PT1242620E - Ensaio de intensidade de fluorescência para hibridação de ácido nucleico dúplice e tríplice em solução utilizando intercaladores fluorescentes - Google Patents

Description

ΕΡ 1 242 620/ΡΤ DESCRIÇÃO "Ensaio de intensidade de fluorescência para hibridação de ácido nucleico dúplice e tríplice em solução utilizando intercaladores fluorescentes"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção refere-se a métodos de sequenciação ou ensaio de ácidos nucleicos, e mais particularmente a métodos de ensaio de complexos de hibridação de ácido nucleico tríplices e dúplices empregando medições de intensidade de fluorescência. 2. Descrição da Arte Relacionada Têm-se utilizado corantes fluorescentes para detectar e quantificar ácidos nucleicos desde há décadas. Na sua forma mais básica, os ensaios à base de intensidade de fluorescência compreendiam tipicamente o contacto de um alvo com uma sonda contendo um fluoróforo, a remoção de qualquer sonda não ligada da sonda ligada, e a detecção da fluorescência na amostra lavada. Ensaios homogéneos são melhores que estes ensaios básicos, na medida em que os primeiros não requerem um passo de lavagem ou o fornecimento de um suporte de fase não líquida.

Por exemplo, as Patentes U.S. 5,538,848 de Livak et ai. e 4,220,450 de Maggio descrevem ensaios homogéneos à base de fluorescência de sequências nucleotídicas utilizando sondas oligonucleotídicas em solução. Contudo, estas patentes requerem a utilização de um agente extintor em combinação com um agente repórter, de modo a distinguir entre os sinais gerados por sondas hibridadas e sondas não hibridadas. Livak et al. requerem também a utilização de enzimas no seu método descrito. Os agentes extintores e as enzimas adicionam complexidade e despesa aos métodos. A Patente U.S. 5,332,659 de Kidwell revela um método para a detecção de sequências nucleotídicas em solução utilizando 2 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ sondas compreendendo pelo menos duas porções de fluoróforo. Os fluoróforos têm que ser seleccionados para interagir electronicamente uns com os outros quando estão suficientemente próximos para variar a dependência dos seus espectros relativamente ao comprimento de onda. As sondas não hibridadas são muito mais flexíveis do que as sondas hibridadas à sequência alvo, e consequentemente as duas porções de fluoróforo em cada sonda têm maior probabilidade de estarem próximas uma da outra quando a sonda não está hibridada do que quando a sonda está hibridada. Assim, uma alteração no comprimento de onda emissão correlacionada com a sonda livre pode ser monitorada como uma indicação da quantidade de sonda livre na amostra. A Patente U.S. 5,846,729 de Wu et al. revela também ensaios homogéneos à base de fluorescência para hibridação de ácido nucleico.

Alguns ensaios empregaram fluoróforos intercalantes para detectar a hibridação de ácido nucleico, com base na capacidade desses fluoróforos se ligarem entre cadeias de ácido nucleico num complexo de hibridação.

Por exemplo, a Patente U.S. 5,824, 557 de Burke et al. revela um método e um kit para a detecção e quantificação de moléculas de ácido nucleico. Uma concretização preferida assenta da intercalação de um corante numa hélice de ácido nucleico de cadeia dupla ou ácido nucleico de cadeia simples. 0 corante fluoresce após a intercalação e a intensidade é uma medida directa da quantidade de ácido nucleico presente na amostra. Embora o método de Burke et al. seja supostamente útil para a medição da quantidade de ácido nucleico numa amostra, a ligação não especifica entre o intercalador e o ácido nucleico na qual o método se baseia torna o método impraticável para a detecção de ligação especifica, particularmente sob condições em que estão presentes dúplices de ácido nucleico que não são o alvo. A Patente U.S. 5,814,447 de Ishiguro et al. revela um ensaio que supostamente é melhor que os ensaios que assentam na interacção não especifica entre os agentes intercalantes e os dúplices de ácido nucleico, tal como o de Burke et al. e um 3 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ ensaio anterior descrito por Ishiguro et al. da Patente japonesa publicada com o N.° 237000/1993. O anterior desenvolvimento incluía a adição de um fluorócromo intercalante possuindo uma tendência para exibir uma intensidade de fluorescência aumentada quando intercalado, a uma solução de amostra antes de uma região específica de um ácido nucleico alvo ser amplificada por PCR, e medição da intensidade de fluorescência a partir da solução reaccional em determinados intervalos de tempo para detectar e quantificar o ácido nucleico alvo antes da amplificação. A patente '447 tentou melhorar o desenvolvimento anterior proporcionando um ensaio com especificidades melhorada, caracterizado por a sonda ser um oligonucleótido de cadeia simples marcado com um fluorócromo intercalante que vai ser intercalado numa porção de ligação complementar entre um ácido nucleico alvo e uma sonda oligonucleotídica de cadeia simples. WO 97/45539 revela uma sonda de duas unidades para detecção de ácidos nucleicos possuindo uma sequência particular. Uma unidade da sonda compreende um elemento de reconhecimento da sequência (SRE) que reconhece uma sequência de ácido nucleico particular. A segunda unidade da sonda compreende um grupo repórter (RG) que contém um composto detectável cujas propriedades são alteradas após a ligação. As duas unidades são unidas através de um ligante, preferivelmente um ligante peptídico. GB 2333359 revela um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo amplificada por PCR numa amostra.

Em adição aos desenvolvimentos supramencionados que detectam a intensidade de fluorescência, alguns advogaram as vantagens de ensaios de polarização de fluorescência. Contudo, há significativos inconvenientes nos ensaios à base de polarização. O grau de alteração na polarização em função da ligação pode ser imprevisível, e a interpretação dos resultados para conformar resultados inconsistentes às expectativas teóricas pode requerer mais esforço do que é desejável num método analítico, particularmente quando o método se pretende automático. 4 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

Apesar dos anterior desenvolvimentos, continua a existir uma necessidade na especialidade de um método simples, altamente sensível, eficaz e rápido, para a análise da interacção entre ácidos nucleicos e/ou análogos de ácidos nucleicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para o ensaio de ligação, compreendendo o referido método: proporcionar um alvo compreendendo ADNcd; proporcionar uma sonda compreendendo ADNcs ou ARN imperfeitamente complementares a pelo menos uma porção do referido alvo; proporcionar um agente intercalante, em que o referido agente intercalante compreende um fluoróforo; adicionar a referida sonda, o referido alvo e o referido agente intercalante a um meio de hibridação para proporcionar uma amostra de teste; irradiar a referida amostra de teste com radiação de excitação para fazer com que o referido fluoróforo emita radiação fluorescente; detectar uma intensidade da referida radiação fluorescente, em que a referida intensidade é uma indicação directa de uma afinidade de ligação entre a referida sonda e o referido alvo; calibrar a referida intensidade contra intensidades exibidas por outras sondas combinadas com o referido alvo e o referido agente intercalante, diferindo cada uma das referidas sondas da referida sonda em pelo menos uma base; e determinar, a partir da referida calibração, uma extensão de erros de emparelhamento entre a referida sonda e o referido alvo, em que o referido método é um ensaio homogéneo conduzido sem amplificação por PCR do referido alvo e sem desnaturação do referido alvo. 5 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A invenção será descrita em conjunto com os seguintes desenhos em que referências numéricas iguais designam elementos iguais e em que:

As Fig. ΙΑ, 1B, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7B, 8A e 8B são gráficos compostos de intensidades de fluorescência máximas representadas em função da temperatura para cada amostra analisada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS A invenção proporciona um método rápido, sensível, amigo do ambiente e seguro para o ensaio da ligação entre um alvo e uma sonda, em que o alvo compreende uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência análoga de ácido nucleico e a sonda compreende uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência análoga de ácido nucleico.

Ao contrário de alguns dos ensaios do estado anterior da técnica, a invenção não só detecta a presença de hibridação, como também proporciona uma informação qualitativa e quantitativa em relação à natureza da hibridação entre uma sonda e o alvo. Assim, a invenção permite que o técnico distinga entre um emparelhamento perfeito, um erro de emparelhamento de um par de bases, um erro de emparelhamento de dois pares de bases, um erro de emparelhamento de três pares de bases, uma deleção de um par de bases, uma deleção de dois pares de bases e uma deleção de três pares de bases.

Concretizações da invenção compreendem a calibração da intensidade de fluorescência medida para uma primeira mistura sonda-alvo contra intensidades exibidas por outras sondas combinadas com o mesmo alvo e o mesmo agente intercalante, em que cada uma das outras sondas difere da primeira sonda em pelo menos uma base. A intensidade de fluorescência detectada no método da invenção aumenta com o aumento da afinidade de ligação entre a sonda e o alvo. 0 presente método não requer a medição da polarização de fluorescência, ao contrário de métodos de anisotropia de fluorescência. 6 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

Pode ser gerada uma curva de calibração, em que a intensidade é uma função da afinidade de ligação entre o alvo e a sonda. Como a afinidade de ligação entre o alvo e uma pluralidade de diferentes sondas varia com o número de bases mal emparelhadas, a natureza do erro de emparelhamento (A-G vs. A-C vs. T-G vs. T-C, etc.), a localização do(s) erro(s) de emparelhamento no interior do complexo de hibridação, etc., o ensaio da invenção pode ser utilizado para sequenciar o alvo. A invenção permite a quantificação da afinidade de ligação entre a sonda e o alvo. Esta informação pode ser valiosa para uma variedade de utilizações, incluindo o desenho de fármacos anti-sentido com caracteristicas de ligação optimizadas.

Ao contrário dos métodos do estado anterior da técnica, o ensaio da invenção é preferivelmente homogéneo. O ensaio pode ser conduzido sem separação do complexo sonda-alvo da sonda livre e do alvo antes da detecção da intensidade de fluorescência. 0 ensaio não requer um passo de separação em gel, permitindo desse modo um grande aumento no rendimento dos ensaios. As análises quantitativas são simples e precisas. Adicionalmente, o ensaio é preferivelmente conduzido numa solução homogénea, eliminando o requisito de separação de complexos ligados das sondas não ligadas, quer por filtração e numerosos passos de lavagem quer por electroforese em gel. Consequentemente, o ensaio de ligação poupa muito tempo e despesa, e pode ser facilmente automatizado. Adicionalmente, permite que sejam rapidamente determinadas variáveis de ligação tais como tampão, pH, concentração iónica, temperatura, tempo de incubação, concentrações relativas de sequências de sonda e alvo, concentração de intercalador, comprimento das sequências alvo, comprimento das sequências sonda, e possíveis necessidades de cofactores.

Adicionalmente, o ensaio da invenção é preferivelmente conduzido sem o fornecimento de um agente extintor de sinal no alvo ou na sonda.

As concretizações preferidas da invenção detectam especificamente a hibridação tríplice entre a sonda e o alvo de cadeia dupla, obviando assim a necessidade de desnaturar o 7 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ alvo. Embora fosse conhecido que sondas de PNA formam tríplices com certas classes de alvos (veja-se, e.g., Egholm et al., 365 Nature 566 (1993), e Tomac et al., 118 J.Am.Chem.Soc. 5544 (1996)), os inventores foram surpreendidos pelo facto de que eram capazes de ensaiar especificamente tríplices formadas entre sondas de ácido nucleico de cadeia simples (e.g., ADNcs e ARN) e alvos de ácido nucleico de cadeia dupla (e.g., ADNcd).

As sondas adequadas para utilização no ensaio da invenção incluem, e.g., ADNcs, ARN, PNA e outros análogos de ácido nucleico possuindo estruturas não carregadas. São preferidas sequências de sondas possuindo qualquer comprimento de 8 a 20 bases pois é esta a gama na qual se encontram as menores sequências de ADN exclusivas de procariotas e eucariotas. São particularmente preferidas sondas de 12 a 18 bases pois é este o comprimento das menores sequências exclusivas do genoma humano. Em concretizações, preferem-se sondas de 6-30 bases, sendo mais preferidas as de 15 bases. Contudo, podem ser utilizadas uma pluralidade de sondas mais curtas para detectar uma sequência nucleotídica possuindo uma pluralidade de sequências alvo não exclusivas, que se combinam para identificar de forma exclusiva a sequência nucleotídica. A invenção não requer a utilização de sondas radioactivas, que são de utilização perigosa, tediosa e consumidora de tempo, e necessitam de ser constantemente regeneradas. As sondas da invenção são preferivelmente de utilização segura e estáveis durante anos. Assim, as sondas podem ser preparadas ou encomendadas em grandes quantidades e armazenadas.

Os inventores foram igualmente surpreendidos pelo facto de verificarem que sondas de PNA paralelo suplantam as sondas de PNA antiparalelo mais convencionalmente sintetizadas. Quando as sequências de ácido nucleico alvo eram mais de três vezes mais longas do que as sondas de PNA, as sondas de PNA paralelo e antiparalelo foram igualmente eficientes na distinção entre complexos de hibridação de ácido nucleico com emparelhamentos perfeitos e os que continham vários erros de emparelhamento de um par de bases, dois pares de bases ou três pares de bases. Contudo, quando as sequências de ADN alvo eram 8 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ do mesmo comprimento que as sequências das sondas de PNA (i.e., 15 nucleótidos de comprimento), as sondas de PNA paralelo foram muito mais preferidas do que as sondas de PNA antiparalelo, devido a maiores diferenças nas intensidades de fluorescência observadas entre complexos com emparelhamentos perfeitos e complexos com erros de emparelhamento de um ou dois pares de bases.

Embora o mecanismo exacto pelo qual as sondas de PNA paralelo são preferidas sob estas condições não seja conhecido, estas observações sugerem que os complexos de hibridação PNA paralelo:ADN com erros de emparelhamento são menos estáveis do que os híbridos análogos PNA antiparalelo:ADN com erros de emparelhamento, resultando menos intercalação do intercalador de ácido nucleico e portanto menores valores observados de intensidade de fluorescência.

Prefere-se que a sonda e o alvo não estejam marcados, mas em concretizações alternativas, existe um agente intercalante ligado covalentemente à sonda. Nestas concretizações, o agente intercalante está preferivelmente ligado à sonda em qualquer extremidade.

Noutras concretizações, o agente intercalante não está ligado covalentemente à sonda, embora possa ele próprio inserir-se entre a sonda e o alvo durante o ensaio, num sentido de ligação à sonda de maneira não covalente.

Os agentes intercalantes preferidos para utilização na invenção incluem, e.g., Y0Y0-1, T0T0-1, brometo de etidio, homodímero-1 de etidio, homodímero-2 de etidio e acridina. Em geral, o agente intercalante é uma porção que é capaz de se intercalar entre cadeias de um complexo dúplice e/ou tríplice de ácido nucleico. Em concretizações preferidas, o agente intercalante (ou um seu componente) é essencialmente não fluorescente na ausência de ácidos nucleicos e fluoresce quando intercalado e excitado por radiação com um comprimento de onda apropriado, exibindo um aumento de 100 vezes a 10 000 vezes da fluorescência quando intercalado no interior de um complexo dúplice ou tríplice de ácido nucleico. 9 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

Em concretizações alternativas, o agente intercalante pode exibir um desvio no comprimento de onda de fluorescência após a intercalação e a excitação por radiação com um comprimento de onda apropriado. 0 comprimento de onda de fluorescência exacto pode depender da estrutura do ácido nucleico que é intercalado, por exemplo, ADN vs. ARN, dúplice vs. tríplice, etc. 0 comprimento de onda de excitação é seleccionado (por experimentação de rotina e/ou reconhecimento convencional) para corresponder a este máximo de excitação para o fluoróforo utilizado, e é preferivelmente de 200 a 1000 nm. Os agentes intercalantes são preferivelmente seleccionados de modo a possuírem um comprimento de onda de emissão de 200 a 1000 nm. Em concretizações preferidas, é utilizado um laser de iões de árgon para irradiar o fluoróforo com luz com um comprimento de onda numa gama de 400 a 540 nm, e a emissão de fluorescência é detectada numa gama de 500 a 750 nm. O ensaio da invenção pode ser realizado ao longo de uma ampla variedade de temperaturas, tais como, e.g., de 5 a 85°C. Certos ensaios do estado anterior da técnica requerem temperaturas elevadas, adicionando custos e atrasando o ensaio. Por outro lado, a invenção pode ser conduzida à temperatura ambiente ou abaixo desta temperatura (e.g., a uma temperatura inferior a 25°C). A fiabilidade da invenção é independente do teor de guanina e citosina no referido alvo. Como os pares de bases G-C formam três ligações de hidrogénio, enquanto os pares de bases A-T formam apenas duas ligações de hidrogénio, as sequências alvo e sonda com um maior teor de G ou C são mais estáveis, possuindo superiores temperaturas de fusão. Consequentemente, os erros de emparelhamento que aumentam o teor de GC da região hibridada de sonda e alvo acima do que está presente em híbridos com emparelhamentos perfeitos podem implicar uma fraqueza de ligação associada a uma sonda com erros de emparelhamento. Complexos de hibridação contendo todos os possíveis erros de emparelhamento entre a sonda e o alvo provaram-se mais instáveis do que os híbridos com emparelhamentos perfeitos, resultando sempre menores 10 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ intensidades de fluorescência do que os híbridos perfeitamente complementares. O ensaio da invenção é extremamente sensível, obviando assim a necessidade de conduzir uma amplificação por PCR do alvo. Por exemplo, é possível ensaiar uma amostra de teste possuindo um volume de cerca de 20 microlitros, que contém cerca de 10 fentomoles de alvo e cerca de 10 fentomoles de sonda. Concretizações da invenção são suficientemente sensíveis para ensaiar alvos numa concentração de 5 X 1CT9 M, preferivelmente numa concentração não superior a 5 x 1CT10 M. As concretizações da invenção são suficientemente sensíveis para empregar sondas numa concentração de 5 X 1CT9M, preferivelmente numa concentração não superior a 5 x 1CT10 M. Não será necessário referir que os valores anteriores não significam que o método não possa detectar concentrações superiores. O meio de hibridação pode ser qualquer meio convencional que se saiba adequado para a preservação de nucleótidos. Veja-se, e.g., Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Lab Manual," Vol. 2 (1989). Por exemplo, o meio líquido pode compreender nucleótidos, água, tampões e concentrações salinas Standard. A hibridação entre bases complementares ocorre sob uma ampla variedade de condições com variações de temperatura, concentração salina, força electrostática e composição de tampão. Os exemplos destas condições e métodos para aplicação são conhecidos na especialidade.

Prefere-se que os complexos de hibridação sejam formados a uma temperatura de cerca de 15°C a cerca de 25°C durante cerca de 1 minuto a cerca de 5 minutos. Não são necessários tempos de reacção mais longos, mas a incubação durante várias horas não afectará adversamente os complexos de hibridação.

Desde que seja incluído um agente intercalante fluorescente adequado na mistura reaccional (como discutido anteriormente), na vasta maioria dos casos, não serão necessários outros reagentes facilitadores. Contudo, é possível facilitar a hibridação em solução utilizando certos 11 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ reagentes. Os exemplos preferidos destes reagentes incluem proteínas de ligação de cadeia simples tais como proteína Rec A, proteína do gene 32 de T4, proteína de ligação de cadeia simples de E. coli, proteínas de ligação ao sulco de ácido nucleico maior ou menor, iões bivalentes, iões polivalentes, viologen e substâncias intercalantes tais como brometo de etídio, actinomicina D, psoraleno e angelicina. Estes reagentes facilitadores podem provar-se úteis em condições operatórias extremas, por exemplo, sob níveis de pH anómalos ou temperaturas extremamente elevadas. 0 ensaio da invenção pode ser utilizado para, e.g., identificar regiões acessíveis em sequências nucleotídicas dobradas, para determinar o número de pares de bases mas emparelhados num complexo de hibridação, e para mapear genomas. A invenção será ilustrada com mais detalhes com referência aos Exemplos que se seguem, mas deverá entender-se que a presente invenção não se considera a estes limitada.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Sintetizaram-se sequências alvo de ADNcs de sentido directo e anti-sentido 50-mero, derivadas do exão 10 do gene da fibrose cística humano (Nature 380, 207 (1996)) num sintetizador de ADN (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems) e purificaram-se por HPLC. Desnaturaram-se quantidades equimolares de oligonucleótidos complementares a 95°C durante 10 min e deixaram-se hibridar gradualmente à medida que a temperatura arrefecia para 21°C ao longo de 1,5 horas. Dissolveram-se os oligonucleótidos de ADNcd em ddH20 numa concentração de 1 pmol/μΐ. A cadeia de sentido directo do adn alvo do tipo selvagem tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:l): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. 12 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A cadeia anti-sentido do ADN alvo do tipo selvagem tinha a seguinte sequência (SEQ ID N0:1): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Preparou-se uma sequência alvo de ADNcd mutante 50-mero para ser idêntica ao ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) excepto quanto a uma mutação de um par de bases (sublinhada) na posição de aminoácido 50 7, onde a sequência CAT do tipo selvagem foi alterada para CGT. A cadeia de sentido directo desta sequência alvo 50-mero tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:2): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. A cadeia anti-sentido desta sequência alvo 50-mero tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:2): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Preparou-se uma sequência alvo de ADNcd mutante 50-mero para ser idêntica ao ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) excepto quanto a uma mutação de dois pares de bases consecutivos (sublinhada) nas posições de aminoácido 506 e 507, onde a sequência CAT do tipo selvagem foi alterada para ACT. A cadeia de sentido directo desta sequência alvo tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:3): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. A cadeia anti-sentido desta sequência alvo tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:3): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Preparou-se uma sequência alvo de ADNcd mutante 50-mero para ser idêntica ao ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) excepto quanto a uma mutação de três pares de bases consecutivos (sublinhada) nas posições de aminoácido 506 e 507, onde a sequência CAT do tipo selvagem foi alterada para ACG. 13 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A cadeia de sentido directo desta sequência alvo tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:4): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACG CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. A cadeia anti-sentido desta sequência alvo tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:4): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGC GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

Preparou-se uma sequência alvo de ADNcd mutante 47-mero para ser idêntica ao ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) excepto quanto a uma deleção de três pares de bases consecutivos (indicados por reticências) nas posições de aminoácido 507 e 508, onde a sequência CTT do tipo selvagem é eliminada. A cadeia de sentido directo desta sequência alvo 47-mero tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO: 5): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT ... TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. A cadeia anti-sentido desta sequência alvo 47-mero tinha a seguinte sequência (SEQ ID NO:5): 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA ... A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

As sondas de PNA utilizadas nos Exemplos foram sintetizadas, purificadas por HPLC e confirmadas por espectroscopia de massa por Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA, EUA). As sondas de PNA foram primeiro dissolvidas em TFA a 0,1% (ácido trifluoroacético) numa concentração de 10 mg/ml, e depois diluídas para 1 mg/ml através da adição de ddH20. Prepararam-se soluções-mãe de PNA finais em ddH20 numa concentração de 1 pmol/μΐ. A Sonda N.° 1 era uma sonda de PNA antiparalelo 15-mero desenhada para ser completamente complementar a um segmento de 15 nucleótidos da cadeia de sentido directo do ADN alvo 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO:l), com sobreposição das posições de aminoácido 505 a 510 (Nature 380, 207 (1996)). A sonda tinha a seguinte estrutura (SEQ ID NO: 6): 5'-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH2-3 ' . A Sonda N.° 2 era uma sonda de PNA 15-mero de sequência idêntica à Sonda N.° 1, mas que estava na orientação paralela, 14 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ em vez da orientação antiparalela. A sonda tinha a seguinte estrutura (SEQ ID N0:7): 5'-H-TAT AGT AGA AAC CAC-Lys- CONH2-3'.

Cada mistura reaccional de hibridação (80μ1) continha o seguinte: 4 pmol de ADNcd alvo, 4 pmol de sonda de PNA, TBE 0,5x e 500 nM do intercalador de ADN YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA). Incubaram-se as misturas reaccionais a 95°C durante 5-10 minutos para permitir a desnaturação, e depois mantiveram-se a 80°C até ao ensaio. Colocaram-se as amostras numa cuvete de quartzo, irradiaram-se com um feixe de laser de iões de árgon possuindo um comprimento de onda de 488 nm e monitoraram-se repetidamente quanto à emissão de fluorescência à medida que a temperatura diminuía ao longo do tempo. Conseguiram-se medições de temperatura concorrentes através de uma sonda de temperatura controlada por software colocada directamente em cada amostra. A intensidade de fluorescência máxima ocorreu a um comprimento de onda de 540 nm, indicativo de intercalação de YOYO-1 nos híbridos PNA:ADN. As intensidades de fluorescência máximas foram representadas em função da temperatura para cada amostra analisada.

As intensidades de fluorescência observadas quando não estava presente ADN nem PNA (apenas YOYO-1), ou quando SEQ ID NO:l do tipo selvagem, SEQ ID NO:2 mutante ou SEQ ID NO:3 mutante reagiram com Sonda N.° 1 de PNA antiparalelo ou Sonda N.° 2 de PNA paralelo estão mostradas nas Fig. IA e 1B, respectivamente. Os híbridos ADNcs:PNA que consistiam em sequências perfeitamente complementares (SEQ ID NO:l + Sonda N.° 1) permitiram uma intercalação máxima de YOYO-1, originando as intensidades de fluorescência mais elevadas, que aumentaram à medida que a temperatura diminuía (Fig. IA) . As intensidades de fluorescência para um híbrido ADNcs:PNA com um erro de emparelhamento de um par de bases (SEQ ID NO:2 + Sonda N.° 1) e um híbrido ADNcs:PNA com um erro de emparelhamento de dois pares de bases (SEQ ID NO:3 + Sonda N.° 1) foram 81% e 89% inferiores, respectivamente, às do híbrido ADNcs:PNA perfeitamente emparelhado a 60°C (Fig. IA). Similarmente, quando a Sonda N.° 2 de PNA paralelo hibridou com as sequências de ADN alvo, os híbridos ADNcs:PNA com erros de emparelhamento de um e dois pares de bases exibiram intensidades de fluorescência que foram 70% e 86% inferiores, 15 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ respectivamente, às do híbrido ADNcs:PNA perfeitamente complementar (SEQ ID N0:1 + Sonda N.° 2) a 60°C (Fig. 1B) . À medida que o grau de erros de emparelhamento entre a sonda e o alvo aumentava, o nível de intercalação por YOYO-1 diminuiu e portanto o nível de intensidade de fluorescência diminuiu. Esta relação manteve-se independentemente do facto de se utilizar sonda de PNA antiparalelo ou paralelo.

De forma interessante, quando as sequências de adn alvo tinham o mesmo comprimento que as sequências das sondas de PNA (í.e., 15 nucleótidos de comprimento), as sondas de PNA paralelo foram muito mais preferidas do que as sondas de PNA antiparalelo, devido às maiores diferenças nas intensidades de fluorescência observadas entre complexos com emparelhamentos perfeitos e complexos com erros de emparelhamento de um ou dois pares de bases (resultados não apresentados).

Embora o mecanismo exacto através do qual as sondas de PNA paralelo são preferidas sob estas condições não seja conhecido, estas observações sugerem que os complexos de hibridação PNA paralelo:ADN com erros de emparelhamento são menos estáveis do que os híbridos PNA antiparalelo:ADN análogos com erros de emparelhamento, resultando menos intercalação do intercalador de ácido nucleico e portanto menores valores de intensidade de fluorescência observada.

Exemplo 2 A Fig. 2 demonstra que o ensaio de hibridação da invenção pode também discriminar entre híbridos ADNcs:PNA perfeitamente emparelhados e aqueles que contêm erros de emparelhamento de 1, 2 ou 3 pb, assim como uma deleção de 3 pb, quando se emprega uma sonda de PNA paralelo. As condições do ensaio eram idênticas às descritas no Exemplo 1. As intensidades de fluorescência para um híbrido ADNcs:PNA com um erro de emparelhamento de 1 pb (SEQ ID NO:2 + Sonda N.° 2), um erro de emparelhamento de 2 pb consecutivos (SEQ ID NO: 3 + Sonda N.° 2), um erro de emparelhamento de 3 pb consecutivos (SEQ ID NO:4 + Sonda N.° 2) e uma deleção de 3 pb (SEQ ID NO:5 + Sonda N.° 2) foram 41%, 71%, 87% e 95% inferiores, respectivamente, aos do híbrido ADNcs:PNA perfeitamente emparelhado (SEQ ID N0:1 + Sonda N.° 2) a 60°C. À medida que a temperatura 16 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ diminuía de 70°C para 60°C, o grau de discriminação entre emparelhamento perfeito e os vários erros de emparelhamento de pares bases aumentou. Como no Exemplo 1, o aumento do grau de erros de emparelhamento entre a sonda e o alvo resultou em níveis progressivamente diminuídos de intensidade de fluorescência. Adicionalmente, este padrão de fluorescência foi consistente mesmo quando as sequências mutantes exibiam um teor percentual de GC superior ao da sequência do tipo selvagem (Fig. 2).

Quando se utilizou uma sonda de PNA paralelo, erros de emparelhamento de 2 pb separados (em que dois erros de emparelhamento de 1 pb estavam separados por 3 pares de bases) resultaram em intensidades de fluorescência ligeiramente inferiores às de erros de emparelhamento de 2 pb consecutivos (resultados não apresentados). Similarmente, erros de emparelhamento de 3 pb separados (em que três erros de emparelhamento de 1 pb estavam separados por 3 pares de bases cada um) originaram intensidades de fluorescência ligeiramente inferiores às de erros de emparelhamento de 3 pb consecutivos (resultados não apresentados). Estes resultados sugerem que erros de emparelhamento de pares de bases separados são mais interferentes na formação de híbridos ADNcs:PNA do que erros de emparelhamento de pares de bases consecutivos.

Exemplo 3 A SEQ ID NO:8 era uma sequência alvo de ADNcd 15-mero derivada de SEQ ID N0:1, desenhada para ser completamente complementar à Sonda N.° 1. As SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:17 eram sequências alvo de ADNcd mutantes 15-mero idênticas à SEQ ID NO:8 do tipo selvagem excepto quanto a uma mutação de um par de bases (sublinhada). As sequências de ADNcs 15-mero de sentido directo e anti-sentido foram sintetizadas, purificadas e hibridadas como acima. Os oligonucleótidos de ADNcd foram dissolvidos em ddH20 numa concentração de 1 pmol/μΐ. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:8) era: 5'-ATA TCA TCT TTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:8) era: 5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3'. 17 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:9) era: 5'-ATA TCT TCT TTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:9) era: 5'-CAC CAA AGA AGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:10) era: 5'-ata TCA TCT TTC GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:10) era: 5'-CAC GAA AGA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:11) era: 5'-ATA TCA TGT TTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:11) era: 5'-CAC CAA ACA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:12) era: 5'-ATA TCA TCT ATG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:12) era: 5'-CAC CAT AGA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:13) era: 5'-ATA TCA TCT CTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:13) era: 5'-CAC CAG AGA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:14) era: 5'-ATA TCA TCT GTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:14) era: 5'-CAC CAC AGA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:15) era: 5'-ATA TCG TCT TTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:15) era: 5'-CAC CAA AGA CGA TAT-3'. 18 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:16) era: 5'-ATA TCA TTT TTG GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:16) era: 5'-CAC CAA AAA TGA TAT-3'. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo mutante (SEQ ID N0:17) era: 5'-ATA TCA tct ttt GTG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo mutante (SEQ ID NO:17) era: 5'-CAC AAA AGA TGA TAT-3'. A especificidade do ensaio de hibridação foi

adicionalmente testada por reacção da Sonda N.° 2 de PNA paralelo com um ADNcd alvo 15-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO:8) e vários ADNcd alvo 15-mero mutados em 1 pb (SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO: 17), que gerariam cada um dos tipos de erros de emparelhamento de 1 pb possíveis (Fig. 3) . As condições do ensaio foram idênticas às descritas no Exemplo 1.

As intensidades de fluorescência mais elevadas foram atingidas com híbridos ADNcs:PNA consistindo em sequências perfeitamente complementares, a todas as temperaturas testadas. A fluorescência aumentou à medida que a temperatura diminuiu. Os híbridos ADNcs:PNA que resultaram em erros de emparelhamento de 1 pb T-T, C-C, G-G, a-a, C-a, G-a, G-t e C-T originaram todos intensidades de fluorescência inferiores às observadas para híbridos ADNcs:PNA perfeitamente emparelhados (Fig. 3A e 3B). As intensidades de fluorescência para os erros de emparelhamento de 1 pb variaram de 64% a 96% inferiores, e 57% a 95% inferiores à observadas para o emparelhamento perfeito a 55°C e 75°C, respectivamente. A variabilidade nas intensidades de fluorescência observada entre os vários erros de emparelhamento de 1 pb dependia mais do erro de emparelhamento do par de bases particular do que da alteração no teor percentual de GC das sequências mutantes, quando se utilizou uma sonda de PNA paralelo (Fig. 3) . Quando se testou a Sonda N.° 1 de PNA antiparalelo numa experiência similar, as diferenças nas intensidades de fluorescência observadas entre o emparelhamento perfeito e os vários erros de emparelhamento de 1 pb foram menos drásticos do que as conseguidas com a 19 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

Sonda Ν.° 2 de ΡΝΑ paralelo e pareciam ser influenciadas pela temperatura (resultados não apresentados). 0 ensaio produziu melhores resultados entre 40°C e 60°C, quando se utilizou uma sonda de PNA antiparalelo. Uma sonda de pna paralelo é portanto preferida quando as sequências de ADN alvo têm o mesmo comprimento que as sequências da sonda de PNA.

Os resultados da Fig. 3 confirmaram a fiabilidade do ensaio de hibridação para identificar todos os possíveis erros de emparelhamento de 1 pb com grande precisão.

Exemplo 4

Os ensaios de hibridação nos Exemplos 1 a 3 foram realizados após desnaturação das sequências de ADNcd alvo e mediram a formação do híbrido ADNcs:PNA a temperaturas acima do ponto de fusão (Tf) dos alvos de ADNcd. Este exemplo demonstra a fiabilidade do ensaio da invenção para diferenciar entre emparelhamentos perfeitos e erros de emparelhamento de pares de bases sem necessidade de desnaturação prévia. A mistura reaccional de hibridação (120 μΐ) continha o seguinte: 6 pmol de ADNcd alvo, 6 pmol de Sonda N.° 2 de PNA paralelo, TBE 0,5x e 500 nM do intercalador de ADN YOYO-1. Embora o volume reaccional fosse ligeiramente maior do que nos Exemplos 1 a 3, as quantidades de ADN, PNA e YOYO-1 foram ajustadas em concordância para manter concentrações constantes de amostras. Obtiveram-se resultados idênticos quando o volume reaccional foi de 40 μΐ, 80 μΐ ou 120 μΐ. Incubaram-se as misturas reaccionais à temperatura ambiente (21°C) durante 5 minutos, colocaram-se numa cuvete de quartzo, irradiaram-se com um feixe de laser de iões de árgon possuindo um comprimento de onda de 488 nm e monitoraram-se repetidamente quanto à emissão de fluorescência à medida que a temperatura aumentava ao longo do tempo, numa câmara aquecida.

Conseguiram-se medições de temperatura concorrentes das amostras através de uma sonda de temperatura controlada por software colocada directamente em cada amostra. As intensidades de fluorescência máximas foram representadas em função da temperatura para cada amostra analisada. 20

ΕΡ 1 242 620/PT

A Fig. 4 ilustra que mesmo na ausência de desnaturação prévia, as intensidades de fluorescência mais elevadas eram atingidas quando a sequência alvo de ADNcd 50-mero do tipo selvagem (SEQ id NO:l) reagia com a Sonda N.° 2 de PNA paralelo 15-mero de 30°C a 85°C. A temperaturas inferiores a 65°C, a Tf do ADNcd 50-mero do tipo selvagem, formaram-se tríplices de ADNcdrPNA. À medida que a temperatura aumentava acima de 65°C, as estruturas tríplices convertiam-se em dúplices de ADNcs:PNA. Claramente, o YOYO-1 foi capaz de se intercalar eficazmente tanto nas estruturas tríplices como nas dúplices. Consequentemente, as intensidades de fluorescência para um tríplice ADNcdrPNA com um erro de emparelhamento de 1 pb (SEQ ID NO: 2 + Sonda N.° 2), um tríplice com um erro de emparelhamento de 2 pb consecutivos (SEQ ID NO: 3 + Sonda

N.° 2), um tríplice com um erro de emparelhamento de 3 pb consecutivos (SEQ ID NO: 4 + Sonda N.° 2) e um tríplice com deleção de 3 pb (SEQ ID NO:5 + Sonda N.° 2) foram 83%, 93%, 99% e 99,5% inferiores, respectivamente, às do tríplice ADNcd:PNA perfeitamente emparelhado (SEQ ID NO:l + Sonda N.° 2) a 30°C. À medida que a temperatura aumentava de 30°C para 85°C, o grau de discriminação entre emparelhamento perfeito e os erros de emparelhamento de pares de bases diminuía. A 85°C, os híbridos com erros de emparelhamento de 1 pb, erros de emparelhamento de 2 pb, erros de emparelhamento de 3 pb e deleção de 3 pb, originaram intensidades de fluorescência 65%, 76%, 94% e 95% inferiores, respectivamente, às observadas para as sequências perfeitamente complementares. Portanto, o ensaio de hibridação da invenção é capaz de distinguir entre sequências do tipo selvagem e as que contêm mutações de 1 pb, 2 pb ou 3 pb, ou deleções, sem desnaturação prévia das sequências.

Exemplo 5 A Sonda N.° 3 era uma sonda de ADNcs 15-mero de sequência e orientação idênticas à Sonda N.° 1 de PNA antiparalelo 15-mero (SEQ ID NO:6). A sonda tinha a seguinte estrutura: 5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3' A especificidade do ensaio de hibridação foi adicionalmente investigada por reacção de Sonda N.° 3 de ADNcs com as sequências alvo de ADNcd 50-mero do tipo selvagem e 21 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ mutante, na ausência de desnaturação prévia. As condições de ensaio foram idênticas às descritas no Exemplo 4.

Melhoradas pelo intercalador de ADN YOYO-1, formaram-se tríplices ADNcd:ADNcs entre 30°C e 65°C. Os tríplices de ADN perfeitamente emparelhados, consistindo em SEQ ID N0:1 + Sonda N.° 3, originaram as intensidades de fluorescência mais elevadas (Fig. 5) . Em contraste, combinações de sonda e alvo incompletamente complementares que geravam um erro de emparelhamento de 1 pb (SEQ ID NO:2 + Sonda N.° 3), um erro de emparelhamento de 2 pb consecutivos (SEQ ID NO: 3 + Sonda N.° 3), um erro de emparelhamento de 3 pb consecutivos (SEQ ID NO:4 + Sonda N.° 3) e uma deleção de 3 pb (SEQ ID NO:5 + Sonda N.° 3) resultaram em intensidades de fluorescência que eram 57%, 94%, 97% e 98% inferiores a 30°C, e 47%, 79%, 92% e 91% inferiores a 65°C, respectivamente, às observadas com as sequências perfeitamente emparelhadas (Fig. 5). À medida que a temperatura aumentava acima de 65°C, o grau de discriminação entre o emparelhamento perfeito e os erros de emparelhamento de pares de bases diminuía, indicativo da quebra gradual da estrutura tríplice do ADN. A 85°C, as intensidades de fluorescência atingidas por um erro de emparelhamento de 1 pb, um erro de emparelhamento de 2 pb, um erro de emparelhamento de 3 pb e uma deleção de 3 pb foram 40%, 63%, 92% e 83% inferiores às obtidas com o emparelhamento perfeito (Fig. 5). A presença de YOYO-1 permitiu que uma sonda de ADNcs fosse utilizada em vez de uma sonda de pna para diferenciar entre sequências perfeitamente complementares e as que contêm erros de emparelhamento de 1 pb, 2 pb ou 3 pb ou deleções, sem a necessidade de desnaturação prévia.

Exemplo 6

Para assegurar que o ensaio de hibridação utilizando sondas de ADNcs e alvos de ADNcd realizado na ausência de desnaturação prévia se aplicaria a ADN sonda e alvo possuindo teores percentuais de GC drasticamente diferentes (e consequentemente diferentes temperaturas de fusão), sintetizaram-se novas sequências de sondas de ADNcs 15-mero e alvos de ADNcd 50-mero, purificaram-se e hibridaram-se como acima. Tanto as sondas de ADNcs como os alvos de ADNcd foram dissolvido em ddH20 numa concentração de 1 pmol/μΐ. 22 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A SEQ ID Ν0:18 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero modificada a partir de SEQ ID NO:l, em que o teor percentual de GC foi alterado de 30% para 52%. A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO: 18) era: 5' -GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO: 18) era: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'. A SEQ ID NO: 19 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero mutante idêntica à SEQ ID NO:18, excepto quanto a uma mutação de um par de bases (sublinhada), na qual a sequência CAT foi alterada para CGT. A sequência da cadeia de sentido directo de SEQ ID NO:19 mutante era: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido de SEQ ID NO: 19 mutante era: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'. A SEQ ID NO:20 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero mutante idêntica a SEQ ID NO:18, excepto quanto a uma mutação de dois pares de bases consecutivos (sublinhada), em que a sequência CAT foi alterada para ACT. A sequência da cadeia de sentido directo de SEQ ID NO:20 mutante era: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido de SEQ ID NO: 20 mutante era: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'. A SEQ ID NO:21 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero modificada a partir da SEQ ID NO:l, em que o teor percentual de GC foi alterado de 30% para 72%. 23 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A sequência da cadeia de sentido directo do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:21) era: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido do ADN alvo do tipo selvagem (SEQ ID NO:21), era: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3' A SEQ ID NO: 22 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero mutante idêntica a SEQ ID NO:21, excepto quanto a uma mutação de um par de bases (sublinhada), em que a sequência CGT foi alterada para CAT. A sequência da cadeia de sentido directo de SEQ ID NO:22 mutante era: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido de SEQ ID NO: 22 mutante era: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA TGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3' A SEQ ID NO:23 era uma sequência alvo de ADNcd 50-mero mutante idêntica a SEQ ID NO:21, excepto quanto a uma mutação de dois pares de bases consecutivos (sublinhada), em que a sequência CGT foi alterada para ATT. A sequência da cadeia de sentido directo de SEQ ID NO:23 mutante era: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT ATT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'. A sequência da cadeia anti-sentido de SEQ ID NO: 23 mutante era: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA ATA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'. A Sonda N.° 4 era uma sonda de ADNcs 15-mero desenhada para ser completamente complementar a um segmento de 15 nucleótidos da cadeia de sentido directo do ADN alvo 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO:18). A sonda tinha a seguinte estrutura (SEQ ID NO:24): 5'-CAC CAG AGA TGA CAG-3'. 24 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ A Sonda Νο. 5 era uma sonda de ADNcs 15-mero desenhada para ser completamente complementar a um segmento de 15 nucleótidos da cadeia de sentido directo do ADN alvo 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID N0:21). A sonda tinha a seguinte estrutura (SEQ ID NO:25): 5'-CAC CAG GGA CGA CCG-3'.

As condições do ensaio de hibridação foram idênticas às descritas no Exemplo 4.

Quando a Sonda N.° 4 de ADNcs (com um teor de 53% de GC) foi hibridada com o alvo de ADNcd 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO: 18) e os alvos de ADNcd mutantes (SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO:20), formaram-se tríplices ADNcd:ADNcs a baixas temperaturas sob condições não desnaturantes (Fig. 6A) . Enquanto os tríplices de ADN perfeitamente emparelhados atingiram as intensidades de fluorescência mais elevadas, os tríplices incompletamente complementares com um erro de emparelhamento de um 1 pb (SEQ ID NO: 19 + Sonda N.° 4) e um erro de emparelhamento de 2 pb consecutivos (SEQ ID NO:20 +

Sonda N.° 4) produziram intensidades de fluorescência que eram 63% e 95% inferiores, respectivamente, às observadas com as sequências perfeitamente emparelhadas a 30°C (Fig. 6A) . À medida que a temperatura aumentava, ocorria a quebra gradual da estrutura do tríplice de ADN, resultando intensidades de fluorescência diminuídas e menor discriminação entre emparelhamentos perfeitos e os erros de emparelhamento de pares de bases. A 85°C, observou-se uma diferença muito pequena na fluorescência entre sequências perfeitamente emparelhadas e as que contêm erros de emparelhamento de pares de bases (Fig. 6A).

Similarmente, na presença de YOYO-1, formaram-se tríplices ADNcd:ADNcs quando a Sonda No. 5 de ADNcs (possuindo um teor de 73% de GC) foi feita reagir com o correspondente alvo de ADNcd 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO:21) e os alvos de ADNcd mutantes (SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:23). As intensidades de fluorescência para um tríplice de ADN com um erro de emparelhamento de 1 pb (SEQ ID NO:22 + Sonda N.° 5) e um tríplice de ADN com um erro de emparelhamento de 2 pb consecutivos (SEQ ID NO:23 + Sonda N.° 5) foram 48% e 64% inferiores, respectivamente, às obtidas com as sequências perfeitamente emparelhadas a 30°C (Fig. 6B) . A fluorescência 25 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ de todas as amostras diminuiu à medida que a temperatura aumentava de 30°C para 85°C, indicativo de intercalação diminuida de Y0Y0-1 e quebra do tríplice de ADN.

Independentemente do teor percentual de GC das sondas de adncs e dos alvos de ADNcd, o yoyo-1 foi capaz de facilitar a formação de tríplices de ADN sob condições não desnaturantes, para permitir uma discriminação precisa entre sequências perfeitamente complementares e as que contêm mutações de 1 ou 2 pb.

Exemplo 7

Os ensaios de hibridação dos Exemplos 5 e 6 demonstraram a fiabilidade da invenção para distinguir entre sequências de ADN do tipo selvagem e as que contêm erros de emparelhamento ou deleções de pares de bases, sem a necessidade de desnaturação prévia, utilizando sondas de ADNcs. Estes ensaios mediram a formação de tríplices de adn abaixo do ponto de fusão dos alvos de ADNcd. Adicionalmente, a discriminação óptima entre sequências do tipo selvagem e mutadas foi conseguida a 30°C, a menor temperatura medida. Para determinar se temperaturas abaixo de 30°C seriam ainda mais benéficas para o ensaio, fez-se reagir a Sonda N.° 3 de ADNcs 15-mero com o alvo de ADNcd 50-mero do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) ou com o alvo de ADNcd 50-mero mutante (SEQ ID NO:2) entre 5°C e 30°C.

Na Fig. 7A, fizeram-se reagir 2 pmol de alvo de ADNcd com 2 pmol de Sonda N.° 3 de ADNcs numa mistura reaccional de 40 μΐ contendo TBE 0,5x e 500 nM de YOYO-1. Na Fig. 7B, fizeram-se reagir 500 fmol (í.e., 10“15 moles) de alvo de ADNcd com 500 fmol de Sonda N.° 3 de ADNcs numa mistura reaccional de 40 μΐ contendo TBE 0,5x e 250 nM de YOYO-1. Incubaram-se as misturas reaccionais à temperatura ambiente (21°C) durante 5 minutos, transferiram-se para uma cuvete de quartzo, e depois irradiaram-se com um feixe de laser de iões de árgon a 30°C como realizado nos Exemplos 4 a 6. As cuvetes contendo as amostras foram subsequentemente colocadas em gelo. Quando a temperatura de cada amostra atingiu 2°C (como determinado pela sonda de temperatura colocada directamente em cada amostra), transferiram-se as amostras para uma câmara de medição e 26 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ monitorou-se repetidamente a emissão de fluorescência à medida que a temperatura aumentava ao longo do tempo desde 5°C até 30°C. As intensidades de fluorescência máximas foram representadas em função da temperatura para cada amostra analisada. A discriminação óptima entre os tríplices de ADN perfeitamente complementares (SEQ ID N0:1 + Sonda N.° 3) e os tríplices de ADN contendo um erro de emparelhamento de 1 pb (SEQ ID NO:2 + Sonda N.° 3) foi observada a 5°C para ambas as concentrações de ADN testadas (Fig. 7A e 7B) . Contudo, a diferença de intensidades de fluorescência entre tríplices de ADN completa e incompletamente complementares não variou drasticamente à medida que a temperatura aumentava desde 5°C até 30°C. Numa concentração de 1 pmol/20pl tanto de sonda como de alvo, os tríplices de ADN com um erro de emparelhamento de 1 pb produziram intensidades de fluorescência que eram 84% e 77% inferiores a 5°C e 30°C, respectivamente, às obtidas com as sequências perfeitamente emparelhadas (Fig. 7A) .

Similarmente, a uma concentração quatro vezes menor de sonda e alvo, observou-se uma diferença de 63% e 50% nas intensidades de fluorescência a 5°C e 30°C, respectivamente, entre os tríplices de ADN perfeitamente emparelhado e com erros de emparelhamento (Fig. 7B). As intensidades de fluorescência de todas as amostras medidas a 30°C antes e depois do arrefecimento para 5°C foram muito semelhantes (resultados não apresentados). Embora se observassem diferenças máximas a 5°C, por conveniência, o ensaio de hibridação não desnaturante pode ser realizado de forma fiável à temperatura ambiente.

Exemplo 8 A sensibilidade do ensaio de hibridação foi testada através da reacção de concentrações decrescentes de Sonda N.° 2 de PNA paralelo ou Sonda N.° 3 de ADNcs com concentrações decrescentes de alvos 50-mero de ADNcd do tipo selvagem ou mutante (SEQ ID NO:l e SEQ ID NO: 2, respectivamente), sob condições não desnaturantes entre 27°C e 32°C (Fig. 8). A mistura reaccional de hibridação (40 μΐ) continha o seguinte: 20 fmol a 2 pmol de ADNcd alvo, 20 fmol a 2 pmol de 27 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ

Sonda Ν.° 3 de ADNcs ou Sonda N.° 2 de PNA paralelo, TBE 0,5x e 2,5 nM a 500 nM de YOYO-1. Em cada amostra, as sequências alvo e as sequências sonda foram mantidas em concentrações idênticas. As condições de ensaio foram idênticas às descritas no Exemplo 4.

Quando 1 pmol/20 μΐ de Sonda N.° 2 de PNA paralelo ou Sonda N.° 3 de ADNcs foi hibridada com 1 pmol/20 μΐ de sequências alvo de ADNcd à concentração normal de YOYO-1 de 500 nM, os tríplices ADNcdrPNA e ADNcdrADNcs resultantes de um erro de emparelhamento de 1 pb produziram intensidades de fluorescência variando de 93% a 94% e 56% a 54% inferiores, respectivamente, às observadas a partir dos tríplices perfeitamente emparelhados a 27°C a 32°C (resultados não apresentados).

Numa concentração de 10 fmol/20 μΐ tanto da sonda como do alvo (í.e. uma concentração 100 vezes inferior), o híbrido ADNcdrPNA com um erro de emparelhamento de 1 pb atingiu intensidades de fluorescência variando de 85% a 83% inferiores às obtidas a partir dos tríplices perfeitamente complementares a 27°C a 32°C quando se utilizou YOYO-1 a 25 nM (Fig. 8A) . Similarmente, quando se fizeram reagir 10 fmol/20 μΐ de Sonda N.° 3 de ADNcs com 10 fmol/20 μΐ das sequências alvo de ADNcd, na presença de YOYO-1 10 nM, as intensidades de fluorescência geradas por um erro de emparelhamento de 1 pb foram 90% a 84% inferiores às produzidas por tríplices de ADN perfeitamente emparelhados de 27°C a 32°C (Fig. 8B), provando a extrema sensibilidade do ensaio de hibridação, mesmo com concentrações muito baixas de sonda e alvo.

Foi tolerada uma ampla gama de concentrações de YOYO-1 para cada concentração de sonda e alvo testada. Quando se hibridaram 10 fmol/20 μΐ tanto de sonda como de alvo, as concentrações óptimas de YOYO-1 foram de 25 nM a 2,5 nM (para uma sonda de PNA paralelo) e 10 nM a 2,5 nM (para uma sonda de ADNcs), originando diferenças de intensidades de fluorescência variando de 90% a 71% entre sequências perfeitamente emparelhadas e com erros de emparelhamento (resultados não apresentados). Colectivamente, estes resultados confirmaram a extrema sensibilidade e fiabilidade do ensaio de hibridação 28 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ não desnaturante para distinguir entre sequências do tipo selvagem e as que contêm várias mutações de pares de bases.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe e com referência a seus exemplos específicos, será evidente para um perito na especialidade que podem ser efectuadas várias alterações e modificações sem afastamento ao seu espírito e ao seu âmbito.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Jasmine Daksis Pierre Picard Glen Erikson

<120> ENSAIO DE INTENSIDADE DE FLUORESCÊNCIA PARA HIBRIDAÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO DÚPLICE E TRÍPLICE EM SOLUÇÃO UTILIZANDO INTERCALADORES FLUORESCENTES <130> E1047/20030 <140> <141> <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano <400> 1 tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50

<210> 2 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano < 4 0 0 > 2 tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50 < 210 > 3 <211> 50

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial <22 0> 29 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 3 tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50

<210> 4 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano <400> 4 tggcaccatt aaagaaaata tacgctttgg tgtttcctat gatgaatata 50

<210> 5 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano < 4 0 0 > 5 tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47 < 210 > 6 <211> 15

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: sonda de PNA < 4 0 0 > 6 caccaaagat gatat 15 < 210 > 7 <211> 15

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: sonda de PNA <400> 7 tatagtagaa accac 15

<210> 8 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano 30 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ < 4 0 0 > 8 atatcatctt tggtg 15 <210> 9 <211> 15

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 9 atatcttctt tggtg 15

<210> 10 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 10 atatcatctt tcgtg 15

<210> 11 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 11 atatcatgtt tggtg 15

<210> 12 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 12 atatcatcta tggtg 15

<210> 13 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano 31 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ < 4 Ο Ο > 13 atatcatctc tggtg 15 <210> 14 <211> 15

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 14 atatcatctg tggtg 15

<210> 15 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 15 atatcgtctt tggtg 15

<210> 16 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 16 atatcatttt tggtg 15

<210> 17 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano < 4 0 0 > 17 atatcatctt ttgtg 15

<210> 18 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano 32 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ < 4 Ο Ο > 18 gagcaccatg acagacactg tcatctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50

<210> 19 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cistica humano <400> 19 gagcaccatg acagacactg tcgtctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50

<210> 20 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano <400> 20 gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50 <210> 21 <211> 50

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano < 4 0 0 > 21 gagcaccctc ccaggcacgg tcgtccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50 <210> 22 <211> 50

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano <400> 22 gagcaccctc ccaggcacgg tcatccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50

<210> 23 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: derivada do exão 10 do gene da fibrose cística humano 33 ΕΡ 1 242 620/ΡΤ <4Ο Ο> 23 gagcaccctc ccaggcacgg tattccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50

<210> 24 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: sonda de ADNcs <400> 24 caccagagat gacag 15

<210> 25 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: sonda de ADNcs <400> 25 caccagggac gaccg 15

Lisboa,

Claims (9)

1. ΕΡ 1 242 620/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para ensaio de ligação, compreendendo o referido método: proporcionar um alvo compreendendo ADNcd; proporcionar uma sonda compreendendo ADNcs ou ARN imperfeitamente complementar com pelo menos uma porção do referido alvo; proporcionar um agente intercalante, em que o referido agente intercalante compreende um fluoróforo; adicionar a referida sonda, o referido alvo e o referido agente intercalante a um meio de hibridação para proporcionar uma amostra de teste; irradiar a referida amostra de teste com radiação de excitação para fazer com que o referido fluoróforo emita radiação fluorescente; detectar uma intensidade da referida radiação fluorescente, em que a referida intensidade é uma indicação directa de uma afinidade de ligação entre a referida sonda e o referido alvo; calibrar a referida intensidade contra intensidades exibidas por outras sondas combinadas com o referido alvo e o referido agente intercalante, diferindo cada uma das referidas sondas da referida sonda em pelo menos uma base; e determinar a partir da referida calibração uma extensão de erros de emparelhamento entre a referida sonda e o referido alvo, em que o referido método é um ensaio homogéneo conduzido sem amplificação por PCR do referido alvo e sem desnaturação do referido alvo.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que relativamente ao referido alvo, cada uma da referida sonda e das referidas outras sondas constitui um membro diferente seleccionado do grupo que consiste num emparelhamento perfeito, um erro de emparelhamento de uma base, um erro de emparelhamento de duas bases, um erro de emparelhamento de três bases, uma deleção de uma base, uma deleção de duas bases e uma deleção de três bases, desde que a referida sonda não possa constituir o referido emparelhamento perfeito. ΕΡ 1 242 620/ΡΤ 2/2
3. 3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, em que o referido método é conduzido sem proporcionar um agente de extinção de sinal ao referido alvo ou à referida sonda.
4. 4. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referida sonda híbrida especificamente com o referido alvo para formar um tríplice.
5. 5. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido agente intercalante está covalentemente ligado à referida sonda.
6. 6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido agente intercalante é um membro seleccionado do grupo que consiste em Y0Y0-1, T0T0-1, brometo de etídio, homodímero-1 de etídio, homodímero-2 de etídio e acridina.
7. 7. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referida radiação de excitação é emitida por um laser de iões de árgon a um comprimento de onda de cerca de 200 nm a cerca de 1000 nm.
8. 8. Método de acordo com qualquer da reivindicação anterior, em que a referida amostra de teste possui um volume de cerca de 20 microlitros contendo cerca de 10 fentomoles de alvo e cerca de 10 fentomoles de sonda.
9. 9. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que uma concentração do referido alvo e/ou da referida sonda na referida amostra não é superior a 5 x 10~10 M. Lisboa,