MX2007003497A - Ensayo genómico - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una secuencia deácido nucleico en una muestra genómica, incluye:proporcionar la muestra genómica que contiene una secuencia deácido nucleico objetivo de unácido nucleico dúplex;proporcionar, una sonda que contiene una secuencia deácido nucleico de sonda;proporcionar una mezcla de hibridación que contiene la muestra genómica, la sonda, un agente de promoción de hibridación y marcas;incubar la mezcla de hibridación;irradiar la mezcla incubada con radiación efectiva para estimular por lo menos algunas de las marcas para emitir energía;y detectar de una señal fluorescente si la sonda perfectamente iguala la secuencia deácido nucleico objetivo, en donde la detección se completa dentro de sesenta minutos de la provisión de la mezcla de hibridación, y el método se conduce sin desnaturalización y sin amplificación de PCR delácido nucleico dúplex. Un equipo para practicar el método incluye la sonda, el agente de promoción de hibridación y marcas.

Description

ENSAYO GENÓMICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a ensayos de material genómico, y más particularmente a un método y a un equipo para detectar la hibridación dúplex, triplex y/o cuádruplex de ácidos nucleicos. 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Los inventores han divulgado previamente cuadruplexos de Watson-Crick específicamente enlazados y otros cuadruplexos, triplexos y duplexos no canónicos específicamente enlazados en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,656,692 y la patente norteamericana No. 6,927,027. Esas publicaciones proporcionan amplia guía que considera la selección de las condiciones de hibridación apropiadas para obtener cualquiera de los diversos multiplexos divulgados en la misma, incluyendo duplexos, triplexos o cuadruplexos paralelos o antiparalelos que enlazan en la porción homologa o de Watson-Crick. Ver también la patente norteamericana No. 6,420,115 de Erikson y colaboradores, patente norteamericana No. 6,403,313 de Daksis y colaboradores y la publicación de solicitud de patente norteamericana copendiente No. 2004/180345, publicada el 16 de Septiembre de 2004. A pesar de los desarrollos anteriores, se desean proporcionar medios adicionales para analizar ácidos nucleicos que sean sensibles, robustos y confiables. Particularmente se desean proporcionar métodos, y equipos para analizar secuencias de ácido nucleico de muestras genómicas. Además se desean proporcionar medios para la detección directa de secuencias de ácido nucleico en muestras genómicas sin amplificar las secuencias de ácido nucleico. Todavía además se desea mejorar la sensibilidad e identificar más precisamente y confiablemente la señal emitida por la reacción de enlace de interés. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas en la misma por referencia en sus totalidades. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por consiguiente, la invención proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico en una muestra genómica, el método que comprende: proporcionar la muestra genómica que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo de un ácido nucleico dúplex; proporcionar una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de sonda; proporcionar una mezcla de hibridación que comprende la muestra genómica, la sonda, un agente de promoción de hibridación y marcas; incubar la mezcla de hibridación para proporcionar una mezcla incubada que comprende un complejo de la secuencia de ácido nucleico objetivo, la sonda y las marcas; irradiar la mezcla incubada con radiación efectiva para estimular por lo menos algunas de las marcas para emitir energía; y detectar de una señal fluorescente si la sonda perfectamente iguala a la secuencia de ácido nucleico objetivo, para de esta manera detectar si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra genómica, en donde la detección se completa dentro de sesenta minutos de proporcionar la mezcla de hibridación, y el método se conduce sin desnaturalizar el ácido nucleico dúplex y sin amplificación de PCR del ácido nucleico dúplex. Además se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico en una muestra genómica, el método que comprende: proporcionar la muestra genómica que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo de un ácido nucleico de una sola hebra o de doble hebra; proporcionar una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de sonda; proporcionar una mezcla de hibridación que comprende la muestra genómica, la sonda, un agente de promoción de hibridación y marcas; incubar la mezcla de hibridación para proporcionar una mezcla incubada que comprende un complejo de la secuencia de ácido nucleico objetivo, la sonda y las marcas; aplicar energía a la mezcla incubada efectiva para inducir una señal a partir de la mezcla de hibridación; y detectar de la señal si la sonda perfectamente igual a la secuencia de ácido nucleico objetivo, para de esta manera detectar si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra genómica, en donde la detección se completa dentro de sesenta minutos de proporcionar la mezcla de hibridación, y el método se conduce sin desnaturalizar el ácido nucleico dúplex y sin amplificación de PCR del ácido nucleico, dúplex. También se proporciona un equipo para practicar el método de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La invención será descrita en conjunción con los siguientes dibujos en los cuales números de referencias similares designan elementos similares y en donde: Las Figs. 1, 2, 3, 4 y 5 son gráficas de intensidad fluorescente contra el tiempo de incubación que muestra el incremento y/o menguamiento de la intensidad fluorescente a través del tiempo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Los inventores han divulgado previamente el enlace especifico de la hebra heteropolimérica al ácido nucleico dúplex y el enlace específico del ácido nucleico dúplex a otro ácido nucleico dúplex. La descripción de los inventores proporciona los medios mediante los cuales las secuencias de bases en dúplexos que ocurren naturalmente se pueden hacer específicamente reactivos a una secuencia de base en una tercera hebra mientras que permanecen establemente emparejados en el dúplex, un hecho previamente no reconocido de capital importancia. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,656,692 y la patente norteamericana No. 6,927,027. Los inventores también han divulgado que los ácidos nucleicos heteropoliméricos (y/o sus análogos) pueden enlazarse específicamente entre sí mediante la unión de base homologa así como mediante la interacción de base de Watson-Crick, y que la unión de base no está limitada a hebras que tienen direccionalidad antiparalela con relación entre sí. Id. Así, los ácidos nucleicos heteropoliméricos (y/o sus análogos) pueden enlazarse específicamente entre sí con direccionalidad paralela o antiparalela, en donde las bases se unen mediante la unión de base homologa y/o las reglas de unión de base de atson-Crick . La descripción de los inventores de la preferencia de porción de enlace de los ácidos nucleicos fue de manera similar no reconocida previamente y es del mismo modo de capital importancia. Todos los complejos específicos anteriores son fácilmente reproductibles habiéndose detectado in vitro utilizando instrumentos fácilmente disponibles y reactivos utilizados bajo condiciones leves y permisivas. Los inventores han divulgado previamente que la pre-incubación de la sonda con un agente de incubación de sonda y/o el objetivo con un agente- de incubación objetivo puede incrementar la discriminación de la señal a ser detectada de las señales antecedentes (es decir, el ruido de interferencia o antecedentes) al (a) incrementar la afinidad de enlace o la intensidad de señal del objetivo y la sonda perfectamente igualados; y/o (b) disminuir la afinidad de enlace o intensidad de señal del objetivo y sonda desigualado. Ver, la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2004/0180345. Los inventores ahora divulgan otros diversos parámetros, incluyendo la longitud de la sonda, la concentración' de sonda, la concentración objetivo y la concentración de marca, cuyo ajuste puede lograr efectos benéficos inesperados . Por consiguiente, la invención proporciona un método para analizar el enlace de ácido nucleico, en donde por lo menos uno de los parámetros anteriores se ajusta para el efecto benéfico. Además, los inventores ahora divulgan un método que permite la detección de un polimorfismo de nucleótido en un objetivo genómico, tal como un dsDNA humano, sin amplificación del objetivo. Distinto a cualquiera de otros métodos de los cuales los inventores están concientes , el presente método se puede conducir en menos de sesenta minutos, y de preferencia menos de quince minutos, en una temperatura sin desnaturalización. La invención comprende el uso y/o la formación de complejos dúplex, triplex y/o cuádruplex novedosos de ácidos nucleicos (y/o análogos de los mismos) . Las hebras de ácido nucleico tienen direccionalidad inherente. La sabiduría convencional mantiene que las hebras de direccionalidad opuesta, es decir, que son antiparalelas en su orientación entre sí, forman un dúplex a través del enlace complementario de Watson-Crick de sus bases respectivas. La unión conjunta de la sonda y la secuencia de ácido nucleico objetivo solamente como dos hebras antiparalelas que cumplen con las reglas de emparejamiento de base de Watson-Crick por lo tanto es excluida de ciertas modalidades de la invención. Ciertos duplexos de acuerdo con la invención, por otra parte, comprenden dos hebras de ácido nucleico (y/o análogos de ácido nucleico) hibridados en relación paralela entre sí, en donde el enlace específico es ya sea a través del empare amiento de base homologa o el emparejamiento de base de Watson-Crick. La sabiduría convencional sostiene que tales duplexos no existen, o por lo menos serían extremadamente inestables debido a, por ejemplo, irregularidades de la cadena principal necesitadas por los requerimientos conformacionales de la unión de base paralela. Aun más sorprendente es el descubrimiento de los inventores que bajo condiciones de hibridación apropiadas, la unión homologa, de preferencia promovida es señalizada por Y0Y0-1, demuestra especificidad y estabilidad que rivaliza a aquella del dúplex antiparalelo complementario de Watson-Crick. La invención también comprende duplexos que contienen dos hebras de ácido nucleico (y/o análogos de ácido nucleico) hibridados en relación paralelo entre si, en donde el enlace especifico es a través del emparejamiento de base homologa . Como se utiliza en la presente, los términos "emparejamiento de base de Watson-Crick" , "emparejamiento de base complementaria" y los similares se proponen para definir a la asociación especifica entre pares opuestos o adyacentes de hebras de ácido nucleico y/o análogo de ácido nucleico por la via de bases igualadas (por ejemplo, A:T; G:C y/o A:U). En el contexto de complejos no canónicos descritos en la presente, incluyendo duplexos paralelos, triplexos paralelos y antiparalelos y cuadruplexos paralelos y antiparalelos, los términos similares a "unión de base de Watson-Crick" y "unión de base complementaria" se proponen para denotar la unión entre A y T, A y ü y/o G y C, pero no necesariamente en la conformación plana, de lado, primero descrito por Watson-Crick. Además de la porción de enlace convencional primero propuesta por Watson-Crick (la "porción W-C" y las variantes conformacionales de la misma comprendidas por la definición anterior de la unión de la unión de Watson-Crick, la presente invención comprende complejos formados por la unión de base homologa. En la unión de base homologa, las bases se unen específicamente con bases idénticas antes que bases complementarias. Así, en la "porción homologa" las pares de bases homologas incluyen A: , G:G, C:C, T:T, U:U y T:U. El enlace por las bases de hebras de ácido nucleico es afectado o · condicionado por un número de factores, particularmente el potencial de enlace de las hebras conforme a ya sea la porción de W-C o la porción homologa, y condiciones iónicas (por ejemplo, concentración y/o tipo de sal) . Las condiciones salinas tienden a favorecer la formación de la unión de Watson-Crick sobre la unión homologa. Los cuadruplexos de porción homologa son favorecidos sobre los cuadruplexos de porción W-C bajo condiciones de solución reguladora idéntica. Cada hebra en un complejo de la invención puede comprender cualquier secuencia de nucleobases y/o análogos de nucleobase, siempre y cuando las nucleobases sean relacionadas a las nucleobases a las cuales se enlazan específicamente por ya sea la porción de W-C o la porción homologa. Contrario a ciertas enseñanzas de la técnica previa, el objetivo y la sonda no necesitan ser homopoliméricos para lograr el enlace, aún en el caso de la formación de triplex o cuádruplex. Así, en ciertas modalidades, las nucleobases de sondas se arreglan en una secuencia de sonda heteropolimérica de pu ina interdispersadas y pirimidinas, y las nucleobases objetivas se arreglan en una secuencia objetivo por lo menos parcialmente complementario o parcialmente homologa a la secuencia de sonda. Por ejemplo, la secuencia de sonda puede contener 25% a 75% de bases de purina y 75% a 25% de bases de pirimidina en cualquier orden. Los complejos de la invención pueden formarse de secuencias heteropoliméricas , que, como se definió en la presente, significan secuencias que contienen por lo menos una nucleobase de purina o análogo de purina y por lo menos una nucleobase de pirimidina o análogo de pirimidina en por lo menos su segmentos de hibridación. Tales secuencias heteropoliméricas de preferencia carecen de fragmentos homopoliméricos de largo mayores que 5 bases. Otras nucleobases también son adecuadas para el uso en la invención, tales como, por ejemplo, análogos sintéticos de bases que ocurren naturalmente, que tienen afinidades de enlace de Watson-Crick y/u homologa a otras bases. Además de los duplexos, los complejos de la invención también incluyen triplexos y cuadruplexos, donde hebras heteropoliméricas opuestas son enlazadas por bases complementarias de Watson-Crick o por bases homologas, y la direccionalidad relativa de las secuencias enlazadas es paralela o antiparalela entre si. Una hebra de sonda puede enlazarse específicamente en la hendidura mayor o menor de un objetivo de doble hebra. Además, las bases de una sonda de una sola hebra pueden interactuar específicamente con bases en una o ambas hebras de un objetivo de doble hebra. De manera similar, las bases de cada hebra de una sonda de doble hebra pueden interactuar específicamente con bases en una o ambas hebras de un objetivo de doble hebra en complejos cuádruplex de la invención. Así, en ciertas modalidades de . triplex de la invención, por lo menos una base de la sonda es unida por lo menos una base o par de bases del objetivo mediante la interacción de base complementaria de Watson-Crick y/o mediante la interacción de base homologa, tal que el complejo es un triplex, y en ciertas modalidades cuádruplex de la invención, por lo menos una base de la sonda es unida a por lo menos una base o par de bases del objetivo mediante la interacción de base complementaria de Watson-Crick y/o mediante la interacción de base homologa, tal que el complejo es un cuádruplex. En ciertas modalidades de triplex y cuádruplex, cada nucleobase enlaza a una o dos de otras nucleobases. Asi, además de los pares de base de Watson-Crick dúplex tradicionales y los pares de bases homologas dúplex descritas en lo anterior, tales modalidades incluyen los siguientes tripletes de base de Watson-Crick: A: :A, T : : , U:A:T, T:A:U, A:U:A, U:A:Ü, G:C:G y/o C:G:C (incluyendo C+:G:C, y/o cualquiera de otras especies ionizadas de bases) y/o los siguientes tripletes de bases homólogos: A:A:T, T:T:A, U:U:A, T:U:A, A:A:U, U:T:A, G:G:C y/o C:C:G (incluyendo C:C+:G, y/o cualquiera de otras especies ionizadas de base) . Asi, en ciertas modalidades de cuádruplex en donde la sonda es definida como un dúplex de la primera y la segunda hebra antiparalela asociadas por los empare amientos de base Watson-Crick, y el objetivo es definido como un dúplex similarmente estructurado de una tercera y una cuarta hebra, se cree que las bases de la primera y la tercera hebra también se enlazan entre si, además de: (a) el enlace entre las bases opuestas de la primera y la segunda hebra; (b) el enlace entre las bases opuestas de la tercera y la cuarta hebra; y (c) el enlace entre las bases opuestas de la segunda y la cuarta hebra. En ciertas modalidades de la estructura de triplex y cuádruplex de la invención, ninguna secuencia de enlace de bases está contigua con otras secuencias de enlace de bases. Esto es, hay por lo menos tres hebras separadas. Aunque las conformaciones plegadas y los similares (por ejemplo, vueltas de horquilla, etc.) están dentro del alcance de la invención (particularmente pero no limitado a modalidades de interferencia de RNA, · donde el diseño de horquilla se ha encontrado que es ventajoso para ocasionar la interferencia basada en el enlace de dúplex de Watson-Crick convencional de objetivos de RNA - ver Hemann y colaboradores, "An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo" Nat . Genet . 2003 Mar; 33 (3) : 396-400) , porciones plegadas de una sola hebra no hacen el conteo de hebra más de una vez hacia el mínimo de tres hebras separadas. Los complejos de la invención de preferencia no dependen de la unión de Hoogsteen (incluyendo la unión de Hoogsteen inversa) y/o cuartetos G para el mantenimiento de la estructura compleja, aunque la unión de Hoogsteen (incluyendo la unión de Hoogsteen inversa) y/o cuartetos de G puede estar presente. Esto es, los complejos de la invención de preferencia están sustancialmente libres de la unión de Hoogsteen (incluyendo la unión de Hoogsteen inversa) y sustancialmente libre de cuartetos G. Cada hebra del complejo independientemente comprende un ácido nucleico que tiene una cadena principal de deoxirribosa fosfato o ribosa fosfato (por ejemplo, DNA, RNA, mRNA, hnRNA, rRNA, tRNA o cDNA) o una cadena principal de ácido nucleico o base análoga. Los análogos de ácido nucleico preferidos incluyen una cadena principal no cargada o parcialmente cargada (es decir, una cadena principal que tiene una carga que no está negativa como una cadena principal del DNA nativa) e incluye, por ejemplo, PNA y LNA. Ciertas modalidades están libres de PNA. Para la estabilidad incrementada, las sondas se pueden proporcionar en una forma de fosfotriéster, para inhibir la degradación durante el uso. Distinto a cierbos complejos particularmen e asociados con PNA, los triplexos de la invención no dependen de un mecanismo de invasión de hebra. Por lo menos una porción del complejo es aislada, purificada, artificial o sintética. En modalidades, una porción del complejo es un producto amplificado por PCR. Sin embargo, las modalidades preferidas de la invención están libres de amplificación por PCR y productos del mismo. Los complejos de la invención se pueden presentar en solución, sobre un soporte sólido, in vitro, in vivo o in silico. El soporte sólido puede ser eléctricamente conductor (por ejemplo un electrodo) o no conductor. En ciertas modalidades, el soporte sólido es una película de isla de plata u otro material que toma ventaja de las interacciones de fluoróforo-metal para aumentar la sensibilidad, como es enseñado por Asían y colaboradores, Metal-enhanced fluorescence : an emerging tool in biotechnology" . Current Opinión in Biotechnology 2005, 16:55-62. Además, los complejos pueden ser ópticamente mapeados o secuenciados después de ser alargados, como es enseñado en las patentes norteamericanas Nos. 6,147,198 y 5,720,928 de Schwartz. El enlace especifico entre los ácidos nucleicos ocurre bajo una amplia variedad de condiciones que tienen variaciones en la temperatura, concentración de sal, resistencia a la electrostática, composición de la solución reguladora y concentración molar relativa de los ácidos nucleicos. Ejemplos de estas condiciones y métodos para aplicarlos son conocidos en la técnica. Los inventores han divulgado previamente condiciones particularmente adecuadas para proporcionar los complejos únicos y específicos de estos inventores, en el contexto del análisis de ácido nucleico y de otra manera. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,656,692 y la patente norteamericana No. 6,927,027. Los inventores ahora además elaboran en sus enseñanzas previas considerando tales condiciones . Distinto a muchos complejos de tipo Hoogs Leen, que son inestables o no existentes en niveles de pH arriba de aproximadamente 7.6, los complejos de la invención son estables sobre una amplia gama de niveles de pH, de preferencia de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9.

Como se muestra en los ejemplos descritos enseguida, los inventores han descubierto inesperadamente que la economía del manejo del material objetivo genómico se puede lograr sin el sacrificio proporcionado en la señal de ensayo. Asi, es sorprendentemente posible reducir la cantidad de material objetivo genómico en el ensayo invertido sin causar una disminución proporcionada en la especificidad o sensibilidad del ensayo. En algunos casos, la reducción de la cantidad de material genómico se presenta para incrementar la especificidad y/o sensibilidad del ensayo. De manera similar, bajo las mismas condiciones cantidades reducidas de promotores de hibridación o marcas dan por resultado la emisión de señal aumentada. Sin que se desee que sea relacionado por cualquiera de las teorías, los inventores tienen una explicación posible para este fenómeno. Los inventores creen que hay por lo menos dos restricciones opuestas que dictan el número óptimo de marcas intercaladas en un complejo. La intensidad de florescencia emitida por el complejo se incrementa con el número de marcas intercaladas en el mismo. Sin embargo, el número de marcas por complejo es limitado por el número de sitios disponibles a las marcas, y quizás más importantemente, por la repulsión de carga mutua entre marcas próximas. Así, si se lograra una relación de saturación de marca a complejos (u objetivos), la adición del objetivo adicional del sistema seria esperado que reduzca la relación por debajo del punto de saturación. Cada complejo luego incluirla menos que el número mínimo de marcas, dando por resultado fluorescencia reducida por complejo. La fluorescencia reducida por complejo puede dar por resultado una reducción total en la fluorescencia (cuando el incremento en el número de complejos fluorescentes es sobrepasado por la reducción en la fluorescencia de cada complejo) o un incremento en la fluorescencia menor que el proporcionado al incremento del número de complejos (cuando el incremento en el número de complejos fluorescentes sobrepasan la reducción en la fluorescencia de cada complejo) . Los inventores además creen que el DNA dúplex actúa un poco para proteger la reproducción de carga contra las marcas intercaladas en la epidura menor que el dúplex y aquellas agrupadas cerca de la tercera hebra o la sonda dúplex creando la oportunidad para una concentración de marca hiper-densa en el complejo. Esas marcas luego se creen que interactúan cuando se radian con un modelo de migración de energía de donador : donador debido a su proximidad. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No 6,911,310 para información adicional que considera los sistemas de transferencia de energía de donador-a-donador. Los inventores también han observado que algunas marcas, tal como el intercalador YOYO-1, son capaces de varias intensidades de emisiones, dependiendo de la estructura del complejo en el cual son intercalados. Esto puede ser debido que son apagados por hidratación. Puede ser que la estructura de triple hebra, cuando se forma, proporciona un ambiente deshidratado inventado para las marcas intercaladas sobre las que existen cuando los intercaladores inhabitaron el dúplex antes del procedimiento de la primera hebra que enlaza para formar el triplex. También puede ser que la formación de un triplex estabilizado por marcas intercaladas puede causar colapso del DNA local, que a su vez contribuye a todavía más grande deshidratación de las marcas y todavía emisiones más grandes de esas marcas. El siguiente lenguaje se utiliza en la 'presente basado en el entendimiento anterior de la invención. Una cantidad de saturación de complejo de la marca es una concentración de marca por lo menos suficiente para lograr un máximo en una gráfica de intensidad fluorescente contra la concentración de marca en una concentración de ácido nucleico fijada. Una cantidad de saturación objetivo de sonda es una concentración de sonda por lo menos suficiente para enlazar a todos los objetivos en el medio de hibridación. Este valor teórico se puede ajusfar basado en datos experimentales (por ejemplo, la titulación de la sonda en una mezcla de divulgación de concentración objetivo fijada). En la práctica, el valor teórico no puede ser idéntico al valor empíricamente derivado, debido a factores similares al autoenlace de las sondas, enlace no específico al sustrato, etc. La expresión "cantidades de saturación objetivo" como se utiliza en la presente se refiere a la cantidad empíricamente derivada a menos que se establezca de otra manera. La cantidad de saturación objetivo de la sonda también se puede expresar como una relación de sonda a objetivo. Esta relación es de preferencia de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1012:1. Las concentraciones absolutas de sonda y marca en la mezcla de hibridación generalmente se seleccionan en base a la concentración sospechada de objetivo en la mezcla. El ensayo invertido es extremadamente sensible, obviando de esta manera la necesidad para conducir la amplificación de PCR del objetivo. Por ejemplo, es posible analizar una muestra de prueba que tiene un volumen de aproximadamente 80 microlitros, que contiene aproximadamente 19 yoctomoles de objetivo genómico humano y aproximadamente 3.2 pmoles de sonda. Las modalidades de la invención son bastante sensibles para analizar objetivos genómicos humanos a una concentración de 2.4 x 10-18 M, de preferencia una concentración de no más de 2.4 x 10~19 M. Las modalidades de la invención son bastante sensibles para emplear sondas a una concentración de 4 x 10"7 M, de preferencia a una concentración de no más de 4 x 10~8 M. Esto debe ir sin decir que los valores anteriores no se proponen para sugerir que el método no puede detectar concentraciones más altas o más bajas de objetivo o que la concentración de sonda no puede ser más alta o más baja. En modalidades particularmente preferidas, los objetivos genómicos no amplificados pueden ser detectados en sus concentraciones nativas . El ensayo inventivo es bastante sensible para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) y/o polimorfismos de múltiples nucleótidos en muestras genómicas humanas que pesan 4 ng a 75 pg, que contienen aproximadamente 604 copias a 11 copias (1.3 x 10~17 M a 2.4 x 10~19 M en una mezcla de hibridación de 80 µ?) de la secuencia objetivo de ácido nucleico. Asi, en ciertas modalidades, el ensayo se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 80 µ? se conduce en una muestra genómica que contiene menos de 700 copias de la secuencia de ácido nucleico objetivo, y de preferencia aproximadamente 150 a aproximadamente 300 copias de la secuencia de ácido nucleico objetivo (algunas veces referida después en la presente como "el objetivo") . De manera similar, en una mezcla de reacción de 80 µ? los inventores han detectado una secuencia característica presente en 5 copias de ácido nucleico objetivo de Bacillus globigii . Los objetivos no necesitan ser parcialmente o completamente purificados para lograr tal sensibilidad. En modalidades preferidas, una muestra biológica se obtiene de un organismo o célula, y una muestra genómica se prepara de la muestra mediante lisis o digestión o la remoción de por lo menos una porción de (y mucho más de preferencia sustancialmente todo) el material no de ácido nucleico, tales como histonas y los similares, del DNA. Las fuentes adecuadas de material genómico para el uso en la invención incluyen pero no están limitadas a eucariotes, plantas, animales, vertebrados, peces, mamíferos, humanos, microbios y virus. Opcionalmente , el DNA genómico en la muestra genómica se puede amplificar mediante un método de amplificación de múltiple desplazamiento, de preferencia a aquel divulgado en la patente norteamericana No. 6,617,137 B2 de Dean y colaboradores, en donde se evitan las condiciones de desnaturalización. Mientras que ciertos métodos de ensayo previo requieren que el DNA de la muestra genómica se ha digerido para facilitar el acceso a la(s) secuencia (s) de ácido nucleico objetivo, la presente invención permite la detección directa de la(s) secuencia (s) de ácido nucleico objetivo que constituye una porción infinitesimal del genoma completo sin requerir que el DNA genómico sea segmentado en secuencias más pequeñas. Así, la presente invención puede detectar secuencias de ácido nucleico objetivo cuando la muestra genómica comprende un objetivo genómico que no es fraccionado o es solo parcialmente fraccionado. En ciertas modalidades, la muestra genómica comprende por lo menos 1%, de preferencia por lo menos 10%, más de preferencia 100% de un genoraa completo. En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico objetivo se puede detectar en secuencias genómicas de más de 2 kb de largo, de preferencia más de 5 kb de largo. Por consiguiente, la longitud del" material genómico que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo no es un factor limitativo del ensayo. De preferencia, las secuencia de ácido nucleico objetivo es un material genómico de una sola o doble hebra que tiene una longitud de 8 bp a 3.3 X 109 bp de largo. La longitud de la secuencia de ácido nucleico objetivo de preferencia debe ser suficientemente larga de modo que la secuencia de ácido nucleico objetivo sea única en la muestra (aunque una pluralidad de secuencias no únicas, más cortas dentro de un genoma pueden ser dirigidas para identificar únicamente propiedades del genoma) . La secuencia de ácido nucleico objetivo preferida son de 8 a 200 bases en longitud, más de preferencia 15 a 30 bases en longitud. La secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser material genómico no amplificado, amplificado de material genómico o sintético. La secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser todo o parte del genoma del organismo celular de la cual , se extrajo el material genómico, o puede pertenecer a un patógeno presente (o previamente presente) en el organismo o célula. Asi, la invención no es solamente adecuada para diagnosticar mutaciones genéticas, pero también para detectar ácidos nucleicos de patógenos que infectan un organismo hospedero o célula. El ensayo de la invención también es adecuado para detectar objetivos no genómicos, tal como cDNA, particularmente para los propósitos de clasificar librerías de cDNA. El ensayo puede detectar la presencia de uno o más objetivos utilizando una o más sondas. El uso de una pluralidad de diferentes sondas para detectar una pluralidad de diferentes objetivos es particularmente útil para detectar haplotipos. Los inventores han divulgado previamente que las sondas son de preferencia de 2 a 200 bases de largo, y más de preferencia de 5 a 30 bases de largo, y pueden ser de una sola o de doble hebra. Desde entonces, los inventores han descubierto inesperadamente maneras en las cuales la longitud de la celda se puede ajusfar para incrementar la sensibilidad y especificidad de detección. Por ejemplo, en los sistemas descritos en los ejemplos, las sondas de 25-mer y 30-mer que abarcan las sondas de 15-mer y 20-mer, con sondas de 25-mer algunas veces que proporcionan la sensibilidad y especificidad más grandes cuando se detecta la presencia de un SNP es el objetivo. Por consiguiente, las sondas que forman triplex pueden ser opcionalmente especificas para la detección de SNP cuando son de 25-mer de largo lo cual difiere que las sondas que forman dúplex que son óptimamente especificas para la detección de SNP cuando más cortas antes que más largas. Sin que se desee que sea relacionado con cualquiera de las teorías, los inventores ofrecen una explicación posible para este fenómeno. Asumiendo, por ejemplo, que las marcas son capaces de enlazar con la hendidura menor de un complejo de sonda-objetivo en sitios separados por 11 bases, los inventores esperarían un complejo de sonda-objeti a de 25-mer que tiene 2 marcas de enlace de hendidura menor por complejo, mientras que un complejo de sonda-objetivo de 15-mer sería esperado que tenga solamente una marca de enlace de hendidura menor por complejo. Esto podría explicar porque una sonda de 25-mer se desempeñaría para una sonda de 15-mer. El complejo de sonda-objetivo de 125-mer sería esperado que tenga el mismo número de marcas de enlace de hendidura menor como el complejo de sonda-objetivo de 25-mer (2 marcas), pero la sonda de 30-mer, no sería tan sensible como los polimorfismos de nucleótido, puesto que la intensidad fluorescente está correlacionada con la afinidad de enlace, y una desigualación de bases sería más desestabilizante a un 25-mer que a un 30-mer. Una teoría alternativa asume que las marcas son mutuamente repulsivas en una primera función de las distancias (Fi) y que las marcas son capaces de aumentar la fluorescencia de marcas adyacentes (por ejemplo, por la vía de FRET, transferencia de energía de resonancia fluorescente o por la vía de DDEM, migración de energía de donador : donador) como una segunda función de las distancias (F2) , en donde Fx está inversamente relacionado a F2. Puede haber una concentración o intervalo de concentraciones de marcas cargadas, que permiten la intercalación máxima del complejo de sonda : obj etivo y la emisión similar a FRET máxima o DDEM. Es posible que la adición de la sonda objetivo pueda proporcionar sitios de intercalación adicionales para las marcas, pero el número y la ubicación de tales sitios son restringidos por la repulsión mutua entre las marcas. Así, las sondas por debajo de una cierta longitud (que los inventores esperarán que varían un poco dependiendo de la naturaleza de la sonda, objetivo, marcas y medio ambiente) no pueden proporcionar protección adecuada de las cargas mutuamente repulsivas de las marcas próximas y/o. no podrían proporcionar sitios favorables para la interacción similar a FRET o DDEM entre las marcas en la hendidura menor o intercalada entre las bases del objetivo. Por ejemplo, se asume que las marcas son capaces de intercalarse cada 20 bases por todo el objetivo de doble hebra, y que la distancia entre estas marcas es demasiado grande para soportar la interacción similar a FRET o DDEM. Si la interacción similar a FRET o DDEM ocurre entre tales marcas intercaladas del objetivo y las marcas asociadas con la sonda (por ejemplo, al enlazar en la hendidura menor, la intercalación entre las bases de la sonda y el objetivo, etc. ) , la alineación de las marcas asociadas de la sonda con las marcas asociadas con el objetivo probablemente serian para sondas más largas. Las hebras de sonda de longitud suficiente pueden transmitir un número suficiente de las marcas que entren en tal proximidad estrecha entre si de modo que la transferencia de energía entre las marcas puede aumentar la emisión del complejo de sonda : obj etivo y por consiguiente la detección. Por consiguiente, las sondas de la invención de preferencia son ácidos nucleicos de una sola hebra o análogos de ácido nucleico de 15 a 30 bases en longitud, en donde la discriminación de la señal de las señales antecedentes- es maximizada por la transferencia de energía a la migración de energía entre o además de las marcas intercaladas intraobjetivo y las marcas intercaladas de sonda-objetivo. Más de preferencia, la sonda tiene el objetivo optimizado para transferencia de energía o la migración de energía. De preferencia, la longitud es más grande que 15 bases. Pero aún más de preferencia, la sonda es de 20-30 bases en longitud. Las sondas adecuadas para el uso en el ensayo inventivo incluye, por ejemplo, ssDNA, RNA, ssPNA, LNA, dsDNA, dsRNA, híbridos de D : RNA, dsPNA, híbridos de PNA: DNA y otros ácidos nucleicos de una sola y doble hebra y análogos de ácido nucleico que comprenden cadenas principales de azúcar fosfato y/o péptido no cargadas, parcialmente cargadas por completo o en parte o análogos de base por completo o en parte. En ciertas modalidades, la longitud de la sonda se puede seleccionar para igualar la longitud del objetivo. Las sondas de la invención de preferencia son seguidas de utilizar y estables por años. Por consiguiente, las sondas se pueden hacer u ordenar en grandes cantidades y almacenar. En ciertas modalidades de la invención, las sondas de bloqueo se pueden utilizar además de las sondas propuestas para enlazar la secuencia de ácido nucleico objetivo. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,110,676. La sonda y el objetivo se hibridan en la presencia de un agente de promoción de hibridación (HPA) . Los HPAs son generalmente iones que se han encontrado que mejoran la especificidad y/o presteza con la cual el ensayo se pueda realizar. Los inventores también han encontrado que los HPAs se pueden utilizar para la duración extendida de los ensayos para estabilizar la intensidad de fluorescencia emitida de las muestras de control que contiene la sonda o marca. Los HPAS adecuados incluyen, pero no están limitados a, cationes de (CH3) 4NC1, (CH3) 3N-HC1, NaCl, Na2S04, Na2HP04 y (NH4)2S04. Los HPAs preferidos incluyen las estructuras que hacen estructura de agua (es decir, agentes cosmótropos o cosmotrópicos ) divulgados en la patente norteamericana No. 6,783,932 B2 de Fresco y colaboradores. Los beneficios del uso de uno o más HPAs en una mezcla de reacción y las mejores concentraciones para el uso bajo cualquiera de las condiciones de ensayos adicionales se pueden determinar experimentalmente utilizando la presente descripción como una guia. Las concentraciones preferidas para los HPAs seleccionados incluyen, pero no están limitados a, lo siguiente: NaCl 50 a 80 mM, NaS04 10 a 60 mM, Na2HP04 50 mM, (NH4)2S04 125 a 250 mM, Trimetilamoniocloruro 30 mM (o clorhidrato de trimetilamina) , tetrametilamoniocloruro 35 a 52.-5 mM (TMA-C1) cada uno adicionado por separado o TMA-C1 50 mM en combinación con NaCl 10 a 20 mM. La patente norteamericana No. 6,783,932 B2 de Fresco y colaboradores enseña el uso de concentraciones muco más altas de cosmótropos para estabilizar triplexos basados en secuencias de polipurina . Mientras que tales concentraciones más altas están dentro del alcance de la presente invención, ellas no son requeridas para estabilizar los triplexos y cuadruplexos heteropoliméricos específicos de la presente invención. En ciertas modalidades, el HPA también es una marca fluorescente. En tales modalidades, el uso de una marca no de HPA o marcas de HPA adicionales es opcional. Los HPAs adicionales a la marca de HPA también son opcionales. El HPA-marca es de preferencia una marca de intercalación, más de preferencia un tinte de cianina dimérico y aun más de preferencia YOYO-l. Las marcas de la invención (si funcionan solamente como marcadores, solamente como HPAs, o como HPAs y marcadores) de preferencia son fluoróforos de intercalación. Las marcas preferidas son miembros seleccionados del grupo que consiste de YOYO-l, TOTO-1, YOYO-3, TOTO-3, POPO-1, BOBO-1, POPO-3, BOBO-3, LOLO-1, ¦ JOJO-1, dimeros de cianina, YO-PRO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-3, TO-PRO-3, TO-PRO-5, PO-PRO-1, BO-PRO-1, PO-PRO-3, BO-PRO-3, LO-PRO-1, JO-PRO-1, monómeros de cianina, bromuro de etidio, homo-dimero-1 de etidio, ho-dimero-2 de etidio, derivados de etidio, acridina, naranja de acridina, derivados de acridina, heterodimeros de etidio-acridina, monoazida de etidio, yoduro de propidio, tintes SYTO, Verde 1 SYBR, tintes SYBR, Pico Green, tintes SYTOX y 7-aminoactinomicina D. Mucho más de preferencia, las marcas son tintes de cianina u homo- o heterodimeros de tintes de cianina que proporcionan fluorescencia aumentada cuando se asocian con ácidos nucleicos, tales como aquellas descritas en las patentes norteamericanas Nos. 4,883,867 (Lee), 5,582,977 (Yue y colaboradores), 5,321,130 (Yue y colaboradores) y 5,410,030 (Yue y colaboradores), incluyendo las manchas de ácido nucleico comercialmente disponibles bajo las marcas TOTO, BOBO, POPO, YOYO, TO-PRO, BO-PRO, PO-PRO y YO-PRO de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. De estos, YOYO-1 (algunas veces referido en la presente como "YOYO") es el más preferido. Las marcas no de intercalación también son adecuadas para el uso en la invención. Ejemplos preferidos de tales marcas incluyen biotina, rodamina, fluoresceina y otras marcas o pares de marcas que por fluorescencia o la ausencia de la señal de fluorescencia ya sea que son enlazadas en un complejo de sonda/objetivo cuando se irradian con energía excitante . La invención además comprende el uso de marcas que emiten señales no fluorescentes. Tales marcas incluyen agentes luminiscentes, partículas detectables de luz dispersada (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,214,560 de Yguerabide y colaboradores), marcas magnéticas (ver, por ejemplo Chemla y colaboradores "Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay" . Proc Nati. Acad. Sci. U.S.A. vol . 97, 14268-14272 (2000)., etc. En ciertas modalidades, las marcas son aquellas divulgadas en la patente norteamericana No. 5,939,256 de Yamamoto y colaboradores, que causa un cambio detectable mediante la reacción o interacción con el complejo mismo, o que son mutuamente interactivas en la presencia de una estructura helicoidal múltiples, para de esta manera causar un cambio detectable. En ciertas modalidades, las marcas son conjuntos de redox (por ejemplo, pares de redox) de sondas de dos partes, como es divulgado en la patente norteamericana No. 6,361,942 Bl de Coull y colaboradores. En ciertas modalidades, las marcas son puntos de quantum. También está dentro del alcance de la invención utilizar marcas adaptadas para los métodos de anisotropia de fluorescencia de detección, tal como es divulgado por la patente norteamericana No. 5,593,867 de alker y colaboradores . En ciertas modalidades, no se requieren marcas. Por ejemplo, la hibridación se puede detectar al extender el complejo de hibridación a través de un nanoporo, al aplicar un campo eléctrico, y al monitorear el nanoporo para cambios de corriente, como es divulgado en la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2003/0099951 Al de Akeson y colaboradores . También es posible detectar diferencias entre los perfiles de fusión de complejos similares para determinar si los complejos son idénticos. Ver, por ejemplo la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2003/0157507 Al de Lipsky y colaboradores. En tales modalidades, enlazadores de hendidura menor también se pueden utilizar para nivelar las temperaturas de fusión de las sondas, de modo que ellas exhiben afinidades de enlace comparables para los objetivos y perfiles de desnaturalización comparables para los ensayos de desnaturalización. Ver la patente norteamericana No. 6,683,173 B2 de Dempcy y colaboradores. La marca, sonda, objetivo y HPA se combinan para proporcionar la mezcla de hibridación, junto con cualquiera de los componentes adicionales, tales como agua, por lo menos una solución reguladora, etc. El orden de la adición de los componentes a la mezcla de divulgación no necesita ser critico, pero información significante acerca del objetivo se puede obtener si el orden de adición a la mezcla de reacción es variado y las emisiones de marca monitoreadas y comparadas. Por ejemplo, el HPA (y/o HPA-marca) se puede adicionar a una solución que ya contiene al múltiplex a ser estabilizado o se puede adicionar junto con una o más hebras. Además, los componentes de la mezcla de hibridación pueden estar en la forma de compuestos discretos o compuestos de los componentes individuales. Ejemplos de tales compuestos incluyen, por ejemplo, HPA, HPA-marca y/o marca covalentemente enlazada a o intercalada con la sonda y/o el objetivo. En ciertas modalidades, el compuesto puede ser un "conjugado de oligonucleótido-apagador-fluorescente-tinte" del tipo divulgado en la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2004/0081959 A9 de Reed y colaboradores. Tales modalidades además pueden comprender los enlazadores de hendidura menor (MGs) de Reed y colaboradores. Los MGBs de Redd y colaboradores también son adecuados para la adición como componentes discretos que la mezcla de hibridación, y se espera que faciliten la formación de múltiples sin incrementar el ruido al precedente de la fluorescencia no especifica. Ver también la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2004/0058322 Al de Hegpeth y colaboradores . El orden de adición de los componentes de la mezcla de hibridación puede ser significante en ciertas modalidades. Sin embargo, los inventores no han encontrado que el orden de adición necesita ser tan significante como para volver el método operable bajo cualquier orden especifico de adición. Más bien, los inventores se han encontrado que la alteración del orden de adición puede identificar un orden preferido de adición, que da por resultado resultados mejorados con relación a órdenes menos preferidos de adición. Por ejemplo, Los inventores han descubierto inesperadamente que la adición de la secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, contenida en la muestra genómica) de la mezcla de hibridación puede dar por resultado especificidad y sensibilidad aumentadas. Esto es particularmente sorprendente considerando que la adición de la marca a la mezcla de hibridación al último es más preferida para algunas otras modalidades. El orden de adición también puede ser significante cuando algunos o todos los componentes son eléctricamente pretratados de acuerdo con las enseñanzas de la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2003/0170659 previa de los inventores. Por ejemplo, una solución regulada podría ser eléctricamente pretratada antes de la combinación de la sonda con otros componentes para formar la mezcla de hibridación. El pret atamiento eléctrico puede aumentar la sensibilidad y/o especificidad del ensayo. La mezcla de hibridación puede ser incubada durante un período de tiempo para permitir que ocurra la hibridación. La incubación se conduce durante un período de tiempo de menos de 60 minutos, de preferencia menos de 15 minutos, más de preferencia no más de 10 minutos, aun más de preferencia aproximadamente 5 minutos o menos, mucho más de preferencia 1 minuto o menos. La incubación de preferencia se conduce a una temperatura de no desnaturalización, y más de preferencia se conduce a temperatura ( s ) dentro del intervalo de 20 a 40°C. Como se utiliza en la presente, el término "temperatura de no desnaturalización" se refiere a una temperatura insuficiente para desnaturalizar la secuencia de ácido nucleico objetivo de doble hebra, y explícitamente comprende temperaturas por lo menos tan altas como 40°C. Las temperaturas suficientes para desnaturalizar el objetivo no son preferidas ya que ellas adicionan costo, retardan y dan complejidad innecesaria al método.

La mezcla de hibridación se irradia con luz coherente de preferencia en o cerca de la longitud de onda de excitación máxima de la marca después de la incubación y luego se monitorea para la fluorescencia si la mezcla de hibridación contiene un fluoróforo. Para YOYO (es decir, Y0Y0-1) , una longitud de onda de excitación de 488 nm es preferida. Se ha descubierto que la densidad de potencia de la luz que irradia la muestra de prueba es importante, y de preferencia puede ser ajustada para suministrar aproximadamente 84 /cm2/seg de radiación cuando la marca es YOYO-1. Indebidamente densidades de potencia altas, si son suministradas de láseres o fuentes de luz brillante, no solamente puede anular el ensayo, sino también dañar los reactivos tal que la muestra de prueba no puede ser subsecuentemente analizada utilizando la radiación apropiadamente accionada. Esto es asi debido a que YOYO-1 puede actuar como un agente de fotosegmentación si se estimula adecuadamente. Los láseres son la fuente de radiación más preferidos. Los instrumentos accionados por fuentes de "luz brillante", tales como bulbos de Xenón, que general luz brillante pulsada o continua, aun si subsecuentemente se filtran, son menos adecuados para llevar a cabo el ensayo utilizando YOYO-1 y generalmente generan resultados no inteligibles. La "luz brillante" filtrada no es equivalente a la estimulación de láser. Fotodiodos de potencia de watt muy bajas, tal como aquel presente en un instrumento Turner Design "TD" Picofluor, accionados por baterías de 4 AAA, se puede utilizar para llevar a cabo en ensayo para medir las emisiones fluorescentes de Y0Y0-1. Una o más fuentes de luz diferentes se pueden emplear para irradiar las marcas. La irradiación de las marcas con una pluralidad de haces de luz de diferentes longitudes de onda es particularmente útil donde se emplean marcas que tienen diferentes características de excitación. Por ejemplo, la luz láser de 488 nm se puede aplicar para excitar las marcas de Y0Y0-1 dirigidas a la detección de secuencia objetivo mientras que la luz de láser de otra longitud de onda es aplicada para excitar otras marcas presentes . En una modalidad alternativa, la especificidad del ensayo se puede mejorar al digerir cualquier dúplex en el medio de hibridación que de otra manera podría generar una señal no específica. El objetivo dúplex en el triplex se protege de la digestión, como es enseñado por la patente norteamericana No. 6,458,540 Bl de Ramberg. Tolun y colaboradores, "A real time DNase assay (ReDA) based on PicoGreen fluorescence" Nucleic Acids Res. 2003 Sep 15; 31(18) :elll muestra que los intercaladores en el dúplex no necesitan detener la digestión, mientras que la intercalación y la estabilización del DNA de triplex puede hacerlo.

En ciertas modalidades de la invención, una etapa de separación se conduce antes de la detección de la señal emitida del medio de hibridación. Esta etapa separa las sondas no enlazadas de los complejos de sonda-objetivo. De preferencia, la etapa de separación comprende el uso de un soporte sólido policatiónico como es enseñado en la patente norteamericana No. 5,599,667. La mezcla de hibridación puede ser monitoreada una o más veces para la emisión de marca después de que es irradiada una o más veces. La señal medida es de preferencia la intensidad fluorescente emitida de la mezcla de hibridación. En tales modalidades, la actividad del enlace entre la sonda . obj etivo se puede correlacionar directamente o inversamente con la intensidad, dependiendo de si la hibridación de las señales de marca a través del apagamiento de la señal o la emisión de señal. Asi, la intensidad fluorescente generada al intercalar agentes está directamente correlacionada con la afinidad de enlace de sonda-objetivo, mientras que la intensidad fluorescente de las modalidades que emplean fluoróforos no de intercalación covalentemente enlazado a la sonda puede ser inversamente correlacionada con la afinidad de enlace de sonda-objetivo. En ciertas modalidades, la intensidad fluorescente se incrementa (o disminuye para los no intercaladores junto con el grado de igualaciones entre la sonda y el objetivo, de preferencia sobre un intervalo inclusivo de 0-2 desigualaciones y/o supresiones, más de preferencia sobre un intervalo inclusivo de 0-2 desigualaciones y/o supresiones. Las modalidades de la invención comprenden calibrar la señal medida contra las señales de referencia para determinar si la sonda es una igualación perfecta para la secuencia de ácido nucleico objetivo. Una curva de calibración puede ser generada, en donde la magnitud de la señal medida (por ejemplo, intensidad fluorescente) es una función de la afinidad de enlace entre la secuencia de ácido nucleico objetivo y la sonda. Como la afinidad de enlace entre la secuencia de ácido nucleico objetivo y la sonda varia con el número de bases desigualadas, la naturaleza de la desigualación (es) (A-G contra A-C contra T-G contra T-C, etc.), la localización de la (s) desigualación (es) dentro del complejo de hibridación, etc., el método de la invención se puede utilizar para detectar si la sonda y la secuencia de ácido nucleico objetiva son una igualación perfecta o una desigualación y finalmente para secuenciar la secuencia de ácido nucleico objetivo. La señal emitida puede ser recolectada serialmente y evaluada como una función del tiempo asi como instantáneamente. Por ejemplo, un cambio en la señal fluorescente con respecto al tiempo puede ser monitoreado para mejor determinar si la sonda perfectamente igual a la secuencia de ácido nucleico objetiva en una mezcla de hibridación que contiene una marca de intercalación, en donde un incremento en la señal fluorescente con respecto al tiempo ("incremento") indica una igualación perfecta y una disminución en la señal fluorescente con respecto al tiempo ( "menguamiento" ) indica una falta de una igualación perfecta. De manera similar, las señales de incremento y de menguamiento generado por una mezcla de hibridación que contiene una marca de no intercalación puede indicar una igualación imperfecta a una igualación perfecta, respectivamente. Aunque bajo algunas circunstancias la intensidad de señal de una mezcla carece de una igualación perfecta no disminuye a través del tiempo, todavía es posible distinguir entre las igualaciones perfectas y las desigualaciones donde la señal emitida por la mezcla de desigualación cambia en una proporción menor que aquella de la mezcla de igualación, o la señal emitida por la mezcla de desigualación muestra evidencia de cambios discontinuos y regresiones . La invención comprende el uso de uno o más de la medición de señal anteriores y los protocolos de análisis de datos. El uso de más de uno de los protocolos puede aumentar la conflabilidad del ensayo. Otros parámetros del ensayo (por ejemplo, el orden de adición de la. mezcla, de hibridación, longitud de la sonda, etc.) también puede ser variado para verificar la consistencia a través de múltiples protocolos, para aumentar la conflabilidad del ensayo. La detección de la señal fluorescente de preferencia es completada dentro de 60 minutos de la provisión de la mezcla de hibridación, más de preferencia menos de 15 minutos, aun más de preferencia aproximadamente 10 minutos, todavía más de preferencia dentro de aproximadamente 5 minutos. El método completo de preferencia se conduce en menos de 60 minutos, más de preferencia menos de 15 minutos, todavía más de preferencia menos de 10 minutos, aun más de preferencia de aproximadamente 5 minutos o menos, en una temperatura de no desnaturalización. La conflabilidad de la invención es independiente del contenido de guanina y citosina en cualquiera de la sonda o el objetivo. En la porción de W-C tradicional, puesto que los pares de bases G:C forman tres enlaces de hidrógeno, mientras que los pares de bases ?:? forman solamente dos enlaces de hidrógeno, las secuencias objetivo de sonda con un contenido de G o C más altos son más estables, presentando temperaturas de fusión más altas. Consecuentemente, las desigualaciones de pares de bases que incrementan el contenido de GC de la sonda hibridada y la región objetivo arriba de aquella presente en los híbridos perfectamente igualados puede desalinear la debilidad de enlace asociado con una sonda desigualada.

El método de la invención es útil para detectar mutaciones genéticas, incluyendo SNPs con una combinación sin precedente de velocidad y conflabilidad . Las repeticiones de secuencia de ácido nucleico, inserciones y supresiones también pueden ser detectadas. El método también es útil para detectar un estado morfológico de un organismo o célula de la cual se obtiene una muestra genómica. El estado morfológico de preferencia comprende información que considera: (a) una etapa de desarrollo; (b) estructura de orden más alto; (c) eventos de enlace y/o (d) un estado de enfermedad. El método se puede- conducir dentro de una célula biológica . La invención comprende además de los métodos, anteriores un equipo para practicar esos métodos. El equipo de preferencia comprende: medios de recolección de muestra para recolectar la muestra genómica; la sonda; el agente de promoción de hibridación y las marcas . Los medios de recolección de muestra adecuados incluyen pero no están limitados a jeringas, vasos, frasquitos, esponjas, torundas, adherentes, tubos capilares, hojas absorbentes, membrana, película, microcavidad, columna, cuentas, chips, etc. De preferencia, los medios de recolección de muestra se adaptan para recolectar tejido, células bucales, sangre, fluido, esputo, orina y/o heces. En ciertas modalidades, una etiqueta de identificación molecular se adiciona a la muestra para proporcionar un equipo y método para marcar una muestra biológica para propósitos de rastrear su historia y proporcionar un camino auditivo definitivo. La etiqueta es por lo menos una molécula capaz de la detección. De preferencia, la etiqueta es una secuencia de ácido nucleico análogo de ácido nucleico que se ha funcionalizado con por lo menos una marca detectable (de preferencia marcas de giro o puntos de quantum) y opcionalmente con por lo menos un agente de reticulación. Los medios de recolección de muestra utilizados en el método y el equipo de preferencia incluirán la etiqueta (por ejemplo, reticulado de una superficie de soporte) y tiene un código de barras u otros medios para identificar qué etiqueta es únicamente asociada con la muestra. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,153,389, que describe las etiquetas de identificación para los ensayos basados en PCR. En ciertas modalidades, la sonda se proporciona sobre un soporte seleccionado del grupo que consiste de una cuenta, una placa, una membrana, una película, una microcavidad, un electrodo, una columna o un tubo capilar. La sonda, las marcas y HPAs del equipo son esencialmente los mismos como para el método. La invención se ilustra en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos, pero se debe entender que la presente invención no se considera que sea limitada a los mismos. EJEMPLOS Ejemplo 1 En este Ejemplo, los inventores comparan las señales de ensayo triplex emitidas cuando sondas de oligonucleótido de una sola hebra de 15-mer o 25-mer se utilizan para analizar objetivos de amplicón dúplex. El dsDNA genómico se extrajo de una muestra de sangre humana utilizando un equipo de purificación de sangre QIAamp DNA (QIAGEN, Mississauga, Canadá) según las instrucciones del fabricante, ün fragmento de dsDNA de 491 bp (SEQ ID N0:1), correspondiente a una región clínicamente significante del exón 10 del gen de fibrosis cística [Genomics 1_0, 214-228 (1991) ] , se amplificó por PCR. Un cebador superior de 20-mer y un cebador inferior de 20-mer se sintetizaron en un sintetizador de DNA (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems) , se purificaron en cartucho y se disolvieron en ddFbO. La secuencia para el cebador superior de 20-mer: 5'-GCA GAG TAC CTG AAA CAG GA-3' (SEQ ID NO:2). La secuencia para el cebador inferior de 20-mer: 5'-CAT TCA CAG TAG CTT ACC CA-3' (SEQ ID NO: 3) . 100 pmol de cada cebador se mezcló con 1 g de dsDNA genómico en una mezcla de reacción de PCR de 100 µ? utilizando un equipo Taq PCR Master Mix (QIAGEN, Mississauga, Canadá) . Los siguientes parámetros del ciclo de PCR se utilizaron: 1 ciclo de 94°C x 5 min, 25 ciclos de (93°C x 30 seg, ' 48°C x 30 seg; 72°C x 45 seg), 1 ciclo de 72°C x 7 min. El tamaño del fragmento de PCR se confirmó mediante la electroforesis en gel . No se realizó purificación de la muestra para remover cantidades pequeñísimas de cebadores residuales o DNA genómico. La concentración del objetivo de dsDNA de 491 bp amplificado por PCR, con los cebadores residuales y el DNA genómico, se determinó mediante la espectroscopia de UV y se preparó una solución de extracto de 1 pmol/ µ?. Las secuencias de sonda de ssDNA de 15-mer o 25-mer antisentido, derivadas del exón 10 del gen de fibrosis cística humana se sintetizaron en un sintetizador de DNA (Expedite 8909, PerSeptive Biosystem) se purificaron en el cartucho y se disolvieron en ddH?0 a una concentración de 1 pmol/µ? . La sonda CF01-15 (SEQ ID NO: 4) fue una sonda de ssDNA de 15-mer diseñada para ser completamente complementaria a un segmento de 15 nucleótidos de la hebra de sentido del objetivo dsDNA de 491 bp amplificado por PCR de tipo silvestre (SEQ ID NO:l), sobreposición de posiciones de aminoácido 505 a 510 [Genomics 10, 214-228 (1991)]. La secuencia para la sonda CF01-15 (SEQ ID NO: 4) fue: 5'-CAC CAA AGA TGA TAT-3 ' . Las sondas CF10-15 y CF09-15 fueron sondas de ssDNA mutantes de 15-mer idénticas en secuencia a la sonda de tipo silvestre CF01-15, excepto para una mutación de una base (subrayada) . La secuencia para la sonda CF10-15 (SEQ ID NO: 5) fue: 5'-CAC CAA AGA CGA TAT-3 ' . La secuencia para la sonda CF09-15 (SEQ ID NO: 6) fue: 5'-CAC CAC AGA TGA TAT-3 ' . La sonda CF01-25 (SEQ ID NO: 7) fue una sonda de ssDNA de 25-mer diseñada para ser completamente complementaria a un segmento -de 25 nucleótidos desde la hebra de sentido del objetivo de dsDNA de 491 bp amplificado por PCR de tipo silvestre (SEQ ID NO:l), sobreposicion de posiciones de aminoácidos de 504 a 512 [Genomics 1_0, 214-228 (1991) ] . La secuencia para la sonda CF01-25 (SEQ ID NO: 7) fue: 5'-TAG GAA ACA CCA AAG ATG ATA TTT T-3' - Las sondas CF10-25 y CF09-25 fueron sondas ssDNA mutantes de 25-mer idénticas en la secuencia a la sonda de tipo silvestre CF01-25, excepto para una mutación de una base (subrayada) . La secuencia para la sonda CF10-25 (SEQ ID NO: 8) fue: 5'-TAG GAA ACA CCA AAG ACG ATA TTT T-3' . La secuencia para la sonda CF09-25 (SEQ ID NO: 9) fue: 5'-TAG GAA ACA CCA CAG ATG ATA TTT T-3' . Los ensayos de triplex, señalizados por intercaladores fluorescentes tal como Y0Y0-1, se han realizado con radiación de estimulación de varios láseres, incluyendo un láser de ion de argón Melles Griot 50 mW, Modelo 532-AP, un Láser de ion argón 25 mW Ion Láser Technology, Modelo 5490 ACM-00, un láser de estado sólido Coherente de 20 mW, Modelo Sapphire 488-20 OEM, un Analizador Genexus que contiene un láser de ion argón Melles Griot 15 mW, Modelo 35-IMA-415-120 y un Analizador Genexus que contiene un láser de estado sólido Coherente 20 mW, Modelo 'Sapphire 488-20 OEM. Todos de estos láseres se configuraron para suministrar radiación entre 80-84 /cm2/seg en una longitud de onda de 488 nm. La mezcla de reacción (80 µ? ) contuvo lo siguiente: 0.05 pmoles de objetivo de dsDNA de 491 bp amplificado por PCR, 1.25 pmoles de sonda de ssDNA de 15-mer o 25 mer, 0.5 x TBE y 150 nM del intercalador de DNA YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA) . Las mezclas de reacción referidas en éste y todos los otros ejemplos fueron volúmenes finales de 80 µ? y se incubaron a temperatura ambiente (RT) , a menos que se indique de otra manera. Después de una incubación de 5 minutos a RT (24 °C) las mezclas de reacción se colocaron en placas de 384 cavidades Corning No Bind Surface (fondo negro con claro) y se irradiaron con el láser de ion argón de 15 mW Genexus Analyser que tiene una longitud de onda de 488 nm. 10 mW de la luz láser irradia las muestras desde el fondo de cada cavidad. La radiación ocurrió en un intervalo de muestreo de 60 mieras en ajuste de 20 hertz, 32% PMT y sensibilidad 10 µ?/V. Las emisiones fluorescentes se monitorearon y nuevamente en la irradiación después de 10 minutos adicionales de incubación. ¦ Este Genexus Analyser se utilizó en todos los ejemplos acompañantes, a menos que se indique de otra manera. Las sondas de ssDNA, cuando se incubaron con YOYO-1 como un control, produjeron un nivel relativamente alto de fluorescencia como es comparado a aquel del control objetivo de dsDNA incubado con YOYO-1. En cada control la misma cantidad de YOYO-1 estuvo presente como en la mezcla de reacción relacionada. Alto nivel de fluorescencia del control de sonda de ssDNA fue un resultado de la formación de los complejos estabilizados y señalizados por YOYO-1. El control de sonda de 25-mer produjo un nivel mucho más alto de fluorescencia que el del control de sonda de 15-mer (Tabla 1) - Triplexos de DNA perfectamente igualados que consisten de dsDNA de 491 bp (SEQ ID NO:l) y la sonda CF01-15 de 15-mer, se formaron en la presencia de 150 nM YOYO-1 (muestra 4), produjeron emisiones fluorescentes muy intensas después de tanto 5 minutos como 15 minutos de incubación (Tabla 1) . La emisión de un triplex de 15-mer de dsDNA: ssDNA es igualado a A-C bp (491 bp dsDNA + sonda CF10-15) (muestra 6) fue 96.2% y 95.4% menor que después de una incubación de 5 min y 15 min respectivamente, que del triplex de 15-mer perfectamente igualado (muestra 4), cuando se normalizó para variaciones en las emisiones de control de sonda de ssDNA. La emisión de un triplex de 15-mer dsDNA:ssDNA desigualado de T-C de un bp (dsDNA de 491 bp + sondas CF09-15) (muestra 8) fue 98.2% y 98.8% menor después de una incubación de 5 min y 15 min respectivamente, que del triplex de 15-mer perfectamente igualado (muestra 4) cuando se normalizó para variaciones en emisiones de control de sonda ssDNA. Los triplexos de 25-mer de DNA perfectamente igualados consisten de dsDNA de 490 bp (SEQ ID NO:l) y la sonda CF01-25, formados en la presencia de 150 n YOYO-1 (muestra 10), produjeron emisiones fluorescentes intensas después de 5 min y después de 15 min de incubación (Tabla 1) . La formación en complejo del objetivo dsDNA con las sondas de ssDNA de 25-mer igualadas dio por resultado una emisión grandemente montada como es comparada a aquella que surge del enlace del objetivo dsDNA a las sondas ssDNA de 15-mer igualadas. Por consiguiente, el uso de las sondas de 25 mer dio por resultado un ensayo de triplex más sensitivo del objetivo de dúplex que el uso de la sondas es de 15-mer. La sonda incompletamente complementaria y los complejos objetivos, que contienen una desigualación de A-C de 1 bp (dsDNA 491 bp + sonda CF10-25) (muestra 12) o una desigualación de T-C de 1 bp (dsDNA de 491bp + sonda CF09-25) (muestra 14) produjo intensidades de emisión que fue de 98.0% o 100% menores, respectivamente después de 5 min de incubación y 98.5% o 100% menor, respectivamente después de 15 min de incubación, que aquellas observadas con los triplexos de 25-mer perfectamente igualadas (muestra G0) , cuando se normalizó para variaciones en emisiones de control de sondas de ssDNA (Tabla 1) . Estos datos soportan la conclusión sorprendente que las sondas de 25-mer pueden ser más especificas que las sondas de 15-mer y la detección de SNPs en objetivos dúplex. Es. notable, inesperado y altamente útil que una desigualación de 1 bp en un triplex de 25 bases puede ser más desestabilizante que una desigualación de 1 bp en un triplex de 15 bases. Para delinear adicionalmente este hecho intuitivo contrario, los inventores compararon triplexos perfectamente igualado formados con el objetivo dúplex y sondas de oligo de 15, 20, 25, 27, 30 o 35 mer bajo condiciones descritas en lo anterior. Los inventores empíricamente determinaron sondas de 25-mer que son las más especificas bajo las condiciones de la reacción. Las sondas de formación de triplex más largas pueden por consiguiente ser más especificas que las sondas de formación de triplex más cortas. Puede ocurrir que un triplex desigualado, formado cuando una sonda de 25-mer se hace complejo con un objetivo dúplex en la presencia de YOYO-1, produce emisión que es menor que la emisión de control de sonda (comparar las muestras 13 y 14) (Tabla 1) . Este resultado puede ocurrir debido a que, mientras que YOYO-1 puede facilitar la autoasociación de' las sondas que dan origen a una emisión en la radiación, tal autoasociación del complejo con YOYO-1 se presenta que se dispersa en la introducción del objetivo dúplex sin una ganancia de desajuste bastante grande en la florescencia de la intercalación de YOYO-1 en la hendidura menor del objetivo dúplex y en nuevas hendiduras creadas por cualquier triplex desigualado formado. Las emisiones de ensayo de los triplexos desigualados, que son menores que las emisiones de la emisión de control de sonda relevante proporciona una característica muy deseable de un ensayo SNP homogéneo en solución. En este caso, el método da por resultado una señal de ensayo binaria para SNP presentes en objetivos de dsDNA genómicos. Ejemplo 2 Este Ejemplo compara las señales de ensayo cuádruplex emitidas cuando sondas de dsDNA ya sea de 15-mer o 25-mer se han preincubado con YOYO-1 e'n varias temperaturas antes de la adición a la mezcla de reacción. Las sondas dúplex se crearon fuera de las secuencias de 15-mer o 25-mer de sentido y antisentido complementarias, derivadas del exón 10 del gen de fibrosis cística humana, que se sintetizaron en un sintetizador DNA, se purificaron en cartucho y luego se disolvieron en ddFÍ20 a una concentración de 1 pmol/µ?. Cantidades equimolares -de oligonucleótido complementarios se calentaron a 95°C' durante 10 min y se dejaron recocer gradualmente en la presencia de Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM y NaCl 100 mM, conforme la temperatura se enfrió a 21 °C durante 1.5 horas. Los oligos de DsDNA se diluyeron en ddH20 a una concentración de 1 pmol/µ?. La sonda Ds CFOl-15 (SEQ ID NO: 10) comprendió una sonda de dsDNA de 15-mer diseñada para ser homologa a un segmento de 15 nucleótidos del objetivo de dsDNA de 491 bp amplificado por PCR de tipo silvestre (SEQ ID NO:l), sobreposición de las posiciones de aminoácidos 505 a 510 [Genomics 10, 214-228 (1991)]. La secuencia paralela de sentido de la sonda ds CFOl-15 (SEQ ID NO:10) fue; 5'-ATA TCA TCT TTG GTG-3'. La sonda ds CF10-15 y sonda ds CF09-15 comprendió sondas de DNA mutante de 15-mer idénticas en secuencia a la sonda ds CFOl-15 de tipo silvestre, excepto para una mutación de una bp (subrayado) . La secuencia para la hebra de sentido de la sonda ds CF10-15 (SEQ ID NO:ll) fue: 5'ATA TCG TCT TTG GTG-3'. La secuencia para la hebra de sentido de la sonda ds CF09-15 (SEQ ID NO:12) fue: 5'-ATA TCA TCT GTG GTG-3'. La sonda ds CF01-25 (SEQ ID NO: 13) fue una sonda de dsDNA de 25-mer diseñada para ser homologa a un segmento de 25 nucleótidos del objetivo en dsDNA de 491 bp amplificado por el PCR de tipo silvestre .(SEQ ID NO : 1 ) , sobreposición de las posiciones de aminoácido 504 a 512 [Genomics 1_0, 214-228 (1991)]. La secuencia para la hebra de sentido de la sonda ds CF01-25 (SEQ ID NO: 13 fue: 5'-AAA ATA TCA TCT TTG GTG TTT CCT A-3' . La sonda ds CF10-25 y sonda ds CF09-25 fueron sondas de dsDNA mutantes de 25-mer idénticas en la secuencia a la sonda ds CF01-25 de tipo silvestre, excepto por una mutación de una bp (subrayado) . La secuencia para la hebra de sentido de la sonda ds CF09-25 (SEQ ID NO: 15) fue: 5'-AAA ATA TCG TCT TTG GTG TTT CCT A-3' . La secuencia para la hebra de sentido de la sonda ds CF09-25 (SEQ ID NO: 15) fue: 5'-AAA ATA TCA TCT GTG GTG TTT CCT A-3' . Los inventores han divulgado previamente en, por ejemplo la patente norteamericana No. 5,656,692 y la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2003/0113716, que la sonda dúplex, que son homologas a objetivos dúplex, se enlazaran específicamente y detectablemente a tales objetivos dúplex. Las sondas dúplex y los objetivos dúplex también pueden enlazar específicamente y detectablemente si existe correspondencia de Watson-Crick entre las bases próximas en complejo. Tal enlace "complementario empalmado" puede evitar que ocurra menos ávidamente que el enlace de cuádruplex homólogo sin embargo. 1.25 pmoles de la sonda de dsDNA de tipo silvestre o mutante se preincubaron en 0.5 x TBE con solución reguladora con 30 n de YOYO-1 ya sea en RT (24°C) o en 30°C (sobre una placa caliente) durante 1 hora hasta que la adición de 0.05 pmoles del objetivo en dsDNA 491 bp amplificado por PCR (SEQ ID NO:l) y 70 nM de YOYO-1. Las mezclas de reacción de 80 µ? luego se incubaron ya sea en RT o en 30 °C durante 5 minutos, se colocaron en una probeta de cuarzo, se irradiaron con un láser en estado sólido coherente que tiene longitud de onda 488 nm y se monitorea ron inmediatamente para la emisión fluorescente. El periodo de irradiación de láser fue de 70 mseq y suministraron radiación de 80 W/cm2. La luz emitida fue recolectada por Ocean Optics CCD y documentada por Ocean Optics software. La pre incubación de los controles de sonda de ds DNA con 30 nM YOYO-1 para 1 hora a 30 °C, grandemente redujo la intensidad de emisión de cada control de sonda de dsDNA. Cuando la sonda preincubada como es descrito se adicionó a las mezclas de reacción, las intensidades de emisión más altas se produjeron mediante los cuadruplexos de dsDNA: dsDNA que consisten de duplexos homólogos paralelos perfectamente igualados (dsDNA de 491 bp + sonda ds CF01-15 y dsDNA de 491 bp + sonda ds CF01-25) . Adicionalmente, la incubación de la mezcla de reacción a 30 °C da por resultado emisiones aumentadas de las muestras que contienen duadrúplexos homólogos de 15-mer o 25 mer igualados, que el de los mismos complejos incubados en R . Las ganancias de emisi-ón del cuádruplex homólogo perfectamente igualado fueron más evidentes cuando las sondas de dsDNA de 25-mer se utilizaron en las reacciones incubadas a 30°C (datos no mostrados) . La sensibilidad y especificidad de un ensayo SNP promovido y señalizado con YOYO-1 puede por consiguiente ser aumentada mediante la pre-incubación de la sonda antes de la adición a la mezcla de reacción y también mediante la incubación de la mezcla de reacción en temperaturas de no desnaturalización más altas que RT. Las combinaciones de sonda y objetivo incompletamente homólogos que generan un complejo desigualado de A-C 1 bp (dsDNA de 491 bp + sonda ds CF10-15) o un complejo desigualado de T-C 1 bp (dsDNA de 491 bp + sonda ds CF09-15) dio por resultado intensidades de emisión fluorescentes asociadas con el cuádruplex que fueron 61.3% o 67.8% menores, respectivamente, después de 5 min de incubación en RT, que aquellas emitidas de los cuadruplexos homólogos paralelos perfectamente igualados en R . Los cuádruplexos desigualados A-C uno bp (dsDNA de 491 bp +sonda ds CF10-25) o cuadruplexos desigualados de T-C de uno bp (dsDNA de 491 bp + sonda ds F09-25) produjeron intensidades de emisión fluorescentes asociadas con el cuádruplex que fueron tanto 100% menos que 5 min de incubación de RT, que aquellas emitidas de los cuádruplexos perfectamente igualadas a R . La especificidad más grande se observó cuando el objetivo dsDNA se hizo complejo con las sondas de dsDNA de 25-mer homologas, que cuando se hizo complejo con las sondas dsDNA de 15-mer homologas al objetivo de dsDNA. Por consiguiente sondas dúplex más largas pueden ser más especificas que las sondas dúplex más cortas. Para el análisis de SNP se prefieren sondas dúplex de 25-mer. Las intensidades fluorescentes asociadas con cuádruplex emitidas de un cuádruplex de dsDNA : dsDNA desigualado de A-C de un bp formado con una sonda de 15-mer (dsDNA de 492 bp + sonda ds CF10-15) o formado con una sonda de 25-mer (dsDNA de 491 bp + sonda ds CF10-25) fue de 41.5% y 85.2% inferiores, respectivamente, después de una incubación de 5 min a 30 °C, que aquellas emitidas de los cuádruplexos perfectamente igualados a 30 °C. Las intensidades fluorescentes asociadas con el cuádruplex emitidas de un cuádruplex de dsDNA:dsDNA desigualado de T-C de uno bp con una sonda de 15 mer (dsDNA de 491 bp + sonda ds CF09-15) o formada con una sonda de 25-mer (dsDNA de 491 bp + sonda ds de CF09-25) donde ambos 100% inferiores después de una incubación de 5 min a 30 °C, que aquellas emitidas de los cuádruplexos perfectamente igualados a 30 °C. La pre-incubación de la sonda de dsDNA de 25-mer con 30 nM YOYO-1 durante 1 hora a 30 °C antes de la formación de cuádruplex a 30°C dio por resultado sensibilidad más grande y especificidad que aquella lograda después de la pre incubación de la sonda de dúplex de 25-mer con 50 nM YOYO-1 durante 1 hora as RT o diferente a aquella lograda después de la pre-incubación de una sonda de dsDNA de 15-mer con 30 nM YOYO-1 a 30 °C durante 1 hora. Las ganancias de intensidad significantes de la emisión YOYO-1 se observaron para los cuádruplexos perfectamente igualados formados con ya sea sondas de dsDNA 15-mer o con sondas de dsDNA de 25-mer cuando las mezclas de reacción se incubaron a 30 °C en lugar de R . Las ganancias fueron más pronunciadas cuando se utilizaron sondas homologas paralelas de dsDNA de 25-mer. Por consiguiente, las sondas de 25-mer ds pueden ser más sensible y especificas que las sondas de ds 15-mer comparables. Ejemplo 3 Este Ejemplo describe la formación triplex de los objetivos de desDNA genómicos humanos purificados reaccionados con sondas ssDNA de 15-mer, 20-.mer, 25-mer o 30-mer de RT en la presencia de YOYO-1. El dsDNA genómico humano se extrajo de una muestra de sangre utilizando un equipo de purificación de sangre QIAamp DNA (QIAGEN, Mississauga, Canadá) según instrucciones del fabricante. La concentración de dsDNA genómico se determinó mediante espectroscopia de UV. Las sondas de ssDNA de 15-mer, 20-mer o 25-mer antisentido, con secuencias derivadas del exón 10 del gen de fibrosis cistica humana (CFTR) , se sintetizaron sobre un sintetizador de DNA, se purificaron en cartucho y se disolvieron en ddH20 a una concentración de 1 pmol/ µ?. La sonda Delta F508-WT15C (SEQ ID NO: ) fue una sonda ssDNA de tipo silvestre de 15-mer idéntica en la secuencia de sonda CF01-15. La sonda Delta F508-MUT15C (SEQ ID NO: 16) fue una sonda de ssDNA mutante de 15-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 15 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 10 del gen de fibrosis cistica humana, excepto para una supresión de tres bases consecutivas en las posiciones de aminoácido 507 y 508 donde la secuencia de antisentido de tipo silvestre AAG es suprimida. La secuencia para la sonda Delta F508-MUTI5C (SEQ ID NO:16) fue: 5'-AAC ACC AAT GAT ATT-3' . La sonda Delta F508-WT20C (SEQ ID NO: 17) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 20-mer diseñada para ser complementaria de un segmento de 20 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 10 del gen de fibrosis cistica humana, de posiciones de aminoácido 506 a 512.

La secuencia para la sonda Delta F508-W 20C (SEQ ID N0:17) fue: 5'TAG GAA ACA CCA AAG ATG AT-3' . La sonda Delta F508-MÜT20C (SEQ ID NO: 18) fue una sonda ssDNA mutante de 20-mer diseñada para ser complementa ia a un segmento de 20 núcleo idos de La hebra de sentido del exón 10 del gen de fibrosis cística humana, excepto para una supresión de tres bases consecutivas en las posiciones de aminoácido 507 y 508 donde la secuencia de antisentido de tipo silvestre AAG es suprimida. La secuencia para la sonda Delta F508- UT20C (SEQ ID NO:18) fue: 5'-ATA GGA AAC ACC AAT GAT AT-3' . La sonda Delta F508-WT25C (SEQ ID NO: 7) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 25-mer idéntica en la secuencia a la sonda CF01-25. La sonda Delta F508-MUT25C (SEQ ID NO: 19) fue una sonda de ssDNA mutante de 25-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 25 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 10 del gen de fibrosis cística humana, excepto para una supresión de tres bases consecutiva en las posiciones de aminoácidos 507 y 508 donde la secuencia de antisentido de tipo silvestre AAG es suprimida. La secuencia para la sonda Delta F508-MürL'25C (SEQ ID NO: 19) fue: 5 ' -ATA GGA AAC ACC AAT GAT ATT T C T-3' . La mezcla de reacción (80 µ?) contuvo lo siguiente: 500 pg de objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 75 copias), 3.2 pmoles de la sonda de ssDNA de ya sea 15-mer, 20-mer o 25-mer, 0.5 x TBE y YOYO-1 600 nM. Las emisiones fluorescentes de las mezclas de reacción se detectaron utilizando el Genexus Analyzer que comprende un láser de ion argón de 15 mW y ajustes de PMT de 34% después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación. Los controles de sonda de ssDNA produjeron altos niveles de emisión fluorescente en la presencia de YOYO-1 600 nM como es compara a aquella emitida del control de objetivo de dsDNA genómico que también comprende YOYO-1 600 nM. Los controles de sonda de 25-mer exhibieron niveles más altos de fluorescencia, que los controles de sonda de 20-me.r o 15-mer comparables (Tabla 2). Los valores de emisión de fluorescencia de las mezclas de reacción se normalizaron para identificar la señal asociada con el triplex al sustraer el valor de emisión del control de sonda apropiado de la emisión de la mezcla de reacción relevante, ambas de las cuaJ.es se monitorearon a través del tiempo. Los triplexos de DNA perfectamente igualados, heteropoliméricos , que consisten de dsDNA genómico y la sonda Delta F508-WT25C de 25-mer (muestra 5) , se formaron y se detectaron después tampoco como la incubación de 5 min en la presencia de YOYO-1 600 nM (Tabla 2) . Es verdaderamente notable que las emisiones relacionadas con el triplex de igualación perfecta pueden ser significativamente más grandes que las emisiones combinadas del control de objebivo de dsDNA genómico y el control de sonda. También es notable que bajo ciertas condiciones Jos niveles de emisión de estos triplexos de DNA perfectamente igualados (muestra 5) fueron esencialmente estables en varios puntos del tiempo hasta 55 min después de la incubación de 5 min inicial y la primera medición de láser (Tabla 2 y datos no mostrados) . La observación de que los complejos de "triplex detectados formados en los primeros 5 minutos fueron establemente detectados por todo el periodo de 60 minutos fuertemente sugiere que el equilibrio del objetivo genómico y los otros reactivos se ha logrado subs tancialmente después de solo cinco minutos de incubación a R . Las observaciones anteriores constituyen evidencia contra el modelo de "colisión aleatoria" del enlace de ácido nucleico. Las restricciones de tiempo impuestas por las etapas de manejo manual han evitado a los inventores del monitoreo de la formación de triplex con objetivos genómicos durante las incubaciones más cortas que 5 minutos. Las intensidades de emisión fluorescente asociadas con el triplex producidas por un triplex de gDNA: ssDNA que contiene una desigualación de 3 bp (dsDNA genómico + sonda Delta F508-MUT25C) (muestra 6) fueron 90.1%, 92.9%, 92.5% y 91.6% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente, que aquellas emitidas por el triplex perfectamente igualado (muestra 5) (Tabla 2). Estos resultados claramente demuestran la capacidad para analizar el dsDNA genómico humano homogéneamente en solución, RT, después de tan poco como 5 minutos de incubación, utilizando sondas de ssDNA oligo no marcadas y YOYO-1. Tales triplexos heteropoliméricos se pueden formar para detectar SNPs en muestras genómicas humanas, una secuencia en una muestra genómica humana, o la presencia o genotipo de otro organismo o patógeno en una muestra que también contiene dsDMA genómico humano. El ensayo proporciona la detección directa de una señal relacionada con el complejo triplex. Los inventores algunas veces se refieren al complejo como el INGENEUS TRIPLEX y la capacidad del ensayo divulgada en esta invención como el Ensayo Genómico. Los triplexos de DNA perfectamente igualados, heteropoliméricos, que consisten de dsDNA genómico y la sonda Delta F508-WT20C de 20-mer (muestra 10), también se formaron y se detectaron después de una incubación de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 600 nM (Tabla 2) . La eficiencia de la formación del triplex de igualación perfecta después de una incubación de 5 minutos con YOYO-1 se presentó que significativamente menor, como es evidenciado por el nivel de emisión fluorescente, cuando se utilizaron sondas de ssDNA de 20-mer, antes que sondas de ssDNA de 25-mer. Las intensidades fluorescentes asociadas con el triplex para un triplex de 20-mer que contiene una desigualación de 3 bp (dsDNA genómico + sonda Delta F508-MUT20C (muestra 11) fueron 43.0%, 77.6%, 85.9% y 95.5% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos respectivamente, que aquellas emitidas por el triplex de 20-mer perfectamente igualado comparables (muestra 10) (Tabla 2) . Aunque el nivel de discriminación entre los triplexos de 20-mer perfectamente igualados y ios triplexos desigualados de 3 bp comprendidos de sondas de dsDNA y ssDNA de 20-mer genómicas fue notablemente menor que el observado para los triplexos comprendidos de sondas de dsDNA y de ssDNA de 25-mer genómicas después de una incubación de 5 minutos, la incubación de hasta 45 minutos dio por resultado un incremento progresivo en los niveles de discriminación entre los triplexos de 20-me igualados y desigualados (Tabla 2 ) . Esto fue atribuido a un incremento permanente de Formación do triplex de 20-mer de igualación perfecta a través del tiempo coincidente con una declinación progresiva de la formación de triplex de 20-mer desigualado. Este patrón continúo y se monitoreó durante el periodo de 45 y 60 minutos de incubación (datos no mostrados) . Después de 45 minutos de incubación los niveles de discriminación entre los triplexos igualados y desigualados compuestos de sondas de dsDNA y ssDNA de 20-mer genómicas fueron equivalentes a los niveles de discrim nación entre los triplexos Igualados y desigualados compuestos de sondas de dsDNA y de ssDNA de 2.5-mer genómicas (Tabla 2), aunque con señales de emisión fJ uorescenles asociadas con e,l triplex menores. Niveles significativamente menores de emisiones de fluorescencia del triplex de igualación perfecta de 15-mer, se observaron cuando el dsDNA genómico y la sonda Delta F508-WT15C (muestra 15) se incubaron durante 5 minutos en la presencia de YOYO-1 600 nM (Tabla 2). Las emisiones de fluorescencia observadas de triplexos de 15-mer desigualados de 3 bp comprendidos de dsDNA genómico y la sonda Delta F508-MÜT15C (muestra 16) fueron más altas después de la incubación corta que aquella de los triplexos de 15-mer perfectamente igualados (muestra 15) . Sin embargo, después de 45 minutos de incubación en la presencia de YOYO-1 600 nM, la fluorescencia asociada con el triplex de 15-mer desigualado ha declinado lo suficiente que la emisión fluorescente asociada con el triplex del triplex de 15-mer desigualado de 3 bp (muestra 16) fue 83.1% menor que aquella del triplex de 15-mer perfectamente igualado (muestra 15) (Tabla 2). .sta discriminación se mantuvo después de 60 m nutos de incubación (da os .no mostrados) . Los resultados anteriores claramente demuestran la eficiencia sorprendente del ensayo de triplex heteropolimérico para detectar desigualaciones de SNP en objetivos de dsDNA genómicos humanos, no amplificados, no desnaturalizados, de preferencia cuando se utilizan Y0Y0-1 y sondas de ssDNA de 25-mer. La sensibilidad del ensayo de triplex heteropoliméri co de los objetivos de dsDNA genómicos se considera sorprendente de que 500 pg de dsDNA genómtco, aproximadamente 75 copias, se analizó homogéneamente en un volumen final de mezcla de reacción de 80 µ? . Los SNPs en los objetivos genómicos humanos que pesan de 2 ng a 100 pg, aproximadamente 302 copias a 15 copias, han sido analizados de manera similar en solución utilizando concentraciones variadas de YOYO-1. Las sondas de ssDNA de 20-mer, 25-mer o 30-mer antisentido, con las secuencias derivadas del exón 4 del gen metilentetrahidrofolato reductasa humano (MTHFR) , se sintetizaron en un sintetizador de DNA, se purificaron en cartuchos y se disolvieron en ddl-^O en una concentración de 1 pmol/µ? . La sonda C677T-WT20C (SEQ ID NO: 20) fue una sonda ssDNA de tipo silvestre de 20-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 20 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 4 del gen MTHFR humano [Nature Genetics 7, 195-200 (1994) j. La secuencia para sonda C677T-WT20C (SEQ ID NO: 20) fue: 5' -TGA TGA TGA AAT CGG CTC CC-3' . La sonda C677T-MUT20C (SEQ ID NO: 21) fue una sonda de ssDNA mutante de 20-mer idéntica en secuencia a la sonda de tipo silvestre C677T-WT20C, excepto para una mutación de una base (subrayada) . El polimorfismo de MTHFR 677 es una sustitución de citosina a timina en 'la hebra de sentido del gen MTHFR, dando por resultado una sustitución de alanina a valina en la enzima MTHFR. La secuencia para la sonda C677T-MUT20C (SF.Q ID NO: 21) fue: 5' -TGA TGA TGA AA CGA CTC CC-3' . La sonda C677T-WT25C (SEQ ID NO: 22) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 25-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 25 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 4 del gen MTHFR humano. La secuencia para la sonda C677T-WT25C (SEQ ID NO: 22) fue: 5'-TGA TGA TGA AAT CGG CTC CCG CAG A-3' . La sonda C677T-MUT25C (SEQ ID NO: 23) fue una sonda de ssDNA mutante de 25-mer idéntica en la secuencia a la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C, excepto para una mutación de una base (subrayada) . La secuencia para la sonda C677T-MUT25C (SEQ ID NO: 23) fue: 5' -TGA TGA TGA AAT CGA CTC CCG CAG A-3' . La sonda C677T-WT30C (SEQ ID NO: 24) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 30-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 30 nucleótidos de la hebra de sentido del exón 4 del gen MTHFR humano. La secuencia para la sonda C677T-WT30C (SEQ ID NO: 24) fue: 5'-GCG TGA TGA TGA AAT CGG CTC CCG CAG ACA-3' .

La sonda C677T- UT30G (SEQ ID NO: 25) fue una sonda de ssDNA imitante de 30-mer idéntica en la secuencia a la sonda de tipo silvestre C677T-WT30C, excepto para una mutación una base (subrayada). La secuencia para la sonda C677T-MUT30C (SEQ ID NO: 25) fue: 5'-GCG TGA TGA TGA AAT CGA CTC CCG CAG ACA-3'. Las mezclas de reacción (80 µ?) contuvieron lo siguiente: 1 ng o 2 ng de objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 151 copias o 302 copias, respectivamente) , 3.2 pmoles de sonda de ssDNA de ya sea de 20-mer, 2.5-mer o 30-mer, 0.5 x TBE y YOYO-1 500 nM. Las emisiones fluorescentes de las mezclas de reacción se monitorearon con el láser de ion de argón de 15 mW en Genexus Analyzer en un ajuste de 30% de PMT después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, como es descrito en el Ejemplo 1. Niveles de emisión de fluorescencia muy diferentes se observaron para los controles de sonda de ssDNA de tipo silvestre y mulante, debido a diferencias en los niveles de la característica de auto hibridación de cada secuencia de sonda en la presencia de YOYO-1 bajo estas condiciones (Tabla 3). Las sondas de 30-mer exhibieron niveles más aJtos de fluorescencia que las sondas de 25-mer o 20-mer. Las emisiones de fluorescencia de las mezclas de reacción so normalizaron para identificar la señal asociada con el triplex al substraer el valor de emisión de control de sonda apropiado de la emisión de la mezcla de reacción relacionada, ambos de los cuales se monitorean a través del tiempo. Los triplexos de 30-mer y 25-mer pe rí ectamcnte igualados, heteropoliméricos que consisten de dsDNA genóm Leo y ya sea la sonda C677T-WT30C o la sonda C677T-WT25C (muestras 5 y 10 en la tabla 3, respectivamente) , se formaron durante una incubación de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 500 nM. Los niveles de señal asociado con el triplex de 30-mer y 25-mer de igualación perfecta fueron ambos significativamente más grandes que las señales de fluorescencia combinadas del control de dsDNA genómico objetivo más los controles de sonda reJ.ac ionados después de solo 5 minutos de incubación. Que los complejos de triplex de 30-mer y 25-mer se formaron y se detectaron directamente después de 5 minutos de incubación y que las señales de detección fueron estables por todo el periodo de 55 minutos implícitos (Tabla 3) sugiere que el equilibrio ha sido sustancialmente logrado después de solo cinco minutos de incubación. Utilizando la mitad de la cantidad del objetivo de dsDNA genómico, es decir 1 ng en lugar de 2 ng en el ensayo triplex genómico, asombrosamente no dio por resul ado una declinación proporcionada en la seña.1 asociada con triplex emitida de los complejos de triplex de 30-mer o 25-mer perfectamente igualados formados (datos no mostrados) . Los triplexos de 25-mer perfectamente igualados se formaron con eficacia similar, como es demostrado por los niveles comparables de las emisiones fluorescentes de la mezcla de reacción (datos no mostrados) . Basado en el nivel de emisión fluorescente asociado con el triplex, los triplexos de 25-mer perfectamente igualados se formaron más eficientemente que los triplexos de 30-mer perfectamente igualados, bajo las condiciones de reacción probadas (comparar las muestras 10 y 5 en la Tabla 3) . La emisión fluorescente asociada con el triplex de un triplex de 30-mer desigualado de C-A de 1 bp en una mezcla de reacción comprendida de 2 ng de dsDNA genómico y la sonda C677T-MUT30C (muestra 6) fue 90.4%, 92.6%, 92.4% y 93.3% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente de aquella emitida de la mezcla de reacción que contiene el triplex de 30-mer perfectamente igualado, (muestra 5), cada uno eva.l uado después de la incubaci ón comparable (Tabla 3) . De manera similar, cuando 1 ng de dsDNA genómico se hizo reaccionar con la sonda C677T-MUT30C para formar un triplex de 30-mer desigualado de C-A de 1 bp, la emisión fluorescente asociada con el triplex de este triplex desigualado fue de 80.2%, 84.9%, 86% y 87.3% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente, que aquella emitida de la mezcla de reacción que. contieno el triplex de 30-mer perfectamente igualado, cada uno evaluado después de la incubación comparable (datos no mostrados) .

Estos resultados claramente demuestran la eficiencia de la señal emitida por INGENEUS TRIPLEX utilizando las sondas de ssDNA de 30-mer para detectar desigualaciones de SNP en los objetivos de dsDMA genómicos humanos. Es notable que una desigualación de 1 bp en un INGENEUS TRIPLEX de 30-mer puede ser asi desestabilizante para permitir altos niveles de discriminación entre los triplexos de 30-mer perfectamente igualados y los triplexos de 30-mer desigualados en la presencia de Y0Y0-1 y una muestra de DNA genómica humana. Cuando 2 ng de dsDNA genómico se hizo reaccionar con la sonda C677T-MUT25C para formar un triplex de 25-mer desigualado de C-A de 1 bp (muestra 11, Tabla 3), la emisión fluorescente asociada con el triplex de la -mezcla de reacción que contiene este triplex desigualado fue 98.1%, 99.0%, 99.3% y 99.4% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente, que aquella emitida por la mezcla de reacción que contiene el triplex de 25-mer perfectamente igualado (muestra 10). La emisión fluorescente de una mezcla de reacción que contiene un triplex de 25-mer desigualado de C-A comprendido de 1 ng de dsDNA genómico y la sonda d C677T-MUT25C fue 91.4%, 93.7%, 94.4% y 95.2% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente, que aquella emitida por una mezcla de reacción que contiene el triplex de 25-mer perfectamente igualado (datos no mostrados). Estos resultados colectivamente demuestran el alto nivel de especificidad del ensayo de triplex heteropo1imé ico cuando se practica con sondas de ssDNA de ya sea 30-mer o 25-mer y YOYO-1 para detectar desigua] aciones de SNP en objetivos de dsDNA genómicos humanos. La eficiencia de formación de los triplexos de 20-mer perfectamente igualados heteropoliméricos en mezclas de reacción que contienen ya sea 2 ng o 1 ng de dsDNA genómico y la sonda C677T-WT20C (muestra 15 en la Tabla 3 y datos no mostrados, respectivamente) fue significativamente menor que aquellos formados con las sondas de 25-mer o 30-mer comparables. /unque el nivel de discriminación entre los triplexos de 20-mer perfectamente i.gualados (muestra Ib) y los triplexos desigualados de 1 bp (muestra 16) comprendidos de dsDNA genómico y sondas de ssDNA de 20-mer fue notablemente menor que aquel observado para los triplexos comprendidos de dsDNA genómico y las sondas de ssDNA de 25-mer o 30-mer después de una incubación de 5 minutos, la incubación de hasta 45 minutos dio por resultado un incremento progresivo en los niveles de discriminación entre los complexos de 20-mer igualados y desigualados (Tabla 3) . Los resultados anteriores demuestran que las sondas de ssDNA de 25-mer o 30-mer son claramente preferidas sobre las sondas de longitud más cortas de 15 o 20 bases para el ensayo de triplex heteropoliméri co de las muestras que contienen DNA genómico humano.

Ejemplo 4 El ejemplo 4 demuestra el efecto del pretratamiento eléctrico del medio de prueba sobre la formación de triplex heteropolimérico subsecuente entre las sondas de ssDNA, YOYO-1 y los objetivos de dsDNA genómico humano. Previamente Jos inventores han divulgado la ventaja del p etratami en Lo eléctrico del medio antes de la adición a una mezcla de reacción que contiene objetivos de menos complejidad que el dsDNA genómico humano. Ver la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2003/0170659. El medio de prueba que comprende 0.7 X TBE en un tubo de microcentrifuga de 1.5 mi fue ya sea no tratado o eléctricamente, pretratado antes de uso. El medio de prueba fue eléctricamente pretratado por medio de dos eléctrodos de platino/iridio 2 mm separados inmersos en el medio de p ueba . Cuarenta pulsos de 500 mseg de nueve voltios de corriente de DC, separados por intervalos de 10 segundos, se aplicaron a 56 µp? del medio de prueba que consiste de 0.7 X TBE. Inmediatamente después del pulso final de la corriente de DC, 3.2 pmoles de la sonda de ssDNA de 25-mer heteropolimérica (SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 19), 500 pg de objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 75 copias) y YOYO-1 se adicionaron a .los medios de prueba no tratados y eléctricamente pretratados para producir mezclas de reacción con un volumen final de 80 µ? . La concent ación de solución reguladora final fue 0.5 X TBE, y la concentración de YOYO-1 final fue de 600 nM. Las emisiones fluorescentes se monitorearon con el ajuste de PMT ai 30% después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación. Mientras que las mezclas de reacción que contienen triplexos de DNA perfectamente igualados (dsDNA genómico -I-sonda Delta F508-WT25C) emitieron la intensidad fluorescente más alta, las mezclas de reacción que contienen los triplexos incompletamente complementarios con una desigualación de 3 bp (dsDNA genómico. -l- sonda Delta -ü'508-MUT25C) produjeron emisiones fluorescentes asociadas con el triplex que fueron 54.7%, 79.9%, 84.7%, 98.6% y 90.5% menor después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, respectivamente, que aquellas emitidas por los triplexos perfectamente igualados en el medio no tratado después de la incubación comparable (datos no mostrados). La aplicación de cuarenta pulsos de 9V al. medio de prueba antes de la adición de los componentes de prueba dio por resultado una disminución de aproximadamente 2 veces en los niveles de emisión fluorescente del control de sonda de ssDNA, como es comparado a aquel observado con el mismo control en medio de prueba no tratado. Ninguna diferencia sin embargo en la emisión de fluorescencia del control de dsDNA genómico seguido del pretratamiento eléctrico del medio de prueba. El pretratamiento eléctrico del medio de prueba como es descrito notablemente aumenLó la señal emitida de la mezcla de reacción que contiene la formación de triplex de 25-mer heteropolimé rico pe fectamente igualado, en este caso al grado de un incremento de 92.50% como es comparado a aquel observado con el mismo triplex perfectamente igualado formado en el medio de prueba no tratado (datos no mostrados) . La señal emitida de la formación de triplex desigualado de tres bp (dsDNA genómico -1- sonda Delta F508-MUT25C) también se incrementó significativamente mediante la aplicación de cuarenta pulsos de 9V al medio de prueba, tal que La emisión fluorescente asociada con el triplex de las mezclas de reacción que contienen complejos desigualados de 3 bp en el medio de pretratado fue solo de 17.4% menor después de una incubación de 5 minutos, que aquel obtenido por los complejos perfectamente igualados (datos no mostrados). Los niveles altos extraordinarios de la emisión fluorescente de los triplexos de DNA de 25-mer heteropoliméricos tanto igualados como desigualados no solamente fueron sostenidos a través del tiempo, sino que se incrementaron ligeramente por todo el periodo de incubación de 60 minutos moni toreados . Este incremento dramático en la señal asociada con el triplex emitida demuestra una habilidad dramática pa a incrementar la sensibilidad del ensayo de triplex utilizando la sonda de ssDNA de 25-mer y YOYO-1 al practicar el pretratamiento eléctrico del medio de prueba antes de la adición del analito y los reactivos. Tal sensibilidad incrementa permitirá la detección de tan menos que 75 copias de una secuencia de interés presente en la mezcla de reacción que tiene un volumen final de hasta 80 µ? aún en la presencia del antecedente genómico humano. Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra la habilidad del INGENEUS TRIPLEX para formar específicamente en objetivos de dsDNA genómicos humanos, purificados de sangre o saliva, sobre un intervalo de concentraciones objetivo reaccionadas con sondas de ssDNA de 25-mer en la presencia de YOYO-1. dsDNA genómico humano se extrajo de una muestra de sangre humana utilizando un equipo de purificación de sangre de DNA QIAamp (QIAGEN, Mississauga , Canadá) o de Ja sali a humana utilizando un equipo de recolección de DNA Oragene (DNA Genotek, Ottawa, Canadá) según las ins rucciones del. fabricante. La concentración de dsDNA genómico se determinó mediante la espectroscopia de UV. Las sondas de ssDNA de 25-mer de antisentido, con las secuencias derivadas del exón 10 del gen del factor V humano o secuencias derivadas del intrón 14b del gen de fibrosis cística humana (CFTR) , se sintetizaron sobre un sintetizador de DNA, se purificaron en cartucho y se disolvieron en ddl- O a una concentración de 1 pmol/µ?. La sonda FVL- T25C (SEQ ID NO: 26) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 25-mer' diseñada para ser complementaria a un segmento de 25 nucleotidos de la hebra de sentido del exón 10 del gen del factor V humano. La secuencia para la sonda FVL-WT25C (SEQ ID NO: 26) fue: 5'-CCC TCT GTA TTC CTC GCC TGT CCA G-3' . La sonda FVL-MUT25C (SEQ ID NO: 27) fue una sonda de ssDNA mutante de 25-mer idéntica en secuencia a la sonda de tipo silvestre FVL-WT25C, excepto por una mutación de una base (subrayada) correspondiente a la mutación Leiden de Factor V G1691A [Nature 369, 64-67 (1994] . Esta mutación da por resultado la sustitución de glutamina por arginina en la posición 506 en la secuencia de aminoácidos en la proteína de factor V de coagulación. La secuencia para la sonda FVL-MUT25C (SEQ ID NO: 27) fue: 5'CCC TCT GTA TTC CTT GCC TGT CCA G-3' . La sonda 2789-l-5G->A- T25C (SEQ ID NO: 28) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 25-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 25 nucleotidos de la hebra de sentido del exón 14b y el intrón 14b del gen CFTR humano. La secuencia para la sonda 2789+5G->A-WT25C (SEQ ID NO: 28) fue: 5'-AAT AGG ACA TGG AAT ACT CAC TTT C-3' . La sonda 2789+5G->A-WT25C (SEQ ID NO: 29) fue una sonda de ssDNA mutante de 25-mer idéntica en secuencia a la sonda de tipo silvestre 2789-l-5G->A-WT25C, excepto por una mutación de una base (subrayada) correspondiente a la mutación 2789+5G->A en el intrón 14b del gen CFTR humano. La secuencia para sonda 2789+5G->A-Mü 25C (SEQ TD NO: 29) fue: 5 ' -AAT AGG ACA TGG AA'J' ATT CAC TTT C-3'. La mezcla de reacción (80 µ?) contuvo lo siguiente: cantidades de 75 pg a 4 ng del objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 11 copias a 604 copias), 3.2 pmoles de la sonda de ssDNA de 25-mer, 0.5 x TBE y YOYO-1 500 nM. La emisión fluorescente de las mezclas de reacción se monitorearon con un ajuste de PMT de 30% después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación. Los niveles de emisión de fluorescencia diferentes se observaron para .los controies de sonda de ssDNA de tipo silvestre y mutante. Los valores de emisión de fluorescencia de mezclas de reacción se normalizaron para identificar la señal asociada con el triplex al substraer el valor de emisión de control de sonda apropiado, ambos de los cuales se monitorearon a través del tiempo. Los triplexos de 25-mer perfectamente igualados, heteropoliméricos, que consisten de ya sea 2 ng, 1 ng, 500 pg o 200 pg de dsDNA genómico (purificado de la sangre) y la sonda FVL-WT25C (muestras 5, 8, 1] y 14 en La Tabla 4, respectivamente), se formaron durante una incubación de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 500 "nM. Los niveles de señal del triplex de 25-mer de igualación perfecta fueron todos significativamente más grandes que las señales de fluorescencia combinadas del control de dsDNA gonómico objetivo y el control de sonda de tipo silvestre después de solo 5 minutos de incubación. Cuando 1 ng de dsDNA genómico estuvo presente en la mezcla de reacción hubo un incremento progresivo en la emisión de florescencia de.l triplex de 2.5-mer perfectamente igualado (muestra 8, Tabla 4) por todo el periodo de incubación de 60 minutos. Mientras que las concentraciones disminuidas de los controles de dsDNA genómicos producidos progresivamente disminuyeron las emisiones fluorescentes, la disminución de las concentraciones de dsDNA genómico en la mezcla de reacción no dio por resultado una declinación proporcionada en las emisiones asociadas con triplex del triplex de 25-mer perfectamente igualado, formado (Tabla 4). Las emisiones fluorescen es asociadas con el. triplex de las mezclas de reacción que contienen triplex de 25-mer desigualado de G-T de 1 bp y los objetivos genómicos que pesan entre 2 ng y 200 pg y la sonda FVL-MUT25C (muestras 6, 9, 12 y 15 en la Tabla 4) fueron todos 100% menores después de las incubaciones de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos que aquellas emitidas por las mezclas de reacción que contienen triplexos de 25-mer perfectamente igualados y cantidades comparables de dsDNA genómico y la sonda l7'VL-WT25C (muestras 5, 8, 11 y 14, respectivamente, en la Tabla 4). Como se discutió en el Ejemplo 1, YOYO-1 facilitó la aut©asociación de las sondas que se presenta que es grandemente disminuida en la introducción del objetivo de dúplex genómico dando por resultado una declinación en la emisión de Y0Y0-1, sin una ganancia de desviación suficientemente grande en la fluorescencia a partir de la intercalación en el objetivo de dúplex y cualquier formación de triplex desigualado. Esto puede dar por resultado las emisiones fluorescentes de las mezclas de reacción que contienen triplexos de DNA genómicos desigualados es menor que las emisiones de los controles de sonda comparables. Los triplexos de 25-mer perfectamente igualados heteropoliméricos , en mezclas de reacción que contienen ya sea 4 ng, 2 ng, 1 ng, 500 pg, 200 pg, 100 pg o 75 pg de dsDNA genómico (purificado de la sangre) y 3.2 pmoles de la sonda CFTR 2789+5G->A-WT25C se formaron con eficiencia similar a los triplexos de 25-mer perfectamente igualados compuestos de dsDNA genómico en la sonda FVL-WT 5C (mostrada en la Tabla 4) después de una incubación de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 500 nM (datos no mostrados) . Las emisiones asociadas con el triplex de 25-mer de igualación perfecta CFTR fueron todas significativamente más grandes que la emisión de fluorescencia combinada del control de dsDNA genómico objetivo en la emisión de control de sonda relacionada. Como fue usual bajo las condiciones de ensayo empleadas, las emisiones asociadas con el triplex de las mezclas de reacción fueron estables por todo el período de incubación de 60 minutos (datos no mostrados) . La emisión fluorescente asociada con el triplex de una mezcla de reacción que contiene triplex de 25-mer desigualado de T-G 1 bp comprendido entre 4 ng y 75 pg de dsDNA genómico y la sonda 2789-i-5G~>A-Mü"TC25C fueron todos 100% menores después de de las incubaciones de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos que aquellas emitidas por mezclas de reacción que contienen triplexos de 25-mer perfectamente igualados que comprenden cantidades comparables del DNA genómico objetivo genómico y después de ser normalizadas al valor de control de sonda relevante (datos no mostrados) . Los resultados anteriores claramente demuestran la eficiencia sorprendente y la sensibilidad del INGENEUS TRIPLEX para permitir al ensayo genómico directamente detectar desigualaciones en varios genes el objetivo de dsDNA genómico humanos no purificados, no desnaturalizados, sobre una amplia gama de concentraciones de dsDNA genómicas. La capacidad del ensayo anterior es todavía más sorprendente ya que permite que no más de 75 pg de dsDNA genómico, aproximadamente 11 copias, sean analizadas para SNPs en el equipo disponible para los investigadores que no se ha optimizado para la sensibilidad de detección, o para trabajar con volúmenes finales menores que 80 µ? . ' Numerosos SNPs se han analizados exitosamente utilizando el ensayo genómico utilizando esencialmente eJ mismo protocolo de ensayo descrito en este ejemplo. En la ocasión, variaciones en las concentraciones del reactivo o el protocolo se hicieron. Los SNPs analizados incluyeron el Factor V Leiden G1691A, MTHFR C677T, CFTR de.l La F508, CFTR delta 1507, CFTR 2789+5G->A, CFTR 3849 i 10kbC->T, CFTR 3659delC, CFTR G551D, CFTR 621+1G->T, CFTRR1162X, CFTR 1717-1G->A, CFTR A455E, CFTR G542X, CFTR N1303K, CFTR R560T y CFTR W1282X. Setenta y cinco por ciento de las secuencias objetivo en los objetivos de dúplex analizados en los Ensayos Genómicos mencionados en lo anterior contuvieron una o más regiones de 4 o 5 bases de purina y pirimidina alternantes, que bajo condiciones leves pueden formar regiones de ZDNA. Este potencial de ZDNA dio por resultado ninguna dificultad en el ensayo y llevar a cabo los Ensayos Genómicos. En todos estos casos las muestras de dsDNA genómicas humanas purificadas de la sangre se analizaron. Los ensayos de triplex Genómicos también se realizaron para la mutación CFTR 2789-l-5G->A utilizando dsDNA genómico purificado de muestras de saliva, que se han almacenado a RT durante 1 semana después de la incubación a 50°C durante 30 minutos. La incubación de 50 °C se recomienda por el fabricante del equipo Oragene para permitir el almacenamiento a largo plazo de muestras de saliva a RT . La tabla 5 compara los resultados del ensayo obtenidos del dsDNA genómico humano purificado de saliva a aquellos del dsDNA genómico humano purificado de la sangre. Ya sea 4 ng o 2 ng de dsDNA genómico humano se analizaron utilizando 3.2 pmoles de la sonda 2789+5G->A- 25C (muestras 5 y 8 en la Tabla 5) . Las emisiones de las mezclas de reacción indicaron que los triplexos igualados se formaron con eficacia equivalente (muestras 5 y 8 en la Tabla 5 y datos no mostrados) después de una incubación de 5 minutos, en la presencia de Y0Y0-1 500 nM. Las emisiones asociadas con el triplex fueron estables a través del periodo de 45 minutos que se monitorearon . Las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex de las mezclas de reacción que contienen un 1 triplex de 25-mer es igualado de T-G de 1 bp comprendido de 4 ng de dsDNA genómico y la sonda 2789+5G->A-MUT25C (muestra 6, Tabla 5) fueron 94.9%, 93.1%, 94.1% y 93.8% menor después de las incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respec ivamente, que aquellas emitidas por las mezclas de reacción que contienen triplexos de 25-mer perfectamente igualados (muestra 5 en la Tabla 5) . De manera similar cuando 2 ng de dsDNA genómico se hizo reaccionar con la misma sonda para formar el triplex de 25-mer desigualado del T-G de 1 bp (muestra 9, Tabla 5) , las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex fueron 100%, 97.7%, 100% y 100% menores después de incubaciones de 5, 15, 30 y 45 minutos, respectivamente, que aquellas emitidas por las mezclas de reacción que contienen tripiexos de 25-me r perfectamente igualados (muestra 8, Tabla 5). Los resultados anteriores demuestran que el Ensayo Genómico del DNA genómico humano purificado de la saliva puede ser tan eficiente y especifico como uno en el cual el DNA genómico humano se purificó de la sangre. La purificación extensiva del DNA genómico, como ocurre cuando se utiliza en los equipos Qiagen, puede por lo tanto no ser un requerimiento para un ensayo de triplex de muestras que contienen dsDNA genómico humano. La adquisición del DNA genómico humana para el ensayo de la saliva ofrece ventajas claras en el manejo, almacenamiento y envió sobre la adquisición de la sangre. En comparaciones de lado por lado, 1 mi de sangre periférica purificada por el equipo Qiagen produjo más que bastante DNA genómico humano para llevar a cabo arriba de 9,000 ensayos de triplex como es descritos en estos ejemplos, si 3 ng se analizaron por reacción. Una muestra de esputo típica, semi-purificada con un equipo Oragene, produjo bastante DNA genómico humano para arriba de 7,000 ensayos de triplex a ser reali ados. Se observa que todos estos datos en estos ejemplos es consistente con la conclusión de que las moléculas YOYO-1 formadas en complejo con ácido nucleico triplex emiten más luz que cuando se forman en un complejo con el ácido nucleico dúplex .

Ejemplo 6 Este ejemplo describe un ensayo de SNP de los objetivos de dsDNA genómicos humanos reaccionados con sondas de ssDNA de 25-mer en las cuales el incremento y/o menguamiento de las emisiones se monitorean a través del tiempo y se evalúan. El dsDNA genómico humano se extrajo de una muestra de sangre humana y se cuantificó como es descrito en e] Ejemplo 3. Las sondas de ssDNA de 25-mer de Antisentido, con las secuencias derivadas del intrón 19 del gen CF R humano, se sintetizaron en un sintetizador de DNA, se purificaron en cartuchos y se disolvieron en ddH20 a una concentración de 1 pmol/µ? . La sonda 3849+10kbC->T-WT25C (SEQ ID NO: 30) fue una sonda de ssDNA de tipo silvestre de 25-mer diseñada para ser complementaria a un segmento de 25 nucleótidos de la hebra de sentido del intrón 19 del gen CFTR humano. La secuencia para sonda 3849+10kbC->T-MUT25C (SEQ ID NO: 30) fue: 5'-GTG TCT TAC TCG CCA TTT TAA TAC T-3' . La sonda 3849+10kbC->T-NUT25C (SEQ ID NO: 31) fue una sonda de ssDNA mutante de 25-mer idéntica en la secuencia a la sonda de tipo silvestre 3849+10kbC->T-WT25C, excepto para una mutación de una base (subrayada) correspondiente a la mutación 3849-1-10kbC->T en el intrón 19 del gen CFTR humano .

La secuencia para la sonda 3849+10 kbC->T-MUT2bC (SEQ ID NO: 31) fue: 5'-GTG TCT TAC TCA CCA TTT TAA TAC T-3'. Las mezclas de reacción (80 µ?) contuvieron lo siguiente: 2 ng de objetivos de dsDNA genómico humano (aproximadamente 302 copias), 3.2 pmoles de la sonda de ssDNA de 25-mer, 0.5 x BE, YOYO-1 500 nM y ya sea 40 mM del catión kosmotrópico, cloruro de tetrametilamonio ( TMA-C1). En cada experimento las mezclas de reacción se formaron por duplicado, una tuvo YOYO-1 al adicionado por úllirno a la mezcla de reacción. En la otra mezcla de reacción, todos los componentes de la mezcla de reacción se han mezclado antes de que se adicionara el DNA genómico. En todos los casos las mezclas de reacción se incubaron durante 5 minutos y . se 'irradiaron. Las emisiones- fluorescentes de las mezclas de reacción se monitorearon con el láser del ion de argón de 15 mW de Genexus Analyzer en un ajuste de 32% de PMT después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, como es descri o en el Ejemplo 1. En la presencia de 45 mM o 40 mM de TMA-Cl las emisiones fluorescentes de los controles de sonda de s s DNA de tipo silvestre y. mutante para cada SNP fueron similares después de 5 minutos de incubación (Tablas 6, 7 y datos no mostrados) y permanecieron permanentes durante un curso de tiempo de 55 minutos adicionales. Solamente los valores de emisión asociados con el triplex obtenidos después de 15 a 60 minutos de incubación de las mezclas de reacción se muestran en las Tablas 6 y 7. Las emisiones asociadas con el triplex de tripiexos de 25-mer perfectamente igualados por duplicado en las mezclas de reacción que consisten de DNA genómico y la sonda 2789-l-5G->A-WT25C (muestras 5 y 9, Tabla 6), monitoreadas después de una incubación de 15 minutos en la presencia de 45 mM de TMA-C1 y Y0Y0-1 500 nM, fueron similares si el YOYO-l o gDNA se adicionaron por último a las mezclas de reacción. Bajo ambos protocolos de ensayo de triplex las emisiones asociadas con el triplex perfectamente igualadas dramáticamente se incrementaron cuando se moni torearon durante un periodo de tiempo de 60 minutos (Tabla 6, Figs. 1 y 2) . Las emisiones asociadas con el triplex de los tripiexos de 25-mer desigualados por el duplicado en las mezclas de reacción que consisten de DNA genómico y la sonda 2789-i-5G->A-MUT25C (muestras 6 y 10, Tabla 6), monitoreadas después de una incubación de 15 min en la presencia de TMA-Cl de 45 mM y YOYO-1 500 nM, fueron similares si el YOYO-1 o gDNA se ha adicionado por último a las mezclas de reacción y produjeron emisiones que fueron con 55% o 54% menores que Jas mezclas de reacción que contienen tripiexos perfectamente igualados (muestras 5 y 9, respectivamente, Tabla 6) . Las emisiones asociadas con el triplex de los tripiexos desigualados formados en la mezcla de reacción a Las cuales Y0Y0-1 se ha adicionado por último, permanecieron relativamente constantes cuando se monitorearon durante un periodo de tiempo de 60 min (muestra 6, Tabla y Fig. 1) . Puesto que las emisiones asociadazas con el triplex perfectamente '.igualados correspondientes se incremen ron significativamente a través del periodo de monitoreo, eJ nivel de discriminación entre las señales de triplex perfectamente igualadas y las señales desigualadas de 1 bp se incrementaron de 55% a 65% en las mezclas de reacción a las cuales se ha adicionado al último YOYO-1. Las emisiones asociadas con el triplex de los triplexos desigualados formados en la mezcla de reacción a la cual gDNA se ha adicionado por último, se incrementó ligeramente a través del tiempo (muestra 10, Tabla 6 y Fig. 2) . Sin embargo, la proporción de incremento de la emisión asociada con triplex para los triplexos desigualados en estas mezclas de reacción fue mucho menor que aquellas de las mezclas de reacción que contienen triplexos perfectamente igualados comparables, tal que el nivel de discriminación entre las señales asociadas con el triplex perfectamente igualadas y las señales asociadas con el triplex desigualadas de 1 bp se incrementaron de 54% a 60% cuando se monitorearon durante el. periodo de tiempo. Las emisiones asociadas con el triplex de los triplexos de 25-mer perfectamente igualados en. las mezclas de reacción que consisten de DNA genómico y la sonda 3849+lOkbC->T-WT25C (muestras 5 y 9, Tabla 7), monitoreadas después de una incubación de 15 min en la presencia de TMA-C1 de 40 mM y YOYO-1 500 nM, fueron similares si YOYO-1 o gDNA se ha adicionado por último a las mezclas de reacción. Bajo ambos protocolos de ensayos de triplex, las emisiones asociadas con el triplex perfectamente igualados se incrementaron cuando se monitorearon hasta el punto de tiempo de 60 min (Tabla 7, Figs. 3 y 4) . En la mezcla de reacción que contiene TMA-C.L 40 mM, al cual YOYO-1 se ha adicionado al último, las emisiones asociadas con el triplex de un triplex de 25-mer desigualado que consiste de DNA genómico y la sonda 3849+10kbC->T-MÜT25C (muestra 6, Tabla 7) fue 70%, 84%, 90%, 94%, 99%, 98%, 100%, 100%, 100% y 100% menor después de 5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 min de incubación, respectivamente, que aquella emitida de una mezcla de reacción s imilarmente monitoreada que contiene el triplex de 25-mer pe ectamente igualado (muestra 5, Tabla 7) . En la mezcla de reacción que contiene TMA-C1 40 mM, el cual gDNA se ha adicionado al. último, las emisiones asociadas con el triplex de un triplex de 25-mer desigualado que consiste de DNA genómico y la sonda 3849+10kbC->T-MUT25C (muestra 10, Tabla 7) fue 49%, 55%, 62%, 66%, 69%, 72%, 73%, 76%, 85% y 88% menor después de 15, 20, , 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 min de incubación, respectivamente, ¦ que aquellas emitidas de una mezcla de reacción similármente monitoreada que contiene el triplex de 25-mer perfectamente igualado (muestra 9, Tabla 7). Por consiguiente la adición de concentraciones especificas de TMA-C1 o uno o más cationes kosmoL trópicos adicionados por separado o combinación a una mezcla de reacción de ensayo puede dar por resultado un incremento progresivo en las emisiones de señal, si está ocurriendo en enlace de igualación perfecta, mientras que el enlace de desigualación puede dar por resultado una declinación progresiva en las emisiones de señal de una mezcla de reacción de ensayo (Tabla 7, Figs . 3 y 4, y datos no mostrados) . Asi las mezclas de reacción pueden ser seleccionadas en los cuales los incrementos en los niveles de discriminación entre el enlace de igualación perfecta y el enlace de desigualación puede ser monitoreada a través del tiempo. El monitoreo puede también ser dirigido para observar los niveles altos, constantes o incrementados del enlace de la señal asociadas de las mezclas de reacción, bajo las cuales las señales de enlace de desi gualaci ón están bajas. Consecuentemente hay ventajas en llevar a cabo ensayos por duplicado en varios protocolos o reactivos para obtener la señal cuyas varias características confirman el registro de la muestra. Los inventores se refieren a estos métodos de detección de enlace igualada o desigualado colectivamente como los métodos de "incremento y menguamiento". Es muy útil generar Ensayos Genómicos de señal fluorescente, que no son dependientes meramente de las ganancias relativas en las intensidades de emisión, sino que también puede emplear proporciones y dirección de cambio de las emisiones a través del tiempo. Cuando 2 ng de DNA genómico se hizo reaccionar con ya sea la sonda Delta F508-WT25C de 25-mer o la sonda Delta F508-MÜT25C de 25-mer en mezclas de reacción que contienen TMA-C1 de mM y Y0Y0-1 500 nM, ya sea que YOYO-1 o gDNA se ha adicionado por último a las mezclas de reacción, el incremento y menguamiento de las emisiones asociadas con el triplex de duración perfecta y las emisiones asociadas con el triplex de desigualación se observaron durante el periodo de incubación de 60 min (datos no mostrados) . En este caso las emisiones asociadas con el triplex también se moni torearan después de 24 horas de incubación de las mezclas de reacción. El patrón de emisión de incremento y menguamiento fue. evidente después de 24 horas de incubación (datos no mostrados ) . Cuando 2 ng de DNA genómico se hicieron reaccionar con ya sea la sonda FVL-WT25C de 25-mer o la sonda FVL-MUT25C de 25-mer en mezclas de reacción que contienen TMA-Cl 50 mM, NaCl 20 mM y YOYO-1 500 nM y ya sea que YOYO-1 o gDNA se ha adicionó por último a las mezclas de reacción, el patrón de emisión de incremento y menguamiento se observó en el monitoreo de las mezclas de reacción durante 24 horas (datos no mostrados ) . Numerosos cationes kosmotrópicos se han utilizado en conjunción con YOYO-1 500 nM para mejorar la especificidad del Ensayo Genómico y también aumentar el incremento y el menguamiento de las emisiones asociadas con el triplex. Elstos incluyen NaCl 50 a 80 mM, Na2S04 10 a 60 m , Na2HP04 50 mM, (NH4)2S04 125 a 250 mM, TriMA-Cl 30 mM, TMA-Cl. 30 a 52.5 mM, cada uno adicionado por separado o TMA-Cl 50 mM en combinación con NaCl 10 a 20 mM . Los beneficios del uso de uno o más cationes kosmotrópicos en la mezcla de reacción y las mejores concentraciones para el uso bajo cualquiera de las condiciones de ensayo seleccionadas se pueden determinar experimentalmente . Por consiguiente es claro que un Ensayo Genómico puede ser realizado al formar el INGENEUS TRIPLEX en dos o más mezclas de reacción ensambladas de acuerdo con dos o más protocolos que son calculados para producir emisiones asociadas con triplex monitoreadas a través del tiempo, que permiten que características de emisión múltiples sean observadas y evaluadas para permitir el análisis más preciso . Ejemplo 7 Este Ejemplo demuestra la habilidad del INGENEUS TRIPLEX para formar específicamente sobre los objetivos de dsDNA genómicos patogénicos reaccionados con sondas de ssDWA de 25-mer en la presencia de Y0Y0-1 y un exceso de dsDNA genómico humano. Una suspensión de células de BacL.llus globLgi i vegetativas (BG) fue suministrada por Dycor Technologies Ltd. (Edmonton, Alberta, Canadá) . Un mi de BG se formó en pelotillas mediante la centrifugación durante 5 min a 5000 x g (7500 rpm) , se resuspendió en 20 µ? de Agente de Liberación de Célula Bacteriana de (New Horizons, Columbus, MD) , y se incubó a RT durante 5 min. Las bacterias Usadas luego se resuspendieron en 160 µ? de solución reguladora AL (suministrada en el equipo de minipu ificación de DNA QIAamp, QIAGEN, Mississauga, Canadá) , y se incubaron a 56°C con 20 µ? de proteinaza K durante 30 min. El aislamiento del dsDNA genómico de BG se completó con el equipo de purificación de DNA de QIAamp, según las instrucciones del fab icante. La concentración del dsDNA genómico de BG se determinó mediante la espectroscopia de UV. El dsDNA genómico humano se extraj o en una muestra de sangre humana y se cuantificó como es descrito en el Ejemplo 3. Las sondas de ssDNA de 25-mer de antisentido, con las secuencias complementarias a un segmento de 25 nucleótidos de la hebra de sentido de], gen de endonucleasa de restricción Bgl I (bglIR) o el gen de pro eína SASP especifico de esporulación (csgA) de B. globigii , se sintetizaron en un sintetizador de DNA, se purificaron en cartuchos y se disolvió en ddl-l20 a una concentración de ] pmol/µ?. La secuencia para la sonda bglIR-WT25C (SEQ ID NO: 32) fue: 5'-TAT TTT GAT TAT AGG ACA TGA AGA T-3' . La secuencia para la sonda csgA-WT25C (SEQ ID NO: 33) fue: 5'-GCA AAT AAC CGA GTG TAA CAT CCA T-3'. Las mezclas de reacción (80 µ.? ) contuvieron lo siguiente: 0.46 pg de dsDNA genómico de BG (100 copias), 3.2 pmoles de sonda de ssDNA de 25-mer, 0.5 x BE, TMA-Cl 40 mM, YOYO-1 entre 500 y 300 nM y ya sea la presencia o ausencia de 2 ng del objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 302 copias) . En todos los casos YOYO-1 se adicionó al último a las mezclas de reacción, que se incubaron durante 5 minutos y se irradiaron. Las emisiones fluorescen es de las mezclas de reacción se moni torearon con el .Láser de ion de argón de 15 mW Genexus Analyzer en un ajuste de 32% de PMT después de 5, 15, 25, 35, 45, 55 y 65 minutos de incubación, como es descrito en el Ejemplo 1. En la presencia de TMA-Cl 40 mM, los niveles de emisión de fluorescencia para ambos de los controles de sonda bglIR-WT25C y csgA- T25C de ssDNA, se incrementaron conforme la concentración de YOYO-1 se incrementó en la mezcla de reacción (Tabla 8 y datos no mostrados), indicativo del nivel de auto-hibridación de la sonda en las diferentes concentraciones de Y0Y0-1. F.l nivel de emisión de fluorescencia de cada control de sonda permaneció constante por todo el periodo de incubación de 65 minutos. Como es esperado, los niveles de emisión de fluorescencia de los controles de DNA genómico humano disminuyeron ligeramente con la concentración de YOYO-1 disminuyente y permanecieron relativamente constantes por todo el periodo de incubación de 65 minutos (Tabla 8). No se observó señal fluorescente para los controles de DNA genómico de BG moni toreados en ajustes de PMT de 32% (Tabla 8) o 34% (datos no mostrados), que reflejan el número de copias muy bajo del gDNA de BG analizado. En un ajuste de 36% de PMT, los controles de gDNA de BG dieron valores de emisión de fluorescencia ligeramente arriba que los controles de YOYO-1, en cada concentración de YOYO-1 analizada (datos no mostrados) . Los valores de emisión de fluorescencia de mezclas de reacción se normalizaron para identificar la señal asociada con el triplex al substraer el valor de emisión de control de sonda apropiado, ambos de los cuales se monitorearon a través del tiempo. Los triplexos de 25-mer perfectamente Igualados heteropoliméricos que consisten de 100 copias de dsDNA genómico de BG y la sonda bglIR-WT25C, formados durante una incubación de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 500, 400 o 300 nM (muestras 5, 10 y 15 en la Tabla 8, respectivamente) .

Los niveles de emisión de señal de la mezcla de reacción de igualación perfecta fueron todos significativamente más grandes que las señales de fluorescencia combinadas del control de dsD A genómico de BG o el control de sonda. La eficiencia de la formación de triplex se mejoró conforme I-a concentración de Y0Y0-1 se disminuyó de 500 nM a 300 nM en las mezclas de reacción que contienen 100 copias de DNA genómico de BG. Cuando YOYO-1 300 nM estuvo presente en la mezcla de .reacción hubo un incremento progresivo en la emisión de fluorescencia de triplex de 25-mer perfectamente igualada (muestra 15, Tabla 8) por todos los primeros 35 minutos de incubación, después de lo cual se observó una meseta en la emisión de fluorescencia. Cuando 200 copias de DNA genómico de BG se analizaron con la sonda bglIR-WT2C, la formación de triplex eficiente también se observó en la presencia de YOYO-1 500 - 300 nM después de 5 minutos de incubación, con 400 nM y 500 nM que es la concentración de YOYO-1 preferida en las mezclas de reacción de 80 µ? (datos no mostrados) . El DNA genómico de BG que varia en la concentración de 1000 copias a 30 copias por 80 µ? también se analizó exitosamente con la sonda csgA- T25C (datos no mostrados). Tan poco como 10 cop s del DNA genómico de BG en un volumen de reacción de 80 µ? se analizó reproduct i bl emen te con la sonda bglIR-WTC en la presencia de YOYO-1 300 nM, demostrando claramente la sensibilidad extrema del ensayo INGENEUS TRIPLEX para detectar patógenos (datos no mostrados) . Aún más notable es la habilidad del INGENEUS TRIPLEX para analizar específicamente 100 copias del DNA genómico bacteriano de un antecedente de DNA genómico humano. Los triplexos perfectamente igualados he teropoliméricos, formados entre las 100 copias del dsDNA genómico de BG. y .la sonda bglI-WT25C, se formaron durante un período de 5 minutos en la presencia de YOYO-1 300 nM, TMA-Cl 40 mM y 302 copias del DNA genómico humano (muestra 17 en la Tabla 8). Además, hubo un incremento progresivo en la emisión de fluorescencia del triplex de BG por todos los 65 minutos de incubación. La emisión de fluorescencia de las mezclas de reacción mostradas en la Tabla 8 también se monitoreó después de 24 horas de incubación. Mientras que la fluorescencia asociada con el triplex de BG observada en la ausencia del DNA genómico humano antecedente ligeramente dism nuyeron después de 24 horas de incubación, la fluorescencia asociada con el triplex de BG observado en la presencia del DNA genómico en exceso continua incrementándose por todas las 24 horas de incubación. La habilidad para analizar homogéneamente 0.33 copias de DNA genómico bacteriano para cada copia del DNA genómico humano presente demuestra la sensibilidad extrema del ensayo INGENEUS TRIPLEX para detectar el patógeno en no más de 5 minutos .

Ejemplo 8 Este Ejemplo demuestra la habilidad para analizar el homocigoto de tipo silvestre, el. heteroc igoto mutante o las muestras de dsDNA genómico humano homocigotas mutantes para la mutación de MTHF'R C677T. El dsDNA genómico humano que fue ya sea homocigoto de tipo silvestre, heterocigoto mutante o homocigoto mutante con respecto un MTHFR C677T, se extrajo de muestras de sangre de pacientes y se cuantificó como es descrito en el Ejemplo 3. Las sondas de ssDNA de 25-mer de antisentido, con las secuencias derivadas del exón 4 del gen MTHFR humano, se prepararon como es descrito en el Ejemplo 3. Las mezclas de reacción (80 µ?) contuvieron lo siguiente: 1 ng o 2 ng de objetivo de dsDNA genómico humano (aproximadamente 151 copias o 302 copias, respectivamente) , 3.2 pmoles de la sonda de ssDNA de 25-mer de ya sea tipo silvestre o mutante, 0.5 X TBE y YOYO-1 500 nM. Las emisiones fluorescentes de las mezclas de reacción se monitorearon utilizando el láser de ion argón de 15 mW Genexus Analyzer en un ajuste de 30% de PMT después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, como es descrito en el Ejemplo 1. Diferentes niveles de emisión de fluorescencia se observaron para los controles de sonda de tipo silvestre C677T-WT25C (SEQ ID NO: 22) y la sonda mutante C677T-MUT25C · (SEQ ID NO: 23), debido a diferencias en los niveles de auto- hibridación que son características para cada secuencia de sonda en la presencia de Y0Y0-1 (datos no mostrados) . Los valores de emisión de fluorescencia de las mezclas de reacción se normalizaron para identificar la señal asociada con el triplex al substraer el valor de emisión de control de sonda apropiado de la emisión de la mezcla de reacción relevante, ambos de los cuales se midieron después de la misma duración de incubación. Los triplexos de DNA perfectamente igualados, heteropoliméricos en las mezclas de reacción comprendidos de ya sea dsDNA genómico humano homocigoto de tipo silvestre y la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C o el dsDNA genómico humano homocigoto imitante y la sonda C677T-MUT25C mutante, se formaron eficien emente y se detectaron después de solo 5 minutos de incubación en la presencia del Y0Y0-1 500 nM (muestras 1 y 4, respectivamente, en la Fig. 5). La eficiencia de la formación de triplex igualado, señalizado por la apariencia de la fluorescencia asociada con el triplex, fue ligeramente más grande . en las mezclas de reacción comprendidas de 1 ng de dsDNA genómico homocigoto mutante y la sonda C677T-MUT25C (muestra 4, Fig. 5) y aquella de las mezclas de reacción comprendidas de 1 ng de dsDNA genómico homocigoto de tipo si vestre y la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C (muestra 1, E'ig. 5) después de 5 minutos de incubación. Las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex de los triplexos igualados (muestra 4, Fig. 5) disminuyeron ligeramente durante un periodo de incubación de 60 minutos monitoreado, mientras que las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex de los triplexos igualados (muestra 1, Fig. 5) permanecieron relati amente constantes a través del tiempo. Las intensidades de emisión fluorescentes asociadas con el triplex observadas de las mezclas de reacción que contienen cualquiera de los dos triplexos perfectamente igualados fueron más similares cuando 2 ng, en lugar de 1 ng, de dsDNA genómico estuvo presente en las mezclas de reacción (datos no mostrados) . Cuando 1 ng de dsDNA genómico mutante heterocigoto mutante se hizo reaccionar con la sonda mutante C677T-MUT25C (muestra' 3, Fig. 5), las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex fue 77%, 80%, 85%, 88% y 90% menores después de la incubación de 5, 15, 30, 45 y 60 min, respectivamente, que aquella emitida de la mezcla de reacción que contiene el triplex perfectamente igualado comprendido de 1 ng de dsDNA genómico humano homocigoto de tipo silvestre y la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C (muestra 1, Fig. 5), cada uno evaluado después de periodos comparables de incubación. Las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex de triplexos de des igualación de C-A de 1 bp en una mezcla de reacción comprendida de 1 ng de dsDNA genómico humano homocigoto de tipo silvestre y la sonda mutante C677T- MÜT25C (muestra 2, Fig. 5) fueron 92%, 95%, 98%, 98% y 98% menor después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, respectivamente, que aquellas emitidas de la mezcla de reacción que contienen los triplexos perfectamente iguaJ ados comprendidos de 1 ng de dsDNA genómico humano homocigoto de tipo silvestre y la sonda de tipo silvestre C677T-W 25C (muestra 1, Fig. 5) , cada una evaluada después de periodos comparables de incubación. Las emisiones fluorescentes asociadas con el triplex de los triplexos de desigualación de C-A de 1 bp en una mezcla de reacción comprendida de 1 ng de dsDNA genómico humano homocigoto mulante y la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C (muestra 5, Fig. 5) fueron todos 100% menores después de 5, 15, 30, 45 y 60 minutos de incubación, respectivamente, que aquellas emitidas de la mezcla de reacción que contiene los triplexos perfectamente igualados comprendidos de 1 ng de dsDNA genómico humano homocigoto mutante y la sonda mutante C677T-MUT25C (muestra 4, Fig. 5) cada una evaluada después de periodos comparables de incubación . Los resultados anteriores demuestran La alta eficiencia y especificidad del método de analizar muestras de dsDNA genómico humano homocigoto de tipo silvestre, heterocigoto mutante u homocigoto mutante. Estos resultados se obtuvieron utilizando sondas de tipo silvestre y mutantes de 25-mer para MTHFR C677T. Los resultados comparables se observaron cuando reacciones análogas se realizaron utilizando sondas de tipo silvestre imitantes de 25-mer de sentido para THFR C677T (datos no mostrados) . La sensibilidad del ensayo además se demostró cuando los objetivos de dsDNA genómico humano, que va ían en peso de 2 ng a 200 pg, se analizaron exitosamente con la sonda de tipo silvestre C677T-WT25C y la sonda mutante C677T-MUT25C en un volumen de reacción de 80 µ? (datos no mostrados) . Mientras que la invención se ha descrito en detalle y con referencia a ejemplos específicos de la misma, será evidente para un experto en la técnica que varios cambios y modificaciones se pueden hacer en la misma sin apartarse de] espíritu y alcance de la misma.

TABLA 1. Comparación de ensayos de triplex usando sondas de ssDNA de 15-mer y 25-mer Obj etivo = amxilicón de dsDNñ de 491 CF sondas de 15-mer = CFO 1-15 (normal) , FC10-15 (mutarite) , CF09-15 (mutante) sondas de 25-mer = CF01-25 (normal) , CF10 -25 (mutante) , CF09-25 (mutante) YOYO-l 150 iiM est á presente en cada muestra !S Q w ? Ul > <? ¦a 1 5. ?? ra tn «; T3 o ss C C Q O cu ta tn ? w O T3 ? ra ai ai H tn ? £ 0) 1 ? o ¦M C Sf ?? «: TABLA 3. Comparación de los ensayos de triplex de dsDNA genómico humano usando sondas de ssDNA de 20-mer, 25-mer o 30-mer Objeti o =dsDHA genómico humano, WX para MTHFE. sondas de 20-mer =C677T-WT20C (tipo silvestre) , C677T-MUT20C (imitante) sondas de 25-mer =C677T-WI25C (tipo silvestre) , C677T-MUT25C (imitante) sondas de 30-mer =C677T-WT30C (tipo silvestre) , C677T-MUT30C (imitante) YO O-1 500 títí está presente en cada muestra ¦H M ü H a en O H e C Q oo mi ? tn <3S ? 8 s -P £ tn o ) a -O (1 •H U s t O Tabla 4. Comparación de los ensayos triplex de dsDNñ genómico humano en cantidades variantes Objetivo = dsDNA genómico humano, WT para FYL sondas de 25-mer = FVL-WT25C (tipo silvestre) , FVL-MUT25C (mutante) Y0Y0-1 500 nbi está presente en cada muestra c o o PQ EH O L/i O L TABLA 7. Ensayos de triplex de dsDNA genómico humano empleando protocolos de reacc Objetivo = dsDNA genómico humano, WT para CFTR sondas de 25-mer = 3849+10kbC->TWT25C (tipo silvestre) , 3849+10kbC->T-MUT25C (muta YOYO-l 500 nM y TMA-Cl 40 mM están presentes en cada muestra *Sonda ÷ gDHA es mezclado, luego YOXO-1 es adicionado. La mezcla de reacción se incuba durante 5 mili * *S onda + ????-l de control es mezclado, incubado durante 5 min e irradiado, luego gDHA se adiciona se incuba durante 5 mi y se irradia.

TABLA 8. Ensayos de triplex del dsDNA genómico de Bacillus globigii Objetivo = dsDNA genómico de Bacillus globigii sonda de 25-mer = bglIR-WT25c (tipo silvestre paras, globigii) TMA-Cl 40 mM estuvo presente en cada muestra YOYO-1 500 nM estuvo presente en las muestras 1-5, YOYO-1 400 nM estuvo presente en las muestras 6-10. YOYO-1 300 nl-i estuvo presente en las muestras 11-17 *Sonda + gDNA fueron mezclados,- luego YOYO-1 fue adicionado. Las mezclas de reacción se incubaron durante 5 min y luego se irradiaron. o TABLA 8. Continuación *Sonda + gDNA fueron mezclados,, luego YOYO-1 fue adicionado . Las mezclas de reacción se incuba durante 5 min y luego se irradiaron. ? o TABLA 8. Continuación *Sonda + gDNA fueron mezclados, luego Y0Y0-1 fue adicionado . Las mezclas de reacción se incubaron durante 5 min y luego se irradiaron.

TABLA 8. Continuación *Sonda + gDHA fueron mezclados, luego Y0Y0-1 fue adicionado . Las mezclas de reacción se incubaron durante 5 min y luego se irradiaron.

Claims (69)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico en una muestra genómica, el método caracterizado porque comprende: proporcionar la muestra genómica que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo de un ácido nucleico dúplex; proporcionar una sonda que comprende una secuencia de ácido - nucleico de sonda ; proporcionar una mezcla de hibridación que comprende la muestra genómica, la sonda, un agente de promoción de hibridación y marcas; incubar la mezcla de hibridación para proporcionar una mezcla incubada que comprende un complejo de la secuencia de ácido nucleico objetivo, la sonda y las marcas; irradiar la mezcla incubada con radiación efectiva para estimular por lo menos algunas de las marcas para emitir energía; y detectar de una señal fluorescente si la sonda perfectamente iguala a la secuencia de áci.do nucleico objetivo, para de esta manera detectar si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra genómica, en donde la detección se completa dentro de sesenta minutos de proporcionar la mezcla de hibridación, y el método se conduce sin desnaturalización del ácido nucleico dúplex y sin amplificación de PCR del ácido nucleico dúplex.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se detecta un polimorfismo de nucleótido individual o múltiple.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque más de una de la secuencia de ácido nucleico se detecta en la muestra genómica por más de una sonda .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se detecta un haplotipo.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se detecta un estado morfológico de un organismo o célula de la cual, se obtuvo la muestra genómica, el estado morfológico que comprende por lo menos uno de información que considera una etapa del desarrollo e información que considera un estado de enfermedad.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra genómica comprende menos de 700 copias de la secuencia de ácido nucleico objetivo.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muestra genómica comprende aproximadamente 150 a aproximadamente 300 copias de la secuencia de ácido nucleico objetivo.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la muestra genómica consiste esencialmente de contenidos de una célula individual.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se conduce en una célula biológica .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra genómica es de más de 5 kb en longitud.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra genómica es no digerida por todo el método.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico objetivo pertenece a un patógeno presente o previamente presente en un organismo o una célula de la cual se obtiene la muestra genómica.
13. 13. El método de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque la sonda, si es unitaria, es un ácido nucleico de una sola hebra o análogo de ácido nucleico de 15 a 30 bases en longitud.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de promoción de hibridación es, una marca de intercalación.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la marca do intercalación comprende tintes de cianina diméricos.
16. 16. El método de conformidad con la rei indicación 15, caracterizado porque la marca de intercalación consiste de YOYO-1.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las marcas son fluoróforos de intercalación que también constituyen el agente de promoción de hibridación.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de promoción de hibridación es un cosmótropo.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de promoción de hibridación es un catión de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de (CH3)4NC1, (CH3)3N-HC1, NaCl, Na2S04/ Na2HP04 y (NH4)2S04.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las marcas son fluoróforos no de intercalación .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el periodo de incubación es de uno a diez minutos, y el método se practica completamente en menos de quince minutos .
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de hibridación se mantiene a una temperatura de 20 a 40°C por todo el periodo de incubación .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una base de la sonda enlaza a una base o a un par de bases del objetivo mediante la interacción de base complementaria de Wa tson-Crick y/o mediante la interacción de base homologa, tal que el complejo es un triplex.
24. 24. El método de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque por lo menos una base de la sonda enlaza a una base o a un par de bases del objetivo mediante la interacción de base complementaria de Watson-Crick y/o mediante la interacción de base homologa, tal que el complejo es un cuádruplex.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda y la secuencia de ácido nucleico objetivo no se enlazan de manera conjunta solamente como hebras antiparalelas que obedecen a las reglas de emparejamiento de base de Watson-Crick .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la radiación es un haz de láser que tiene una densidad de potencia de aproximadamente 8? W/cm2/seg .
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la señal fluorescente se compara con una señal fluorescente de referencia para determinar si la sonda es una igualación perfecta para la secuencia de ácido nucleico objetivo.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección comprende moni torea r un cambio en la señal fluorescente a través del tiempo para determinar si la sonda perfectamente iguala la secuencia de ácido nucleico objetivo, y en donde un incremento en la señal fluorescente a través del tiempo indica una igualación perfecta y una disminución en la señal fluorescente a través del tiempo indica una falta de igualación perfecta.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda se proporciona en la mezcla de hibridación en una cantidad de saturación objetivo, la cantidad de saturación objetivo es una concentración de sonda en exceso de una concentración objetivo, y Las marcas so proporcionan en la mezcla de hibridación en una cantidad de saturación compleja, la cantidad de saturación compleja que es una concentración de marca arriba de la cual i.a discriminación de la señal de las señales antecedentes cambia en una primera proporción menor que una segunda proporción en la cual cambia la concentración de la marca.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda tiene una longitud efectiva para optimizar la transferencia o migración de energía.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque Ja discriminación de La señal fluorescente 'de las señales antecedentes se maximiza mediante la transferencia de energía o migración de energía entre las marcas intercaladas intra-obj eti vo y las marcas intercaladas de sonda-ob etivo.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la sonda es de 20-30 bases o pares de base en longitud.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una longitud de la sonda se selecciona para maximizar una intensidad de la señal-fluorescente .
34. 34. El método de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque la sonda se proporciona en la mezcla de hibridación en una cantidad de saturación objetivo, las marcas se proporcionan en la mezcla de hibridación en una cantidad de saturación compleja, y la sonda tiene una longitud efectiva para optimizar la transferencia o migración de energía.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una mezcla preliminar que comprende una solución reguladora y agua se somete a una carga eléctrica aplicada efectiva para aumentar una sensibilidad del método, y por lo menos una porción de la mezcla preliminar es subsecuentemente incorporada en la mezcla de hibridación.
36. 36. El método de conformidad con la rei i dicación 1, caracterizado porque la muestra genómica se adiciona a la mezcla de hibridación después de .la sonda, el. agente de promoción de hibridación y las marcas.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de promoción de hibridación o las marcas se adicionan a la mezcla de hibridación al último .
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra genómica se purifica, se semipurifica, no se purifica o se diluye.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los niveles de la expresión del producto de gen en una muestra genómica se detectan o los productos de expresión de gen de por lo menos dos muestras genómicas se comparan.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la mezcla de hibridación además comprende una pluralidad de sondas que enlazan las secuencias de la muestra genómica adyacentes a la secuencia de ácido nucleico objetivo.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda comprende un apagador de emisión y por lo menos una de las marcas.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda se modifica por al menos una porción enlazada.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las marcas comprenden FET, FRET, migración de energía o ajustes de redox.
44. 44. El método de conformidad con la reiv indi.cac.ión 1, caracterizado porque las marcas comprenden puntos de quantum.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se detectan repeticiones de secuencia de ácido nucleico, inserciones o supresiones.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se repite bajo condiciones variadas de la mezcla de hibridación.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se detecta un estado canceroso o de enfermedad de un organismo o célula de la cual se obtuvo la muestra genómica, o se determina la preñez del organismo.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra genómica se obtiene de una muestra de tejido humano) células bucales, sangre, fluido, esputo, orina o heces, y se marca con una etiqueta de identificación molecular adaptada para identi ficar una fuente de la muestra genómica.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda se proporciona sobre un soporte seleccionado del grupo que consiste de una cuenta, una placa, una membrana, una película, una micropantalla , un electrodo, una columna y un tubo capilar.
50. 50. El método de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque la sonda se proporciona sobre una película de isla de plata.
51. 51. Un equ.i.po para practicar e] método de la reivindicación 1, el equipo caracterizado porque comprende : la sonda; el agente de promoción de hibridación; y las marcas.
52. 52. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque además comprende un contenedor en el cual se proporciona la mezcla de hibridación.
53. 53. El equipo de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el contenedor se adapta para recolectar esputo o el equipo además comprende un dispositivo de recolección de esputo.
54. 54. El equipo de conformidad con la re indicación 52, caracterizado porque el contenedor comprende una etiqueta de identificación molecular adaptada para identificar una fuente de la muestra genómica.
55. 55. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la sonda se proporciona sobre un soporte seleccionado del grupo que consiste de una cuenta, una placa, una membrana, una pelicu.la, una micropantalla, un electrodo', una columna y un tubo capilar.
56. 56. El equipo de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el soporte es una película de isla de plata.
57. 57. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la sonda es de una sola hebra que contiene una horquilla, o es de doble hebra.
58. 58. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las marcas comprenden tintes de cianina diméricos .
59. 59. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las marcas y el agente de promoción de hibridación consisten de Y0Y0-1.
60. 60. El equipo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el agente de promoción de hibridación es por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de (CH3)4NC1, (CH3) 3N · HC.l. , NaC 1. , Na2SOa, Na2HP04 y (NH4)2S04.
61. 61. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico en una muestra genómica, el método caracterizado porque comprende: proporcionar la muestra genómica que comprende una secuencia de ácido nucleico objetivo de un ácido nucleico de una sola hebra o de doble hebra; proporcionar una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico de sonda; proporcionar una mezcla de hibridación que comprende la muestra genómica, la sonda, un agento de promoción de hibridación y marcas ; incubar la mezcla de hibridación para proporcionar una mezcla incubada que comprende un complejo de la secuencia de ácido nucleico objetivo, la sonda y las marcas ; aplicar energía a la mezcla incubada efectiva para inducir una señal de la mezcla de hibridación; y detectar de la señal , si la sonda perfectamente iguala a la secuencia de ácido nucleico objetivo, para de esta manera detectar si la secuencia de ácido nucleico está presente en la muestra genómica, en donde la detección se completa dentro de sesenta minutos de la provisión de la mezcla de hibridación, y el método se conduce sin la desnaturalización del ácido nucleico dúplex y sin la amplificación de PCR del ácido nucleico dúplex.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque subsecuente a la etapa de incubación y antes de la etapa de aplicación de energía, la mezcla incubada además se incuba bajo condiciones tal que las sondas se disasocian de la secuencia de ácido nucleico objetivo, y en donde la etapa de detección comprende determinar de la señal si la sonda es disasociada de la secuencia de ácido nucleico objetivo y las condiciones de incubación, para determinar si la sonda perfectamente iguala la secuencia de ácido nucleico objetivo.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque subsecuente a la etapa de incubación y antes de la etapa de aplicación de energía, la mezcla incubada además es incubada bajo condiciones tal que las sondas se disasocian en la secuencia de ácido nucleico objetivo, y en donde la etapa de detección comprende determinar de la señal si la sonda es disasociada de la secuencia de ácido nucleico objetivo y las condiciones de incubación, para determinar si la sonda perfectamente iguala a la secuencia de ácido nucleico objetivo.
64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda comprende una o más partes, y por lo menos una de las partes es 5 a 30 bases en longitud.
65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una etapa de separación se realiza antes de la etapa de irradiación.
66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende una etapa de provisión de por lo menos una sonda de bloqueo para suprimir el enlace de la sonda a una secuencia no objetivo de la mezcla genómica.
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo actúa como una' estructura fotónica para recolectar la energía fotónica y transferir energía a una marca que emite señal.
68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas del método se repiten más de una vez para proporcionar más de una mezcla de hibridación y más de una señal fluorescente, con la condición de que la mezcla de hibridación se forme al combinar la muestra genómica, la sonda, el agente de promoción de hibridación y las marcas en una secuencia diferente.
69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección comprende monítorear un cambio en la anisotropía de fluorescencia de la señal fluorescente a través del tiempo para determinar si la sonda perfectamente iguala a la secuencia de ácido nucleico obj etivo .