CN1441850A - 阳离子介导的三链体杂交分析 - Google Patents
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- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Abstract
三链体复合体含有与双链核酸靶结合的单链探针，其中该探针包括杂聚核酸或杂聚核酸类似物。所述复合体的所有碱基三联体选自A－T－A、T－A－T、U－A－T、T－A－U、A－U－A、U－A－U、G－C－G和C－G－C。阳离子促进的分析包括检测这些三链复合体的存在以确定探针和靶序列之间的互补性的程度。该分析优选检测标记的荧光强度的变化，作为探针和靶之间结合亲合力的函数。该标记可共价结合到探针或靶上，或可以是反应介质中的嵌入荧光团。
Description
发明说明
发明背景
1.
发明领域
本发明涉及核酸三链体，以及更具体地涉及利用荧光强度测定来准确地分析三链体核酸复合体的方法。
2.
相关领域说明
几十年来，一直使用荧光染料来检测并量化核酸。基于荧光强度分析的最基本形式通常包含靶核酸与含有荧光团的探针接触，从结合探针中将未结合探针去除，检测洗涤样品中的荧光。均相分析在此基本分析上有了提高，前者并不需要洗涤的步骤，或不需要提供非液相的支持。
例如，Livak等的美国专利5,538,848和Maggio的美国专利4,220,450公布了利用溶液中的寡核苷酸探针对核酸序列基于均相荧光的分析。然而，这些专利需要淬灭剂与报告剂组合使用，以区分杂交探针和未杂交探针所产生的信号。Livak等在其公布的方法中还要求使用酶。淬灭剂与酶增加了该方法的复杂性和花费。
Kidwell的美国专利5,332,659公布了检测溶液中核酸序列的方法，其使用包含至少两个荧光基团部分的探针。这些荧光基团的选择要求是，当二者间距足以改变其光谱的波长依赖性时，互相之间有电性的干扰。未杂交的探针比杂交到靶序列上的探针更灵活，因此，未杂交探针上的两个荧光基团部分比杂交探针上的更可能相互靠近。因此，可以监测与游离探针相关的发射波长的变化，作为样品中游离探针数量的指示。
Wu等的美国专利5,846,729也公布了检测核酸杂交的基于均相荧光的分析。
除了上述检测荧光强度的研究进展外，还有一些研究极力推荐荧光极性分析的优点。然而，基于极性的分析有一些明显的缺点。以极性的变化程度作为结合的函数是难以预测的，对于不一致数据进行解释使其符合理论的预期，这在分析方法中是不理想的，特别当这种分析是自动化分析时。还有来自分子的分子量的约束，所述分子其运动在荧光极性分析中正受到评价。
对核酸的常规分析一般基于双链体杂交模型，其中单链探针与互补单链靶序列特异性地结合。核酸的三链体杂交以前在本领域中已被鉴定；然而，三条链间的杂交主要认为限制于核酸极有限的物种中(例如，多嘌呤或多嘧啶序列)参见，例如，Floris等，“Effect of cations onpurine-purine-pyrimidine triple helix formation in mixed-valence saltsolutions，”260 Eur.J.Biochem.801-809(1999)。此外，这样的三链体形成或杂交是基于有限种类的相邻核碱基间的Hoogsteen结合，而非沃森-克里克碱基配对。参见，例如Floris等和Dervan等的美国专利号5,874,555。
尽管有以上的研究成果，本领域仍需要用于核酸之间和/或核酸类似物间相互作用的简便、高灵敏度、有效并且快速的分析方法。
所有在此引用的参考文献以其全文在此引作参考。
发明概述
本发明提供三链体复合体，其包括与双链核酸靶结合的单链探针，其中该探针包括杂聚核酸或杂聚核酸类似物，以及所有该复合体的碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
本发明还提供测定结合的方法，所述方法包括：
提供包含靶序列的双链核酸，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基和至少一个嘧啶碱基；
提供包含核酸序列或核酸类似物序列的探针；
提供阳离子；
将所述探针、所述靶序列和所述阳离子加入到介质中以提供测试含有三链体的样品，该三链体包括与所述靶序列结合的所述探针，其中所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；
用激发辐射照射所述测试样品以促使测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲合力相关；以及
从所述强度确定所述探针和所述靶序列之间匹配的程度。
附图简述
本发明将结合下列附图描述，其中同样的参考数字指定同样的因素，以及其中：
图1A、1B、2A、2B、2C、3A、3B、3C、4A、4B、4C、5A、5B、5C、5D和5E是各分析样品的荧光强度以波长为函数所制作的综合图。
优选实施方案的详细说明
本发明提供三链体，其包括与双链核酸靶结合的单链探针，其中该探针包括杂聚核酸或杂聚核酸类似物，以及所有复合体的碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
与现有技术所公开的某些Hoogsteen三链体不同，本发明的三链体在pH值大于7.6时是稳定的。此外，本发明的三链体不要求存在如某些现有技术中的三链体的同嘧啶序列或同嘌呤序列。例如，靶序列可以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基。
优选地，三链体的单链核酸或核酸类似物的长度是5-30个碱基，以及双链核酸靶的长度为8-3.3×109个碱基对。
根据本发明，三链体的形成适合于各种用途。例如，与双链核酸切割剂共价结合的探针可用于特异性地切割双链核酸的靶序列。与化学治疗剂共价结合的探针可用于特异性地处理双链核酸的靶序列。
在优选的实施方案中，本发明提供快速、灵敏、环保和安全的方法，用于分析双链靶和单链探针之间的结合，其中所述靶包括核酸序列或核酸类似物序列，以及所述探针包括核酸序列或核酸类似物序列。
与某些现有技术的分析不同，本发明不仅检测特异探针-靶结合是否存在，还提供有关探针和靶之间相互作用性质的定量和定性信息。因此，本发明可使操作者区分在探针和双链靶的链中的碱基序列之间出现的完全匹配、单碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、单碱基对缺失、两个碱基对缺失和三个碱基对缺失。
本发明的实施方案包括将第一探针-靶混合物中检测到的信号(如荧光强度)与其它探针与相同的靶结合而发出的相同类型的信号进行校准，其中其他各个探针与第一探针存在至少一个碱基的差异。
可得出标准曲线，其中所测信号的强度(如荧光强度)是靶和探针之间结合亲合力的函数。由于靶与多种不同探针间的结合亲合力随错配碱基数、错配的性质(A-G对A-C对T-G对T-C等)、错配碱基在三链体中位置等因素的不同而各有差异，因此，本发明分析可用于对靶测序。
在实施方案中，测定信号可以是测试样品中所含荧光团的荧光强度。在这些实施方案中，探针与靶之间的结合亲合力与强度正相关或负相关，这取决于荧光团信号杂交是否通过信号淬灭或信号扩增。在选择条件下，由嵌入剂产生的荧光强度能与探针-靶结合的亲合力正相关，而在采用与探针共价结合的非嵌入荧光团的优选的实施方案中，其强度与探针-靶结合的亲合力负相关。随着探针和靶之间匹配程度的增加，非嵌入荧光团的荧光强度降低，优选在包括0-2个错配和/或缺失的范围，更优选在包括0-3个错配和/或缺失的范围。
本发明可以量化探针与靶之间的结合亲合力。这样的信息在许多方面非常有用，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。
与现有技术的方法不同，本发明的分析优选是均相的。该分析在检测荧光强度之前，无需将探针-靶复合体与游离探针和靶分离。该分析无需凝胶分离的步骤，因此检测通量有很大提高。定量分析简便且准确。因此，这种结合分析可节省大量的时间和花费，而且容易自动化完成。此外，这种分析使结合中的一些变量，如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列的长度以及可能的辅助因子要求被快速确定。
在不可渗透的表面或生物芯片上，可在例如孔内的溶液中进行分析。
此外，本发明的分析优选在进行时无需给靶或探针提供信号淬灭剂。
尽管本发明人以前已经公开了荧光强度分析杂交的优点(参见，例如1998年12月31日提交的美国专利申请号09/224,505)，但是根据本发明的分析特异性地检测探针与双链靶的三链体，从而排除了变性靶的需要。已知核酸(核酸类似物)探针与某些有限种类的靶形成三链体(参见，例如Floris等，同上，Dervan等，同上，Egholm等，365 Nature 566(1993)，Tomac等，118 J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，令人惊奇的是本发明人能够特异性地分析单链核酸(例如ssDNA和RNA)探针和双链核酸(例如dsDNA)靶之间形成的三链体，其中探针与靶之间的相互作用是基于沃森-克里克碱基配对(某种意义上至少是A结合T(或U，在RNA情形下)以及G结合C)，而非基于很有限的例如Dervan等的三链体杂交的Hoogsteen模型。本文所用的术语“沃森-克里克三链体”通过将单链探针和双链靶之间的碱基配对的特性限于A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和/或C-G-C(包括C+-G-C和/或任何其他离子化的碱基形式)，旨在明确这些差异。这些三元基团下文称为沃森-克里克碱基三联体，以及所得的结构称作沃森-克里克三链体。
本发明分析中使用的合适的探针包括，如ssDNA、RNA、PNA以及其它具有不带电荷或带部分电荷主链的核酸类似物。优选长度为8到20个碱基的探针序列，因为该范围是原核和真核生物中已发现的最小的独特DNA序列范围。特别优选12到18个碱基的探针，因为这是人类基因组中最小的独特序列的长度。实施方案中，最优选5-30个碱基的探针。不过，多个更短的探针可用于检测具有多个非独特靶序列的核酸序列，这些探针组合用来独特地识别核苷酸序列。探针的长度可选择来匹配靶长度。
在母专利美国申请序列号09/468,679中，发明人公开了令人惊讶的进展，即他们能特异性地分析以沃森-克里克碱基对依赖的方式在单链核酸(如ssDNA、RNA、ssPNA和其他DNA和RNA的类似物)探针和双链核酸(如dsDNA)靶之间形成的很多种的三链体。本发明人公开了三链体的形成和/或稳定性的提高是由于测试样品中嵌入剂的存在。
通过公开三链体的形成和/或稳定性的提高是由于测试样品中嵌入剂的存在，本发明扩大了早先公开的内容。合适的阳离子包括，例如单价阳离子，如Na+(优选浓度为50mM-125mM)、K+和其他碱金属离子；二价阳离子，如碱土金属离子(如Mg+2和Ca+2)以及二价过渡金属离子(如Mn+2、Ni+2、Cd+2、Co+2和Zn+2)；具有至少3价正电荷的阳离子，如Co(NH3)6 +3、三价亚精胺和四价精胺。Mn+2优选以10mM-30mM浓度提供。Mg+2优选以15mM-20mM浓度提供。Ni+2优选以约20mM的浓度提供。在实施方案中，Mg+2和Mn+2组合各自以浓度10mM、15mM或20mM(即各自10-20mM)提供。
向其中形成三链体的介质中加入阳离子的量依赖于许多因素，包括阳离子的性质、探针浓度、靶浓度、额外阳离子的存在以及探针和靶的碱基含量。优选的阳离子浓度和混合物可以常规实验方法找到。
本发明无须使用危险、操作烦琐、耗时而且需要经常再生的放射性探针。本发明的探针优选的是数年都安全稳定的探针。因此，探针可大量制备或订购和储存。
在实施方案中，探针标记有多分子信号复合体或氧还对或具有引发化学发光或电子化学发光的特性的标记。
优选的是探针或靶(优选探针)具有共价结合其上的荧光标记。标记优选是非嵌入荧光团。在这些实施方案中，荧光团优选在任意末端与探针结合。优选的标记包括生物素、罗丹明和荧光素，以及其他用激发能辐射时发荧光的标记。
(通过常规实验和/或常识)选择相当于所用荧光团最大激发的激发波长，优选200到1000nm。优选选择具有发射波长为200到1000nm的荧光团。优选的实施方案中，使用氩离子激光器和波长范围在400nm到540nm之间的光辐射荧光团，在500到750nm之间检测到荧光发射。
本发明的分析可在极广的温度范围下进行，如5℃到85℃之间。某些现有技术分析要求提高温度，增加成本并延迟分析。另一方面，本发明可在室温或室温以下的温度进行(如低于25℃的温度)。
本发明的可靠性不依赖于所述靶中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。由于G-C碱基对形成三个氢键，而A-T碱基对仅形成两个氢键，具有较高G或C含量的靶和探针更加稳定，熔解温度更高。因此，在完全匹配杂合体中增加杂交的探针与靶区域GC含量的碱基错配可抵消错配探针引起的弱结合。当使用嵌入荧光团时，在探针与靶之间含有每一个可能的碱基错配的杂交复合体比完全匹配的杂合体更不稳定，总是导致比完全互补杂合体更低的荧光强度。
本发明的分析是极其灵敏的，因此无须对靶进行PCR扩增。例如，可以对含有约10fmol靶和约10fmol探针的体积为约20微升检测样品进行分析。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的靶，优选浓度不高于5×10-10M。本发明实施方案的灵敏度足以分析5×10-9M浓度的探针，优选浓度不高于5×10-10M。毫无疑问，上述数值并不意味着本方法不能检测更高的浓度。
其中形成三链体的介质可以是任何已知的适宜于保存核苷酸的常规介质。参见如Sambrook等，“Molecular Cloning：A Lab Manual(分子克隆：实验手册)”，第2卷(1989)。例如，液相介质可包括核苷酸、水、缓冲液以及标准盐浓缩物。当二价阳离子专有地用于促进三链体的形成时，螯合剂如EDTA或EGTA不应包括在反应混合物中。
互补碱基间的特异结合在很多条件下出现，各条件在温度、盐浓度、静电强度和缓冲液组成方面有所不同。这些条件和使用方法的例子是本领域已知的。
与许多Hoogsteen型的三链体不同，它们在pH值大于约7.6时是不稳定的或非存在的，而本发明的沃森-克里克三链体在宽范围的pH水平上是稳定的，优选从约pH 5到约pH9。
优选的是三链体在约5℃到约25℃的温度下形成约1小时或更短。不需要更长的反应时间，但在大多数情形下温育长达24小时对三链体没有副作用。本发明的沃森-克里克三链体的快速结合时间与基于Hoogsteen三链体分析的更长的结合时间形成对照。
尽管不需要，通过使用除阳离子以外的某些试剂，有可能促进溶液中三链体的形成。这些试剂优选的例子包括单链结合蛋白，如Rec A蛋白、T4基因32蛋白、大肠杆菌单链结合蛋白、大或小的核酸沟结合蛋白、viologen以及嵌入物质如溴化乙啶、放线菌素D、补骨脂素及当归素。可证明这些助剂在极端的操作条件下是有用的，例如在异常的pH值或极其高的温度下。
本发明分析可用于，例如，识别折叠核酸序列中可及区域，确定杂交复合体中错配的碱基数，以及基因组制图。
本发明人在此可提示沃森-克里克三链体产生自探针与双链体靶的杂交。当结合到探针上的荧光团在与含有沃森-克里克互补碱基的链的双链体靶接触后产生淬灭的荧光发射时，这说明发生了某种结合事件，本发明人不能确信在沃森-克里克三链体中发生的事最好被描述成传统意义上与沃森-克里克双链体形成相关的杂交。当沃森-克里克三链体的形成可称为本文的杂交事件，这仅仅是方便起见，决非意在限制本发明的范围是有关沃森-克里克三链体的形成如何最好地被鉴别特征。
本发明将通过以下实施例进行详细阐述，但应当理解本发明并不只限于以下实施例。实施例 实施例1
在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成衍生自人囊性纤维化基因的外显子10(Nature 380，207(1996))的有义和反义50聚体ssDNA靶序列，并通过HPLC纯化。等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃变性10分钟，然后慢慢退火，使温度在1个半小时内下降到21℃。将双链DNA(dsDNA)寡核苷酸溶解在ddH2O中，终浓度为1pmole/μl。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3’。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3’。
SEQ ID NO：2是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置第507处有一个碱基对的突变(下划线)以外，其中将野生型序列CAT变为CGT。
SEQ ID NO：2的有义链序列为：5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT C
GT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：2的反义链序列为：5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGA
CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
SEQ ID NO：3是与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的47聚体的突变dsDNA靶序列，除在氨基酸位置第507和508处有连续的三个碱基对缺失(以省略符表示)以外，其中野生型序列CTT缺失。
SEQ ID NO：3的有义链序列为：5’-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT CAT...TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO：3的反义链序列为：5’-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CA...A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
1号探针(SEQ ID NO：4)是在5′位置附着有荧光素部分的15聚体ssDNA探针，设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ IDNO：1)的有义链的15个核苷酸区段，与氨基酸位置第505-510重叠(Nature 380,207(1996))。1号探针在DNA合成仪上合成，通过HPLC纯化，并以1pmole/μl的浓度溶解于ddH2O中。
SEQ ID NO：4的序列是：5′-Flu-CAC CAA AGA TGA TAT-3′。
杂交反应混合物(40μl)含有以下成分：0.4 pmole的靶dsDNA、4 pmole的5′-荧光素标记的ssDNA1号探针、10mM Tris-HCl、pH 7.5和0、10、25、50、75、100、125或150mM NaCl。无需变性，把反应混合物在室温(21℃)下温育1小时。将样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束辐射，并对荧光发射进行监控。最大荧光强度出现在波长525nm，这是荧光素的发射波长。各分析样品的最大荧光强度以波长为函数进行绘图。
在NaCl缺乏或10mM或25mM NaCl存在的情况下，未检测到dsDNA靶和ssDNA-F探针之间的杂交，导致当野生型靶SEQ ID NO：1或突变体靶SEQ ID NO：2与1号探针(SEQ ID NO：4)混合时，或当1号探针单独存在时所观察到相似的荧光强度(数据未显示)。
在50mM NaCl存在下温育1小时后，容易形成由完全互补的序列组成的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：1+1号探针)，与由1号探针单独(标记的ssDNA-F)发射的比较，荧光强度降低了49％(图1A)。相反，含有1bp G-T错配的不完全互补dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)在这些条件下较不稳定，与探针单独显示的比较仅降低了11％的荧光强度。
在75mM NaCl存在下温育1小时稍稍不利于三链体的形成，导致完全匹配的dsDNA：ssDNA-F三链体荧光强度降低30％(图1B)。观察到1bp G-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体的最少形成，导致荧光仅降低0.4％。
100mM和125mM NaCl的存在也有助于完全匹配的SEQ ID NO：1靶和1号探针之间形成最多的三链体DNA，以及有助于1bp G-T错配SEQ ID NO：2和1号探针杂交体之间形成较不稳定的三链体DNA(数据未显示)。在150mM NaCl下，没有明显形成三链体DNA。
因而，特定浓度下含有单价阳离子，如Na+和K+，足够允许检测dsDNA靶和标记有荧光素的ssDNA探针在未预变性的情况下形成三链体。此外，利用天然dsDNA，探针与靶以10；1的比例在室温下温育仅1个小时即可发生反应。该实施例中所用的dsDNA靶和ssDNA探针含有33％的GC，而且不含有DNA的同嘌呤或同嘧啶延伸序列。尽管有6个嘧啶碱基散布在15个核苷酸ssDNA探针内，但是容易形成DNA三链体。显然，利用天然DNA，本发明的杂交分析能区分完全互补的DNA序列和那些含有单个1bp错配的序列。实施例2
为了确保在没有预变性的情况下利用5′-荧光素标记的ssDNA探针和dsDNA靶的杂交分析可适用于具有显著不同的百分数GC含量(以及潜在不同的退火参数选择)的探针和靶DNA，合成了新的15聚体ssDNA-F探针和50聚体dsDNA靶序列，同上纯化和退火。以1pmole/μl的浓度将ssDNA-F探针和dsDNA靶溶解于ddH2O中。
SEQ ID NO：5是从SEQ ID NO：1修饰的50聚体的dsDNA靶序列，其中百分数GC含量的变化从30％到52％。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：5)为：5′-GAG CACCAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTCCTA CGA TGA CTC TG-3′。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：5)为：5′-CAG AGTCAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGTCTG TCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：6是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CTC改变为CTT。
突变SEQ ID NO：6的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CT
T TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：6的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CA
A AGA TGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：7是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CAT改变为C
GT。
突变SEQ ID NO：7的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT C
GT CTC TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：7的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA
CGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：8是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CAT改变为C
TT。
突变SEQ ID NO：8的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT C
TT CTC TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：8的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA
AGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：9是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CTC改变为C
CC。
突变SEQ ID NO：9的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT C
CC TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：9的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG
GGA TGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：10是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CTC改变为C
GC。
突变SEQ ID NO：10的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT C
GC TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：10的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG
CGA TGA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：11是与SEQ ID NO：5相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有连续两个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CAT改变为
ACT。
突变SEQ ID NO：11的有义链的序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT
ACT CTC TGG TGT GTC CTACGA TGA CTC TG-3′。
突变SEQ ID NO：11的反义链的序列为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA
GTA CAG TGT CTGTCA TGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：12是从SEQ ID NO：1修饰的50聚体的dsDNA靶序列，其中百分数GC含量的变化从30％到72％。
野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：12)为：5′-GAGCAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGCGAC CTC CGA CGA GCG TG-3′。
野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：12)为：5′-CACGCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCGTGC CTG GGA GGG TGC TC-3′。
SEQ ID NO：13是与SEQ ID NO：12相同的50聚体的突变dsDNA靶序列，除有一个碱基对突变(下划线)以外，此处序列CGT改变为CAT。
突变SEQ ID NO：13的有义链的序列为：5′-GAG CAC CCTCCC AGG CAC GGT C
AT CCC TGG TGC GAC CTCCGA CGA GCG TG-3′。
突变SEQ ID NO：13的反义链的序列为：5′-CAC GCT CGTCGG AGG TCG CAC CAG GGA
TGA CCG TGC CTGGGA GGG TGC TC-3′。
2号探针(SEQ ID NO：14)是在5′位置附着有荧光素部分的15聚体ssDNA探针，设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ IDNO：1)的有义链的15个核苷酸区段。
SEQ ID NO：14的序列为：5′-Flu-CAC CAG AGA TGACAG-3′。
3号探针(SEQ ID NO：15)是5′荧光素标记的15聚体ssDNA探针，其设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：12)的有义链的15个核苷酸区段。
SEQ ID NO：15的序列为：5′-Flu-CAC-CAG-GGA-CGA-CCG-3′。
在反应混合物中加入单价阳离子有助于实施例1中所进行的三链体DNA杂交分析。利用二价阳离子(而非单价阳离子)以促进dsDNA靶与具有各种百分数GC含量的ssDNA-F探针形成三链体DNA来进一步检查杂交分析的特异性。
杂交反应混合物(40μl)含有以下成分：0.4pmole的靶dsDNA、4pmole的5′-荧光素标记的ssDNA探针、10mM Tris-HCl、pH 7.5和5mM-30mM MnCl2或5mM-30mM MgCl2或5mM-30mM NiCl2。无需预变性，把反应混合物在室温(21℃)下温育1小时。将样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束辐射，并对荧光发射进行监控。保存样品并允许在室温下温育过夜共22小时，此时用氩离子激光束辐射后进行第二荧光强度测定。各分析样品的最大荧光强度以波长为函数进行绘图。
当ssDNA-F2号探针(含有53％的GC)在10mM MnCl2存在下与50聚体的野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)和突变dsDNA靶(SEQID NO：6-SEQ ID NO：11)温育时，室温非变性条件下形成dsDNA：ssDNA-F三链体。当完全匹配的DNA三链体产生荧光强度最大的降低(1个小时温育后降低43％)时，1个小时温育后，含有1bp T-G错配的较不稳定的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：6+2号探针)产生的荧光强度比仅用2号探针所观察到的要低20％(图2A)。导致1bp G-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：7+2号探针)、1bp T-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：8+2号探针)、1bp C-A错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：9+2号探针)以及连续2bp A-G和C-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQID NO：11+2号探针)都比完全匹配的DNA三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)更不稳定，生成的荧光强度介于仅仅2号探针所观察到的和完全匹配的DNA三链体所观察到的荧光强度之间(数据未显示)。除最不稳定的1bp T-T错配的DNA三链体(1小时后导致荧光强度仅降低5％)以外，所有其他错配的DNA三链体生成了很相似的荧光强度。只有含1bp G-A错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：10+2号探针)产生了低于完全匹配的DNA三链体所产生的荧光强度(数据未显示)。
在10mM MnCl2存在的条件下温育22小时后，DNA三链体形成更有效。然而，观察到了含有完全匹配序列的DNA三链体与含有碱基对错配序列的DNA三链体之间更突出的区别。如图2B中所示，在10mM MnCl2存在下温育22小时后，含有完全互补序列的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)或含有1bp T-G错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQID NO：6+2号探针)产生的荧光强度分别比由2号探针单独得到的强度低92％和66％。同样，在30mMMnCl2存在下温育22小时后，导致完全匹配的DNA三链体和1bp T-G错配的DNA三链体的荧光强度分别减少90％和57％(图2C)。
将ssDNA-F 3号探针(含有73％的GC)与对应的50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：12)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：13)反应1小时，包括20mM MgCl2或20mM MnCl2或20mM NiCl2也促进了dsDNA：ssDNA三链体的形成(数据未显示)。正如所料，完全匹配的DNA三链体生成了荧光强度的最大降低，而较不稳定的1bp A-C错配DNA三链体(SEQ ID NO：13+3号探针)产生了中间水平的荧光(数据未显示)。在10mM MnCl2存在下温育22小时后，完全匹配的DNA三链体的形成很有效，产生了荧光强度89％的降低。在这些条件下，以等效形成了1bp A-C错配的DNA三链体，与单独用3号探针所观察的比较，其产生的荧光降低了90％(数据未显示)。所以，在20mM二价阳离子存在下1小时的短温育后，完全匹配的和1bp错配的73％GC的DNA三链体之间获得了更佳的区别。
在10mM MnCl2存在下1小时以内容易形成完全匹配的dsDNA：ssDNA-F三链体(具有33％的GC含量)(SEQ ID NO：1+1号探针)，与由1号探针单独发射比较，导致荧光强度降低57％(数据未显示)。这些反应条件高度不适宜于含有1bp G-T错配的DNA三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)，与单独用1号探针所观察的比较，荧光强度增加(数据未显示)。在15mM MgCl2存在下22小时温育后获得了类似的结果。
不管dsDNA靶和ssDNA探针的GC含量百分数如何，在非变性条件下，加入二价阳离子如Mn+2、Mg+2或Ni+2促进了DNA三链体的形成，从而准确区分完全互补的序列和那些含有1bp突变的序列。实施例3
在存在一种单价或二价阳离子的情况下，进行实施例1和2中的三链体DNA杂交分析。接下来的实施例将证实本发明分析在反应混合物中存在二价阳离子的组合时，区分三链体DNA中完全匹配和1bp错配的可靠性。
杂交反应混合物(40μl)含有以下成分：0.4pmole的靶dsDNA、4pmole的5′-荧光素标记的ssDNA探针、10mM Tris-HCl、pH 7.5和5mM MgCl2和5mM MnCl2或10mM MgCl2和10mM MnCl2或15mMMgCl2和15mM MnCl2或20mM MgCl2和20mM MnCl2。无需预变性，把反应混合物在室温(21℃)下温育1小时。将样品放于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束辐射，并对荧光发射进行监控。保存样品并允许在室温下温育过夜共22小时，此时用氩离子激光束辐射后进行第二荧光强度测定。各分析样品的最大荧光强度以波长为函数进行绘图。
在所有dsDNA靶和ssDNA-F探针的混合物中，加入5mM MgCl2和5mM MnCl2对允许检测三链体形成是不够的(数据未显示)。当存在10mM MgCl2和10mM MnCl2或15mM MgCl2和15mM MnCl2的情况下，将ssDNA-F3号探针(具有73％的GC含量)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：12)温育1小时，以等效形成完全互补的dsDNA：ssDNA-F三链体，与由3号探针单独发射比较，产生的荧光降低29％。这两种反应条件都高度不适宜于含有1bp A-C错配的DNA三链体(SEQ ID NO：13+3号探针)，与单独用3号探针所观察的比较，荧光降低了14％。在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2的情况下，温育1小时后所得到的荧光光谱显示在图3A中。
温育22小时生成了更多的DNA三链体。在10mM MgCl2和10mMMnCl2存在下22小时温育后，含有完全匹配序列的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：12+3号探针)或1bp A-C错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：13+3号探针)产生的荧光强度分别比由3号探针单独获得的低62％和21％(图3B)。采用含有15mM MgCl2和15mMMnCl2的样品22小时后得到了很相似的结果(数据未显示)。
用20mM MgCl2和20mM MnCl2仅处理1小时，导致完全匹配的DNA三链体和1bp A-C错配的DNA三链体的荧光分别减少了46％和3％(图3C)。在此情形下，进一步温育样品22小时是无益的(数据未显示)。
当含有73％的GC含量的dsDNA靶在本发明的杂交分析中进行测试时，采用20mM MgCl2和20mM MnCl2处理1小时在完全互补的DNA三链体和含有1bp错配的DNA三链体之间提供最大的稳定性和荧光差异。实施例4
在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2的情况下，将ssDNA-F1号探针(具有33％的GC含量)与野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：1)或突变dsDNA靶(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)温育，观察到最低的DNA三链体的形成(数据未显示)。然而，在15mM MgCl2和15mMMnCl2存在下温育1小时有助于完全匹配的DNA三链体的形成，作为证据是与由1号探针所得到的比较，观察到荧光强度降低了49％(图4A)。在15mM MgCl2和15mM MnCl2存在下，导致1bp G-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)或导致3bp缺失的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)是很不稳定的，与由1号探针单独发射的比较，产生的荧光分别降低2％和增加5％(图4A)。
用20mM MgCl2和20mM MnCl2处理1小时，与仅用1号探针所观察的比较，导致完全匹配的DNA三链体和含有1bp G-T错配或3bp缺失的dsDNA：ssDNA-F的荧光分别减少68％、48％和6％(图4B)。当这些同样样品温育22小时后，获得了最佳的区分含有野生型序列或碱基错配的33％的GC DNA三链体。完全互补的DNA三链体(SEQID NO：1+1号探针)维持稳定22小时以上，与由单独1号探针所得的比较，荧光强度降低62％(图4C)。相反，含有1bp G-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：2+1号探针)或3bp缺失的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：3+1号探针)证明在22小时温育期间很不稳定，与由1号探针单独发射的比较，生成的荧光分别增加了1％和13％的增加(图4C)。实施例5
在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2的情况下1小时内容易形成完全匹配的dsDNA：ssDNA-F三链体(具有53％的GC含量)，与由2号探针单独观察到的比较，导致荧光降低68％(图5A)。含有1bp T-G错配的DNA三链体(SEQ ID NO：6+2号探针)是较不稳定的，与仅由2号探针得到的比较，荧光强度降低了20％(图5A)。
同样样品温育22小时在由完全匹配的或错配的DNA三链体所得到的荧光中产生了更显著的差异。如图5B显示，在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2的情况下，含有完全互补序列的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)或含有1bp T-G错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：6+2号探针)生成的荧光强度分别比仅由2号探针所发射的荧光强度低92％和33％。
在相似的实验中，在存在10mM MgCl2和10mM MnCl2的情况下温育22小时后，完全匹配的DNA三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)生成的荧光强度比只用2号探针所观察到的降低了85％，导致1bp G-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：7+2号探针)、1bp C-A错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：9+2号探针)和连续2bpA-G和C-T错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：11+2号探针)产生的荧光降低了43％、69％以及32％(图5C)。只有含1bp G-A错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：10+2号探针)产生的荧光强度稍低于由完全匹配的DNA三链体产生的荧光强度(数据未显示)。
在存在15mM MgCl2和15mM MnCl2的情况下温育1小时后，获得了含有完全互补序列或碱基对错配的53％GC DNA三链体之间的最佳区分。这些反应条件大大地促进了完全匹配的DNA序列之间DNA三链体(SEQ ID NO：5+2号探针)的形成，与仅由2号探针所获得的比较，导致荧光减少74％(图5D)。相反，在存在15mM MgCl2和15mMMnCl2的情况下，含有1bp T-G错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ IDNO：6+2号探针)是更不稳定的，1小时温育后，与仅由2号探针所发射的比较，产生的荧光降低了15％(图5D)。
同样，导致1bp G-T错配的DNA三链体(SEQ ID NO：7+2号探针)、1bp C-A错配的DNA三链体(SEQ ID NO：9+2号探针)、1bp G-A错配的DNA三链体(SEQ ID NO：10+2号探针)以及连续2bp A-G和C-T错配的DNA三链体(SEQ ID NO：11+2号探针)都比完全匹配的DNA三链体不稳定得多(数据未显示)。在存在10mM MnCl2或10mM MgCl2和10mM MnCl2的情况下相对容易形成1bp G-A错配的DNA三链体，但有15mM MgCl2和15mM MnCl2存在下却不易形成，与只用2号探针所观察到的比较，产生的荧光仅减少7％(数据未显示)。当2号探针(含有53％的GC含量)与dsDNA靶SEQ IDNO：3(含有33％的GC含量)反应时，与仅由2号探针得到的比较观察到荧光增加3％(图5D)，表明没有DNA三链体形成。此结果预计可考虑这种探针和靶组合将导致5bp错配。
采用15mM MgCl2和15mM MnCl2处理22小时，与仅用2号探针所得到的比较，含有完全互补序列的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQID NO：5+2号探针)和含有1bp T-G错配的dsDNA：ssDNA-F三链体(SEQ ID NO：6+2号探针)生成的荧光强度分别降低了76％和44％(图5E)。
总之，上述实施例证实了向杂交介质中加入至少一种阳离子可促进具有显著差别百分数GC含量的dsDNA靶和荧光标记的ssDNA探针之间形成DNA三链体，从而准确并可靠地区分完全互补序列与那些含有各种突变的序列。
本发明已详细描述，参照特定实施例，对于本领域专业技术人员来说，在不背离本发明实质和保护范围的情况下，明显可做出各种变化和修饰。
序列表<110>格伦·埃里克森(Erikson，Glen)
亚斯曼·戴克斯(Daksis，Jasmine)
皮埃尔·皮卡德(Picard，Pierre)<120>阳离子介导的三链体杂交分析
(CATION MEDIATED TRIPLEX HYBRIDIZATION ASSAY)<130>SCT022942-09<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
(Description of Artificial Sequence：derived from
exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>1tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
(Description of Artificial Sequence：derived from
exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>2tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
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exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>3tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ssDNA探针<400>4caccaaagat gatat 15<210>5<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
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exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>12gagcaccctc ccaggcacgg tcgtccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：衍生自人囊性纤维化基因的外显子10
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exon 10 of the human cystic fibrosis gene)<400>13gagcaccctc ccaggcacgg tcatccctgg tgcgacctcc gacgagcgtg 50<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ssDNA探针<400>14caccagagat gacag 15<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：ssDNA探针<400>15caccagggac gaccg 15
Claims (45)
1.一种三链体复合体，其包括与双链核酸靶结合的单链探针，其中所述探针包括杂聚核酸或杂聚核酸类似物，以及所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C。
2.权利要求1所述的复合体，其中所述复合体存在其中的介质的pH大于7.6。
3.权利要求1所述的复合体，其中所述单链核酸或核酸类似物长度为5-30个碱基，以及所述双链核酸靶的长度为8-3.3×109碱基对。
4.权利要求1所述的复合体，其中所述靶序列以任意顺序含有25％-75％嘌呤碱基和75％-25％嘧啶碱基。
5.权利要求1所述的复合体，其中所述探针与双链核酸切割剂共价结合。
6.权利要求1所述的复合体，其中所述探针与化学治疗剂共价结合。
7.权利要求1所述的复合体，其中所述探针与标记共价结合。
8.权利要求7所述的复合体，其中所述标记是多分子信号复合体、氧还对、化学发光剂或电子化学发光剂。
9.权利要求7所述的复合体，其中所述标记是荧光团。
10.权利要求9所述的复合体，其中所述复合体的荧光强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲合力正相关。
11.一种分析结合的方法，所述方法包括：
提供包含靶序列的双链核酸，其中所述靶序列含有至少一个嘌呤碱基以及至少一个嘧啶碱基；
提供包含核酸序列或核酸类似物序列的探针；
提供阳离子；
向介质中加入所述探针、所述靶序列和所述阳离子，以提供含有三链体复合体的测试样品，所述三链体复合体包含与所述靶序列结合的所述探针，其中所述复合体的所有碱基三联体选自A-T-A、T-A-T、U-A-T、T-A-U、A-U-A、U-A-U、G-C-G和C-G-C；
用激发照射辐射所述测试样品以引发测试样品发射荧光辐射；
检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度与所述探针和所述靶序列之间的结合亲和性相关；以及
从所述强度中确定所述探针和所述靶序列之间的匹配程度。
12.权利要求11的方法，其中所述确定的实现方法是以其他探针结合所述靶序列和所述阳离子所显现出的强度对所述强度进行标定，至少一种所述其他探针与所述探针有至少一个碱基的区别。
13.权利要求12的方法，其中相对于所述靶序列，各个所述探针和所述其他探针是选自下组不同成员：完全匹配、单碱基错配、两个碱基错配、三个碱基错配、单碱基缺失、两个碱基缺失以及三个碱基缺失。
14.权利要求11所述的方法，其进一步包括量化所述结合亲合力。
15.权利要求11所述的方法，其中所述方法是进行均相分析，不给所述靶序列或所述探针提供信号淬灭剂。
16.权利要求11所述的方法，其中所述方法是进行均相分析，不对所述靶序列进行预变性。
17.权利要求11所述的方法，其中所述方法是进行均相分析，不对所述靶序列进行PCR扩增。
18.权利要求11所述的方法，其中所述靶序列是dsDNA，以及所述探针特异性地与所述靶序列结合形成三链体。
19.权利要求18所述的方法，其中所述探针是ssDNA或RNA。
20.权利要求11所述的方法，其中所述探针具有带部分电荷的主链。
21.权利要求11所述的方法，其中所述探针具有不带电荷的主链。
22.权利要求21所述的方法，其中所述探针包括PNA序列。
23.权利要求11所述的方法，其中所述探针是通过平行合成制备的ssPNA。
24.权利要求23所述的方法，其中所述探针和所述靶序列长度相同。
25.权利要求11所述的方法，其中所述探针长度为5-30个核苷酸。
26.权利要求11所述的方法，其中所述激发辐射是由波长为约200nm到约1000nm的氩离子激光器发射出的。
27.权利要求11所述的方法，其在温度为5-85℃下进行。
28.权利要求11所述的方法，其在温度低于25℃时进行。
29.权利要求11所述的方法，其中所述方法的可靠性不依赖于探针碱基序列、靶序列碱基序列、所述探针和靶序列的鸟嘌呤含量和胞嘧啶含量。
30.权利要求11所述的方法，其中所述测试样品体积约为20μl，包含约10fmole的靶序列和约10fmole的探针。
31.权利要求11所述的方法，其中所述样品中所述靶序列的浓度不高于5×10-10M。
32.权利要求31所述的方法，其中所述样品中所述探针的浓度不高于5×10-10M。
33.权利要求11所述的方法，其在生物芯片上进行。
34.权利要求11所述的方法，其中所述阳离子是嵌入荧光团以及所述强度与所述结合亲合力正相关。
35.权利要求34所述的方法，其中所述嵌入荧光团与所述探针共价结合。
36.权利要求34所述的方法，其中所述嵌入荧光团以不含所述探针和不含所述靶序列的形式加入到所述介质中。
37.权利要求34所述的方法，其中所述嵌入荧光团选自：YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚体-1、乙啶同型二聚体-2和吖啶。
38.权利要求34所述的方法，其中在嵌入后，所述嵌入荧光团发荧光的波长位移到第二波长处，所述波长和所述第二波长之间的差异显示所述探针和所述靶之间的复合体是双链体还是三链体，以及所述靶是DNA还是RNA。
39.权利要求11所述的方法，其中所述探针被非嵌入荧光团共价地标记以及所述强度与所述结合亲合力负相关。
40.权利要求39所述的方法，其中所述非嵌入荧光团选自生物素、罗丹明和荧光素。
41.权利要求11所述的方法，其中在各个C-G-C和G-C-G碱基三联体中的一个胞嘧啶带正电荷。
42.权利要求11所述的方法，其中所述阳离子是至少一个选自下组成员：碱金属阳离子、碱土金属阳离子、过渡金属阳离子、Co(NH3)6 +3、三价亚精胺和四价精胺。
43.权利要求11所述的方法，其中所述阳离子是以50mM-125mM的浓度提供的Na+。
44.权利要求11所述的方法，其中所述阳离子是以10mM-30mM的浓度提供的Mn+2、以15mM-20mM的浓度提供的Mg+2或以20mM的浓度提供的Ni+2。
45.权利要求11所述的方法，其中所述阳离子包含各以10mM、15mM或20mM的浓度提供的Mg+2和Mn+2。
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