JP2005527181A - 2重鎖、3重鎖、または4重鎖複合体を形成するための、核酸またはその類似体の平行または逆平行な相同的または相補的な結合 - Google Patents
2重鎖、3重鎖、または4重鎖複合体を形成するための、核酸またはその類似体の平行または逆平行な相同的または相補的な結合 Download PDFInfo
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Abstract
Description
核酸鎖は、固有の方向性を持つ。従来の知見によれば、反対の方向性を持つ鎖、すなわち互いにその向きが逆平行である鎖が、それぞれの塩基のワトソン・クリック相補的結合によって2重鎖を形成することが可能であることを教示している。
実施形態において、複合体の一部はPCR増幅産物である。
本発明は、アッセイを行う前に標的を変性させる必要がない。プローブと標的との間の相互作用が、前掲の特許文献5の複合体ハイブリダイゼーションの非常に制約あるフーグスティーン・モデルではなくワトソン・クリックまたは相同的塩基相互作用に基づく場合(少なくともAがT(またはRNAの場合はU)に結合しGがCに結合するという意味で)、本発明者等がヘテロポリマー3重鎖および4重鎖を特異的にアッセイすることができたことは、驚くべきことである。
ある従来技術のアッセイとは異なり、本発明は、ハイブリダーゼーション(すなわち結合)の存在を検出するだけではなく、プローブと標的との結合の性質に関する定性的・定量的な情報も提供する。したがって本発明によれば、実行者は、(a)試験媒体中の標的の存在を検出し、(b)標的中の対立遺伝子またはヘテロ接合の不一致を検出し、(c)標的を定量し、(d)プローブと標的との相補性(W−Cモチーフでの結合の場合)または相同的性(相同的モチーフでの結合の場合)の程度を検出し、(e)ハプロタイプを検出することが可能になる。
ある特定の実施形態では、4重鎖が、ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行なヘテロポリマー・プローブ配列を含有し、このヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基結合またはワトソン・クリック相補的塩基結合によってヘテロポリマー標的配列に結合するものである。そのような実施形態では、4重鎖複合体が、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第1のプローブ鎖と、第1のプローブ配列に相補的であり逆平行な第2のプローブ配列を含有する第2のプローブ鎖とを含有する。標的は、ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の標的鎖と、第1の標的鎖に相補的であり逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の標的鎖とを含む。
野生型標的DNA(配列番号5)のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
変異配列番号6のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
変異配列番号7のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CTT TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
変異配列番号8のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
変異配列番号10のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
変異配列番号11のセンス鎖の配列は、5’−GAG CAC CAT GAC AGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG−3’であった。
プローブNo.2は、プローブNo.1の配列と同一な15量体のPNAプローブであるが、dsDNA標的のセンス鎖と同じ方向性または平行なものであった。
15量体のssDNAプローブを上述のように合成してHPLCにより精製した。ssDNAプローブをddH2Oに溶解して、濃度1pmol/μlにした。
プローブNo.4は、その配列がプローブNo.3と同一な15量体のssDNAプローブであるが、dsDNA標的のセンス鎖と同じ方向性または平行な方向性のものであった。
プローブNo.5は、5’位置に取着したフルオレセイン部分を有すること以外はプローブNo.3と同一な、15量体の逆平行ssDNAプローブであった。
プローブNo.6は、5’位置に取着したフルオレセイン部分を有すること以外はプローブNo.4と同一な、15量体の平行ssDNAプローブであった。
プローブNo.7は、50量体の野生型標的DNA(配列番号1)のセンス鎖の15ヌクレオチド・セグメントに完全に相補的になるよう設計された、5’位置にフルオロセイン部分が取着している15量体のssDNAプローブであった。このプローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に対して反対または逆平行であった。
プローブNo.8は、50量体の野生型標的DNA(配列番号1)のセンス鎖の15ヌクレオチド・セグメントと完全に相補的になるよう設計された、15量体のssDNAプローブであった。このプローブの方向性は、標的のセンス鎖の方向性に逆平行であった。
プローブNo.9およびプローブNo.10は、1塩基変異(下線箇所)以外、配列が野生型プローブNo.8と同一な、15量体の変異ssDNAプローブであった。
プローブNo.10の配列(配列番号21)は、5’−CAC CAA ACA TGA TAT−3’であった。
図3Aに例示するデータを生成するハイブリダイゼーション反応は、それぞれ以下の物質、すなわちssDNA標的2pmol、ssDNAプローブ2pmol、0.5×TBE、および500nM YOYO−1を含有し、その最終体積は40μlであった。反応混合物を室温(21℃)で5分間インキュベートし、石英キュベットに5分間入れて、波長488nmのアルゴンイオン・レーザビームで照射し、蛍光放出をモニタした。蛍光放出強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
プローブNo.11のアンチセンス鎖の配列(配列番号22)は、5’−Flu−CAC CAG AGA TGA CAG−3’であった。
プローブNo.12(配列番号23)のセンス鎖の配列は、5’−CTG TCA TCT CTG GTG−3’であった。
各ハイブリダイゼーション反応混合物(40μl)は、以下の物質、すなわちdsDNA標的0.4pmol、dsDNAプローブNo.12 4pmol、0.5×TBE、および100nM YOYO−1を含有していた。反応混合物を21℃で5分間インキュベートし、石英キュベットに入れ、波長488nmのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
プローブNo.13(配列番号24)のアンチセンス鎖の配列は、5’−GTG GTC TCT ACT GTC−3’であった。
各ハイブリダイゼーション反応混合物(40μl)は、以下の物質、すなわち標的dsDNA 0.4pmol、5’−フルオレセイン標識ssDNAプローブ4pmol、10mM Tris−HCl、pH7.5、および10mM〜150mM NaClを含有していた。反応混合物を、dsDNA標的の事前の変性なく、室温(21℃)で、1分から2時間にわたる様々な時間でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを石英キュベットに入れ、波長488nmのアルゴンイオン・レーザビームで照射して、蛍光放出をモニタした。最大蛍光強度は、フルオレセインの放出波長である523nmという波長で生じた。蛍光放出の強度を、分析した各サンプルの波長の関数としてプロットした。
本発明は、塩基結合の知識に対する実質的な追加を構成し、したがって本発明は、遺伝子抑制など、そのメカニズムが現在のところ謎につつまれている多くの生物学的機能の解明の中心をなす。
本発明者等は、本発明者等が解明した事実により、多くの「カノニカル」な着想を放棄することが必要になり、核酸の結合能力に再び疑問が生ずることになると考えられる。
Claims (60)
- 核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブと、核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する標的とを備える複合体において、
前記複合体が2重鎖であって尚かつ前記ヘテロポリマー・プローブ配列が前記ヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合には前記ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合することと、前記複合体が3重鎖である場合には前記複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、(a)前記プローブおよび前記標的の少なくとも1つは精製されたものか合成物であり、(b)ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー・プローブ配列は前記ヘテロポリマー標的配列に結合する複合体。 - 前記複合体は2重鎖であり、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によってまたはワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、前記ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行である請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブおよび前記標的のうちの一方は1本鎖であり、前記プローブおよび前記標的のうちの他方は2本鎖であり、前記複合体は3重鎖である請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体にはPNAが含まれない請求項3に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、(b)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の鎖とを含み、(c)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、(b)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の鎖とを含み、(c)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に結合する請求項3に記載の複合体。
- 前記プローブおよび前記標的は2本鎖であり、前記複合体は4重鎖である請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体にはPNAが含まれない請求項11に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項11に記載の複合体。
- 前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項11に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、(b)前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第1のプローブ鎖と、前記第1のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第2のプローブ鎖とを含み、(c)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の標的鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の標的鎖とを含み、(d)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項11に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは平行な方向性を有し、(b)前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第1のプローブ鎖と、前記第1のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第2のプローブ鎖とを含み、(c)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の標的鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の標的鎖とを含み、(d)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項11に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、(b)前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第1のプローブ鎖と、前記第1のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第2のプローブ鎖とを含み、(c)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の標的鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の標的鎖とを含み、(d)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項11に記載の複合体。
- (a)前記ヘテロポリマー・プローブ配列と前記ヘテロポリマー標的配列とは逆平行な方向性を有し、(b)前記プローブは、前記ヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第1のプローブ鎖と、前記第1のヘテロポリマー・プローブ配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー・プローブ配列を含有する第2のプローブ鎖とを含み、(c)前記標的は、前記ヘテロポリマー標的配列を含有する第1の標的鎖と、前記第1のヘテロポリマー標的配列に相補的かつ逆平行な第2のヘテロポリマー標的配列を含有する第2の標的鎖とを含み、(d)前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって前記第2のヘテロポリマー標的配列に任意に結合する請求項11に記載の複合体。
- 前記プローブは前記標的の副溝を占有する請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブは前記標的の主溝を占有する請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブの塩基は、前記標的の両方の鎖の塩基に対して同時に相互作用する請求項3に記載の複合体。
- 前記プローブの塩基は、前記標的の両方の鎖の塩基に対して同時に相互作用する請求項11に記載の複合体。
- 前記プローブの主鎖はデオキシリボースホスフェートからなる請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブの主鎖は、帯電していないか、部分的に負又は正に帯電している請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブの少なくとも1つの塩基は、ワトソン・クリック相補的結合または相同的結合に基づく特異的な結合親和性を有した天然産出塩基の合成類似体である請求項1に記載の複合体。
- 標的をアッセイするための方法であって、その方法は、
核酸または核酸類似体のヘテロポリマー標的配列を含有する前記標的を含んだサンプルを準備する工程と、
核酸または核酸類似体のヘテロポリマー・プローブ配列を含有するプローブを準備する工程と、
前記標的、前記プローブ、水、および緩衝剤を含んだハイブリダイゼーション混合物を準備する工程と、
複合体を得るべく、前記ヘテロポリマー標的配列を前記ヘテロポリマー・プローブ配列に結合させるのに有効なインキュベーション時間で前記ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする工程と、
標的をアッセイするべく、前記プローブと前記標的との間の結合親和性と相関するシグナルを検出する工程とを備え、
前記複合体が2重鎖であって尚かつ前記ヘテロポリマー・プローブ配列が前記ヘテロポリマー標的配列に逆平行である場合には前記ヘテロポリマー・プローブ配列が相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合することと、前記複合体が3重鎖である場合には前記複合体には組換えタンパク質が含まれないこととを条件として、ワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって、または相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー・プローブ配列は前記ヘテロポリマー標的配列に結合する方法。 - 前記ヘテロポリマー・プローブ配列の塩基と前記ヘテロポリマー標的配列の塩基との間の整合または不整合が検出される請求項26に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記標的は1本鎖であり、前記複合体は2重鎖であり、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、相同的塩基相互作用によって、またはワトソン・クリック相補的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合し、前記ヘテロポリマー・プローブ配列は、前記ヘテロポリマー標的配列に平行または逆平行である請求項26に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記標的のうちの一方は1本鎖であり、前記プローブおよび前記標的のうちの他方は2本鎖であり、前記複合体は3重鎖である請求項26に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記標的は2本鎖であり、前記複合体は4重鎖である請求項26に記載の方法。
- 前記標的は、支持体、表面、または半透膜に共有結合する請求項26に記載の方法。
- 前記プローブは、支持体、表面、または半透膜に共有結合する請求項26に記載の方法。
- 前記シグナルを生成または変化させるべく、電流または電磁力が前記複合体に印加される請求項26に記載の方法。
- 前記プローブまたは前記標的は、支持体、表面、または半透膜に共有結合し、前記シグナルを生成または変化させるべく、電流または電磁力が前記複合体に印加される請求項26に記載の方法。
- 前記方法はさらに、前記シグナルを変化させるべく、前記ハイブリダイゼーション混合物の条件を繰り返し変化させる工程を備え、前記標的は、前記変化に応答したシグナル分散の関数としてアッセイされる請求項26に記載の方法。
- 前記変化させる工程によって、前記プローブを前記複合体の前記標的から解離させる請求項35に記載の方法。
- 前記変化させる工程は、前記ハイブリダイゼーション混合物に第1の刺激および第2の刺激を与えることを含み、前記第1の刺激は、前記第2の刺激と同一の大きさであって尚かつ反対の極性を有する請求項35に記載の方法。
- 前記変化させる工程は、一連の刺激を与えることを含み、前記刺激のそれぞれは同一である請求項35に記載の方法。
- 前記シグナルは、前記プローブと共有結合した少なくとも1つの標識によって発せられる請求項26に記載の方法。
- 前記シグナルは、前記標的と共有結合した少なくとも1つの標識によって発せられる請求項26に記載の方法。
- 前記シグナルは、前記複合体と非共有的に結合した少なくとも1つの標識によって発せられる請求項26に記載の方法。
- 前記プローブは前記標的に侵入し、ワトソン・クリック塩基認識または相同的塩基認識に基づいて前記ヘテロポリマー・プローブ配列の塩基が前記ヘテロポリマー標的配列の塩基と結合するように、前記ヘテロポリマー標的配列に結合した塩基の配列を置換する請求項26に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも1つは、無水状態にて前記ハイブリダイゼーション混合物に導入される請求項26に記載方法。
- 前記方法は、前記プローブまたは前記標的を変性させることなく実施される請求項26に記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション混合物はさらに、少なくとも1つの結合プロモーターを含有する請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのプロモーターは、縮合剤または非縮合剤である請求項45に記載の方法。
- 前記プロモーターは、YOYO−1、TOTO−1、YOYO−3、TOTO−3、POPO−1、BOBO−1、POPO−3、BOBO−3、LOLO−1、JOJO−1、シアニンダイマー、YO−PRO−1、TO−PRO−1、YO−PRO−3、TO−PRO−3、TO−PRO−5、PO−PRO−1、BO−PRO−1、PO−PRO−3、BO−PRO−3、LO−PRO−1、JO−PRO−1、シアニンモノマー、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー1、エチジウムホモダイマー2、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウムアクリジンヘテロダイマー、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、SYTO色素、SYBRグリーン1、SYBR色素、Picoグリーン、SYTOX色素、および7−アミノアクチノマイシンDからなる群より選ばれる1つである請求項45に記載の方法。
- 前記複合体の他の可能な結合構造よりも前記複合体の1つの結合構造に有利に働くように、前記少なくとも1つのプロモーターの濃度が提供される請求項45に記載の方法。
- 前記標的を任意にマッピングするか、あるいは任意に前記標的の配列を決定する工程をさらに備える請求項26に記載の方法。
- 前記シグナルは、連続的に変化する条件下で検出された一連のシグナルを含む請求項26に記載の方法。
- 前記解離の特性は、前記プローブと前記標的との間の結合親和性と相関する請求項36に記載の方法。
- (a)相同的結合条件が提供されて、不完全相同的プローブは、前記標的に結合しないか、効率の低下した状態で前記標的に結合しており、若しくは(b)ワトソン・クリック相補的結合条件が提供されて、不完全相補的プローブは、前記標的に結合しないか、効率の低下した状態で前記標的に結合している請求項26に記載の方法。
- 前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも1つに結合した少なくとも1つの遊離塩基、ヌクレオチド、またはヌクレオシドをさらに備える請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブおよび前記標的のうちの少なくとも1つに結合した少なくとも1つのタンパク質または酵素をさらに備える請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体は、溶液中、固体の支持体上、インビトロ、インビボ、またはインシリコにある請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブは、相同的塩基相互作用によって前記ヘテロポリマー標的配列に結合したヘテロポリマーPNAであり、前記標的は2重鎖である請求項1に記載の複合体。
- 前記プローブは、前記2重鎖標的に侵入して前記ヘテロポリマー標的配列に結合する請求項56に記載の複合体。
- 前記プローブは2重鎖であり、前記プローブの少なくとも1つの鎖は、帯電していないか、部分的に負又は正に帯電しており、前記標的が1本鎖または2本鎖である請求項1に記載の複合体。
- 分析、診断、治療、または設計製作の用途に適合された請求項1に記載の複合体。
- 複合体形成混合物からの少なくとも1つの結合プロモーターをさらに備える請求項1に記載の複合体。
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