DE60036307T2

DE60036307T2 - Fluoreszenzintensitätstest für duplex- und triplex-nukleinsäurehybridisierung in lösung unter verwendung von fluoreszenzinterkalatoren

Info

Publication number: DE60036307T2
Application number: DE60036307T
Authority: DE
Inventors: Jasmine I. Richmond Hill DAKSIS; Pierre Ottawa PICARD; Glen H. Erikson
Original assignee: Ingeneus Inc
Current assignee: Ingeneus Inc
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: HK1047454A1; CN1413264A; ES2296661T3; EP1242620B1; ATE372390T1; KR100537979B1; HK1047454B; WO2001046467A3; AU778892B2; JP2003517841A; EP1242620A2; IL150284A0; CA2394752C; WO2001046467A2; CA2394752A1; IL150284A; JP4041867B2; RU2002119394A; DE60036307D1; MXPA02006262A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Durchführung einer Sequenzanalyse oder zum Testen von Nukleinsäuren, genauer gesagt ein Verfahren zum Testen von Triplex- und Duplex-Nukleinsäurehybridisierungskomplexen unter Verwendung von Fluoreszenzintensitätsmessungen.
Fluoreszierende Farbstoffe sind zum Detektieren und Quantifizieren von Nukleinsäuren seit Jahrzehnten verwendet worden. In ihrer grundlegensten Form umfassen Tests auf Fluoreszenzintensitätsbasis typischerweise das Kontaktieren eines Testobjektes mit einer ein Fluorophor-enthaltenden Sonde, das Entfernen der ungebundenen Sonde von der gebundenen Sonde und das Detektieren der Fluoreszenz in der gewaschenen Probe. Homogene Tests verbessern derartige grundlegende Tests, da sie keinen Waschschritt oder die Bereitstellung eines nichtflüssigen Phasenträgers benötigen.
Beispielsweise offenbaren die US-PS'en 5 538 848 und 4 220 450 homogene Tests auf Fluoreszenzbasis von Nukleotidsequenzen unter Verwendung von Oligonukleotidproben in Lösung. Diese Veröffentlichungen fordern jedoch die Verwendung eines Abschreckmittels in Kombination mit einem be richterstattenden Mittel, so dass zur Unterscheidung zwischen den durch die hybridisierten Sonden und nichthybridisierten Sonden erzeugten Signalen auch der Einsatz von Enzymen benötigt wird. Abschreckmittel und Enzyme machen jedoch die Verfahren komplexer und teurer.
Die US-PS 5 332 659 beschreibt ein Verfahren zum Detektieren von Nukleotidsequenzen in Lösungen unter Verwendung von Sonden, die mindestens zwei Fluorophorkomponenten enthalten. Die Fluorophore müssen so ausgewählt werden, dass sie elektronisch miteinander agieren, wenn sie nahe genug sind, um die Wellenlängenabhängigkeit ihrer Spektren zu verändern. Nicht hybridisierte Sonden sind viel flexibler als Sonden, die auf die Zielsequenz hybridisiert sind, so dass daher die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass die beiden Fluorophorkomponenten einer jeden Sonde nahe beieinander sind, wenn die Sonde nicht hybridisiert ist als wenn die hybridisiert ist. Somit kann eine Änderung in der mit der freien Sonde korrelierten Emissionswellenlänge als Anzeige der Menge der freien Sonde innerhalb der Probe überwacht werden.
Die US-PS 5 846 729 offenbart ebenfalls homogene Tests auf Fluoreszenzbasis zur Nukleinsäurehybridisierung.
Bei einigen Versuchen sind interkalierende Fluorophore verwendet worden, um die Nukleinsäurehybridisierung zu detektieren, und zwar auf der Basis der Fähigkeit von derartigen Fluorophoren, eine Bindung zwischen Strängen der Nukleinsäure in einem Hybridisierungskomplex zu bewirken.
Beispielsweise offenbart die US-PS 5 824 557 ein Verfahren und entsprechendes Zubehör zum Detektieren und Quantifizieren von Nukleinsäuremolekülen. Eine bevorzugte Ausführungsform beruht auf der Interkalation eines Farbstoffes in eine Doppelstrangnukleinsäurehelix oder eine Einzelstrangnukleinsäure. Der Farbstoff fluoresziert nach der Interkalation, wobei die Intensität ein direktes Mal für die Menge der in der Sonde enthaltenen Nukleinsäure darstellt. Während dieses Verfahren als zum Messen der Menge der Nukleinsäure in einer Sonde geeignet angesehen wird, macht die nichtspezifische Bindung zwischen dem Interkalator und der Nukleinsäure, auf der das Verfahren basiert, das Verfahren zum Detektieren einer spezifischen Bindung unpraktisch, und zwar insbesondere unter Bedingungen, bei denen testobjektfreie Nukleinsäureduplexe vorhanden sind.
Die US-PS 5 814 447 beschreibt einen Test, der eine Verbesserung gegenüber Tests darstellen soll, welche auf einer nichtspezifischen Interaktion zwischen interkalierenden Substanzen und Nukleinsäureduplexen basieren, wie beispielsweise in der US-PS 5 824 557 und der japanischen Patentveröffentlichung 237000/1993 beschrieben. Die in der letztgenannten Veröffentlichung beschriebene frühere Entwicklung umfasst das Zusetzen eines interkalierenden Fluorochroms, das die Tendenz besitzt, eine erhöhte Fluoreszenzintensität zu zeigen, wenn es in eine Probenlösung interkaliert wird, bevor ein spezifischer Bereich einer zu testenden Nukleinsäure durch PCR verstärkt wurde, und das Messen der Fluoreszenzintensität aus der Reaktionslösung in vorgegebenen Zeitintervallen, um die zu testende Nukleinsäure vor der Verstärkung zu detektieren und zu quantifi zieren. Gemäß der US-PS 5 814 447 versucht man diese frühere Entwicklung zu verbessern, indem man einen Test mit verbesserter Spezifizität zur Verfügung stellt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass es sich bei der Sonde um ein Einzelstrangoligonukleotid handelt, das mit einem interkalierenden Fluorochrom ausgestattet ist, welches in einen komplementären Bindungsabschnitt zwischen einer zu testenden Nukleinsäure und einer Einzelstrangoligonukleotidprobe zu interkalieren ist.
Die WO 97/45539 offenbart eine aus zwei Einheiten bestehende Probe zum Detektieren von Nukleinsäuren mit einer speziellen Sequenz. Eine Einheit der Sonde umfasst ein Sequenzerkennungselement (SRE), das eine spezielle Nukleinsäuresequenz erkennt. Die zweite Einheit der Sonde umfasst eine Berichterstattergruppe (RG), die eine detektierbare Verbindung enthält, deren Eigenschaften bei der Bindung verändert werden. Die beiden Einheiten sind über einen Linker, vorzugsweise einen Peptidlinker, miteinander verknüpft.
Die GB 2333359 beschreibt ein Verfahren zum Detektieren einer PCR-verstärkten Testnukleinsäuresequenz in einer Probe.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Entwicklungen, die die Fluoreszenzintensität detektieren, haben einige von den Vorteilen von Fluoreszenzpolarisationstests Gebrauch gemacht. Bei Tests auf Polarisationsbasis gibt es jedoch signifikante Nachteile. Der Änderungsgrad der Polarisation in Abhängigkeit von der Bindung kann unvorsehbar sein, und die Interpretation von Daten, um eine Anpassung von inkonsis tenten Daten an theoretische Erwartungen zu erreichen, kann größere Anstrengungen erfordern, als sie in einem analytischen Verfahren wünschenswert sind, insbesondere dann, wenn das Verfahren automatisiert werden soll.
Trotz der vorstehend beschriebenen Entwicklungen besteht weiterhin ein Bedarf nach einem einfachen, besonders sensitiven, wirksamen und raschen Verfahren zum Analysieren der Wechselwirkung zwischen Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanalogen.
Die Erfindung sieht ein Bindungstestverfahren vor, das die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen eines dsDNA umfassenden Testobjektes;
Bereitstellen einer ssDNA oder RNSA umfassenden Sonde, die in Bezug auf wenigstens einen Teil des Testobjektes nicht perfekt komplementär ist;
Bereitstellen eines Interkalierungsmittels, das ein Fluorophor umfasst;
Zusetzen der Sonde, des Testobjektes und des Interkalierungsmittels zu einem Hybridisierungsmedium zum Vorsehen einer Testprobe;
Bestrahlen der Testprobe mit Anregungsstrahlung, um zu bewirken, dass das Fluorophor Fluoreszenzstrahlung emittiert;
Detektieren einer Intensität der Fluoreszenzstrahlung, wobei diese Intensität eine direkte Anzeige einer Bindungsaffinität zwischen der Sonde und dem Testobjekt ist;
Kalibrieren der Intensität gegenüber von anderen Sonden in Kombination mit dem Testobjekt und dem Interkalierungsmittel erreichten Intensitäten, wobei sich jede dieser Sonden von der Sonde um mindestens eine Base unterscheidet; und
Ermitteln aus dieser Kalibrierung ein Ausmaß an Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Testobjekt,
wobei es sich bei dem Verfahren um einen ohne PCR-Verstärkung des Testobjektes und ohne Denaturierung des Testobjektes durchgeführten homogenen Test handelt.
Die Erfindung wird nachfolgend in Verbindung mit den folgenden Zeichnungen beschrieben, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Elemente bezeichnen.
Die 1A, 1B, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 8A und 8B sind Diagramme von maximalen Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit von der Temperatur für jede analysierte Probe.
Die Erfindung stellt ein rasches, empfindliches, umweltfreundliches und sicheres Verfahren zum Testen der Bindung zwischen einem Testobjekt und einer Sonde zur Verfügung, wobei das Testobjekt eine Nukleinsäuresequenz oder eine Nukleinsäureanalogsequenz und die Sonde eine Nukleinsäuresequenz oder eine Nukleinsäureanalogsequenz umfassen.
Im Gegensatz zu bestimmten Tests des Standes der Technik detektiert die Erfindung nicht nur das Vorhandensein einer Hybridisierung, sondern stellt auch qualitative und quantitative Informationen in Bezug auf die Natur der Hybridisierung zwischen einer Sonde und einem Testobjekt zur Verfügung. Die Erfindung versetzt daher den Praktiker in die Lage, zwischen einer perfekten Paarung, einer Einbasenpaarfehlpaarung, einer Zweibasenpaarfehlpaarung, einer Dreibasenpaarfehlpaarung, einer Einbasenpaarannulierung, Zweibasenpaarannulierung und einer Dreibasenpaarannulierung zu unterscheiden.
Ausführungsformen der Erfindung umfassen das Kalibrieren der für ein erstes Sonden-Testobjekt-Gemisch gemessenen Fluoreszenzintensität gegenüber Intensitäten, die andere Sonden zeigen, welche mit dem gleichen Testobjekt und dem gleichen Interkalierungsmittel kombiniert sind, wobei sich jede der anderen Sonden von der ersten Sonde um mindestens eine Base unterscheidet. Die beim Verfahren der Erfindung detektierte Fluoreszenzintensität steigt mit der Bindungsaffinität zwischen der Sonde und dem Testobjekt an. Das vorliegende Verfahren benötigt keine Messung der Polarisation der Fluoreszenz im Gegensatz zu Fluoreszenzanisotropieverfahren.
Es kann eine Kalibrierungskurve erzeugt werden, wobei die Intensität von der Bindungsaffinität zwischen dem Testobjekt und der Sonde abhängig ist. Da die Bindungsaffinität zwischen dem Testobjekt und einer Vielzahl von unterschiedlichen Sonden mit der Anzahl der fehlgepaarten Basen, der Natur der Fehlpaarung (A-G gegenüber A-C gegenüber T-G ge genüber T-C etc.), der Lage der Fehlpaarung (der Fehlpaarungen) innerhalb des Hybridisierungskomplexes etc. variiert, kann der erfindungsgemäße Test für eine Sequenzanalyse des Testobjektes verwendet werden.
Die Erfindung ermöglicht die Quantifizierung der Bindungsaffinität zwischen der Probe und dem Testobjekt. Eine derartige Information kann für eine Vielzahl von Verwendungszwecken wertvoll sein, einschließlich der Herstellung von Antisense-Arzneimitteln mit optimierten Bindungscharakteristiken.
Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik ist der erfindungsgemäße Test vorzugsweise homogen. Der Test kann durchgeführt werden, ohne den Sonden-Testobjekt-Komplex von der freien Sonde und dem Testobjekt vor dem Detektieren der Fluoreszenzintensität zu trennen. Der Test erfordert keinen Gelseparationsschritt, so dass auf diese Weise eine starke Zunahme des Testdurchsatzes ermöglicht wird. Die quantitativen Analysen sind einfach und genau. Ferner wird der Test vorzugsweise in einer homogenen Lösung durchgeführt, so dass eine Trennung der gebundenen Komplexe von ungebundenen Sonden entweder durch Filtration und zahlreiche Waschschritte oder durch Gelelektrophorese nicht erforderlich ist. Daher werden mit dem Bindungstest viel Zeit und Aufwand eingespart und kann der Test in einfacher Weise automatisiert werden. Des Weiteren ermöglicht er eine rasche Bestimmung von Bindungsvariablen, wie Puffer, pH-Wert, ionischer Konzentration, Temperatur, Inkubationszeit, relativen Konzentrationen von Sonden- und Testobjektsequenzen, Interkalatorkonzentrationen, Länge der Testobjektsequenzen, Länge der Sondensequenzen und möglichen Cofaktorerfordernissen.
Des Weiteren wird der erfindungsgemäße Test vorzugsweise ohne die Bereitstellung eines Signalabschreckmittels auf dem Testobjekt oder auf der Sonde durchgeführt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird auf spezifische Weise die Triplexhybridisierung zwischen der Sonde und dem Doppelstrangtestobjekt detektiert, so dass die Notwendigkeit einer Denaturierung des Testobjektes vermieden wird. Während es bekannt ist, dass PNA-Sonden Triplexe mit bestimmten Klassen von Testobjekten bilden (siehe beispielsweise Egholm et al., 365 Nature 566 (1993) und Tomac et al., 118 J. Am. Chem. Soc. 5544 (1996)), waren die Erfinder überrascht, dass sie in der Lage waren, auf spezifische Weise Triplexe zu testen, die zwischen Einzelstrangnukleinsäuresonden (d. h. ssDNA und RNA) und DOppelstrangnukleinsäuretestobjekten (d. h. dsDNA) gebildet wurden.
Geeignete Proben zur Verwendung im erfindungsgemäßen Test umfassen ssDNA, RNA, PNA und andere Nukleinsäureanaloge mit nicht aufgeladenen Ketten. Sondensequenzen mit irgendeiner Länge zwischen 8 und 20 Basen werden bevorzugt, da dies den Bereich bildet, in dem die kleinsten einzigartigen DNA-Sequenzen von Prokarioten und Eukarioten gefunden werden. Sonden von 12-18 Basen werden besonders bevorzugt, da dies die Länge der kleinsten einzigartigen Sequenzen im menschlichen Genom darstellt. Bei speziellen Ausführungsformen werden Sonden von 6-30 Basen bevorzugt, wobei 15 Basen am bevorzugtesten sind. Es kann jedoch auch eine Vielzahl von kürzeren Proben Verwendung finden, um eine Nukleotidsequenz mit einer Vielzahl von nicht einzigartigen Testobjektsequenzen darin zu detektieren, die auf kombinierte Weise die Nukleotidsequenz identifizieren.
Die Erfindung benötigt keine Verwendung von radioaktiven Sonden, die gefährlich, schwierig, und zeitaufwändig zu handhaben sind und auf konstante Weise regeneriert werden müssen. Sonden der Erfindung sind vorzugsweise sicher im Gebrauch und stabil über Jahre. Daher können Sonden in großen Mengen geordert und gelagert werden.
Die Erfinder waren darüber hinaus überrascht, festzustellen, dass parallele PNA-Sonden ein besseres Verhalten aufweisen als auf mehr herkömmliche Art und Weise synthetisierte Antiparallel PNA-Sonden. Wenn die Nukleinsäuretestobjektsequenzen um mehr als das dreifache länger waren als die PNA-Sonden, waren die parallelen und antiparallelen PNA-Sonden in gleicher Weise effizient in Bezug auf die Unterscheidung zwischen perfekt gepaarten Nukleinsäurehybridisierungskomplexen und denjenigen, die verschiedene Einbasenpaar-, Zweibasenpaar- oder Dreibasenpaarfehlpaarungen enthielten. Wenn jedoch die Testobjekt-DNA-Sequenzen die gleiche Länge wie die PNA-Sondensequenzen besaßen (d. h. 15 Nukleotide lang), wurden parallele DNA-Sonden gegenüber antiparallelen PNA-Sonden wegen der größeren Differenzen bei den beobachteten Fluoreszenzintensitäten zwischen perfekt gepaarten Komplexen und Ein- oder Zweibasenpaarfehlpaarungskomplexen bevorzugt.
Obwohl der exakte Mechanismus, warum unter solchen Bedingungen parallele PNA-Sonden bevorzugt werden, nicht bekannt ist, schlagen diese Beobachtungen vor, dass die fehlgepaarten parallelen PNA:DNA Hybridisierungskomplexe mehr stabil sind als die analogen fehlgepaarten antiparallelen PNA:DNA-Hybride, was zu einer geringeren Interkalation des Nukleinsäureinterkalators und somit zu geringeren beobachteten Fluoreszenzintensitätswerten führt.
Es wird bevorzugt, dass die Sonde und das Testobjekt nicht markiert sind. Bei alternativen Ausführungsformen ist jedoch ein Interkalierungsmittel auf kovalente Weise an die Sonde gebunden. Bei derartigen Ausführungsformen ist das Interkalierungsmittel vorzugsweise an jedem Ende an die Sonde gebunden.
Bei anderen Ausführungsformen ist das Interkalierungsmittel nicht kovalent an die Sonde gebunden, obwohl es sich während des Tests selbst zwischen die Sonde und das Testobjekt einsetzen kann, und zwar in einem solchen Sinn, dass es an die Sonde auf nichtkovalente Weise gebunden wird.
Bevorzugte Interkalierungsmittel zur Verwendung in der Erfindung sind YOYO-1, TOTO-1, Ethidiumbromid, Ethidiumhomodimer-1, Ethidiumhomodimer-2 und Acridin. Generell handelt es sich bei dem Interkalierungsmittel um eine Komponente, die in der Lage ist, zwischen Stränge eines Duplex- und/oder eines Triplexnukleinsäurekomplexes zu interkalieren oder sich zwischen diese einzulagern. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Interkalierungsmittel (oder eine Komponente hiervon) in Abwesenheit von Nukleinsäuren im We sentlichen nichtfluoreszierend und fluoresziert, wenn es eingelagert ist und durch Strahlung mit einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, wobei eine 100-fache bis 10.000-fache Vergrößerung der Fluoreszenz bei Einlagerung in einem Duplex- oder Triplexnukleinsäurekomplex erzielt wird.
Bei anderen Ausführungsformen kann das Interkalierungsmittel eine Verschiebung in der Fluoreszenzwellenlänge bei Interkalation und Anregung durch Strahlung einer geeigneten Wellenlänge erfahren. Die exakte Fluoreszenzwellenlänge kann von der Struktur der Nukleinsäure, die interkaliert wird, abhängen, beispielsweise DNA gegenüber RNA, Duplex gegenüber Triplex etc..
Die Anregungswellenlänge wird so ausgewählt (durch Routineversuche und/oder vorhandene Kenntnisse), dass sie diesem Anregungsmaximum für das verwendete Fluorophor entspricht, und beträgt vorzugsweise 200-1.000 nm. Interkalierungsmittel werden vorzugsweise so ausgewählt, dass sie eine Emissionswellenlänge von 200-1.000 nm besitzen. Bei bevorzugten Ausführungsformen findet ein Argonionenlaser Verwendung, um das Fluorophor mit Licht einer Wellenlänge in einem Bereich von 400-540 nm zu bestrahlen, wobei die Fluoreszenzemission in einem Bereich von 500-750 nm detektiert wird.
Der erfindungsgemäße Test kann über eine große Vielzahl von Temperaturen durchgeführt werden, wie beispielsweise von 5-85°C. Bestimmte Tests des Standes der Technik erfordern erhöhte Temperaturen, wodurch der Test mit höheren Kosten und Verzögerungen verbunden ist. Demgegenüber kann die Erfin dung bei Raumtemperatur oder darunter (d. h. bei einer Temperatur von unter 25°C) durchgeführt werden.
Die Zuverlässigkeit der Erfindung ist unabhängig von einem Guanin- und Cytosingehalt im Testobjekt. Da G-C-Basenpaare drei Wasserstoffbindungen bilden, während A-D-Basenpaare nur zwei Wasserstoffbindungen bilden, sind Testobjekt- und Sondensequenzen mit einem höheren G- oder C-Anteil stabiler und besitzen höhere Schmelztemperaturen. Daher können Basenpaarfehlpaarungen, die den GC-Anteil des hybridisierten Sonden- und des Testobjektbereiches über den in perfekt gepaarten Hybriden vorhandenen erhöhen, die mit einer fehlgepaarten Sonde verbundene Bindungsschwäche ausgleichen. Hybridisierungskomplexe, die jede mögliche Basenpaarfehlpaarung zwischen der Sonde und dem Testobjekt enthielten, erwiesen sich als unbeständiger als perfekt gepaarte Hybride, was immer in geringeren Fluoreszenzintesitäten als bei perfekt komplementären Hybriden resultierte.
Der erfindungsgemäße Test ist extrem sensitiv, so dass daher keine PCR-Verstärkung des Testobjektes durchgeführt werden muss. Beispielsweise ist es möglich, eine Testprobe zu testen, die ein Volumen von etwa 20 μl besitzt und etwa 10 Femtomol Testobjekt und etwa 10 Femtomol Sonde enthält. Ausführungsformen der Erfindung sind sensitiv genug, um Testobjekte mit einer Konzentration von 5 × 10^-9M, vorzugsweise mit einer Konzentration von nicht mehr als 5 × 10^-10M, zu testen. Ausführungsformen der Erfindung sind sensitiv genug, um Sonden mit einer Konzentration von 5 × 10^-9M, vorzugsweise mit einer Konzentration von nicht mehr als 5 × 10^-10M, zu verwenden. Es versteht sich von selbst, dass die vorstehend genannten Werte in keiner Weise bedeuten, dass das Verfahren keine höheren Konzentrationen detektieren kann.
Bei dem Hybridierungsmedium kann es sich um irgendein herkömmliches Medium handeln, das zum Präservieren von Nukleotiden geeignet ist, siehe beispielsweise Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Lab Manual," Band 2 (1989). Beispielsweise kann das flüssige Medium Nukleotide, Wasser, Puffersubstanzen und standardmäßige Salzkonzentrationen enthalten.
Die Hybridisierung zwischen den komplementären Basen tritt unter einer großen Vielzahl von Bedingungen auf, die Variationen in Bezug auf Temperatur, Salzkonzentration, elektrostatische Stärke und Pufferzusammensetzung aufweisen. Beispiele dieser Bedingungen und Verfahren zur Anwendung derselben sind bekannt.
Es wird bevorzugt, die Hybridisierungskomplexe bei einer Temperatur von etwa 15°C bis etwa 25°C über etwa 1 min bis etwa 5 min zu bilden. Längere Reaktionszeiten sind nicht erforderlich, wobei jedoch eine Inkubation über diverse Stunden die Hybridisierungskomplexe nicht nachteilig beeinflusst.
Unter der Voraussetzung, dass ein geeignetes Fluoreszenzinterkalierungsmittel im Reaktionsgemisch enthalten ist (wie vorstehend erläutert), sind unter der großen Vielzahl der Fälle andere zur Erleichterung dienende Reagenzien nicht erforderlich. Es ist jedoch möglich, die Hybridisierung in Lösung zu erleichtern, indem bestimmte Reagenzien verwendet werden. Bevorzugte Beispiele dieser Reagenzien sind Einzelstrangbindungsproteine, wie Rec A Protein, T4 Gen 32 Protein, E. Coli Einzelstrangbindungsprotein, Haupt- oder Nebennukleinsäuregroovebindungsproteine, zweivalente Ionen, polyvalente Ionen, Viologen und interkalierende Substanzen, wie Ethidiumbromid, Actinomycin D, Psoralen und Angelicin. Diese, zur Erleichterung dienenden Reagenzien können sich in extremen Betriebsbedingungen als geeignet erweisen, beispielsweise bei abnormen pH-Werten oder extrem hohen Temperaturen.
Der erfindungsgemäße Test kann beispielsweise dazu benutzt werden, um zugängliche Bereiche in gefalteten Nukleotidsequenzen zu identifizieren, die Anzahl von fehlgepaarten Basenpaaren in einem Hybridisierungskomplex zu ermitteln und Genome zu kartieren.
Die Erfindung wird nachfolgend in größeren Einzelheiten in Verbindung mit den nachfolgenden Ausführungsbeispielen erläutert. Es versteht sich, dass die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt ist.
Beispiel 1
Sense- und Antisense 50-mer ssDNA-Testobjektsequenzen, abgeleitet von Exon 10 des menschlichen zystischen Fibrosegens (Nature 380, 207 (1996)) wurden auf einem DNA-Synthetisator (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems) synthetisiert und mit HPLC gereinigt. Equimolare Mengen von komplementären Oligonukleotiden wurden bei 95°C über 10 min denaturiert und allmählich abkühlen gelassen, als die Temperatur über 1,5h auf 21°C sank. DsDNA-Oligonukleotide wurden in ddH₂O bei einer Konzentration von 1 pmol/μl gelöst.
Der Sense-Strang der Wildtyp-Test-DNA besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:1): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
Der Antisense-Strang der Wildtyp-Test-DNA besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:1): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
Es wurde eine 50-mer Mutant-dsDNA Testsequenz identisch zur Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:1) hergestellt, mit Ausnahme einer Einbasenpaarmutation (unterstrichen) an der Aminosäurenposition 507, bei der die Wildtyp-Sequenz CAT auf CGT verändert wurde.
Der Sense-Strang dieser 50-mer Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:2): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
Der Antisense-Strang dieser 50-mer Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:2): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
Es wurde eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testsequenz identisch mit der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID No:1) hergestellt, mit Ausnahme einer aufeinanderfolgenden Zweibasenpaarmutation (unter strichen) an den Aminosäurepositionen 506 und 507, bei denen die Wildtypsequenz CAT auf ACT verändert wurde.
Der Sensestrang dieser Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:3): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA ATA TA-3'.
Die Antisensestrang dieser Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:3): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
Es wurde eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testsequenz identisch mit der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:1) hergestellt mit Ausnahme einer aufeinanderfolgenden Dreibasenpaarmutation (unterstrichen) an den Aminosäurepositionen 506 und 507, an denen die Wildtypsequenz CAT auf ACG verändert wurde.
Der Sensestrang dieser Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:4): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACG CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
Der Antisensestrang dieser Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:4): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGC GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
Es wurde eine 47-mer Mutant-dsDNA-Testsequenz identisch mit der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:1) hergestellt mit der Ausnahme einer aufeinanderfolgenden Dreibasenpaarannullierung (angezeigt durch eine Ellipse) an den Aminosäurepositionen 507 und 508, an denen die Wildtypsequenz CTT annulliert wurde.
Der Sensestrang dieser 47-mer Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:5): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT ... TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
Der Antisensestrang dieser 47-mer Testsequenz besaß die folgende Sequenz (SEQ ID NO:5): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA ... A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
Die in den Beispielen verwendeten PNA-Sonden wurden synthetisiert, mit HPLC gereinigt und durch Massenspektroskopie von Commonwealth Biotechnologies, INc. (Richmond, VA, USA) bestätigt. PNA-Sonden wurden zuerst in 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) bis auf eine Konzentration von 10 mg/ml gelöst und dann durch Zusatz von ddH₂O auf 1 mg/ml verdünnt. Endgültige PNA-Lösungen wurden in ddH₂O mit einer Konzentration von 1 pMol/μl hergestellt.
Sonde Nr. 1 war eine 15-mer antiparallele PNA-Sonde, die so ausgebildet war, dass sie vollständig komplementär zu einem 15 Nukleotidsegment des Sensestranges der 50-mer Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:1) war und die Aminosäureposition 505 bis 510 überlappte (Nature 380, 207 (1996)). Die Probe besaß die folgende Struktur (SEQ ID NO:6): 5'-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH₂-3'.
Sonde Nr. 2 war eine 15-mer PNA-Sonde mit identischer Sequenz wie Sonde Nr. 1, jedoch in paralleler Orientierung anstelle der antiparallelen Orientierung. Die Sonde besaß die folgende Struktur (SEQ ID NO:7): 5'-H-TAT AGT AGA AAC CAC-Lys-CONH₂-3'.
Jedes Hybridisierungsreaktionsgemisch (80 μl) enthielt das folgende: 4 pMol der Test-dsDNA, 4 pMol der PNA-Sonde, 0,5 × TBE und 500 nM des DNA-Interkalators YOYO-1 (Molekular Probes, Eugene, OR, USA). Die Reaktionsgemische wurden bei 95°C 5-10 min inkubiert, um eine Denaturierung zu ermöglichen, und dann bis zum Test auf 80°C gehalten. Proben wurden in eine Quarzküvette eingesetzt, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und wiederholt in Bezug auf Fluoreszenzemissionen überwacht, als die Temperatur mit der Zeit abfiel. Laufende Temperaturmessungen wurden über eine softwaregesteuerte Temperatursonde, die direkt in jede Sonde eingesetzt war, erhalten. Die maximale Fluoreszenzintensität trat bei einer Wellenlänge von 540 mm auf, was eine Interkalation von YOYO-1 in die PNA:DNA-Hybriden anzeigte. Die maximalen Fluoreszenzintensitäten wurden in Abhängigkeit von der Temperatur für jede analysierte Probe aufgezeichnet.
Die Fluoreszenzintensitäten, die beobachtet wurden, als keine DNA oder PNA vorhanden war (nur YOYO-1) oder als Wildtyp SEQ ID NO:1, Mutant SEQ ID NO:2 oder Mutant SEQ ID NO:3 mit der antiparallelen PNA-Sonde Nr. 1 oder der parallelen PNA-Sonde Nr. 2 reagierten, sind in den 1A und 1B gezeigt. SsDNA:PNA-Hybride, die aus perfekt komplementären Sequenzen (SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 1) bestanden, ermöglichten eine maximale Interkalation von YOYO-1 und führten zu den höchsten Fluoreszenzintensitäten, die anstiegen, als die Temperatur abfiel (1A). Die Fluoreszenzintensitäten für ein fehlgepaartes Einbasenpaar ssDNA:PNA-Hybrid (SEQ ID NO:2 + Sonde Nr.1) und ein fehlgepaartes Zweibasenpaar ssDNA:PNA-Hybrid (SEQ ID NO:3 + Sonde Nr. 1) waren um 81% und 89% niedriger als das perfekt gepaarte ssDNA:pNA-Hybrid bei 60°C (1A). In entsprechender Weise wiesen bei der Hybridisierung der parallelen PNA-Sonde Nr. 2 auf die Test-DNA-Sequenzen die fehlgepaarten Ein- und Zweibasenpaare ssDNA:PNA-Hybride Fluoreszenzintensitäten auf, die um 70% und 86% niedriger waren als das perfekt komplementäre ssDNA:PNA-Hybrid (SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 2) bei 60°C (1B). Bei einem Anstieg des Fehlpaarungsgrades zwischen der Sonde und dem Testobjekt verringerte sich das Niveau der Interkalation durch YOYO-1 und nahm somit der Wert der Fluoreszenzintensität ab. Diese Beziehung war gültig unabhängig davon, ob eine antiparallele oder parallele PNA-Sonde verwendet wurde.
Als die Test-DNA-Sequenzen die gleiche Länge besaßen wie die PNA-Sondensequenzen (d. h. 15 Nukleotide lang) wurden interessanterweise parallele PNA-Sonden vielmehr bevorzugt als antiparallele PNA-Sonden, und zwar wegen größerer Differenzen in den beobachteten Fluoreszenzintensitäten zwischen perfekt gepaarten Komplexen und fehlgepaarten Ein- und Zweibasenpaarkomplexen (Daten sind nicht gezeigt).
Obwohl der exakte Mechanismus, warum unter diesen Bedingungen parallele PNA-Sonden bevorzugt werden, nicht bekannt ist, legen diese Beobachtungen nahe, dass die fehlgepaarten parallelen PNA:DNA-Hybridisierungskomplexe weniger stabil sind als die analogen fehlgepaarten antiparallelen PNA:DNA-Hybride, was zu einer geringeren Interkalation des Nuklein säureinterkalators und somit zu geringeren beobachteten Fluoreszenzintensitätswerten führt.
Beispiel 2
2 zeigt, dass der Hybridisierungstest der Erfindung auch zwischen perfekt gepaarten ssDNA:PNA-Hybriden und denjenigen unterscheiden kann, die 1, 2 oder 3 bp Fehlpaarungen sowie eine 3 bp Annullierung enthalten, wenn eine parallele PNA-Sonde verwendet wird. Die Testbedingungen sind hierbei identisch mit denen von Beispiel 1. Die Fluoreszenzintensitäten für ein 1 bp fehlgepaartes ssDNA:PNA-Hybrid (SEQ ID NO:2 + Sonde Nr.2), eine darauffolgende 2 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:3 + Sonde Nr. 2), eine darauffolgende 3 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:4 + Sonde Nr. 2) und eine 3 bp Annullierung (SEQ IS NO:5 + Sonde Nr. 2) waren um 41%, 71%, 87% und 95% geringer als bei dem perfekt gepaarten ssDNA:PNA-Hybrid (SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 2) bei 60°C. Als die Temperatur von 70°C auf 60°C abfiel, nahm der Unterscheidungsgrad zwischen perfekter Paarung und den verschiedenen Basenpaarfehlpaarungen zu. Wie in Beispiel 1 führte der Anstieg der Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Testobjekt zu zunehmend verringerten Niveaus der Fluoreszenzintensität. Darüber hinaus war dieses Fluoreszenzmuster selbst dann konsistent, wenn die Mutant-Sequenzen einen GC-Anteil aufwiesen, der höher war als der der Wildtypsequenz (2).
Als eine parallele PNA-Sonde verwendet wurde, führten separierte 2 bp Fehlpaarungen (worin zwei 1 bp Fehlpaarungen durch 3 Basenpaare separiert waren) zu geringfügig geringe ren Fluoreszenzintensitäten als die darauffolgenden 2 bp Fehlpaarungen (Daten nicht gezeigt). In entsprechender Weise ergaben separierte 3 bp Fehlpaarungen (worin drei 1 bp Fehlpaarungen jeweils durch drei Basenpaare separiert waren) zu geringfügig niedrigeren Fluoreszenzintensitäten als nachfolgende 3 bp Fehlpaarungen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen nahe, dass separierte Basenpaarfehlpaarungen mehr spaltend in Bezug auf die ssDNA:PNA Hybridbildung sind als aufeinanderfolgende Basenpaarfehlpaarungen.
Beispiel 3
SEQ ID NO:8 war eine 15-mer dsDNA-Testsequenz, abgeleitet von SEQ ID NO:1, die vollständig komplementär zu Sonde Nr. 1 sein sollte. Bei SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:17 handelte es sich um 15-mer Mutant dsDNA-Testsequenzen, die mit Ausnahme einer Einbasenpaarmutation (unterstrichen) identisch mit der Wildtyp SEQ ID NO:8 waren. Sense- und Antisense 15-mer ssDNA-Sequenzen wurden synthetisiert, gereinigt und abgekühlt, wie vorstehend beschrieben. DsDNA-Oligonukleotide wurden in ddH₂O bei einer Konzentration von 1 pMol/μl gelöst.
Die Sequenz für den Sensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:8) betrug: 5'-ATA TCA TCT TTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:8) betrug: 5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:9) betrug: 5'-ATA TCT TCT TTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:9) betrug: 5'-CAC CAA AGA AGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:10) betrug: 5'-ATA TCA TCT TTC GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:10) betrug: 5'-CAC GAA AGA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:11) betrug: 5'-ATA TCA TGT TTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:11) betrug: 5'-CAC CAA ACA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:12) betrug: 5'-ATA TCA TCT ATG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:12) betrug: 5'-CAC CAT AGA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:13) betrug: 5'-ATA TCA TCT CTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:13) betrug: 5'-CAC CAG AGA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:14) betrug: 5'-ATA TCA TCT GTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:14) betrug: 5'-CAC CAC AGA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:15) betrug: 5'-ATA TCG TCT TTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:15) betrug: 5'-CAC CAA AGA CGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:16) betrug: 5'-ATA TCA TTT TTG GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:16) betrug: 5'-CAC CAA AAA TGA TAT-3'.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:17) betrug: 5'-ATA TCA TCT TTT GTG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant-Test-DNA (SEQ ID NO:17) betrug: 5'-CAC AAA AGA TGA TAT-3'.
Die Spezifizität des Hybridisierungstestes wurde weitergetestet, indem man die parallele PNA Sonde Nr. 3 mit einer 15-mer Wildtyp-Test-dsDNA (SEQ ID NO:8) und verschiedenen 15-mer 1 bp mutierten Test-ds-DNAs (SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:17) reagieren ließ, die jeden Typ einer möglichen 1 bp Fehlpaarung erzeugen würden (3). Die Testbedingungen waren mit denen von Beispiel 1 identisch.
Die höchsten Fluoreszenzintensitäten wurden mit ssDNA:PNA-Hybriden erreicht, die aus perfekt komplementären Sequenzen bestanden, und zwar bei sämtlichen getesteten Temperaturen. Die Fluoreszenz nahm zu, als die Temperatur abnahm. SsDNA:PNA-Hybride, die zu 1 bp T-T, C-C, G-G, A-A, C-A, G-T und C-T-Fehlpaarungen führten, ergaben alle Fluoreszenzintensitäten, die geringer waren als die, die für perfekt gepaarte ssDNA:PNA-Hybride beobachtet wurden (3A und 3B). Die Fluoreszenzintensität für die 1 bp Fehlpaarungen waren um 64% bis 96% und um 57% bis 95% geringer als die, die für die perfekte Paarung bei 55°C und 75°C beobachtet wurden. Die Variabilität in den beobachteten Fluoreszenzintensitäten zwischen den verschiedenen 1 bp Fehlpaarungen hing mehr von der speziellen Basenpaarfehlpaarung ab als von der Veränderung des GC Anteils der Mutant-Sequenzen, wenn eine parallele PNA-Sonde verwendet wurde (3). Wenn eine antiparallele PNA-Sonde Nr. 1 in einem entsprechenden Experiment getestet wurde, waren die festgestellten Unterschiede in den Fluoreszenzintensitäten zwischen der perfekten Paarung und den verschiedenen 1 bp Fehlpaarungen weniger dramatisch als die, die mit der parallelen PNA-Probe Nr. 2 erzielt wurden, und schienen durch Temperatur beeinflusst zu sein (Daten nicht gezeigt). Der Test führte zu besten Ergebnissen zwischen 40°C und 60°C bei Verwendung einer antiparallelen PNA-Probe. Eine parallele PNA-Probe wird daher bevorzugt, wenn die Test-DNA-Sequenzen die gleiche Länge wie die PNA-Sonden-Sequenzen besitzen.
Die Ergebnisse von 3 bestätigten die Zuverlässigkeit des Hybridisierungstests zur Indentifizierung von sämtlichen möglichen 1 bp Fehlpaarungen mit großer Genauigkeit.
Beispiel 4
Die Hybridisierungstests der Beispiele 1-3 wurden nach Denaturierung der dsDNA-Testsequenzen durchgeführt, und es wurde die ssDNA-:PNA-Hybridbildung bei Temperaturen über dem Schmelzpunkt (T_m) der dsDNA-Testobjekte gemessen. Dieses Beispiel zeigt die Zuverlässigkeit des Tests der Erfindung zum Differenzieren zwischen perfekten Paarungen und Basenpaarfehlpaarungen, ohne dass eine vorherige Denaturierung erforderlich ist.
Das Hybridisierungsreaktionsgemisch (120 μl) enthielt die nachfolgenden Bestandteile: 6 pMol der Test-dsDNA, 6 pMol der parallelen PNA-Sonde Nr. 2, 0,5 × TBE und 500 nM des DNA-Interkalators YOYO-1. Obwohl das Reaktionsvolumen geringfügig größer war als das der Beispiele 1-3, wurden die DNA-,PNA- und YOYO-1-Mengen entsprechend eingestellt, um konstante Konzentrationen der Proben aufrechtzuerhalten. Bei Reaktionsvolumina von 40 μl, 80 μl oder 120 μl wurden identische Ergebnisse erhalten. Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur (21°C) über 5 min inkubiert, in eine Quarzküvette eingebracht, mit einem Argonionenlaserstrahl mit einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und wiederholt in Bezug auf die Fluoreszenzemission überwacht, als die Temperatur mit der Zeit in einer erhitzten Kammer anstieg. Laufende Temperaturmessungen der Proben wurden mit einer softwaregesteuerten Temperatursonde durchgeführt, die direkt in jede Probe eingeführt wurde. Maximale Fluoreszenzintensitäten wurden in Abhängigkeit von der Temperatur für jede analysierte Probe aufgezeichnet.
4 zeigt, dass selbst beim Fehlen einer vorherigen Denaturierung die höchsten Fluoreszenzintensitäten erreicht wurden, als die Wildtyp 50-mer dsDNA-Testsequenz (SEQ ID NO:1) mit der 15-mer 1 parallelen PNA-Sonde Nr. 2 von 30°C bis 85°C reagierte. Bei Temperaturen unter 65°C, dem T_m-Wert der 50-mer Wildtyp dsDNA, wurden dsDNA:PNA-Triplexe gebildet. Als die Temperatur über 65°C anstieg, wandelten sich die Triplexstrukturen in ssDNA:PNA-Duplexe um. Das Interkalungsmittel YOYO-1 war ohne Weiteres in der Lage, auf effiziente Weise sowohl in die Triplex- als auch in die Duplexstrukturen einzudringen. Folglich waren die Fluoreszenzintensitäten für einen 1 bp fehlgepaarten dsDNA:PNA-Triplex (SEQ ID NO:2 + Sonde Nr. 2), einen aufeinanderfolgenden 2 bp fehlgepaarten Triplex (SEQ ID NO:3 + Sonde Nr. 2), einen aufeinanderfolgenden 3 bp fehlgepaarten Triplex (SEQ ID NO:4 + Sonde Nr. 2) und einen 3 bp Annullierungstriplex (SEQ ID NO:5 + Sonde Nr. 2) um 83%, 93%, 99% und 99,5% geringer als der perfekt gepaarte dsDNA:PNA-Triplex (SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 2) bei 30°C. Als die Temperatur von 30°C auf 85°C anstieg, nahm der Unterscheidungsgrad zwischen perfekter Paarung und den Basenpaarfehlpaarungen ab. Bei 85°C ergaben die 1 bp Fehlpaarungs-, 2 bp Fehlpaarungs-, 3 bp Fehlpaarungs- und 3 bp Annullierungshybride Fluoreszenzintensitäten, die um 65%, 76%, 94% und 95% geringer waren als diejenigen, die für die perfekt komplementären Sequenzen beobachtet wurden. Daher kann mit dem erfindungsgemäßen Hybridisierungstest zwischen Wildtypsequenzen und denjenigen unterschieden werden, die 1 bp, 2 bp oder 3 bp Mutationen oder Annullierungen enthalten, ohne dass eine vorhergehende Denaturierung der Sequenzen stattfinden muss.
Beispiel 5
Sonde Nr. 3 war eine 15-mer ssDNA-Sonde, die in Bezug auf Sequenz und Orientierung mit der 15-mer antiparallelen PNA-Sonde Nr. 1 (SEQ ID NO:6) identisch war. Die Sonde besaß die folgende Struktur:
5'-CAC CAR AGA TGA TAT-3'
Die Spezifizität des Hybridisierungstestes wurde weiter untersucht, indem man die ssDNA-Sonde Nr. 3 mit den 50-mer Wildtyp- und Mutant-dsDNA-Testsequenzen bei Fehlen einer vorhergehenden Denaturierung reagieren ließ. Die Testbedingungen waren identisch mit denen von Beispiel 4.
Verstärkt durch den DNA-Interkalator YOYO-1 wurden dsDNA:ssDNA-Triplexe zwischen 30°C und 65°C gebildet. Perfekt gepaarte DNA-Triplexe, die aus SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 3 bestanden, führten zu den höchsten Fluoreszenzintensitäten (5). Im Gegensatz dazu erzeugten unvollständig komplementäre Sonden- und Testobjektkombinationen eine 1 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:2 + Sonde Nr. 3), eine aufeinanderfolgende 2 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:3 + Sonde Nr. 3), eine aufeinanderfolgende 3 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:4 + Sonde Nr. 3) und eine 3 bp Annullierung (SEQ ID NO:5 + Sonde Nr. 3) sowie Fluoreszenzintensitäten, die um 57%, 94%, 97% und 98% bei 30°C und um 47%, 79%, 92% und 91% bei 65°C geringer waren als die, die bei den perfekt gepaarten Sequenzen beobachtet wurden (5). Als die Temperatur über 65°C anstieg, nahm der Unterscheidungsgrad zwischen der perfekten Paarung und den Basenpaarfehlpaarungen ab, was den allmäh lichen Zusammenbruch der DNA-Triplexstruktur anzeigte. Bei 85°C waren die durch eine 1 bp Fehlpaarung, eine 2 bp Fehlpaarung, eine 3 bp Fehlpaarung und eine 3 bp Annullierung erzielten Fluoreszenzintensitäten um 40%, 63, 92% und 83% niedriger als die durch die perfekte Paarung erhaltene Intensität (5). Durch das Vorhandensein von YOYO-1 konnte eine ssDNA-Sonde anstelle einer PNA-Sonde verwendet werden, um zwischen perfekt komplementären Sequenzen und denjenigen, die 1 bp, 1 bp oder 3 bp Fehlpaarungen oder Annullierungen enthielten, zu differenzieren, ohne dass eine vorhergehende Denaturierung erforderlich war.
Beispiel 6
Um sicherzustellen, dass der Hybridisierungstest unter Verwendung von ssDNA-Proben und dsDNA-Testobjekten, der bei Fehlen einer vorhergehenden Denaturierung durchgeführt wird, auch für Sonden- und Testobjekt-DNAs geeignet ist, die dramatisch verschiedene GC-Anteile (somit unterschiedliche Schmelztemperaturen) besitzen, wurden neue 15-mer ssDNA-Sonden und 50-mer dsDNA-Testobjektsequenzen synthetisiert, gereinigt und gekühlt, wie vorstehend erläutert. Sowohl die ssDNA-Sonden als auch die ds-DNA-Testobjekte wurden in ddH₂O bei einer Konzentration von 1 pMol/μl gelöst.
Bei SEQ ID NO:18 handelte es sich um eine 50-mer dsDNA-Testobjektsequenz, modifiziert von SEQ ID NO:1, wobei der GC-Anteil von 30% auf 52% verändert wurde.
Die Sequenz für den Sensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:18) war: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:18) war: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCG TGG TGC TC-3'.
SEQ ID NO:19 war eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testobjektsequenz identisch mit SEQ ID NO:18 mit Ausnahme einer Einbasenpaarmutation (unterstrichen), bei der die Sequenz CAT auf CGT verändert worden war.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant SEQ ID NO:19 war: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant SEQ ID NO:19 war: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
SEQ ID NO:10 war eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testobjektsequenz identisch mit SEQ ID NO:18 mit Ausnahme einer aufeinanderfolgenden Zweibasenpaarmutation (unterstrichen), bei der die Sequenz CAT in ACT verändert worden war.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant SEQ ID NO:20 war: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant SEQ ID NO:20 war: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
SEQ ID NO:21 war eine 50-mer dsDNA-Testobjektsequenz modifiziert von SEQ ID NO:1, wobei der GC-Anteil von 30% auf 72% verändert worden war.
Die Sequenz für den Sensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:21) war: 5'-CAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:21) war: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.
SEQ ID NO:22 war eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testobjektsequenz identisch mit SEQ ID NO:21 mit Ausnahme einer Einbasenpaarmutation (unterstrichen), bei der die Sequenz CGT in CAT verändert worden war.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant SEQ ID NO:22 war: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant SEQ ID NO:22 war: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA TGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.
SEQ ID NO:23 war eine 50-mer Mutant-dsDNA-Testobjektsequenz identisch mit SEQ ID NO:21 mit Ausnahme einer aufeinander folgenden Zweibasepaarmutation (unterstrichen), bei der die Sequenz CGT in ATT verändert worden war.
Die Sequenz für den Sensestrang der Mutant SEQ ID NO:23 war: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT ATT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.
Die Sequenz für den Antisensestrang der Mutant SEQ ID NO:23 war: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA ATA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.
Sonde Nr. 4 war eine 15-mer-ssDNA-Sonde, die so ausgebildet war, dass sie vollständig komplementär zu einem 15-Nukleotidsegment des Sensestranges der 50-mer Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:18) war. Die Sonde hatte die folgende Struktur (SEQ ID NO:24):
5'-CAC CAG AGA TGA CAG-3
Sonde Nr. 5 war eine 15-mer ssDNA-Sonde, die so ausgebildet war, dass sie vollständig komplementär zu einem 15-Nukleotidsegment des Sensestranges der 50-mer Wildtyp-Test-DNA (SEQ ID NO:21) war. Die Sonde hatte die folgende Struktur (SEQ ID NO:25):
5'-CAC CAG GGA CGA CCG-3'
Die Hybridisierungsversuchsbedingungen entsprachen denen von Beispiel 4.
Als die ssDNA-Sonde Nr. 4 (mit einem GC-Anteil von 53%) zum 50-mer Wildtyp-dsDNA-Testobjekt (SEQ ID NO:18) und Mutant-dsDNA-Testobjekten (SEQ ID NO:19 und SEQ ID NO:20) hybridi siert worden war, wurden dsDNA:ssDNA-Triplexe bei niedrigen Temperaturen unter nichtdenaturierenden Bedingungen geformt (6A). Während perfekt gepaarte DNA-Triplexe die höchsten Fluoreszenzintensitäten erreichten, erzeugten unvollständig komplementäre Triplexe mit einer 1 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:19 + Sonde Nr. 4) und einer nachfolgenden 2 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:20 + Sonde Nr. 4) Fluoreszenzintensitäten, die um 63% und 95% geringer waren als die, die bei den perfekt gepaarten Sequenzen bei 30°C festgestellt wurden (6A). Als die Temperatur anstieg, trat ein allmählicher Zusammenbruch der DNA-Triplexstruktur auf, was zu verringerten Fluoreszenzintensitäten und einer geringeren Unterscheidung zwischen der perfekten Paarung und den Basenpaarfehlpaarungen führte. Bei 85°C wurde ein sehr geringer Unterschied in der Fluoreszenz zwischen perfekt gepaarten Sequenzen und denjenigen, die Basenpaarfehlpaarungen enthielten, festgestellt (6A).
In entsprechender Weise wurden in Anwesenheit von YOYO-1 dsDNA:ssDNA-Triplexe erzeugt, als die ssDNA-Sonde Nr. 5 (mit einem GC-Anteil von 73%) mit dem entsprechenden 50-mer Wildtyp dsDNA-Testobjekt (SEQ ID NO:21) und Mutant-dsDNA-Testobjekten (SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO:23) reagierte. Die Fluoreszenzintensitäten für einen DNA-Triplex mit 1 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:22 + Sonde Nr. 5) und einen aufeinanderfolgenden DNA-Triplex mit 2 bp Fehlpaarung (SEQ ID NO:23 + Sonde Nr. 5) waren um 48% und 64% niedriger als diejenigen, die bei den perfekt gepaarten Sequenzen bei 30°C erhalten wurden (6B). Die Fluoreszenz von sämtlichen Proben nahm ab, als die Temperatur von 30°C auf 85°C anstieg, was eine verringerte YOYO-1-Interkalation und einen DNA-Triplex-Zusammenbruch anzeigte.
Unabhängig vom GC-Anteil der ssDNA-Sonden und dsDNA-Testobjekte war YOYO-1 in der Lage, die DNA-Triplexerzeugung bei nichtdenaturierenden Bedingungen zu erleichtern, so dass eine genaue Unterscheidung zwischen perfekt komplementären Sequenzen und denjenigen, die 1 oder 2 bp Mutationen enthielten, möglich wurde.
Beispiel 7
Die Hybridisierungsversuche in den Beispielen 5 und 6 bewiesen die Zuverlässigkeit der Erfindung in Bezug auf die Unterscheidung zwischen Wildtyp-DNA-Sequenzen und denjenigen, die Basenpaarfehlpaarungen oder Annullierungen enthielten, ohne die Notwendigkeit einer vorhergehenden Denaturierung, unter Verwendung von ssDNA-Sonden. Bei diesen Versuchen wurde die DNA-Triplexerzeugung unter dem Schmelzpunkt der dsDNA-Testobjekte gemessen. Darüber hinaus wurde eine optimale Unterscheidung zwischen Wildtyp-Sequenzen und mutierten Sequenzen bei 30°C, der niedrigsten gemessenen Temperatur, erhalten. Um zu ermitteln, ob Temperaturen unter 30°C noch günstiger für den Versuch sind, wurde die 15-mer ssDNA-Sonde Nr. 3 mit dem 50-mer Wildtyp-dsDNA-Testobjekt (SEQ ID NO:1) oder mit dem 50-mer Mutant-dsDNA-Testobjekt (SEQ ID NO:2) zwischen 5°C und 30°C zur Reaktion gebracht.
Gemäß 7A wurden 2 pMol des dsDNA-Testobjektes mit 2 pMol der ssDNA-Sonde Nr. 3 in einem 40 μl Reaktionsgemisch, das 0,5 × TBE und 500 nM von YOYO-1 enthielt, zur Reaktion gebracht. Gemäß 7B wurden 500 fMol (d. h. 10^-15Mol) des dsDNA-Testobjektes mit 500 fMol der ssDNA-Sonde Nr. 3 in einem 40 μl Reaktionsgemisch, das 0,5 × TBE und 250 nM von YOYO-1 enthielt, zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur (21°C) 5 Minuten lang inkubiert, auf eine Quarzküvette übertragen und dann mit einem Argonlaserstrahl bei 30°C wie in den Beispielen 4-6 bestrahlt. Die die Sonden enthaltenden Küvetten wurden danach auf Eis gelagert. Als die Temperatur einer jeden Probe 2°C erreichte (bestimmt durch die in jede Probe direkt eingesetzte Temperatursonde), wurden die Proben zur Messkammer übertragen und wiederholt in Bezug auf die Fluoreszenzemission überwacht, wobei die Temperatur mit der Zeit von 5°C auf 30°C anstieg. Die maximalen Fluoreszenzintensitäten wurden in Abhängigkeit von der Temperatur für jede analysierte Probe aufgezeichnet.
Es wurde eine optimale Unterscheidung zwischen den perfekt komplementären DNA-Triplexen (SEQ ID NO:1 + Sonde Nr. 3) und den DNA-Triplexen, die eine 1 bp Fehlpaarung enthielten (SEQ ID NO:2 + Sonde Nr. 3), bei 5°C für beide getestete Konzentrationen der DNA festgestellt (7A und 7B). Der Unterschied in den Fluoreszenzintensitäten zwischen vollständig und unvollständig komplementären DNA-Triplexen variierte jedoch nicht dramatisch, als die Temperatur von 5°C auf 30°C anstieg. Bei einer Konzentration von 1pMol/20 μl von Sonde und Testobjekt führten die DNA-Triplexe mit einer 1 bp Fehlpaarung zu Fluoreszenzintensitäten, die um 84% und 77% bei 5°C und 30°C geringer waren als diejenigen, die mit den perfekt gepaarten Sequenzen er halten wurden (7A). In entsprechender Weise wurde bei einer vierfach niedrigeren Konzentration der Sonde und des Testobjektes ein Unterschied von 63% und 65% in den Fluoreszenzintensitäten bei 5°C und 30°C zwischen dem perfekt gepaarten DNA-Triplex und dem mit Fehlpaarungen versehenen DNA-Triplex festgestellt (7B). Die Fluoreszenzintensitäten sämtlicher Proben, die bei 30°C und vor und nach der Kühlung auf 5°C gemessen wurden, waren sehr ähnlich (Daten nicht gezeigt). Obwohl maximale Unterschiede bei 5°C beobachtet wurden, kann der Hybridisierungstest ohne Denaturierung auf zuverlässige Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Beispiel 8
Die Sensitivität des Hybridisierungstests wurde getestet, indem abnehmende Konzentrationen der parallelen PNA-Sonde Nr. 2 oder ssDNA-Sonde Nr. 3 mit abnehmenden Konzentrationen von 50-mer Wildtyp- oder Mutant-dsDNA-Testobjekten (SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2) unter nichtdenaturierenden Bedingungen zwischen 27°C und 32°C (8) zur Reaktion gebracht wurden.
Das Hybridisierungsreaktionsgemisch (40 μl) enthielt die folgenden Bestandteile: 20 fMol bis 2 pMol der Test-dsDNA, 20 fMol bis 2 pMol der ssDNA-Sonde Nr. 3 oder paralellen PNA-Sonde Nr. 2, 0,5 × TBE und 2,5 nM bis 500 nM YOYO-1. In jeder Probe wurden die Testsequenzen und Sondensequenzen auf identischen Konzentrationen gehalten. Die Testbedingungen waren identisch mit denen von Beispiel 4.
Als 1 pMol/20 μl der parallelen PNA Sonde Nr. 2 oder der ssDNA Sonde Nr. 3 auf 1 pMol/20 μl von dsDNA-Testsequenzen bei der normalen YOYO-1-Konzentration von 500 nM hybridisiert wurde, ergaben die dsDNA:PNA- und dsDNA:ssDNA-Triplexe, die aus einer 1 bp Fehlpaarung resultierten, Fluoreszenzintensitäten, die um 93% bis 94% und 56% bis 54% geringer waren als diejenigen, die aus den perfekt gepaarten Triplexen bei 27°C bis 32°C festgestellt wurden (Daten nicht gezeigt).
Bei einer Konzentration von 10 fMol/20 μl sowohl von der Sonde als auch von dem Testobjekt (d. h. einer 100-fach niedrigeren Konzentration) ergaben sich bei dem 1 bp fehlgepaarten dsDNA:PNA-Hybrid Fluoreszenzintensitäten, die 85% bis 83% niedriger waren als diejenigen, die von den perfekt komplementären Triplexen bei 27°C bis 32°C erhalten wurden, wenn 25 nM YOYO-1 verwendet wurden (8A). Als man 10 fMol/20 μl der ssDNA-Sonde Nr. 3 mit 10 fMol/20 μl der dsDNA-Testsequenzen in Gegenwart von 10 nM YOYO-1 reagieren ließ, waren die von einer 1 bP Fehlpaarung erzeugten Fluoreszenzintensitäten um 90% bis 84% geringer als diejenigen, die durch perfekt gepaarte DNA-Triplexe bei 27°C bis 32°C erzeugt wurden (8B), wodurch die extreme Sensitivität des Hybridisierungstests selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen von Sonde und Testobjekt nachgewiesen wurden.
Ein großer Bereich an YOYO-1-Konzentrationen wurde bei jeder getesteten Konzentration von Sonde und Testobjekt toleriert. Als 10 fMol/20 μl sowohl von der Sonde als auch von dem Testobjekt hybridisiert wurden, betrugen die optimalen Konzentrationen von YOYO-1 25 nM bis 2,5 nM (für eine pa rallele PNA-Sonde) und 10 nM bis 2,5 nM (für eine ssDNA-Sonde), was zu Differenzen der Fluoreszenzintensität von 90% bis 71% zwischen perfekt gepaarten und fehlgepaarten Sequenzen führte (Daten nicht gezeigt). Zusammen bestätigten diese Ergebnisse die extreme Sensitivität und Zuverlässigkeit des nichtdenaturierenden Hybridisierungstests zur Unterscheidung zwischen Wildtyp-Sequenzen und denjenigen, die verschiedenartige Basenpaarmutationen enthielten.
Obwohl die Erfindung vorstehend im Detail und in Verbindung mit speziellen Beispielen beschrieben wurde, versteht es sich für den Fachmann, dass diverse Änderungen durchgeführt werden können, ohne von der erfindungsgemäßen Lehre abzuweichen. Sequenzliste

Claims

Bindungstestverfahren, bei dem man: ein dsDNA umfassendes Ziel bereitstellt, eine ssDNA oder RNA umfassende Sonde, die zu wenigstens einem Teil des Ziels nicht perfekt komplementär ist, bereitstellt, ein Interkalierungsmittel bereitstellt, wobei das Interkalierungsmittel einen Fluorophor umfaßt, die Sonde, das Ziel und das Interkalierungsmittel zu einem Hybridisierungsmedium gibt, so daß eine Testprobe bereitgestellt wird, die Testprobe mit einer Anregungsstrahlung bestrahlt, um den Fluorophor dazu zu bringen, Fluoreszenzstrahlung zu emittieren, eine Intensität der Fluoreszenzstrahlung nachweist, wobei die Intensität ein direkter Hinweis auf eine Bindungsaffinität zwischen der Sonde und dem Ziel ist, die Intensität gegen von anderen Sonden in Kombination mit dem Ziel und dem Interkalierungsmittel gezeigte Intensitäten kalibriert, wobei sich diese Sonden jeweils von der Sonde um wenigstens eine Base unterscheiden, und aus der Kalibrierung ein Ausmaß an Fehlpaarung zwischen der Sonde und dem Ziel bestimmt, wobei es sich bei dem Verfahren um einen ohne PCR-Amplifikation des Ziels und ohne Denaturierung des Ziels ausgeführten homogenen Test handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Sonde und den anderen Sonden relativ zum Ziel jeweils um ein anderes Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe perfekte Paarung, Ein-Basen-Fehlpaarung, Zwei-Basen-Fehlpaarung, Drei-Basen-Fehlpaarung, Ein-Basen-Deletion, Zwei-Basen-Deletion und Drei-Basen-Deletion, handelt, vorausgesetzt, daß die Sonde nicht die perfekte Paarung sein kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei das Verfahren ohne Bereitstellung eines signalquenchenden Mittels auf dem Ziel oder auf der Sonde ausgeführt wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Sonde spezifisch mit dem Ziel unter Ausbildung eines Triplex hybridisiert.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Interkalierungsmittel kovalent an die Sonde gebunden wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei dem Interkalierungsmittel um ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe YOYO-1, TOTO-1, Ethidiumbromid, Ethidium-Homodimer-1, Ethidium-Homodimer-2 und Acridin, handelt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Anregungsstrahlung von einem Argonionenlaser mit einer Wellenlänge von etwa 200 nm bis etwa 1000 nm emittiert wird.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Testprobe ein Volumen von etwa 20 Mikrolitern mit etwa 10 Femtomolen Ziel und etwa 10 Femtomolen Sonde aufweist.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei eine Konzentration des Ziels und/oder der Sonde nicht mehr als 5 × 10^-10 M beträgt.