhöht wird, wodurch ein vollkommen neues und verbessertes Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren und ihren Bestandteilen bereitgestellt wird, ein Verfahren, das viel rascher und preiswerter durchgeführt werden kann und weniger Fachkenntnisse erfordert als bestehende Nachweisverfahren.
Die erhöhte Empfindlichkeit kann in der vorliegenden Erfindung auf die nachstehend beschriebene Weise erreicht werden. Dies umfasst die Verwendung von zumindest einem, vorzugsweise mehreren, von drei Modifikationsmerkmalen, die alle dazu beitragen, den primären oder sekundären Komplex näher an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zu bringen, die zum Erhalt des SE(R)RS-Spektrums eingesetzt wird.
Dieses Verfahren nutzt zumindest eine (vorzugsweise mehr als eine, noch bevorzugter alle drei) Modifikation(en), um die Empfindlichkeit von bestehenden SE(R)RS-Nachweisverfahren zu erhöhen, sodass es in manchen Fällen zum Nachweis von äußerst geringen Konzentrationen eines nichtamplifizierten Ziels eingesetzt werden kann.
Die Wirkung der einzelnen Merkmale (i) – (iii) bei der Erhöhung der Empfindlichkeit ist wahrscheinlich zumindest additiv; zwei oder mehr Merkmale zusammen können eine synergistische Wirkung auf die Nachweisempfindlichkeit haben. Die einzelnen Merkmale sind unten nach der Erklärung der für die Definition der Erfindung verwendeten Bezeichnungen genauer erläutert.
Bedeutung von SE(R)RS
Erstens ist mit SE(R)RS entweder Surface-Enhanced-Raman-Streuung oder Surface-Enhanced-Resonanz-Raman-Streuung gemeint. Die Verfahren der Erfindung umfassen gegebenenfalls eine beliebige Spektroskopieform, da das wesentliche Prinzip (die Assoziation einer Raman-aktiven Markierung mit einer Raman-aktiven Oberfläche) in allen Fällen gleich ist. Vorzugsweise umfassen die Verfahren der Erfindung eher SERRS als SERS, da der Betrieb bei der Resonanzfrequenz der Markierung zu erhöhter Empfindlichkeit führt – in diesem Fall ist die zur Erzeugung des Raman-Spektrums verwendete Lichtquelle eine kohärente Lichtquelle (z.B. eine Laser), die im Wesentlichen auf die maximale Absorptionsfrequenz der eingesetzten Markierung abgestimmt ist. (Es sei darauf hingewiesen, dass sich diese Frequenz bei Assoziation der Markierung mit der SE(R)RS-aktiven Oberfläche und dem Ziel und/oder der Zielbindungsspezies leicht verschieben kann, aber für Fachleute stellt es sicherlich kein Problem dar, die Lichtquelle so abzustimmen, dass dem Rechnung getragen wird. Außerdem gilt anzumerken, dass die Lichtquelle auf eine Frequenz nahe dem Absorptionsmaximum der Markierung eingestellt werden kann oder auf eine Frequenz, die einem sekundären Peak im Absorptionsspektrum der Markierung entspricht oder nahe bei diesem liegt.)
SE(R)RS kann alternativ dazu auch den Betrieb bei der Resonanzfrequenz der Plasmone auf der aktiven Oberfläche umfassen, obwohl davon ausgegangen wird, dass bei den Verfahren der Erfindung vorzugsweise auf die Resonanzfrequenz der Markierung eingestellt wird.
Art des Ziels und der Probe
Die Verfahren der Erfindung können für den quantitativen oder qualitativen Nachweis von Ziel-Nucleinsäuren und zum Nachweis der Abwesenheit sowie der Gegenwart eines Ziels in einer Probe eingesetzt werden. Sie können Teil eines Gesamtverfahrens zur Bestimmung der Sequenz einer Nucleinsäure bilden, indem die Gegenwart von mehreren selektierten Ziel-Nucleotiden oder -Nucleotidsequenzen darin nachgewiesen wird.
Die Ziel-Nucleinsäure kann natürlich vorkommende DNA, RNA, mRNA, rRNA oder cDNA oder synthetische DNA, RNA, PNA oder ein anderes Nucleinsäureanalogon sein. Typischerweise handelt es sich um natürlich vorkommende DNA oder RNA. Sie kann ein Oligonucleotid oder ein Polynucleotid sein. Im vorliegenden Dokument bezieht sich, sofern durch den Zusammenhang nicht anders vorgegeben ist, die Bezeichnung „Nucleotid" auf entweder ein Desoxyribo- oder ein Ribonucleotid oder ein Analogon davon; „Oligonucleotid" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz aus zwischen 2 und 100 Baseneinheiten; und „Polynucleotid" auf eine Nucleotidsequenz aus 50 oder mehr Baseneinheiten.
Ein Ziel-Oligonucleotid oder -Polynucleotid kann im Wesentlichen einzel- oder doppelsträngig sein. Es versteht sich, dass ein Ausgangsziel vor dem Nachweis molekularbiologischen Manipulationen, beispielsweise einem Verdau mit Restriktionsenzymen oder einem Kopiervorgang mithilfe von Nucleinsäurepolymerasen, unterzogen werden kann, wodurch Modifikationen darin eingebracht werden können.
Die Wahl des Ziels hängt vom Zweck ab, für den das Nachweisverfahren letztendlich dient – beim Nachweis der Gegenwart von Bakterien oder Viren in Zellen ist es etwa wahrscheinlich, dass genomische DNA oder RNA am besten als Nachweisziel geeignet sind.
Die Probe kann jedes beliebige Präparat sein, in dem das Ziel wahrscheinlich vorkommt. Im Falle von medizinischen Diagnoseverfahren kann die Probe beispielsweise Blut (einschließlich Plasma- und Blutplättchenfraktionen), Rückenmarksflüssigkeit, Mucus, Sputum, Sperma, Stuhl oder Urin umfassen. Besonders gut geeignete Proben umfassen beispielsweise 20-1000 μl Blut oder 1-10 ml Mundspülung. Proben können auch Lebensmittel und Getränke, vermutlich verunreinigtes Wasser usw. umfassen. Diese Listen sind natürlich nicht erschöpfend.
Die Probe wird typischerweise vorbehandelt, um das Ziel zu isolieren und es für eine nachfolgende SE(R)RS-Analyse vorzubereiten. Zahlreiche Verfahren und Sets zur Vorbehandlung verschiedener Probenarten stehen zur Verfügung.
Die Nachweisprobe kann in jeder beliebigen geeigneten Form, beispielsweise als Feststoff, Lösung oder Suspension oder als Gas, vorliegen, die passend vorbereitet wurde, um eine Aufzeichnung des SE(R)RS-Spektrums zu ermöglichen. Die Nachweisprobe kann jeden beliebigen pH aufweisen, hat aber typischerweise einen sauren pH.
Die SE(R)RS-aktive Markierung
Die Markierung kann jedes beliebige Material sein, das aktiv ist, d.h. in der Lage ist, ein SERS- oder SERRS-Spektrum zu erzeugen, wenn es passend bestrahlt wird. Außerdem muss es in der Lage sein, auf die nachstehend beschriebene Weise einen primären Komplex mit dem Ziel zu bilden, entweder direkt oder über eine Zielbindungsspezies.
In manchen Fällen, vor allem beim Einsatz von SERS-Spektroskopie, besteht die Möglichkeit, dass das Ziel selbst oder die Zielbindungsspezies als SE(R)RS-aktive Markierung agiert und in der Lage ist, sein eigenes Raman-Spektrum zu erzeugen.
Viele SE(R)RS-aktive Markierungen sind bereits bekannt und in Literatur über SE(R)RS erwähnt. Dazu gehören Spezies, die Chromophore und/oder Fluorophore enthalten, die relativ leicht unter Verwendung von SE(R)RS nachgewiesen werden können.
Beispiele für geeignete SE(R)RS-aktive Spezies umfassen Fluorescein-Farbstoffe, wie z.B. 5-(und 6-)Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein und 5-Carboxyfluorescein; Rhodamin-Farbstoffe, wie Z.B. 5-(und 6-)Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylrhodamin und 6-Carboxyrhodamin X; Phthalocyanine, wie z.B. Methyl-, Nitrosyl-, Sulfonyl- und Aminophthalocyanine; Azofarbstoffe, wie z.B. in die C.H. Munro et al., Analyst 120, 993 (1995), aufgelisteten; Azomethine; Cyanine und Xanthine, wie z.B. die Methyl-, Nitro-, Sulfano- und Aminoderivate; und Succinylfluoresceine. Jede davon kann auf beliebige herkömmliche Weise substituiert sein, was zu einer großen Anzahl an zweckdienlichen Markierungen führt. Die Wahl der Markierung in einem bestimmten Fall hängt von Faktoren wie der Resonanzfrequenz der Markierung, den anderen vorhanden Spezies, der Verfügbarkeit der Markierung usw. ab.
Am meisten bevorzugt sind Markierungen, die eine chemiadsorptive fuktionelle Gruppe enthalten, wie sie nachstehend im Zusammenhang mit Merkmal (iii) der Erfindung beschrieben ist.
Bevorzugte SE(R)RS-aktive Markierungen sind außerdem solche, die geeignete funktionelle Gruppen enthalten, um eine leichte Anbindung an sowohl das Ziel (oder eine geeignete Zielbindungsspezies) als auch an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zu ermöglichen. Die Markierung sollte natürlich keine Gruppen enthalten, die voraussichtlich das Ziel oder die Zielbindungsspezies beeinträchtigen.
Wenn die Markierung über eine Zielbindungsspezies an das Ziel gebunden werden soll, wird die Markierung vorzugsweise in Form eines vorher vorbereiteten Markierung-Bindungsspezies-Komplexes verwendet. Wege zur Komplexierung von Markierungen mit Zielbindungsspezies sind nachstehend erläutert.
Die Zielbindungsspezies
Typischerweise ist es, wenn die Verfahren der Erfindung durchgeführt werden, notwendig, das Ziel über eine Zielbindungsspezies an die SE(R)RS-aktive Markierung zu binden. Diese liegt in Form einer Nucleinsäure, die im Wesentlichen zu zumindest einem Teil des Ziels komplementär ist, vor oder enthält eine solche – mit anderen Worten ist die Zielbindungsspezies eine Form von für das Ziel spezifischer/m Nucleinsäure-Sonde oder -Primer. (Mit „im Wesentlichen komplementär" ist gemeint, dass die Nucleinsäure zu selektiver Hybridisierung an das Ziel in der Lage ist.) Ein nachfolgender Nachweis der SE(R)RS-aktiven Markierung, die an die Zielbindungsspezies gebunden ist, stellt Informationen über die Gegenwart (oder Abwesenheit) jedes beliebigen Ziels bereit, an das sie gebunden ist oder wurde.
Der primäre Ziel-Markierungs-Komplex
Der oben beschriebene primäre Komplex umfasst im Allgemeinen die spezifische Bindung zumindest eines Teils des Ziels mit einer Zielbindungsspezies, die wiederum an die SE(R)RS-aktive Markierung gebunden ist. Die Hauptanforderung an die Verbindung zwischen Ziel und Markierung ist, dass ein Komplex aus den beiden Spezies gebildet wird, sodass der Nachweis der Markierung mittels seines SE(R)RS-Spektrums im Grunde mit dem Nachweis des gebundenen Ziels äquivalent ist.
Die Bindung zwischen der Markierung und dem Ziel, oder, wenn zutreffend, zwischen der Markierung und der Zielbindungsspezies, kann jede beliebige geeignete Bindungsform umfassen. Zahlreiche Verfahren zur Bindung von Farbstoffen und anderen Markierungen an Nucleinsäuren sind bekannt, beispielsweise aus der Fluoreszenzspektroskopie. Einige umfassen eine chemische Modifikation der Grundstruktur der Markierung. Für Fachleute stellt es sicherlich kein Problem dar, eine für die jeweilige Markierung, das jeweilige Ziel und die jeweilige Zielbindungsspezies geeignete auszuwählen. Die Bindung kann beispielsweise direkt, über eine kovalente Bindung oder über eine Chelatisierungsbindung, erfolgen. Noch bevorzugter erfolgt sie indirekt durch eine separate Linkergruppe – wiederum sind geeignete Linkergruppen bekannt, und diese können dazu beitragen, die Markierung von gebundenen Nucleinsäuren zu trennen, die möglicherweise (wie nachstehend erläutert) die entscheidende Wechselwirkung zwischen der Markierung und der SE(R)RS-aktiven Oberfläche beeinträchtigen können. DNA-Bindungsproteine können in diesem Zusammensetzung beispielsweise als „Linkergruppen" dienen.
Die Markierung ist vorzugsweise an das 5'-Ende der relevanten Nucleinsäure gebunden, obwohl eine Bindung an das 3'-Ende oder an eine Zwischenposition (z.B. an eine Base oder an eine Rückgrat-Zuckergruppe) ebenfalls möglich ist.
Zwei Beispiele für Verfahren, durch welche eine SE(R)RS-aktive Markierung an eine Nucleinsäure oder eine Nucleinsäureeinheit gebunden werden kann, umfassen Folgende:

1. Die Nucleinsäure wird mit einer nucleophilen primären Aminogruppe synthetisiert, üblicherweise am 5'-Terminus. Nach Entfernung der Schutzgruppen wird sie mit einer geeigneten reaktiven Stelle (z.B. einer aktiven Esterstelle) auf der Markierung umgesetzt. Eine Reinigung, üblicherweise durch Chromatographie, ergibt das gewünschte Produkt (siehe z.B. J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1, 165-187 (1990)).
2. Die Markierung wird mit einer chemischen Gruppe (üblicherweise einem Alkohol) synthetisiert, der in der Lage ist, eine Phosphorfunktionalisierung zu durchlaufen. Die aktive Phosphorverbindung wird dann mit der Nucleinsäure umgesetzt. Diese Reaktion kann unter Verwendung mehrerer Arten von Standardchemie erreicht werden, wie beispielsweise in M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press Oxford (1984), erläutert ist.

Weitere Beispiele für geeignete Bindungen, einschließlich mittels Linkergruppen, finden sich in P. Theisen et al., Tetrahedron Letters 33, Nr. 35, 5033-5036 (1992); J.M. Prober et al., Science 233, 336-341 (1987); D.B. Shealy et al., Anal. Chem. 67, 247-251 (1995); und C. Mackellar et al., Nuc. Acids Res. 20, 3411-3417 (1992).
Weitere Beispiele für Wege zur Bindung einer SE(R)RS-aktiven Markierung an eine Nucleinsäure sind die folgenden typischen bekannten Verfahren. Obwohl eine 5'-Markierung von Nucleinsäuren dargestellt ist, sind im Wesentlichen identische Modifikationen des 3'-Endes und/oder der internen Stellen gleichermaßen möglich. Modifizierter Farbstoff:
(Siehe P. Theisen et al., w.o.) Gekuppelter Farbstoff (die Kupplung kann in situ stattfinden):

(X = eine geeignete Gruppe für einen Angriff durch ein primäres Amin, z.B. Isothiocyanat oder N-Succinamid; Y liegt in seiner derivatisierten Form vor.)
(Siehe J. Goodchild, s.o. für ein spezifisches Beispiel.)

(X, Y = wie oben; B = jede beliebige Base in der Nucleinsäure. Wenn die Nucleinsäure eine Zielbindungsspezies ist, kann das Produkt als Monomer bei der Synthese eines markierten Polynucleotids eingesetzt werden, das zur Bindung an das nachgewiesene Ziel geeignet ist.)
(Siehe J.M. Prober et al., w.o.)

Der sekundäre Komplex
Der „sekundäre Komplex" ist direkt vom primären Ziel-Markierungs-Komplex abgeleitet, sodass seine Gegenwart von der Bildung des primären Komplexes abhängt. Der Nachweis des sekundären Komplexes entspricht, auch wenn das ursprüngliche Ziel nicht mehr vorhanden ist, (sowohl qualitativ als auch vorzugsweise quantitativ) dem Nachweis des Ziels. Der sekundäre Komplex enthält immer noch die SE(R)RS-aktive Markierung, um ein nachweisbares SE(R)RS-Spektrum zu ergeben.
Ein sekundärer Komplex kann beispielsweise gebildet werden, indem das gesamte oder ein Teil des ursprüngliche Ziels aus dem primären Ziel-Markierungs-Komplex abgespalten wird. Es gibt ähnliche Situationen, in denen ein sekundärer Komplex durch die Addition oder Entfernung von Spezies direkt vom primären abgeleitet werden kann – die einzige Anforderung besteht darin, dass die Gegenwart des sekundären Komplexes in der Nachweisprobe die Gegenwart des primären Komplexes in der ursprünglichen Probe reflektiert.
Zum Zeitpunkt des Nachweises müssen der primäre und sekundäre „Komplex" keine direkten Bindungen, wie z.B. kovalente Bindungen, zwischen ihren aufbauenden Spezies aufweisen. Auch berücksichtigt sind Situationen, in denen etwa das Ziel oder die Zielbindungsspezies lediglich mit der Markierung assoziiert ist, d.h. dieses ist immer noch in der Nachweisprobe vorhanden, und seine Gegenwart kann immer noch die Wechselwirkung der anderen vorhandenen Spezies und somit das SE(R)RS-Spektrum beeinflussen, aber es wurde beispielsweise vom die Markierung enthaltenden Komplex abgespalten.
Kombinationsreihenfolge der Spezies
Die Kombinationsreihenfolge des Ziels, der Markierung (mit der Zielbindungsspezies, falls vorhanden) und der SE(R)RS-aktiven Oberfläche ist in den Verfahren der Erfindung nicht entscheidend. Vorzugsweise wird der primäre oder sekundäre Komplex gebildet und dann zur aktiven Oberfläche hinzugefügt. Alternativ dazu kann der erste Schritt in der Bestätigung der Gegenwart (oder Abwesenheit) des Ziels durch Umsetzung mit einer Zielbindungsspezies bestehen, die dann durch den Zusatz einer geeigneten SE(R)RS-aktiven Markierung und Oberfläche nachgewiesen werden kann.
Auch eine Situation ist möglich, in der das Ziel mit einer geeigneten Oberfläche (z.B. in Form einer Beschichtung auf einem Wellenleiter) in Kontakt gebracht wird, bevor die Markierung und die Zielbindungsspezies zugesetzt werden, falls dies erforderlich ist.
Auf jeden Fall sollte das Ergebnis ein System sein, in dem der die Markierung enthaltende Komplex mit den Elektronenpools auf der aktiven Oberfläche assoziiert ist und idealerweise so nah wie möglich bei diesen liegt. Die nachstehend beschriebenen Merkmale (i) – (iii) tragen alle zur Optimierung der Nähe zwischen dem Komplex und der Oberfläche bei und erhöhen so die Empfindlichkeit.
Die SE(R)RS-aktive Oberfläche
Die SE(R)RS-aktive Oberfläche kann wieder jede beliebige geeignete Oberfläche sein, üblicherweise eine metallische, die zu einer Steigerung des Raman-Effekts führt, wie sie in großer Zahl aus der SE(R)RS-Literatur bekannt sind. Es kann sich beispielsweise um eine geätzte oder auf andere Weise aufgeraute Metalloberfläche, ein Metallsol oder, noch bevorzugter, eine Aggregation von Metallkolloidpartikeln handeln. Silber-, Gold- oder Kupferoberflächen, insbesondere Silber, sind besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, und wieder wird davon ausgegangen, dass aggregierte Kolloidoberflächen den besten SE(R)RS-Effekte bereitstellen.
Die Oberfläche kann nacktes Metall sein oder eine Metalloxidschicht auf einer Metalloberfläche umfassen. Sie kann eine organische Beschichtung aus beispielsweise Citrat oder aus einem geeigneten Polymer, wie z.B. Polylysin oder Polyphenol, enthalten, um die Sorptionskapazität zu erhöhen.
Wenn die Oberfläche kolloidal ist, werden die Kolloidpartikel vorzugsweise auf kontrollierte Weise aggregiert, sodass sie eine gleichmäßige und gewünschte Größe und Gestalt aufweisen und so stabil wie möglich gegen Selbstaggregation sind. Verfahren zur Herstellung solcher nichtaggregierten Kolloide sind schon bekannt. Sie umfassen beispielsweise die Reduktion eines Metallsalzes (z.B. Silbernitrat) mit einem Reduktionsmittel, wie z.B. Citrat, um eine stabile mikrokristalline Suspension zu bilden (siehe P.C. Lee & D. Meisel, J. Phys. Chem. 86, 3391 (1982)). Diese „Stammsuspension" wird dann direkt vor ihrer Verwendung aggregiert. Geeignete Aggregationsmittel umfassen Säuren (z.B. HNO₃ oder Ascorbinsäure), Polyamine (z.B. Polylysin, Spermin, Spermidin, 1,4-Diaminopiperazin, Diethylentriamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin) sowie anorgani sche Aktivierungsionen, wie z.B. Cl^–, I^–, Na⁺ oder Mg²⁺. Um den Prozess besser kontrollieren zu können, sollten alle verwendeten Geräte äußerst sauber sein, und die Reagenzien sollten hohe Reinheit aufweisen. Da die aggregierten Kolloide relativ instabil gegenüber Präzipitation sind, werden sie idealerweise in situ in der Nachweisprobe gebildet, und das SE(R)RS-Spektrum wird kurz danach entnommen (vorzugsweise innerhalb von 15 Minuten nach der Aggregation).
Idealerweise wird ein Material, wie z.B. Spermin oder Spermidin, eingeführt, um den Aggregationsvorgang besser kontrollieren zu können – siehe nachstehende Erläuterung von Merkmal (i). Die Aggregation kann zur gleichen Zeit wie die Zugabe der Oberfläche zu den anderen Spezies in der Nachweisprobe oder kurz danach durchgeführt werden.
Die Kolloidpartikel sind vorzugsweise von monodisperser Art und können jede beliebige Größe aufweisen, solange sie einen SE(R)RS-Effekt bereitstellen – im Allgemeinen weisen sie einen Durchmesser von 4-50 nm, vorzugsweise 25-36 nm, auf, was jedoch von der Art des Metalls abhängt.
Vorzugsweise umfasst die Oberfläche Silberkolloidpartikel, die vorzugsweise eine im Wesentlichen hexagonale Form und einen maximalen Durchmesser von etwa 20-36 nm aufweisen.
Assoziation des die Markierung enthaltenden Komplexes mit der Oberfläche
Die „Assoziation" des die Markierung enthaltenden Komplexes (d.h. des primären oder sekundären Komplexes) mit der SE(R)RS-aktiven Oberfläche erfolgt typischerweise durch Chemisorption des Komplexes an die Oberfläche oder durch chemische Bindung (kovalent, chelatbildend usw.) des Komplexes mit einer Beschichtung auf der Oberfläche, entweder direkt oder durch eine Bindungsgruppe. Die Assoziation erfolgt üblicherweise über geeignete funktionelle Gruppen auf der Markierung, wie z.B. geladene polare Gruppen (z.B. NH₃ ⁺ oder CO₂ ^–), die von der Oberfläche oder Oberflächenbeschichtung angezogen werden (z.B. von freien Amingruppen in einer Polyaminbeschichtung). Klarerweise hängt die Art der Assoziation von der Art der Oberfläche und der Markierung im jeweiligen Fall ab; unterschiedliche funktionelle Gruppen werden beispielsweise von einer positiv geladenen Oberfläche angezogen oder von einer negativ geladenen.
Geeignete Gruppen, durch welche der Komplex an die aktive Oberfläche gebunden werden kann, umfassen Komplexbildungsgruppen, wie z.B. Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphordonatoren; Chelatbildungsgruppen; Brückenliganden und Polymerbildungsliganden – Beispiele dafür umfassen:
Bevorzugte Wege zur Optimierung der Bindung zwischen Oberfläche und dem die Markierung enthaltendem Komplex sind nachstehend in Zusammenhang mit den Merkmalen (i) – (iii) beschrieben.
Merkmale (i) – (iii)
Bezüglich der Merkmale (i) – (iii) der Verfahren der Erfindung sind alle drei darauf ausgerichtet, die Empfindlichkeit der Verfahren zu erhöhen, indem der bestmögliche Kontakt zwischen der SE(R)RS-aktiven Oberfläche und dem die Markierung enthaltenden Komplex vereinfacht wird. Jedes der Merkmale unterstützt dies auf eine ein bisschen andere Art, und einige bieten noch andere Vorteile.
Die Identifikation dieser Merkmale und ihrer Auswirkungen auf die Empfindlichkeit hat zu einem besseren Verständnis der Probleme der Anwendung von SE(R)RS auf Nucleinsäuren und der bisher vorherrschenden mangelnden Empfindlichkeit geführt. Um empfindlichen SE(R)RS-Nachweis zu erreichen, muss die SE(R)RS-aktive Markierung in der Lage sein, auf zumindest etwa 20 nm an die SE(R)RS-aktive Oberfläche heranzukommen, d.h. innerhalb der ersten Molekülschicht. Im Allgemeinen gilt: je näher desto besser; die Steigerung des Raman-Signals ist proportional zu 1/r², worin r für den Abstand zwischen Oberfläche und Markierung steht. Wenn die Markierung an ein Nucleinsäure-Ziel oder eine Zielbindungsspezies mit einer Größe, die in der Molekularbiologie üblich ist (zumindest 8 Base lang), gebunden ist, dann hemmen zwei Faktoren die Nähe zwischen Markierung und Oberfläche und somit die Nachweisempfindlichkeit: (a) die Nucleinsäure ist viel größer als die Markierung, was die Markierung-Oberflächen-Wechselwirkung sterisch beeinträchtigt; und (b) die Nucleinsäure ist ein Polyanion mit einer negativen Ladung auf jedem Nucleotidrest; folglich wird sie von negativ geladenen Spezies, wie z.B. den Reduktionsmitteln, die meist mit typischerweise eingesetzten SE(R)RS-aktiven Oberflächen (insbesondere Kolloiden) assoziiert sind, elektrostatisch abgestoßen, und dies beeinträchtigt wiederum die Annäherung der Markierung an die Oberfläche.
Um die Markierung ausreichend nahe zur Oberfläche zu bringen, ist es also erstens notwendig, die gebundene Nucleinsäure näher an die Oberfläche zu bringen, als es normalerweise möglich wäre.
Die Merkmale (i) – (iii) scheinen diese Hürden wirksam zu überwinden und eine bessere Markierung-Oberflächen-Wechselwirkung zu erleichtern. Das Merkmal (i) ist in den Verfahren der Erfindung besonders bevorzugt, obwohl es idealerweise mit einem oder mehreren der Merkmale (ii) und (iii) kombiniert ist.
Die einzelnen Merkmale:
(i) Einführung eines Polyamins
Zuerst einmal ist mit „Polyamin" ein Amin mit mehr als einer Aminogruppe pro Molekül gemeint. Die Bezeichnung umfasst sowohl monomere als auch polymere Polyamine; im Falle von polymeren Polyaminen müssen mehr als eine Aminogruppe pro Monomer oder pro Grundeinheit des Polymers vorhanden sein.
Es zeigte sich, dass die Einführung eines Polyamins die Empfindlichkeit der Verfahren der Erfindung deutlich erhöht. Es wird angenommen, dass dies zumindest teilweise auf die Fähigkeit des Polyamins zurückzuführen ist, einen Teil der negativen Gesamtladung im Zusammenhang mit der Ziel-Nucleinsäure (und/oder mit eine beliebigen Ziel-Bindungsspezies, die eingesetzt wird) „auszugleichen"; ein „Ionenpaar" scheint zwischen dem Polyamin und der Nucleinsäure gebildet zu werden. Das Polyamin scheint außerdem als großer positiv geladener Ligand (der per se eine relativ hohe Konzentration von freien Aminosäuren enthält) auf der SE(R)RS-aktiven Oberfläche zu agieren, was anscheinend die Annäherung des primären oder sekundären Komplexes und seine bessere Haftung an der Oberfläche erleichtert. Dies wiederum erhöht die Empfindlichkeit und Störungsunempfindlichkeit.
Überraschenderweise zeigte sich, dass einige Polyamine einen weiteren Vorteil mit sich bringen, wenn die Oberfläche ein Metallkolloid ist; sie unterstützen die Steuerung der Kolloidaggregation, sodass diese auf kontrolliertere Weise ablaufen kann und ein gleichförmigeres und zeitlich stabileres Produkt ergibt. Wiederum ist dies wahrscheinlich auf die Fähigkeit des Polyamins zurückzuführen, die Ladung der Metallpartikel zu reduzieren, was für eine effiziente Aggregation erforderlich ist. Spermin und Spermidin, insbesondere Spermin, haben eine besonders gute Wirkung auf Kolloidaggregation und sind deshalb äußerst bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Wenn hohe Empfindlichkeitswerte erforderlich sind, wie im Falle von Nucleinsäure-Zielen, ist die Qualität der aktiven Oberfläche wichtiger als in vielen Verfahren nach dem Stand der Technik – bei einer kolloidalen Oberfläche sollten die aggregierten Kolloidpartikel beispielsweise eine optimale (und gleichmäßige) Größe und Form aufweisen. Die Verwendung eines Polyamins, wie z.B. Sperm(id)in, hilft, dies zu erreichen.
Der Stand der Technik beschreibt die Verwendung von Polylysin (ein polymeres Amin, das nur eine Aminogruppe pro Grundeinheit enthält) als Beschichtung für eine SE(R)RS-aktive Oberfläche, um die Ladung von anionischen SE(R)RS-aktiven Farbstoffen zu modifizieren (siehe z.B. C.H. Munro et al., in: J. Phys. Chem., w.o.). Polylysin fördert jedoch nicht die Nucleinsäure-Markierung-Oberflächen-Wechselwirkung auf die gleiche Weise wie Polyamine gemäß der vorliegenden Erfindung; vor allem ist es nicht in der Lage, eine Nucleinsäure-Ladung auf die gleiche Weise zu modifizieren. Der Stand der Technik hat nicht erkannt, dass Polyamine, wie z.B. Spermin oder Spermidin, nützlich sein könnten, um sowohl die Kolloidbildung zu unterstützen als auch die Affinität der aktiven Oberfläche für den die Markierung enthaltenden Komplex zu steigern. Die Entdeckung, dass sie dies können, ist sowohl neu als auch unerwartet.
Aufgrund der Doppelfunktion des Polyamins wird es in der Nachweisprobe vorzugsweise in einen Vorläufer einer kolloidalen SE(R)RS-aktive Oberfläche (z.B. die oben beschriebene mikrokristalle Lösung) eingeführt; das Polyamin fördert dann die Aggregation des Kolloids und modifiziert gleichzeitig die negative Ladung der vorhandenen Nucleinsäuren oder Nucleinsäureeinheiten. Überschüssiges Polyamin verbleibt als Beschichtung auf der Oberfläche, an welche sich der die Markierung enthaltende Komplex leichter annähern und anbinden kann.
Allgemeiner gesagt sollte das Polyamin zu einem Zeitpunkt eingeführt werden, zu dem es mit dem Ziel und/oder der Zielbindungsspezies Wechselwirken kann, bevor das SE(R)RS-Spektrum erhalten wird. Beispielsweise kann es zu einem Markierung-Bindungsspezies-Komplex zugesetzt werden, bevor die Markierung und die Bin dungsspezies in die Probe mit dem Zielmaterial eingeführt werden. Alternativ dazu kann es zur Zielprobe zugesetzt werden, bevor die Markierung (und gegebenenfalls die Bindungsspezies) und später die SE(R)RS-aktive Oberfläche eingeführt werden. Sobald die Oberfläche mit den anderen Reagenzien vereinigt ist, ist das Ergebnis eine „Assoziationskette" von der Oberfläche durch eine beliebige Beschichtung, die gegebenenfalls darauf vorhanden ist, durch die darauf folgende Polyaminbeschichtung bis zu dem die Markierung enthaltenden Komplex, der nachgewiesen werden soll.
Das Polyamin ist vorzugsweise ein kurzkettiges aliphatisches Polyamin, wie z.B. Spermin, Spermidin, 1,4-Diaminopiperazin, Diethylentriamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, Triethylentetramin und Tetraethylenpentamin (siehe die nachstehenden Strukturformeln); Spermin und Spermidin, insbesondere Spermin mit seinen vier NH₂-Gruppen pro Grundeinheit, sind besonders bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Das Polyamin wird vorzugsweise in Form eines Säuresalzes, wie z.B. seines Hydrochlorids, eingeführt. Wie oben beschrieben ist es am besten geeignet, wenn die SE(R)RS-aktive Oberfläche kolloidal ist.
Die zugesetzte Polyaminmenge liegt vorzugsweise im Bereich von 100- bis 1.000-mal mehr als erforderlich wäre, um eine Monoschichtbedeckung der Oberfläche mit dem Polyamin zu erhalten. Im Falle einer kolloidalen Oberfläche kann dies unter Bezugnahme auf die Größe der Kolloidpartikel berechnet werden.
(ii) Modifikation des Ziels oder der Zielbindungsspezies
Wiederum kann eine Modifikation des Ziels oder der Zielbindungsspezies (die selbst eine Nucleinsäure enthält), um die Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zu fördern oder vereinfachen, zur Stabilisierung der Wechselwirkung zwischen dem die Markierung enthaltenden Komplex und der Oberfläche beitragen und die Empfindlichkeit und Störungsunempfindlichkeit der Verfahren der Erfindung erhöhen.
Die Modifikation kann die Chemisorption zumindest zum Teil vereinfachen, indem die negative Gesamtladung der Nucleinsäure verringert wird. Idealerweise sieht die Modifikation so aus, dass beide Wirkungen erreicht werden, d.h. die Förderung oder Vereinfachung der Chemisorption und eine Reduktion der negativen Gesamtladung.
Eine Modifikation kann auf verschiedene Arten erreicht werden, wobei am meisten bevorzugt entweder die Inkorporation einer oder mehrerer geeigneter funktioneller Gruppen in die Nucleinsäure oder die Verwendung eines neutralen Analogons sind (siehe nachfolgende Erläuterung). Die beiden Modifikationen können kombiniert werden, wenn dies erwünscht ist, um eine stärkere Gesamtwirkung zu erreichen, obwohl Vorsicht geboten ist, um nicht zu stark zu modifizieren, sodass die Nucleinsäure nicht mehr wirksam hybridisieren kann, wie das erforderlich ist. Vorzugsweise wird die Modifikation in den Verfahren der Erfindung mit der Verwendung eines Polyamins gemäß Merkmal (i) kombiniert. Am besten wird sie an einer Zielbindungsspezies durchgeführt, bei der es sich um eine/n Nucleinsäure-Sonde oder -Primer handelt.
Inkorporation von funktionellen Gruppen
Geeignete funktionelle Gruppen umfassen die Lewis-Basen, wie z.B. Thiole und Amine, die leicht zu Nucleinsäuren hinzugefügt werden können. Eine besonders bevorzugte funktionelle Gruppe ist eine, die weitere kationische Stellen bereitstellen kann (unter den vorherrschenden Testbedingungen), z.B. eine Gruppe, die eine oder mehrere Aminogruppen, vorzugsweise primäre Aminogruppen, enthält. Aminogruppen können über einen Spacer-Arm an unterschiedlichen Positionen, einschließlich der 5'- und 3'-terminalen Hydroxygruppen, an eine Nucleinsäure gebunden sein, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist. Sie können auch an Nucleobasen gebunden sein, insbesondere an der C5-Position von Thymidin oder Uridin, wie ebenfalls bekannt ist.
Spezifische Beispiele für 5'- und 3'-Aminomodifikatoren, die an eine Nucleinsäure(einheit) gebunden werden können, umfassen Alkylaminogruppen H₂N-(CH₂)_n-, worin n eine beliebige ganze Zahl größer als 1 ist, und Aminoethylenglykole H₂N-(CH₂CH₂O)_n-, worin n eine beliebige ganze Zahl größer als 1 ist. Spezifische Beispiele für Thymidin- oder Uridinmodifikatoren sind beispielsweise -CH=CH-CO-NH-(CH₂)_n-NH₂ und -CH=CH-CO-NH-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂NH₂, wobei n wieder eine beliebige ganze Zahl größer als 1 ist.
Ein weiteres Beispiel für ein aminomodifiziertes Thymidin ist 5-(3-Aminoprop-1-in-1-yl)-2'-desoxyurid in:
(Siehe K.A. Cruickshank et al., Tetrahedron Letts. 29, 5221-5224 (1988), zur Synthese.)
Eine weitere nützliche Aminomodifikation wäre die Herstellung eines Polyaminolinkers von der C5-Position von Thymidin oder Uridin oder von einer beliebigen anderen geeigneten Position auf einer Nucleinsäure. Dies könnte beispielsweise in einem Schritt ausgehend von der bekannten Verbindung 5-(3-Acrylyl)thymidin erfolgen, die mit einem Polyamin wie Spermin unter Verwendung eines Peptidkupplers wie Dicyclohexylcarbodiamid (DCC) umgesetzt wird, um eine Amidbindung zu bilden:
Die Modifikation findet am besten an den Basen der Nucleinsäure statt. Sie kann an mehr als einer Position stattfinden, wobei der Grad der Modifikation, der möglich ist, von den chemischen und stereochemischen Möglichkeiten abhängt. Innerhalb vernünftiger Grenzen ergibt ein stärkerer Modifikationsgrad in den Verfahren der Erfindung im Allgemeinen eine höhere Nachweisempfindlichkeit.
Neutrale Analoga
Neutrale Analoga von Nucleinsäuren, worin eine oder mehrere (oder sogar alle) Internucleotidphosphodiester-Bindungen durch eine elektrisch neutrale Gruppierung ersetzt sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und auch in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich, insbesondere als Zielbindungsspezies.
In Wildtyp-Nucleinsäuren weist das Rückgrat eine Wiederholung von sechs Atomen zwischen Resten auf, die aus dem 3'-Kohlenstoff eines (Desoxy)ribosezuckerrings, den 4'- und 5'-Kohlenstoffen desselben (Desoxy)ribosrests, dem an den 5'-Kohlenstoff gebundenen Sauerstoff, dem an diesen Sauerstoff gebundenen Phosphor und dem an sowohl den Phosphor als auch den 3'-Kohlenstoff des folgenden (Desoxy)ribosreings in 5'-Richtung gebundenen Sauerstoff bestehen. In neutralen Nucleinsäureanaloga wird dieses zwischen Resten liegende Wiederholungsmotiv aus sechs Atomen üblicherweise aufrechterhalten. Meistens wird die Verwendung von (Desoxy)ribosezuckerringen beibehalten, sodass zwei der Atome üblicherweise aus den 3'- und 4'-Kohlenstoffen von (Desoxy)riboseringen bestehen, aber jedes einzelne, alle oder eine beliebige Kombination aus den restlichen vier Atomen der Bindung durch andere Atome oder funktionelle Gruppen ersetzt sein kann. Einige Beispiele für diese elektrisch neutralen Internucleotidbindungen sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt.
Verschiedene andere neutrale Nucleinsäureanaloga sind bekannt, in denen die (Desoxy)riboseringe des Rückgrats sowie die Interringatome durch andere Atome oder funktionelle Gruppe ersetzt sind. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Peptidnucleinsäuren (PNA), Ornithinpeptidnucleinsäuren und Morpholincarbamate (siehe Strukturformeln in der nachstehenden Tabelle 1).
Tabelle 1

(In den folgenden Formeln steht B für eine beliebige Nucleobase und R für eine beliebige geeignete funktionelle Gruppe, einschließlich Wasserstoff, für die Fachleuten Beispiele geläufig sind.)

Nr.	W	X	Y	Z	Name	Literaturverweis
1	O	O=P-O^–	O	CH₂	Phosphodiester (Wildtyp)
2	O	O=P-CH₃	O	CH₂	Methylphosphonat	1
3	O	O=P-OR	O	CH₂	Phosphotriester	1
4	O	O=P-F	O	CH₂	Phosphofluoridat	1
5	O	S=P-F	O	CH₂	Phosphofluoridothionat	1
6	O	O=P-NR₂	O	CH₂	Phosphoramidat	1, 6
7	CH₂	O=S=O	CH₂	CH₂	Sulfon	1
8	S	CH₂	O	CH₂	Thioformacetal	2
9	CH₂	CH₂	S	CH₂	Thioether	3
10	O	O=S=O	O	CH₂	Sulfat	3
11	O	O=S=O	CH₂	CH₂	Sulfonat	3
12	O	O=S=O	NH	CH₂	Sulfamat	3
13	NH	O=S=O	CH₂	CH₂	Sulfonamid	3
14	O	S=O	O	CH₂	Sulfit	3
15	CH₂	S=O	CH₂	CH₂	Sulfoxid	3
16	O	R-Si-R	O	CH₂	Siloxan	1, 2
17	O	CH₂	O	CH₂	Formacetal	1
18	O	O=C	O	CH2	Carbonat	1
19	O	O=C	R-N	CH₂	Carbamat	1
20	CH₂	N-CH₃	O	CH₂	N-Methylhydroxylamin	2, 3
21	R-N	O=C	CH₂	CH₂	Amid	2
22	R-N	O=C	R-N	CH₂	Harnstoff	2
23	CH₂	C=O	CH₂	CH₂	Keton	2
24	CH₂	CH₂	CH₂	CH₂	Butyl	2
25	O	CH₂	O=C	O	Carboxymethyl	1

Beispiele für Formeln (die hochgestellten Zahlen verweisen auf Tabelle 1 selbst) umfassen:
Literaturzitate für Tabelle 1

1. Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Hrsg. S. Agrawal, Humana Press (1993).
2. A. De Mesmaeker, R. Häner, P. Martin und H.E. Moser, Acc. Chem. Res. 28, 366-374 (1995).
3. J.F. Milligan, M.D. Matteucci und J.C. Martin, J. Med. Chem. 36, 1923-1937 (1993).
4. M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen und R.H. Berg, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992).
5. E. Lioy und H. Kessler, Liebigs Ann., 201-204 (1996).
6. S. Chaturvedi, T. Horn und R.L. Letsinger, Nucleic Acids Res. 24, 2318-2323 (1996).

Die Verwendung von neutralen Internucleotidbindungen zur Herstellung von modifizierten Nucleinsäuren zielt im Allgemeinen darauf ab, Resistenz gegen den Abbau der Nucleinsäuren durch Phosphodiesterasen und alkalische Phosphatasen zu verleihen und ihre Lipophilie zu erhöhen, um so die Durchdringung von Zellmembranen zu unterstützen, wenn sie als In-vivo-Therapeutika eingesetzt werden. Es zeigt sich jedoch häufig, dass die Verwendung von nichtnatürlichen Internucleotidbindungen die thermische Stabilität eines Duplex verringert, der zwischen der modifizierten Nucleinsäure und seiner komplementären Wildtyp-Sequenz gebildet wird. Aus diesem Grund werden modifizierte neutrale Internucleotidbindungen oft nur an den 3'- und/oder 5'-Termini in eine Nucleinsäure eingeführt, um den enzymatischen Abbau zu hemmen, während die restlichen Internucleotidbindungen Phospodiestergruppen sind, die zur Aufrechterhaltung der Duplexstabilität eingesetzt werden.
Einige der neutralen Internucleotidbindungen erwiesen sich jedoch nicht als destabilisierend. Dazu gehören einige Amid-, N-Methylhydroxylamin- und Thioformacetalbindungen. Nucleinsäuren, die mit diesen Bindungen ausgestattet werden, binden an RNA, um Duplexe mit der gleichen oder einer höheren Stabilität zu bilden als zwischen Wildtyp-DNA und -RNA (siehe Literaturverweis 2 nach Tabelle 1). Peptidnuc leinsäuren (PNAs) binden ebenfalls an DNA, um Hybride zu bilden, die stabiler sind als die entsprechenden DNA-DNA-Hybride.
Eine SE(R)RS-Sonde, d.h. eine Zielbindungsspezies, kombiniert mit einer Markierung für Nachweiszwecke gemäß der vorliegenden Erfindung, kann aus einer passend markierten Nucleinsäure hergestellt werden, wobei die Nucleinsäure entweder (i) unter Verwendung eines Gemischs aus Wildtyp-Phospodiester-Internucleotidbindungen in Kombination mit synthetischen neutralen Internucleotidbindungen oder (ii) gänzlich aus synthetischen neutralen Internucleotidbindungen, einschließlich PNA, hergestellt wurde. Es wäre zu erwarten, dass solch eine modifizierte Nucleinsäure weniger sauer wäre als die entsprechende Wildty-DNA- oder -RNA-Sequenz und folglich höhere Affinität für eine SE(R)RS-aktive Oberfläche aufweisen würde.
Besonders zweckdienlich als SE(R)RS-Sonde wäre eine, die unter Verwendung einer Phosphoramid-Internucleotidbindung hergestellt würde. Von besonderem potenziellem Nutzen wären Bindungen, welche die (O^–)-Funktionalität einer Phosphodiestergruppe durch NR₂ ersetzen, um Phosphoramidate zu bilden. Die einzelnen modifizierten Bindungen sind dann nicht mehr lediglich neutral, sondern auch in der Lage, eine positive Ladung aufzuweisen. Chaturvedi et al. (Literaturverweis 6 nach Tabelle 1) haben dieses Konzept durch die Herstellung von N-(Dimethylaminopropyl)phosphoramidaten ausgeweitet, die eine aliphatische Aminogruppe pro Internucleotidrest sowie die Phosphoramidataminofunktion aufweisen.
(iii) Chemisorptive funktionelle Gruppe auf der Markierung
Die SE(R)RS-aktive Markierung umfasst vorzugsweise eine funktionelle Gruppe, die ihre Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche fördert. Die Wahl einer solchen Gruppe hängt von der Art der Oberfläche (z.B. ihrer Ladung und der Gegenwart oder Abwesenheit einer Oxid- oder einer anderen Schicht) und von jeglichen Oberflächenbeschichtungen oder anderen mit ihr assoziierten Spezies (wie z.B. Citrat-Reduktionsmittel) sowie von der Art der Markierung ab. Die funktionelle Gruppe umfasst eine Lewis-Base. Idealerweise wird sie aktiv von der verwendeten Oberfläche angezogen.
Die Triazolgruppe:
ist reich an freien Elektronenpaaren am Stickstoff und scheint eine spezielle Affinität für SE(R)RS-aktive Oberflächen, wie z.B. Metallkolloide, aufzuweisen. Somit ist die Inkorporation dieser Gruppe in die Markierung besonders bevorzugt, da sie die Nähe der Markierung zur Oberfläche, den Oberflächenverbesserungseffekt und letztendlich die Nachweisempfindlichkeit steigern kann.
Vorzugsweise enthält die Markierung die Benzotriazolgruppe, insbesondere wenn die SE(R)RS-aktive Oberfläche auf Silber oder Kupfer basiert:
die einen hohen Konjugationsgrad aufweist (insbesondere im deprotonierten Zustand) und somit besonders gut für SE(R)RS-Nachweis geeignet ist, der auf der Markierungsresonanz basiert.
Benzotriazolderivate, wie z. B.:
sind leicht verfügbar und können mit vorhandenen Markierungen (wie z.B. Azofarbstoffen) gekuppelt werden, um passend modifizierte Markierungen zu erhalten. Es wird angenommen, dass einige dieser modifizierten Markierungen neue Verbindungen sind, und somit stellen sie Aspekte der vorliegenden Erfindung dar (siehe vor allem den nachstehend definierten sechsten Aspekt).
Andere geeignete chemisorptive funktionelle Gruppen für die SE(R)RS-aktive Markierung umfassen die Calixerine und die Mercaptobenzotriazole.
Geeignete Markierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Azobenzotriazole, die typischerweise durch die Kombination von Azosubstraten mit Benzotriazolderivaten gebildet werden. Beispiele für Azobenzotriazole umfassen 9-(Carboxyethyl)-3-hydroxy-6-oxo-6H-benzotriazol und substituierte Benzoe- und Naphtoesäure-Azoderivate, die an Benzotriazol gekuppelt sind.
Geeignete Markierungen sind durch die folgenden Formeln dargestellt:
worin R₁-R₆ für beliebige geeignete Gruppen (einschließlich Wasserstoff) stehen, für die Fachleuten sicherlich Beispiele bekannt sind, wobei aber die rechts von den Formeln aufgelisteten bevorzugt sind. W, X, Y und Z sind ebenfalls rechts von den Formeln definiert. Eine noch bevorzugtere Untergruppe solcher Verbindungen sind jene, worin R₁, R₂, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, 6-gliedrigen aromatischen Ringen, Halogen, -COOH, -SO₃H, -PO₄, -SH, -PO, -NR₇ und R₈ ausgewählt sind; R₅ kann gleich R₁ sein oder alternativ dazu -NH₂ oder funktionalisiertes -COOH, wie z.B. -(CH₂)_n-COOH, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist; und R₇ und R₈ können unabhängig voneinander aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl (unverzweigt oder verzweigt) und ungesättigten zyklischen Alkylringen ausgewählt sein.
Die am meisten bevorzugten Formen solcher Markierungen sind jene, worin R₁ und R₂ beide Wasserstoff sind, R₃ und R₄ unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Methoxy ausgewählt sind, R₅ entweder -COOH oder -amino ist und R₆ Wasserstoff ist. Noch bevorzugter sind die im nachstehenden Beispiel 2 angeführten.
Praktische Überlegungen
Andere Merkmale des ersten Aspekts der Erfindung können ganz konventionelle sein. Beispielsweise können die Immobilisation, Isolation und/oder Manipulation des Ziels und des die Markierung enthaltenden Komplexes, falls erwünscht; und die Verwendung und Interpretation des erhaltenen SE(R)RS-Spektrums (vor allem, wenn es als Teil eines Gesamtsequenzierungsvorgangs verwendet werden soll) gemäß den Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannten Praktiken durchgeführt werden.
Es gilt anzumerken, dass der Anwender zur Maximierung der Nachweisempfindlichkeit geeignete Merkmale – Markierung, Markierungsmodifikation, Zielbindungsspezies, falls zutreffend, Nucleinsäuremodifikation, Polyamin, Lichtquelle usw., und insbesondere die SE(R)RS-aktive Oberfläche – auswählen muss, die auf die bestmögliche Weise unter Anbetracht aller Anwendungsumstände wechselwirkt. Diese Selek tion kann teilweise ein Trial-and-Error-Anpassungsprozess mit Reagenzien, Bedingungen und anderen Parametern sein, unterliegt aber den Fachkenntnissen des Fachmanns auf dem Gebiet der Erfindung, vorausgesetzt dieser hält sich an die im vorliegenden Dokument dargelegten Anleitungen.
Die sorgfältige Wahl von Markierung(en) und Lichtquelle(n) kann auch (bei Einsatz von SERRS) einen hochempfindlichen Nachweis verschiedener Ziele gleichzeitig anhand ihrer unterschiedlichen Raman-Spektren ermöglichen, ohne dass diese vorher getrennt werden müssten. Möglicherweise könnten bis zu zwanzig unterschiedliche SERRS-aktive Markierungen auf diese Weise aufgelöst werden, idealerweise in einem homogenen Test der nachstehend beschriebenen Art.
Homogene und nichthomogene Tests
Die Nachweisprobe kann in festem, flüssigem oder gasförmigen Zustand vorliegen. Die Verfahren der Erfindung werden am besten in einem homogenen Format durchgeführt, d.h. alle erforderlichen Reagenzien können gleichzeitig oder im Wesentlichen gleichzeitig zur Nachweisprobe zugesetzt werden, und ein Ergebnis wird erhalten, ohne dass zu irgendeinem Zeitpunkt weitere Reagenzien zugesetzt werden müssten oder irgendeine Komponente des Tests nachher von den restlichen Komponenten abgetrennt werden müsste.
Homogene Tests weisen den Vorteil auf, dass sie weniger anfällig für Verunreinigungen sind und weniger wahrscheinlich die äußere Umgebung verunreinigen, da die Reaktionsbehälter zu keinem Zeitpunkt während des Tests geöffnet werden müssen. Der direkte Nachweis von Nucleinsäuren ohne Amplifikation, wie in der vorliegenden Erfindung, neigt nicht zu Verunreinigungen durch die Produkte vorangegangener Tests, wie dies bei amplifikationsbasierten Tests der Fall sein kann. Nichtsdestotrotz ist es aufgrund der hohen Empfindlichkeit, die für die Verfahren der Erfindung erforderlich ist, wünschenswert, dass sie in homogenen Systemen durchgeführt werden.
Bekannte Beispiele für homogene Nucleinsäuretests basieren meist auf Fluoreszenzspektroskopie. Die vorliegende Erfindung macht es nun möglich, mit der viel einfacheren und kostengünstigeren SE(R)RS-Spektroskopie ähnliche Testarten durchzuführen.
Homogene Tests gemäß der vorliegenden Erfindung werden am besten unter Einsatz von Detektoren für abklingende Wellen durchgeführt – siehe die nachstehende Beschreibung von zur Verwendung in der Erfindung geeigneten Lichtquellen.
Erhalt des SE(R)RS-Spektrums
Das Verfahren zum Erhalt des SE(R)RS-Spektrums, nachdem der die Markierung enthaltende primäre oder sekundäre Komplex gebildet wurde, kann ebenfalls ein herkömmliches sein. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich lediglich mit chemischen Modifikationen an vorhandenen SE(R)RS-Verfahren, d.h. Modifikationen am Ziel oder an der Zielbindungsspezies, der Markierung und der SE(R)RS-aktiven Oberfläche, damit sie für den Nachweis von nichtamplifizierten Nucleinsäure-basierten Zielen einsetzbar sind.
Beispielsweise kann Folgendes für die spektroskopischen Messungen gelten:
Lichtquelle
Typischerweise werden die Verfahren der Erfindung unter Verwendung von einfallendem Licht von einem Laser mit einer Frequenz im sichtbaren Spektrum durchgeführt (die genaue Frequenz wird in jedem Fall in Abhängigkeit von der Markierung, der Oberfläche und dem Ziel ausgewählt – Frequenzen im roten Bereich des sichtbaren Spektrums ergeben im Allgemeinen bessere Oberflächen-Verbesserungswirkungen). Es ist jedoch auch möglich, Situationen zu avisieren, in denen andere Frequenzen, beispielsweise im Ultraviolett- oder Nahinfrarotbereich, eingesetzt werden können – siehe die nachstehende Erläuterung bezüglich Sequenzierungsverfahren.
Die Auswahl und, falls erforderlich, Abstimmung einer geeigneten Lichtquelle mit einer geeigneten Frequenz und Leistung kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sicherlich durchgeführt werden, vor allem unter Heranziehung der verfügbaren SE(R)RS-Literatur. Um einen hochempfindlichen Nachweis unter Einsatz von SE(R)RS zu erreichen, ist eine kohärente Lichtquelle mit einer Frequenz erforderlich, die dem Absorptionsmaximum für die Markierung (wie oben beschrieben) oder der Oberflächenplasmone entspricht oder nahe bei diesem liegt. Wenn niedrigere Empfindlichkeiten erforderlich sind, muss die Lichtquelle nicht kohärent sein oder hohe Intensität aufweisen, sodass Lampen in Kombination mit einem Monochromatorgitter oder -Prisma eingesetzt werden können, um eine geeignete Anregungsfrequenz auszuwählen; hier ist es nicht notwendig, bei der Resonanzfrequenz der Markierung oder Plasmone zu arbeiten.
Die Quelle kann verwendet werden, um die Markierung direkt auf einer aktiven Oberfläche, wie z.B. einer Elektrode, anzuregen; indem durch eine SE(R)RS-aktive kolloidale Suspension durchgestrahlt wird; oder mithilfe von abklingenden Wellen über einen Wellenleiter, der mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche beschichtet ist.
Das Licht kann von der Quelle zur aktiven Oberfläche geleitet werden, indem es mit Spiegeln reflektiert wird, und kann fokussiert werden, um einen höheren Lichtfluss zu erreichen, indem es durch Linsen geleitet wird. Eine geeignete Vorrichtung für SE(R)RS-Analysen ist ein Fluoreszenzmikroskop mit Signaldetektion bei 90° in Bezug auf den Anregungsstrahl. Ein Fluoreszenzmikroskop mit konfokaler Optik ist ebenfalls geeignet. Die Verwendung von Mikroskopoptik erlaubt die Analyse von sehr kleinen Bereichen oder Volumina.
Das Licht kann alternativ dazu auch durch einen Wellenleiter von der Quelle zur aktiven Oberfläche geleitet werden. Dies führt zu Flexibilität in Bezug auf den Ort der Probenahme; der Wellenleiter kann über die aktive Oberfläche geführt oder in eine SE(R)RS-aktive kolloidale Suspension getaucht werden. Ein Wellenleiter ist besonders gut für Analysen geeignet, die in der Lösungsphase in den Wells einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Der Wellenleiter kann von einem Roboterarm geführt und nacheinander in die einzelnen Wells geführt werden, um Hochdurchsatz-Screening von zahlreichen Proben zu ermöglichen.
Ein mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche beschichteter Wellenleiter kann auch selektiv eingesetzt werden, um Analyten nachzuweisen, die an diese Oberfläche binden. Das Prinzip ist wie folgt. Licht wird mittels innerer Totalreflexion über einen Wellenleiter gesendet. Eng an die externe Oberfläche des Wellenleiters gebundene Moleküle können jedoch immer noch durch das elektrische Feld des Lichts angeregt werden („Abklingen"). Emissionen, wie z.B. SE(R)RS-Emissionen, die aus dieser Anregung resultieren, laufen weiter durch den Wellenleiter und können am Ausgabeende nachgewiesen werden.
Ein auf diese Weise nachgewiesenes SE(R)S-Spektrum wird beeinflusst, wenn die Oberflächenmoleküle an andere Spezies gebunden werden. So kann die Gegenwart einer Bindung etwa zwischen Affinitätspaaren, wie z.B. einer Ziel-Nucleinsäure und seiner komplementären Zielbindungsspezies, aufgezeigt werden, wobei eine Hälfte des Paars auf die Wellenleiter-Oberfläche aufgetragen ist, um die andere Hälfte aus der Probe „einzufangen". Natürlich ist eine SE(R)RS-aktive Markierung auf zumindest einer der beiden Hälften des Paars erforderlich. Vorzugsweise ist die „freie" Hälfte markiert, sodass SE(R)RS-Signale nur nachgewiesen werden, wenn diese Spezies von seiner komplementären Spezies auf der Wellenleiter-Oberfläche "eingefangen" wird. Da nur Moleküle, die an die Wellenleiter-Oberfläche gebunden sind, abgefragt werden, können spezifische Bindungsvorgänge homogen nachgewiesen werden, ohne dass nichtumgesetzte Reagenzien durch Waschen entfernt werden müssten.
Mehrere Veröffentlichungen offenbaren geeignete Verfahren zur Beschichtung von Lichtleitern, sodass sie spezifisch Analyten absorbieren und deren nachfolgenden SE(R)RS-Nachweis ermöglichen. US-4.395.312 (McCreery et al.) offenbart die elektrochemische Bildung von Chromophoren, die durch Raman-Sonden nachgewiesen werden können. US-4.573.761 (McLachlan et al.) offenbart eine Lichtleiter-Sonde, die separate, für Raman-Spektroskopie geeignete Übertragungs- und Sammel- Lichtleiter umfasst, welche einen spezifisch festgelegten Konvergenzwinkel aufweisen. US-4.781.458 (Angel et al.) offenbart eine Lichtleiter-Sonde oder „Optrode", die dünn mit einem SERS-aktiven Metall beschichtet ist und zusätzlich auf einer Seite, Ober dem Metall, mit einem selektiv absorbierenden Material beschichtet ist. US-4.834.497 (Angel et al.) offenbaren ebenfalls einen faseroptischen Fluid-Detektor, der für spezifische Materialien wie Benzin entworfen wurde. US-5.327.211 (Carron und Mullen) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Lichtleitern oder Lichtleiter-Sonden, die mit einer chemischen Schicht überzogen sind, die selektiv gewünschte Moleküle komplexiert oder trennt, was einen SERS-Nachweis erlaubt.
Detektor
Bei SE(R)RS hängen die primären Messungen von der Intensität des Streulichts und der Wellenlänge der Emissionen ab. Weder der Winkel des Einfallstrahls noch die Position des Detektors ist entscheidend. Bei flachen Oberflächen wird oft ein einfallender Laserstrahl so positioniert, dass er in einem Winkel von 60 °C auf die Oberfläche trifft, wobei bei entweder 90° oder 180° zum Einfallstrahl gemessen wird. Bei Kolloidsuspensionen kann der Nachweis bei jedem beliebigen Winkel zum Einfallstrahl erfolgen, wobei jedoch wieder häufig 90° eingesetzt werden.
Die Intensität der Raman-Signale muss gegen einen intensiven Hintergrund vom Anregungsstrahl gemessen werden, und aus diesem Grund ist die Verwendung von Raman-Analyten mit großen Stokes-Shifts ein Vorteil. Der Hintergrund ist primär Raleigh-Streulicht und gerichtete Reflexion, die selektiv mit optischen Hochleistungsfiltern entfernt werden können.
Unterschiedliche Vorrichtungen sind zum Sammeln von SE(R)RS-Signalen geeignet, einschließlich wellenlängenselektiven Spiegeln, holographischen optischen Elementen zum Nachweis von Streulicht und Lichtwellenleiter. Die Intensität eines SE(R)RS-Signals kann mithilfe eines ladungsgekoppelten Bauteils (CCD), einer Silicium-Photodiode oder von Photoelektronenvervielfacherröhren, die entweder einzeln oder in Serie für eine Kaskadenamplifikation des Signals angeordnet sind, gemessen werden. Photonenzählelektronik kann für empfindlichen Nachweis eingesetzt werden. Die Wahl des Detektors hängt größtenteils von der erforderlichen Nachweisempfindlichkeit ab, die in einem bestimmten Test notwendig ist.
Es gilt anzumerken, dass Verfahren der Erfindung entweder den Erhalt eines vollen SE(R)RS-Spektrums über einen bestimmten Wellenlängenbereich oder die Auswahl eines Peaks und das Scannen bei nur der Wellenlänge des Peaks (d.h. Raman-„Imaging") umfassen kann.
Datenprozessor
Ein Gerät zum Erhalt und/oder zur Analyse eines SE(R)RS-Spektrums umfasst fast immer eine Art Datenprozessor, wie z.B. einen Computer.
Raman-Signale bestehen aus einer Reihe von separaten Spektrallinien mit unterschiedlicher Intensität. Die Frequenz und relative Intensität der Linien sind spezifisch für die nachzuweisende Markierung, und das Raman-Signal ist somit ein "Fingerabdruck" der Markierung. Wenn ein SE(R)RS-Analysator eingesetzt wird, um selektiv eine Markierung aus einem Gemisch nachzuweisen, dann ist es zu Identifikationszwecken notwendig, das gesamte Spektrum des „Fingerabdrucks" nachzuweisen. Wenn jedoch der Analysator eingesetzt wird, um eine oder mehrere Markierungen, von denen jede eine einzigartige Spektrallinie besitzt, quantitativ nachzuweisen, dann ist es nur notwendig, die Signalintensität bei einer oder mehreren ausgewählten Spektrallinienfrequenzen nachzuweisen.
Sobald das SE(R)RS-Signal mithilfe eines geeigneten Detektors eingefangen wurde, werden typischerweise seine Frequenz- und Intensitätsdaten zur Analyse an einen Computer weitergeleitet. Entweder wird das Fingerabdruck-Raman-Spektrum mit Vergleichsspektren verglichen, um die nachgewiesene Raman-aktive Verbindung zu identifizieren, oder die Signalintensität bei den gemessenen Frequenzen wird verwendet, um die Menge der nachgewiesenen Raman-aktiven Verbindung zu berechnen.
Instrumente
Ein handelsüblicher SE(R)RS-Analysator, der zur Durchführung der Erfindung eingesetzt wird, umfasst voraussichtlich folgende Komponenten: eine Laserlichtquelle, ein geeignetes optisches System zur Weiterleitung des Lichts zur SE(R)RS-aktiven Oberfläche, eine Halterung zur Befestigung der Probe während der Analyse, optische Systeme zum Empfangen des Raman-Signals, einen Detektor zum Umwandeln des Raman-Signals in eine Reihe von Intensitäten bei bestimmten Wellenlängen und einen Datenprozessor zur Interpretation der Wellenlängen/Intensitäts-Daten und zur Bereitstellung einer Analyseausgabe.
Die Lichtquelle, die optischen Systeme, der Detektor und der Prozessor wurden schon erwähnt. Die Halterung zur Befestigung der Probe ist gegebenenfalls so aufgebaut, dass einer oder mehrere der folgenden festen Träger vorhanden sind: ein Objektträger oder eine andere flache Oberfläche, wie z.B. ein Siliciumwafer oder ein Chip, eine Mikrotiterplatte oder eine Mikrowellplatte mit einer dichteren Anordnung oder eine Membran.
Ein Test könnte auf einem festen Träger durchgeführt und der Träger dann zur Analyse in ein SE(R)RS-Lesegerät eingeführt werden. Alternativ dazu kann der Test in einem separaten Behälter durchgeführt werden, wonach die Testkomponenten auf den festen Träger übertragen werden, um dann in den Analysator eingeführt zu werden. Die Verwendung von Robotern zur Beförderung von festen Trägern zu und von SE(R)RS-Analysehalterungen weg würde die Entwicklung eines Hochdurchsatzsystems ohne wesentliche Eingabe vonseiten des Bedieners erlauben, wobei die Proben automatisch durchgeschickt und analysiert werden.
Zweiter und dritter Aspekt – Komplexe
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Surface-Enhanced-(Resonanz)-Raman-Spektroskopie-(SE(R)RS-)aktiven Komplex bereit, der Folgendes umfasst:

– eine Zielnucleinsäure, gebunden an
– eine SE(R)RS-aktive Markierung, gegebenenfalls über eine Zielbindungsspezies, die eine/ein Nucleinsäure-Sonde oder -Primer ist, die/der in der Lage ist, an zumindest einen Teil des Ziels selektiv zu hybridisieren, wobei die Markierung mit Folgendem assoziiert ist:
– einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche, worin der Komplex eines oder mehrere der folgenden Merkmale (i) bis (iii) umfasst:
(i) ein monomeres oder polymeres Polyamin;
(ii) Nucleinsäure im Ziel und gegebenenfalls in der Zielbindungsspezies, die eine oder mehrere, eine Lewis-Base umfassende funktionelle Gruppen enthält oder eine neutrale Nucleinsäure ist, um in jedem Fall dessen/deren Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zu fördern oder zu erleichtern;
(iii) eine chemisorptive funktionelle Gruppe, die eine Lewis-Base ist, in der SE(R)RS-aktiven Markierung.

Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung einen SE(R)RS-aktiven Komplex bereit, der eine Bindungsspezies umfasst, die Nucleinsäure enthält und an eine SE(R)RS-aktive Markierung gebunden ist, wobei die Markierung mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche assoziiert ist und der Komplex eines oder mehrere der oben beschriebenen Merkmale (i) oder (iii) inkorporiert.
Solche Komplexe sind natürlich in Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung von Nutzen. Im dritten Aspekt ist die Bindungsspezies typischerweise eine Sonde oder ein Primer, die/der im Wesentlichen komplementär zu zumindest einem Teil einer anderen Nucleinsäure ist, die schlussendlich nachgewiesen werden soll. Solch ein Komplex könnte beispielsweise mit einem immobilisierten Ziel in einer Probe umgesetzt werden; dann könnte der ungebundene Komplex durch Waschen entfernt werden, sodass alle eine Markierung enthaltenden Komplexe auf die Gegenwart des Ziels in der ursprünglichen Probe hinweisen würden.
Die Bindung der diese Komplexe bildenden Spezies aneinander kann durch Assoziation oder durch eine direkte oder indirekte (über eine Linkergruppe) chemische Bindung, wie z.B. eine kovalente oder Chelatisierungsbindung, erfolgen.
„Inkorporation" von Merkmal (i) bedeutet, dass ein Polyamin mit dem Komplex assoziiert ist, beispielsweise in Form eines ladungsausgleichenden Ionenpaars mit dem/der gesamten Ziel oder Bindungsspezies oder einem Teil davon und/oder einer Beschichtung auf der SE(R)RS-aktiven Oberfläche.
Vierter Aspekt – Sequenzierung
Die Erfindung stellt weiters, gemäß einem vierten Aspekt, ein Verfahren zur Sequenzierung von Nucleinsäure bereit, das die Anwendung des Verfahrens des ersten Aspekts umfasst, um zumindest ein Ziel-Nucleotid oder eine Nucleotidsequenz in der Säure zu detektieren. Weitere Schritte eines solchen Sequenzierungsverfahrens können ganz konventionell sein; Fachleute können leicht anhand der Daten aus dem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung auf eine Gesamtsequenz schließen. Bei diesem Verfahren kann die SE(R)RS-aktive Markierung über eine Zielbindungsspezies in Form einer Nucleinsäure-Primersequenz, die im Wesentlichen komplementär zum Ziel ist, oder in Form einer dNTP oder ddNTP ((Di)desoxynucleotidtriphosphatbase) an das relevante Ziel-Nucleotid oder die relevante Sequenz komplexiert werden.
Derzeitige nichtradioaktive Arbeitsvorschriften zur Nucleinsäure-Sequenzierung basieren auf zwei Grundsystemen:

a) Vier identische Primer, die mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind, werden in Kettenterminationsreaktionen vom „Sanger"-Typ laufen gelassen, gepoolt und durch Gelelektrophorese aufgelöst. Die Fluoreszenz wird unter Verwendung eines Lasers und von CCD im Gel nachgewiesen.
b) Jede Didesoxy-Terminationsbase in einer Sanger-Reaktion wird mit einem anderen Farbstoff markiert, und alle Reaktionen werden in einem einzigen Gefäß durchgeführt. Nach der Entfernung von überschüssigem Farbstoffterminationsrea gens werden die markierten Produkte durch Gelelektrophorese aufgelöst und mit einem Laser abgefragt.

Um zwischen den Farbstoffen unterscheiden zu können, werden verschiedene Anregungs- und Emissionswellenlängen verwendet, welche die Empfindlichkeit einschränken, welche mit einer einzelnen Laserlinie erreicht werden kann, da manche der Farbstoffe Anregungsmaxima aufweisen, die weit von den verwendeten entfernt sind. Außerdem ist eine große Menge Sequenzierungsmatrize erforderlich, um verlässliche Informationen zu erhalten, was normalerweise vorher eine Amplifikation und daraus resultierende(n) Aufwand und Kosten bedingt. Somit bringt die Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung in Sequenzierungsverfahren deutliche Vorteile mit sich.
Mithilfe der vorliegenden Erfindung sind beide der obigen Reaktionsschemata möglich. Andere mögliche Nachweisschemata sind das Direktblotting der Sequenzierungsverlängerungsprodukte auf Nylon- oder Nitrocellulosemembranen oder Flution der Produkte aus Gelelektrophorese auf eine sich bewegende Membranrolle. Die Produkte könnten dann durch Tränken mit Polyamin (z.B. Spermin) gefolgt von Kolloid und SE(R)RS-Spektrokopie des gesamten Filters bestimmt werden. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung beim Sequenzieren bringt zwei Vorteile mit sich: Erstens kann jeder Farbstoff Anregnungsoptimalwerte aufweisen, die nahe bei der Laserlinie liegen, sodass alle gleich gut angeregt werden, und zweitens erlaubt die hohe Empfindlichkeit des Verfahrens der Erfindung die Verwendung von geringeren Mengen Ausgangsmatrize, mit der Möglichkeit, direkt aus dem Genom zu sequenzieren.
Ein plausibles Sequenzierungsformat gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung könnte wie folgt aussehen:

a. Isolieren der Matrize (oder möglicherweise des Genoms).
b. Verwendung von vier parallelen Reaktionen mit jeweils einem anderen markierten Primer und ddNTP-Terminator, Durchführung einer Kettenterminationssequenzierung.
c. Poolen der vier Reaktionen.
d. Auflösung der Reaktionsprodukte auf einem Polyacrylamid/Harnstoff-Gel.
e. Blotten des Gels auf Nylon.
f. Tränken der Membran mit Spermin.
g. Tränken der Membran mit dispergiertem Silberkolloid.
h. Erhalten der SE(R)RS-Spektren.
i. Wiederherstellung einer Sequenz aus dem Bild, das verarbeitet werden kann.

Ein alternatives Sequenzierungsschema ähnelt dem Southern-Blotting. Vier Terminatorreaktionen werden ohne Markierung durchgeführt. Nach einer Elektrophorese (vier Spuren pro Matrize) werden die Produkte auf eine Membran transferiert und an eine komplementäre Sonde hybridisiert, die eine SE(R)RS-aktive Markierung aufweist. Das SE(R)RS-Signal wird durch Tränken mit Spermin und einem Kolloid entwickelt, bevor die Spektren gewonnen werden. Der Durchsatz in solch einer Reaktion könnte verbessert werden, indem mehrere Reaktionen durchgeführt werden und die Sonden verwendet werden, um jeweils nur eine Reaktionsgruppe zu "betrachten". Die Hybridisierungen mit den verschiedenen Sonden könnten nacheinander oder gleichzeitig erfolgen (was von einer ausgeklügelten Dekodierung der Daten durch die Computer-Software abhängt). Die Sonden sollten nahe der Priming-Stelle, aber innerhalb der sequenzierten Region liegen.
Ein Sequenzierungsverfahren gemäß der Erfindung kann auch Multiplexing umfassen (siehe Beispiel 9 weiter unten).
Sequenzierung im ultravioletten Bereich
Weitere Nachteile herkömmlicher Nucleinsäure-Sequenzierungsverfahren (die auf dem „Sanger"-Verfahren basieren) umfassen (i) die Notwendigkeit, vier separate Sequenzierungsreaktionen durchzuführen, für jede Base eine, und (ii) die Notwendigkeit, die Ergebnisse unter Einsatz von hochauflösender Elektrophorese zu analysieren.
Ein Verfahren, das derzeit untersucht wird (SEQ) und einige dieser Punkte anspricht, erfordert das Binden eines einzelnen Moleküls einer Nucleinsäure an einen festen Träger in einem linearen Pufferfluss und die Behandlung mit einer 3'-->5'-Exonuclease unter kontrollierten Bedingungen. Die einzelnen Nucleotide werden nacheinander von der Nucleinsäure abgespalten und fließen an einem geeigneten Detektor vorbei.
An diesem Punkt könnte ein Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um die Gegenwart der einzelnen Nucleotide nachzuweisen und somit eine Sequenzauflistung der ursprünglichen Nucleinsäure bereitzustellen. In diesem Fall würde das SE(R)RS-Spektrum idealerweise erhalten werden, indem einfallendes Licht im Ultraviolettbereich und eine Oberfläche mit geeigneter SE(R)RS-Aktivität eingesetzt werden. Solch ein Verfahren bringt mehrere Vorteile mit sich. Erstens weisen die vier Nucleotide ähnliche UV-Spektren auf (ein Maximum bei etwa 260 nm), sodass jedes durch eine einzelne Laserlinie mit einem Zentrum bei dieser Frequenz maximal angeregt würde. Außerdem wäre zu erwarten, dass die vier Nucleotide, wie es bei Raman-Spektroskopie üblich ist, leicht unterscheidbare Raman-Spektren aufweisen. Und schließlich sind die UV-Extinktionskoeffizienten der Nucleotide sehr hoch, wodurch sie unter Verwendung von SE(R)RS leicht nachweisbar sind.
Die Möglichkeit, Raman-Renonanz-Spektroskopie im UV-Bereich zur Analyse von biologischen Proben einzusetzen, wird kurz von T.M. Cotton et al. in J. Raman Spectroscopy 22, 729-742 (1991), erwähnt. Wahrscheinlich würde ein Verfahren auf UV-Basis eingesetzt, um eine Nucleinsäure direkt mithilfe ihres SE(R)RS-Spektrums und nicht über eine separate SE(R)RS-aktive Markierung nachzuweisen. Die Ziel-Nucleinsäure(einheit) oder eine geeignete Zielbindungsspezies würde in diesem Fall auch als SE(R)RS-aktive Markierung funktionieren.
Fünfter Aspekt – Set
Gemäß einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Set zur Verwendung bei der Durchführung eines Verfahrens gemäß dem ersten oder vierten Aspekt oder zur Bildung eine Komplexes gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt bereit. Solch ein Set umfasst zumindest eine SE(R)RS-aktive Markierung und vorzugsweise eine SE(R)RS-aktive Oberfläche oder ein Mittel zur Herstellung einer solcher Oberfläche. Die Markierung kann schon an die Oberfläche oder ein zur Herstellung der Oberfläche verwendetes Reagens gebunden oder auf andere Weise damit assoziiert sein. Die Markierung ist an die Zielbindungsspezies gebunden, die eine Nucleinsäure enthält, wobei die Markierung eine chemisorptive funktionelle Gruppe umfasst, die eine Lewis-Base ist. Das Set kann gegebenenfalls einen Oberfläche-Markierung-Bindungsspezies-Komplex gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung enthalten.
Jede vorhandene Zielbindungsspezies wird vorzugsweise gemäß Merkmal (ii) modifiziert. Gemäß Merkmal (i) umfasst das Set vorzugsweise auch ein Polyamin zur Einführung in eine Nachweisprobe, bevor das SE(R)RS-Spektrum erhalten wird.
Mittel zur Herstellung einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche können beispielsweise Reagenzien wie Citronensäure, Silbernitrat, Ascorbinsäure, destilliertes Wasser und Spermin (zur Herstellung eines Silberkolloids) umfassen.
Ein Set gemäß der Erfindung kann außerdem ein Fangmaterial enthalten, mithilfe dessen ein Ziel oder ein eine Markierung enthaltender Komplex auf einem festen Träger immobilisiert werden können. Ein geeignetes Fangmaterial ist beispielsweise eine Oligonucleotidsonde (d.h. eine Zielbindungsspezies), die an einen festen Träger gebunden ist oder spezifisch an diesen gebunden werden kann. Solch ein Träger kann beispielsweise die Oberfläche einer Mikrotiterplatte, ein paramagnetisches Kügelchen oder ein sedimentierfähiges Kügelchen sein.
Das Set kann außerdem Reagenzien und/oder andere Materialien (z.B. Filter, Spritzen, Säulen usw.) zur Herstellung einer rohen zielhältigen Probe für eine SE(R)RS- Analyse enthalten. Es kann Reagenzien, wie z.B. Enzyme, zur Verwendung bei der Manipulation von Ziel-Nucleinsäuren und/oder andere Reagenzien enthalten. Solche Enzyme sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen beispielsweise Taq-Polymerase und andere sehr zuverlässige Nucleinsäure-Polymerasen.
Schließlich kann das Set auch ein Gerät enthalten, das verwendet wird, um ein SE(R)RS-Spektrum zu erhalten, wie z.B. eine Lichtquelle, einen Detektor, einen Datenprozessor usw. Es kann auch einen Wellenleiter enthalten, der mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche beschichtet ist, wobei gegebenenfalls auch eine Zielbindungsspezies an diese Oberfläche gebunden ist.
Sechster Aspekt – neue Verbindungen
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem sechsten Aspekt die folgenden neuen Azobenzotriazole bereit, die als SE(R)RS-aktive Markierungen in anderen Aspekten der Erfindung zweckdienlich sind:

a) 3-Methoxy-4-(5'-azobenzotriazolyl)phenylamin;
b) 3,5-Dimethoxy-4-(5'-azobenzotriazolyl)phenylamin; und
c) 4-(5'-Azobenzotriazolyl)-1-aminonaphthalin.

Empfindlichkeit der Verfahren der Erfindung
Versuche haben gezeigt, dass Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung in der Lage sind, sub-femtomolare (10^–15 M) Mengen von Ziel-Nucleinsäuren, wie z.B. DNA, RNA, cDNA, mRNA und dergleichen, nachzuweisen – eine vorherige Amplifikation des Ziels ist dabei nicht erforderlich. Mithilfe eines Ziel-Moleküls aus 17-18 Basen, die mit einem einzigen Farbstoff-Molekül markiert sind, konnte die Gegenwart von zwischen 1 und 100 Ziel-Molekülen (fast immer weniger als 50) verlässlich in der Festphase nachgewiesen werden; in der Lösungsphase wurden zwischen 1 und 10 Molekülen nachgewiesen (siehe auch Beispiel 5, 7 und 8 weiter unten).
Ein Sequenzierungsverfahren gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung kann im Allgemeinen unter Einsatz geringerer Mengen der erforderlichen Matrizen-Sequenz durchgeführt werden als für herkömmliche Sequenzierungsverfahren notwendig sind - typischerweise reichen weniger als etwa 100 Femtomol einer Matrize aus, möglicherweise sogar attomolare (10^–18 M) oder geringere Mengen.
Die hohe Empfindlichkeit der Verfahren der Erfindung ist auf die Fähigkeit des eine Markierung enthaltenden SE(R)RS-aktiven Komplexes zurückzuführen, nahe an die SE(R)RS-aktive Oberfläche heranzukommen; Abstände zwischen Oberfläche und Markierung im Bereich von 5 Å, was weit unter den für eine SE(R)RS-Wirkung erforderlichen 20 nm liegt, sind unter Einsatz der Verfahren der Erfindung möglich.
Anwendungen der Erfindung
Die Anwendungen der Erfindung gehen aus der obigen Beschreibung hervor und umfassen die Vorhersage und den Nachweis von Krankheiten, forensische Tests, die Sequenzierung von menschlichen und tierischen Genen und die Identifizierung von sicherheitsmarkierten Produkten, wobei die „Markierung" eine Ziel-Nucleinsäure umfasst. Andere Verfahren, welche den Nachweis von genetischen Markern umfassen und für die daher die vorliegende Erfindung nützlich sein könnte, umfassen den Nachweis von positiven Merkmalen in Lebensmitteln und in der Viehzucht und den Nachweis von HLA-Spezifitäten, um Transplantat-Proben auf ihre Eignung zu überprüfen. Natürlich können Aspekte der Erfindung auch dazu eingesetzt werden, hohe sowie niedrige Konzentrationen einer Ziel-Nucleinsäure nachzuweisen.
Nachweisverfahren gemäß der Erfindung können verwendet werden, um einen ganzen Bereich von vorhandenen biochemischen Verfahren zu verbessern. Sequenzierung (wie sie im Zusammenhang mit dem fünften Aspekt der Erfindung beschrieben wurde) ist ein offensichtliches Beispiel. Weitere sind im Folgenden angeführt.

A) Genetische Krankheiten, erworbene oder vererbte, treten auf, wenn die DNA-Sequenz des Genoms eines Organismus sich an bestimmten entscheidenden Punk ten von der Wildtyp-Sequenz unterscheidet. Eine Analyse dieser Variation wird derzeit unter Einsatz von Sequenzierung, SSCP und DGGE durchgeführt, um DNA zu analysieren, die durch PCR oder andere auf Amplifikation basierende Verfahren amplifiziert wurde. Die Verwendung von ARMS (EP-B-0.332.435) ist nützlich zur Erzeugung eines PCR-Produkts auf sequenzabhängige Weise, sodass die Sequenz des amplifizierten Fragments danach nicht mehr analysiert werden muss. Eine direkte Analyse einer genetischen Krankheit durch den Einsatz von ARMS zur Erzeugung von linearen Verlängerungsprodukten aus genomischer DNA, gefolgt vom Nachweis der Verlängerung mithilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung würde die genetische Analyse beschleunigen. Die Vermeidung der PCR-Amplifikation würde außerdem einer Crossing-over-Verunreinigung von PCR-Produkten vorbeugen. Der Einsatz von ARMS zum Nachweis von Sequenzvariationen ist nicht auf Mutationen im Zusammenhang mit Krankheiten begrenzt, sondern könnte auch zum Nachweis von Einzel-Nucleotid-Polymorphismen (SNPs), bei denen es sich um stille Mutationen handelt, die bei der genetischen Unterscheidung von Individuen zweckdienlich sind, angewendet werden.
B) Analyse der variablen Zahl von Tandemwiederholungen (VNTR) ist ein Mittel zur Identifikation von Individuen aufgrund der genetischen Variabilität von Person zu Person. Genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen behandelt, um DNA-Fragmente zu erzeugen, von denen einige Tandemwiederholungssequenzen mit unterschiedlicher Länge enthalten. Diese Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt, und das Gel wird mit einer Base denaturiert. Die DNA wird dann auf eine Membran transferiert, und eine markierte einzelsträngige Oligonucleotidsonde, die komplementär zur Wiederholungssequenz ist, wird an die DNA hybridisiert. Nachdem die Sonde einer Stringenzwaschung unterzogen wurde, wird sie über ihre Markierung nachgewiesen. Sonden, die mit dem Enzym alkalische Phosphatase markiert sind, können beispielsweise nachgewiesen werden, indem sie Chemilumineszenz von einem geeigneten phosphorylierten Substrat erzeugen, oder radioaktiv markierte Sonden können durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Sobald die Sonde nachgewiesen wurde, wird sie gestrippt, und die nächste Sonde wird hybridisiert, um eine weitere VNTR nachzuweisen. Üblicherweise werden drei bis fünf Son dennachweise pro Individuum vorgenommen, und jeder Sondennachweis nimmt einen Arbeitstag in Anspruch. Die Sonden werden keinem Multiplexing unterzogen, weil sich enzymgekoppelter Nachweis und Autoradiographie nicht für solch einen Multiplex-Nachweis eignen und Fluoreszenz-Sondennachweise aufgrund der geringen Mengen an Eingabe-DNA und der hohen Eigenfluoreszenz von Hybridisierungsmembranen nicht empfindlich genug sind. Es wäre ein Vorteil bezüglich Arbeitszeitersparnis, wenn alle Sondennachweise gleichzeitig durchgeführt werden können. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung würden den Multiplex-Nachweis mehrerer Sonden mit ihren einzigartigen Raman-Schwingungs-„Fingerabdrücken" erlauben, ohne dass die Eigenfluoreszenzhintergründe ein Problem darstellen würden.
C) Schwierigkeiten beim Multiplexing von Fluoreszenz sind auch im Bereich der zytogenetischen Analyse durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) zu beobachten. Aufgrund der breiten Fluoreszenz der meisten organischen Fluorophore ist es schwierig, mehr als fünf sichtbare Fluorophore auszuwählen, deren Fluoreszenzen nicht überlappen, sodass viele zytogenetische Laboratorien nur zwei oder drei Fluorophore zur Markierung ihrer Chromosomsonden verwenden, was einen Multiplex-Nachweis einschränkt. Eine Lösung besteht in der Verwendung variierender Fluorophorgemische, um unterschiedliche Chromosomregionen zu färben, wonach die einzelnen Farben nacheinander mit einem eigenen Filter nachgewiesen und die resultierenden Abbildungen mithilfe eines Computers zusammengefügt werden, um die unterschiedlich markierten Regionen zu identifizieren. Dieses Verfahren erfordert teure Bildgebungs- und Analysegeräte, und das Verfahren wird von nur relativ wenig Labors eingesetzt. Es wäre von Vorteil, die separaten Spektrallinien von Raman-Spektren zu nutzen, sodass „Fingerabdrücke" unterschiedlicher Chromophore durch Hybridisierung an unterschiedliche SE(R)RS-aktive Sonden erhalten werden können. Ein weiterer Vorteil solch eines Verfahrens ist, dass Raman-Signale sich nicht selbst quenchen, sodass Markierungschromophore dichter auf die Chromosomenoberfläche gepackt werden können als Fluorophore, was mit einer Signalssteigerung einhergeht.
D) Auch eine Minisequenzierung, bei der ein markierter Didesoxy-Kettenterminator auf sequenzabhängige Weise am 3'-Terminus eines Primers inkorporiert wird, kann direkt am Genom durchgeführt werden, wobei die inkorporierte Base mithilfe eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird.
E) Eine Analyse der Gene, die in unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus in Geweben exprimiert werden, anhand des Nachweises von mRNAs ist ein nützliches Mittel zur Aufdeckung einer Genfunktion. Derzeit werden mRNA-Werte durch RT-PCR quantifiziert, bei der es sich um ein schwieriges Verfahren handelt. Eine direkte Quantifizierung von mRNA-Werten mithilfe der vorliegenden Erfindung würde eine rasche und gleichzeitige Überwachung vieler Gene in Geweben ermöglichen, was zu Erkenntnissen bezüglich ihrer Funktion führen würde. Dies könnte erreicht werden, indem eine mit einem SE(R)RS-aktiven Farbstoff markierte Sonde an eine zugängliche Region der mRNA hybridisiert würde, wonach der Hybrid mit einer Polythymidinsequenz auf einer festen Phase eingefangen und die mRNA-Werte durch Messung der Intensität der SE(R)RS-Signale vom Farbstoff quantifiziert werden könnten.
F) Eine weitere Anwendung der Erfindung besteht im Nachweis, welche Regionen von mRNA für eine Hybridisierung an Antisense-Oligonucleotide zugänglich sind. mRNA weist eine bemerkenswerte Sekundärstruktur auf, die durch Computer-Modellierung vorhergesagt werden kann, obwohl dieses Verfahren nicht zufrieden stellend ist. Nur bestimmte Regionen der mRNA neigen auch dazu, sowohl einzelsträngig vorzuliegen als auch für eine Bindung an ein Antisense-Oligonucleotid zugänglich zu sein. Es wäre von großem Wert für Unternehmen, die "Antigen"-Technologien entwickeln, diese Bindungsstellen rasch identifizieren zu können. Ein mögliches Verfahren besteht in der Bindung der mRNA an einen festen Träger auf einem Chip mit 4ⁿ Elementen, worin n für die Länge einer Oligonucleotidsonde steht (es gäbe 4ⁿ mögliche Oligonucleotid-n-mere). Die 4ⁿ unterschiedlichen Sonden würden hergestellt und mit einem SE(R)RS-aktiven Farbstoff markiert, wonach jede einzeln zu einem Punkt auf der mRNA-Anordnung hinzugefügt und dann einer Stringenzwaschung unterzogen würde. Jene markierten Sonden, die an die mRNA hybridisieren, würden dann durch Spektroskopie detektiert, und ein Verglich mit der mRNA-Se quenz würde aufzeigen, welche Regionen des Moleküls für eine Sondenanalyse zur Verfügung stünden. Nach der Herstellung könnte die resultierende Bibliothek von SE(R)RS-aktiven Sonden für jedes beliebige mRNA-Ziel verwendet werden. Alternativ dazu könnten die 4ⁿ Sondenoligomere auf einem Oligonucleotid-Chip ausplattiert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist, und die mRNA könnte hinzugefügt und einer Stringenzwaschung unterzogen werden. Die Bindung der mRNA an spezifische Regionen des Chips könnte nachgewiesen werden, indem eine Polythymidin-Sonde, die mit einem SE(R)RS-aktiven Farbstoff markiert ist, der an den PolyA-Schwanz der mRNA binden würde, hinzugefügt würde, und durch SE(R)RS nachgewiesen werden. Nach Beendigung der Analyse könnte die mRNA durch Behandlung mit einer RNAse oder einer Base entfernt und der Chip wiederverwendet werden.
G) Die Verwendung von Oligonucleotid-Chips in Kombination mit der vorliegenden Erfindung kann auch auf die Analyse von Genotypen ausgeweitet werden, sowohl für SNPs als auch für schädliche Mutationen. Dies kann unter Einsatz von amplifizierten Nucleinsäure oder vorzugsweise direkt auf nichtamplifiziertem Material erfolgen. Eine große Anzahl an Fangsonden für spezifische Regionen des Genoms kann verwendet werden, um den Chip herzustellen, und theoretisch könnte eine beträchtliche Menge an Informationen bezügliche der genetischen Variation eines Individuums in einem Experiment gewonnen werden, wodurch diese Person (durch SNPs) eindeutig identifiziert werden könnte und klinisch nützliche Einblicke in deren gegenwärtigen und zukünftigen Krankheitszustand gewonnen werden könnten.

Kurzbeschreibung der Abbildungen
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen genauer erläutert, worin:
1 und 2 alternative Reaktionsschemata für die Herstellung von Benzotriazol-Monoazofarbstoffen zur Verwendung als Markierungen in einem Verfahren gemäß der Erfindung zeigen (Beispiel 2);
3-6 SERRS-Spektren für modifizierte Azofarbstoffe zur Verwendung als Markierungen in einem Verfahren gemäß der Erfindung zeigen (Beispiel 3);
7 und 8 SERRS-Spektren, die durch ein Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurden, für ein Farbstoff-markiertes modifiziertes Oligonucleotid in einer Lösung zeigen (Beispiel 5);
9-15 SERRS-Spektren sind, die für ein Farbstoff-markiertes nichtmodifiziertes Oligonucleotid auf einer Nylon-Membran erhalten wurden (Beispiel 6);
und
16-22 SERRS-Spektren, die gemäß der Erfindung erhalten wurden, für ein Farbstoff-markiertes modifiziertes Oligonucleotid auf einer Nylon-Membran sind (Beispiel 7).
Detaillierte Beschreibung
Beispiel 1: Herstellung von Benzotriazol-Azofarbstoffen – Allgemeines Verfahren Benzotriazol-Azofarbstoffe, die zur Verwendung als Markierungen in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können gemäß dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt werden.
Schritt 1: Diazotierung
5-Aminobenzotriazol (1,0 g, 7,63 mmol) wird in HCl (5 ml, 50 Vol.-%) gelöst und durch den tropfweisen Zusatz von Natriumnitrit (0,578 g, 1,1 Äqu., in 5 ml H₂O) bei 0 °C diazotiert. Ein Überschuss an Natriumnitrit wird mithilfe von Iodstärkepapier nachgewiesen. Eine dunkelblaue Farbe zeigt die Bildung des Diazoniumsalzes an.
Schritt 2: Kupplungsreaktion
Der gewünschte Kuppler (1 Äqu.), der mit dem Diazoniumsalz gekuppelt werden soll, wird in Natriumacetatpuffer (5 ml, pH 6,0) und entweder Aceton oder Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Die Diazoniumlösung wird zum gepufferten Kuppler zugetropft. Die Lösung wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt.
Beispiel 2: Herstellung von Benzotriazol-Azofarbstoffen – Spezifische Beispiele
A) 4-(5'-Azobenzotriazolyl)phenylamin
Anilin (1 Äqu.) wurde in Natriumacetatpuffer (1,0 M, 5 ml, pH 6,0) und Aceton (5 ml) gelöst. Diazotiertes Aminobenzotriazol wurde bei 0 °C zu dieser Lösung zugetropft, wobei über 1 Stunde lang gerührt wurde. Der hergestellte Feststoff wurde abfiltriert und mit gesättigtem KCl (3 × 50 ml) gewaschen, sodass ein dunkelgelber Rückstand blieb (0,892 g, 3,74 mmol, 84 %), R_f [Dichlormethan/Methanol (A) 9:1] 0,37; δ_H (DSMO-d6) 4,10 (1 H, s, NH) 7,14-8,25 (7 H, m, ar) 12,73 (2 H, br, s, NH₂); λ_max (MeOH) 360 nm.
B) 3-Methoxy-4-(5'-azobenzotriazolyl)phenylamin
Anisidin (1 Äqu.) wurde in Natriumacetatpuffer (1,0 M, 5 ml, pH 6,0) und Aceton (5 ml) gelöst. Diazotiertes Aminobenzotriazol wurde bei 0 °C zu dieser Lösung zugetropft, wobei über 1 Stunde lang gerührt wurde. Der hergestellte Feststoff wurde abfiltriert und mit gesättigtem KCl (3 × 50 ml) gewaschen. Der Rückstand wurde aus Ethanol/Wasser (8:2) umkristallisiert, was rote Kristalle ergab (0,458 g, 1,94 mmol, 73 %), R_f (A) 0,42; δ_H (DMSO-d6) 3,96 (3 H, s, OCH₃) 6,46 (1 H, s, ar) 6,60-6,63 (2 H, d, ar) 6,63-7,68 (2 H, br s, NH₂) 7,66-7,68 (1 H, d, ar) 7,96-8,02 (2 H, dd, ar) 8,18 (1 H, s, ar); λ_max (MeOH) 409 nm.
C) 3, 5-Dimethoxy-4-(5'-azobenzotriazolyl)phenylamin
3,5-Dimethoxyanilin (1 Äqu.) wurde in Natriumacetatpuffer (1,0 M, 5 ml, pH 6,0) und Aceton (5 ml) gelöst. Diazotiertes Aminobenzotriazol wurde bei 0 °C zu dieser Lösung zugetropft, wobei über 1 Stunde lang gerührt wurde. Der hergestellte Feststoff wurde abfiltriert und mit gesättigtem KCl (3 × 50 ml) gewaschen. Der Rückstand wurde aus Methanol umkristallisiert, was orange Kristalle ergab (0,768 g, 2,58 mmol, 67 %), R_f (A) 0,37; δ_H (DMSO-d6) 3,36 (6 H, s, 2 × OCH₃) 3,87 (2 H, s, ar) 6,08 (2 H, s, ar) 7,81 (3 H, m, NH₂ + ar) 11,99 (1 H, s, NH); λ_max (MeOH) 395 nm; FAB-MS m/z 299,1256 [C₁₄H₁₄O₂N₆(M+1) < 0,1 ppm].
D) 4-(5'-Azobenzotriazolyl)-1-aminonaphthalin
1-Aminonaphthalin wurde in Natriumacetatpuffer (1,0 M, 5 ml, pH 6,0) und Aceton (5 ml) gelöst. Diazotiertes Aminobenzotriazol wurde bei 0 °C zu dieser Lösung zugetropft, wobei über 1 Stunde lang gerührt wurde. Der hergestellte Feststoff wurde abfiltriert und mit gesättigtem KCl (3 × 50 ml) gewaschen. Der Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert, was violette Kristalle ergab (0,645 g, 2,24 mmol, 29 %), R_f (A) 0,35; δ_H (DMSO-d6) 3,36 (6 H, s, 2 × OCH₃) 3,87 (2 H, s, ar) 6,08 (2 H, s, ar) 7,81 (3 H, m, NH₂ + ar) 11,99 (1 H, s, NH); λ_max (MeOH) 469 nm.
Weitere Syntheseschemata für Benzotriazol-Monoazofarbstoffe
Zuerst wurde das in 1 dargelegte Schema versucht, um Benzotriazol-Monoazofarbstoffe herzustellen, die als Markierungen in der Erfindung geeignet sind. Die Kupplung der aromatischen Ringe an das Benzotriazol stellte sich jedoch als sehr schwierige Reaktion dar. Die Aktivität der 4-Position war aufgrund der Gegenwart der Amidbindung stark reduziert. Die Reaktion wurde unter Einsatz von drei verschiedenen aromatischen Ringen versucht. Leider waren alle schwer umzusetzen.
Der in 2 dargestellte alternative Weg erwies sich als erfolgreicher bei der Herstellung und Verwendung von Azofarbstoffen.
Beispiel 3: SERRS-Spektren für modifizierte (Benzotriazol-) Azofarbstoffe
3-6 sind SERRS-Spektren, die für die in Beispiel 2 hergestellten modifizierten Azofarbstoffe A-D erhalten wurden.
Es handelt sich hierbei um Farbstoffe, welche die chemi-adsorptive Benzotriazolgruppe enthalten, die meist eine SE(R)RS-aktive Silberkolloid-Oberfläche „auswählt". Solche Farbstoffe sind als Markierungen in der Erfindung geeignet.
Die Bedingungen zum Erhalt der Spektren waren wie folgt. Die SERRS-aktive Oberfläche war ein Citrat-reduziertes Silberkolloid, das wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt wurde, und zwar in Form eines Kolloid/Wasser-Gemischs (1:1, 1 ml). Dazu wurde eine Methanollösung des betreffenden Farbstoffs zugesetzt (10 μl, etwa 10^–5 M), gefolgt von Spermin (20 μl, 8 × 10^–4 M). Spektren wurden mithilfe des ebenfalls in Beispiel 5 beschriebenen Geräts erhalten. λ_max für den Laser betrug 514,5 nm; λ_max-Werte für die Farbstoffe waren ~394 nm (3), 409 nm (4), 444 nm (5) und 468 nm (6).
Beispiel 4: Bindung von Benzotriazol-Monoazofarbstoffen an eine Nucleinsäure Allgemeines Verfahren
Nach der Synthese des Benzotriazol-Monoazofarbstoffs wird das primäre Amin durch die Dimethylformamidgruppe geschützt, was den selektiven Schutz des sekundären Benzotriazolamins durch die Monomethoxytritylgruppe ermöglicht. Nach der Entfernung der Formamidgruppe durch Behandlung mit einer Base wird das freie Amin mit Bernsteinsäureanhydrid gekuppelt, um die Carbonsäure herzustellen. Die Säure wird dann mit einem Methylen-Linker gekuppelt, der ein primäres Amin und einen geschützten Alkohol aufweist. Nach der selektiven Entfernung der Schutzgruppe wird der Alkohol phosphityliert, wodurch ein Monomer hergestellt wird, das in der Lage ist, eine Routine-Festphasensynthese zu durchlaufen.
Alternativ dazu kann die im obigen Schema hergestellte Säure auch in einen geeigneten aktiven Ester (N-Hydroxysuccinimid, Pentafluorphenol) übergeführt und mit einem nucleophilen primären Amin am 5'-Terminus einer Nucleinsäure gekuppelt werden (siehe J. Goodchild, w.o.).
Spezifisches Beispiel
Die oben genannten Benzotriazol-Monoazofarbstoffe können als Ausgangsmaterial für dieses vorgeschlagene Bindungsverfahren dienen.
Schritt 1
Der Farbstoff (1 Äqu.) wird in wasserfreiem Pyridin gelöst und in wasserfreiem Pyridin gemeinsam abgedampft, bevor er in Pyridin gelöst wird, und Dimethylformamidindimethylacetal (3 Äqu.) wird unter Rühren zugesetzt. Nach 2 Stunden Rühren bei 40 °C wird das Lösungsmittel entfernt, und der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst. Nachdem es mit gesättigtem KCl (x3) gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet wurde, wird das Produkt durch Nass-Flash-Säulenchromatographie gereinigt, wobei mit Methanol in Dichlormethan eluiert wird.
Schritt 2
Das Produkt aus Schritt 1 (1 Äqu.) wird mit wasserfreiem Pyridin gemeinsam abgedampft (x3), bevor es in wasserfreiem Pyridin gelöst wurde und Dimethylaminopyridin (0,1 Äqu.) zugesetzt wurde. Monomethoxytritylchlorid (1,2 Äqu.) wird portionsweise über zwei Stunden zugesetzt, und das Gemisch wird vier Stunden gerührt, bevor Methanol zugesetzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wird. Der Rückstand wird in methanolischem Ammoniak gelöst und 16 Stunden lang gerührt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, wird der Rückstand in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem KCl gewaschen (x3) und mit Na₂SO₄ getrocknet. Das Produkt wird durch Nass-Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Silica, voräquilibriert mit 1 % Triethylamin), wobei mit Methanol in Dichlormethan eluiert wird.
Schritt 3
Das Produkt aus Schritt 2 (1 Äqu.) wird aus wasserfreiem Pyridin gemeinsam abgedampft (x3), bevor es in wasserfreiem Pyridin gelöst wurde, und Bernsteinsäureanhydrid (1,2 Äqu.) wurde langsam zugesetzt. Nach 2 Stunden Rühren wird Methanol zugesetzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem KCl gewaschen (x3) und mit Na₂SO₄ getrocknet. Das Produkt wird entweder durch Nass-Flash-Säulenchromatographie (Silica, voräqui libriert mit 1 % Triethylamin), wobei mit Methanol in Dichlormethan eluiert wird, oder Umkristallisierung aus einem geeigneten Lösungsmittel gereinigt.
Schritt 4
Aminohexanol (1 Äqu.) wird in wasserfreiem Pyridin gelöst, und Dimethylaminopyridin (0,1 Äqu.) wird unter Rühren zugesetzt. tert-Butyldiphenylsilylchlorid (1,2 Äqu.) wird langsam zugesetzt, und das Gemisch wird 16 Stunden lang gerührt, wonach Methanol zugesetzt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wird. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem KCl (x3) gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet. Das Produkt wird durch Nass-Flash-Säulenchromatographie (Silica, voräquilibriert mit 1 % Triethylamin) gereinigt, wobei mit Methanol in Dichiormethan eluiert wird.
Schritt 5
Die in Schritt 3 erzeugte Verbindung (1 Äqu.) wird in wasserfreiem Dichlormethan gelöst, und Triethylamin (3 Äqu.) wird zugesetzt. Die Verbindung aus Schritt 4 (1 Äqu.) wird ebenfalls mit TOPPipU (2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl)-1,1,3,3-bispentamethylenuroniumtetrafluorborat) (1,1 Äqu.) zugesetzt, und das Gemisch wird 18 Stunden lang gerührt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, wird der Rückstand mit Tetrabutylammoniumfluorid (3 Äqu.) in wasserfreiem Tetrahydrofuran weitere 6 Stunden lang behandelt. Methanol und Dower-Harz (Py) (10 Äqu.) werden zugesetzt, und nach 1 Stunde Rühren wird das Gemisch filtriert. Nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, wird der Rückstand in Ethylacetat gelöst, mit gesättigtem KCl (x3) gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet. Das Produkt wird durch Nass-Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Silica, voräquilibriert mit 1 % Triethylamin), wobei mit Methanol in Dichlormethan eluiert wurde.
Schritt 6
Das Produkt aus Schritt 5 (1 Äqu.) wird dreimal gemeinsam mit wasserfreiem Tetrahydrofuran abgedampft, bevor es in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst wird. Wasserfreies Diisopropylethylamin (4 Äqu.) wird unter Rühren unter Argon zugesetzt. 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (1,1 Äqu.) wird zugetropft, und das Gemisch wird 2 Stunden lang gerührt. Ethylacetat wird zugesetzt, die organische Phase wird mit gesättigtem KCl gewaschen und mit Na₂SO₄ getrocknet, und das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, was ein Öl ergab, das durch Nass-Flash-Säulenchromatographie gereinigt wurde (Silica, voräquilibriert mit 1 % Triethylamin), wobei mit 100 % Ethylacetat eluiert wurde.
Schritt 3A
Das Produkt aus Schritt 3 (1 Äqu.) wird in wasserfreiem Dichlormethan gelöst, und Triethylamin (3 Äqu.) wird zugesetzt. Pentafluorphenol (1 Äqu.) und TOPPipU (1,1 Äqu.) werden ebenfalls zugesetzt, und das Gemisch wird 18 Stunden lang gerührt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt wurde, wird das Produkt durch Nass-Flash-Säulenchromatographie gereinigt (Silica, voräquilibriert mit 1 % Triethylamin), wobei mit 100 % Ethylacetat eluiert wurde.
Die Verbindungen aus Schritt 6 und 3A können dann mithilfe der oben genannten Verfahren an eine Nucleinsäure gekuppelt werden.
Beispiel 5: Nachweis eines Farbstoff-markierten modifizierten Oligonucleotids in eqiner Lösung
Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren gemäß der Erfindung, bei dem gemäß Merkmal (i) Spermin eingesetzt wird, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, und bei dem ein Ziel-Oligonucleotid gemäß Merkmal (ii) modifiziert wird.
Die Nachweisbarkeit des eingesetzten SE(R)RS-aktiven Farbstoffs, wenn er an das modifizierte Oligonucleotid gebunden ist, erwies sich als deutlich besser als wenn der Farbstoff an die gleiche Oligonucleotidsequenz gebunden ist, wo jedoch die 5-(3-Aminoprop-1-in-1-yl)-2'-desoxyuridinreste durch unmodifizierte Thymidinbasen ersetzt sind. Dies zeigt, dass die modifizierenden Aminogruppen die Wechselwirkung zwischen der markierten DNA und der SE(R)RS-aktiven Kolloidoberfläche stabilisieren, wodurch der Farbstoff leichter an die Oberfläche herankommt und auf dieser verweilen kann, was wiederum seinen Nachweis erleichtert.
Verfahren
Silbernitrat (99,9999 %; Johnson Matthey), Trinatriumcitrat und Sperminhydrochlorid (Sigma) wiesen alle Analysereinheit auf. Ein 17-Basen-DNA-Oligonucleotid, das sechs 5-(3-Aminoprop-1-in-1-yl)-2-desoxyuridinreste anstelle von 2'-Desoxythymidin umfasste, wurde von OSWEL DNA Unit, University of Southampton, erworben. Der 5'-Terminus war mit einem substituierten Fluorescein-Farbstoff, 2,5,1',3',7',9'-Hexachlor-5-carboxyfluorescein, das als „HEX" (Marke von P.E. Applied Biosystems) im Handel erhältlich ist, markiert – die Anbindung des Farbstoffs erfolgte durch herkömmliche Phosphoramidit-Chemie (M.H. Caruthers, Science 230, 281-285 (1985)).
Citrat-reduzierte Silberkolloide wurden gemäß dem Verfahren von P.C. Lee & D. Meisel, w.o., hergestellt, das wie folgt modifiziert war. Alle Glasgeräte wurden vor der Verwendung sorgfältig durch eine Behandlung mit Königswasser (HCl, NHO₃ (3+1 Vol.-%)), gefolgt von vorsichtigem Scheuern in einer Seifenlösung und gründlichem Spülen mit destilliertem Wasser gereinigt. Eine Silbernitratprobe (90 mg) wurde in destilliertem Wasser (500 ml, 45 °C) suspendiert und rasch unter Rühren zum Sieden erhitzt. Sobald das Sieden begann, wurde rasch eine wässrige Natriumcitratlösung (1,0 %, 10 ml) zugesetzt und die Temperatur verringert, aber die Lösung wurde 90 Minuten lang unter kontinuierlichem Rühren vorsichtig sieden gelassen, wonach das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 500 ml eingestellt wurde. Für die SERRS-Untersuchungen wurde ein Lösung dieses Kolloids in destilliertem Wasser (50 Vol.-%) hergestellt.
In destilliertem Wasser wurde eine Lösung hergestellt, die das markierte Oligomer enthielt (1 × 10^–8 M). Eine wässrige Sperminhydrochlorid-Lösung (8 × 10^–4 M, 20 μl) wurde mit dem Oligomer (20 μl) vorgemischt, und das Gemisch wurde zu einer Allquote der Silberkolloidlösung (1 ml) zugesetzt. Eine Aliquote dieser Kolloidsuspension (400 μl) wurde für die SERRS-Untersuchung auf eine Mikrotiterplatte übertragen.
Ein SERRS-Spektrum wurde unter Einsatz eines 25-mW-Argonionenlasers (514,5 nm, 1 mW) als Anregungsquelle aufgezeichnet, und zwar mithilfe eines Renishaw-2000-Spektrometers (Renishaw Ltd., Gloucestershire) und eines Mikroskops. Bei diesem Aufbau wird eine gekühlte CCD-Vorrichtung (ladungsgekoppelter Bauteil) als Detektor eingesetzt. Zehn Speicherungen über jeweils 10 Sekunden werden aufgezeichnet und kombiniert, um das endgültige SERRS-Spektrum zu erhalten. Kontrollspektren wurden erhalten, indem eine Suspension der oben genannten Komponenten, in der keine DNA vorhanden war, untersucht wurde.
Ergebnisse und Diskussion
Der kovalent gebundene Farbstoff weist ein Maximum im Absorptionsspektrum bei 540 nm auf und ein Maximum im Emissionsspektrum bei etwa 565 nm.
Die Surface-Enhanced-Raman-Resonanz-Streuung vom markierten Oligomer wurde mit einer Anregung bei 514,5 nm untersucht. Eine Anregung bei dieser Wellenlänge fällt in etwa mit dem Maximum im Absorptionsspektrum zusammen, und es gibt eine deutliche Resonanzsteigerung aufgrund des Übergangs, der zu dieser Absorptionsbande führt.
Die untersuchte Aliquote enthielt ein Farbstoff-markiertes Oligonucleotid in einer Konzentration von etwa 2 × 10^–10 M, und starke SERRS-Signale im Bereich von 1.000.000 Impulsen s^–1 wurden vom Farbstoff beobachtet. Das Spektrum ist in 7 zu sehen.
Starke SERRS-Signale könnten auch von einer 5-μl-Aliquote der kolloidalen Suspension erhalten werden, die zu 495 μl destilliertem Wasser zugesetzt wird – dies entspricht etwa 1 × 10^–11 M. 8 zeigt das erhaltene Spektrum.
(Vergleichs-) Beispiel 6: Nachweis eines Farbstoff-markierten Oligonucleotids auf einer Nylon-Membran
Dieser Versuch zeigt den Nachweis eines unmodifizierten Oligonucleotids in der Festphase. Keines der Merkmale (i) – (iii) der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Die Ergebnisse können mit jenen aus Beispiel 7 verglichen werden, bei dem die beiden Merkmale (i) und (ii) genutzt wurden.
Verfahren
Citrat-reduzierte Silberkolloide wurden wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt. Ein HEX-markierter Primer, der die vier herkömmlichen 2'-Desoxynucleoside enthielt, wurde von der OSWEL DNA Unit, University of Southampton, erworben. Zur SERRS-Bestimmung wurde eine das HEX-markierte Oligonucleotid enthaltende Lösung (1 × 10^–8 M) in destilliertem Wasser hergestellt. Verdünnungen dieser Lösung wurden in destilliertem Wasser vorgenommen, um Lösungen zu erhalten, die das Farbstoff-markierte Oligonucleotid in Konzentrationen im Bereich von 1 × 10^–9 M bis 1 × 10 enthielten.
Die verschiedenen Konzentrationen (1 × 10^–8 M bis 1 × 10^–18 M) des Farbstoffmarkierten Oligonucleotids wurden in Volumina von 2 × 1 μl auf Hybond-N (Amersham) geblottet. Das Oligonucleotid wurde durch eine 45-sekündige Bestrahlung bei 366 nm kovalent an die Nylon-Membran gebunden.
Um ein SERRS zu erhalten, wurde Poly(L-Lysin) (0,01 %, 2 × 5 μl) zur Membran zugesetzt und das Ganze zwei Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde Citratreduziertes Silberkolloid (2 × 5 μl) zur Membran zugesetzt, und der das Oligomer enthaltende Bereich wurde untersucht. SERRS wurde mithilfe des in vorangegangenen Beispielen beschriebenen Renishaw-Systems aufgezeichnet. Die Erfassungsdauer betrug in jedem Fall 5 Sekunden.
Kontrollspektren wurden erhalten, indem ein Bereich der Nylon-Membran untersucht wurde, der keine DNA enthielt, und zwar auf die oben beschriebene Weise.
Ergebnisse und Diskussion
Wie bei Verfahren nach dem Stand der Technik wurde die Membran vor dem Silberkolloid mit Poly(L-lysin) behandelt, und nicht mit einem Polyamin des in der vorliegenden Erfindung bevorzugten Typs.
Die Kolloid-beschichtete Membran, die auf einem xyz-Tisch befestigt und mithilfe der x- und y-Regelung im Laserstrahl positioniert war, wurde gescannt, bis die SERRS- Signale tatsächlich von der HEX-Markierung stammten. Kontrollspektren der Hybond-Membran wurden nach jedem positiven Ergebnis gewonnen.
Die erhaltenen Spektren sind in den 9-15 dargestellt. Die Oligonucleotid-Konzentrationen betrugen 1 × 10^–8 M (9); 1 × 10^–10 M (10); 1 × 10^–11 M (11); 1 × 10^–12 M (12); 1 × 10^–13 M (13); 1 × 10^–15 M (14) und 1 × 10^–16 M (15).
Obwohl bis zu so geringen Beladungskonzentrationen wie 1 × 10^–16 M positive Ergebnisse erhalten wurden, scheinen sich die Positionen der Peaks und ihre relativen Intensitäten zu unterscheiden. Dies wird darauf zurückgeführt, dass die HEX-Markierung während der Adsorption an die Oberfläche des Silberkolloids unterschiedliche Konformationen annimmt. Da deutlich unter der Konzentration für eine Monoschichtbedeckung gearbeitet wird, ist dieses Ergebnis nicht unerwartet.
Die Zahl 1 × 10^–16 M entspricht etwa 60 Molekülen eines markierten Oligonucleotids, da in jedem Fall nur die Hälfte der Oligonucleotid-gesättigten Membran untersucht wurde.
Beispiel 7: Nachweis eines Farbstoff-markierten modifizierten Oliqonucleotids auf einer Nylon-Membran
In diesem Versuch wurde das Ziel-Oligonucleotid modifiziert, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Spermin wurde ebenfalls eingesetzt, um die Empfindlichkeit noch weiter zu erhöhen. Geringere Konzentrationen des Ziels als in Beispiel 6 möglich war wurden verlässlich nachgewiesen.
Verfahren
Citrat-reduzierte Silberkolloide wurden wie schon beschrieben hergestellt. Ein 17-Basen-DNA-Oligonucleotid, das 5-(3-Aminoprop-1-in-1-yl)-2-desoxyuridinreste anstelle von 2'-Desoxythymidin umfasste, wurde von OSWEL DNA Unit, University of Southampton, erworben, und der 5'-Terminus wurde mit HEX markiert. Zur SERRS- Bestimmung wurde eine das HEX-markierte Oligonucleotid enthaltende Lösung (1 × 10^–8 M) in destilliertem Wasser hergestellt. Verdünnungen dieser Lösung wurden in destilliertem Wasser vorgenommen, um Lösungen zu erhalten, die das Farbstoffmarkierte Oligonucleotid in Konzentrationen im Bereich von 1 × 10^–9 M bis 1 × 10^–18 M enthielten.
Die verschiedenen Konzentrationen (1 × 10^–8 M bis 1 × 10^–18 M) des Farbstoffmarkierten Oligonucleotids wurden in Volumina von 2 × 1 μl auf Hybond-N (Amersham) geblottet. Das Oligonucleotid wurde durch eine 45-sekündige Bestrahlung bei 366 nm kovalent an die Nylon-Membran gebunden.
Um ein SERRS zu erhalten, wurde Sperminhydrochlorid (8 × 10^–4 M, 2 × 5 μl) zur Membran zugesetzt. Dann wurde direkt Citrat-reduziertes Silberkolloid (2 × 5 μl) zur Membran zugesetzt, und der das Oligomer enthaltende Bereich wurde untersucht. SERRS wurde mithilfe des in vorangegangenen Beispielen beschriebenen Renishaw-Systems aufgezeichnet. Die Erfassungsdauer betrug in jedem Fall 5 Sekunden.
Kontrollspektren wurden erhalten, indem ein Bereich der Nylon-Membran untersucht wurde, der keine DNA enthielt, und zwar auf die oben beschriebene Weise.
Ergebnisse und Diskussion
Die Membran wurde vor dem Silberkolloid mit Sperminhydrochiorid behandelt, um die Anhaftung des Farbstoff-markierten Oligonucleotids an die Kolloidoberfläche und die Bildung von stabilen kolloidalen Aggregaten, die für ein starkes SERRS-Signal erforderlich ist, zu fördern.
Die Kolloid-beschichtete Membran, die auf einem xyz-Tisch befestigt und mithilfe der x- und y-Regelung im Laserstrahl positioniert war, wurde gescannt, bis die Streustrahlung ein vernünftiges SERRS-Signal anzeigten. Um zu bestätigen, dass die SERRS-Signale tatsächlich von der HEX-Markierung stammten, wurden Kontrollspektren der Hybond-Membran nach jedem positiven Ergebnis gewonnen.
Die erhaltenen Spektren sind in den 16-22 dargestellt. Die Oligonucleotid-Konzentrationen betrugen 1 × 10^–7 M (16); 1 × 10^–8 M (17); 1 × 10^–9 M (18); 1 × 10^–13 M (19); 1 × 10^–14 M (20); 1 × 10^–15 M (21) und 1 × 10^–17 M (22).
Bis zu so geringen Konzentrationen wie 1 × 10^–17 M wurden positive Ergebnisse erhalten, was etwa 6 Molekülen von Farbstoff-markiertem Oligonucleotid entspricht (nur die Hälfte des Bereichs mit dem Oligonucleotid wurde in jedem Fall untersucht). Die Spektrumqualität ist ebenfalls deutlich besser als in Beispiel 6. Die für die mit einer Konzentration von 1 × 10^–8 M beladene Membran erhaltenen Spektren waren identisch mit denen aus Beispiel 6, aber nach dieser Konzentration veränderten sich die Spektren. Die relative Intensität und die Peak-Positionen bleiben für jedes Spektrum von 1 × 10^–9 M bis 1 × 10^–17 M gleich, was auf einen konsistenten Nachweis der HEX-Markierung hinweist.
Dieses Verfahren bietet verbesserte Spektrumqualität bis zu einer niedrigeren Nachweisgrenze als in Beispiel 6, wodurch eine genaue und verlässliche Analyse von sehr kleinen Nucleinsäuremengen erleichtert wird.
Beispiel 8: Nachweisempfindlichkeit für modifizierte Oliqonucleotide
Ausgehend von Beispiel 5 und 7 wurden die folgenden Berechnungen der tatsächlichen Anzahl an Ziel-Molekülen durchgeführt, die mithilfe der Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden können.
Lösungsphase (Beispiel 5)
Die Aliquote eines markierten Oligomers, das untersucht wurde, enthielt etwa 200 × 10-15 mol des Farbstoff-(HEX-) markierten modifizierten Oligomers. Starke SERRS-Signale im Bereich von 1.000.000 Impulsen s^–1 wurden vom Farbstoff beobachtet. Starke Signale könnten auch von einer 5-μl-Aliquotr der kolloidalen Suspension erhalten werden, die zu 495 μl destilliertem Wasser zugesetzt wird – diese Lösung entspricht etwa 1 × 10^–15 mol des Oligomers.
Eine Umsetzung dieser Molzahlen in Molekülzahlen ergibt die folgenden Zahlen:
200 × 10^–15 mol entspricht 1,2 × 10¹¹ Molekülen,
10 × 10^–15 mol entspricht 6 × 10⁹ Molekülen.
Wenn das Volumen der Lösung, das tatsächlich zu einem bestimmten Zeitpunkt durch den Laserstrahl untersucht wird (3,93 × 10^–16 m³, 393 Femtoliter), in Betracht gezogen wird, können die folgenden hypothetischen Zahlen berechnet werden:
200 × 10^–15 mol entspricht durchschnittlich 94,5 nachgewiesenen Molekülen,
10 × 10^–15 mol entspricht durchschnittlich 4,7 nachgewiesenen Molekülen.
Festphase (Beispiel 7)
Das in der Festphase erhaltene Spektrum, wobei eine Konzentration von 1 × 10^–8 M eingesetzt wurde, war identisch mit dem in der Lösungsphase für die gleiche Konzentration erhaltene. Nach dieser Konzentration änderte sich das Spektrum und wies mehr Peaks auf. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass der Farbstoff gezwungen wird, eine bestimmte Konformation bezüglich der Oberfläche des aggregierten Kolloids anzunehmen. Der Hauptunterschied zwischen dieser Untersuchung und der mit Poly(L-lysin) durchgeführten war, dass die nachfolgenden Spektren bis zu einer so niedrigen Konzentration wie 1 × 10^–17 M fast identische Peak-Positionen und relative Intensitäten aufwiesen. Diese Konzentration entspricht etwa sechs Molekülen im untersuchten Bereich.
Das in Beispiel 7 eingesetzte Spermin scheint die Größe des aggregierten Kolloids stärker zu kontrollieren als Poly(L-lysin) (in Beispiel 6 verwendet). Es wird vermutet, dass es zu einer besseren Reproduzierbarkeit der Spektren führt, wenn Spermin eingesetzt wird.
Beispiel 9: Beispiele für Testformate und Sequenzierunqsverfahren
Die folgenden Beispielformate zeigen, wie die Verfahren der Erfindung in Tests und Sequenzierungsverfahren eingesetzt werden können und in vielen Fällen die vorhandenen Verfahren verbessern. In jedem Fall können, obwohl DNA und RNA als Ziel-Nucleinsäure genannt werden, auch andere Nucleinsäuretypen auf die gleiche oder eine analoge Weise behandelt werden.
Southern-Blotting

1. Herstellung von DNA, Restriktionsverdau, Elektrophorese und Blot mittels üblicher Verfahren.
2. Hybridisierung mit einer Farbstoff-markierten Oligonucleotid-Sonde (oder mehreren Sonden); die Ladung der Sonden kann mit Aminopropargyl oder anderen Mitteln modifiziert werden.
3. Waschung bei der optimierten Stringenz, wie vorher bestimmt (Waschung mit Phosphat zur Minimierung der Chlorid-Eintragung).
4. Tränken mit Spermin.
5. Tränken mit reduziertem Silberkolloid.
6. Spektren-Gewinnung über gesamten Filter.
7. Software-Einsatz zur Analyse der Daten und Decodierung der gemischten Spektren von verschiedenen Farbstoffen.

Nachweis einer Infektionskrankheit

1. Zelllyse mit bevorzugtem Verfahren – wenn das Ziel DNA ist, Durchführung eines Denaturierungsschritts.
2. Hybridisierung einer oder mehrerer mit einem SE(R)RS-aktiven Farbstoff markierten Sonden an ein beliebiges Ziel (RNA oder DNA).
3. Einfangen des hybridisierten Materials durch ein aus verschiedenen ausgewähltes Verfahren, z.B. Biotin-Einfangen eines Oligomers am gleichen Strang wie das Sondenziel.
4. Entfernen überschüssiger Sonde und überschüssigen Ziels durch Waschen.
5. Zusatz von Spermin, dann Kolloid.
6. Spektren-Gewinnung.
7. Spezies oder Genera können durch die Auswahl von Sonden und die Decodierung der Spektren von verschiedenen Farbstoffen am Ende unterschieden werden.

(Anstelle der Sondenhybridisierung, gefolgt vom Einfangen, ist auch ein Format, das auf Verlängerung, Freisetzung und Einfangen basiert, wie bei genomischer Variation möglich.)

Genomische Variation

1. Herstellung eines denaturierten genomischen Ziels (Sieden in einer Base ist gut).
2. Hybridisierung eines Farbstoff-markierten Primers mit Paarung oder Fehlpaarung am 3'-Ende.
3. Verlängerung (oder nicht, je nach 3'-Paarungsstatus).
4. Freisetzung neu verlängerten Materials durch Hitze oder basische Denaturierung oder Strangverdrängung.
5. Einfangen eines freigesetzten Strangs mithilfe eines immobilisierten oder immobilisierbaren Oligomers.
6. Waschen zum Entfernen von überschüssigem, nichtinkorporiertem Primer (ist nicht erforderlich, wenn der Nachweis einer abklingenden Welle an der Einfangoberfläche erfolgt).
7. Entwicklung eines SE(R)RS-Effekts mit Spermin und einem Kolloid.
8. Spektren-Gewinnung wie üblich.

Sequenzierung
Format A

1. Herstellung einer Matrize (oder eines Genoms).
2. Hybridisierung eines Sequenzierungsprimers (4 parallele Röhren, jede mit einem anderen Farbstoff, der an den Primer gebunden ist).
3. Durchführung von Kettenterminationsreaktionen mit einer Polymerase, dNTPs und ddNTPs (ein anderes ddNTP für jedes Röhrchen).
4. Poolen aller vier Reaktionen und Auflösen auf einem Gel.
5. Transfer auf eine Membran – Blotten oder Flution auf sich bewegender Membran.
6. Tränken mit Spermin und einem Kolloid.
7. Gewinnen von SE(R)RS-Spektren und Sequenz-Reassemblierung.

Format B

1. Herstellung einer Matrize (oder eines Genoms).
2. Annealing eines nichtmarkierten Primers.
3. Durchführung von Kettenterminationsreaktionen mit Polymerase, dNTP und Farbstoff-markierten ddNTPs.
4. Auflösung der Produkte auf Sequenzierungsgel; Transfer und Entwicklung wie oben.

Format C

1. Durchführung von Kettenterminationsreaktionen ohne Markierung auf dem Primer oder den ddNTPs (ein Röhrchen pro Terminatorbase).
2. Auslösung der Produkte auf Polyacrylamidgel (4 Wells pro Matrize); Transfer auf Membran durch obige Verfahren.
3. Einsatz eines Farbstoff-markierten Oligomers, das komplementär zu einem internen Abschnitt des verlängerten Produkts ist, vorzugsweise sehr nahe beim Primer selbst, um die Membran zu sondieren.
4. Nach Hybridisierung und Waschung Entwicklung des SE(R)RS-Signals mit Sperrain, einem Kolloid und Spektroskopie.

Neben den oben genannten Verfahren, bei denen die Sequenzierungsprodukte auf Membranen transferiert werden, ist es auch möglich, SE(R)RS-Farbstoff-markierte Materialien direkt im Gel nachzuweisen, wenn die eine oder andere Gelplatte aus einer aufgerauten SE(R)RS-aktiven Oberfläche besteht. In diesem Zusammenhang gibt es jedoch einige ungelöste Probleme; die Oberfläche ist gegebenenfalls nicht ganz für einen Nachweis mit optimaler Empfindlichkeit geeignet; es wird kein Spermin zur Neutralisierung der Gesamtladung auf der Nucleinsäure eingesetzt; und nur ein kleiner Teil der markierten Ziel-Moleküle kann an die Silberoberfläche angrenzen.
Eine Variation von Format A nutzt Multiplexing, um den Durchsatz zu erhöhen. Verschiedene Farbstoff-markierte Primer würden hier zur Sequenzierung verschiedener genomischer Regionen eingesetzt. Bei Schritt 2 könnte deshalb jedes Röhrchen 2 oder mehr (bis zu 5 oder 10) unterschiedlich markierte Primer enthalten, die für eine Sequenzierung unterschiedlicher Regionen ausgerichtet sind. Nach der Durchführung vier separater Reaktionen, jede mit bis zu 10 verschiedenen Farbstoffen (insgesamt 40 Farbstoffe), würde der Inhalt der 4 Röhrchen gepoolt, aufgelöst und wie oben decodiert. Aufgrund der enormen Flexibilität von SE(R)RS-Spektroskopie und großen Auswahl an verfügbaren Farbstoffen mit unterscheidbaren Spektren sollten 40 geeignete Chromophore zu erhalten sein, und die Decodierung der resultierenden Signale sollte ebenfalls durchführbar sein, auch wenn sie sich komplex gestaltet.
Durch die Nutzung dieses Multiplexing kann der Durchsatz eines Seuqenzierungsprojekts deutlich erhöht werden. Es gibt keinen Grund, die Ziele der Sequenzierungsreaktionen auf eine bestimmte Region einzuschränken; sie können weit verstreut sein, solange es eine Möglichkeit gibt, passende Matrizen herzustellen.

Claims

Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Ziel-Nucleinsäure in einer Probe, wobei das Verfahren (in beliebiger geeigneter Reihenfolge) folgende Schritte umfasst: a) das Bilden eines primären Komplexes zwischen einer aktiven Markierung von Surface-Enhanced-(Resonanz-)Raman-Spektroskopie (SE(R)RS) und einem beliebigen in der Probe vorhandenen Ziel, gegebenenfalls über eine Zielbindungsspezies, bei der es sich um eine(n) Nucleinsäure-Sonde oder -Primer handelt, die/der in der Lage ist, an zumindest einen Teil des Ziels selektiv zu hybridisieren; b) das Herstellen einer Nachweisprobe, in welcher der primäre Komplex, oder ein sekundärer Komplex, der die Markierung und die Zielbindungsspezies enthält und direkt vom primären Komplex herrührt, mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche assoziiert ist; und c) den Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit des primären oder sekundären Komplexes in der Nachweisprobe (und somit des Ziels in der; ursprünglichen Probe) durch Erhalt und Analyse eines SE(R)RS-Spektrums für die Nachweisprobe; worin eines oder mehrere der folgenden Merkmale verwendet werden: i) die Einführung eines monomeren oder eines polymeren Polyamins in die Nachweisprobe vor dem Nachweis; (ii) die Modifikation des Ziels und/oder der in der Zielbindungsspezies enthaltenen Nucleinsäure vor dem Nachweis auf eine Art und Weise, die dessen/deren Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche fördert oder erleichtert; (iii) den Einschluss einer chemisorptiv-funktionellen Gruppe, die eine Lewis-Base ist, in die SE(R)RS-aktive Markierung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration des im primären Komplex vorhandenen Ziels oder der in der Zielbindungsspezies im sekundären Komplex enthaltenen Nucleinsäure nicht höher ist als 10^–10 Mol pro Liter ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin zumindest Merkmal (i) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Merkmale (i) und (ii) zusammen verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die SE(R)RS-aktive Markierung ein Rhodaminfarbstoff oder ein Azofarbstoff ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, in dem das Ziel natürlich vorkommende DNA oder RNA ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die SE(R)RS-aktive Oberfläche eine Aggregation von Silberkolloidpartikeln umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Merkmal (i) verwendet wird und das Polyamin ein kurzkettiges aliphatisches Polyamin ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Polyamin Spermin ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Merkmal (ii) verwendet wird und die Modifikation des Ziels oder der Zielbindungsspezies dessen/deren Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zumindest teilweise durch eine Verringerung der negativen Gesamtladung der Nucleinsäure erleichtert.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Merkmal (ii) verwendet wird und die Modifikation des Ziels oder der Zielbindungsspezies durch Einschluss einer oder mehrerer funktionellen Gruppen, die eine Lewis-Base umfassen, in die Nucleinsäure erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, worin eine oder mehrere Aminogruppen in die Nucleinsäure miteinbezogen werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Merkmal (ii) verwendet wird und die Modifikation des Ziels oder der Zielbindungsspezies durch Umwandeln desselben/derselben in ein neutrales Analogon erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das neutrale Analogon eine oder mehrere Phosphoramid-Internucleotidbindungen aufweist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Merkmal (iii) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die funktionelle Gruppe eine Triazolgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die funktionelle Gruppe eine Benzotriazolgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Markierung ein Azobenzotriazol ist.
Surface-Enhanced-(Resonanz)-Raman-Spektroskopie-(SE(R)RS)-aktiver Komplex, der Folgendes umfasst: – eine Zielnucleinsäure, gebunden an – eine SE(R)RS-aktive Markierung, gegebenenfalls über eine Zielbindungsspezies, die eine/ein Nucleinsäure-Sonde oder -Primer ist, die/der in der Lage ist, an zumindest einen Teil des Ziels selektiv zu hybridisieren, wobei die Markierung mit Folgendem assoziiert ist: – einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche, worin der Komplex eines oder mehrere der folgenden Merkmale (i) bis (iii) umfasst: (i) ein monomeres oder polymeres Polyamin; (ii) Nucleinsäure im Ziel und gegebenenfalls in der Zielbindungsspezies, die eine oder mehrere, eine Lewis-Base umfassende funktionelle Gruppen enthält, oder eine neutrale Nucleinsäure ist, um in jedem Fall dessen/deren Chemisorption an die SE(R)RS-aktive Oberfläche zu fördern oder zu erleichtern; (iii) eine chemisorptiv-funktionelle Gruppe, die eine Lewis-Base ist, in der SE(R)RS-aktiven Markierung.
Surface-Enhanced-(Resonanz)-Raman-Spektroskopie-(SE(R)RS)-aktiver Komplex, der eine Bindungsspezies umfasst, die Nucleinsäure enthält und an eine SE(R)RS-aktive Markierung gebunden ist, wobei die Markierung mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche assoziiert ist und wobei der Komplex ein monomeres oder ein polymeres Polyamin enthält.
Surface-Enhanced-(Resonanz)-Raman-Spektroskopie-(SE(R)RS)-aktiver Komplex, der eine Bindungsspezies umfasst, die eine Nucleinsäure enthält und an eine SE(R)RS-aktive Markierung gebunden ist, wobei die Markierung mit einer SE(R)RS-aktiven Oberfläche assoziiert ist und wobei der Komplex in der SE(R)RS-aktiven Markierung eine chemisorptiv-funktionelle Gruppe enthält, die eine Lewis-Base ist.
Komplex nach Anspruch 19 oder Anspruch 21, worin die SE(R)RS-aktive Markierung ein Rhodaminfarbstoff oder ein Azofarbstoff ist.
Komplex nach Anspruch 22, worin die Markierung ein Azobenzotriazol ist.
Verfahren zur Sequenzierung von Nucleinsäure, das die Anwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 umfasst, um zumindest ein Ziel-Nucleotid oder eine Nucleotidsequenz in der Säure zu detektieren.
Set zur Verwendung bei der Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 24 zur Bildung eines Surface-Enhanced-(Resonanz)-Raman-Spektroskopie-(SE(R)RS)-aktiven Komplexes nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei das Set zumindest eine SE(R)RS-aktive Markierung umfasst, die an eine Bindungsspezies gebunden ist, die Nucleinsäure enthält, wobei die Markierung eine chemisorptiv-funktionelle Gruppe enthält, die eine Lewis-Base ist.
Set nach Anspruch 25, das zusätzlich eine SE(R)RS-aktive Oberfläche oder Mittel zur Herstellung einer solchen Oberfläche umfasst.
Set nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, worin die SE(R)RS-aktive Markierung ein Azofarbstoff ist.
Set nach Anspruch 27, worin die Markierung ein Azobenzotriazol ist.
Set nach einem der Ansprüche 25 bis 28, das zusätzlich ein monomeres oder polymeres Polyamin umfasst.
Azobenzotriazol, ausgewählt aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe: a) 3-Methoxy-4-(5N-azobenzotriazolyl)phenylamin; b) 3,5-Dimethoxy-4-(5N-azobenzotriazolyl)phenylamin; und c) 4-(5N-Azobenzotriazolyl)-1-aminonaphthalin.