CN1413264A - 利用荧光嵌入剂对双链和三链核酸在溶液中杂交的荧光强度分析 - Google Patents

利用荧光嵌入剂对双链和三链核酸在溶液中杂交的荧光强度分析 Download PDF

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Abstract

本发明提供了对核酸杂交的一种均相分析。包含探针、靶以及嵌入剂的杂交介质的荧光强度是该探针对于该靶的杂交效率的函数。本分析可以检测单链探针与非变性的双链靶之间形成三链体的特异性杂交，因此无需变性靶。本分析也可检测双链杂交复合体。本分析可用于识别折叠核酸序列中的可及区域，判定杂交复合体中错配碱基对数，以及为基因组作图。

Description

利用荧光嵌入剂对双链和三链核酸在溶液中杂交 的荧光强度分析
发明说明 发明背景
1. 发明领域
本发明涉及核酸的测序或分析方法，更具体地涉及利用荧光强度检测分析三链和双链核酸杂交复合体的方法。
2. 相关领域说明
几十年来，荧光染料一直被用来检测并量化核酸。基于荧光强度分析的最基本形式通常包含靶核酸与含有荧光团的探针接触，从结合探针中将未结合探针去除，检测洗涤样品中的荧光。均相分析在此基本分析上有了提高，前者并不需要洗涤的步骤，或不需要提供非液相的支持。
例如，Livak等的美国专利5,538,848和Maggio的美国专利4,220,450公布了利用溶液中的寡核苷酸探针对核酸序列基于均相荧光的分析。然而，这些专利需要淬灭剂与报告剂组合使用，以区分杂交探针和未杂交探针所产生的信号。Livak等在其公布的方法中还要求使用酶。淬灭剂与酶增加了该方法的复杂性和花费。
Kidwell的美国专利5,332,659公布了检测溶液中核酸序列的方法，其使用包含至少两个荧光基团部分的探针。这些荧光基团的选择要求是，当二者间距足以改变其光谱的波长依赖性时，互相之间有电性的干扰。未杂交的探针比杂交到靶序列上的探针更灵活，因此，未杂交探针上的两个荧光基团部分比杂交探针上的更可能相互靠近。因此，可以监测与游离探针相关的发射波长的变化，作为样品中游离探针数量的指示。
Wu等的美国专利5,846,729也公布了核酸杂交的基于均相荧光的分析。
基于某些荧光团在杂交复合体中结合于核酸链之间的能力，一些分析也利用嵌入荧光团检测核酸杂交。
例如，Burke等的美国专利5,824,557公布了检测并量化核酸分子的方法和试剂盒。优选的实施方案取决于将染料嵌入双链核酸的双螺旋或单链核酸中。染料在嵌入之后发出荧光，其强度直接反映了样品中存在的核酸量。尽管Burke等的方法声称可用于检测样品中的核酸量，但是这种方法基于嵌入染料与核酸之间非特异性的结合，使该方法对于检测特异性结合，尤其是存在非靶核酸双链的情况中不实用。
Ishiguro等的美国专利5,814,447公布的方法宣称，对依赖于嵌入染料和核酸双链间非特异性结合的方法作了改进，这些方法如Burke等的方法以及由Ishiguro等早期在日本专利公开237000/1993中所描述的方法。早期的发展包括在靶核酸一个特定区域经PCR扩增之前，加入嵌入荧光素，该荧光素嵌入到样品溶液后荧光强度增加，以及以给定时间间隔对反应溶液的荧光强度进行检测，以检测并量化扩增前的靶核酸。该447专利试图通过提供提高了特异性的分析方法对前期的发展进行改进，该分析的特征在于探针是标记了嵌入荧光素的单链寡核苷酸，该荧光素被嵌入到介于靶核酸与单链寡核苷酸探针之间互补的结合部分。
除了上述检测荧光强度的研究外，还有一些研究极力推荐荧光极性分析的优点。然而，基于极性的分析有一些明显的缺点。以极性的变化程度作为结合的函数是难以预测的，对于不一致数据进行解释使其符合理论的预期，这在分析方法中是不理想的，特别当这种分析是自动化分析时。
尽管有以上的研究成果，本领域仍需要用于核酸之间和/或核酸类似物间相互作用的简便、高灵敏度、有效并且快速的分析方法。
所有在此引用的参考文献以其全文在此引作参考。
发明概述
本发明提供了一种分析结合的方法，所述方法包含：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含与至少一部分所述靶不完全互补的核酸或核酸类似物序列的探针；
提供一种嵌入剂，其中所述探针或所述嵌入剂之一含有荧光团；
将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入杂交介质，作为检测样品；
用激发辐射照射所述检测样品，使所述荧光团发出荧光；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；以及
从所述强度中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。
附图简述
本发明将与以下附图一同描述，在这些附图中，类似的参考数字命名类似元件并且其中：
图1A、1B、2、3A、3B、4、5、6A、6B、7A、7B、8A和8B是各分析样品最大荧光强度以温度为函数所绘制的组合图。
优选实施方案的详细说明
本发明提供了一种分析靶与探针结合的快速、灵敏、环保而且安全的方法，其中该靶包含核酸序列或核酸类似物序列，探针包含核酸序列或核酸类似物序列。
与某些先前的分析方法不同，本发明不仅检测杂交是否存在，还提供有关探针和靶之间杂交性质的定量和定性信息。因此，本发明使操作者可以区分是完全匹配、单碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、单碱基对缺失、两个碱基对缺失、还是三个碱基对缺失。
本发明的实施方案包括将第一个探针-靶混合物中检测到的荧光强度，和在其它探针与相同的靶和相同嵌入剂组合发出的荧光强度进行校准，其中其他探针每一个与第一个探针有至少一个碱基的差异。本发明方法检测到的荧光强度随探针与靶间结合亲合力的增加而增加。与荧光各向异性方法不同，本方法无需检测荧光的极化。
从而可产生标准曲线，其中强度是靶和探针之间结合亲合力的函数。因为靶与多种不同探针间的结合亲合力因错配碱基数不同、错配的性质不同(A-G对A-C对T-G对T-C等)、错配碱基在杂交复合体中的位置等因素，各有差异，因此，本发明分析可用于对靶测序。
本发明可以量化探针与靶之间的结合亲合力。这样的信息在许多方面非常有用，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。
与先前的方法不同，本发明的分析优选是均相的。该分析在检测荧光强度之前，无需将探针-靶复合体与游离探针和靶分离。该分析无需凝胶分离的步骤，因此检测通量有很大提高。定量分析简便准确。此外，该分析优选地在均相溶液中进行，不需要通过过滤和多步润洗，或通过凝胶电泳将结合复合体与未结合探针分离。因此，这种结合分析可节省大量的时间和花费，而且容易自动化完成。进一步，这种分析使结合中的一些变量，如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列的长度以及可能的辅助因子的要求被快速确定。
此外，本发明的分析优选在进行时无需提供对靶和探针的信号淬灭剂。
本发明的优选实施方案特异地检测探针与双链靶之间的三链体杂交，因此无须将靶序列变性。当PNA探针已知可与某些类型的靶形成三链体时(参见，如Egholm等，365 Nature 566(1993)，和Tomac等，118 J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，本发明者惊讶地发现，这些PNA探针能够特异地分析单链核酸(如ssDNA和RNA)探针与双链核酸(如dsDNA)靶之间形成的三链体。
本发明分析中使用的合适的探针包括，如ssDNA，RNA，PNA以及其它具有不带电荷主链的核酸类似物。优选长度为8到20个碱基的探针序列，因为该范围是原核和真核生物已发现的最小的独特DNA序列范围。特别优选12到18个碱基的探针，因为这是人基因组中最小的独特序列的长度。实施方案中，优选6-30个碱基的探针，并最优选15个碱基。不过，多个更短的探针可用于检测具有多个非独特靶序列的核酸序列，这些探针组合用来独特地识别核苷酸序列。
本发明无须使用危险、操作烦琐、耗时，而且需要经常再生的放射性探针。本发明的探针优选的是数年都安全稳定的探针。相应的，探针可大量地制备或订购和储存。
本发明者还惊讶地发现平行PNA探针比传统合成的反平行PNA探针效果好得多。核酸靶序列比PNA探针长三倍以上时，平行和反平行PNA探针对于区分完全匹配的核酸杂交复合体与那些含有一个、两个或三个碱基对错配的杂交复合体同样有效。但当靶DNA序列与PNA探针序列长度相同时(如15个核苷酸长)，由于完全匹配复合体与具有一个或两个碱基对错配的复合体所观察到的荧光强度差异增大，平行PNA探针要优于反平行PNA探针。
尽管对于在这种情况下平行PNA探针更佳的确切机制还不了解，但这些观察暗示，错配平行PNA：DNA杂交复合体比类似的错配反平行PNA：DNA杂合体更不稳定，导致核酸嵌入剂嵌入减少，因此观察到的荧光强度值更低。
优选未标记的探针和靶，但在另一些实施方案中，嵌入剂与探针共价结合。在这样一些实施方案中，该嵌入剂优选地结合于探针的任一端。
其它实施方案中，嵌入剂尽管可在分析中插入探针与靶之间，但并不与探针共价结合，而是以非共价形式与探针有义键合。
本发明使用的优选嵌入剂包括，如YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚体-1、乙啶同型二聚体-2和吖啶。通常，嵌入剂是能够嵌入双链和/或三链核酸复合体链间的成分。优选的实施方案中，嵌入剂(或其一个组分)实际上在核酸不存在时是无荧光的，只有在嵌入双链或三链核酸复合体时，被合适波长辐射激发和嵌入的荧光才显示100倍到10000倍的增强。
其它实施方案中，嵌入剂在嵌入和被适当波长的辐射激发后，可能表现荧光波长移位。确切的荧光波长可根据被嵌入核酸的结构，如DNA对RNA，双链体对三链体等。
选择相当于所用荧光团最大激发的激发波长(通过常规实验和/或常识)，优选200到1000nm。优选发射波长为200到1000nm的嵌入剂。优选的实施方案中，使用氩离子激光器和波长范围在400nm到540nm之间的光辐射荧光团，在500到750nm之间检测到荧光发射。
本发明的分析可在极广的温度范围下进行，如5℃到85℃之间。某些先前的分析要求提高温度，使花费增加并延迟分析。另一方面，本发明可在室温或以下的温度进行(如低于25℃的温度)。
本发明的可靠性不依赖于所述靶中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。由于G-C碱基对形成三个氢键，而A-T碱基对仅形成两个氢键，具有高的G或C含量的靶和探针更加稳定，熔解温度更高。因此，在完全匹配杂合体中增加杂交的探针与靶区域GC含量的碱基错配可抵消错配探针引起的弱结合。在探针与靶之间含有每一个可能的碱基错配的杂交复合体比完全匹配的杂合体更不稳定，总是导致比完全互补杂合体更低的荧光强度。
本发明的分析是极其灵敏的，因此无须对靶进行PCR扩增。例如，可以对含有约10fmol靶和约10fmol探针的体积为约20微升检测样品进行分析。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的靶，优选浓度不高于5×10-10M。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的探针，优选浓度不高于5×10-10M。毫无疑问，上述数值并不意味着本方法不能检测更高的浓度。
杂交介质可以是任何已知的适宜于保存核酸的常规介质。参见如Sambrook等“分子克隆：实验手册”第2卷(1989)。例如，液相介质可包括核苷酸、水、缓冲液以及标准盐浓度。
互补碱基间的杂交在多种情况下进行，各情况在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成方面有所不同。这些条件和使用方法的例子是本领域所已知的。
优选的，杂交复合体在约15℃到约25℃的温度下形成1到5分钟。不需要更长的反应时间，但温育几个小时对杂交复合体也没有副作用。
假使反应混合物中存在合适的荧光嵌入剂(如上所述)，绝大多数情况下，不需要其它的助剂。然而，可能使用某些试剂促进溶液中的杂交。这些试剂优选的例子包括单链结合蛋白，如Rec A蛋白、T4基因32蛋白、大肠杆菌单链结合蛋白、大或小的核酸沟结合蛋白、二价离子、多价离子、viologen以及嵌入剂如溴化乙啶、放线菌素D、补骨脂素及当归素。这些助剂可被证明在极端的操作条件下是有用的，如异常的pH值或异常高温。
本发明分析可被用于，如识别折叠核酸序列中可及区域，以确定杂交复合体中错配的碱基数以及基因组制图。
本发明将通过以下实施例进行详细阐述，但应当理解本发明并不只限于以下实施例。实施例 实施例1
DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)合成来自人囊性纤维化基因的外显子10(Nature 380，207(1996))的有义和反义50聚体ssDNA靶序列，HPLC纯化。等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃变性10分钟，然后慢慢退火，使温度在1个半小时内下降到21℃。DsDNA寡核苷酸溶解在ddH2O中，终浓度为1pmole/μl。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3’。
制备与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的50聚体的突变dsDNA靶序列，只在氨基酸位置第507处有一个碱基对的突变(下划线)，其中将野生型序列CAT变为C GT。
该50聚体的靶序列的有义链序列(SEQ ID NO：2)为：5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT C GT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3’。
该50聚体的靶序列的反义链序列(SEQ ID NO：2)为：5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA  CGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3’。
制备与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的50聚体的突变dsDNA靶序列，只在氨基酸位置第506和507处有连续的两个碱基对的突变(下划线)，其中将野生型序列CAT突变为 ACT。
该靶序列的有义链的序列(SEQ ID NO：3)为：5’-TGG CAC CATTAA AGA AAA TAT  ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATATA-3’。
该靶序列的反义链的序列(SEQ ID NO：3)为：5’-TAT ATT CATCAT AGG AAA CAC CAA AGA  GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGCCA-3’。
制备与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的50聚体的突变dsDNA靶序列，只在氨基酸位置第506和507处有连续的三个碱基对的突变(下划线)，其中将野生型序列CAT突变为 ACG。
该靶序列的有义链的序列(SEQ ID NO：4)为：5’-TGG CAC CATTAA AGA AAA TAT  ACG CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATATA-3’。
该靶序列的反义链的序列(SEQ ID NO：4)为：5’-TAT ATT CATCAT AGG AAA CAC CAA AG C  GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGCCA-3’。
制备与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)类似的47聚体的突变dsDNA靶序列，只在氨基酸位置第507和508处有连续的三个碱基对的缺失(以省略号表示)，其中将野生型序列CTT缺失。
该47聚体靶序列的有义链的序列(SEQ ID NO：5)为：5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT…TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATATA-3’。
该47聚体靶序列的反义链的序列(SEQ ID NO：5)为：5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CA…A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGCCA-3’。
本实施例中使用的PNA探针由Commonwealth Biotechnologies公司(Richmond，VA，USA)合成、HPLC纯化并通过质谱分析确认。PNA探针首先被溶解在0.1％的TFA(三氟乙酸)到浓度为10mg/ml，加入双蒸水使其稀释至1mg/ml。最终PNA的储藏溶液制成水溶液浓度1pmole/μL。
1号探针是15聚体反平行PNA探针，其设计成与50聚体野生型靶DNA有义链(SEQ ID NO：1)的一个15核苷酸区段完全互补，从氨基酸位置505到510序列是完全重叠的(Nature  380，207(1996))。该探针结构(SEQ ID NO：6)为：5’-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH2-3’。
2号探针是与1号探针序列上类似的15聚体PNA探针，不过是以平行方向，而非反平行方向。该探针结构(SEQ ID NO：7)为：5’-H-TAT AGT AGA AAC CAC-Lys-CONH2-3’。
各杂交反应混合物(80μl)均含有以下成分：4pmole的靶dsDNA、4pmole的PNA探针、0.5xTBE和500nM的DNA嵌入剂YOYO-1(分子探针，Eugene，OR，USA)。反应混合物在95℃温育5到10分钟使其变性，接着保存于80℃直到分析。样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束辐射，随时间温度不断降低反复监测荧光发射情况。通过一个由软件控制的直接放置在各样品中温度探针，同时实现温度检测。最大荧光强度产生于540nm波长，表明YOYO-1嵌入了PNA：DNA杂和体。对各分析样品最大荧光强度以温度函数进行绘图。
DNA或PNA不存在时观察到的荧光强度(仅有YOYO-1)，或当野生型SEQ ID NO：1、突变体SEQ ID NO：2或突变体SEQ ID NO：3与1号反平行探针或2号平行探针的反应时观察到的荧光强度分别表示在图1A和1B中。由完全互补序列(SEQ ID NO：1+1号探针)组成的ssDNA：PNA杂合体使得YOYO-1最大嵌入，产生最强的荧光，该荧光强度随温度的降低而增加(图1A)。单碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：2+1号探针)与两个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：3+1号探针)在60℃时，其荧光强度分别比完全匹配的ssDNA：PNA杂合体的荧光强度低81％和89％(图1A)。同样的，当2号平行PNA探针与靶DNA序列杂交时，单碱基对错配与两个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体在60℃时，其荧光强度分别比完全互补ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：1+2号探针)的荧光强度低70％和86％(图1B)。随着探针与靶之间的错配程度增加，YOYO-1嵌入的水平降低，因而荧光强度也降低。无论使用反平行或平行PNA探针均存在这种关系。
有趣的是，当靶DNA序列与PNA探针序列长度相同时(即15个核苷酸的长度)，由于完全匹配复合体与单个或两个碱基对错配的复合体间所观察到荧光强度的差异更大(数据未显示)，平行PNA探针比反平行PNA探针更好。
尽管在这种条件下优选平行PNA探针的确切机制仍不明确，但这些观察结果暗示错配的平行PNA：DNA杂交复合体比类似的错配反平行PNA：DNA杂合体更不稳定，导致核酸嵌入剂嵌入更少，因此所观察到的荧光强度更低。实施例2
图2表明，本发明的杂交分析在使用平行PNA探针时，也可区分完全匹配的ssDNA：PNA杂合体与那些含有1、2、或3碱基对错配以及含有3个碱基对缺失的杂合体。本分析的条件与实施例中所述的相同。在60℃时，单碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ IDNO：2+2号探针)、连续的两个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQID NO：3+2号探针)、连续的三个碱基对错配的ssDNA：PNA杂合体(SEQID NO：4+2号探针)和三个碱基对缺失的ssDNA：PNA杂合体(SEQ IDNO：5+2号探针)，其荧光强度分别比完全匹配的ssDNA：PNA杂合体(SEQ ID NO：1+2号探针)的荧光强度低41％、71％、87％和95％。随着温度由70℃降至60℃，在完全匹配和各种碱基对错配之间的差异增大。如实施例1，探针和靶之间错配程度增加导致荧光强度的渐进性降低。此外，即使在突变序列有比野生型序列更高的GC百分比含量时，这种荧光变化模式仍然一致(图2)。
使用平行PNA探针时，独立的2个碱基对错配(其中两个单碱基对错配由3个碱基对分隔开)导致荧光强度略低于连续的两个碱基对错配(数据未显示)。同样的，独立的3个碱基对错配(其中三个单碱基对错配由3个碱基对分隔开)荧光强度略低于连续的三个碱基对错配(数据未显示)。这些结果暗示独立的碱基对错配比连续的碱基对错配对于ssDNA：PNA杂合体的形成更具有破坏性。实施例3
SEQ ID NO：8是来源于SEQ ID NO：1的15聚体dsDNA靶序列，与1号探针完全互补。除了一个碱基对突变(下划线)以外，SEQID NO：9到SEQ ID NO：17是与野生型SEQ ID NO：8相同的15聚体突变dsDNA靶序列。如上所述方法合成有义和反义的15聚体ssDNA序列，纯化并退火。DsDNA寡核苷酸溶解在ddH2O中，终浓度为1pmole/μl。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：8)为：5’-ATA TCATCT TTG GTG-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：8)为：5’-CAC CAAAGA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：9)为：5’-ATA TC TTCT TTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：9)为：5’-CAC CAAAGA  AGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：10)为：5’-ATA TCATCT TT C GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：10)为：5’-CAC  GAAAGA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：11)为：5’-ATA TCAT GT TTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：11)为：5’-CAC CAAA CA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：12)为：5’-ATA TCATCT  ATG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：12)为：5’-CAC CA TAGA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：13)为：5’-ATA TCATCT  CTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：13)为：5’-CAC CA GAGA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：14)为：5’-ATA TCATCT  GTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：14)为：5’-CAC CA CAGA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：15)为：5’-ATA TC GTCT TTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：15)为：5’-CAC CAAAGA  CGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：16)为：5’-ATA TCATTT TTG GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：16)为：5’-CAC CAAA AA TGA TAT-3’。
突变的靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：17)为：5’-ATA TCATCT TT T GTG-3’。
突变的靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：17)为：5’-CAC  AAAAGA TGA TAT-3’。
杂交分析特异性的的进一步验证是通过将2号平行PNA探针与15聚体野生型靶dsDNA(SEQ ID NO：8)和多种单碱基对突变的靶dsDNA((SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：17)反应，可以产生各种可能的单碱基错配(图3)。本分析的条件与上述实施例1所述相同。
在经检测的所有温度，由完全互补序列组成的ssDNA：PNA杂合体具有最高的荧光强度。荧光强度随温度的降低而增加。导致单碱基对T-T、C-C、G-G、A-A、C-A、G-A、G-T和C-T错配的所有ssDNA：PNA杂合体所产生的荧光强度均低于完全匹配ssDNA：PNA杂合体所观察到的荧光强度(图3A和3B)。单碱基对错配的荧光强度在55℃时，比完全匹配所观察到的荧光强度低64％-96％，在75℃时比完全匹配的荧光强度低57％-95％。使用平行PNA探针时，各种单碱基对错配之间产生的荧光强度变化更主要地依赖于特定碱基对的错配，而次要地依赖于突变序列中GC百分比含量的变化(图3)。在相似的实验中，当检测1号反平行探针时，完全匹配与各种单碱基对错配所表现出的荧光强度的差异，比使用2号平行PNA探针所获得的差异更不显著，并且似乎还受温度的影响(数据未显示)。使用反平行PNA探针时，此分析在40℃到60℃之间有最佳结果。因此当靶DNA序列与PNA探针序列长度相同时，优选平行PNA探针。
图3的结果确证了此杂交分析对于精确识别所有可能的单碱基对错配的可靠性。实施例4
实施例1到3中进行的杂交分析是在dsDNA靶序列变性之后进行的，并在高于dsDNA靶熔点(Tm)的温度下检测ssDNA：PNA杂合体的形成。本实施例表明本发明分析在无需预变性情况下，区分完全匹配和碱基对错配的可靠性。
杂交反应混合物(120μl)含有以下成分：6pmole的靶dsDNA、6pmole的2号平行PNA探针、0.5xTBE和500nM的DNA嵌入剂YOYO-1。尽管反应体积略大于实施例1到3中的反应体积，但DNA、PNA和YOYO-1的量也相应地调整，以保证样品浓度不变。在反应体积为40μl、80μl或120μl时均获得了一致的结果。反应混合物在21℃室温温育5分钟，放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束辐射，加温仓中随时间温度不断升高，反复监测荧光发射情况。通过一个由软件控制直接放置在各样品中的温度探针来同时获得样品温度检测。对各分析样品最大荧光强度以温度函数进行绘图。
图4表明，即使在未经预变性的情况下，从30℃到85℃最大荧光强度也来自野生型50聚体dsDNA靶序列(SEQ ID NO：1)与2号15聚体平行PNA探针的反应。在低于50聚体野生型dsDNA的Tm65℃时，形成dsDNA：PNA三链体。随着温度上升到高于65℃时，该三链体转变为ssDNA：PNA双链体。很明显，YOYO-1可以有效嵌入到三链和双链体中。从而，单碱基对错配的dsDNA：PNA三链体(SEQ IDNO：2+2号探针)，连续的二碱基对错配三链体(SEQ ID NO：3+2号探针)，连续的三碱基对错配三链体(SEQ ID NO：4+2号探针)，以及三碱基对缺失三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)，在30℃时，其荧光强度分别比完全匹配的dsDNA：PNA三链体(SEQ ID NO：1+2号探针)的荧光强度低83％、93％、99％和99.5％。当温度从30℃增加到85℃时，完全匹配与碱基对错配之间的差异程度降低。在85℃时，单碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、以及三个碱基对缺失杂合体所产生的荧光强度，分别比完全互补序列的荧光强度低65％、76％、94％和95％。因此本发明的杂交分析不经序列预变性就能区分野生型序列与那些含有单碱基对、二个碱基对或3个碱基对突变或缺失的序列。实施例5
3号探针是15聚体的ssDNA，在序列和方向上均类似15聚体的1号反平行探针(SEQ ID NO：6)。该探针结构如下：5’-CAC CAA AGATGA TAT-3’。
将3号ssDNA探针与50聚体野生型和突变型dsDNA靶序列在未经预变性条件下反应，以进一步验证本杂交分析的特异性。本分析的条件与实施例4中所述条件等同。
由于DNA嵌入剂YOYO-1的增强作用，在30℃到65℃之间形成了dsDNA：ssDNA三链体。由SEQ ID NO：1和3号探针组成的完全匹配DNA三链体产生最高的荧光强度(图5)。相反，不完全互补探针与靶组合生成单碱基对错配(SEQ ID NO：2+3号探针)、连续的二碱基对错配(SEQ ID NO：3+3号探针)、连续的三碱基对错配(SEQ IDNO：4+3号探针)以及三碱基对缺失(SEQ ID NO：5+3号探针)，导致荧光强度分别比完全匹配序列所观察到的荧光强度在30℃时低57％、94％、97％和98％，在65℃时低47％、79％、92％和91％(图5)。当温度增加到高于65℃时，完全匹配和碱基对错配之间的差异程度降低，表明DNA三链体结构逐渐遭到破坏。至85℃时，由单碱基对错配、二碱基对错配、三碱基对错配、以及三碱基对缺失所获得的荧光强度分别比完全匹配低40％、63％、92％和83％(图5)。YOYO-1的存在使得可以使用ssDNA探针替代PNA探针，以便在不要求预变性条件下区分完全互补序列和那些含有1、2或3个碱基对错配或缺失的序列。实施例6
依据上述方法合成新的15聚体ssDNA探针和50聚体dsDNA靶序列，并经纯化和退火，以证明不经预变性使用ssDNA探针和dsDNA靶的杂交分析，能应用在GC百分比含量显著不同(因此熔解温度也不同)的探针与靶DNA上。将ssDNA探针和dsDNA靶溶于重蒸馏水中，终浓度为1pmole/μl。
SEQ ID NO：18是来自SEQ ID NO：1经修饰的50聚体dsDNA靶序列，其中其GC百分比含量由原来的30％变为52％。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：18)为：5’-GAG CACCAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGACTC TG-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：18)为：5’-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGGTGC TC-3’。
SEQ ID NO：19是类似SEQ ID NO：18的50聚体突变dsDNA靶序列，其中有一个碱基对突变(下划线)，由CAT转变为C GT。
突变的SEQ ID NO：19有义链的序列为：5’-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT C GT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变的SEQ ID NO：19反义链的序列为：5’-CAG AGT CAT CGTAGG ACA CAC CAG AGA  CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：20是类似SEQ ID NO：18的50聚体突变dsDNA靶序列，其中有连续两个碱基对突变(下划线)，由CAT转变为 ACT。
突变的SEQ ID NO：20有义链的序列为：5’-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT  ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3’。
突变的SEQ ID NO：20反义链的序列为：5’-CAG AGT CAT CGTAGG ACA CAC CAG AGA  GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：20是来自SEQ ID NO：1经修饰的50聚体dsDNA靶序列，其中其GC百分比含量由30％改变为72％。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：21)为：5’-GAG CACCCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGAGCG TG-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：21)为：5’-CAC GCTCGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGGTGC TC-3’。
SEQ ID NO：22是类似SEQ ID NO：21的50聚体突变dsDNA靶序列，其中有一个碱基对突变(下划线)，由CGT转变为C AT。
突变的SEQ ID NO：22有义链的序列为：5’-GAG CAC CCT CCCAGG CAC GGT C AT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
突变的SEQ ID NO：22反义链的序列为：5’-CAC GCT CGT CGGAGG TCG CAC CAG GGA  TGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
SEQ ID NO：23是类似SEQ ID NO：21的50聚体dsDNA靶序列，其中有连续两个碱基对突变(下划线)，由CGT转变为 ATT。
突变的SEQ ID NO：23有义链的序列为：5’-GAG CAC CCT CCCAGG CAC GGT  ATT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3’。
突变的SEQ ID NO：23反义链的序列为：5’-CAC GCT CGT CGGAGG TCG CAC CAG GGA  ATA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3’。
4号探针是15聚体的ssDNA探针，与50聚体野生型靶DNA(SEQID NO：18)有义链的一段15个核苷酸区段完全互补。该探针结构(SEQID NO：24)如下：5’-CAC CAG AGA TGA CAG-3’。
5号探针是15聚体的ssDNA探针，与50聚体野生型靶DNA(SEQID NO：21)有义链的一段15个核苷酸区段完全互补。该探针结构(SEQID NO：25)如下：5’-CAC CAG GGA CGA CCG-3’。
杂交分析条件等同于实施例4所述。
将4号ssDNA探针(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：18)和突变型dsDNA靶(SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20)，在非变性条件下低温杂交，形成了dsDNA：ssDNA三链体(图6A)。当完全匹配的DNA三链体产生最高的荧光强度时，含有单碱基对错配的不完全互补链体(SEQ ID NO：19+4号探针)和含有连续的二碱基对错配的不完全互补三链体(SEQ ID NO：20+4号探针)在30℃时，分别比完全匹配序列的荧光强度低63％和95％(图6A)。随着温度增加，DNA三链体结构逐渐破坏，导致荧光强度降低，以及完全匹配与碱基对错配之间的差异缩小。至85℃时，完全匹配序列与含有碱基对错配序列之间的荧光强度几乎无差异(图6A)。
同样，当YOYO-1存在时，将5号ssDNA探针(GC含量为73％)与对应的50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：21)和突变型dsDNA靶(SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23)反应，也形成了dsDNA：ssDNA三链体。单碱基对错配的DNA三链体(SEQ ID NO：22+5号探针)和连续的二碱基对错配的DNA三链体(SEQ ID NO：23+5号探针)在30℃时，分别比完全匹配序列的荧光强度低48％和64％(图6B)。随着温度由30℃升高到85℃，所有样品的荧光强度都降低，暗示YOYO-1嵌入程度降低以及DNA三链体的破坏。
无论ssDNA探针和dsDNA靶的GC百分比含量如何，YOYO-1都能在非变性的条件下促进DNA三链体的形成，因此可以精确地区分完全互补序列和那些含有一个或两个碱基对突变的序列。实施例7
实施例5和6中的杂交分析证实，在不需要预变性的条件下，本发明使用ssDNA探针区分野生型DNA序列和那些含有碱基对错配或缺失的序列是可靠的。这些分析均检测dsDNA靶的熔点温度以下的DNA三链体的形成。此外，在检测的最低温度30℃时，对于野生型和突变序列有最佳区分度。为了确定低于30℃的温度条件是否对分析更有利，将1 5聚体的3号ssDNA探针与50聚体野生型dsDNA靶(SEQID NO：1)或与50聚体突变型dsDNA靶(SEQ ID NO：2)在5℃和30℃之间反应。
图7A中，2pmole的dsDNA靶与2pmole的3号ssDNA探针在40μl含有0.5xTBE和500nM YOYO-1的反应混合物中反应。图7B中，500fmole(即10-15mole)的dsDNA靶与500fmole 3号ssDNA探针在40μl含有0.5xTBE和250nM YOYO-1的反应混合物中反应。反应混合物在室温(21℃)温育5分钟，转移至石英杯中，然后用氩离子激光束在30℃辐射，操作方法如实施例4到6所述。随后将装有样品的石英杯放置在冰上。当各样品温度降至2℃时(通过直接放置在各样品中的温度探针测知)，将样品转移到测定仓中，在温度随时间从5℃增加到30℃的过程中，反复监测荧光发射情况。对各分析样品最大荧光强度以温度函数进行绘图。
两种测试浓度DNA在5℃时，均表现出对于完全互补DNA三链体(SEQ ID NO：1+3号探针)和含有单碱基对错配DNA三链体(SEQID NO：2+3号探针)的最佳区分度(图7A和7B)。然而，随着温度从5℃增加到30℃，完全互补和不完全互补DNA三链体之间荧光强度的差异并无显著改变。当探针与靶的浓度均为1pmole/20μl时，单碱基对错配的DNA三链体产生的荧光强度在5℃和30℃时，分别比完全匹配序列的荧光强度低84％和77％(图7A)。同样的，探针和靶的浓度低于此四倍时，完全匹配和错配DNA三链体在5℃和30℃时荧光强度的差异分别是63％和50％(图7B)。所有的样品在温度降低到5℃之前和之后，在30℃检测到的荧光强度都是非常相似的(数据未显示)。尽管在5℃观察到了最大差异，但为方便起见，这种非变性的杂交分析方法可以可靠地在室温下进行。实施例8
该杂交分析的灵敏度的测试，是通过将不断降低浓度的2号平行PNA探针或3号ssDNA探针与不断降低浓度的50聚体野生型或突变型dsDNA靶(分别是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，在非变性条件下27℃到32℃之间反应(图8)。
杂交反应混合物(40μl)含有下列成分：20fmole到2pmole的靶dsDNA、20pmole到2pmole的3号ssDNA探针或2号平行PNA探针、0.5xTBE和2.5nM到500nM的YOYO-1。各样品中靶序列和探针序列的浓度均维持在相同的水平。分析条件等同于实施例4所述条件。
将1pmole/20μl的2号平行PNA探针或3号ssDNA探针与1pmole/20μl的dsDNA靶序列在500nM正常浓度的YOYO-1下杂交，由单碱基对错配产生的dsDNA：PNA和dsDNA：ssDNA三链体，在27℃到32℃时，其荧光强度分别比完全匹配三链体的荧光强度低93％到94％以及56％到54％(数据未显示)。
在探针与靶的浓度均为10fmole/20μl(即浓度低100倍)，YOYO-1使用浓度为25nM时，单碱基对错配dsDNA：PNA杂合体，在27℃到32℃下，其荧光强度比完全互补三链体的荧光强度低85％到83％(图8A)。同样，10fmole/20μl3号ssDNA探针与10fmole/20μl的dsDNA靶序列在YOYO-1浓度为10nM时反应，在27℃到32℃下，由单碱基对错配所采用荧光强度比完全匹配DNA三链体的荧光强度低90％到84％(图8B)，证明本杂交分析即使在探针与靶的浓度极低时依然灵敏。
在各种受测的探针和靶浓度下可采用广范围浓度的YOYO-1。当浓度均为10fmole/20μl探针和靶杂交时，最佳YOYO-1浓度在25nM到2.5nM之间(对PNA探针而言)，以及10nM到2.5nM(对ssDNA探针而言)，完全匹配和碱基对错配序列之间荧光强度的差异在90％到71％之间(数据未显示)。这些结果证实了这种非变性杂交分析对于区分野生型序列和含有多种碱基对突变序列是极其灵敏可靠的。
尽管本发明在此做了详细说明，并列举特定的范例，对于本领域技术人员而言，显然在不背离本发明实质和范围的情况下，还可有多种改变和修饰。
                           序列表<110>亚斯曼·戴克斯(Jasmine DAKSIS)
 皮埃尔·皮卡德(Pierre PICARD)
 格伦·埃里克森(Glen ERIKSON)<120>利用荧光嵌入剂对双链和三链核酸在溶液中杂产的荧光强度分析
(fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid
hybridization in solution utilizing fluorescent intercalators)<130>SCT021230-09<140><141><160>25<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>1tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata        50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>2tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata         50<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>3tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata        50<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>4tggcaccatt aaagaaaata tacgctttgg tgtttcctat gatgaatata        50<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>5tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata           47<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PNA探针<400>6caccaaagat gatat                                               15<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PNA探针<400>7tatagtagaa accac                                          15<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>8atatcatctt tggtg                                          15<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>9atatcttctt tggtg                                          15<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>10atatcatctt tcgtg                                        15<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>11atatcatgtt tggtg                                        15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>12atatcatcta tggtg                                        15<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>13atatcatctc tggtg                                        15<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>14atatcatctg tgggtg                                        15<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>15atatcgtctt tggtg                                         15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>16atatcatttt tggtg                                         15<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>17atatcatctt ttgtg                                         15<210>18<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>18gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg       50<210>19<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>19gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg       50<210>20<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>20gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg       50<210>21<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>21gagcaccctc ccaggcacgg tcgtccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg       50<210>22<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>22gagcaccctc ccaggcacgg tcatccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg       50<210>23<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10<400>23gagcaccctc ccaggcacgg tattccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg       50<210>24<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ssDNA探针<400>24caccagagat gacag                                             15<210>25<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ssDNA探针<400>25caccagggac gaccg                                 15

Claims (32)

1.分析结合的一种方法，所述方法包含：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含与至少一部分的所述靶不完全互补的核酸或核酸类似物序列的探针；
提供一种嵌入剂，其中所述探针或所述嵌入剂之一含有荧光团；
将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入到杂交介质中，作为检测样品；
用激发辐射照射所述检测样品，使所述荧光团发出荧光；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；以及
从所述强度中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。
2.权利要求1的方法，其中所述确定是通过将所述强度与其它探针和所述靶及所述嵌入剂组合产生的强度校准来完成的，各所述其它探针至少与所述探针相差一个碱基。
3.权利要求2的方法，其中相对于所述靶，假使所述探针不是完全匹配，则各所述探针和所述其它探针是选自以下的不同的成员：完全匹配、单碱基错配、两个碱基的错配、三个碱基的错配、单碱基缺失、两个碱基的缺失和三个碱基的缺失。
4.权利要求1的方法，进一步包括量化所述结合亲合力。
5.权利要求1的方法，其中所述方法是一种均相分析，对于所述靶或所述探针不提供信号淬灭剂。
6.权利要求1的方法，其中所述方法是所述靶不经预变性所进行的均相分析。
7.权利要求1的方法，其中所述方法是所述靶不经PCR扩增所进行的均相分析。
8.权利要求1的方法，其中所述靶是dsDNA，所述探针与所述靶特异性地杂交形成三链体。
9.权利要求8的方法，其中所述探针是ssDNA或RNA。
10.权利要求1的方法，其中所述探针是部分带电荷的主链。
11.权利要求1的方法，其中所述探针是不带电荷的主链。
12.权利要求11的方法，其中所述探针包含PNA序列。
13.权利要求1的方法，其中所述探针是通过平行合成制备的ssPNA。
14.权利要求13的方法，其中所述探针和所述靶的长度相同。
15.权利要求1的方法，其中所述探针长为6到30个核苷酸。
16.权利要求1的方法，其中所述探针长为15个核苷酸。
17.权利要求1的方法，其中所述嵌入剂与所述探针共价相连。
18.权利要求1的方法，其中将所述嵌入剂加入到不含所述探针和所述靶的所述杂交介质中。
19.权利要求1的方法，其中所述嵌入剂选自：YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚体-1、乙啶同型二聚体-2和吖啶。
20.权利要求1的方法，其中所述探针实质上由所述核酸或所述核酸类似物序列组成。
21.权利要求1的方法，其中所述激发辐射是由波长为约200nm到约1000nm的氩离子激光器发射出的。
22.权利要求1的方法，在温度为5到85℃进行。
23.权利要求1的方法，在温度低于25℃时进行。
24.权利要求1的方法，其中所述方法的可靠性不依赖于探针或靶碱基序列，并且不依赖于探针或靶的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。
25.权利要求1的方法，其中所述检测样品体积约为20μl，包含约10fmole的靶和约10fmole的探针。
26.权利要求1的方法，其中所述样品中所述靶的浓度不高于5×10-10M。
27.权利要求23的方法，其中所述样品中所述探针的浓度不高于5×10-10M。
28.分析结合的一种方法，所述方法包含：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含第一种荧光团以及与至少一部分的所述靶不完全互补的核酸或核酸类似物序列的探针；
提供一种包含第二种荧光团的嵌入剂，其中所述第二种荧光团与所述第一种荧光团的荧光波长不同；
将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入到杂交介质中，作为检测样品；
用激发辐射照射所述检测样品，使所述第一种荧光团和所述第二种荧光团中的至少一个发出荧光；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；以及
从所述强度中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。
29.权利要求1的方法，其中所述嵌入剂发出荧光时的波长在嵌入后转变为第二种波长，所述波长与所述第二种波长之间的差异表明所述探针与所述靶形成的复合体是否是双链体或三链体，以及所述靶是否是DNA或RNA。
30.权利要求1的方法，在孔内或在不透性表面上的溶液中进行。
31.权利要求1的方法，在生物芯片上进行。
32.分析结合的一种方法，所述方法包含：
提供包含至少一种核酸序列的靶；
提供包含核酸或核酸类似物序列的探针；
提供一种嵌入剂，其中所述探针或所述嵌入剂包含一个荧光团；
将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入到杂交介质中，作为检测样品；
用激发辐射照射所述检测样品，使所述荧光团发出荧光；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；
将所述强度与其它探针和所述靶及所述嵌入剂组合产生的强度校准，其中相对于所述靶，各所述探针和所述其它探针是选自以下的不同成员：完全匹配、单碱基错配、两个碱基的错配、三个碱基的错配、单碱基缺失、两个碱基的缺失和三个碱基的缺失；以及
从所述校准中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6656692B2 (en) * 1999-12-21 2003-12-02 Ingeneus Corporation Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US6858390B2 (en) * 1998-12-31 2005-02-22 Ingeneus Corporation Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes
US7309569B2 (en) 1999-12-21 2007-12-18 Ingeneus, Inc. Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes
US7052844B2 (en) * 1999-12-21 2006-05-30 Ingeneus, Inc. Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism
US20030181412A1 (en) * 1999-12-21 2003-09-25 Ingeneus Corporation Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses
US20030170659A1 (en) * 2000-01-24 2003-09-11 Ingeneus Corporation Electrical treatment of binding media to encourage, discourage and/or study biopolymer binding
US7220541B2 (en) 2000-01-24 2007-05-22 Ingeneus, Inc. Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions
KR100386606B1 (ko) * 2001-02-03 2003-06-02 엘지전자 주식회사 Ｄｎａ 검출 방법 및 그 장치
KR100434067B1 (ko) * 2002-03-14 2004-06-04 엘지전자 주식회사 핵산 혼성화 검출을 위한 핵산검출장치 및 핵산 혼성화검출방법
JP2005289810A (ja) * 2002-03-18 2005-10-20 Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk 蛍光色素基およびインターカレート基を含有する二本鎖核酸を選択的に検出するための蛍光試薬
US20040019791A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Congruence, Llc Code for object identification
US7268878B2 (en) * 2002-08-01 2007-09-11 Sensor Technologies Llc Fluorescence correlation spectroscopy instrument and method of using the same
US20040142329A1 (en) * 2003-01-17 2004-07-22 Ingeneus Corporation Probe conjugation to increase multiplex binding motif preference
US20040180345A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-16 Ingeneus Corporation Pre-incubation method to improve signal/noise ratio of nucleic acid assays
GB0310270D0 (en) * 2003-05-03 2003-06-11 Univ Edinburgh Biomolecular devices
US8911942B2 (en) 2004-05-20 2014-12-16 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
AU2005286084C1 (en) * 2004-09-24 2011-11-24 Ingeneus Inc. Genomic assay
EP1846760B1 (en) 2005-01-27 2010-12-15 Quest Diagnostics Investments Incorporated Rapid comparative genome hybridization
US8076074B2 (en) 2005-11-29 2011-12-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Balanced translocation in comparative hybridization
RU2394915C2 (ru) * 2006-03-24 2010-07-20 Александр Борисович Четверин Бесконтактные способы обнаружения молекулярных колоний, наборы реагентов и устройство для их осуществления
US7807359B2 (en) 2006-12-01 2010-10-05 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods of detecting TPMT mutations
US7507539B2 (en) 2007-07-30 2009-03-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Substractive single label comparative hybridization
EP2201136B1 (en) * 2007-10-01 2017-12-06 Nabsys 2.0 LLC Nanopore sequencing by hybridization of probes to form ternary complexes and variable range alignment
US8093063B2 (en) 2007-11-29 2012-01-10 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids
US8262879B2 (en) 2008-09-03 2012-09-11 Nabsys, Inc. Devices and methods for determining the length of biopolymers and distances between probes bound thereto
US9650668B2 (en) 2008-09-03 2017-05-16 Nabsys 2.0 Llc Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels
JP5717634B2 (ja) 2008-09-03 2015-05-13 ナブシス， インコーポレイテッド 流体チャネル内の生体分子および他の分析物の電圧感知のための、長手方向に変位されるナノスケールの電極の使用
DK2337860T3 (en) * 2008-10-15 2016-08-29 Axolabs Gmbh A method for the detection of oligonucleotides
US8039794B2 (en) 2008-12-16 2011-10-18 Quest Diagnostics Investments Incorporated Mass spectrometry assay for thiopurine-S-methyl transferase activity and products generated thereby
US20110086772A1 (en) 2009-09-25 2011-04-14 Signature Genomics Laboratories Llc Multiplex (+/-) stranded arrays and assays for detecting chromosomal abnormalities associated with cancer and other diseases
US8715933B2 (en) 2010-09-27 2014-05-06 Nabsys, Inc. Assay methods using nicking endonucleases
US8859201B2 (en) 2010-11-16 2014-10-14 Nabsys, Inc. Methods for sequencing a biomolecule by detecting relative positions of hybridized probes
WO2012109574A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Nabsys, Inc. Assay methods using dna binding proteins
KR102012690B1 (ko) * 2011-07-12 2019-08-21 주식회사 파나진 평행 결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템
EP2802411B1 (en) * 2012-01-13 2017-04-05 Koninklijke Philips N.V. Dna sequencing with reagent recycling on wiregrid
US8956815B2 (en) 2012-04-18 2015-02-17 Toxic Report Llc Intercalation methods and devices
US9914966B1 (en) 2012-12-20 2018-03-13 Nabsys 2.0 Llc Apparatus and methods for analysis of biomolecules using high frequency alternating current excitation
US10294516B2 (en) 2013-01-18 2019-05-21 Nabsys 2.0 Llc Enhanced probe binding
RU2675502C1 (ru) * 2013-11-29 2018-12-19 Конинклейке Филипс Н.В. Оптический контроль химической реакции
CN113720837B (zh) * 2021-09-23 2024-01-19 西北大学 一种快速检测水体中汞离子的比色传感器

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4220450A (en) 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
FR2558172B1 (fr) 1984-01-16 1986-06-13 Inst Nat Sante Rech Med Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue
US4876187A (en) 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US5011769A (en) 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US5874555A (en) 1987-10-30 1999-02-23 California Institute Of Technology Triple helices and processes for making same
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1990002204A1 (en) 1988-08-31 1990-03-08 Research Development Foundation Manual in situ hybridization assay
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5824477A (en) 1990-09-12 1998-10-20 Scientific Generics Limited Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid
DE69128520T2 (de) 1990-10-31 1998-07-09 Tosoh Corp Verfahren zum Nachweis oder Quantifizierung von Zielnukleinsäuren
WO1992011390A1 (en) * 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5641625A (en) * 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US6048690A (en) 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5558998A (en) * 1992-02-25 1996-09-24 The Regents Of The Univ. Of California DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence
US5332659A (en) 1992-04-09 1994-07-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids
JPH06153997A (ja) * 1992-11-27 1994-06-03 Canon Inc 検出信号増幅による標的核酸の検出方法
US6027880A (en) 1995-08-02 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis
US5861124A (en) 1993-07-15 1999-01-19 Hamamatsu Photonics Kk Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid
EP0716713A1 (en) 1993-08-18 1996-06-19 Id Biomedical Corporation Compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing adjacent sequence-enzyme molecules
ATE227342T1 (de) 1993-09-02 2002-11-15 Ribozyme Pharm Inc Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
AU8102694A (en) 1993-11-17 1995-06-06 Id Biomedical Corporation Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences
US5998193A (en) 1994-06-24 1999-12-07 Gene Shears Pty., Ltd. Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof
JP3189000B2 (ja) * 1994-12-01 2001-07-16 東ソー株式会社 特定核酸配列の検出方法
US5814516A (en) 1995-10-13 1998-09-29 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof
US5824557A (en) 1996-04-02 1998-10-20 Panvera Corporation Method for detecting and quantitating nucleic acid impurities in biochemical preparations
SE506700C2 (sv) * 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US5948897A (en) 1996-06-14 1999-09-07 Simon Fraser University Method of binding two or more DNA double helices and products formed
US5912332A (en) 1996-07-26 1999-06-15 Hybridon, Inc. Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides
US5691145A (en) 1996-08-27 1997-11-25 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids using G-quartets
US6251591B1 (en) 1997-02-27 2001-06-26 Lorne Park Research, Inc. Quantitative method for detecting nucleotide concentration
US5846729A (en) * 1997-02-27 1998-12-08 Lorne Park Research, Inc. Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect
US6060242A (en) 1997-02-27 2000-05-09 Lorne Park Research, Inc. PNA diagnostic methods
US6046004A (en) * 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US6312925B1 (en) * 1997-05-08 2001-11-06 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions to facilitate D-loop formation by oligonucleotides
US6013442A (en) * 1997-08-05 2000-01-11 Wisconsin Alumni Res Found Direct quantitation of low copy number RNA
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
US6017709A (en) 1998-04-29 2000-01-25 University Of Houston DNA replication templates stabilized by guanine quartets
US6255050B1 (en) 1998-05-22 2001-07-03 Lorne Park Research, Inc. Dynamic hybridization system
GB9812768D0 (en) * 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
GB9821989D0 (en) * 1998-10-08 1998-12-02 Hybaid Ltd Detection of nucleic acid polymorphism
US6265170B1 (en) 2000-01-24 2001-07-24 Ingeneus Corporation Homogenous assay of duplex of triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions

Also Published As

Publication number Publication date
CA2394752C (en) 2012-09-25
AU778892B2 (en) 2004-12-23
JP4041867B2 (ja) 2008-02-06
DE60036307T2 (de) 2008-05-29
ES2296661T3 (es) 2008-05-01
IL150284A0 (en) 2002-12-01
IL150284A (en) 2008-03-20
RU2002119394A (ru) 2004-01-27
CA2394752A1 (en) 2001-06-28
AU1726301A (en) 2001-07-03
RU2273668C2 (ru) 2006-04-10
PT1242620E (pt) 2007-12-13
WO2001046467A3 (en) 2002-05-30
HK1047454A1 (en) 2003-02-21
EP1242620A2 (en) 2002-09-25
WO2001046467A2 (en) 2001-06-28
ATE372390T1 (de) 2007-09-15
KR20020079757A (ko) 2002-10-19
BR0016614A (pt) 2003-01-07
DE60036307D1 (de) 2007-10-18
EP1242620B1 (en) 2007-09-05
BR0016614A8 (pt) 2019-01-22
MXPA02006262A (es) 2004-09-06
US6403313B1 (en) 2002-06-11
JP2003517841A (ja) 2003-06-03
KR100537979B1 (en) 2005-12-21
HK1047454B (zh) 2008-07-25

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