KR20030066580A - 양이온 매개 트리플렉스 혼성화 분석 - Google Patents
양이온 매개 트리플렉스 혼성화 분석 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030066580A KR20030066580A KR20037000309A KR20037000309A KR20030066580A KR 20030066580 A KR20030066580 A KR 20030066580A KR 20037000309 A KR20037000309 A KR 20037000309A KR 20037000309 A KR20037000309 A KR 20037000309A KR 20030066580 A KR20030066580 A KR 20030066580A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- probe
- target sequence
- target
- triplex
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 title claims description 34
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title description 24
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 228
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 53
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 163
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- -1 argon ion Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 6
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 claims description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 2
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical group [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 claims 1
- 239000005091 electrochemiluminescent agent Substances 0.000 claims 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 abstract 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 8
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCPXMKYSHVGGJL-UHFFFAOYSA-N 7h-purine;pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1.C1=NC=C2NC=NC2=N1.C1=NC=C2NC=NC2=N1 VCPXMKYSHVGGJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 101710088729 Single-stranded nucleic acid-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N isopsoralen Natural products C1=C2OC=CC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 XDROKJSWHURZGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N picoperine Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(C=1C=CC=CC=1)CCN1CCCCC1 MVMXJBMAGBRAHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N pseudoisopsoralene Natural products C1=C2C=COC2=C2OC(=O)C=CC2=C1 MLMVLVJMKDPYBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
본 발명의 트리플렉스 결합체는 이중 가닥 핵산 표적에 결합된 단일 가닥 프로브를 함유하고, 상기 프로브는 이종중합체 핵산 또는 이종중합체 핵산 동족체를 포함한다. 상기 결합체의 모든 염기 트리플렛은 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이다. 양이온에 의해 촉진되는 분석법은 이러한 트리플렉스 결합체의 존재를 검출하여 상기 프로브와 표적 서열 사이의 상보성의 정도를 측정하는 것을 포함한다. 상기 분석법은 바람직하게는 표지의 형광 강도의 변화를 상기 프로브와 표적 사이의 결합 친화도의 함수로서 검출한다. 상기 표지는 상기 프로브 또는 상기 표적에 공유결합적으로 부착시킬 수 있거나, 반응 매질 중의 인터킬레이팅 형광물질일 수 있다.
Description
형광 염색제는 수십 년동안 핵산을 검출하고 정량하는 데 사용되어 왔다. 형광 염색제를 사용한 가장 일반적인 형태인 형광-기재 분석법은 일반적으로 표적을 형광물질 함유 프로브와 접촉시키고, 결합되지 않은 임의의 프로브를 결합된 프로브로부터 제거하고, 세척된 샘플에서 형광도를 측정하는 것을 포함한다. 동종 분석법은 세척과정 또는 비액상 지지체의 공급을 필요로 하지 않는다는 점에서 이러한 형광-기재 분석법보다 개선된 방법이다 .
예를 들면, 미국특허 제5,538,848호 (Livak et al.) 및 미국특허 제4,220,450호 (Maggio et al.)는 용액 중에서 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 핵산 서열을 분석하는 동종 형광-기재 분석법을 개시하였다. 그러나, 이들 특허의 방법들은 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브에 의해서 나타나는 형광 신호를 구별하기 위해서 켄칭제 (quenching agent)와 리포터 (reporter)의 사용을 필요로 한다. 또한, 상기 '848 특허에 기재된 방법은 특정 효소의 사용을 필요로 한다. 켄칭제와 효소는 이러한 분석법에 복잡성 및 비용을 더한다.
부여된 미국특허 제5,332,659호 (Kidwell et al.)는 2개 이상의 형광물질 잔기를 포함하는 프로브를 사용하여 용액 중에서 핵산 서열을 검출하는 방법을 개시한다. 상기 형광물질은 그들의 스펙트럼의 파장 의존성을 바꾸기에 충분한 정도로 가깝게 위치할 때 서로 전자적으로 상호작용을 하도록 선택해야 한다. 혼성화되지 않은 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 프로브보다 훨씬 더 높은 가요성을 나타내고, 따라서 각각의 프로브 상의 두 형광물질 잔기는 프로브가 혼성화되어 있을 때보다 혼성화되지 않았을 때에 서로 더욱 가깝게 있을 가능성이 더 높다. 따라서, 자유 프로브와 상관관계를 갖는 방출 파장의 변화를 시료에 있는 자유 프로브 양의 지표로서 모니터링할 수 있다.
핵산 혼성화를 검출할 수 있는 동종 형광-기재 분석법은 미국특허 제5,846,729호 (Wu et al.)에도 기재되어 있다.
형광 강도를 검출하는 상기 방법들 이외에, 일부 당업자들은 형광 극성화 분석법의 장점을 크게 선전한 바 있다. 그러나, 극성화-기재 분석법에는 상당한 결점이 있다. 결합의 함수로서의 극성화 변화도는 예측불가능할 수 있고, 일관성이 없는 데이타를 이론적 기대치에 맞게 하는 데이타의 해석은 특히 이 방법이 자동화되는 경우 분석에 적당한 노력보다 더 많은 노력을 필요로 할 수 있다. 형광 극성화 분석법에서 움직임이 평가되는 분자의 분자량으로부터 발생되는 한계점들도 있다.
핵산의 통상적인 분석법들은 일반적으로 듀플렉스 혼성화 모델을 기초로 하는데, 여기서 단일 가닥 프로브는 상보적 단일 가닥 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 핵산의 트리플렉스 혼성화는 당업계에서 이미 확인되어 있으나, 세 가닥 사이의 혼성화는 주로 매우 제한된 핵산 종 (예를 들어, 폴리퓨린 또는 폴리피리미딘 서열)에 한정되는 것으로 생각되었다 [예를 들어, 문헌 (Floris et al., "Effect of cations on purine-purine-pyrimidine triple helix formation in mixed-valence salt solutions," 260 Eur. J. Biochem. 801-809 (1999)) 참조]. 또한, 이러한 트리플렉스 형성 또는 혼성화는 와슨-크릭 염기 짝짓기가 아니라 인접한 뉴클레오베이스의 제한된 변종 사이의 호오그스틴 (Hoogsteen ) 결합을 기초로 하였다 [예를 들어, 문헌 (Floris et al.) 및 미국 특허 제5,874,555호 (Dervan et al.) 참조].
상기와 같은 발전에도 불구하고, 당업계에서는 핵산 및(또는) 핵산 동족체 사이의 상호작용을 분석하기 위한, 단순하고 매우 민감하며 효과적이고 빠른 다른 방법이 절실히 필요하다.
본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌들은 그 전문이 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
발명의 요약
본 발명은 이중 가닥 핵산 표적에 결합된 단일 가닥 프로브를 포함하는 트리플렉스 결합체를 제공하는데, 상기 프로브는 이종중합체 핵산 또는 이종중합체 핵산 동족체를 포함하고, 상기 결합체의 모든 염기 트리플렛은 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 퓨린 염기 및 하나 이상의 피리미딘 염기를 함유하는 표적 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;
핵산 서열 또는 핵산 동족체 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계;
양이온을 제공하는 단계;
상기 프로브, 상기 표적 서열 및 상기 양이온을 매질에 첨가하여, 상기 표적 서열에 결합된 상기 프로브를 포함하며 모든 염기 트리플렛이 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 트리플렉스 결합체를 함유하는 시험 샘플을 제공하는 단계;
상기 시험 샘플이 형광 방사선을 방출하도록 상기 시험 샘플을 여기 방사선으로 조사하는 단계;
상기 프로브와 상기 표적 서열의 결합 친화도와 상관관계를 갖는, 상기 형광 방사선의 강도를 검출하는 단계; 및
상기 프로브와 상기 표적 서열의 매칭 (matching) 정도를 상기 강도로부터 측정하는 단계
를 포함하는, 결합 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 핵산 트리플렉스 (triplex), 및 보다 구체적으로 형광 강도 측정을 이용하여 트리플렉스 핵산 결합체를 정확하게 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 같은 참조 번호가 같은 요소를 지칭하는 것인 하기 도면들과 함께 설명될 것이고, 도 1A, 1B, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, 4C, 5A, 5B, 5C, 5D 및 5E는 분석된 각 샘플에 대한 파장의 함수로서 작도된 형광 강도의 합성 그래프이다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 이중 가닥 핵산 표적에 결합된 단일 가닥 프로브를 포함하는 트리플렉스 결합체를 제공하는데, 상기 프로브는 이종중합체 핵산 또는 이종중합체 핵산 동족체를 포함하고, 상기 결합체의 모든 염기 트리플렛은 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택된다.
선행기술에 의해 개시된 일부 호오그스틴 트리플렉스와는 달리, 본 발명의 트리플렉스는 7.6보다 더 높은 pH 값에서 안정하다. 또한, 본 발명의 트리플렉스는 일부 선행기술의 트리플렉스에서와 같이 호모피리딘 서열 또는 호모퓨린 서열의 존재를 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 표적 서열은 25% 내지 75%의 퓨린 염기 및 75% 내지 25%의 피리미딘 염기를 임의의 순서로 함유할 수 있다.
바람직하게는, 상기 트리플렉스의 단일 가닥 핵산 또는 핵산 동족체의 길이는 5 내지 30 염기이고, 이중 가닥 핵산 표적의 길이는 8 내지 3.3 X 109염기쌍이다.
본 발명에 따른 트리플렉스 형성은 다양한 용도에 적합하다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산 절단제에 공유결합된 프로브는 이중 가닥 핵산의 표적 서열을 특이적으로 절단하는 데 사용할 수 있다. 화학요법제에 공유결합된 프로브는 이중 가닥 핵산의 표적 서열을 특이적으로 처리하는 데 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이중 가닥 표적과 단일 가닥 프로브 사이의 결합을 빠르게, 민감하게, 환경친화적으로 안전하게 분석하는 방법을 제공하는데, 여기서 표적은 핵산 서열 또는 핵산 동족체 서열을 포함하고, 프로브는 핵산 서열 또는 핵산 동족체 서열을 포함한다.
일부 선행기술의 분석법들과는 달리, 본 발명은 특이적 프로브-표적 결합의 존재를 검출할 뿐만 아니라, 프로브와 표적 사이의 상호작용의 성질에 대한 정성적 및 정량적 정보도 제공한다. 따라서, 본 발명은 당업자들로 하여금 프로브의 염기 서열과 이중 가닥 표적 중 한 가닥의 염기 서열 사이에서 일어나는 완전 매치, 1개-염기쌍 미스매치 (mismatch), 2개-염기쌍 미스매치, 3개-염기쌍 미스매치, 1개-염기쌍 결실, 2개-염기쌍 결실 및 3개-염기쌍 결실을 구별할 수 있게 한다.
본 발명의 실시양태는 동일한 표적과 혼합된 다른 프로브에 의해 나타나는 동일한 유형의 신호에 대하여 제1 프로브-표적 혼합물에 대한 측정된 신호 (예를 들어, 형광 강도)를 보정하는 것을 포함하는데, 상기 다른 프로브들 각각은 하나 이상의 염기에 의해 제1 프로브와 구별된다.
측정된 신호 (예를 들어, 형광 강도)의 크기가 표적과 프로브의 결합 친화도의 함수인 보정 곡선을 만들 수 있다. 표적과 다수의 다양한 프로브의 결합 친화도가 미스매치된 염기의 수, 미스매치(들)의 성질 (A-G 대 A-C 대 T-G 대 T-C, 등), 트리플렉스 내의 미스매치(들)의 위치 등에 따라 다르기 때문에, 본 발명의 분석법은 표적을 시퀀싱하는 데 사용할 수 있다.
실시양태에서, 측정된 신호는 시험 샘플에 포함된 형광물질의 형광 강도일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 프로브와 표적의 결합 친화도는 형광물질이 신호 켄칭을 통해 혼성화 신호를 나타내느냐 아니면 신호 증폭을 통해 혼성화 신호를 나타느냐에 따라 신호 강도와 정비례 또는 반비례 상관관계를 가질 수 있다. 선택된 조건 하에서, 인터킬레이팅제에 의해 발생되는 형광 강도는 프로브-표적 결합 친화도와 정비례 상관관계를 가질 수 있는 반면, 프로브에 공유 결합된 비-인터킬레이팅 형광물질을 사용하는 바람직한 실시양태의 형광 강도는 프로브-표적 결합 친화도와 반비례 상관관계를 가질 수 있다. 비-인터킬레이팅 형광물질의 경우 형광 강도는 프로브와 표적 사이의 매칭도가 바람직하게는 0.2개의 미스매치 및(또는) 결실, 보다 바람직하게는 0-3개의 미스매치 및(또는) 결실 범위를 넘는 정도까지 증가할 때 감소한다.
본 발명은 프로브와 표적의 결합 친화도를 정량할 수 있게 한다. 이러한 정보는 결합 특성이 최적화되어 있는 안티센스 약물을 디자인하는 것을 비롯한 다양한 용도에 유용할 수 있다.
선행기술의 방법과는 달리, 본 발명의 분석법은 바람직하게는 동종 분석법이다. 상기 분석법은 측정된 신호의 크기를 검출하기 전에 자유 프로브와 표적으로부터 프로브-표적 결합체를 분리하지 않고 수행할 수 있다. 상기 분석법은 겔 분리 단계를 필요로 하지 않기 때문에 시험 처리량이 많이 증가한다. 정량 분석은 단순하고 정확하다. 따라서, 이 결합 분석법은 많은 시간 및 비용을 줄이고, 쉽게 자동화될 수 있다. 또한, 상기 분석법은 완충제, pH, 이온 농도, 온도, 인큐베이션 시간, 프로브와 표적 서열의 상대적 농도, 인터킬레이터 농도, 표적 서열의 길이, 프로브 서열의 길이 및 가능한 경우 보조 인자 요구와 같은 결합 변수를 쉽게 결정할 수 있게 한다.
본 발명의 분석법은 예를 들어, 웰 내의 용액 중에서, 불투과성 표면 상에서 또는 바이오칩 상에서 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 분석법은 표적 또는 프로브 상에 신호 켄칭제를 제공하지 않고 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명자들이 혼성화를 위한 형광 강도 분석의 장점을 이미 개시하였지만 (예를 들어, 미국 특허 출원 제09/224,505호; 1998년 12월 31일 출원), 본 발명에 따른 분석법은 프로브와 이중 가닥 표적으로 구성된 트리플렉스를 특이적으로 검출하므로 표적을 변성할 필요가 없게 된다. 핵산 (및 핵산 동족체) 프로브가 일부 제한된 부류의 표적과 트리플렉스를 형성하는 것으로 알려져 있지만 [예를 들어, 문헌 (Floris et al.,supra, Dervan et al.,supra, Egholm et al., 365 Nature 566 (1993), and Tomac et al., 118, J. Am. Chem. Soc. 5544 (1996)) 참조], 본 발명자들이 단일 가닥 핵산 (예를 들어, ssDNA 및 RNA) 프로브와 이중 가닥 핵산 (예를 들어, dsDNA)에 의해 형성된 트리플렉스를 특이적으로 분석할 수 있다는 것은 놀라운 일인데, 상기 프로브와 표적 사이의 상호작용은 예를 들어, 문헌 (Dervan et al.)의 트리플렉스 혼성화의 매우 제한된 호오그스틴 모델이 아니라 와슨-크릭 염기 짝짓기 (적어도, A가 T (또는 RNA의 경우에는 U)에 결합하고 G가 C에 결합한다는 의미에서)를 기초로 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "와슨-크릭 트리플렉스"는 단일 가닥 프로브와 이중 가닥 표적 사이의 염기 짝짓기의 성질을 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및(또는) C-G-C (C+-G-C 및(또는) 임의의 다른 이온화된 염기 종을 포함함)에 한정함으로써 상기 프로브와 상기 표적 사이의 차이점을 구체화하기 위한 것이다. 3개의 구성요소로 된 이들 군은 이하 와슨-크릭 염기 트리플렛으로 지칭되고, 생성되는 구조는 와슨-크릭 트리플렉스로 지칭된다.
본 발명의 분석법에 사용하기에 적합한 프로브에는 예를 들어, ssDNA, RNA, PNA, 및 하전되지 않은 또는 부분적으로 하전된 골격 (backbone)을 갖는 다른 핵산 동족체가 포함된다. 길이가 8 내지 20개 염기인 프로브 서열이 바람직한데, 이는 상기 범위가 원핵세포와 진핵 세포의 최소 유일 DNA 서열이 발견되는 범위이기 때문이다. 12 내지 18개의 염기로 된 프로브는 인간 게놈에 있는 최소 유일 서열의 길이이기 때문에 특히 바람직하다. 실시양태에서, 5개 내지 30개의 염기로 된 프로브가 가장 바람직하다. 그러나, 보다 짧은 다수의 프로브를 사용하여 다수의 비-유일 표적 서열을 갖는 핵산 서열을 검출할 수 있는데, 상기 다수의 프로브는 상기 핵산 서열을 특이적으로 확인시켜 주도록 결합한다. 상기 프로브의 길이는 표적의 길이와 일치하도록 선택할 수 있다.
미국 모출원 제09/468,679호에서, 본 발명자들은 그들이 단일 가닥 핵산 (예를 들어, ssDNA, RNA, ssPNA, 및 DNA 또는 RNA의 다른 동족체) 프로브와 이중 가닥 핵산 (예를 들어, dsDNA) 표적 사이에 와슨-크릭 염기-짝 의존성 방식으로 형성된 매우 다양한 트리플렉스를 특이적으로 분석할 수 있었다는 놀라운 발견을 개시하였다. 본 발명자들은 트리플렉스 형성 및(또는) 안정화가 시험되는 샘플에서 인터킬레이팅제의 존재에 의해 상승된다는 것을 개시하였다.
본 발명의 개시내용은 와슨-크릭 트리플렉스 형성 및(또는) 안정화가 시험되는 샘플에서 양이온의 존재에 의해 상승된다는 것을 개시함으로써 앞서 개시한 것보다 확장된다. 적당한 양이온에는 예를 들어, Na+(바람직하게는 50 mM 내지 125 mM의 농도), K+및 다른 알칼리성 금속 이온과 같은 1가 양이온; 알칼리성 토금속 이온 (예를 들어, Mg+2및 Ca+2) 및 2가 전이 금속 이온 (예컨대, Mn+2, Ni+2, Cd+2, Co+2및 Zn+2)과 같은 2가 양이온; 및 Co(NH3)6 +3, 3가 스퍼미딘 (spermidine) 및 4가 스퍼민 (spermine)과 같은, 3개 이상의 양 전하를 갖는 양이온이 포함된다. Mn+2는 10 mM 내지 30 mM의 농도로 공급하는 것이 바람직하다. Mg+2은 15 mM 내지 20 mM의 농도로 공급하는 것이 바람직하다. Ni+2은 약 20 mM의 농도로 공급하는 것이 바람직하다. 실시양태에서, Mg+2및 Mn+2은 각각 10 mM, 각각 15 mM 또는 각각 20 mM (즉, 각각 10-20 mM)의 농도로 배합하여 공급한다.
트리플렉스가 형성되는 매질에 첨가되는 양이온의 양은 양이온의 성질, 프로브의 농도, 표적의 농도, 추가 양이온의 존재 및 프로브와 표적의 염기 함량을 비롯한 다수의 요인에 달려 있다. 바람직한 양이온 농도 및 혼합물은 통상적으로 실험에 의해 발견할 수 있다.
본 발명은 사용시 해롭고 지루하고 시간 소모적이며 꾸준히 재생되어야 할방사성 프로브의 사용을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 사용시 안전하고 장기간 동안 안정하다. 따라서, 프로브를 대량으로 만들거나 또는 주문하여 저장할 수 있다.
실시양태에서, 프로브는 다중-분자 신호전달 결합체 또는 산화환원쌍으로 표지하거나, 화학발광 또는 전기화학발광 성질을 나타내는 표지로 표지한다.
프로브 또는 표적 (바람직하게는 프로브)에는 형광 표지가 공유결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 표지는 바람직하게는 비-인터킬레이팅 형광물질이다. 이러한 실시양태에서, 형광물질은 바람직하게는 양 말단 중 한 말단에서 프로브에 결합되어 있다. 바람직한 형광 마커에는 바이오틴, 로다민 및 플루오레세인, 및 여기 에너지로 조사될 때 형광을 나타내는 다른 마커가 포함된다.
여기 파장은 사용되는 형광물질에 대한 이 여기 최대치에 상응하도록 (통상적인 실험 및(또는) 종래의 지식에 의해) 선택하고, 바람직하게는 200 내지 1000 nm이다. 형광물질은 바람직하게는 200 내지 1000 nm의 방출 파장을 갖도록 선택한다. 바람직한 실시양태에서, 아르곤 이온 레이저는 파장이 400 내지 540 nm인 광을 갖는 형광물질을 조사하는 데 사용하고, 형광 방출은 500 내지 750 nm에서 검출한다.
본 발명의 분석법은 매우 다양한 온도, 예를 들어, 5 내지 85℃에서 수행할 수 있다. 일부 선행기술의 분석법은 승온을 필요로 하고, 분석시 비용 및 시간 지연이 생긴다. 다른 한편으로, 본 발명은 실온 이하에서 (예를 들어, 25℃ 이하의 온도에서) 수행할 수 있다.
본 발명의 신뢰도는 상기 표적물질의 구아닌 및 시토신 함량과는 무관하다. A-T 염기쌍은 단지 2개의 수소결합을 형성하는 반면, G-C 염기쌍은 3개의 수소결합을 형성하기 때문에, 표적 및 프로브의 G-C 함량이 높을수록 융점 (Tm)은 더 높아져서 더욱 안정하다. 따라서, 혼성화되는 프로브와 표적 영역의 GC 함량을 완전히 매치된 하이브리드의 GC 함량보다 더 높은 수준으로 증가시키는 염기쌍 미스매치는 미스매치된 프로브와 관련된 결합 약화를 상쇄시킬 수 있다. 프로브와 표적 사이의 모든 가능한 염기쌍 미스매치를 포함하는 트리플렉스는 완전히 매치된 트리플렉스보다 더 불안정하고, 인터킬레이팅 형광물질이 사용되는 경우 완전히 상보적인 하이브리드보다 항상 더 낮은 형광 강도를 나타낸다는 것이 입증되었다.
본 발명의 분석법은 매우 민감하기 때문에 표적의 PCR 증폭을 수행할 필요가 없게 된다. 예를 들면, 약 10 x 10-15M의 표적 및 약 10 x 10-15M의 프로브를 함유하는 약 20 ㎕의 시험 샘플을 분석할 수 있다. 본 발명의 실시양태는, 5 x 10-9M 농도, 바람직하게는 5 x 10-10M 미만의 농도에서 표적을 분석하기에 충분할 만큼 민감하다. 그러나, 상기 값이 본 발명의 분석법이 상기 언급된 농도보다 더 높은 농도의 표적을 검출할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다는 것은 말할 것도 없다.
트리플렉스가 형성되는 매질은 뉴클레오타이드를 보존하기에 적합한 것으로 알려진 임의의 통상적 매질일 수 있다 (참고, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Lab Manual, Vol. 2 (1989). 예를 들면, 액체 매질은 뉴클레오타이드, 물, 완충용액, 표준의 염 농도를 포함할 수 있다. 트리플렉스 형성을 촉진하는 데 2가 양이온을 독점적으로 사용하는 경우, EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이터를 반응 혼합물에 포함시켜서는 안된다.
상보적인 염기들 사이의 특이적 결합은 온도, 염 농도, 정전기도, 및 완충 조성물을 변화시킨 매우 다양한 조건 하에서 일어난다. 이러한 조건의 예 및 이를 이용한 방법의 예는 당분야에 잘 알려져 있다.
약 7.6보다 높은 pH 수준에서 불안정하거나 존재하지 않는 많은 호오그스틴-타입 트리플렉스와는 달리, 본 발명의 와슨-크릭 트리플렉스는 넓은 범위의 pH 수준, 바람직하게는 약 5 내지 약 9의 pH에서 안정하다.
트리플렉스는 약 5℃ 내지 약 25℃에서 약 1시간 이하 동안 형성하는 것이 바람직하다. 보다 더 긴 반응 시간은 요구되지 않으나, 대부분의 경우 24시간 이하의 인큐베이션이 트리플렉스에 악영향을 주지 않았다. 본 발명의 와슨-크릭 트리플렉스의 빠른 결합 시간은 호오그스틴 트리플렉스-기재의 분석법의 훨씬 더 긴 결합 시간과 상반된다.
필요하지는 않지만, 양이온 이외에 특정 시약을 사용하여 용액 중에서 트리플렉스 형성을 용이하게 하는 것도 가능하다. 이들 시약의 바람직한 예에는 단일 가닥 핵산 결합 단백질, 예를 들면, Rec A 단백질, T4 유전자 32 단백질, 이. 콜라이 (E. coli) 단일 가닥 결합 단백질, 메이저 또는 마이너 핵산 그루브(groove) 결합 단백질, 비올로겐(viologen), 및 인터킬레이팅 물질, 예컨대, 에티디움 브로마이드, 액티노마이신 D, 소랄렌(psoralen), 안겔리신(angelicin)을 포함한다. 이러한 특정 시약은 극한 반응 조건, 예를 들면, 비정상적인 pH 수준, 또는 극도로 높은 온도에서 유용한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 분석법은 폴딩된 뉴클레오타이드 서열에서 접근가능한 영역을 찾는 데 사용할 수 있고, 이를 이용하여 혼성화 결합체에서 미스매치된 염기쌍의 수를 측정하는 데 사용할 수 있고, 게놈을 맵핑하는 데 사용할 수 있다.
본 발명자들은 본 명세서에서 종종 와슨-크릭 트리플렉스가 프로브와 듀플렉스 표적의 혼성화로부터 만들어진다는 것을 제시할 수 있다. 프로브에 부착된 형광물질이 와슨-크릭 상보적 염기들로 구성된 가닥을 함유하는 듀플렉스 표적에 노출될 때 켄칭된 형광을 방출하고, 이것은 특정 종류의 결합이 일어났음을 나타내지만, 본 발명자들은 와슨-크릭 트리플렉스에서 일어난다는 것이 와슨-크릭 듀플렉스 형성과 전통적으로 관련되어 있는 의미에서 혼성화로서 가장 잘 설명되는지는 확신할 수 없다. 와슨-크릭 트리플렉스의 형성을 본 명세서에서 혼성화로서 종종 부를 수 있지만, 이것은 단지 편의상 부르는 것이고, 와슨-크릭 트리플렉스 형성의 특징을 가장 잘 규명하는 방법에 대하여 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명은 하기 실시예와 관련하여 보다 상세히 설명될 것이지만, 본 발명이 하기 실시예에 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1
인간 포낭성 섬유증 유전자 (Nature380, 207 (1996))의 엑손 10으로부터 유래된 센스 및 안티센스 50-머 ssDNA 표적 서열을 DNA 합성기 (Expedite 8909,PerSeptive Biosystems) 상에서 합성하고, HPLC로 정제하였다. 동량의 상보적 올리고뉴클레오티드를 95℃에서 10분 동안 변성하고, 1.5시간에 걸쳐 온도를 21℃로 냉각하면서 점차적으로 어닐링시켰다. 이중 가닥 DNA (dsDNA) 올리고뉴클레오티드를 1 pmole/㎕의 농도로 ddH2O에 용해시켰다.
야생형 표적 DNA (서열 1)의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
야생형 표적 DNA (서열 1)에 대한 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
서열 2는 야생형 서열 CAT가 CGT로 바뀐 아미노산 위치 507에서의 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 야생형 표적 DNA (서열 1)와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
서열 2의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
서열 2에 대한 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGACGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
서열 3은 야생형 서열 CTT가 결실된 아미노산 위치 507 및 508에서의 연속 3개의 염기쌍 결실 (생략부호에 의해 표시됨)을 제외하고 야생형 표적 DNA (서열 1)와 동일한 47-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
서열 3의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TATCAT . . . TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'.
서열 3의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CA . . . A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.
5' 위치에 플루오레세인 잔기가 부착되어 있는 15-머 ssDNA 프로브인 제1번 프로브 (서열 4)는, 50-머 야생형 표적 DNA (서열 1)의 센스 가닥의 15개 뉴클레오티드 단편에 완전히 상보적이고 아미노산 위치 505 내지 510이 오버랩핑되도록 디자인하였다 (Nature380, 207 (1996)). 제1번 프로브는 DNA 합성기 상에서 합성하고, HPLC로 정제하고, 1 pmole/㎕의 농도로 ddH2O에 용해시켰다.
서열 4에 대한 서열: 5'-Flu-CAC CAA AGA TGA TAT-3'.
혼성화 반응 혼합물 (40 ㎕)은 0.4 pmoles의 표적 dsDNA, 4 pmoles의 5' 플루오레세인 표지 제1번 ssDNA 프로브, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 0, 10, 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 mM NaCl를 함유하였다. 이 반응 혼합물을 미리 변성시키지 않고 실온 (21℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 석영 큐빗에 넣고, 파장이 488 nm인 아르곤 이온 레이저로 조사하고, 형광 방출에 대하여 모니터링하였다. 최대 형광 강도는 플루오레세인에 대한 방출 파장인 525 nm의 파장에서 일어났다. 형광의 강도를 분석된 각 샘플에 대하여 파장의 함수로서 작도하였다.
NaCl의 부재 또는 10 mM 또는 25 mM NaCl의 존재 하에서, dsDNA 표적과 ssDNA-F 프로브의 혼성화는 전혀 검출되지 않았고, 야생형 표적 서열 1 또는 돌연변이체 표적 서열 2가 제1번 프로브 (서열 4)와 혼합되거나 제1번 프로브가 단독으로 존재하는 경우 (데이타는 기재되지 않음) 관찰되는 형광 강도와 유사하였다.
50 mM NaCl의 존재 하에 21℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 완전히 상보적인 서열 (서열 1 + 제1번 프로브)로 구성되는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스가 용이하게 형성되었고, 제1번 프로브 단독 (표지된 ssDNA-F)에 의해 방출되는 형광 강도와 비교할 때 형광 강도가 49% 감소되었다 (도 1A). 반대로, 1 bp G-T 미스매치 (서열 2 + 제1번 프로브)를 포함하는 불완전하게 상보적인 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스는 이 반응 조건 하에서 보다 덜 안정하였고, 제1번 프로브 단독에 의해 나타나는 형광 강도와 비교할 때 형광 강도가 11%만 감소되었다.
75 mM NaCl의 존재 하에서의 1시간 동안의 인큐베이션은 트리플렉스 형성에 다소 덜 도움이 되었고, 완전하게 매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스의 형광 강도를 30% 감소시켰다 (도 1B). 1 bp G-T 미스매치 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스의 최소 형성이 관찰되었고, 형광 강도가 단지 0.4% 감소되었다.
100 mM 및 125 mM NaCl의 존재도 완전하게 매치된 서열 1의 표적과 제1번 프로브의 최대 트리플렉스 형성, 및 1 bp G-T 미스매치 서열 2와 제1번 프로브의 보다 덜 안정한 트리플렉스 DNA 형성을 용이하게 하였다 (데이타는 기재되지 않음). 150 mM NaCl에서, 트리플렉스 DNA 형성은 전혀 나타나지 않았다.
그러므로, 특정한 농도로 Na+및 K+와 같은 1가 양이온을 포함시키는 것이 미리 변성하지 않고 플루오레세인으로 표지된 ssDNA 프로브와 dsDNA 표적의 트리플렉스 형성을 검출하기에 충분하였다. 또한, 반응은 천연 dsDNA를 사용하여 10 대 1의 프로브 대 표적의 비율로 1시간 내의 인큐베이션 중에 실온에서 일어났다. 본 실시예에서 사용된 dsDNA 표적 및 ssDNA 프로브는 33% GC 함량을 함유하고, 동종퓨린 또는 동종피리미딘 DNA 스트레치를 함유하지 않았다. 15개의 뉴클레오티드로 구성된 ssDNA 프로브 내에 산재된 6개의 피리미딘 염기의 존재에도 불구하고, DNA 트리플렉스가 용이하게 형성되었다. 두드러지게는, 본 발명의 혼성화 분석법은 천연 DNA를 사용하여 완전히 상보적인 DNA 서열과 1 bp의 단일 미스매치를 함유하는 DNA 서열을 구별할 수 있었다.
실시예 2
미리 변성하지 않고 5' 플루오레세인 표지 ssDNA 프로브와 dsDNA 표적을 사용하는 혼성화 분석법이 GC 함량% (및 잠재적으로 다른 어닐링 선호도)이 크게 다른 프로브와 표적 DNA에 적용되는지를 확인하기 위해, 새로운 15-머 ssDNA-F 프로브 및 50-머 dsDNA 표적 서열을 상기와 같이 합성하고 정제하고 어닐링시켰다. 두 ssDNA-F 프로브 및 dsDNA 표적은 1 pmole/㎕의 농도로 ddH2O에 용해시켰다.
서열 5는 서열 1로부터 변형된 50-머 dsDNA 표적 서열이고, GC 함량%은 30%에서 52%로 바뀌었다.
야생형 표적 DNA (서열 5)의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
야생형 표적 DNA (서열 5)의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 6은 서열 CTC가 CTT로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 6의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTTTGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 6의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAAAGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 7은 서열 CAT가 CGT로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 7의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 7의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGACGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 8은 서열 CAT가 CTT로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 8의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 8의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGAAGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 9는 서열 CTC가 CCC로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 9의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 9의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAGGGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 10은 서열 CTC가 CGC로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 10의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CGC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 10의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAGCGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 11은 서열 CAT가ACT로 바뀐 연속 2개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 5와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 11의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGTACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3'.
돌연변이체 서열 11의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAG AGT CAT CGT AGG ACA CAC CAG AGAGTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3'.
서열 12는 GC 함량%이 30%에서 72%로 바뀐, 서열 1로부터 변형된 50-머 dsDNA 표적 서열이었다.
야생형 표적 DNA (서열 12)의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CGT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.
야생형 표적 DNA (서열 12)의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGA CGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.
서열 13은 서열 CGT가 CAT로 바뀐 1개의 염기쌍 돌연변이 (밑줄침)를 제외하고 서열 12와 동일한 50-머 돌연변이체 dsDNA 표적 서열이었다.
돌연변이체 서열 13의 센스 가닥에 대한 서열: 5'-GAG CAC CCT CCC AGG CAC GGT CAT CCC TGG TGC GAC CTC CGA CGA GCG TG-3'.
돌연변이체 서열 13의 안티센스 가닥에 대한 서열: 5'-CAC GCT CGT CGG AGG TCG CAC CAG GGATGA CCG TGC CTG GGA GGG TGC TC-3'.
5' 위치에 플루오레세인 잔기가 부착되어 있는 15-머 ssDNA 프로브인 제2번 프로브 (서열 14)는 50-머 야생형 표적 DNA (서열 5)의 센스 가닥의 15개 뉴클레오티드 단편에 완전히 상보적이도록 디자인하였다.
서열 14에 대한 서열: 5'-Flu-CAC CAG AGA TGA CAG-3'.
제3번 프로브 (서열 15)는 50-머 야생형 표적 DNA (서열 12)의 센스 가닥의 15개 뉴클레오티드 단편에 완전히 상보적이도록 디자인된 15-머 5' 플루오레세인 표지 ssDNA 프로브이었다.
서열 15에 대한 서열: 5'-Flu-CAC CAG GGA CGA CCG-3'.
실시예 1에서 수행된 트리플렉스 DNA 혼성화 분석법은 1가 양이온을 반응 혼합물에 첨가함으로써 용이하게 되었다. 상기 혼성화 분석법의 특이성은 다양한 GC 함량을 갖는 dsDNA 표적과 ssDNA-F 프로브를 사용한 트리플렉스 DNA 형성을 촉진하기 위한 (1가 양이온 대신에) 2가 양이온을 사용하여 더 조사하였다.
혼성화 반응 혼합물 (40 ㎕)은 0.4 pmoles의 표적 dsDNA, 4 pmoles의 5' 플루오레세인 표지 ssDNA 프로브, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 및 5 mM 내지 30 mM MnCl2또는 5 mM 내지 30 mM MgCl2또는 5 mM 내지 30 mM NiCl2을 함유하였다. 이 반응 혼합물을 변성하지 않고 1시간 동안 실온 (21℃)에서 인큐베이션하였다. 샘플을 석영 큐빗에 넣고, 파장이 488 nm인 아르곤 이온 레이저 빔으로 조사하고, 형광 방출에 대하여 모니터링하였다. 샘플을 덜어놓고 실온에서 총 22시간 동안 밤새 인큐베이션하였고, 아르곤 이온 레이저 빔으로 조사한 후 형광 강도를 두번째로 측정하였다. 형광 강도는 분석된 각 샘플에 대하여 파장의 함수로서 작도하였다.
제2번 ssDNA-F 프로브 (GC 함량이 53%임)를 10 mM MnCl2의 존재 하에서 50-머 야생형 dsDNA 표적 (서열 5) 및 돌연변이체 dsDNA 표적 (서열 6 내지 서열 11)과 인큐베이션하는 경우, dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스가 비-변성 조건 하에 실온에서 형성되었다. 완전히 매치된 DNA 트리플렉스는 형광 강도를 최대로 감소시키지만 (1시간 인큐베이션 후 43% 감소), 1 bp T-G 미스매치를 함유하는 보다 덜 안정한 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)는 1시간 인큐베이션 후 제2번 프로브 단독에서 관찰된 형광 강도보다 20% 더 낮은 형광 강도를 나타내었다 (도 2A). 1 bp G-T 미스매치를 나타내는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 7 + 제2번 프로브), 1 bp T-T 미스매치를 나타내는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 8 + 제2번 프로브), 1 bp C-A 미스매치를 나타내는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 9 + 제2번 프로브) 및 연속 2 bp A-G 및 C-T 불일치를 나타내는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 11 + 제2번 프로브) 모두는 제2번 프로브 단독의 경우 관찰된 형광 강도 내지 완전히 매치된 DNA 트리플렉스의 경우 관찰된 형광 강도의 형광 강도를 나타내면서 완전히 매치된 DNA 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브)보다 덜 안정하였다 (데이타는 기재되지 않음). 안정성이 가장 낮은 (1시간 후 형광 강도기 단지 5%만 감소됨) 1 bp T-T 미스매치 DNA 트리플렉스를 제외하고, 다른 모든 미스매치 DNA 트리플렉스가 매우 유사한 형광 강도를 나타내었다. 1 bp G-A 미스매치 (서열 10 + 제2번 프로브)를 함유하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스만이 완전히 미스매치된 DNA 트리플렉스에 의해 나타나는 형광 강도보다 더 낮은 형광 강도를 나타내었다 (데이타는 기재되지 않음).
DNA 트리플렉스 형성은 10 mM의 MnCl2의 존재 하에 22시간 인큐베이션한 후에 보다 더 효율적이었다. 그럼에도 불구하고, 완전히 매치된 서열을 포함하는 DNA 트리플렉스와 염기쌍 미스매치 서열을 포함하는 DNA 트리플렉스의 보다 현저한 차이가 관찰되었다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 완전히 상보적인 서열을 포함하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브) 또는 1 bp T-G 미스매치를 포함하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)는 10 mM MnCl2의 존재 하에 22시간 인큐베이션한 후 제2번 프로브 단독에 의해 나타나는 형광 강도보다 각각 92% 및 66% 더 낮은 형광 강도를 나타내었다. 유사하게, 30 mM MnCl2의 존재 하에서의 22시간 인큐베이션은 완전히 미스매치된 DNA 트리플렉스 및 1 bp T-G 미스매치 DNA 트리플렉스에 의해 나타나는 형광 강도를 각각 90% 및 57% 감소시켰다(도 2C).
20 mM MgCl2, 20 mM MnCl2또는 20 mM NiCl2을 포함시키는 것도 제3번 ssDNA-F 프로브 (73%의 GC 함량을 가짐)가 상응하는 50-머 야생형 dsDNA 표적 (서열 12) 및 돌연변이체 dsDNA 표적 (서열 13)과 1시간 동안 반응하였을 때 dsDNA:ssDNA 트리플렉스 형성을 용이하게 하였다 (데이타는 도시되지 않음). 예측된 바와 같이, 완전히 매치된 DNA 트리플렉스는 형광 강도에서 최대 감소를 나타내었지만, 보다 덜 안정한 1 bp A-C 미스매치 DNA 트리플렉스 (서열 13 + 제3번 프로브)는 중간 수준의 형광 강도를 나타내었다 (데이타는 도시되지 않음). 완전히 매치된 DNA 트리플렉스는 10 mM MnCl2의 존재 하에 22시간 인큐베이션된 후 매우 효율적으로 형성되었고, 형광 강도를 89% 감소시켰다. 1 bp A-C 미스매치 DNA 트리플렉스는 이 반응 조건에서 동일한 효율로 형성되었고, 제3번 프로브 단독에서 관찰된 형광 강도와 비교할 때 형광 강도를 90% 감소시켰다 (데이타는 도시되지 않음). 그러므로, 20 mM의 2가 양이온의 존재 하에서의 1시간의 짧은 인큐베이션 후 완전히 매치된 73% GC DNA 트리플렉스와 1 bp 미스매치 73% GC DNA 트리플렉스를 보다 잘 식별할 수 있었다.
완전히 매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (33% GC 함량을 가짐) (서열 1 + 제1번 프로브)는 10 mM MnCl2의 존재 하에서 1시간 내에 용이하게 형성되었고, 제1번 프로브 단독에 의해 방출되는 형광 강도와 비교할 때 형광 강도를 57% 감소시켰다 (데이타는 도시되지 않음). 이 반응 조건은 1 bp G-T 미스매치 (서열 2 + 제1번 프로브)를 함유하는 DNA 트리플렉스에게 매우 불리하였고, 상기 DNA 트리플렉스는 제1번 프로브 단독에 의해 방출되는 형광 강도와 비교할 때 형광 강도를 증가시켰다 (데이타는 기재되지 않음). 15 mM MnCl2의 존재 하에서 22시간 동안 인큐베이션한 후 유사한 결과를 얻었다.
dsDNA 표적과 ssDNA 프로브의 GC 함량%과는 관계없이, Mn+2, Mg+2or Ni+2와 같은 2가 양이온의 첨가는 비-변성 조건 하에서 DNA 트리플렉스 형성을 촉진시켜 완전히 상보적인 서열과 1 bp 돌연변이를 함유하는 서열을 정확히 구별하게 하였다.
실시예 3
실시예 1 및 2의 트리플렉스 DNA 혼성화 분석법은 1종의 1가 또는 2가 양이온의 존재 하에서 수행하였다. 다음 실시예는 2가 양이온의 배합물이 반응 혼합물에 존재하는 경우 완전 매치 트리플렉스 DNA와 1 bp 미스매치 트리플렉스 DNA를 구별하는 본 발명의 분석법의 신뢰성을 입증할 것이다.
혼성화 반응 혼합물 (40 ㎕)은 0.4 pmoles의 표적 dsDNA, 4 pmoles의 5' 플루오레세인 표지 ssDNA 프로브, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 및 5 mM MnCl2와 5 mM MgCl2, 또는 10 mM MnCl2와 10 mM MgCl2,또는 15 mM MnCl2와 15 mM MgCl2,또는 20 MnCl2와 20 mM MgCl2을 함유하였다. 이 반응 혼합물을 변성하지 않고 1시간 동안 실온 (21℃)에서 인큐베이션하였다. 샘플을 석영 큐빗에 넣고, 파장이 488 nm인아르곤 이온 레이저 빔으로 조사하고, 형광 방출에 대하여 모니터링하였다. 샘플을 덜어놓고 실온에서 총 22시간 동안 밤새 인큐베이션하였고, 아르곤 이온 레이저 빔으로 조사한 후 형광 강도를 두번째로 측정하였다. 형광 강도는 분석된 각 샘플에 대하여 파장의 함수로서 작도하였다.
dsDNA 표적과 ssDNA-F 프로브의 모든 혼합물에서, 5 mM MgCl2및 5 mM MnCl2의 첨가는 트리플렉스 DNA 형성의 검출을 허용하기에는 불충분하였다 (데이타는 도시되지 않음). 제3번 ssDNA-F 프로브 (73%의 GC 함량을 가짐)를 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2, 또는 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서 50-머의 야생형 dsDNA 표적 (서열 12)과 함께 1시간 동안 인큐베이션할 때, 완전히 상보적인 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스가 동일한 효율로 형성되었고, 제3번 프로브만에 의해 방출되는 형광도에 비해 형광도를 29% 감소시켰다. 두 반응 조건은 1 bp A-C 미스매치를 함유하는 DNA 트리플렉스 (서열 13 + 제3번 프로브)에 매우 불리하였고, 따라서 제3번 프로브만을 사용한 경우 관찰되는 형광에 비해 형광을 14% 증가시켰다. 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 얻은 형광 스펙트럼은 도 3A에 도시되어 있다.
22시간의 인큐베이션은 보다 많은 DNA 트리플렉스 형성을 나타내었다. 완전히 일치된 서열를 포함하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 12 + 제3번 프로브) 또는 1 bp A-C 미스매치를 포함하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 13 + 제3번프로브)는 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 22시간 동안 인큐베이션된 후 제3번 프로브만에 의해 나타나는 형광 강도보다 각각 62% 및 21%만큼 더 낮은 형광 강도를 나타내었다 (도 3B). 22시간 후 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2를 함유하는 샘플을 사용하여 매우 유사한 결과를 얻었다 (데이타는 도시되지 않음).
20 mM MgCl2및 20 mM MnCl2로 1시간 동안 처리하면 완전히 매치된 DNA 트리플렉스 및 1 bp A-C 미스매치 DNA 트리플렉스 경우 각각 46% 및 3%만큼 형광도가 감소되었다 (도 3C). 이 경우, 상기 샘플을 22시간 동안 더 인큐베이션하였을 때는 이점을 전혀 얻지 못하였다 (데이타는 도시되지 않음).
GC 함량이 73%인 dsDNA 표적이 본 발명의 혼성화 분석법에서 시험된 경우, 20 mM MgCl2및 20 mM MnCl2로 1시간 동안 처리하면 완전히 상보적인 DNA 트리플렉스와 1 bp 불일치를 포함하는 DNA 트리플렉스 간에 안정성 및 형광도의 최대 차이가 나타났다.
실시예 4
제1번 ssDNA-F 프로브 (GC 함량이 33%임)를 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 야생형 dsDNA 표적 (서열 1) 또는 돌연변이체 dsDNA 표적 서열 2 및 서열 3)과 함께 인큐베이션시켰을 때, DNA 트리플렉스의 최소 형성이 관찰되었다 (데이타는 도시되지 않음). 그러나, 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서의 1시간 동안의 인큐베이션은 제1번 프로브에 의해 얻어지는 형광 강도와 비교할 때 관찰된 형광 강도의 49% 감소에 의해 입증되는 바와 같이 완전히 매치된 DNA 트리플렉스 형성을 촉진하였다 (도 4A). 1 bp G-T가 미스매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 2 + 제1번 프로브) 또는 3 bp가 결실된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 3 + 제1번 프로브)는 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서 매우 불안정하였고, 제1번 프로브 단독에 의해 방출되는 형광도에 비해 형광도를 각각 2% 감소시키고 5% 증가시켰다 (도 4A).
20 mM MgCl2및 20 mM MnCl2로 1시간 동안 처리하면, 완전히 매치된 DNA 트리플렉스의 경우 및 1 bp G-T가 미스매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 또는 3 bp가 결실된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스의 경우에는 제1번 프로브만을 사용할 때 관찰되는 형광도에 비해 형광도가 각각 68%, 48% 및 6%만큼 감소되었다 (도 4B). 야생형 서열을 포함하는 33% GC DNA 트리플렉스와 염기쌍 불일치를 포함하는 33% GC DNA 트리플렉스 사이의 최적 식별은 이들 두 샘플을 22시간 동안 인큐베이션하였을 때 달성되었다. 완전히 상보적인 DNA 트리플렉스 (서열 1 + 제1번 프로브)는 제1번 프로브만을 사용하여 얻은 형광 강도에 비해 형광 강도를 62% 만큼 감소시키면서 22시간에 걸쳐 안정한 상태로 유지되었다 (도 4C). 반대로, 1 bp G-T가 미스매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 2 + 제1번 프로브) 또는 3 bp가 결실된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 3 + 제1번 프로브)는 22시간의 인큐베이션 동안 매우 불안정하여 제1번 프로브만에 의해 방출되는 형광도와 비교할 때 형광도를 각각 1% 및 13% 증가시키는 것으로 입증되었다 (도 4C).
실시예 5
완전히 매치된 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (GC 함량은 53%임) (서열 5 + 제2번 프로브)는 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 1시간 내에 쉽게 형성되었고, 제2번 프로브만을 사용한 경우 관찰되는 형광도에 비해 형광도를 68% 감소시켰다 (도 5A). 1 bp T-G 미스매치를 포함하는 DNA 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)는 보다 덜 안정하여, 제2번 프로브만을 사용한 경우 관찰되는 형광 강도에 비해 형광 강도를 20% 만큼 감소시켰다 (도 5A).
상기 샘플들을 22시간 동안 인큐베이션하였을 때 완전히 매치된 DNA 트리플렉스와 미스매치된 DNA 트리플렉스에 의해 얻어지는 형광도의 차이는 훨씬 더 컸다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 완전히 상보적인 서열을 포함하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브) 또는 1 bp T-G 미스매치를 갖는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)는 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 제2번 프로브만에 의해 방출되는 형광 강도보다 각각 92% 및 33% 더 낮은 형광 강도를 나타내었다.
유사한 실험에서, 완전히 매치된 DNA 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브)는 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 22시간 동안 인큐베이션된 후 제2번 프로브만 사용한 경우 관찰되는 형광도에 비해 형광도를 85% 감소시켰지만, 1 bp G-T 미스매치를 갖는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 7 + 제2번 프로브), 1 bp C-A 미스매치를 갖는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 9 + 제2번 프로브), 및 연속된 2bp A-G 미스매치와 C-T 미스매치를 갖는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 11 + 제2번 프로브)는 형광도를 각각 43%, 69% 및 32% 감소시켰다 (도 5C). 1 bp G-A 미스매치를 함유하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 10 + 제2번 프로브)만이 완전히 매치된 DNA 트리플렉스에 의해 나타나는 형광 강도보다 약간 더 낮은 형광 강도를 나타내었다 (데이타는 도시되지 않음).
완전히 상보적인 서열을 함유하는 53% GC DNA 트리플렉스와 염기쌍 불일치를 함유하는 53% GC DNA 트리플렉스 간의 최적 식별은 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서의 1시간 인큐베이션 후에 달성되었다. 이 반응 조건들은 완전히 매치되는 DNA 서열들 간에 DNA 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브) 형성을 매우 촉진시켰고, 상기 트리플렉스는 제2번 프로브만에 의해 달성되는 형광 강도와 비교할 때 형광 강도를 74% 감소시켰다 (도 5D). 반대로, 1 bp T-G 미스매치를 함유하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)는 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서 훨씬 더 불안정하였고, 1시간 동안의 인큐베이션 후 제2번 프로브만에 의해 방출되는 형광도와 비교할 때 형광도를 15% 감소시켰다 (도 5D).
유사하게, 1 bp G-T 미스매치를 갖는 DNA 트리플렉스 (서열 7 + 제2번 프로브), 1 bp C-A 미스매치를 갖는 DNA 트리플렉스 (서열 9 + 제2번 프로브), 1 bp G-A 미스매치를 갖는 DNA 트리플렉스 (서열 10 + 제2번 프로브), 및 연속 2 bp A-G 및 C-T 미스매치를 갖는 DNA 트리플렉스 (서열 11 + 제2번 프로브) 모두는 완전히 매치된 DNA 트리플렉스보다 훨씬 더 불안정하였다 (데이타는 도시되지 않음). 10mM MnCl2또는 10 mM MgCl2및 10 mM MnCl2의 존재 하에서 상대적으로 쉽게 형성된 1 bp G-A 미스매치 DNA 트리플렉스는 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2의 존재 하에서는 붕괴되었고, 제2번 프로브만을 사용하여 관찰한 형광도와 비교할 때 형광도를 단지 7%만 감소시켰다 (데이타는 도시되지 않음). 제2번 프로브 (53% GC 함량을 함유함)가 dsDNA 표적 (서열 3; 33%의 GC 함량을 함유함)과 반응하였을 때, 제2번 프로브만을 사용하여 얻은 형광도와 비교할 때 3%의 형광도 증가가 관찰되었고, 이 증가는 DNA 트리플렉스 형성이 없음을 나타낸다. 상기 프로브와 표적의 조합이 5 bp의 미스매치를 초래할 것을 고려하면 상기 결과는 예측할 수 있었다.
22시간 동안 15 mM MgCl2및 15 mM MnCl2로 처리하면, 완전히 상보적인 서열을 함유하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 5 + 제2번 프로브) 및 1 bp T-G 미스매치를 함유하는 dsDNA:ssDNA-F 트리플렉스 (서열 6 + 제2번 프로브)의 경우 형광도는 제2번 프로브만을 사용하여 얻은 형광 강도와 비교할 때 각각 76% 및 44% 감소되었다 (도 5E).
총괄적으로, 상기 실시예들은 1종 이상의 양이온을 혼성화 매질에 첨가하면 GC 함량이 극도로 다른 dsDNA 표적과 형광 표지된 ssDNA 프로브로 구성된 DNA 트리플렉스 형성이 촉진되어 완전히 상보적인 서열과 다양한 돌연변이를 포함하는 서열을 정확하고 신뢰할 수 있을 정도로 구별할 수 있음을 입증하였다.
본 발명이 그의 특정 실시예들과 관련하여 상세히 설명되었지만, 본 발명의 진의 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형을 할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
Claims (45)
- 이종중합체 핵산 또는 이종중합체 핵산 동족체를 포함하는, 이중 가닥 핵산 표적에 결합된 단일 가닥 프로브를 포함하며, 모든 염기 트리플렛 (triplet)이 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 트리플렉스 (triplex) 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 결합체가 존재하는 매질의 pH가 7.6보다 더 높은 pH인 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 단일 가닥 핵산 또는 핵산 동족체의 길이가 5 내지 30개의 염기이고, 상기 이중 가닥 핵산 표적의 길이가 8 내지 3.3 x 109염기쌍인 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 서열이 25% 내지 75%의 퓨린 염기 및 75% 내지 25%의 피리미딘 염기를 임의의 순서로 함유하는 것인 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브가 이중 가닥 핵산 절단제에 공유결합된 것인 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브가 화학요법제에 공유결합된 것인 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브가 표지에 공유결합된 것인 결합체.
- 제7항에 있어서, 상기 표지가 다중-분자 신호전달 결합체, 산화환원쌍, 화학발광제 또는 전기화학발광제인 결합체.
- 제7항에 있어서, 상기 표지가 형광물질인 결합체.
- 제9항에 있어서, 상기 결합체의 형광 강도가 상기 프로브와 상기 표적 서열 사이의 결합 친화도와 정비례적인 상관관계를 갖는 것인 결합체.
- 하나 이상의 퓨린 염기 및 하나 이상의 피리미딘 염기를 함유하는 표적 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;핵산 서열 또는 핵산 동족체 서열을 포함하는 프로브를 제공하는 단계;양이온을 제공하는 단계;상기 프로브, 상기 표적 서열 및 상기 양이온을 매질에 첨가하여, 상기 표적 서열에 결합된 상기 프로브를 포함하며 모든 염기 트리플렛이 A-T-A, T-A-T, U-A-T, T-A-U, A-U-A, U-A-U, G-C-G 및 C-G-C로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 트리플렉스 결합체를 함유하는 시험 샘플을 제공하는 단계;상기 시험 샘플이 형광 방사선을 방출하도록 상기 시험 샘플을 여기 방사선으로 조사하는 단계;상기 프로브와 상기 표적 서열의 결합 친화도와 상관관계를 갖는, 상기 형광 방사선의 강도를 검출하는 단계; 및상기 프로브와 상기 표적 서열의 매칭 (matching) 정도를 상기 강도로부터 측정하는 단계를 포함하는, 결합 분석 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 표적 서열 및 상기 양이온과 배합된 다른 프로브 (이들 다른 프로브 중 하나 이상은 하나 이상의 염기에 의해 상기 프로브와 다름)에 의해 나타나는 강도에 대하여 상기 강도를 보정함으로써 측정을 수행하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 프로브 및 상기 다른 프로브 각각이 상기 표적 서열에 대하여 완전 매치 (match), 1-염기 미스매치 (mismatch), 2-염기 미스매치, 3-염기 미스매치, 1-염기 결실, 2-염기 결실 및 3-염기 결실로 구성되는 군으로부터 선택되는 상이한 프로브인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 결합 친화도를 정량하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 신호 켄칭제 (quenching agent)를 상기 표적 서열 또는 상기 프로브에 제공하지 않고 수행하는 동종 분석법인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 표적 서열을 미리 변성시키지 않고 수행하는 동종 분석법인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 표적 서열의 PCR 증폭 없이 수행하는 동종 분석법인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 표적 서열이 dsDNA이고, 상기 프로브가 상기 표적 서열과 특이적으로 결합하여 트리플렉스를 형성하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 프로브가 ssDNA 또는 RNA인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브가 부분적으로 하전된 골격 (backbone)을 갖는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브가 하전되지 않은 골격을 갖는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 프로브가 PNA 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브가 평행 합성에 의해 제조된 ssPNA인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 프로브의 길이와 상기 표적 서열의 길이가 동일한 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브의 길이가 5 내지 30개의 뉴클레오티드인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 여기 방사선이 약 200 nm 내지 약 1000 nm의 파장에서 아르곤 이온 레이저로부터 방출되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 5 내지 85℃의 온도에서 수행되는 방법.
- 제11항에 있어서, 25℃ 미만의 온도에서 수행되는 방법.
- 제11항에 있어서, 신뢰도가 프로브 염기 서열, 표적 염기 서열, 상기 프로브 및 표적 서열의 구아닌 함량, 및 상기 프로브 및 표적 서열의 시토신 함량과는 무관한 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 시험 샘플의 부피가 약 10 x 10-15몰의 표적 서열 및 약 10 x 10-15몰의 프로브를 함유하는 약 20 마이크로리터인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 샘플 중의 상기 표적 서열의 농도가 5 x 10-10M 이하인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 샘플 중의 상기 프로브의 농도가 5 x 10-10M 이하인 방법.
- 제11항에 있어서, 바이오칩 상에서 수행되는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 양이온이 인터킬레이팅 (intercalating) 형광물질이고, 상기 강도가 상기 결합 친화도와 비레적인 상관관계를 갖는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 형광물질이 상기 프로브에 공유결합된 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 형광물질이 상기 프로브 및 상기 표적서열이 없는 형태로 상기 매질에 첨가되는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 형광물질이 YOYO-1, TOTO-1, 에티디움 브로마이드, 에티디움 동종이량체-1, 에티디움 동종이량체-2 및 아크리딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 형광물질이 형광을 나타내는 파장이 인터킬레이션시 제2의 파장으로 변화되고, 상기 파장과 상기 제2의 파장 사이의 차이가 상기 프로브와 상기 표적으로 구성된 결합체가 듀플렉스 (duplex)인지 아니면 트리플렉스인지, 그리고 상기 표적이 DNA인지 아니면 RNA인지를 나타내는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브가 비-인터킬레이팅 형광물질로 공유결합적으로 표지되어 있고, 상기 강도가 상기 결합 친화도와 반비례적인 상관관계를 갖는 것인 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 비-인터킬레이팅 형광물질이 바이오틴 (biotin), 로다민 (rhodamine) 및 플루오레세인 (fluorescein)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 각 C-G-C 및 G-C-G 염기 트리플렛에서 하나의 시토신이 양성으로 하전된 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 양이온이 알칼리성 금속 양이온, 알칼리성 토금속 양이온, 전이 금속 양이온, Co(NH3)6 +3, 3가 스퍼미딘 (spermidine) 및 4가 스퍼민 (spermine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 양이온인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 양이온이 50 mM 내지 125 mM의 농도로 제공된 Na+인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 양이온이 10 mM 내지 30 mM의 농도로 제공된 Mn+2, 15 mM 내지 20 mM의 농도로 제공된 Mg+2, 또는 20 mM의 농도로 제공된 Ni+2인 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 양이온이 각각 10 mM, 각각 15 mM 또는 각각 20 mM의 농도로 제공된 Mg+2및 Mn+2을 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/613,263 | 2000-07-10 | ||
| US09/613,263 US6420115B1 (en) | 1999-12-21 | 2000-07-10 | Cation mediated triplex hybridization assay |
| PCT/IB2001/001538 WO2002004655A2 (en) | 2000-07-10 | 2001-07-09 | Cation mediated triplex hybridization assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030066580A true KR20030066580A (ko) | 2003-08-09 |
| KR100488826B1 KR100488826B1 (ko) | 2005-05-12 |
Family
ID=24456561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20037000309A KR100488826B1 (ko) | 2000-07-10 | 2001-07-09 | 양이온 매개 트리플렉스 혼성화 분석 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6420115B1 (ko) |
| EP (1) | EP1307591A4 (ko) |
| JP (1) | JP2004511218A (ko) |
| KR (1) | KR100488826B1 (ko) |
| CN (1) | CN1192117C (ko) |
| AU (2) | AU2001280007B2 (ko) |
| BR (1) | BR0112400A (ko) |
| CA (1) | CA2415493C (ko) |
| IL (2) | IL153548A0 (ko) |
| IN (1) | IN2004CH01656A (ko) |
| MX (1) | MXPA03000340A (ko) |
| RU (1) | RU2273643C2 (ko) |
| WO (1) | WO2002004655A2 (ko) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6656692B2 (en) * | 1999-12-21 | 2003-12-02 | Ingeneus Corporation | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US6900300B1 (en) * | 2000-09-19 | 2005-05-31 | Ingeneus Corporation | Quadruplex DNA and duplex probe systems |
| US20030181412A1 (en) * | 1999-12-21 | 2003-09-25 | Ingeneus Corporation | Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses |
| US6911536B1 (en) * | 1999-12-21 | 2005-06-28 | Ingeneus Corporation | Triplex and quadruplex catalytic hybridization |
| US7052844B2 (en) * | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
| US6927027B2 (en) * | 1999-12-21 | 2005-08-09 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid multiplex formation |
| US7309569B2 (en) | 1999-12-21 | 2007-12-18 | Ingeneus, Inc. | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US20030170659A1 (en) * | 2000-01-24 | 2003-09-11 | Ingeneus Corporation | Electrical treatment of binding media to encourage, discourage and/or study biopolymer binding |
| US7220541B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-05-22 | Ingeneus, Inc. | Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
| WO2004010584A2 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-29 | Congruence Llc. | Code for object identification |
| WO2004013620A1 (en) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Sensor Technologies Llc | Fluorescence correlation spectroscopy instrument |
| US20040142329A1 (en) * | 2003-01-17 | 2004-07-22 | Ingeneus Corporation | Probe conjugation to increase multiplex binding motif preference |
| US20040180345A1 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-16 | Ingeneus Corporation | Pre-incubation method to improve signal/noise ratio of nucleic acid assays |
| GB0310270D0 (en) * | 2003-05-03 | 2003-06-11 | Univ Edinburgh | Biomolecular devices |
| CA2581087C (en) * | 2004-09-24 | 2013-11-19 | Ingeneus Inc. | Genomic assay |
| GB0424953D0 (en) * | 2004-11-11 | 2004-12-15 | Plant Bioscience Ltd | Assay |
| US7700287B2 (en) * | 2005-01-28 | 2010-04-20 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target DNA template |
| EP1880019A1 (en) * | 2005-05-12 | 2008-01-23 | Arizona Board Regents, a body corporate of the State of Arizona, acting for and on behalf of Arizona State University | Self-assembled nucleic acid nanoarrays and uses therefor |
| WO2009037511A1 (en) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Astrazeneca Ab | Assay for dna supercoiling/relaxation |
Family Cites Families (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4220450A (en) | 1978-04-05 | 1980-09-02 | Syva Company | Chemically induced fluorescence immunoassay |
| FR2558172B1 (fr) | 1984-01-16 | 1986-06-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| US4876187A (en) | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| US5011769A (en) | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
| US5874555A (en) | 1987-10-30 | 1999-02-23 | California Institute Of Technology | Triple helices and processes for making same |
| US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
| AU634990B2 (en) | 1988-08-31 | 1993-03-11 | Aprogenex, Inc. | Manual in situ hybridization assay |
| US5176996A (en) * | 1988-12-20 | 1993-01-05 | Baylor College Of Medicine | Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use |
| US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5824477A (en) | 1990-09-12 | 1998-10-20 | Scientific Generics Limited | Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid |
| WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
| US6048690A (en) | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| US5558998A (en) | 1992-02-25 | 1996-09-24 | The Regents Of The Univ. Of California | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence |
| US5332659A (en) | 1992-04-09 | 1994-07-26 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids |
| JPH06153997A (ja) | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Canon Inc | 検出信号増幅による標的核酸の検出方法 |
| US6027880A (en) | 1995-08-02 | 2000-02-22 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis |
| US5861124A (en) | 1993-07-15 | 1999-01-19 | Hamamatsu Photonics Kk | Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
| AU7487294A (en) | 1993-08-18 | 1995-03-14 | Id Biomedical Corporation | Compositions and methods for detecting target nucleic acid sequences utilizing flanking sequence enzyme molecules |
| ATE227342T1 (de) | 1993-09-02 | 2002-11-15 | Ribozyme Pharm Inc | Enzymatische nukleiksaüre die nicht-nukleotide enthaltet |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| WO1995014106A2 (en) | 1993-11-17 | 1995-05-26 | Id Biomedical Corporation | Cycling probe cleavage detection of nucleic acid sequences |
| US5998193A (en) | 1994-06-24 | 1999-12-07 | Gene Shears Pty., Ltd. | Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof |
| JP3189000B2 (ja) | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
| US5814516A (en) | 1995-10-13 | 1998-09-29 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof |
| US5824557A (en) | 1996-04-02 | 1998-10-20 | Panvera Corporation | Method for detecting and quantitating nucleic acid impurities in biochemical preparations |
| SE506700C2 (sv) | 1996-05-31 | 1998-02-02 | Mikael Kubista | Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra |
| US5948897A (en) | 1996-06-14 | 1999-09-07 | Simon Fraser University | Method of binding two or more DNA double helices and products formed |
| US5912332A (en) | 1996-07-26 | 1999-06-15 | Hybridon, Inc. | Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides |
| US5691145A (en) | 1996-08-27 | 1997-11-25 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids using G-quartets |
| US5846729A (en) | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
| US6046004A (en) * | 1997-02-27 | 2000-04-04 | Lorne Park Research, Inc. | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones |
| US6251591B1 (en) | 1997-02-27 | 2001-06-26 | Lorne Park Research, Inc. | Quantitative method for detecting nucleotide concentration |
| US6060242A (en) | 1997-02-27 | 2000-05-09 | Lorne Park Research, Inc. | PNA diagnostic methods |
| US6312925B1 (en) * | 1997-05-08 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions to facilitate D-loop formation by oligonucleotides |
| US6013442A (en) | 1997-08-05 | 2000-01-11 | Wisconsin Alumni Res Found | Direct quantitation of low copy number RNA |
| GB9725197D0 (en) | 1997-11-29 | 1998-01-28 | Secr Defence | Detection system |
| US6287772B1 (en) | 1998-04-29 | 2001-09-11 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences |
| US6017709A (en) | 1998-04-29 | 2000-01-25 | University Of Houston | DNA replication templates stabilized by guanine quartets |
| US6255469B1 (en) | 1998-05-06 | 2001-07-03 | New York University | Periodic two and three dimensional nucleic acid structures |
| US6255050B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-07-03 | Lorne Park Research, Inc. | Dynamic hybridization system |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| GB9821989D0 (en) | 1998-10-08 | 1998-12-02 | Hybaid Ltd | Detection of nucleic acid polymorphism |
| US6265170B1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-24 | Ingeneus Corporation | Homogenous assay of duplex of triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions |
-
2000
- 2000-07-10 US US09/613,263 patent/US6420115B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-07-09 WO PCT/IB2001/001538 patent/WO2002004655A2/en active IP Right Grant
- 2001-07-09 BR BR0112400-5A patent/BR0112400A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-07-09 AU AU2001280007A patent/AU2001280007B2/en not_active Ceased
- 2001-07-09 KR KR20037000309A patent/KR100488826B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-07-09 CA CA2415493A patent/CA2415493C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-09 CN CNB018126588A patent/CN1192117C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-09 MX MXPA03000340A patent/MXPA03000340A/es active IP Right Grant
- 2001-07-09 JP JP2002509508A patent/JP2004511218A/ja active Pending
- 2001-07-09 IL IL15354801A patent/IL153548A0/xx unknown
- 2001-07-09 EP EP01958285A patent/EP1307591A4/en not_active Withdrawn
- 2001-07-09 RU RU2003103772/13A patent/RU2273643C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-07-09 AU AU8000701A patent/AU8000701A/xx active Pending
-
2002
- 2002-03-21 US US10/103,002 patent/US6878815B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-12-19 IL IL153548A patent/IL153548A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-06-11 IN IN1656CH2004 patent/IN2004CH01656A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0112400A (pt) | 2004-07-20 |
| IL153548A (en) | 2008-12-29 |
| RU2273643C2 (ru) | 2006-04-10 |
| EP1307591A4 (en) | 2005-02-09 |
| US20020173480A1 (en) | 2002-11-21 |
| CA2415493C (en) | 2010-09-28 |
| AU2001280007B2 (en) | 2005-03-24 |
| IN2004CH01656A (en) | 2006-12-29 |
| WO2002004655A3 (en) | 2002-06-27 |
| US6878815B2 (en) | 2005-04-12 |
| JP2004511218A (ja) | 2004-04-15 |
| AU8000701A (en) | 2002-01-21 |
| CA2415493A1 (en) | 2002-01-17 |
| US6420115B1 (en) | 2002-07-16 |
| KR100488826B1 (ko) | 2005-05-12 |
| IL153548A0 (en) | 2003-07-06 |
| CN1192117C (zh) | 2005-03-09 |
| WO2002004655A2 (en) | 2002-01-17 |
| CN1441850A (zh) | 2003-09-10 |
| EP1307591A2 (en) | 2003-05-07 |
| MXPA03000340A (es) | 2004-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2394752C (en) | Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization in solution utilizing fluorescent intercalators | |
| KR100488826B1 (ko) | 양이온 매개 트리플렉스 혼성화 분석 | |
| CA2398362C (en) | Homogenous assay of duplex or triplex hybridization by means of multiple measurements under varied conditions | |
| US6927027B2 (en) | Nucleic acid multiplex formation | |
| AU2001280007A1 (en) | Cation mediated triplex hybridization assay | |
| AU2002304318A1 (en) | Nucleic acid triplex and quadruplex formation | |
| CA2454300C (en) | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes | |
| AU2002345301A1 (en) | Parallel, antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids | |
| US6900300B1 (en) | Quadruplex DNA and duplex probe systems | |
| US6924108B2 (en) | Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |