JP2003517841A - 蛍光インターカレータを用いた溶液中の二本鎖および三本鎖核酸ハイブリダイゼーションの蛍光強度測定法 - Google Patents
蛍光インターカレータを用いた溶液中の二本鎖および三本鎖核酸ハイブリダイゼーションの蛍光強度測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、核酸ハイブリッド形成の均質測定法を提供する。プローブ、標的および挿入剤を含有するハイブリダイゼーション媒質の蛍光強度は、標的に対するプローブのハイブリダイゼーション効率の関数である。該測定法は、三本鎖を形成する一本鎖プローブと非変性二本鎖標的間の特異的ハイブリダイゼーションを検出することができ、これは標的を変性する必要性をなくす。該測定法はまた、二本鎖ハイブリダイゼーション複合体も検出することができる。該測定法は、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能領域を同定し、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合の数を決定し、またゲノム地図を作成するために、使用することが可能である。
Description
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の属する技術分野
本発明は、核酸を配列決定または測定する方法に関し、詳細には、蛍光強度測
定値を使用して三本鎖および二本鎖核酸ハイブリッド形成複合体を測定する方法
に関する。
定値を使用して三本鎖および二本鎖核酸ハイブリッド形成複合体を測定する方法
に関する。
【０００２】
２．関連技術の記載
蛍光染料は核酸を検出および定量化するために過去数十年間使用されてきた。
蛍光染料の最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定は、通常、蛍光発
色団を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを
除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステ
ップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善
している。
蛍光染料の最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定は、通常、蛍光発
色団を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを
除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステ
ップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善
している。
【０００３】
例えば、Ｌｉｖａｋらに付与された米国特許第５，５３８，８４８号およびＭ
ａｇｇｉｏに付与された第４，２２０，４５０号は、溶液中でオリゴヌクレオチ
ドプローブを使用した、ヌクレオチド配列の均質蛍光に基づく測定法を開示して
いる。しかしながら、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブとハイブ
リダイズしていないプローブによって生成される信号を区別するために、消光剤
をリポーター剤と組み合わせて使用することが必要である。Ｌｉｖａｋらは、開
示した方法において、酵素の使用も必要としている。消光剤と酵素によって、開
示した方法に複雑さと費用が増している。
ａｇｇｉｏに付与された第４，２２０，４５０号は、溶液中でオリゴヌクレオチ
ドプローブを使用した、ヌクレオチド配列の均質蛍光に基づく測定法を開示して
いる。しかしながら、これらの特許では、ハイブリダイズしたプローブとハイブ
リダイズしていないプローブによって生成される信号を区別するために、消光剤
をリポーター剤と組み合わせて使用することが必要である。Ｌｉｖａｋらは、開
示した方法において、酵素の使用も必要としている。消光剤と酵素によって、開
示した方法に複雑さと費用が増している。
【０００４】
Ｋｉｄｗｅｌｌに付与された米国特許第５，３３２，６５９号は、少なくとも
２つの蛍光発色団部分を有するプローブを使用して、溶液中のヌクレオチド配列
を検出する方法を開示している。蛍光発色団は、自身のスペクトルの波長依存性
を変えるのに十分なほど接近している時に互いに電子的に相互作用するように、
選択されなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハ
イブリダイズしたプローブよりもはるかに柔軟性がある。従って、各プローブ上
の２つの蛍光発色団部分は、プローブがハイブリダイズしている時よりもプロー
ブがハイブリダイズしていない時に、互いに接近する可能性が高い。したがって
、自由プローブに関連する放射波長の変化を、試料中の自由プローブの量の指標
としてモニタすることが可能である。
２つの蛍光発色団部分を有するプローブを使用して、溶液中のヌクレオチド配列
を検出する方法を開示している。蛍光発色団は、自身のスペクトルの波長依存性
を変えるのに十分なほど接近している時に互いに電子的に相互作用するように、
選択されなければならない。ハイブリダイズしていないプローブは標的配列にハ
イブリダイズしたプローブよりもはるかに柔軟性がある。従って、各プローブ上
の２つの蛍光発色団部分は、プローブがハイブリダイズしている時よりもプロー
ブがハイブリダイズしていない時に、互いに接近する可能性が高い。したがって
、自由プローブに関連する放射波長の変化を、試料中の自由プローブの量の指標
としてモニタすることが可能である。
【０００５】
Ｗｕらに付与された米国特許第５，８４６，７２９号も、核酸ハイブリッド形
成のための均質蛍光に基づく測定法を開示している。 測定法の中には、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間への蛍光発色
団の結合能に基いて、核酸ハイブリッド形成を検出するインターカレータ（挿入
剤）蛍光発色団を使用しているものもある。
成のための均質蛍光に基づく測定法を開示している。 測定法の中には、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間への蛍光発色
団の結合能に基いて、核酸ハイブリッド形成を検出するインターカレータ（挿入
剤）蛍光発色団を使用しているものもある。
【０００６】
例えばＢｕｒｋｅらに付与された米国特許第５，８２４，５５７号は、核酸分
子を検出し定量化する方法およびキットを開示している。好ましい実施形態は、
二本鎖核酸ヘリックスあるいは一本鎖核酸に染料を挿入することに依存している
。染料は挿入後に蛍光を発するが、その強度は試料中に存在する核酸の量の直接
測定値である。Ｂｕｒｋｅらの方法は、試料中の核酸の量を測定するのに役立つ
と伝えられているが、該方法の基礎となっている挿入剤と核酸間の非特異的結合
は、該方法を（特に標的でない核酸二本鎖が存在する条件下での）特異的結合の
検出に対して非実用的なものとしている。
子を検出し定量化する方法およびキットを開示している。好ましい実施形態は、
二本鎖核酸ヘリックスあるいは一本鎖核酸に染料を挿入することに依存している
。染料は挿入後に蛍光を発するが、その強度は試料中に存在する核酸の量の直接
測定値である。Ｂｕｒｋｅらの方法は、試料中の核酸の量を測定するのに役立つ
と伝えられているが、該方法の基礎となっている挿入剤と核酸間の非特異的結合
は、該方法を（特に標的でない核酸二本鎖が存在する条件下での）特異的結合の
検出に対して非実用的なものとしている。
【０００７】
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらに付与された米国特許第５，８１４，４４７号は、Ｂｕｒ
ｋｅらの測定法のような挿入剤と核酸二本鎖間の非特異的相互作用に基づく測定
法や、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらによって日本国特許公報第２３７０００号（１９９３
年）に記述された以前の測定法よりも優れた改良を与える測定法を開示している
。初期の開発は、標的核酸の特定領域がＰＣＲによって増幅する前に試料溶液に
挿入された時に蛍光強度の増大を示す傾向を有する挿入剤蛍光色素を添加するこ
とと、増幅前に標的核酸を検出かつ定量化するために反応溶液からの蛍光強度を
所定の時間間隔で測定することから成っていた。’４４７特許は、プローブが挿
入剤蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該挿入剤蛍光色素
は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ間の相補的結合部分に挿入さ
れることを特徴とする、改良された特異性を有する測定法を与えることにより、
以前の開発より優れた改良を行うことを試みた。
ｋｅらの測定法のような挿入剤と核酸二本鎖間の非特異的相互作用に基づく測定
法や、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらによって日本国特許公報第２３７０００号（１９９３
年）に記述された以前の測定法よりも優れた改良を与える測定法を開示している
。初期の開発は、標的核酸の特定領域がＰＣＲによって増幅する前に試料溶液に
挿入された時に蛍光強度の増大を示す傾向を有する挿入剤蛍光色素を添加するこ
とと、増幅前に標的核酸を検出かつ定量化するために反応溶液からの蛍光強度を
所定の時間間隔で測定することから成っていた。’４４７特許は、プローブが挿
入剤蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該挿入剤蛍光色素
は、標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ間の相補的結合部分に挿入さ
れることを特徴とする、改良された特異性を有する測定法を与えることにより、
以前の開発より優れた改良を行うことを試みた。
【０００８】
蛍光強度を検出する上述の開発に加えて、ある者は、蛍光偏光測定法の利点を
推薦した。しかしながら、偏光に基づく測定法には重大な欠点がある。結合の関
数としての偏光の変化の程度は予測不能であることがあり、一貫しないデータを
理論期待値に一致させるデータの解釈では、特に該方法が自動化される場合、分
析法で望まれる努力よりも多くの努力が要求され得る。
推薦した。しかしながら、偏光に基づく測定法には重大な欠点がある。結合の関
数としての偏光の変化の程度は予測不能であることがあり、一貫しないデータを
理論期待値に一致させるデータの解釈では、特に該方法が自動化される場合、分
析法で望まれる努力よりも多くの努力が要求され得る。
【０００９】
以上の開発にもかかわらず、核酸および／または核酸類似体の間の相互作用を
分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分
野では依然として必要とされている。
分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分
野では依然として必要とされている。
【００１０】
本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込
まれる。 （発明の概要） 本発明は、 少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と； 前記標的の少なくとも１部分に対して不完全に相補的な核酸または核酸の類似
体配列を有するプローブを提供する工程と； 挿入剤を提供する工程であって、前記プローブか前記挿入剤のいずれかが蛍光
発色団を有する工程と； ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を加
えて、測定用試料を提供する工程と； 前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試
料を照射する工程と； 前記プローブおよび前記標的の間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光
性の放射線の強度を検出する工程と； 前記強度から前記プローブおよび前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と
；から成る、結合を測定する方法を提供する。
まれる。 （発明の概要） 本発明は、 少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と； 前記標的の少なくとも１部分に対して不完全に相補的な核酸または核酸の類似
体配列を有するプローブを提供する工程と； 挿入剤を提供する工程であって、前記プローブか前記挿入剤のいずれかが蛍光
発色団を有する工程と； ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を加
えて、測定用試料を提供する工程と； 前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試
料を照射する工程と； 前記プローブおよび前記標的の間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光
性の放射線の強度を検出する工程と； 前記強度から前記プローブおよび前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と
；から成る、結合を測定する方法を提供する。
【００１１】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、標的とプローブ間の結合を測定する、迅速で、感度が高く、環境に
やさしくて、安全な方法を提供する。標的は核酸配列または核酸類似体配列を有
し、プローブは核酸配列または核酸類似体配列を有する。
やさしくて、安全な方法を提供する。標的は核酸配列または核酸類似体配列を有
し、プローブは核酸配列または核酸類似体配列を有する。
【００１２】
特定の先行技術と異なり、本発明はハイブリダイゼーションの存在を検出する
だけでなく、プローブと標的間のハイブリダイゼーションの性質に関する定性的
・定量的情報を提供する。従って、従事者は、完全対合、１つの塩基対誤対合、
２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠
失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
だけでなく、プローブと標的間のハイブリダイゼーションの性質に関する定性的
・定量的情報を提供する。従って、従事者は、完全対合、１つの塩基対誤対合、
２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠
失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。
【００１３】
本発明の実施形態は、第１のプローブ標的混合物について測定した蛍光強度を
、同じ標的および同じ挿入剤と結合した他のプローブによって示された強度に対
して較正することから成る。ここで、他のプローブの各々は、少なくとも１つの
塩基だけ、第１のプローブと異なっている。本発明の方法で検出される蛍光強度
は、プローブと標的間の結合親和性が増すにつれて増大する。本発明の方法は、
蛍光異方性の方法とは異なり、蛍光の偏光の測定を必要としない。
、同じ標的および同じ挿入剤と結合した他のプローブによって示された強度に対
して較正することから成る。ここで、他のプローブの各々は、少なくとも１つの
塩基だけ、第１のプローブと異なっている。本発明の方法で検出される蛍光強度
は、プローブと標的間の結合親和性が増すにつれて増大する。本発明の方法は、
蛍光異方性の方法とは異なり、蛍光の偏光の測定を必要としない。
【００１４】
強度が標的とプローブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可
能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤
対合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション
複合体の内部の誤対合の位置等と共に変化するために、本発明の測定方法を、標
的の配列決定を行うために使用することが可能である。
能である。標的と複数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤
対合の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション
複合体の内部の誤対合の位置等と共に変化するために、本発明の測定方法を、標
的の配列決定を行うために使用することが可能である。
【００１５】
本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情
報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様
々な用途に有用であり得る。
報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様
々な用途に有用であり得る。
【００１６】
先行技術の方法と異なり、本発明の測定法は好ましくは均質である。測定は、
蛍光強度検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複合体を分離
せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試
験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。
さらに、測定は、均質な溶液で好ましくは行われ、これは非結合プローブから、
ろ過と多数回の洗浄ステップまたはゲル電気泳動により結合複合体を分離する必
要をなくす。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化
できる。さらに、結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベ
ーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長
さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数
を、速やかに決定することを可能である。
蛍光強度検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複合体を分離
せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としないため、試
験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正確である。
さらに、測定は、均質な溶液で好ましくは行われ、これは非結合プローブから、
ろ過と多数回の洗浄ステップまたはゲル電気泳動により結合複合体を分離する必
要をなくす。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化
できる。さらに、結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベ
ーション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長
さ、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数
を、速やかに決定することを可能である。
【００１７】
さらに、本発明の測定法は、標的上のまたはプローブ上にシグナル消光剤を提
供せずに、好ましくは行われる。 本発明の好ましい実施形態は、特にプローブと二本鎖標的間の三本鎖ハイブリ
ダイゼーションを検出し、標的を変性する必要性をなくす。ＰＮＡ（ペプチド核
酸）プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られてい
るが（例えばＥｇｈｏｌｍら、３６５ Ｎａｔｕｒｅ ５６６ （１９９３）、
Ｔｏｍａｃら、１１８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ５５４４（１９９６）
参照）、本願発明者は該ＰＮＡプローブが一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡおよび
ＲＮＡ）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された三
本鎖を特に測定できることに驚いた。
供せずに、好ましくは行われる。 本発明の好ましい実施形態は、特にプローブと二本鎖標的間の三本鎖ハイブリ
ダイゼーションを検出し、標的を変性する必要性をなくす。ＰＮＡ（ペプチド核
酸）プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られてい
るが（例えばＥｇｈｏｌｍら、３６５ Ｎａｔｕｒｅ ５６６ （１９９３）、
Ｔｏｍａｃら、１１８ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ５５４４（１９９６）
参照）、本願発明者は該ＰＮＡプローブが一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡおよび
ＲＮＡ）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された三
本鎖を特に測定できることに驚いた。
【００１８】
本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ
、ＰＮＡ、荷電していないバックボーンを有する他の核酸類似体が含まれる。８
個から２０個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれ
が、原始核生物および真核生物のうちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲
だからである。１２〜１８個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最
小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、６〜３０塩
基から成るプローブが好まれ、１５塩基が最も好まれる。しかしながら、ヌクレ
オチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌ
クレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい
。
、ＰＮＡ、荷電していないバックボーンを有する他の核酸類似体が含まれる。８
個から２０個までの塩基の長さを有するプローブ配列が好まれる。なぜならそれ
が、原始核生物および真核生物のうちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲
だからである。１２〜１８個の塩基から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最
小の固有配列の長さであるので、特に好ましい。ある実施形態では、６〜３０塩
基から成るプローブが好まれ、１５塩基が最も好まれる。しかしながら、ヌクレ
オチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固有の標的配列を有するヌ
クレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプローブを使用してもよい
。
【００１９】
本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかる放射性のプローブの
使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましく
は、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成また
は注文し、保存することが可能である。
使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましく
は、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成また
は注文し、保存することが可能である。
【００２０】
本願発明者は、平行ＰＮＡプローブが従来通りに合成された逆平行ＰＮＡプロ
ーブよりも優れた性能を有することを発見したことにも驚いた。核酸標的配列の
長さがＰＮＡプローブの３倍を超える場合、平行・逆平行ＰＮＡプローブは、完
全対合の核酸ハイブリッド形成複合体と、１塩基対、２塩基対または３塩基対誤
対合を含む核酸ハイブリッド形成複合体とを区別するのに等しく有効であった。
しかしながら、標的ＤＮＡ配列の長さがＰＮＡプローブ配列の長さと同じだった
場合（つまり１５ヌクレオチド長）、完全対合複合体と１または２塩基誤対合複
合体との間に観察された蛍光強度の差がより大きいが故に、平行ＰＮＡプローブ
が逆平行ＰＮＡプローブよりもずっと好まれた。
ーブよりも優れた性能を有することを発見したことにも驚いた。核酸標的配列の
長さがＰＮＡプローブの３倍を超える場合、平行・逆平行ＰＮＡプローブは、完
全対合の核酸ハイブリッド形成複合体と、１塩基対、２塩基対または３塩基対誤
対合を含む核酸ハイブリッド形成複合体とを区別するのに等しく有効であった。
しかしながら、標的ＤＮＡ配列の長さがＰＮＡプローブ配列の長さと同じだった
場合（つまり１５ヌクレオチド長）、完全対合複合体と１または２塩基誤対合複
合体との間に観察された蛍光強度の差がより大きいが故に、平行ＰＮＡプローブ
が逆平行ＰＮＡプローブよりもずっと好まれた。
【００２１】
そのような条件下で平行ＰＮＡプローブが好まれる正確なメカニズムはわかっ
ていないが、上記の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
複合体は、類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定しておらず
、そのため核酸挿入剤の挿入が少なく、観察される蛍光強度の値がより低いこと
を示唆している。
ていないが、上記の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
複合体は、類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定しておらず
、そのため核酸挿入剤の挿入が少なく、観察される蛍光強度の値がより低いこと
を示唆している。
【００２２】
プローブと標的は共に標識されていないことが好ましい。しかし、代替実施形
態では、プローブに挿入剤が共有結合により結び付けられる。そのような実施形
態では、挿入剤は、プローブのいずれかの端部に好ましくは結び付けられる。
態では、プローブに挿入剤が共有結合により結び付けられる。そのような実施形
態では、挿入剤は、プローブのいずれかの端部に好ましくは結び付けられる。
【００２３】
別の実施形態では、挿入剤はプローブに共有結合によっては結び付けられない
が、非共有結合の様式でプローブに結合するという意味で、挿入剤を測定中にプ
ローブと標的の間に挿入することができる。
が、非共有結合の様式でプローブに結合するという意味で、挿入剤を測定中にプ
ローブと標的の間に挿入することができる。
【００２４】
本発明で使用される好ましい挿入剤としては、例えばＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ
−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２
、およびアクリジンが含まれる。一般に、挿入剤は、二本鎖および／または三本
鎖の核酸複合体の鎖の間に挿入可能な部分である。好ましい実施形態では、挿入
剤（またはその構成要素）は、核酸がない状態では本質的に非蛍光性であり、適
切な波長の放射線によって挿入および励起された時には蛍光を発し、二本鎖また
は三本鎖の核酸複合体に挿入された時には１００倍〜１０，０００倍の蛍光の増
強を示す。
−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２
、およびアクリジンが含まれる。一般に、挿入剤は、二本鎖および／または三本
鎖の核酸複合体の鎖の間に挿入可能な部分である。好ましい実施形態では、挿入
剤（またはその構成要素）は、核酸がない状態では本質的に非蛍光性であり、適
切な波長の放射線によって挿入および励起された時には蛍光を発し、二本鎖また
は三本鎖の核酸複合体に挿入された時には１００倍〜１０，０００倍の蛍光の増
強を示す。
【００２５】
代替実施形態では、挿入剤は、適切な波長の放射線により挿入および励起され
た時に、蛍光波長の変化を示し得る。正確な蛍光波長は、挿入される核酸の構造
に依存し得る（例えば、ＤＮＡ対ＲＮＡ、二本鎖対三本鎖等）。
た時に、蛍光波長の変化を示し得る。正確な蛍光波長は、挿入される核酸の構造
に依存し得る（例えば、ＤＮＡ対ＲＮＡ、二本鎖対三本鎖等）。
【００２６】
励起波長は、使用されている蛍光発色団の励起最大値に対応させるために、（
日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２０
０〜１０００ｎｍである。挿入剤は２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するよ
うに好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長
を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用さ
れ、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。
日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２０
０〜１０００ｎｍである。挿入剤は２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するよ
うに好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長
を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用さ
れ、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。
【００２７】
本発明の測定法は、例えば５〜８５℃のような種々の温度にわたって行うこと
が可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定
のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低
い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。
が可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定
のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低
い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。
【００２８】
本発明の信頼性は、前記標的中のグアニン・シトシン含量には依存しない。Ａ
−Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しない一方でＧ−Ｃ塩基対は３つの水素結
合を形成するため、より高いＧまたはＣ含量を有する標的配列およびプローブ配
列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハ
イブリッド中に存在するＧＣ含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標
的領域のＧＣ含量を増加させる塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合
の弱さを相殺し得る。プローブと標的間の考えられるすべての塩基対誤対合を含
むハイブリダイゼーション複合体は、完全に対合したハイブリッドよりも不安定
であることが分かっており、その結果、常に、完全に相補的なハイブリッドより
も蛍光強度が低い。
−Ｔ塩基対が２つの水素結合しか形成しない一方でＧ−Ｃ塩基対は３つの水素結
合を形成するため、より高いＧまたはＣ含量を有する標的配列およびプローブ配
列は、より高い溶融温度を有し、より安定している。従って、完全に対合したハ
イブリッド中に存在するＧＣ含量よりも、ハイブリダイズしたプローブおよび標
的領域のＧＣ含量を増加させる塩基対誤対合は、誤対合プローブに付随する結合
の弱さを相殺し得る。プローブと標的間の考えられるすべての塩基対誤対合を含
むハイブリダイゼーション複合体は、完全に対合したハイブリッドよりも不安定
であることが分かっており、その結果、常に、完全に相補的なハイブリッドより
も蛍光強度が低い。
【００２９】
本発明の測定法は非常に感度が高く、そのため、標的のＰＣＲ増幅を行う必要
性がない。例えば、体積が約２０μｌの測定用試料（約１０フェムトモルの標的
と約１０フェムトモルのプローブを含む）を測定することが可能である。本発明
の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃
度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は５Ｘ１０ −９ Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度のプローブを使用する
ように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出
できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
性がない。例えば、体積が約２０μｌの測定用試料（約１０フェムトモルの標的
と約１０フェムトモルのプローブを含む）を測定することが可能である。本発明
の実施形態は、５×１０−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃
度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本発明の実施形態は５Ｘ１０ −９ Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０−１０Ｍの濃度のプローブを使用する
ように十分な程度に感度が高い。上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出
できないことを示唆する意味ではないことは言うまでもない。
【００３０】
ハイブリダイゼーション媒質はヌクレオチドを保存するのに適していることで
知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， ”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，”第２巻
（１９８９年）を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩
衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。
知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， ”
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，”第２巻
（１９８９年）を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩
衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。
【００３１】
相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度および
緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を
適用する方法は、当該技術分野で周知である。
緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を
適用する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３２】
約１５℃〜約２５℃の温度、約１分〜約５分間で、ハイブリダイゼーション複
合体を形成することが好まれる。それより長い反応時間は必要でないが、数時間
インキュベーションしたとしてもハイブリダイゼーション複合体には悪影響を及
ぼさないだろう。
合体を形成することが好まれる。それより長い反応時間は必要でないが、数時間
インキュベーションしたとしてもハイブリダイゼーション複合体には悪影響を及
ぼさないだろう。
【００３３】
適切な蛍光挿入剤が反応混合物に含まれていると仮定すれば（先に論じたよう
に）、ほとんどの場合では、他の促進試薬は要求されない。しかしながら、ある
試薬の使用によって、溶液でのハイブリダイゼーションを促進することは可能で
ある。そのような試薬の好ましい例としては、Ｒｅｃ Ａタンパク質、Ｔ４遺伝
子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合タンパク質、核酸主溝ま
たは核酸小溝結合タンパク質；二価イオン；多価イオン；ビオロゲン；ならびに
臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシン等の挿入物
質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下
での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
に）、ほとんどの場合では、他の促進試薬は要求されない。しかしながら、ある
試薬の使用によって、溶液でのハイブリダイゼーションを促進することは可能で
ある。そのような試薬の好ましい例としては、Ｒｅｃ Ａタンパク質、Ｔ４遺伝
子３２タンパク質、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合タンパク質、核酸主溝ま
たは核酸小溝結合タンパク質；二価イオン；多価イオン；ビオロゲン；ならびに
臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシン等の挿入物
質が含まれる。そのような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下
での、極端な操作条件において有用であることが判明し得る。
【００３４】
本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能
な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決
定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決
定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。
【００３５】
本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例
に限定されないことを理解すべきである。 本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す以下の図面に関連付けて
説明する。
に限定されないことを理解すべきである。 本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す以下の図面に関連付けて
説明する。
【００３６】
（実施例）
実施例１
ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０由来のセンスとアンチセンス５０ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡ標的配列（Ｎａｔｕｒｅ ３８０ ２０７（１９９６年））を
、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オ
リゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわ
たって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを、１ ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
ｅｒ ｓｓＤＮＡ標的配列（Ｎａｔｕｒｅ ３８０ ２０７（１９９６年））を
、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オ
リゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわ
たって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを、１ ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００３７】
野生型標的ＤＮＡのセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）：５’
−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＴＴ
ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ ＣＴＴ
ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
【００３８】
野生型標的ＤＮＡのアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）
：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ
ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３
’。
：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ
ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３
’。
【００３９】
５０ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０７位置の野生型配列
ＣＡＴがＣＧＴに変化する１つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮ
Ａ（配列番号１と同じになるように調製した。
ＣＡＴがＣＧＴに変化する１つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮ
Ａ（配列番号１と同じになるように調製した。
【００４０】
この５０ｍｅｒ標的配列のセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列番号２
）：５’−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＧＴ
ＣＴＴ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−
３’。
）：５’−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＧＴ
ＣＴＴ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−
３’。
【００４１】
この５０ｍｅｒ標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列
番号２）：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ
ＣＡ−３’。
番号２）：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ
ＣＡ−３’。
【００４２】
５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０６，５０７位置の野生
型配列ＣＡＴがＡＣＴに変化する連続する２つの塩基対変異（下線）を除いて、
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
型配列ＣＡＴがＡＣＴに変化する連続する２つの塩基対変異（下線）を除いて、
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４３】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号３）；５’−Ｔ
ＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＴ ＣＴＴ Ｔ
ＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
ＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＴ ＣＴＴ Ｔ
ＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
【００４４】
この標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号３）：５
’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧ
Ａ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３’。
’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧ
Ａ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３’。
【００４５】
５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０６，５０７位置の野生
型配列ＣＡＴがＡＣＧに変化する連続する３つの塩基対変化（下線）を除いて、
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
型配列ＣＡＴがＡＣＧに変化する連続する３つの塩基対変化（下線）を除いて、
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４６】
この標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号４）：５’−Ｔ
ＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＧ ＣＴＴ Ｔ
ＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
ＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＣＧ ＣＴＴ Ｔ
ＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’。
【００４７】
この標的配列のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた（配列番号４）：
５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ Ａ
ＧＣ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３’
５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＣＡＡ Ａ
ＧＣ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ−３’
【００４８】
４７ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列は、アミノ酸５０７，５０８位置での野
生型配列ＣＴＴが欠失する連続する３つ塩基対欠失（省略記号で示した）を除い
て、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
生型配列ＣＴＴが欠失する連続する３つ塩基対欠失（省略記号で示した）を除い
て、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じになるように調製した。
【００４９】
この４７ｍｅｒ標的配列のセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号５）
：５’−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ
・・・ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’
。
：５’−ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＴ
・・・ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＡＴＡ ＴＡ−３’
。
【００５０】
この４７ｍｅｒ標的配列のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番
号５）：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ Ｃ
Ａ・・・Ａ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ
−３’。
号５）：５’−ＴＡＴ ＡＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ Ｃ
Ａ・・・Ａ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＡ
−３’。
【００５１】
実施例で使用するＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを合成し、ＨＰＬＣで精製
し、Ｃｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国バージ
ニア州リッチモンド所在）の質量分析法により確認した。ＰＮＡプローブは、最
初、１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解
し、次に、ｄｄＨ２Ｏの追加により１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。最終ＰＮＡ溶液
は１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度（ｄｄＨ２Ｏ溶液）に調製した。
し、Ｃｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国バージ
ニア州リッチモンド所在）の質量分析法により確認した。ＰＮＡプローブは、最
初、１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解
し、次に、ｄｄＨ２Ｏの追加により１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。最終ＰＮＡ溶液
は１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度（ｄｄＨ２Ｏ溶液）に調製した。
【００５２】
第１番プローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の
１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された１５ｍｅｒ逆
平行ＰＮＡプローブだった。第１番プローブは、アミノ酸５０５〜５１０位置（
Ｎａｔｕｒｅ ３８０、２０７（１９９６年）がオーバラップしている。第１番
プローブは以下の構造（配列番号６）を有していた：５’−Ｈ−ＣＡＣ ＣＡＡ
ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された１５ｍｅｒ逆
平行ＰＮＡプローブだった。第１番プローブは、アミノ酸５０５〜５１０位置（
Ｎａｔｕｒｅ ３８０、２０７（１９９６年）がオーバラップしている。第１番
プローブは以下の構造（配列番号６）を有していた：５’−Ｈ−ＣＡＣ ＣＡＡ
ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００５３】
第２番プローブは、第１番プローブと配列が同じ１５ｍｅｒＰＮＡプローブで
あったが、逆平行方向の配置ではなく、平行方向の配置であった。第２番プロー
ブは以下の構造（配列番号７）を有していた：５’−Ｈ−ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＧ
Ａ ＡＡＣ ＣＡＣ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
あったが、逆平行方向の配置ではなく、平行方向の配置であった。第２番プロー
ブは以下の構造（配列番号７）を有していた：５’−Ｈ−ＴＡＴ ＡＧＴ ＡＧ
Ａ ＡＡＣ ＣＡＣ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ２−３’。
【００５４】
各ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は下記を含有していた：４
ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅｓのＰＮＡプローブ、０．５×Ｔ
ＢＥ、および５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン所在）。反応混合物は変性するために５
〜１０分間、９５℃でインキュベートし、次に、測定まで８０℃に維持した。試
料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザー
ビームで照射し、温度が経時的に減少するにつれ、蛍光放出について繰り返しモ
ニタした。同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温
度プローブにより達成された。最大蛍光強度は５４０ｎｍの波長で生じたが、こ
れはＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへＹＯＹＯ−１が挿入されたことを示している
。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅｓのＰＮＡプローブ、０．５×Ｔ
ＢＥ、および５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン所在）。反応混合物は変性するために５
〜１０分間、９５℃でインキュベートし、次に、測定まで８０℃に維持した。試
料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザー
ビームで照射し、温度が経時的に減少するにつれ、蛍光放出について繰り返しモ
ニタした。同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温
度プローブにより達成された。最大蛍光強度は５４０ｎｍの波長で生じたが、こ
れはＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへＹＯＹＯ−１が挿入されたことを示している
。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【００５５】
ＤＮＡまたはＰＮＡが存在しない時（ＹＯＹＯ−１のみ）、または野生型配列
番号１、変異型配列番号２もしくは変異型配列番号３が第１番の逆平行ＰＮＡプ
ローブの番号１または第２番の平行ＰＮＡプローブと反応した時に観察される蛍
光強度を図１Ａ，１Ｂにそれぞれ示す。完全に相補的な配列（配列番号１＋第１
番のプローブ）から成るＳＳＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、最大のＹＯＹＯ−
１挿入を許容し、これにより最も高い蛍光強度が生じた。この蛍光強度は、温度
の減少とともに増加した（図１Ａ）。１つの塩基対が誤対合したｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッド（配列番号２＋第１番プローブ）および２塩基対が誤対合した
ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３＋第１番プローブ）の蛍光強度は
、６０℃では完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドよりもそれぞれ８１％
および８９％だけ低かった（図１Ａ）。同様に、第２番の平行ＰＮＡプローブを
標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズした場合には、１塩基対および２塩基対誤対合
ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、６０℃では完全に相補的なｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりもそれぞれ７０％および
８６％だけ低い蛍光強度を示した（図１Ｂ）。プローブと標的間の誤対合の程度
が増加するにつれて、ＹＯＹＯ−１による挿入のレベルは減少した。従って、蛍
光強度のレベルは減少した。使用されたプローブが逆平行であったか平行であっ
たかに関係なく、この関係は保持された。
番号１、変異型配列番号２もしくは変異型配列番号３が第１番の逆平行ＰＮＡプ
ローブの番号１または第２番の平行ＰＮＡプローブと反応した時に観察される蛍
光強度を図１Ａ，１Ｂにそれぞれ示す。完全に相補的な配列（配列番号１＋第１
番のプローブ）から成るＳＳＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、最大のＹＯＹＯ−
１挿入を許容し、これにより最も高い蛍光強度が生じた。この蛍光強度は、温度
の減少とともに増加した（図１Ａ）。１つの塩基対が誤対合したｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッド（配列番号２＋第１番プローブ）および２塩基対が誤対合した
ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３＋第１番プローブ）の蛍光強度は
、６０℃では完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドよりもそれぞれ８１％
および８９％だけ低かった（図１Ａ）。同様に、第２番の平行ＰＮＡプローブを
標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズした場合には、１塩基対および２塩基対誤対合
ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、６０℃では完全に相補的なｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりもそれぞれ７０％および
８６％だけ低い蛍光強度を示した（図１Ｂ）。プローブと標的間の誤対合の程度
が増加するにつれて、ＹＯＹＯ−１による挿入のレベルは減少した。従って、蛍
光強度のレベルは減少した。使用されたプローブが逆平行であったか平行であっ
たかに関係なく、この関係は保持された。
【００５６】
興味深いことに、標的ＤＮＡ配列がＰＮＡプローブ配列と同じ長さだった時（
つまり１５ヌクレオチド長の時）は、完全対合複合体と１または２塩基対誤対合
複合体との間に観察される蛍光強度の差がより大きくなるために、平行ＰＮＡプ
ローブが逆平行ＰＥＡプローブよりもずっと好まれた（データは図示しない）。
つまり１５ヌクレオチド長の時）は、完全対合複合体と１または２塩基対誤対合
複合体との間に観察される蛍光強度の差がより大きくなるために、平行ＰＮＡプ
ローブが逆平行ＰＥＡプローブよりもずっと好まれた（データは図示しない）。
【００５７】
平行ＰＮＡプローブがそのような条件下で好まれる正確なメカニズムはわかっ
ていないが、以上の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
複合体は類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定でなく、核酸
挿入剤の挿入が減少し、それ故により低い蛍光強度が観察されることを示唆して
いる。
ていないが、以上の観察は、誤対合平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション
複合体は類似の誤対合逆平行ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドほど安定でなく、核酸
挿入剤の挿入が減少し、それ故により低い蛍光強度が観察されることを示唆して
いる。
【００５８】
（実施例２）
図２は、本発明のハイブリダイゼーション測定法により、平行ＰＮＡプローブ
を使用した場合に、完全対合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドと、１，２，３ｂ
ｐ誤対合および３ｂｐ欠失を含むｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドとを区別する
ことができることを実証する。測定条件は、実施例１に記述したのと同じであっ
た。１ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号２＋第２番プロ
ーブ）、連続する２ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３
＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド
（配列番号４＋第２番プローブ）、３ｂｐ欠失のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッ
ド（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍光強度は、完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮ
Ａハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりも、６０℃では、４１％、
７１％、８７％、９５％だけ低かった。７０℃から６０℃まで温度が下がるにつ
れて、完全対合ハイブリッドと種々の塩基対誤対合ハイブリッド間の差の程度は
増加した。実施例１のように、プローブと標的間の誤対合の程度の増加により、
蛍光強度のレベルは次第に小さくなった。さらに、変異型配列が野生型配列より
も高いＧＣ含量を示した時でさえ、この蛍光パターンは一貫していた（図２）。
を使用した場合に、完全対合ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドと、１，２，３ｂ
ｐ誤対合および３ｂｐ欠失を含むｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドとを区別する
ことができることを実証する。測定条件は、実施例１に記述したのと同じであっ
た。１ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号２＋第２番プロ
ーブ）、連続する２ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号３
＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド
（配列番号４＋第２番プローブ）、３ｂｐ欠失のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッ
ド（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍光強度は、完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮ
Ａハイブリッド（配列番号１＋第２番プローブ）よりも、６０℃では、４１％、
７１％、８７％、９５％だけ低かった。７０℃から６０℃まで温度が下がるにつ
れて、完全対合ハイブリッドと種々の塩基対誤対合ハイブリッド間の差の程度は
増加した。実施例１のように、プローブと標的間の誤対合の程度の増加により、
蛍光強度のレベルは次第に小さくなった。さらに、変異型配列が野生型配列より
も高いＧＣ含量を示した時でさえ、この蛍光パターンは一貫していた（図２）。
【００５９】
平行ＰＮＡプローブを使用した場合、離散型２ｂｐ誤対合ハイブリッド（２つ
の１ｂｐ誤対合を３塩基対だけ離した）は、連続型２ｂｐ誤対合ハイブリッドよ
り蛍光強度がわずかに低かった（データは図示しない）。同様に、離散型３ｂｐ
誤対合ハイブリッド（３つの１ｂｐ誤対合を３つの塩基対だけ各々離した）は、
連続型３ｂｐ誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった（データは図
示しない）。これらの結果は、離散型塩基対誤対合では連続型塩基対誤対合より
も、ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド形成がより崩壊し易いことを示唆している
。
の１ｂｐ誤対合を３塩基対だけ離した）は、連続型２ｂｐ誤対合ハイブリッドよ
り蛍光強度がわずかに低かった（データは図示しない）。同様に、離散型３ｂｐ
誤対合ハイブリッド（３つの１ｂｐ誤対合を３つの塩基対だけ各々離した）は、
連続型３ｂｐ誤対合ハイブリッドより蛍光強度がわずかに低かった（データは図
示しない）。これらの結果は、離散型塩基対誤対合では連続型塩基対誤対合より
も、ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド形成がより崩壊し易いことを示唆している
。
【００６０】
（実施例３）
配列番号８は、第１番プローブに完全に相補的になるように設計された、配列
番号１に由来する１５ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。配列番号９〜配列
番号１７は、１塩基対の変化（下線）を除いて野生型の配列番号８と同一な、１
５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。センスとアンチセンスの１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡ配列を、上述のように合成し、精製し、アニールした。ｄｓＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した
。
番号１に由来する１５ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。配列番号９〜配列
番号１７は、１塩基対の変化（下線）を除いて野生型の配列番号８と同一な、１
５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。センスとアンチセンスの１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡ配列を、上述のように合成し、精製し、アニールした。ｄｓＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した
。
【００６１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号８）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号８）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｃ
ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号８）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｃ
ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６２】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号９）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＴ
ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号９）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｃ
ＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号９）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｃ
ＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６３】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１０）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＴＴＣ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１０）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｇ ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＴＴＣ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１０）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ｇ ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６４】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１１）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１１）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＧＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１１）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６５】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１２）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６６】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１３）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６７】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１４）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１４）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１４）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＣ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６８】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１５）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＧ
ＴＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１５）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＣＡＡ ＡＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００６９】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１６）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１６）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１６）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００７０】
変異型標的ＤＮＡ（配列番号１７）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡ ＴＣＡ
ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１７）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ａ ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
ＴＣＴ ＴＴＴ ＧＴＧ−３’であった。 変異型標的ＤＮＡ（配列番号１７）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ Ａ ＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴ−３’であった。
【００７１】
１５ｍｅｒ野生型目標ｄｓＤＮＡ（配列番号８）および考えられるあらゆるタ
イプの１ｂｐ誤対合を生成する種々の１５ｍｅｒ １ｂｐ変異ｄｓＤＮＡ（配列
番号９〜配列番号１７）と第２番の平行ＰＮＡプローブを反応させることにより
、ハイブリダイゼーションアッセイの特異性についてさらに試験した（図３）。
測定条件は実施例１に記述したのと同一にした。
イプの１ｂｐ誤対合を生成する種々の１５ｍｅｒ １ｂｐ変異ｄｓＤＮＡ（配列
番号９〜配列番号１７）と第２番の平行ＰＮＡプローブを反応させることにより
、ハイブリダイゼーションアッセイの特異性についてさらに試験した（図３）。
測定条件は実施例１に記述したのと同一にした。
【００７２】
最も高い蛍光強度を、すべての試験温度で、完全に相補的な配列から成るｓｓ
ＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドに関して達成した。温度の減少とともに、蛍光は増
大した。１ｂｐのＴ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｇ−Ｇ、Ａ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｔお
よびＣ−Ｔ誤対合を生じるｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドはすべて、完全対合
のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドで観察された蛍光強度よりも低い蛍光強度を
生じた（図３Ａおよび３Ｂ）。１ｂｐ誤対合に対する蛍光強度は、完全対合で観
察された蛍光強度よりも、５５℃と７５℃のそれぞれにおいて、６４％〜９６％
だけ、および５７％〜９５％だけ低かった。平行ＰＮＡプローブを使用した場合
（図３）、種々の１ｂｐ誤対合間で観察された蛍光強度の変化は、変異型配列の
ＧＣ含量パーセントの変化よりも特定の塩基対誤対合の方に依存していた。同様
の実験で第１番の逆平行ＰＮＡプローブを試験した場合、完全対合と種々の１ｂ
ｐ誤対合間で観察される蛍光強度の差は、第２番の平行ＰＮＡプローブを用いて
達成される蛍光強度の差ほど劇的ではなく、温度の影響を受けるようであった（
データは図示しない）。逆平行ＰＮＡプローブを使用した時、測定は４０℃と６
０℃の間で最良の結果を生じた。したがって、標的ＤＮＡ配列がＰＮＡプローブ
配列と同じ長さである場合には、平行ＰＮＡプローブが好まれる。
ＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドに関して達成した。温度の減少とともに、蛍光は増
大した。１ｂｐのＴ−Ｔ、Ｃ−Ｃ、Ｇ−Ｇ、Ａ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｔお
よびＣ−Ｔ誤対合を生じるｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドはすべて、完全対合
のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドで観察された蛍光強度よりも低い蛍光強度を
生じた（図３Ａおよび３Ｂ）。１ｂｐ誤対合に対する蛍光強度は、完全対合で観
察された蛍光強度よりも、５５℃と７５℃のそれぞれにおいて、６４％〜９６％
だけ、および５７％〜９５％だけ低かった。平行ＰＮＡプローブを使用した場合
（図３）、種々の１ｂｐ誤対合間で観察された蛍光強度の変化は、変異型配列の
ＧＣ含量パーセントの変化よりも特定の塩基対誤対合の方に依存していた。同様
の実験で第１番の逆平行ＰＮＡプローブを試験した場合、完全対合と種々の１ｂ
ｐ誤対合間で観察される蛍光強度の差は、第２番の平行ＰＮＡプローブを用いて
達成される蛍光強度の差ほど劇的ではなく、温度の影響を受けるようであった（
データは図示しない）。逆平行ＰＮＡプローブを使用した時、測定は４０℃と６
０℃の間で最良の結果を生じた。したがって、標的ＤＮＡ配列がＰＮＡプローブ
配列と同じ長さである場合には、平行ＰＮＡプローブが好まれる。
【００７３】
図３の結果により、あらゆる１ｂｐ誤対合を高い精度で同定するための、ハイ
ブリダイゼーション測定法の信頼性が確認された。 （実施例４） 実施例１〜３のハイブリダイゼーションアッセイを、ｄｓＤＮＡ標的配列の変
性と、ｄｓＤＮＡ標的の融点（Ｔｍ）を超える温度でのｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイ
ブリッド形成測定後に行った。この実施例では、予めの変性を必要とせずに完全
対合と塩基対誤対合と区別するための、本発明のアッセイの信頼性を実証する。
ブリダイゼーション測定法の信頼性が確認された。 （実施例４） 実施例１〜３のハイブリダイゼーションアッセイを、ｄｓＤＮＡ標的配列の変
性と、ｄｓＤＮＡ標的の融点（Ｔｍ）を超える温度でのｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイ
ブリッド形成測定後に行った。この実施例では、予めの変性を必要とせずに完全
対合と塩基対誤対合と区別するための、本発明のアッセイの信頼性を実証する。
【００７４】
ハイブリダイゼーション反応混合物（１２０μｌ）は下記のものを含んでいた
：６ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、６ｐｍｏｌｅｓの第２番平行ＰＮＡプロー
ブ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。反応量は実
施例１〜３のものよりもわずかに大きかったが、ＤＮＡ、ＰＮＡ、およびＹＯＹ
Ｏ−１の量は、試料の濃度を一定に維持するように対応して調節された。反応量
が４０μｌ、８０μｌまたは１２０μｌの時、同一の結果が得られた。反応混合
物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８
ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、加熱室で温度が経
時的に増加するにつれて蛍光放出について繰り返しモニタした。試料の同時温度
測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達
成された。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
：６ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、６ｐｍｏｌｅｓの第２番平行ＰＮＡプロー
ブ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。反応量は実
施例１〜３のものよりもわずかに大きかったが、ＤＮＡ、ＰＮＡ、およびＹＯＹ
Ｏ−１の量は、試料の濃度を一定に維持するように対応して調節された。反応量
が４０μｌ、８０μｌまたは１２０μｌの時、同一の結果が得られた。反応混合
物を室温（２１℃）で５分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、４８８
ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービームで照射し、加熱室で温度が経
時的に増加するにつれて蛍光放出について繰り返しモニタした。試料の同時温度
測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブにより達
成された。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の関数としてプロットした。
【００７５】
図４は、野生型５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列（配列番号１）を３０℃〜８
５℃で１５ｍｅｒの第２番平行ＰＮＡプローブと反応させた時に、前もって変性
しなくても最も高い蛍光強度が達成されたことを説明する。５０ｍｅｒ野生型ｄ
ｓＤＮＡのＴｍである６５℃より低い温度では、ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖が形
成された。６５℃を超えて温度が上昇されるにつれて、三本鎖構造が、ｓｓＤＮ
Ａ：ＰＮＡ二本鎖に変換された。ＹＯＹＯ−１を三本鎖構造と二本鎖構造の両方
で効率的に挿入できることは明らかであった。従って、１ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ
：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第２番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合三本鎖
（配列番号３＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合三本鎖（配列番号４＋
第２番プローブ）および３ｂｐ欠失三本鎖（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍
光強度は、完全対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋第２番プローブ）
よりも、それぞれ８３％、９３％、９９％、９９．５％だけ低かった。温度が３
０℃から８５℃まで増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度が
減少した。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合および３ｂｐ
欠失ハイブリッドの蛍光強度は、完全に相補的な配列で観察された蛍光強度より
も、それぞれ６５％、７６％、９４％、９５％だけ低かった。したがって、本発
明のハイブリダイゼーションアッセイは、配列を予め変性しなくても、野生型配
列と、１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐ変異もしくは欠失を含む配列とを区別するこ
とができる。
５℃で１５ｍｅｒの第２番平行ＰＮＡプローブと反応させた時に、前もって変性
しなくても最も高い蛍光強度が達成されたことを説明する。５０ｍｅｒ野生型ｄ
ｓＤＮＡのＴｍである６５℃より低い温度では、ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖が形
成された。６５℃を超えて温度が上昇されるにつれて、三本鎖構造が、ｓｓＤＮ
Ａ：ＰＮＡ二本鎖に変換された。ＹＯＹＯ−１を三本鎖構造と二本鎖構造の両方
で効率的に挿入できることは明らかであった。従って、１ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ
：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第２番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合三本鎖
（配列番号３＋第２番プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合三本鎖（配列番号４＋
第２番プローブ）および３ｂｐ欠失三本鎖（配列番号５＋第２番プローブ）の蛍
光強度は、完全対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋第２番プローブ）
よりも、それぞれ８３％、９３％、９９％、９９．５％だけ低かった。温度が３
０℃から８５℃まで増加するとともに、完全対合と塩基対誤対合間の差の程度が
減少した。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合および３ｂｐ
欠失ハイブリッドの蛍光強度は、完全に相補的な配列で観察された蛍光強度より
も、それぞれ６５％、７６％、９４％、９５％だけ低かった。したがって、本発
明のハイブリダイゼーションアッセイは、配列を予め変性しなくても、野生型配
列と、１ｂｐ、２ｂｐまたは３ｂｐ変異もしくは欠失を含む配列とを区別するこ
とができる。
【００７６】
（実施例５）
第３番プローブは、第１番の１５ｍｅｒ逆平行ＰＮＡプローブと配列および方
向が同じ１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった（配列番号６）。第３番プロ
ーブは５’−ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴー３’の構造を有してい
た。
向が同じ１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった（配列番号６）。第３番プロ
ーブは５’−ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＡＴー３’の構造を有してい
た。
【００７７】
ハイブリダイゼーションアッセイの特異性を、予め変性を行わずに、５０ｍｅ
ｒ野生型および変異型ｄｓＤＮＡ標的配列と第３番ｓｓＤＮＡプローブを反応さ
せることにより、さらに検査した。アッセイ条件は、実施例４に記述したのと同
じにした。
ｒ野生型および変異型ｄｓＤＮＡ標的配列と第３番ｓｓＤＮＡプローブを反応さ
せることにより、さらに検査した。アッセイ条件は、実施例４に記述したのと同
じにした。
【００７８】
ＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１で増強し、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖を３０℃
〜６５℃の間で形成した。配列番号１＋第３番プローブから成る完全対合のＤＮ
Ａ三本鎖は、最も高い蛍光強度を生じた（図５）。これに対して、１ｂｐ誤対合
（配列番号２＋第３番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合（配列番号３＋第３番
プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合（配列番号４＋第３番プローブ）および３ｂ
ｐ欠失（配列番号５＋第３番プローブ）を生成する不完全に相補的なプローブと
標的の組み合わせでは、完全対合の配列で観察されたのよりも、３０℃でそれぞ
れ５７％，９４％，９７％，９８％，６５℃で４７％，７９％，９２％，９１％
だけ蛍光強度が低下した（図５）。温度が６５℃を超えて増加するとともに、完
全対合と塩基対誤対合間の差の程度は減少した。これはＤＮＡ三本鎖構造の徐々
の分解を示す。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合、および
３ｂｐ欠失によって達成された蛍光強度は、完全対合によって得られた蛍光強度
よりも、４０％，６３％，９２％，８３％だけ低かった（図５）。ＹＯＹＯ−１
の存在によって、予め変性を行う必要なく、完全に相補的な配列と１ｂｐ、２ｂ
ｐまたは３ｂｐ誤対合または欠失を含む配列とを区別するために、ＰＮＡプロー
ブの代りにｓｓＤＮＡプローブを使用することができた。
〜６５℃の間で形成した。配列番号１＋第３番プローブから成る完全対合のＤＮ
Ａ三本鎖は、最も高い蛍光強度を生じた（図５）。これに対して、１ｂｐ誤対合
（配列番号２＋第３番プローブ）、連続する２ｂｐ誤対合（配列番号３＋第３番
プローブ）、連続する３ｂｐ誤対合（配列番号４＋第３番プローブ）および３ｂ
ｐ欠失（配列番号５＋第３番プローブ）を生成する不完全に相補的なプローブと
標的の組み合わせでは、完全対合の配列で観察されたのよりも、３０℃でそれぞ
れ５７％，９４％，９７％，９８％，６５℃で４７％，７９％，９２％，９１％
だけ蛍光強度が低下した（図５）。温度が６５℃を超えて増加するとともに、完
全対合と塩基対誤対合間の差の程度は減少した。これはＤＮＡ三本鎖構造の徐々
の分解を示す。８５℃で、１ｂｐ誤対合、２ｂｐ誤対合、３ｂｐ誤対合、および
３ｂｐ欠失によって達成された蛍光強度は、完全対合によって得られた蛍光強度
よりも、４０％，６３％，９２％，８３％だけ低かった（図５）。ＹＯＹＯ−１
の存在によって、予め変性を行う必要なく、完全に相補的な配列と１ｂｐ、２ｂ
ｐまたは３ｂｐ誤対合または欠失を含む配列とを区別するために、ＰＮＡプロー
ブの代りにｓｓＤＮＡプローブを使用することができた。
【００７９】
（実施例６）
予め変性を行わずにｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的を使用して行う
ハイブリダイゼーションアッセイが劇的に異なるＧＣ含量パーセント（従って異
なる溶融温度）を有するプローブと標的ＤＮＡにも適用されることを保証するた
めに、新たな１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブと５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配
列を、上述のように合成、精製、アニールした。ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮ
Ａ標的は共に１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
ハイブリダイゼーションアッセイが劇的に異なるＧＣ含量パーセント（従って異
なる溶融温度）を有するプローブと標的ＤＮＡにも適用されることを保証するた
めに、新たな１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブと５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配
列を、上述のように合成、精製、アニールした。ｓｓＤＮＡプローブとｄｓＤＮ
Ａ標的は共に１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【００８０】
配列番号１８は、配列番号１から改変（ＧＣ含量パーセントを３０％から５２
％に変更）した５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ
ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
％に変更）した５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＡＴ ＧＡＣ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ
ＧＴＣ ＣＴＡ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
【００８１】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ
ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ
ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ− ３’であった。
ＡＧＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ
ＣＡＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ− ３’であった。
【００８２】
配列番号１９は、配列ＣＡＴをＣＧＴに変更した１つの塩基対変化（下線）を
除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だった。 変異型配列番号１９のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡ
Ｃ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＴ
Ａ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だった。 変異型配列番号１９のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡ
Ｃ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＴ
Ａ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
【００８３】
変異型配列番号１９のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ ＡＧＴ ＣＡＴ
ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＣＡＧ ＴＧＴ
ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＣＡＧ ＴＧＴ
ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
【００８４】
配列番号２０は、配列ＣＡＴをＡＣＴに変更した連続する２つの塩基対変化（
下線）を除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だ
った。
下線）を除いて配列番号１８と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列だ
った。
【００８５】
変異型配列番号２０のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＡ
Ｃ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＡＣＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＴ
Ａ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
Ｃ ＡＧＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＡＣＴ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＴＣ ＣＴ
Ａ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＴＧ−３’であった。
【００８６】
変異型配列番号２０のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＧ ＡＧＴ ＣＡＴ
ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ
ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
ＣＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ
ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
【００８７】
配列番号は、配列番号１から改変（ＧＣ含量パーセントを３０％から７２％ま
で変更）した５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ
ＧＡＣ ＣＴＣ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
で変更）した５０ｍｅｒ ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ
ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＧＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ
ＧＡＣ ＣＴＣ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
【００８８】
野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ
ＧＣＴ ＣＧＴ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＧＡ
ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
ＧＣＴ ＣＧＴ ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＧＡ
ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
【００８９】
配列番号２２は、配列ＣＧＴをＣＡＴに変更した１つの塩基対変化（下線）を
除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 変異型配列番号２２のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＣ
Ｃ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＴ
Ｃ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。 変異型配列番号２２のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＣ
Ｃ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＴ
Ｃ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
【００９０】
変異型配列番号２２のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＴ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＣＧ ＴＧＣ
ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＣＧ ＴＧＣ
ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
【００９１】
配列番号２３は、配列ＣＧＴをＡＴＴに変更した連続する２つの塩基対変化（
下線）を除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列で
あった。
下線）を除いて配列番号２１と同一の、５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列で
あった。
【００９２】
変異型配列番号２３のセンス鎖の配列は５’−ＧＡＧ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＣ
Ｃ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＴ
Ｃ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
Ｃ ＡＧＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＧＡＣ ＣＴ
Ｃ ＣＧＡ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＧ−３’であった。
【００９３】
変異型配列番号２３のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＴ
ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＧＣ
ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＧＣ
ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ ＴＣ−３’であった。
【００９４】
第４番のプローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１８）のセンス
鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２４）
を有していた：５’−ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＣＡＧ−３’。
鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２４）
を有していた：５’−ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＣＡＧ−３’。
【００９５】
第５番のプローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号２１）のセンス
鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２５）
を有していた： ５’−ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ＣＣＧ−３’。
鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるように設計された１５ｍ
ｅｒ ｓｓＤＮＡプローブであった。該プローブは以下の構造（配列番号２５）
を有していた： ５’−ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ＣＣＧ−３’。
【００９６】
ハイブリダイゼーションアッセイ条件は実施例４に記述したのと同一とした。
第４番ｓｓＤＮＡプローブ（ＧＣ含量５３％）を、５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮ
Ａ標的（配列番号１８）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１９および配列
番号２０）にハイブリダイズさせた時、非変性条件下の低温でｄｓＤＮＡ：ｓｓ
ＤＮＡ三本鎖が生じた（図６Ａ）。
Ａ標的（配列番号１８）および変異型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１９および配列
番号２０）にハイブリダイズさせた時、非変性条件下の低温でｄｓＤＮＡ：ｓｓ
ＤＮＡ三本鎖が生じた（図６Ａ）。
【００９７】
完全対合のＤＮＡ三本鎖が最も高い蛍光強度を達成する一方で、１ｂｐ誤対合
（配列番号１９＋第４番プローブ）および２ｂｐ誤対合（配列番号２０＋第４番
プローブ）を有する不完全に相補的な三本鎖は、完全対合の配列で観察される蛍
光強度よりも、３０℃でそれぞれ６３％，９５％だけ低い蛍光強度を生じた（図
６Ａ）。温度が増加するにつれて、ＤＮＡ三本鎖構造の分解が徐々に起こり、蛍
光強度が減少し、完全対合と塩基対誤対合間の蛍光強度の差が小さくなった。８
５℃では、完全対合配列と塩基対誤対合を含む配列の間には、蛍光の差はほとん
ど見い出されなかった（図６Ａ）。
（配列番号１９＋第４番プローブ）および２ｂｐ誤対合（配列番号２０＋第４番
プローブ）を有する不完全に相補的な三本鎖は、完全対合の配列で観察される蛍
光強度よりも、３０℃でそれぞれ６３％，９５％だけ低い蛍光強度を生じた（図
６Ａ）。温度が増加するにつれて、ＤＮＡ三本鎖構造の分解が徐々に起こり、蛍
光強度が減少し、完全対合と塩基対誤対合間の蛍光強度の差が小さくなった。８
５℃では、完全対合配列と塩基対誤対合を含む配列の間には、蛍光の差はほとん
ど見い出されなかった（図６Ａ）。
【００９８】
同様に、ＹＯＹＯ−１の存在下で、第５番ｓｓＤＮＡプローブ（ＧＣ含量７３
％）を対応する５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２１）および変異型
ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２２および配列番号２３）と反応させた時、ｄｓＤＮ
Ａ：ｓｓＤＮＡ三本鎖が形成された。
％）を対応する５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２１）および変異型
ｄｓＤＮＡ標的（配列番号２２および配列番号２３）と反応させた時、ｄｓＤＮ
Ａ：ｓｓＤＮＡ三本鎖が形成された。
【００９９】
１ｂｐの誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号２２＋第５番プローブ）および連続す
る２ｂｐの誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号２３＋第５番プローブ）の蛍光強度は
、完全対合配列より得られる蛍光強度よりも、３０℃でそれぞれ４８％，６％だ
け低かった（図６Ｂ）。温度が３０℃から８５℃ｐまで増加するとともに、すべ
ての試料の蛍光は減少したが、これはＹＯＹＯ−１の挿入が減少し、ＤＮＡ三本
鎖が分解したことを示している。
る２ｂｐの誤対合ＤＮＡ三本鎖（配列番号２３＋第５番プローブ）の蛍光強度は
、完全対合配列より得られる蛍光強度よりも、３０℃でそれぞれ４８％，６％だ
け低かった（図６Ｂ）。温度が３０℃から８５℃ｐまで増加するとともに、すべ
ての試料の蛍光は減少したが、これはＹＯＹＯ−１の挿入が減少し、ＤＮＡ三本
鎖が分解したことを示している。
【０１００】
ｓｓＤＮＡプローブおよびｄｓＤＮＡ標的のＧＣ含量パーセントにかかわらず
、ＹＯＹＯ−１は非変性条件下でのＤＮＡ三本鎖の形成を促進することができ、
完全に相補的な配列間と、１または２ｂｐの変異を含む配列との間の、正確な区
別を可能にした。
、ＹＯＹＯ−１は非変性条件下でのＤＮＡ三本鎖の形成を促進することができ、
完全に相補的な配列間と、１または２ｂｐの変異を含む配列との間の、正確な区
別を可能にした。
【０１０１】
（実施例７）
実施例５，６におけるハイブリダイゼーションアッセイは、ｓｓＤＮＡプロー
ブを使用して、予め変性する必要なく、野生型ＤＮＡ配列と、塩基対誤対合また
は欠失を含む配列との間を識別する本発明の信頼性の高さを証明した。そのよう
なアッセイは、ｄｓＤＮＡ標的の融点未満のＤＮＡ三本鎖の形成を測定した。さ
らに、野生型配列と変異配列間の最適な差は、測定した中で最も低温である３０
℃で達成された。３０℃より低い温度がアッセイに対してさらに有益かどうか決
定するために、第３番１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブを、５℃〜３０℃の間で
５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）または５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤ
ＮＡ標的（配列番号２）と反応させた。
ブを使用して、予め変性する必要なく、野生型ＤＮＡ配列と、塩基対誤対合また
は欠失を含む配列との間を識別する本発明の信頼性の高さを証明した。そのよう
なアッセイは、ｄｓＤＮＡ標的の融点未満のＤＮＡ三本鎖の形成を測定した。さ
らに、野生型配列と変異配列間の最適な差は、測定した中で最も低温である３０
℃で達成された。３０℃より低い温度がアッセイに対してさらに有益かどうか決
定するために、第３番１５ｍｅｒ ｓｓＤＮＡプローブを、５℃〜３０℃の間で
５０ｍｅｒ野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）または５０ｍｅｒ変異型ｄｓＤ
ＮＡ標的（配列番号２）と反応させた。
【０１０２】
図７Ａでは、２ｐｍｏｌｅｓのｄｓＤＮＡ標的を、０．５×ＴＢＥおよび５０
０ｎＭのＹＯＹＯ−１を含む４０μｌ反応混合物中の２ｐｍｏｌｅｓの第３番ｓ
ｓＤＮＡプローブと反応させた。図７Ｂでは、５００ｆｍｏｌｅｓ（つまり１０ −１５ モル）のｄｓＤＮＡ標的を、０．５×ＴＢＥおよび２５０ｎＭのＹＯＹＯ
−１を含む４０μｌ反応混合物中の５００ｆｍｏｌｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプロ
ーブと反応させた。反応混合物を、５分間室温（２１℃）でインキュベートし、
石英キュベットに移し、実施例４〜６で行ったように３０℃でアルゴンイオンレ
ーザービームで照射した。続けて、試料を含むキュベットを氷上に置いた。各試
料の温度が２０℃（各試料内に直接入れた温度プローブによって決定）に達した
ら、試料を測定チャンバに移し、温度が５℃から３０℃まで増加するにつれて蛍
光放出に対して繰り返しモニタした。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の
関数としてプロットした。
０ｎＭのＹＯＹＯ−１を含む４０μｌ反応混合物中の２ｐｍｏｌｅｓの第３番ｓ
ｓＤＮＡプローブと反応させた。図７Ｂでは、５００ｆｍｏｌｅｓ（つまり１０ −１５ モル）のｄｓＤＮＡ標的を、０．５×ＴＢＥおよび２５０ｎＭのＹＯＹＯ
−１を含む４０μｌ反応混合物中の５００ｆｍｏｌｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプロ
ーブと反応させた。反応混合物を、５分間室温（２１℃）でインキュベートし、
石英キュベットに移し、実施例４〜６で行ったように３０℃でアルゴンイオンレ
ーザービームで照射した。続けて、試料を含むキュベットを氷上に置いた。各試
料の温度が２０℃（各試料内に直接入れた温度プローブによって決定）に達した
ら、試料を測定チャンバに移し、温度が５℃から３０℃まで増加するにつれて蛍
光放出に対して繰り返しモニタした。最大蛍光強度を、分析した各試料の温度の
関数としてプロットした。
【０１０３】
完全に相補的なＤＮＡ三本鎖（配列番号１＋第３番プローブ）と１ｂｐ誤対合
を含むＤＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ３番）との間の最適な差は、試験し
た両方のＤＮＡ濃度について５℃で観察された（図７Ａ，７Ｂ）。しかしながら
、温度が５℃〜３０℃まで増加するにつれ、完全および不完全に相補的なＤＮＡ
三本鎖間の蛍光強度の差は、劇的には変わらなかった。プローブと標的が共に１
ｐｍｏｌｅ／２０μｌ濃度の場合、１ｂｐ誤対のＤＮＡ三本鎖の蛍光強度は、完
全対合配列で得られる蛍光強度より８４％，７７％低かった（図７Ａ）。 同様
に、プローブと標的が４倍低い濃度の場合、完全対合のＤＮＡ三本鎖と誤対合Ｄ
ＮＡ三本鎖間で、５℃と３０℃で、蛍光強度の６３％，５０％の差が観察された
（図７Ｂ）。５℃まで冷却する前後に３０℃で測定されたすべての試料の蛍光強
度は、非常に類似していた（データは図示しない）。最大の差は５℃に認められ
るが、便宜上、非変性ハイブリダイゼーションアッセイは室温でも高い信頼性で
行える。
を含むＤＮＡ三本鎖（配列番号２＋プローブ３番）との間の最適な差は、試験し
た両方のＤＮＡ濃度について５℃で観察された（図７Ａ，７Ｂ）。しかしながら
、温度が５℃〜３０℃まで増加するにつれ、完全および不完全に相補的なＤＮＡ
三本鎖間の蛍光強度の差は、劇的には変わらなかった。プローブと標的が共に１
ｐｍｏｌｅ／２０μｌ濃度の場合、１ｂｐ誤対のＤＮＡ三本鎖の蛍光強度は、完
全対合配列で得られる蛍光強度より８４％，７７％低かった（図７Ａ）。 同様
に、プローブと標的が４倍低い濃度の場合、完全対合のＤＮＡ三本鎖と誤対合Ｄ
ＮＡ三本鎖間で、５℃と３０℃で、蛍光強度の６３％，５０％の差が観察された
（図７Ｂ）。５℃まで冷却する前後に３０℃で測定されたすべての試料の蛍光強
度は、非常に類似していた（データは図示しない）。最大の差は５℃に認められ
るが、便宜上、非変性ハイブリダイゼーションアッセイは室温でも高い信頼性で
行える。
【０１０４】
（実施例８）
ハイブリダイゼーションアッセイの感度を、減少濃度の第２番の平行ＰＮＡプ
ローブまたは第３番のｓｓＤＮＡプローブを、２７℃と３２℃の非変性条件下で
、減少濃度の５０ｍｅｒの野生型または変異型ｄｓＤＮＡ標的（それぞれ配列番
号１および配列番号２）と反応させることにより試験した（図８）。
ローブまたは第３番のｓｓＤＮＡプローブを、２７℃と３２℃の非変性条件下で
、減少濃度の５０ｍｅｒの野生型または変異型ｄｓＤＮＡ標的（それぞれ配列番
号１および配列番号２）と反応させることにより試験した（図８）。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション反応混合物（４０μｌ）は下記を含んでいた：２０ｆ
ｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、２０ｆｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌ
ｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプローブまたは第２番平行ＰＮＡプローブ、０．５×Ｔ
ＢＥ、および２．５ｎＭ〜５００ｎＭのＹＯＹＯ−１。すべての試料において、
標的配列およびプローブ配列は、同一濃度に維持した。アッセイ条件は実施例４
に記述したものと同一とした。
ｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、２０ｆｍｏｌｅｓ〜２ｐｍｏｌ
ｅｓの第３番ｓｓＤＮＡプローブまたは第２番平行ＰＮＡプローブ、０．５×Ｔ
ＢＥ、および２．５ｎＭ〜５００ｎＭのＹＯＹＯ−１。すべての試料において、
標的配列およびプローブ配列は、同一濃度に維持した。アッセイ条件は実施例４
に記述したものと同一とした。
【０１０６】
１ｐｍｏｌｅ／２０μｌの第２番の平行ＰＮＡプローブまたは第３番のｓｓＤ
ＮＡプローブを、５００ｎＭの正常なＹＯＹＯ−１濃度で、１ｐｍｏｌｅ／２０
μｌのｄｓＤＮＡ標的配列とハイブリダイズすると、１ｂｐ誤対合によって生じ
るｄｓＤＮＡ：ＰＮＡおよびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖は、完全対合の三本
鎖で観察される２７℃〜３２℃より、各々９３％〜９４％までおよび５６％〜５
４％低い範囲の蛍光強度を生じる（データは図示しない）。
ＮＡプローブを、５００ｎＭの正常なＹＯＹＯ−１濃度で、１ｐｍｏｌｅ／２０
μｌのｄｓＤＮＡ標的配列とハイブリダイズすると、１ｂｐ誤対合によって生じ
るｄｓＤＮＡ：ＰＮＡおよびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖は、完全対合の三本
鎖で観察される２７℃〜３２℃より、各々９３％〜９４％までおよび５６％〜５
４％低い範囲の蛍光強度を生じる（データは図示しない）。
【０１０７】
１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌ濃度のプローブおよび標的（つまり１００倍低い濃
度）では、１ ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、２５ｎＭ ＹＯ
ＹＯ−１を使用した時、２７℃〜３２℃の完全に相補的な三本鎖から得られる蛍
光強度よりも８５％〜８３％だけ低い蛍光強度を達成した（図８Ａ）。同様に、
１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌの第３番のｓｓＤＮＡプローブを、１０ｎＭのＹＯＹ
Ｏ−１の存在下で１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌのｄｓＤＮＡ標的配列と反応させる
と、１ｂｐ誤対合によって生成される蛍光強度は、２７℃〜３２℃での完全対合
ＤＮＡ三本鎖により生成される蛍光強度よりも８４％〜９０％だけ低かった（図
８Ｂ）。これはプローブと標的の濃度が非常に低いときでもハイブリダイゼーシ
ョンアッセイの感度が極端に高いことを証明している。
度）では、１ ｂｐ誤対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドは、２５ｎＭ ＹＯ
ＹＯ−１を使用した時、２７℃〜３２℃の完全に相補的な三本鎖から得られる蛍
光強度よりも８５％〜８３％だけ低い蛍光強度を達成した（図８Ａ）。同様に、
１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌの第３番のｓｓＤＮＡプローブを、１０ｎＭのＹＯＹ
Ｏ−１の存在下で１０ｆｍｏｌｅ／２０μｌのｄｓＤＮＡ標的配列と反応させる
と、１ｂｐ誤対合によって生成される蛍光強度は、２７℃〜３２℃での完全対合
ＤＮＡ三本鎖により生成される蛍光強度よりも８４％〜９０％だけ低かった（図
８Ｂ）。これはプローブと標的の濃度が非常に低いときでもハイブリダイゼーシ
ョンアッセイの感度が極端に高いことを証明している。
【０１０８】
試験した各プローブおよび標的濃度で、広範囲のＹＯＹＯ−１濃度が許容され
た。１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌのプローブと１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌの標
的をハイブリダイズさせた時、ＹＯＹＯ−１の最適濃度は、２５ｎＭ〜２．５ｎ
Ｍ（平行ＰＮＡプローブ）および１０ｎＭ〜２．５ｎＭ（ｓｓＤＮＡプローブ）
であり、完全対合配列と誤対合配列間には９０％〜７１％に及ぶ蛍光強度の差が
生じた（データは図示しない）。総括すると、上記結果によって、野生型配列と
、様々な塩基対変異を含む配列とを区別するための、非変性ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイの極端に高い感度と信頼性が確認された。
た。１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌのプローブと１０ｆｍｏｌｅｓ／２０ｐｌの標
的をハイブリダイズさせた時、ＹＯＹＯ−１の最適濃度は、２５ｎＭ〜２．５ｎ
Ｍ（平行ＰＮＡプローブ）および１０ｎＭ〜２．５ｎＭ（ｓｓＤＮＡプローブ）
であり、完全対合配列と誤対合配列間には９０％〜７１％に及ぶ蛍光強度の差が
生じた（データは図示しない）。総括すると、上記結果によって、野生型配列と
、様々な塩基対変異を含む配列とを区別するための、非変性ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイの極端に高い感度と信頼性が確認された。
【０１０９】
本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、
種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得る
ことが明らかである。
種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得る
ことが明らかである。
【配列表】
【図１Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図１Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図２】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の
複合グラフ。
複合グラフ。
【図３Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図３Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図４】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の
複合グラフ。
複合グラフ。
【図５】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度の
複合グラフ。
複合グラフ。
【図６Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図６Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図７Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図７Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図８Ａ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【図８Ｂ】測定する各試料の温度の関数としてプロットされた最大蛍光強度
の複合グラフ。
の複合グラフ。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年８月７日（２００２．８．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２
37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 エリクソン、グレン エイチ．
タークス諸島・カイコス諸島 プロビデン
シャルズ ピー．オー．ボックス 799
Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 DA08 EA01
GA25 GB21 KA01 KA02 KA03
KA05 KA09 NA01
2G045 DA12 DA13 DA14 FA12 FB02
FB07 FB12 GC15
4B024 AA20 CA01 CA09 CA11 HA19
4B063 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR35
QR55 QS34 QX02
Claims (32)
- 【請求項１】結合を測定する方法であって、 少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と； 前記標的の少なくとも１部分に不完全に相補的な核酸または核酸類似体配列を
有するプローブを提供する工程と； 挿入剤を提供する工程であって、前記プローブまたは前記挿入剤のいずれかが
蛍光発色団を有する工程と； ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添
加して、測定用試料を提供する工程と； 前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試
料を照射する工程と； 前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線
の強度を検出する工程と； 前記強度から、前記プローブと前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と；
から成る方法。 - 【請求項２】前記決定工程は、前記標的および前記挿入剤と結合させた他の
プローブによって示された強度に対して前記強度を較正することにより遂行され
、前記他のプローブの各々は、少なくとも１つの塩基が前記プローブと異なるも
のである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記標的に比べて、前記プローブと前記他のプローブの各々は
、完全対合、１塩基誤対合、２塩基誤対合、３塩基対合、１塩基欠失、２塩基欠
失および３塩基欠失から成る群より選択された異なるメンバーである（前記プロ
ーブは前記完全対合でないと仮定する）、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】前記結合親和性を定量化する工程からさらに成る、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項５】前記標的上または前記プローブ上にシグナル消光剤を提供せず
に行われる均質測定法である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記標的を前もって変性せずに行われる均質測定法である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項７】前記標的をＰＣＲ増幅せずに行われる均質測定法である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項８】前記標的はｄｓＤＮＡであり、前記プローブが三本鎖を形成す
るために前記標的と特異的にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】前記プローブはｓｓＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項８に記
載の方法。 - 【請求項１０】前記プローブは部分的に荷電したバックボーンを有する、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記プローブは非荷電のバックボーンを有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１２】前記プローブはＰＮＡ配列を有する、請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】前記プローブは平行合成によって調製されたｓｓＰＮＡであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記プローブと前記標的は同じ長さである、請求項１３に記
載の方法。 - 【請求項１５】前記プローブは６〜３０ヌクレオチド長である、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１６】前記プローブは１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１７】前記挿入剤は前記プローブに共有結合によって結び付けられ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】前記挿入剤は、前記プローブがなく前記標的もない形式の前
記ハイブリダイゼーション媒質に添加される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】前記挿入剤は、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウ
ム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２およびアクリジンか
ら成る群より選択されたメンバーである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】前記プローブは前記核酸または前記核酸類似体配列から本質
的に成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】前記励起放射線はアルゴンイオンレーザーから約２００ｎｍ
〜約１０００ｎｍの波長で放射される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】５〜８５℃の範囲の温度で行われる、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項２３】２５℃より低い温度で行われる、請求項１に記載の方法。
- 【請求項２４】前記方法の信頼性が、プローブまたは標的の塩基配列とは無
関係であり、かつ、プローブまたは標的のグアニンおよびシトシン含量とも無関
係である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】前記測定用試料は、約１０フェムトモルの標的と約１０フェ
ムトモルのプローブを含む約２０マイクロリットルの体積を有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項２６】前記試料中の前記標的の濃度は多くて５×１０−１０Ｍであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】前記試料中の前記プローブの濃度は多くて５×１０−１０Ｍ
である、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２８】結合を測定する方法であって、 少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と； 第１の蛍光発色団と、前記標的の少なくとも１部分に不完全に相補的な核酸ま
たは核酸類似体配列とを有するプローブを提供する工程と； 第２の蛍光発色団を有する挿入剤を提供する工程であって、前記第２の蛍光発
色団と前記第１の蛍光発色団は異なる波長で蛍光を発する工程と； ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添
加して、測定用試料を提供する工程と； 前記第１の蛍光発色団および前記第２の蛍光発色団の少なくとも１つに蛍光放
射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試料を照射する工程と； 前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線
の強度を検出する工程と； 前記強度から、前記プローブと前記標的間の誤対合の程度を決定する工程と；
から成る方法。 - 【請求項２９】前記挿入剤が蛍光を発する波長は、挿入時に第２の波長に変
化し、前記波長と前記第２の波長の間の差が、前記プローブと前記標的間の複合
体が二本鎖であるか三本鎖であるか、および前記標的がＤＮＡであるかＲＮＡで
あるかを示す、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３０】ウェル内の溶液中または不浸透性表面上で行われる、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３１】バイオチップ上で行われる、請求項１に記載の方法。
- 【請求項３２】結合を測定する方法であって、 少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と； 核酸または核酸類似体配列を有するプローブを提供する工程と； 挿入剤を提供する工程であって、前記プローブまたは前記挿入剤のいずれかが
蛍光発色団を含む工程と； ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブ、前記標的および前記挿入剤を添
加して、測定用試料を提供する工程と； 前記蛍光発色団に蛍光放射線を放射させるために、励起放射線で前記測定用試
料を照射する工程と； 前記プローブと前記標的間の結合親和性の直接的指標である、前記蛍光放射線
の強度を検出する工程と； 前記標的および前記挿入剤と結合させた他のプローブによって示された強度に
対して前記強度を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記プローブと前
記他のプローブの各々は、完全対合、１塩基誤対合、２塩基誤対合、３塩基対合
、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠失から成る群より選択された異なるメ
ンバーである工程と； 前記較正工程から、前記プローブと前記標的間の対合の程度を決定する工程と
；から成る方法。
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