JP4041867B2 - 蛍光インターカレータを用いた溶液中の二本鎖および三本鎖核酸ハイブリダイゼーションの蛍光強度測定法 - Google Patents
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Description
(発明の背景)
1.発明の属する技術分野
本発明は、核酸を配列決定または測定する方法に関し、詳細には、蛍光強度測定値を使用して三本鎖および二本鎖核酸ハイブリッド形成複合体を測定する方法に関する。
【0002】
2.関連技術の記載
蛍光染料は核酸を検出および定量化するために過去数十年間使用されてきた。蛍光染料の最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定は、通常、蛍光発色団を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善している。
【0003】
例えば、Livakらに付与された米国特許第5,538,848号およびMaggioに付与された第4,220,450号は、溶液中でオリゴヌクレオチドプローブを使用した、ヌクレオチド配列の均質蛍光に基づく測定法を開示している。しかしながら、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブによって生成される信号を区別するために、消光剤をリポーター剤と組み合わせて使用することが必要である。Livakらは、開示した方法において、酵素の使用も必要としている。消光剤と酵素によって、開示した方法に複雑さと費用が増している。
【0004】
Kidwellに付与された米国特許第5,332,659号は、少なくとも2つの蛍光発色団部分を有するプローブを使用して、溶液中のヌクレオチド配列を検出する方法を開示している。蛍光発色団は、自身のスペクトルの波長依存性を変えるのに十分なほど接近している時に互いに電子的に相互作用するように、選択されなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハイブリダイズしたプローブよりもはるかに柔軟性がある。従って、各プローブ上の2つの蛍光発色団部分は、プローブがハイブリダイズしている時よりもプローブがハイブリダイズしていない時に、互いに接近する可能性が高い。したがって、自由プローブに関連する放射波長の変化を、試料中の自由プローブの量の指標としてモニタすることが可能である。
【0005】
Wuらに付与された米国特許第5,846,729号も、核酸ハイブリッド形成のための均質蛍光に基づく測定法を開示している。
測定法の中には、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間への蛍光発色団の結合能に基いて、核酸ハイブリッド形成を検出するインターカレータ(挿入剤)蛍光発色団を使用しているものもある。
【0006】
例えばBurkeらに付与された米国特許第5,824,557号は、核酸分子を検出し定量化する方法およびキットを開示している。好ましい実施形態は、二本鎖核酸ヘリックスあるいは一本鎖核酸に染料を挿入することに依存している。染料は挿入後に蛍光を発するが、その強度は試料中に存在する核酸の量の直接測定値である。Burkeらの方法は、試料中の核酸の量を測定するのに役立つと伝えられているが、該方法の基礎となっている挿入剤と核酸間の非特異的結合は、該方法を(特に標的でない核酸二本鎖が存在する条件下での)特異的結合の検出に対して非実用的なものとしている。
【0007】
Ishiguroらに付与された米国特許第5,814,447号は、Burkeらの測定法のような挿入剤と核酸二本鎖間の非特異的相互作用に基づく測定法や、Ishiguroらによって日本国特許公報第237000号(1993年)に記述された以前の測定法よりも優れた改良を与える測定法を開示している。初期の開発は、標的核酸の特定領域がPCRによって増幅する前に試料溶液に挿入された時に蛍光強度の増大を示す傾向を有する挿入剤蛍光色素を添加することと、増幅前に標的核酸を検出かつ定量化するために反応溶液からの蛍光強度を所定の時間間隔で測定することから成っていた。’447特許は、プローブが挿入剤蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該挿入剤蛍光色素は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ間の相補的結合部分に挿入されることを特徴とする、改良された特異性を有する測定法を与えることにより、以前の開発より優れた改良を行うことを試みた。
【0008】
蛍光強度を検出する上述の開発に加えて、ある者は、蛍光偏光測定法の利点を推薦した。しかしながら、偏光に基づく測定法には重大な欠点がある。結合の関数としての偏光の変化の程度は予測不能であることがあり、一貫しないデータを理論期待値に一致させるデータの解釈では、特に該方法が自動化される場合、分析法で望まれる努力よりも多くの努力が要求され得る。
【0009】
以上の開発にもかかわらず、核酸および/または核酸類似体の間の相互作用を分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分野では依然として必要とされている。
【0010】
本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
(発明の概要)
本発明は、
少なくとも1つの核酸配列を有する標的を提供する工程と;
前記標的の少なくとも1部分に対して不完全に相補的な核酸または核酸の類似体配列を有するプローブを提供する工程と;
挿入剤を提供する工程であって、前記プローブか前記挿入剤のいずれかが蛍光発色団を有する工程と;
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を加えて、測定用試料を提供する工程と;
前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と;
前記プローブおよび前記標的の間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光性の放射線の強度を検出する工程と;
前記強度から前記プローブおよび前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と;から成る、結合を測定する方法を提供する。
【0011】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
本発明は、標的とプローブ間の結合を測定する、迅速で、感度が高く、環境にやさしくて、安全な方法を提供する。標的は核酸配列または核酸類似体配列を有し、プローブは核酸配列または核酸類似体配列を有する。
【0012】
特定の先行技術と異なり、本発明はハイブリダイゼーションの存在を検出するだけでなく、プローブと標的間のハイブリダイゼーションの性質に関する定性的・定量的情報を提供する。従って、従事者は、完全対合、1つの塩基対誤対合、2つの塩基対誤対合、3つの塩基対誤対合、1つの塩基対欠失、2つの塩基対欠失および3つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
【0013】
本発明の実施形態は、第1のプローブ標的混合物について測定した蛍光強度を、同じ標的および同じ挿入剤と結合した他のプローブによって示された強度に対して較正することから成る。ここで、他のプローブの各々は、少なくとも1つの塩基だけ、第1のプローブと異なっている。本発明の方法で検出される蛍光強度は、プローブと標的間の結合親和性が増すにつれて増大する。本発明の方法は、蛍光異方性の方法とは異なり、蛍光の偏光の測定を必要としない。
【0014】
強度が標的とプローブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤対合の性質(A−G対A−C対T−G対T−Cなど)、ハイブリダイゼーション複合体の内部の誤対合の位置等と共に変化するために、本発明の測定方法を、標的の配列決定を行うために使用することが可能である。
【0015】
本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様々な用途に有用であり得る。
【0016】
先行技術の方法と異なり、本発明の測定法は好ましくは均質である。測定は、蛍光強度検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複合体を分離せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。さらに、測定は、均質な溶液で好ましくは行われ、これは非結合プローブから、ろ過と多数回の洗浄ステップまたはゲル電気泳動により結合複合体を分離する必要をなくす。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化できる。さらに、結合測定法は、緩衝液、pH、イオン濃度、温度、インキュベーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数を、速やかに決定することを可能である。
【0017】
さらに、本発明の測定法は、標的上のまたはプローブ上にシグナル消光剤を提供せずに、好ましくは行われる。
本発明の好ましい実施形態は、特にプローブと二本鎖標的間の三本鎖ハイブリダイゼーションを検出し、標的を変性する必要性をなくす。PNA(ペプチド核酸)プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られているが(例えばEgholmら、365 Nature 566 (1993)、Tomacら、118 J.Am.Chem.Soc. 5544(1996)参照)、本願発明者は該PNAプローブが一本鎖核酸(例えばssDNAおよびRNA)プローブと二本鎖核酸(例えばdsDNA)標的との間に形成された三本鎖を特に測定できることに驚いた。
【0018】
本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばssDNA、RNA、PNA、荷電していないバックボーンを有する他の核酸類似体が含まれる。8個から20個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれが、原始核生物および真核生物のうちの最小の固有DNA配列が見出される範囲だからである。12〜18個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、6〜30塩基から成るプローブが好まれ、15塩基が最も好まれる。しかしながら、ヌクレオチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい。
【0019】
本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかる放射性のプローブの使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましくは、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成または注文し、保存することが可能である。
【0020】
本願発明者は、平行PNAプローブが従来通りに合成された逆平行PNAプローブよりも優れた性能を有することを発見したことにも驚いた。核酸標的配列の長さがPNAプローブの3倍を超える場合、平行・逆平行PNAプローブは、完全対合の核酸ハイブリッド形成複合体と、1塩基対、2塩基対または3塩基対誤対合を含む核酸ハイブリッド形成複合体とを区別するのに等しく有効であった。しかしながら、標的DNA配列の長さがPNAプローブ配列の長さと同じだった場合(つまり15ヌクレオチド長)、完全対合複合体と1または2塩基誤対合複合体との間に観察された蛍光強度の差がより大きいが故に、平行PNAプローブが逆平行PNAプローブよりもずっと好まれた。
【0021】
そのような条件下で平行PNAプローブが好まれる正確なメカニズムはわかっていないが、上記の観察は、誤対合平行PNA:DNAハイブリダイゼーション複合体は、類似の誤対合逆平行PNA:DNAハイブリッドほど安定しておらず、そのため核酸挿入剤の挿入が少なく、観察される蛍光強度の値がより低いことを示唆している。
【0022】
プローブと標的は共に標識されていないことが好ましい。しかし、代替実施形態では、プローブに挿入剤が共有結合により結び付けられる。そのような実施形態では、挿入剤は、プローブのいずれかの端部に好ましくは結び付けられる。
【0023】
別の実施形態では、挿入剤はプローブに共有結合によっては結び付けられないが、非共有結合の様式でプローブに結合するという意味で、挿入剤を測定中にプローブと標的の間に挿入することができる。
【0024】
本発明で使用される好ましい挿入剤としては、例えばYOYO−1(登録商標、一般名:1,1’‐(4,4,8,8‐テトラメチル‐4,8‐ジアザウンデカメチレン)‐ビス‐4‐[3‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐(ベンゾ‐1,3‐オキサゾール)‐2‐メチリデン)‐キノリニウムテトラヨーダイド]、TOTO−1(登録商標、一般名:1,1’‐(4,4,8,8‐テトラメチル‐4,8‐ジアザウンデカメチレン)‐ビス‐4‐[3‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐(ベンゾ‐1,3‐チアゾール)‐2‐メチリデン)‐キノリニウムテトラヨーダイド]、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−1、エチジウムホモ二量体−2、およびアクリジンが含まれる。一般に、挿入剤は、二本鎖および/または三本鎖の核酸複合体の鎖の間に挿入可能な部分である。好ましい実施形態では、挿入剤(またはその構成要素)は、核酸がない状態では本質的に非蛍光性であり、適切な波長の放射線によって挿入および励起された時には蛍光を発し、二本鎖または三本鎖の核酸複合体に挿入された時には100倍〜10,000倍の蛍光の増強を示す。
【0025】
代替実施形態では、挿入剤は、適切な波長の放射線により挿入および励起された時に、蛍光波長の変化を示し得る。正確な蛍光波長は、挿入される核酸の構造に依存し得る(例えば、DNA対RNA、二本鎖対三本鎖等)。
【0026】
励起波長は、使用されている蛍光発色団の励起最大値に対応させるために、(日常的な実験および/または慣習的な知識によって)選択され、好ましくは200〜1000nmである。挿入剤は200〜1000nmの発光波長を有するように好ましくは選択される。好ましい実施形態では、400〜540nmの波長を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用され、蛍光の放出は500〜750nmの範囲で検出される。
【0027】
本発明の測定法は、例えば5〜85℃のような種々の温度にわたって行うことが可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低い温度(例えば25℃未満の温度)で行うことが可能である。
【0028】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニン・シトシン含量には依存しない。A−T塩基対が2つの水素結合しか形成しない一方でG−C塩基対は3つの水素結合を形成するため、より高いGまたはC含量を有する標的配列およびプローブ配列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハイブリッド中に存在するGC含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のGC含量を増加させる塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合の弱さを相殺し得る。プローブと標的間の考えられるすべての塩基対誤対合を含むハイブリダイゼーション複合体は、完全に対合したハイブリッドよりも不安定であることが分かっており、その結果、常に、完全に相補的なハイブリッドよりも蛍光強度が低い。
【0029】
本発明の測定法は非常に感度が高く、そのため、標的のPCR増幅を行う必要性がない。例えば、体積が約20μlの測定用試料(約10フェムトモルの標的と約10フェムトモルのプローブを含む)を測定することが可能である。本発明の実施形態は、5×10−9Mの濃度、好ましくは多くて5×10−10Mの濃度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は5X10−9Mの濃度、好ましくは多くて5×10−10Mの濃度のプローブを使用するように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
【0030】
ハイブリダイゼーション媒質はヌクレオチドを保存するのに適していることで知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばSambrookら, ”Molecular Cloning: A Lab Manual,”第2巻(1989年)を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。
【0031】
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度および緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を適用する方法は、当該技術分野で周知である。
【0032】
約15℃〜約25℃の温度、約1分〜約5分間で、ハイブリダイゼーション複合体を形成することが好まれる。それより長い反応時間は必要でないが、数時間インキュベーションしたとしてもハイブリダイゼーション複合体には悪影響を及ぼさないだろう。
【0033】
適切な蛍光挿入剤が反応混合物に含まれていると仮定すれば(先に論じたように)、ほとんどの場合では、他の促進試薬は要求されない。しかしながら、ある試薬の使用によって、溶液でのハイブリダイゼーションを促進することは可能である。そのような試薬の好ましい例としては、Rec Aタンパク質、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌(E.coli)一本鎖結合タンパク質、核酸主溝または核酸小溝結合タンパク質;二価イオン;多価イオン;ビオロゲン;ならびに臭化エチジウム、アクチノマイシンD、ソラレンおよびアンゲリシン等の挿入物質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なpHレベルや極端な高温下での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
【0034】
本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
【0035】
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことを理解すべきである。
本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す以下の図面に関連付けて説明する。
【0036】
(実施例)
実施例1
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン10由来のセンスとアンチセンス50mer ssDNA標的配列(Nature 380 207(1996年))を、DNA合成装置(Expedite 8909,PerSeptive Biosystems)で合成し、HPLCにより精製した。等モルの量の相補的オリゴヌクレオチドを95℃で10分間変性し、温度が21℃まで1.5時間にわたって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。dsDNAオリゴヌクレオチドを、1 pmole/μlの濃度でddH2Oに溶解した。
【0037】
野生型標的DNAのセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号1):5’−TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA−3’。
【0038】
野生型標的DNAのアンチセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号1):5’−TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA−3’。
【0039】
50merの変異型dsDNA標的配列は、アミノ酸507位置の野生型配列CATがCGTに変化する1つの塩基対変異(下線)を除いて、野生型標的DNA(配列番号1と同じになるように調製した。
【0040】
この50mer標的配列のセンス鎖は、以下の配列を有していた(配列番号2):5’−TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA−3’。
【0041】
この50mer標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた(配列番号2):5’−TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA−3’。
【0042】
50mer変異型dsDNA標的配列は、アミノ酸506,507位置の野生型配列CATがACTに変化する連続する2つの塩基対変異(下線)を除いて、野生型標的DNA(配列番号1)と同じになるように調製した。
【0043】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号3);5’−TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA−3’。
【0044】
この標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号3):5’−TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA−3’。
【0045】
50mer変異型dsDNA標的配列は、アミノ酸506,507位置の野生型配列CATがACGに変化する連続する3つの塩基対変化(下線)を除いて、野生型標的DNA(配列番号1)と同じになるように調製した。
【0046】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号4):5’−TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACG CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA−3’。
【0047】
この標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた(配列番号4):5’−TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGC GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA−3’
【0048】
47mer変異型dsDNA標的配列は、アミノ酸507,508位置での野生型配列CTTが欠失する連続する3つ塩基対欠失(省略記号で示した)を除いて、野生型標的DNA(配列番号1)と同じになるように調製した。
【0049】
この47mer標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号5):5’−TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT ・・・TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA−3’。
【0050】
この47mer標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた(配列番号5):5’−TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA・・・A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA−3’。
【0051】
実施例で使用するPNA(ペプチド核酸)プローブを合成し、HPLCで精製し、Commonwelth Biotechnologies社(米国バージニア州リッチモンド所在)の質量分析法により確認した。PNAプローブは、最初、10mg/ml濃度になるよう0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)に溶解し、次に、ddH2Oの追加により1mg/mlまで希釈した。最終PNA溶液は1pmole/μlの濃度(ddH2O溶液)に調製した。
【0052】
第1番プローブは、50mer野生型標的DNA(配列番号1)のセンス鎖の15ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された15mer逆平行PNAプローブだった。第1番プローブは、アミノ酸505〜510位置(Nature 380、207(1996年)がオーバラップしている。第1番プローブは以下の構造(配列番号6)を有していた:5’−H−CAC CAA AGA TGA TAT−Lys−CONH2−3’。
【0053】
第2番プローブは、第1番プローブと配列が同じ15merPNAプローブであったが、逆平行方向の配置ではなく、平行方向の配置であった。第2番プローブは以下の構造(配列番号7)を有していた:5’−H−TAT AGT AGA AAC CAC−Lys−CONH2−3’。
【0054】
各ハイブリダイゼーション反応混合物(80μl)は下記を含有していた:4pmolesの標的dsDNA、4pmolesのPNAプローブ、0.5×TBE、および500nMのDNA挿入剤YOYO−1(Molecular Probes、米国オレゴン州ユージーン所在)。反応混合物は変性するために5〜10分間、95℃でインキュベートし、次に、測定まで80℃に維持した。試料を石英キュベットに入れ、488nmの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、温度が経時的に減少するにつれ、蛍光放出について繰り返しモニタした。同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達成された。最大蛍光強度は540nmの波長で生じたが、これはPNA:DNAハイブリッドへYOYO−1が挿入されたことを示している。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【0055】
DNAまたはPNAが存在しない時(YOYO−1のみ)、または野生型配列番号1、変異型配列番号2もしくは変異型配列番号3が第1番の逆平行PNAプローブの番号1または第2番の平行PNAプローブと反応した時に観察される蛍光強度を図1A,1Bにそれぞれ示す。完全に相補的な配列(配列番号1+第1番のプローブ)から成るSSDNA:PNAハイブリッドは、最大のYOYO−1挿入を許容し、これにより最も高い蛍光強度が生じた。この蛍光強度は、温度の減少とともに増加した(図1A)。1つの塩基対が誤対合したssDNA:PNAハイブリッド(配列番号2+第1番プローブ)および2塩基対が誤対合したssDNA:PNAハイブリッド(配列番号3+第1番プローブ)の蛍光強度は、60℃では完全対合のssDNA:PNAハイブリッドよりもそれぞれ81%および89%だけ低かった(図1A)。同様に、第2番の平行PNAプローブを標的DNA配列にハイブリダイズした場合には、1塩基対および2塩基対誤対合ssDNA:PNAハイブリッドは、60℃では完全に相補的なssDNA:PNAハイブリッド(配列番号1+第2番プローブ)よりもそれぞれ70%および86%だけ低い蛍光強度を示した(図1B)。プローブと標的間の誤対合の程度が増加するにつれて、YOYO−1による挿入のレベルは減少した。従って、蛍光強度のレベルは減少した。使用されたプローブが逆平行であったか平行であったかに関係なく、この関係は保持された。
【0056】
興味深いことに、標的DNA配列がPNAプローブ配列と同じ長さだった時(つまり15ヌクレオチド長の時)は、完全対合複合体と1または2塩基対誤対合複合体との間に観察される蛍光強度の差がより大きくなるために、平行PNAプローブが逆平行PEAプローブよりもずっと好まれた(データは図示しない)。
【0057】
平行PNAプローブがそのような条件下で好まれる正確なメカニズムはわかっていないが、以上の観察は、誤対合平行PNA:DNAハイブリダイゼーション複合体は類似の誤対合逆平行PNA:DNAハイブリッドほど安定でなく、核酸挿入剤の挿入が減少し、それ故により低い蛍光強度が観察されることを示唆している。
【0058】
(実施例2)
図2は、本発明のハイブリダイゼーション測定法により、平行PNAプローブを使用した場合に、完全対合ssDNA:PNAハイブリッドと、1,2,3bp誤対合および3bp欠失を含むssDNA:PNAハイブリッドとを区別することができることを実証する。測定条件は、実施例1に記述したのと同じであった。1bp誤対合のssDNA:PNAハイブリッド(配列番号2+第2番プローブ)、連続する2bp誤対合のssDNA:PNAハイブリッド(配列番号3+第2番プローブ)、連続する3bp誤対合のssDNA:PNAハイブリッド(配列番号4+第2番プローブ)、3bp欠失のssDNA:PNAハイブリッド(配列番号5+第2番プローブ)の蛍光強度は、完全対合のssDNA:PNAハイブリッド(配列番号1+第2番プローブ)よりも、60℃では、41%、71%、87%、95%だけ低かった。70℃から60℃まで温度が下がるにつれて、完全対合ハイブリッドと種々の塩基対誤対合ハイブリッド間の差の程度は増加した。実施例1のように、プローブと標的間の誤対合の程度の増加により、蛍光強度のレベルは次第に小さくなった。さらに、変異型配列が野生型配列よりも高いGC含量を示した時でさえ、この蛍光パターンは一貫していた(図2)。
【0059】
平行PNAプローブを使用した場合、離散型2bp誤対合ハイブリッド(2つの1bp誤対合を3塩基対だけ離した)は、連続型2bp誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった(データは図示しない)。同様に、離散型3bp誤対合ハイブリッド(3つの1bp誤対合を3つの塩基対だけ各々離した)は、連続型3bp誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった(データは図示しない)。これらの結果は、離散型塩基対誤対合では連続型塩基対誤対合よりも、ssDNA:PNAハイブリッド形成がより崩壊し易いことを示唆している。
【0060】
(実施例3)
配列番号8は、第1番プローブに完全に相補的になるように設計された、配列番号1に由来する15mer dsDNA標的配列であった。配列番号9〜配列番号17は、1塩基対の変化(下線)を除いて野生型の配列番号8と同一な、15merの変異型dsDNA標的配列であった。センスとアンチセンスの15mer ssDNA配列を、上述のように合成し、精製し、アニールした。dsDNAオリゴヌクレオチドを、1pmole/μlの濃度でddH2Oに溶解した。
【0061】
野生型標的DNA(配列番号8)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT TTG GTG−3’であった。
野生型標的DNA(配列番号8)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAA AGA TGA TAT−3’であった。
【0062】
変異型標的DNA(配列番号9)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCT TCT TTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号9)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAA AGA AGA TAT−3’であった。
【0063】
変異型標的DNA(配列番号10)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT TTC GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号10)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC GAA AGA TGA TAT−3’であった。
【0064】
変異型標的DNA(配列番号11)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TGT TTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号11)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAA ACA TGA TAT−3’であった。
【0065】
変異型標的DNA(配列番号12)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT ATG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号12)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAT AGA TGA TAT−3’であった。
【0066】
変異型標的DNA(配列番号13)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT CTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号13)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAG AGA TGA TAT−3’であった。
【0067】
変異型標的DNA(配列番号14)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT GTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号14)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAC AGA TGA TAT−3’であった。
【0068】
変異型標的DNA(配列番号15)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCG TCT TTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号15)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAA AGA CGA TAT−3’であった。
【0069】
変異型標的DNA(配列番号16)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TTT TTG GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号16)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC CAA AAA TGA TAT−3’であった。
【0070】
変異型標的DNA(配列番号17)のセンス鎖の配列は5’−ATA TCA TCT TTT GTG−3’であった。
変異型標的DNA(配列番号17)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC AAA AGA TGA TAT−3’であった。
【0071】
15mer野生型目標dsDNA(配列番号8)および考えられるあらゆるタイプの1bp誤対合を生成する種々の15mer 1bp変異dsDNA(配列番号9〜配列番号17)と第2番の平行PNAプローブを反応させることにより、ハイブリダイゼーションアッセイの特異性についてさらに試験した(図3)。測定条件は実施例1に記述したのと同一にした。
【0072】
最も高い蛍光強度を、すべての試験温度で、完全に相補的な配列から成るssDNA:PNAハイブリッドに関して達成した。温度の減少とともに、蛍光は増大した。1bpのT−T、C−C、G−G、A−A、C−A、G−A、G−TおよびC−T誤対合を生じるssDNA:PNAハイブリッドはすべて、完全対合のssDNA:PNAハイブリッドで観察された蛍光強度よりも低い蛍光強度を生じた(図3Aおよび3B)。1bp誤対合に対する蛍光強度は、完全対合で観察された蛍光強度よりも、55℃と75℃のそれぞれにおいて、64%〜96%だけ、および57%〜95%だけ低かった。平行PNAプローブを使用した場合(図3)、種々の1bp誤対合間で観察された蛍光強度の変化は、変異型配列のGC含量パーセントの変化よりも特定の塩基対誤対合の方に依存していた。同様の実験で第1番の逆平行PNAプローブを試験した場合、完全対合と種々の1bp誤対合間で観察される蛍光強度の差は、第2番の平行PNAプローブを用いて達成される蛍光強度の差ほど劇的ではなく、温度の影響を受けるようであった(データは図示しない)。逆平行PNAプローブを使用した時、測定は40℃と60℃の間で最良の結果を生じた。したがって、標的DNA配列がPNAプローブ配列と同じ長さである場合には、平行PNAプローブが好まれる。
【0073】
図3の結果により、あらゆる1bp誤対合を高い精度で同定するための、ハイブリダイゼーション測定法の信頼性が確認された。
(実施例4)
実施例1〜3のハイブリダイゼーションアッセイを、dsDNA標的配列の変性と、dsDNA標的の融点(Tm)を超える温度でのssDNA:PNAハイブリッド形成測定後に行った。この実施例では、予めの変性を必要とせずに完全対合と塩基対誤対合と区別するための、本発明のアッセイの信頼性を実証する。
【0074】
ハイブリダイゼーション反応混合物(120μl)は下記のものを含んでいた:6pmolesの標的dsDNA、6pmolesの第2番平行PNAプローブ、0.5×TBEおよび500nMのDNA挿入剤YOYO−1。反応量は実施例1〜3のものよりもわずかに大きかったが、DNA、PNA、およびYOYO−1の量は、試料の濃度を一定に維持するように対応して調節された。反応量が40μl、80μlまたは120μlの時、同一の結果が得られた。反応混合物を室温(21℃)で5分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、488nmの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、加熱室で温度が経時的に増加するにつれて蛍光放出について繰り返しモニタした。試料の同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達成された。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【0075】
図4は、野生型50mer dsDNA標的配列(配列番号1)を30℃〜85℃で15merの第2番平行PNAプローブと反応させた時に、前もって変性しなくても最も高い蛍光強度が達成されたことを説明する。50mer野生型dsDNAのTmである65℃より低い温度では、dsDNA:PNA三本鎖が形成された。65℃を超えて温度が上昇されるにつれて、三本鎖構造が、ssDNA:PNA二本鎖に変換された。YOYO−1を三本鎖構造と二本鎖構造の両方で効率的に挿入できることは明らかであった。従って、1bp誤対合dsDNA:PNA三本鎖(配列番号2+第2番プローブ)、連続する2bp誤対合三本鎖(配列番号3+第2番プローブ)、連続する3bp誤対合三本鎖(配列番号4+第2番プローブ)および3bp欠失三本鎖(配列番号5+第2番プローブ)の蛍光強度は、完全対合dsDNA:PNA三本鎖(配列番号1+第2番プローブ)よりも、それぞれ83%、93%、99%、99.5%だけ低かった。温度が30℃から85℃まで増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度が減少した。85℃で、1bp誤対合、2bp誤対合、3bp誤対合および3bp欠失ハイブリッドの蛍光強度は、完全に相補的な配列で観察された蛍光強度よりも、それぞれ65%、76%、94%、95%だけ低かった。したがって、本発明のハイブリダイゼーションアッセイは、配列を予め変性しなくても、野生型配列と、1bp、2bpまたは3bp変異もしくは欠失を含む配列とを区別することができる。
【0076】
(実施例5)
第3番プローブは、第1番の15mer逆平行PNAプローブと配列および方向が同じ15mer ssDNAプローブであった(配列番号6)。第3番プローブは5’−CAC CAA AGA TGA TATー3’の構造を有していた。
【0077】
ハイブリダイゼーションアッセイの特異性を、予め変性を行わずに、50mer野生型および変異型dsDNA標的配列と第3番ssDNAプローブを反応させることにより、さらに検査した。アッセイ条件は、実施例4に記述したのと同じにした。
【0078】
DNA挿入剤YOYO−1で増強し、dsDNA:ssDNA三本鎖を30℃〜65℃の間で形成した。配列番号1+第3番プローブから成る完全対合のDNA三本鎖は、最も高い蛍光強度を生じた(図5)。これに対して、1bp誤対合(配列番号2+第3番プローブ)、連続する2bp誤対合(配列番号3+第3番プローブ)、連続する3bp誤対合(配列番号4+第3番プローブ)および3bp欠失(配列番号5+第3番プローブ)を生成する不完全に相補的なプローブと標的の組み合わせでは、完全対合の配列で観察されたのよりも、30℃でそれぞれ57%,94%,97%,98%,65℃で47%,79%,92%,91%だけ蛍光強度が低下した(図5)。温度が65℃を超えて増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度は減少した。これはDNA三本鎖構造の徐々の分解を示す。85℃で、1bp誤対合、2bp誤対合、3bp誤対合、および3bp欠失によって達成された蛍光強度は、完全対合によって得られた蛍光強度よりも、40%,63%,92%,83%だけ低かった(図5)。YOYO−1の存在によって、予め変性を行う必要なく、完全に相補的な配列と1bp、2bpまたは3bp誤対合または欠失を含む配列とを区別するために、PNAプローブの代りにssDNAプローブを使用することができた。
【0079】
(実施例6)
予め変性を行わずにssDNAプローブおよびdsDNA標的を使用して行うハイブリダイゼーションアッセイが劇的に異なるGC含量パーセント(従って異なる溶融温度)を有するプローブと標的DNAにも適用されることを保証するために、新たな15mer ssDNAプローブと50mer dsDNA標的配列を、上述のように合成、精製、アニールした。ssDNAプローブとdsDNA標的は共に1pmole/μlの濃度でddH2Oに溶解した。
【0080】
配列番号18は、配列番号1から改変(GC含量パーセントを30%から52%に変更)した50mer dsDNA標的配列であった。
野生型標的DNA(配列番号18)のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
【0081】
野生型標的DNA(配列番号18)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC− 3’であった。
【0082】
配列番号19は、配列CATをCGTに変更した1つの塩基対変化(下線)を除いて配列番号18と同一の、50mer変異型dsDNA標的配列だった。
変異型配列番号19のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
【0083】
変異型配列番号19のアンチセンス鎖の配列は5’−CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC−3’であった。
【0084】
配列番号20は、配列CATをACTに変更した連続する2つの塩基対変化(下線)を除いて配列番号18と同一の、50mer変異型dsDNA標的配列だった。
【0085】
変異型配列番号20のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
【0086】
変異型配列番号20のアンチセンス鎖の配列は5’−CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC−3’であった。
【0087】
配列番号は、配列番号1から改変(GC含量パーセントを30%から72%まで変更)した50mer dsDNA標的配列であった。
野生型標的DNA(配列番号21)のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG−3’であった。
【0088】
野生型標的DNA(配列番号21)のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC−3’であった。
【0089】
配列番号22は、配列CGTをCATに変更した1つの塩基対変化(下線)を除いて配列番号21と同一の、50mer変異型dsDNA標的配列であった。
変異型配列番号22のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG−3’であった。
【0090】
変異型配列番号22のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA TGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC−3’であった。
【0091】
配列番号23は、配列CGTをATTに変更した連続する2つの塩基対変化(下線)を除いて配列番号21と同一の、50mer変異型dsDNA標的配列であった。
【0092】
変異型配列番号23のセンス鎖の配列は5’−GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT ATT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG−3’であった。
【0093】
変異型配列番号23のアンチセンス鎖の配列は5’−CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA ATA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC−3’であった。
【0094】
第4番のプローブは、50mer野生型標的DNA(配列番号18)のセンス鎖の15ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された15mer ssDNAプローブであった。該プローブは以下の構造(配列番号24)を有していた:5’−CAC CAG AGA TGA CAG−3’。
【0095】
第5番のプローブは、50mer野生型標的DNA(配列番号21)のセンス鎖の15ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された15mer ssDNAプローブであった。該プローブは以下の構造(配列番号25)を有していた: 5’−CAC CAG GGA CGA CCG−3’。
【0096】
ハイブリダイゼーションアッセイ条件は実施例4に記述したのと同一とした。
第4番ssDNAプローブ(GC含量53%)を、50mer野生型dsDNA標的(配列番号18)および変異型dsDNA標的(配列番号19および配列番号20)にハイブリダイズさせた時、非変性条件下の低温でdsDNA:ssDNA三本鎖が生じた(図6A)。
【0097】
完全対合のDNA三本鎖が最も高い蛍光強度を達成する一方で、1bp誤対合(配列番号19+第4番プローブ)および2bp誤対合(配列番号20+第4番プローブ)を有する不完全に相補的な三本鎖は、完全対合の配列で観察される蛍光強度よりも、30℃でそれぞれ63%,95%だけ低い蛍光強度を生じた(図6A)。温度が増加するにつれて、DNA三本鎖構造の分解が徐々に起こり、蛍光強度が減少し、完全対合と塩基対誤対合間の蛍光強度の差が小さくなった。85℃では、完全対合配列と塩基対誤対合を含む配列の間には、蛍光の差はほとんど見い出されなかった(図6A)。
【0098】
同様に、YOYO−1の存在下で、第5番ssDNAプローブ(GC含量73%)を対応する50mer野生型dsDNA標的(配列番号21)および変異型dsDNA標的(配列番号22および配列番号23)と反応させた時、dsDNA:ssDNA三本鎖が形成された。
【0099】
1bpの誤対合DNA三本鎖(配列番号22+第5番プローブ)および連続する2bpの誤対合DNA三本鎖(配列番号23+第5番プローブ)の蛍光強度は、完全対合配列より得られる蛍光強度よりも、30℃でそれぞれ48%,6%だけ低かった(図6B)。温度が30℃から85℃pまで増加するとともに、すべての試料の蛍光は減少したが、これはYOYO−1の挿入が減少し、DNA三本鎖が分解したことを示している。
【0100】
ssDNAプローブおよびdsDNA標的のGC含量パーセントにかかわらず、YOYO−1は非変性条件下でのDNA三本鎖の形成を促進することができ、完全に相補的な配列間と、1または2bpの変異を含む配列との間の、正確な区別を可能にした。
【0101】
(実施例7)
実施例5,6におけるハイブリダイゼーションアッセイは、ssDNAプローブを使用して、予め変性する必要なく、野生型DNA配列と、塩基対誤対合または欠失を含む配列との間を識別する本発明の信頼性の高さを証明した。そのようなアッセイは、dsDNA標的の融点未満のDNA三本鎖の形成を測定した。さらに、野生型配列と変異配列間の最適な差は、測定した中で最も低温である30℃で達成された。30℃より低い温度がアッセイに対してさらに有益かどうか決定するために、第3番15mer ssDNAプローブを、5℃〜30℃の間で50mer野生型dsDNA標的(配列番号1)または50mer変異型dsDNA標的(配列番号2)と反応させた。
【0102】
図7Aでは、2pmolesのdsDNA標的を、0.5×TBEおよび500nMのYOYO−1を含む40μl反応混合物中の2pmolesの第3番ssDNAプローブと反応させた。図7Bでは、500fmoles(つまり10−15モル)のdsDNA標的を、0.5×TBEおよび250nMのYOYO−1を含む40μl反応混合物中の500fmolesの第3番ssDNAプローブと反応させた。反応混合物を、5分間室温(21℃)でインキュベートし、石英キュベットに移し、実施例4〜6で行ったように30℃でアルゴンイオンレーザービームで照射した。続けて、試料を含むキュベットを氷上に置いた。各試料の温度が20℃(各試料内に直接入れた温度プローブによって決定)に達したら、試料を測定チャンバに移し、温度が5℃から30℃まで増加するにつれて蛍光放出に対して繰り返しモニタした。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【0103】
完全に相補的なDNA三本鎖(配列番号1+第3番プローブ)と1bp誤対合を含むDNA三本鎖(配列番号2+プローブ3番)との間の最適な差は、試験した両方のDNA濃度について5℃で観察された(図7A,7B)。しかしながら、温度が5℃〜30℃まで増加するにつれ、完全および不完全に相補的なDNA三本鎖間の蛍光強度の差は、劇的には変わらなかった。プローブと標的が共に1pmole/20μl濃度の場合、1bp誤対のDNA三本鎖の蛍光強度は、完全対合配列で得られる蛍光強度より84%,77%低かった(図7A)。同様に、プローブと標的が4倍低い濃度の場合、完全対合のDNA三本鎖と誤対合DNA三本鎖間で、5℃と30℃で、蛍光強度の63%,50%の差が観察された(図7B)。5℃まで冷却する前後に30℃で測定されたすべての試料の蛍光強度は、非常に類似していた(データは図示しない)。最大の差は5℃に認められるが、便宜上、非変性ハイブリダイゼーションアッセイは室温でも高い信頼性で行える。
【0104】
(実施例8)
ハイブリダイゼーションアッセイの感度を、減少濃度の第2番の平行PNAプローブまたは第3番のssDNAプローブを、27℃と32℃の非変性条件下で、減少濃度の50merの野生型または変異型dsDNA標的(それぞれ配列番号1および配列番号2)と反応させることにより試験した(図8)。
【0105】
ハイブリダイゼーション反応混合物(40μl)は下記を含んでいた:20fmoles〜2pmolesの標的dsDNA、20fmoles〜2pmolesの第3番ssDNAプローブまたは第2番平行PNAプローブ、0.5×TBE、および2.5nM〜500nMのYOYO−1。すべての試料において、標的配列およびプローブ配列は、同一濃度に維持した。アッセイ条件は実施例4に記述したものと同一とした。
【0106】
1pmole/20μlの第2番の平行PNAプローブまたは第3番のssDNAプローブを、500nMの正常なYOYO−1濃度で、1pmole/20μlのdsDNA標的配列とハイブリダイズすると、1bp誤対合によって生じるdsDNA:PNAおよびdsDNA:ssDNA三本鎖は、完全対合の三本鎖で観察される27℃〜32℃より、各々93%〜94%までおよび56%〜54%低い範囲の蛍光強度を生じる(データは図示しない)。
【0107】
10fmole/20μl濃度のプローブおよび標的(つまり100倍低い濃度)では、1 bp誤対合dsDNA:PNAハイブリッドは、25nM YOYO−1を使用した時、27℃〜32℃の完全に相補的な三本鎖から得られる蛍光強度よりも85%〜83%だけ低い蛍光強度を達成した(図8A)。同様に、10fmole/20μlの第3番のssDNAプローブを、10nMのYOYO−1の存在下で10fmole/20μlのdsDNA標的配列と反応させると、1bp誤対合によって生成される蛍光強度は、27℃〜32℃での完全対合DNA三本鎖により生成される蛍光強度よりも84%〜90%だけ低かった(図8B)。これはプローブと標的の濃度が非常に低いときでもハイブリダイゼーションアッセイの感度が極端に高いことを証明している。
【0108】
試験した各プローブおよび標的濃度で、広範囲のYOYO−1濃度が許容された。10fmoles/20plのプローブと10fmoles/20plの標的をハイブリダイズさせた時、YOYO−1の最適濃度は、25nM〜2.5nM(平行PNAプローブ)および10nM〜2.5nM(ssDNAプローブ)であり、完全対合配列と誤対合配列間には90%〜71%に及ぶ蛍光強度の差が生じた(データは図示しない)。総括すると、上記結果によって、野生型配列と、様々な塩基対変異を含む配列とを区別するための、非変性ハイブリダイゼーションアッセイの極端に高い感度と信頼性が確認された。
【0109】
本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1A】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図1B】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図2】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図3A】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図3B】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図4】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図5】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図6A】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図6B】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図7A】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図7B】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図8A】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
【図8B】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の複合グラフ。
Claims (10)
- 結合を測定する方法であって、
dsDNAを有する標的を提供する工程と;
前記標的の少なくとも1部分に不完全に相補的なssDNAまたはRNAを有するプローブを提供する工程と;
1,1’‐(4,4,8,8‐テトラメチル‐4,8‐ジアザ‐ウンデカメチレン)‐ビス‐4‐(3‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐(ベンゾ‐1,3‐オキサゾール)‐2‐メチリデン)‐キノリニウムテトラヨーダイドである挿入剤を提供する工程と;
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添加して、測定用試料を提供する工程と;
前記挿入剤に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と;
前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線の強度を検出する工程と;
前記強度から、前記プローブと前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と;
前記方法が、PCR増幅も前記標的の変性工程も伴わずに実施される均質測定法であることと
から成る方法。 - 前記決定工程は、前記標的および前記挿入剤と結合させた他のプローブによって示された強度に対して前記強度を較正することにより遂行され、前記他のプローブの各々は、少なくとも1つの塩基が前記プローブと異なるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記標的に比べて、前記プローブと前記他のプローブの各々は、完全対合、1塩基誤対合、2塩基誤対合、3塩基誤対合、1塩基欠失、2塩基欠失および3塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである(前記プローブは前記完全対合でないと仮定する)、請求項2に記載の方法。
- 前記方法は前記標的上または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せずに行われる、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブが三本鎖を形成するために前記標的と特異的にハイブリダイズする、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブはssDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記励起放射線はアルゴンイオンレーザーから200nm〜1000nmの波長で放射される、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記測定用試料は、10フェムトモルの標的と10フェムトモルのプローブを含む20マイクロリットルの体積を有する、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料中の前記標的及びプローブの濃度のうちの少なくとも一方は、多くて5×10−10Mである、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 結合を測定する方法であって、
dsDNAを有する標的を提供する工程と;
ssDNAまたはRNAを有するプローブを提供する工程と;
1,1’‐(4,4,8,8‐テトラメチル‐4,8‐ジアザ‐ウンデカメチレン)‐ビス‐4‐(3‐メチル‐2,3‐ジヒドロ‐(ベンゾ‐1,3‐オキサゾール)‐2‐メチリデン)‐キノリニウムテトラヨーダイドである挿入剤を提供する工程と;
ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添加して、測定用試料を提供する工程と;
前記挿入剤に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と;
前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線の強度を検出する工程と;
前記標的および前記挿入剤と結合させた他のプローブによって示された強度に対して前記強度を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記プローブと前記他のプローブの各々は、完全対合、1塩基誤対合、2塩基誤対合、3塩基誤対合、1塩基欠失、2塩基欠失および3塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである工程と;
前記較正工程から、前記プローブと前記標的間の対合の程度を決定する工程と;
前記方法が、PCR増幅も前記標的の変性工程も伴わずに実施される均質測定法であることと
から成る方法。
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US6858390B2 (en) * | 1998-12-31 | 2005-02-22 | Ingeneus Corporation | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes |
US20030181412A1 (en) * | 1999-12-21 | 2003-09-25 | Ingeneus Corporation | Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses |
US7309569B2 (en) | 1999-12-21 | 2007-12-18 | Ingeneus, Inc. | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
US7052844B2 (en) * | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
US7220541B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-05-22 | Ingeneus, Inc. | Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
US20030170659A1 (en) * | 2000-01-24 | 2003-09-11 | Ingeneus Corporation | Electrical treatment of binding media to encourage, discourage and/or study biopolymer binding |
KR100386606B1 (ko) * | 2001-02-03 | 2003-06-02 | 엘지전자 주식회사 | Dna 검출 방법 및 그 장치 |
KR100434067B1 (ko) * | 2002-03-14 | 2004-06-04 | 엘지전자 주식회사 | 핵산 혼성화 검출을 위한 핵산검출장치 및 핵산 혼성화검출방법 |
JP2005289810A (ja) * | 2002-03-18 | 2005-10-20 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬 |
AU2003259197A1 (en) * | 2002-07-24 | 2004-02-09 | Congruence Llc. | Code for object identification |
JP2005534944A (ja) * | 2002-08-01 | 2005-11-17 | センサー テクノロジーズ リミティド ライアビリティー カンパニー | 螢光相関分光器 |
US20040142329A1 (en) * | 2003-01-17 | 2004-07-22 | Ingeneus Corporation | Probe conjugation to increase multiplex binding motif preference |
US20040180345A1 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-16 | Ingeneus Corporation | Pre-incubation method to improve signal/noise ratio of nucleic acid assays |
GB0310270D0 (en) * | 2003-05-03 | 2003-06-11 | Univ Edinburgh | Biomolecular devices |
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RU2464320C2 (ru) * | 2004-09-24 | 2012-10-20 | Инджиниес Инк. | Геномный анализ |
DE602006018861D1 (de) | 2005-01-27 | 2011-01-27 | Quest Diagnostics Invest Inc | Schnelle komparative genomhybridisierung |
US8076074B2 (en) | 2005-11-29 | 2011-12-13 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Balanced translocation in comparative hybridization |
RU2394915C2 (ru) * | 2006-03-24 | 2010-07-20 | Александр Борисович Четверин | Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления |
US7807359B2 (en) | 2006-12-01 | 2010-10-05 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods of detecting TPMT mutations |
US7507539B2 (en) | 2007-07-30 | 2009-03-24 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Substractive single label comparative hybridization |
US8278047B2 (en) | 2007-10-01 | 2012-10-02 | Nabsys, Inc. | Biopolymer sequencing by hybridization of probes to form ternary complexes and variable range alignment |
US8093063B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
US9650668B2 (en) | 2008-09-03 | 2017-05-16 | Nabsys 2.0 Llc | Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels |
US8262879B2 (en) | 2008-09-03 | 2012-09-11 | Nabsys, Inc. | Devices and methods for determining the length of biopolymers and distances between probes bound thereto |
WO2010028140A2 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Nabsys, Inc. | Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels |
ES2794401T3 (es) * | 2008-10-15 | 2020-11-18 | Axolabs Gmbh | Método de detección de oligonucleótidos |
US8039794B2 (en) | 2008-12-16 | 2011-10-18 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby |
AU2010298000A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-04-05 | Signature Genomics Laboratories Llc | Multiplex (+/-) stranded arrays and assays for detecting chromosomal abnormalities associated with cancer and other diseases |
US8715933B2 (en) | 2010-09-27 | 2014-05-06 | Nabsys, Inc. | Assay methods using nicking endonucleases |
US8859201B2 (en) | 2010-11-16 | 2014-10-14 | Nabsys, Inc. | Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes |
US11274341B2 (en) | 2011-02-11 | 2022-03-15 | NABsys, 2.0 LLC | Assay methods using DNA binding proteins |
WO2013009070A2 (ko) * | 2011-07-12 | 2013-01-17 | 주식회사 파나진 | 평행 결합 구조의 이중 혼성화 pna 프로브 시스템 |
EP2802411B1 (en) * | 2012-01-13 | 2017-04-05 | Koninklijke Philips N.V. | Dna sequencing with reagent recycling on wiregrid |
US8956815B2 (en) | 2012-04-18 | 2015-02-17 | Toxic Report Llc | Intercalation methods and devices |
US9914966B1 (en) | 2012-12-20 | 2018-03-13 | Nabsys 2.0 Llc | Apparatus and methods for analysis of biomolecules using high frequency alternating current excitation |
WO2014113557A1 (en) | 2013-01-18 | 2014-07-24 | Nabsys, Inc. | Enhanced probe binding |
CN105792924A (zh) * | 2013-11-29 | 2016-07-20 | 皇家飞利浦有限公司 | 对化学反应的光学控制 |
CN113720837B (zh) * | 2021-09-23 | 2024-01-19 | 西北大学 | 一种快速检测水体中汞离子的比色传感器 |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4220450A (en) | 1978-04-05 | 1980-09-02 | Syva Company | Chemically induced fluorescence immunoassay |
FR2558172B1 (fr) | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
US5011769A (en) | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
US4876187A (en) | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
US5874555A (en) | 1987-10-30 | 1999-02-23 | California Institute Of Technology | Triple helices and processes for making same |
US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
EP0440749B1 (en) | 1988-08-31 | 1997-05-28 | Aprogenex, Inc. | Manual in situ hybridization assay |
US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5824477A (en) | 1990-09-12 | 1998-10-20 | Scientific Generics Limited | Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid |
DE69128520T2 (de) | 1990-10-31 | 1998-07-09 | Tosoh Corp | Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren |
EP0566670A4 (en) * | 1990-12-17 | 1993-12-08 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5641625A (en) * | 1992-05-22 | 1997-06-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids |
US6048690A (en) | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
US5558998A (en) * | 1992-02-25 | 1996-09-24 | The Regents Of The Univ. Of California | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence |
US5332659A (en) | 1992-04-09 | 1994-07-26 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids |
JPH06153997A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Canon Inc | 検出信号増幅による標的核酸の検出方法 |
US6027880A (en) | 1995-08-02 | 2000-02-22 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis |
US5861124A (en) | 1993-07-15 | 1999-01-19 | Hamamatsu Photonics Kk | Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
AU7487294A (en) | 1993-08-18 | 1995-03-14 | Id Biomedical Corporation | Compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing flanking sequence enzyme molecules |
JPH09502092A (ja) | 1993-09-02 | 1997-03-04 | リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 非ヌクレオチドを含有する酵素性核酸 |
US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
WO1995014106A2 (en) | 1993-11-17 | 1995-05-26 | Id Biomedical Corporation | Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences |
US5998193A (en) | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
JP3189000B2 (ja) * | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
US5814516A (en) | 1995-10-13 | 1998-09-29 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof |
US5824557A (en) | 1996-04-02 | 1998-10-20 | Panvera Corporation | Method for detecting and quantitating nucleic acid impurities in biochemical preparations |
SE506700C2 (sv) * | 1996-05-31 | 1998-02-02 | Mikael Kubista | Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra |
US5948897A (en) | 1996-06-14 | 1999-09-07 | Simon Fraser University | Method of binding two or more DNA double helices and products formed |
US5912332A (en) | 1996-07-26 | 1999-06-15 | Hybridon, Inc. | Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides |
US5691145A (en) | 1996-08-27 | 1997-11-25 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids using G-quartets |
US6046004A (en) * | 1997-02-27 | 2000-04-04 | Lorne Park Research, Inc. | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones |
US6060242A (en) | 1997-02-27 | 2000-05-09 | Lorne Park Research, Inc. | PNA diagnostic methods |
US6251591B1 (en) | 1997-02-27 | 2001-06-26 | Lorne Park Research, Inc. | Quantitative method for detecting nucleotide concentration |
US5846729A (en) * | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
US6312925B1 (en) * | 1997-05-08 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions to facilitate D-loop formation by oligonucleotides |
US6013442A (en) * | 1997-08-05 | 2000-01-11 | Wisconsin Alumni Res Found | Direct quantitation of low copy number RNA |
GB9725197D0 (en) * | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
US6017709A (en) | 1998-04-29 | 2000-01-25 | University Of Houston | DNA replication templates stabilized by guanine quartets |
US6255050B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-07-03 | Lorne Park Research, Inc. | Dynamic hybridization system |
GB9812768D0 (en) * | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
GB9821989D0 (en) * | 1998-10-08 | 1998-12-02 | Hybaid Ltd | Detection of nucleic acid polymorphism |
US6265170B1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-24 | Ingeneus Corporation | Homogenous assay of duplex of triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions |
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