JP2003523738A

JP2003523738A - 様々な条件下での複数の測定による二本鎖および三本鎖ハイブリダイゼーションの均質測定法

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Publication number: JP2003523738A
Application number: JP2001553386A
Authority: JP
Inventors: エイチ．エリクソン、グレン; ピカード、ピエール; アイ．ダクシス、ジャスミン
Original assignee: インジェネウスコーポレイション
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-23
Publication date: 2003-08-12
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: RU2242518C2; ATE408709T1; JP4182149B2; US6265170B1; DE60135827D1; AU3042501A; CN1253583C; EP1250459B1; RU2002122770A; WO2001053526A2; EP1250459A2; CA2398362A1; IL150844A0; CA2398362C; MXPA02007210A; KR100488185B1; HK1047455A1; BR0107831A; CN1447861A; KR20020065940A

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸のハイブリッド形成、検出および評価のための、均質測定法を提供する。該測定法は、試験試料に電圧を適用する前と適用している最中の両方で試験試料から信号を取得し、該信号を相関させることを含む。該信号の各々は、プローブと標的の互いの結合親和性を示す。完全に相補的なハイブリッド形成を除くかなり多くのハイブリッド形成を不安定にするよう電圧を較正できるため、この測定法により、プローブと標的間の対合の程度を決定することができる。結合親和性と大きさが相関する信号は、電気コンダクタンスおよび／または蛍光強度であり得る。好ましくは、測定法の信頼度を高めるために、両方の信号対を測定し、比較する。この測定法は、三本鎖を形成する一本鎖プローブと未変性二本鎖標的間の特定のハイブリッド形成を検出することができるため、標的を変性する必要性がなくなる。この測定法は、二本鎖ハイブリッド形成複合体にも適用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）１．発明の属する技術分野本発明は、核酸を配列決定または測定する方法に関し、詳細には、三本鎖およ
び二本鎖核酸ハイブリダイゼーション複合体を正確に測定する方法に関する。

【０００２】２．関連技術の記載何年にもわたり、生物分子は試料に電場を印加することにより単離、キャラク
タリゼーションを行うことができることが理解されている。電気泳動は生物分子への電場の影響に基づく単離、キャラクタリゼーション技
術のおそらく最もよく知られている一例である。ゲル電気泳動では、均一マトリ
クスまたはゲルは例えばポリアクリルアミドから形成され、これに電場が印加さ
れる。ゲルの一端に適用された混合物はそのサイズおよび電場との相互作用によ
りゲルを通って移動する。移動度は構造、サイズおよび電荷などの物質の独特な
特性に依存する。移動度は、ゲルの細孔サイズを変える、例えば、濃度またはｐ
Ｈ勾配を形成する、または緩衝液の組成（ｐＨ、ＳＤＳ、ＤＯＣ、グリシン、塩
）を変更することにより影響を受ける。一次元および二次元ゲル電気泳動は大部
分の研究所での日常的な手順となっている。標的物質はゲルを通過することによ
り、あるいはゲルから物理的に抽出されることにより精製することができる。

【０００３】生物試料に電場が印加されるより最近開発されたプロセスはＳｔａｎｌｅｙに
付与された米国特許第５，８２４，４７７号において開示されている。Ｓｔａｎ
ｌｅｙの特許では、試料中の予め決められた核酸配列の有無を検出するためのプ
ロセスが開示されている。このプロセスは（ａ）電極により溶液中の試料に電圧
を印加することにより試料の二本鎖核酸試料を変性させる工程と、（ｂ）変性し
た核酸を配列決定のためのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる
工程と、（ｃ）ハイブリダイゼーションが起きたかどうか決定する工程と、を含
む。Ｓｔａｎｌｅｙの特許では標的配列を変性させるという限られた目的のため
に測定試料に電場を印加することが開示されている。

【０００４】より周知の型のハイブリダイゼーション測定法は、蛍光標識剤を使用するもの
である。最も基本的な形式において、蛍光強度に基づく測定法は、通常、蛍光発
色団を含むプローブと標的分子を接触させ、結合プローブから非結合プローブを
除去し、洗浄した試料の蛍光を検出することから成る。均質測定法は、洗浄ステ
ップや非液相支持体の設置を必要としない点で、そのような基本的測定法を改善
している。

【０００５】測定法の中には、ハイブリダイゼーション複合体中の核酸の鎖間への蛍光発色
団の結合能に基づいて、核酸ハイブリッド形成を検出するインターカレータ（挿
入剤）蛍光発色団を使用しているものもある。

【０００６】例えばＢｕｒｋｅらに付与された米国特許第５，８２４，５５７号は、核酸分
子を検出し定量化する方法およびキットを開示している。好ましい実施形態は、
二本鎖核酸ヘリックスあるいは一本鎖核酸に染料を挿入することに依存している
。染料は挿入後に蛍光を発するが、その強度は試料中に存在する核酸の量の直接
測定値である。Ｂｕｒｋｅらの方法は、試料中の核酸の量を測定するのに役立つ
と伝えられているが、該方法の基礎となっている挿入剤と核酸間の非特異的結合
は、該方法を（特に標的でない核酸二本鎖が存在する条件下での）特異的結合の
検出に対して非実用的なものとしている。

【０００７】Ｉｓｈｉｇｕｒｏらに付与された米国特許第５，８１４，４４７号は、Ｂｕｒ
ｋｅらの測定法のような挿入剤と核酸二本鎖間の非特異的相互作用に基づく測定
法や、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらによって日本国特許公報第２３７０００号（１９９３
年）に記述された以前の測定法よりも優れた改良を与える測定法を開示している
。初期の開発は、標的核酸の特定領域がＰＣＲによって増幅する前に試料溶液に
挿入された時に蛍光強度の増大を示す傾向を有する挿入剤蛍光色素を添加するこ
とと、増幅前に標的核酸を検出かつ定量化するために反応溶液からの蛍光強度を
所定の時間間隔で測定することから成っていた。’４４７特許は、プローブが挿
入剤蛍光色素で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該挿入剤蛍光色素
が標的核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ間の相補的結合部分に挿入され
ることを特徴とする、改良された特異性を有する測定法を与えることにより、以
前の開発より優れた改良を行うことを試みた。

【０００８】より高い感度と精度、ならびにより迅速な測定技術が継続して求められている
中で、ある研究グループが核酸ハイブリダイゼーション二本鎖の蛍光強度に対す
る電場の影響を分析する工程を含む測定法を開発した。米国特許出願番号第０８
／８０７，９０１号および０８／８７０，３７０号（各々１９９７年２月２７日
、１９９７年６月６日に出願）を参照されたい。その研究者らは、塩基対が１つ
誤対合した二本鎖の蛍光強度は完全に対合した二本鎖の蛍光強度とは異なること
を示した。このように、これらの出願は、検出工程前にまたは検出工程と同時に
液体媒質に電場を印加し、電場の関数としての蛍光放出の強度変化を、プローブ
が完全に相補的なヌクレオチド配列または不完全に相補的なヌクレオチド配列に
ハイブリダイズしたかどうかを示すものとして検出する、ヌクレオチド配列検出
法を開示するものである。

【０００９】以上の開発にもかかわらず、核酸および／または核酸類似体の間の相互作用を
分析するための、単純で、感度が非常に高く、有効で、迅速な方法が当該技術分
野では依然として必要とされている。本明細書に引用した参考文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組込
まれる。

【００１０】（発明の概要）本発明は、配列特異的なハイブリッド形成を測定するための方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料に第１刺激を加えて、第１刺激された試験試料を提供する工程と
、前記第１刺激された試験試料から、前記プローブと前記標的との間の結合親和
性と相関する第１信号を検出する工程と、前記標識と結合された少なくとも１つの基準プローブを含む基準試料が示す基
準信号に対して前記第１信号を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記
プローブおよび前記少なくとも１つの基準プローブの各々は、完全対合、１塩基
誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失、３塩基欠失か
ら成る群から選択された異なるメンバーである工程と、前記較正から、前記プローブと前記標的間の対合程度の第１決定値を決定する
工程と、前記第１刺激された試験試料に第２刺激を加え、第２刺激された試験試料を提
供する工程と、前記第２刺激された試験試料から、前記プローブと前記標的間の前記結合親和
性と相関する第２信号を検出する工程と、前記第２信号の検出工程から、前記プローブと前記標的との間の前記対合程度
の第２決定値を決定する工程と、前記第１決定値と前記第２決定値とを比較する工程と、から成る方法を提供す
る。

【００１１】本発明はまた、ハイブリッド形成を測定する別の方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料の第１条件の第１信号を測定し、前記プローブと前記標的間のハ
イブリッド形成に関する第１決定値を提供する工程であって、前記第１信号は前
記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に相関する工程と、前記試験試料の第２条件の第２信号を測定し前記プローブと前記標的との間の
ハイブリダイゼーションに関する第２決定値を提供する工程であって、前記第２
信号は前記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に相関し、前記第１条件と
前記第２条件とが類似しているとすれば、前記第１信号の測定後で、かつ前記第
２信号の測定前に、刺激が前記試験試料に加えられ、前記刺激は前記プローブと
前記標的間の不完全に相補的なハイブリッド形成に有意な影響を及ぼすが、前記
プローブと前記標的間の完全に相補的なハイブリッド形成には有意に影響を及ぼ
さない工程と、前記第１決定値と前記第２決定値とを比較して、それらの間の不一致が再試験
を必要とするものであるかどうかを評価する工程と、から成る方法も提供する。

【００１２】さらに、本発明は、別のハイブリッド形成の測定方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料に通電前の蛍光強度を測定し、前記プローブと前記標的間のハイ
ブリッド形成に関する第１決定値を提供する工程であって、前記通電前の蛍光強
度は前記プローブと前記標的との間のハイブリッド形成に相関する工程と、前記試験試料に電圧を印加する工程と、前記電圧印加中か印加後に前記試験試料の通電後の蛍光強度を測定し、前記プ
ローブと前記標的間のハイブリッド形成に関する第２決定値を提供する工程であ
って、前記通電後の蛍光強度は前記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に
相関する工程と、前記第１決定値と前記第２決定値とを比較しそれらの不一致が再試験を必要と
するものであるかどうかを評価する工程と、から成る方法を提供する。

【００１３】本発明はまた、配列特異的なハイブリッド形成を測定する方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、ハイブリダイゼーション媒質に前記プローブおよび前記標的を加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料に電圧を印加する工程と、前記電圧印加中か印加後に、前記プローブと前記標的との間の結合親和性と相
関する前記試験試料の信号を検出する工程と、前記標識と結合された少なくとも１つの基準プローブを含む基準試料が示す基
準信号に対して前記第１信号を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記
プローブおよび前記少なくとも１つの基準プローブの各々は、完全対合、１塩基
誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失、３塩基欠失か
らなる群から選択された異なるメンバーである工程と、前記較正から、前記プローブと前記標的間の対合の程度を決定する工程と、か
ら成る方法を提供する。

【００１４】（好ましい実施形態の詳細な説明）本発明は、標的とプローブ間の結合を測定する、迅速で、感度が高く、環境に
やさしくて、安全な方法を提供する。標的は核酸配列または核酸類似体の配列を
有し、プローブは核酸配列または核酸類似体の配列を有する。

【００１５】特定の先行技術と異なり、本発明はハイブリダイゼーションの存在を検出する
だけでなく、プローブと標的間のハイブリダイゼーションの性質に関する定性的
・定量的情報を提供する。従って、従事者は、完全対合、１つの塩基対誤対合、
２つの塩基対誤対合、３つの塩基対誤対合、１つの塩基対欠失、２つの塩基対欠
失および３つの塩基対欠失を、本発明によって区別することができる。

【００１６】本発明の実施形態は、第１のプローブ標的混合物について測定した信号（例え
ば、電流および／または蛍光強度）を、同じ標的と結合した他のプローブによっ
て示された同じ型の信号に対して較正することから成る。ここで、他のプローブ
の各々は、少なくとも１つの塩基だけ、第１のプローブと異なっている。

【００１７】所定の実施の形態では、前記信号を測定する前に、あるいは測定と同時に試料
に低い電圧が印加される。一般に、電圧は不完全に対合したハイブリダイゼーシ
ョン対を不安定にするには十分なほど高く、完全に対合したハイブリダイゼーシ
ョン対を不安定にするほどは高くないように選択される。所定の好ましい実施の
形態では、電圧は約１Ｖから約２０Ｖまでである。

【００１８】測定した信号（例えば、電流および／または蛍光強度）の大きさが標的とプロ
ーブ間の結合親和性の関数である検量線を生成することが可能である。標的と複
数の異なるプローブ間の結合親和性は、誤対合塩基の数、誤対合の性質（Ａ−Ｇ
対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション複合体の内部の誤対
合の位置等と共に変化するために、本発明の測定方法を、標的の配列決定を行う
ために使用することが可能である。

【００１９】測定した信号は例えば電気コンダクタンスとすることができる。そのような実
施の形態では、プローブと標的間の結合親和性は直接信号の大きさと相関する。
すなわち、コンダクタンスはプローブと標的間の対合の程度に伴い、好ましくは
０〜２の誤対合および／または欠失を含む範囲において、より好ましくは０〜３
の誤対合および／または欠失を含む範囲において増加する。

【００２０】他の実施の形態では、測定した信号は試験試料に含まれる蛍光発色団の蛍光強
度とすることができる。そのような実施の形態では、蛍光発色団が信号消光ある
いは信号増幅のいずれによりハイブリダイゼーションの信号を送るかにより、プ
ローブと標的間の結合親和性と強度とは正比例または反比例の関係となる。この
ように、挿入剤により発生する蛍光強度はプローブ−標的結合親和性と比例相関
し、プローブに共有結合により結合される挿入されない蛍光発色団を使用する実
施の形態の強度はプローブ−標的結合親和性と反比例相関する。蛍光強度はプロ
ーブと標的との間の対合の程度により、好ましくは０−２の誤対合および／また
は欠失を含む範囲において、より好ましくは０−３の誤対合および／または欠失
を含む範囲において増加する（あるいは非挿入剤では減少する）。

【００２１】発明者らは依然にハイブリダイゼーションに対しては蛍光強度測定法が好都合
であることを開示している（１９９９年１２月２１日に出願された米国特許出願
番号第０９／４６８，６７９号を参照のこと）。以下の実施例６に示すように、
試料に電場を印加すると測定法の分解能が増大する。

【００２２】さらに、本発明の特に好ましい実施の形態では、測定法は試料の少なくとも２
つの信号を測定する工程を含む。第１信号は好ましくは蛍光強度であり、第２信
号は好ましくはいくつかのコンダクタンス測定値から選択される（その逆も可）
。

【００２３】好ましい複数測定の実施の形態では、第１信号は第２信号と同じであっても異
なっていてもよい。測定した第１および第２信号が同じである場合、第２信号は
第１信号に対し及び／または第１信号を較正するために使用した同じ基準信号に
対し較正することができる。さらに、第１信号を測定した後第２信号を測定する
前に条件変化刺激を試験試料に加えることが好ましい。刺激はプローブと標的間
の不完全に相補的なハイブリダイゼーションにかなり影響するほど十分なもので
あるが、プローブと標的間の完全に相補的なハイブリダイゼーションに影響する
ほどには十分でないことが好ましい。

【００２４】例えば、本発明の特に好ましい実施の形態では、測定した第１信号は通電前蛍
光強度（すなわち、条件変化電圧を試験試料に印加する前に測定した強度）であ
り、測定した第２信号は通電後蛍光強度（すなわち、条件変化電圧を試験試料に
印加している間または印加後に測定した強度）である。

【００２５】前述の実施の形態における追加の測定により測定法の信頼性が増大し、疑わし
い結果について直ちに再試験することができる。少なくとも２つの測定値が一致
しないと、典型的には再試験が必要となるであろう。

【００２６】本発明はプローブと標的間の結合親和性の定量化を可能にする。そのような情
報は、最適化された結合特性を有するアンチセンス薬を設計することを含めた様
々な用途に有用であり得る。

【００２７】先行技術の方法と異なり、本発明の測定法は好ましくは均質である。測定は、
測定信号の大きさの検出に先立って自由プローブおよび標的からプローブ標的複
合体を分離せずに行うことが可能である。測定はゲル分離ステップを必要としな
いため、試験のスループットの大きな増加を可能にする。定量分析は単純かつ正
確である。従って、結合測定法は、多くの時間と費用を節約し、容易に自動化で
きる。さらに、結合測定法は、緩衝液、ｐＨ、イオン濃度、温度、インキュベー
ション時間、プローブ配列と標的配列の相対濃度、挿入剤濃度、標的配列の長さ
、プローブ配列の長さ、および考えられる補因子の必要条件のような結合変数を
、速やかに決定することを可能である。

【００２８】測定法は例えばウェル中、不浸透性表面上またはバイオチップ上の溶液中で実
行することができる。さらに、本発明の測定法は好ましくは、標的上のまたはプローブ上にシグナル
消光剤を提供せずに行われる。

【００２９】本発明の好ましい実施形態は、特にプローブと二本鎖標的間の三本鎖ハイブリ
ダイゼーションを検出し、標的を変性する必要性をなくす。ＰＮＡ（ペプチド核
酸）プローブは、特定のクラスの標的と共に三本鎖を形成することが知られてい
るが（例えばＥｇｈｏｌｍら、３６５Ｎａｔｕｒｅ５６６（１９９３）、
Ｔｏｍａｃら、１１８Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５５４４（１９９６）
参照）、本願発明者は該ＰＮＡプローブが一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡおよび
ＲＮＡ）プローブと二本鎖核酸（例えばｄｓＤＮＡ）標的との間に形成された三
本鎖を特に測定できることに驚いた。三本鎖の形成および／または安定化は試験
する試料中に挿入剤を存在させると増強する。

【００３０】本発明の測定法に使用される適切なプローブには、例えばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ
、ＰＮＡ、荷電していないまたは部分的に荷電されたバックボーンを有する他の
核酸類似体が含まれる。特定の実施の形態では逆平行プローブが好ましいが、Ｐ
ＮＡプローブは平行とすることもできる。８個から２０個までの塩基の長さを有
するプローブ配列が好まれる。なぜならそれが、原始核生物および真核生物のう
ちの最小の固有ＤＮＡ配列が見出される範囲だからである。１２〜１８個の塩基
から成るプローブは、ヒトゲノムにおける最小の固有配列の長さであるので、特
に好ましい。ある実施形態では、６〜３０塩基から成るプローブが最も好ましい
。しかしながら、ヌクレオチド配列を固有に識別するために結合する複数の非固
有の標的配列を有するヌクレオチド配列を検出するためには、複数のより短いプ
ローブを使用してもよい。プローブの長さは標的の長さと対合するように選択す
ることができる。

【００３１】本発明は、危険で、労力を要し、かつ使用に時間がかかる放射性のプローブの
使用を必要とせず、常に再生される必要はない。本発明のプローブは、好ましく
は、安全に使用でき、何年も安定している。従って、プローブを多量に作成また
は注文し、保存することが可能である。

【００３２】プローブと標的は共に標識されていないことが好ましい。しかし、他の実施形
態では、プローブに挿入剤が共有結合により結び付けられる。そのような実施形
態では、挿入剤は、プローブのいずれかの端部に好ましくは結び付けられる。

【００３３】別の実施形態では、挿入剤はプローブに共有結合によっては結び付けられない
が、非共有結合の様式でプローブに結合するという意味で、挿入剤を測定中にプ
ローブと標的の間に挿入することができる。

【００３４】本発明で使用される好ましい挿入剤としては、例えばＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ
−１、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２
、およびアクリジンが含まれる。一般に、挿入剤は、二本鎖および／または三本
鎖の核酸複合体の鎖の間に挿入可能な部分である。好ましい実施形態では、挿入
剤（またはその構成要素）は、核酸がない条件では本質的に非蛍光性であり、適
切な波長の放射線によって挿入および励起された時には蛍光を発し、二本鎖また
は三本鎖の核酸複合体に挿入された時には１００倍〜１０，０００倍の蛍光の増
強を示す。

【００３５】他の実施形態では、挿入剤は、適切な波長の放射線により挿入および励起され
た時に、蛍光波長の変化を示し得る。正確な蛍光波長は、挿入される核酸の構造
に依存し得る（例えば、ＤＮＡ対ＲＮＡ、二本鎖対三本鎖等）。

【００３６】励起波長は、使用されている蛍光発色団の励起最大値に対応させるために、（
日常的な実験および／または慣習的な知識によって）選択され、好ましくは２０
０〜１０００ｎｍである。挿入剤は２００〜１０００ｎｍの発光波長を有するよ
うに好ましくは選択される。好ましい実施形態では、４００〜５４０ｎｍの波長
を有する光で蛍光発色団を照射するためには、アルゴンイオンレーザーが使用さ
れ、蛍光の放出は５００〜７５０ｎｍの範囲で検出される。

【００３７】本発明の測定法は、例えば５〜８５℃のような種々の温度にわたって行うこと
が可能である。ある先行技術の測定法では、高い温度が必要とされるため、測定
のコストと遅れを増すこととなっている。他方、本発明は室温またはそれより低
い温度（例えば２５℃未満の温度）で行うことが可能である。

【００３８】本発明の測定法は非常に感度が高いため、標的のＰＣＲ増幅を行う必要性がな
い。例えば、少なくとも蛍光強度実施形態では、体積が約２０μｌの試験試料（
約１０フェムトモルの標的と約１０フェムトモルのプローブを含む）を測定する
ことが可能である。本発明の実施形態は、５×１０^−９Ｍの濃度、好ましくは多
くて５×１０^−１０Ｍの濃度の標的を測定するのに十分な程度に感度が高い。本
発明の実施形態は５×１０^−９Ｍの濃度、好ましくは多くて５×１０^−１０Ｍの
濃度のプローブを使用するのに十分な程度に感度が高い。

【００３９】導電率測定により、４０μｌ中に約１ｐｍｏｌｅのプローブと１ｐｍｏｌｅの
標的という少ない量しか含まない試料を識別できる。試料体積を減少させると、
プローブと標的の使用量をさらに減少させることができる。

【００４０】上記の値が、該方法がそれより高い濃度を検出できないことを示唆する意味で
はないことは言うまでもない。試験されるプローブおよび標的濃度のそれぞれにおいて広範囲の挿入剤濃度が
許容される。例えば、５×１０^−１０Ｍのプローブと５×１０^−１０Ｍの標的と
をハイブリダイズさせる場合、挿入剤ＹＯＹＯ−１の最適濃度は２５ｎＭから２
．５ｎＭの範囲である。プローブおよび標的のどちらともが５×１０^−８Ｍであ
る場合、好ましいＹＯＹＯ−１濃度は１０００ｎＭから１００ｎＭである。

【００４１】この測定法は十分感度が高く、１塩基対誤対合プローブ−標的複合体と２塩基
対誤対合プローブ−標的複合体、好ましくは２塩基対誤対合プローブ−標的複合
体と３塩基対誤対合プローブ−標的複合体とを識別することができる。当然、こ
の測定法は十分感度が高く、完全に対合したプローブ−標的複合体と上記誤対合
した任意の複合体とを識別することができる。

【００４２】ハイブリダイゼーション媒質はヌクレオチドを保存するのに適していることで
知られている任意の従来の媒質であってよい。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら， ”
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂＭａｎｕａｌ，”第２巻
（１９８９年）を参照されたい。例えば、液体媒質には、ヌクレオチド、水、緩
衝液および標準塩濃縮液が含まれ得る。

【００４３】相補的塩基間のハイブリダイゼーションは、温度、塩濃度、静電気強度および
緩衝液組成を変化させた、種々の条件下で起こる。そのような条件と、該条件を
適用する方法は、当該技術分野で周知である。

【００４４】約１５℃〜約２５℃の温度、約１分〜約５分間で、ハイブリダイゼーション複
合体を形成することが好まれる。それより長い反応時間は必要でないが、数時間
インキュベーションしたとしてもハイブリダイゼーション複合体には悪影響を及
ぼさないだろう。

【００４５】（特に挿入剤を含む実施の形態では必要ではないが）ある試薬の使用によって
、溶液でのハイブリダイゼーションを促進することは可能である。そのような試
薬の好ましい例としては、ＲｅｃＡタンパク質、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合タンパク質、核酸主溝または核酸小溝結合タ
ンパク質；二価イオン；多価イオン；ビオロゲン；ならびに臭化エチジウム、ア
クチノマイシンＤ、ソラレンおよびアンゲリシン等の挿入物質が含まれる。その
ような促進試薬は、例えば異常なｐＨレベルや極端な高温下での、極端な操作条
件において有用であることが判明し得る。

【００４６】本発明の測定法は、例えば、折り畳まれたヌクレオチド配列中のアクセス可能
な領域を同定したり、ハイブリダイゼーション複合体中の誤対合塩基対の数を決
定したり、ゲノム地図を作成したりするために使用可能である。

【００４７】挿入剤を使用して蛍光強度を検出する実施の形態では、強度はプローブと標的
間の結合親和性が増加するのに伴い増加する。非挿入蛍光発色団を用いて蛍光強
度を検出する実施の形態では、強度はプローブと標的間の結合親和性が増加する
のに伴い減少する。蛍光発色団が挿入されるかどうかに関わらず、本願にかかる
方法では、蛍光異方性法とは異なり蛍光の偏光を測定する必要がない。

【００４８】本発明を以下の実施例を参照しながらより詳細に説明するが、本発明が実施例
に限定されないことを理解すべきである。本発明を、同様な参照数字が同様な要素のことを指す以下の図面に関連付けて
説明する。

【００４９】（実施例）実施例１ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０由来のセンスとアンチセンス５０ｍ
ｅｒｓｓＤＮＡ標的配列（Ｎａｔｕｒｅ３８０２０７（１９９６年））を
、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。等モルの量の相補的オ
リゴヌクレオチドを９５℃で１０分間変性し、温度が２１℃まで１．５時間にわ
たって冷却されるにつれて、徐々にアニールさせた。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ
）オリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ_２Ｏに溶解した
。

【００５０】野生型標的ＤＮＡのセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）：５’
−ＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴ
ＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡ−３’。

【００５１】野生型標的ＤＮＡのアンチセンス鎖は以下の配列を有していた（配列番号１）
：５’−ＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡ
ＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡ−３
’。

【００５２】ｄｓＤＮＡ（配列番号１）の予想融点（Ｔ_ｍ）は６５．２℃である。アミノ酸５０７位置の野生型配列ＣＡＴがＣＧＴに変化する１つの塩基対変異
（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じ５０ｍｅｒの変異型
ｄｓＤＮＡ標的配列を、配列番号２とした。

【００５３】配列番号２のセンス鎖は、以下の配列を有していた：５’−ＴＧＧＣＡＣ
ＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴ
ＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡ−３’。

【００５４】配列番号２のアンチセンス鎖は、以下の配列を有していた：５’−ＴＡＴＡ
ＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴ
ＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡ−３’。

【００５５】ｄｓＤＮＡ（配列番号２）の予想融点は（Ｔ_ｍ）６６．０℃である。アミノ酸５０６，５０７位置の野生型配列ＣＡＴがＡＣＴに変化する連続する
２つの塩基対変異（下線）を除いて、野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）と同じ５
０ｍｅｒ変異型ｄｓＤＮＡ標的配列を配列番号３とした。

【００５６】配列番号３のセンス鎖は以下の配列を有していた；５’−ＴＧＧＣＡＣＣ
ＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴ
ＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡ−３’。

【００５７】配列番号３のアンチセンス鎖は以下の配列を有していた：５’−ＴＡＴＡＴ
ＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡ
ＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡ−３’。

【００５８】ｄｓＤＮＡ（配列番号３）の予想融点（Ｔ_ｍ）は６５．２℃である。実施例で使用するＰＮＡ（ペプチド核酸）プローブを合成し、ＨＰＬＣで精製
し、ＣｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国バージ
ニア州リッチモンド所在）の質量分析法により確認した。ＰＮＡプローブは、最
初、１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるよう０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に溶解
し、次に、ｄｄＨ_２Ｏの追加により１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。最終ＰＮＡ溶液
は１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度（ｄｄＨ_２Ｏ溶液）に調製した。

【００５９】第１番プローブは、５０ｍｅｒ野生型標的ＤＮＡ（配列番号１）のセンス鎖の
１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的となるよう設計された１５ｍｅｒ逆
平行ＰＮＡプローブだった。第１番プローブは、アミノ酸５０５〜５１０位置（
Ｎａｔｕｒｅ３８０、２０７（１９９６年）がオーバラップしている。第１番
プローブは以下の構造（配列番号８）を有していた：５’−Ｈ−ＣＡＣＣＡＡ
ＡＧＡＴＧＡＴＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ_２−３’。

【００６０】ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は下記を含有していた：２ｐ
ｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌｅｓのＰＮＡプローブ、０．５ＸＴ
ＢＥ、および２５０ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン所在）。試料を３ｍｍの石英キュベット
に入れ、１また５ボルトのＤＣ（Ｖ）を１５秒通電した。電流測定法は溶液への
電圧の印加中における電流のモニタリング工程を含む。各溶液中には温度プロー
ブを配置し、電流測定時の温度を測定した。１ボルトでは、通電の最初の２秒中
に電流ピークが観察された。電流はその後１３秒にわたり急激に減少した。５ボ
ルトを印加する実験では、電流は全通電期間（１５秒）にわたり比較的安定なま
まであった。

【００６１】一連の実験を実行した。それらの実験では、コンダクタンス値が、ＤＮＡまた
はＰＮＡが存在しない時（対照標準）、または野生型配列番号１、変異型配列番
号２もしくは変異型配列番号３が第１番の逆平行ＰＮＡプローブと反応した時に
観察された。図１Ａ，１Ｂはそれぞれの実験におけるコンダクタンスに対し得ら
れたデータをプロットしたものである。図１Ａは１Ｖの印加における結果、図１
Ｂは５Ｖの印加における結果を示したものである。完全に相補的な配列（配列番
号１＋第１番のプローブ）から成る二本鎖ＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド三本鎖は
、最大のＹＯＹＯ−１挿入を許容し、これにより１Ｖの印加１５秒間全体を通し
て最も高いコンダクタンス値（図において負の電流値として示した）が生じた。
電圧印加の最初の１秒間では、逆平行ＰＮＡプローブと１塩基対誤対合のｄｓＤ
ＮＡ（配列番号２＋第１番プローブ）および２塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ（配列
番号３＋第１番プローブ）との三本鎖ハイブリダイゼーションに対する正規化ピ
ークコンダクタンスはそれぞれ、完全に対合したｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイ
ブリッド（配列番号１＋第１番プローブ）において観察されたものより７９％、
９６％だけ低かった（図１Ａ）。全１５秒の電圧印加にわたりコンダクタンス値
を平均すると、完全に相補的な三本鎖と塩基対の誤対合を含む三本鎖との間では
、同様の割合のコンダクタンスの減少が見られた。図１Ａでは、１塩基対および
２塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドの平均コンダクタンス値がそ
れぞれ、完全に対合したｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドに対する平均コンダク
タンス値よりも６５％、９１％だけ低いという結果が得られた。図１Ａに示した
実験は全て室温（２３℃）で実行した。プローブと二本鎖標的間の誤対合の程度
が増加するにつれて、ＹＯＹＯ−１による挿入のレベルは減少し、コンダクタン
スのレベルが低下した。上述した実験を繰り返し、より高い電圧（５Ｖ）を印加
した場合にもこの関係が観察された。５Ｖ印加中、１塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ
：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第１番プローブ）および２塩基対誤対合のｄｓＤ
ＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋第１番プローブ）の正規化した平均コンダク
タンス値はそれぞれ、完全に対合したｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋
第１番プローブ）で観察された値よりもそれぞれ５２％、６７％だけ低かった（
図１Ｂ）。図１Ｂに示した実験は室温（２３℃）で実行した。

【００６２】温度を５０℃および６５℃まで上昇させて実験を繰り返すと、同様の電流測定
値が観察された。５０℃で、完全に対合したｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番
号１＋第１番プローブ）に１Ｖを１５秒間印加すると、−０．２５μＡｍｐの平
均電流が得られ、１塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第
１番プローブ）では−０．１５μＡｍｐ（４０％の減少）、２塩基対誤対合のｄ
ｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋第１番プローブ）では−０．０６μＡｍ
ｐ（７６％の減少）であった（図１Ｃ）。６５℃では、１Ｖの電気を１５秒印加
すると同様のことが観察された。完全に対合した核酸ハイブリッドでは−０．３
７μＡｍｐの平均電流が得られ、１塩基対および２塩基対誤対合のハイブリッド
ではそれぞれ−０．１６μＡｍｐ（５７％の減少）、−０．０１μＡｍｐ（９７
％の減少）が得られた（図１Ｃ）。高温で５Ｖ印加すると類似した結果が得られ
た。５０℃で実験を行うと、生じる平均電流は、完全に対合したハイブリッドで
は−０．２７ｍＡｍｐ、１塩基対誤対合のハイブリッドでは−０．１３ｍＡｍｐ
（５２％の減少）、２塩基対誤対合のハイブリッドでは−０．０８ｍＡｍｐ（７
０％の減少）であった。６５℃で実験を行うと、生じた平均電流は、完全に対合
したハイブリッドでは−０．３１ｍＡｍｐ、１塩基対誤対合のハイブリッドでは
−０．１４ｍＡｍｐ（５５％の減少）、２塩基対誤対合のハイブリッドでは−０
．１０ｍＡｍｐ（６８％の減少）であった（図１Ｄ）。前述した実験全てにおい
て、ｄｓＤＮＡは第１番の逆平行ＰＮＡプローブとの三本鎖ハイブリダイゼーシ
ョン前には変性させなかった。

【００６３】ハイブリダイゼーション混合物を６５℃まで加熱し、直ちに冷却した後、同様
の実験を様々な温度で実行した。室温（２３℃）まで冷却した後、完全に対合し
た試料（配列番号１＋第１番プローブ）に１Ｖを１５秒間印加すると、−０．１
８μＡｍｐの平均電流が得られた。比較すると、１塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：
ＰＮＡ三本鎖ハイブリッド（配列番号２＋第１番プローブ）では−０．０６μＡ
ｍｐ（６７％の減少）、２塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッ
ド（配列番号３＋第１番プローブ）では−０．０５μＡｍｐ（７２％の減少）が
得られた（データは示さない）。試料を６５℃から５０℃まで冷却した場合、そ
の後１Ｖを１５秒間印加すると同様な観察がなされた。完全に対合した試料（配
列番号１＋第１番プローブ）では−０．２３μＡｍｐの平均電流が得られた。対
照的に、１塩基対誤対合の試料では−０．１１μＡｍｐ（５２％の減少）、２塩
基対誤対合の試料では−０．０１μＡｍｐ（９６％の減少）が得られた（データ
は示さない）。２３℃または５０℃まで冷却した後５Ｖを印加すると、完全に対
合した三本鎖ハイブリッド（配列番号１＋第１番プローブ）、１塩基対誤対合の
三本鎖ハイブリッド（配列番号２＋第１番プローブ）、および２塩基対誤対合の
三本鎖ハイブリッド（配列番号３＋第１番プローブ）において発生した平均電流
はそれぞれ、２３℃では−０．１５ｍＡｍｐ、−０．０９ｍＡｍｐ（４０％の減
少）、−０．０７ｍＡｍｐ（５３％の減少）、５０℃では−０．２３ｍＡｍｐ、
−０．０９ｍＡｍｐ（６１％の減少）、−０．０９ｍＡｍｐ（６１％の減少）で
あった（データは示さない）。

【００６４】逆平行ＰＮＡプローブを使用した場合、６５℃（５０ｍｅｒｄｓＤＮＡ
配列のＴ_ｍ）でハイブリダイゼーション混合物の前処理を行いその後冷却しても
、（６５℃で予め加熱せず）２３℃または５０℃で直接測定した完全に相補的な
ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖と１塩基対または２塩基対の誤対合を含む三本鎖との
間で観察されたコンダクタンスの差にはそれほど影響しなかった。明らかにＤＮ
Ａ挿入剤ＹＯＹＯ−１の存在下では逆平行ＰＮＡプローブはｄｓＤＮＡ標的と三
本差構造を形成できた。低レベルの電気（例えば１Ｖまたは５Ｖ）を印加すると
、完全に対合したｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖配列を１塩基対または２塩基対の変
異を含む三本鎖配列から予め変性せずに区別することができた。

【００６５】（実施例２）図２は、本発明の電流測定法により、ＰＮＡプローブを標的ＤＮＡ配列に対し
平行方向に使用した場合に、完全対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッドと
、１，２塩基対誤対合を含むｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖ハイブリッドとを区別す
ることもできることを実証する。第２番プローブは第１番プローブと配列が同じ
１５ｍｅｒＰＮＡプローブであるが、従来の逆平行方向ではなく、標的ＤＮ
Ａ配列の平行方向で対合するように合成した。第２番プローブは以下の構造（配
列番号９）を有していた：５’−Ｈ−ＴＡＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＣＡＣ
−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨ_２−３’

【００６６】第１番プローブの代わりに第２番プローブを使用したことを除き実施例１に記
述したのと同じ測定条件を用いて実験を行った。１Ｖを印加すると、１塩基対誤
対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号２＋第２番プローブ）、連続する２
塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号３＋第２番プローブ）の平
均電流はそれぞれ、完全対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（配列番号１＋第２番
プローブ）の対合温度で観察された値よりも、２３℃で２５％、３２％、５０℃
で２８％、５３％だけ低かった（図２Ａ）。

【００６７】（１Ｖの代わりに）５Ｖを１５秒間印加した場合も同様の結果が得られた。完
全対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドで発生した平均電流は２３℃、５０℃
、６５℃でそれぞれ−０．１５ｍＡｍｐ、−０．２４ｍＡｍｐおよび−０．１７
ｍＡｍｐであった（図２Ｂ）。１塩基対誤対合および２塩基対誤対合の不完全に
相補的な三本鎖で発生した平均電流は完全対合のハイブリッド試料により達成さ
れた値よりも、それぞれ、２３℃では２７％（−０．１１ｍＡｍｐ）および５３
％だけ低く（−０．０７ｍＡｍｐ）、５０℃では２１％（−０．１９ｍＡｍｐ）
および４６％だけ低く（−０．１３ｍＡｍｐ）、６５℃では変わらない（−０．
１７ｍＡｍｐ）のと１８％だけ低かった（−０．１４ｍＡｍｐ）（図２Ｂ）。

【００６８】図２Ａおよび２Ｂに示された結果から、第２番平行ＰＮＡプローブを使用する
と、完全対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖と１塩基対または２塩基対誤対合を含
むｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖との間で得られる導電率の差は第１番逆平行プロー
ブを用いて得られる差（図１）より顕著ではない。

【００６９】しかしながら、第２番平行プローブを用い、試料を６５℃まで加熱し直ちに冷
却した後に５Ｖを印加する実験では、電流測定により、完全対合のｄｓＤＮＡ：
ＰＮＡ三本鎖と１塩基対または２塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖との
間の信号の差が増強されることが証明されている。完全対合のハイブリッド（配
列番号１＋第２番プローブ）、１塩基対誤対合のハイブリッド（配列番号２＋第
２番プローブ）、２塩基対誤対合のハイブリッド（配列番号３＋第２番プローブ
）で得られた平均コンダクタンス値はそれぞれ、２３℃では−０．１９ｍＡｍｐ
、−０．０８ｍＡｍｐ、−０．０６ｍＡｍｐ、５０℃では−０．１７ｍＡｍｐ、
−０．０９ｍＡｍｐ、−０．０７ｍＡｍｐ、６５℃では−０．２３ｍＡｍｐ、−
０．１３ｍＡｍｐ、−０．０８ｍＡｍｐであった。これは言い換えると、完全に
相補的な試料で得られる値と比べると、１塩基対および２塩基対誤対合の試料で
はそれぞれ、導電率が２３℃では５８％および６８％、５０℃では４７％および
５９％、６５℃では４３％および６５％減少したことになる（図２Ｃ）。

【００７０】そのため、電流測定法では逆平行および平行ＰＮＡプローブのどちらも完全に
相補的なｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本標的と１塩基対または２塩基対変異を含む不完
全に相補的なｄｓＤＮＡ標的との間の区別を行うことができる。

【００７１】（実施例３）第３番プローブは１５ｍｅｒの第１番逆平行ＰＮＡプローブと配列および方
向が同じ１５ｍｅｒｓｓＤＮＡプローブであった（配列番号８）。第３番プ
ローブは以下の構造を有していた：５’−ＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴ
ＡＴ−３’

【００７２】予め変性させずに、第３番ｓｓＤＮＡプローブと５０ｍｅｒの野生型配列およ
び変異ｄｓＤＮＡ標的配列とを反応させることにより、電流測定法の特異性につ
いてさらに試験した。測定条件は実施例１に記述したのと同一にした。

【００７３】ＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１により増強され、ｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖が
３０℃から６５℃の間で形成された。１Ｖで処理すると、配列番号１＋第３番プ
ローブからなる完全対合のＤＮＡ三本鎖ではもっとも高い導電率値が得られた（
図３Ａ）。対照的に、１塩基対誤対合（配列番号２＋第３番プローブ）と連続２
塩基対誤対合（配列番号３＋第３番プローブ）が形成される不完全に相補的なプ
ローブと標的の組合せでは、平均コンダクタンス値がそれぞれ、対合温度におい
て完全に相補的な配列で観察される値に比べ２３℃では１４％および６４％だけ
低く、５０℃では３０％および７０％低く、６５％では２５％および７２％だけ
低かった（図３Ａ）。これらの試料により高い電圧（５Ｖ）を印加すると、完全
対合の試料と誤対合の試料間で観察される電流測定差が１Ｖで得られたものより
大きくなった（特に、温度がより低い場合そうであった）。５Ｖで１５秒間処理
した後では、１塩基対誤対合のＤＮＡ三本鎖と２塩基対誤対合のＤＮＡ三本鎖に
対する平均電流はそれぞれ、対合温度で完全対合のＤＮＡ三本鎖で観察された値
に比べ２３℃では５４％および７８％だけ低く、５０℃では６８％および７０％
だけ低く、６５℃では３３％および６１％だけ低かった。

【００７４】同様の電気実験では、ハイブリダイゼーション混合物を６５℃まで加熱し、こ
の温度で維持するか、あるいは１Ｖまたは５Ｖ印加する前に直ちに５０℃または
２３℃まで冷却した。完全対合のＤＮＡ三本鎖配列（配列番号１＋第３番プロー
ブ）を１Ｖで１５秒間処理すると、２３℃、５０℃および６５℃で最も高いコン
ダクタンス値が得られた（図３Ａ）。１塩基対誤対合または２塩基対誤対合を含
むＤＮＡ三本鎖（それぞれ、配列番号２＋第３番プローブ、配列番号３＋第３番
プローブ）は導電性がそれぞれ、２３℃では２１％および６３％だけ低く、５０
℃では１８％および７４％だけ低く、６５℃では１２％および１０６％だけ低か
った（図３Ａ）。同様に、予め加熱した試料に５Ｖを１５秒間印加すると、１塩
基対誤対合のＤＮＡ三本鎖と２塩基対誤対合のＤＮＡ三本鎖の平均コンダクタン
ス値はそれぞれ、完全対合のＤＮＡ三本鎖で得られた平均コンダクタンス値に比
べ、２３℃では２４％および１０４％だけ、５０℃では４２％および４４％だけ
、６５℃では３８％および１０２％だけ減少した（図３Ｂ）。

【００７５】逆平行ＰＮＡプローブ（図１）およびｓｓＤＮＡプローブ（図３）の挙動が電
流測定法において同様の様式であるという観察から、プローブとして使用した核
酸全体のバックボーンは特に重要ではないことが示唆された。ＹＯＹＯ−１が存
在すると、ｄｓＤＮＡ標的およびｓｓＤＮＡプローブは溶液中の標的とプローブ
間の配列相補性のレベルに依り異なる電荷を生じさせることができる三本鎖へリ
ックス構造を形成することができた。プローブと標的との間の誤対合の程度が増
加するに伴い、コンダクタンスのレベルは減少した。これにより予め変性せずに
天然のＤＮＡプローブを使用した場合の電流測定法の信頼性が証明された。

【００７６】（実施例４）実施例１から３までに説明した電流測定法では、ＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１を
ハイブリダイゼーション混合物を含む溶液に添加した。ＹＯＹＯ−１の挿入によ
りｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖およびｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ三本鎖の形成が容易
になった。電流測定法においてｓｓＤＮＡプローブと共有結合によりつながれた
挿入剤部分を使用する可能性について実施例４で評価した。

【００７７】アクリジンは他のｄｓＤＮＡ挿入剤であり、三本鎖核酸構造中に挿入されるこ
とができ、このため三本鎖へリックス構造が安定化される。例えば、Ｋｕｋｒｅ
ｔｉらの「三本鎖へリックス形成のために有効なＤＮＡ配列範囲の拡張：アクリ
ジン含有オリゴヌクレオチドによる誤対合した三本鎖の安定化」、２５Ｎｕｃ
ｌｉｅｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ４２６４−４２７０（１９９７）を
参照のこと。３’端に共有結合により結合されたアクリジン分子を含むｓｓＤＮ
Ａプローブ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ、米国バージニア州スターリング所在
）をＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、ＨＰＬＣにより精製した。

【００７８】第４番プローブは、１５ｍｅｒの第３番プローブと配列および方向が同じ１５
ｍｅｒｓｓＤＮＡプローブであり、そのため１５ｍｅｒの逆平行ＰＮＡ第１番
プローブ（配列番号８）とも配列および方向が同じであったが、３’位置にアク
リジンが追加された。第４番プローブは５’−ＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡ
ＴＡＴ−アクリジン−３’の構造を有していた。

【００７９】ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は以下のものを含んだ：２ｐ
ｍｏｌｅの標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌｅの第４番ｓｓＤＮＡプローブおよび０
．５ＸＴＢＥ。試料を３ｍｍ石英キュベットに入れ、２３℃で、５ＶＤＣを
１１秒間通電した。電流および温度を実施例１で説明したようにモニタした。

【００８０】図４に示されるように、第４番ｓｓＤＮＡ配列プローブは共有結合により結び
つけられたアクリジン部分が安定して挿入されるため５０ｍｅｒの完全対合し
たｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）とハイブリダイズすることができ、−０．５３
ｍＡｍｐの平均電流が生じた。対照的に、１塩基対誤対合（配列番号２＋第４番
プローブ）または２塩基対誤対合（配列番号３＋第４番プローブ）を含む安定性
のより低いＤＮＡ三本鎖の平均電流はそれぞれ、対照標準（標的ＤＮＡを含まな
い第４番プローブ）に対し正規化すると、完全対合のＤＮＡ配列三本鎖で得られ
た平均電流に比べ５２％および６６％だけ低かった。

【００８１】そのため、ｓｓＤＮＡプローブに結合されたアクリジンは、電流測定法におい
て標的とプローブ間の配列相補性のレベルに応じて異なる電流を発生させる三本
鎖ＤＮＡへリックスを形成する場合に、結合のないＹＯＹＯ−１と同じくらい有
効であった。

【００８２】（実施例５）ヒト膵嚢胞性線維症遺伝子のエクソン１０由来のセンスとアンチセンス１５ｍ
ｅｒｓｓＤＮＡ標的配列を、実施例１で説明したように合成し、精製し、アニ
ールした。ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを、１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄ
Ｈ_２Ｏに溶解した。

【００８３】配列番号４は第１番プローブに完全に相補的になるように設計された、配列番
号１に由来する１５ｍｅｒｄｓＤＮＡ標的配列であった。野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡＴＣＡ
ＴＣＴＴＴＧＧＴＧ−３’であった。

【００８４】野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣＣ
ＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴ−３’であった。ｄｓＤＮＡ（配列番号４）の予想融点（Ｔ_ｍ）は４０．０℃である。配列番号５は、配列ＴＴＴをＴＡＴに変更した１塩基対の変化（下線）を除い
て野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）と同一な、１５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標
的配列であった。

【００８５】変異型標的ＤＮＡ（配列番号５）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡＴＣＡ
ＴＣＴＡＴＧＧＴＧ−３’であった。変異型標的ＤＮＡ（配列番号５）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣＣ
ＡＴＡＧＡＴＧＡ−３’であった。

【００８６】ｄｓＤＮＡ（配列番号５）の予想融点（Ｔ_ｍ）は４０．０℃である。配列番号６は、配列ＡＴＣをＧＧＣに変更した連続２塩基対の変化（下線）を
除いて野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）と同一な、１５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮ
Ａ標的配列であった。

【００８７】変異型標的ＤＮＡ（配列番号６）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡＴＣＧＧＣＴＴＴＧＧＴＧ−３’であった。変異型標的ＤＮＡ（配列番号６）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣＣ
ＡＡＡＧＣＣＧＡＴＡＴ−３’であった。

【００８８】ｄｓＤＮＡ（配列番号６）の予想融点（Ｔ_ｍ）は４４．０℃である。配列番号７は、３つの１塩基対変異が互いに３塩基対だけ離れている不連続の
３塩基対の変化（下線）を除いて野生型標的ＤＮＡ（配列番号４）と同一な、１
５ｍｅｒの変異型ｄｓＤＮＡ標的配列であった。配列ＡＴＣ、ＴＣＴおよびＴＧ
ＧをそれぞれＡＣＣ、ＴＡＴおよびＴＡＧに変更した。

【００８９】変異型標的ＤＮＡ（配列番号７）のセンス鎖の配列は５’−ＡＴＡＣＣＡ
ＴＡＴＴＴＡＧＴＧ−３’であった。変異型標的ＤＮＡ（配列番号７）のアンチセンス鎖の配列は５’−ＣＡＣＴＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴ−３’であった。

【００９０】ｄｓＤＮＡ（配列番号７）の予想融点（Ｔ_ｍ）は３８．０℃である。ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は下記のものを含んでいた：
２ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、２ｐｍｏｌｅｓの第２番平行ＰＮＡプローブ
、０．５ＸＴＢＥおよび２５０ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。反応混合物
を９５℃で５−１０分間インキュベートし変性させ、その後測定まで６５℃で維
持した。試料を石英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオ
ンレーザービームで照射し、６５℃における蛍光放出についてモニタした。試料
の同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プロー
ブにより達成された。最大蛍光強度は５３６ｎｍの波長で得られ、ＰＮＡ：ＤＮ
Ａハイブリッド中へのＹＯＹＯ−１の挿入が示された。第２の測定として、各試
料に最初のレーザ照射を行った後、同じ試料に１ＶＤＣを４秒間通電した。通
電の最終秒中に、試料の２度目の照射をアルゴンイオンレーザーを用いて行い、
６５℃における蛍光放出についてモニタした。分析した各試料に対し、蛍光強度
を波長の関数としてプロットした。

【００９１】完全に相補的な配列（配列番号４＋第２番プローブ）からなるｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッドにおいて最大のＹＯＹＯ−１の挿入が可能となり、もっとも高
い蛍光強度が得られた（図５Ａ）。１塩基対誤対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブ
リッド（配列番号５＋第２番プローブ）、連続２塩基対誤対合のｓｓＤＮＡ：Ｐ
ＮＡハイブリッド（配列番号６＋第２番プローブ）、不連続の３塩基対誤対合の
ｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッド（配列番号７＋第２番プローブ）の蛍光強度は
すべて、６５℃で、完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドにおいて観察さ
れた蛍光強度よりも低かった（図５およびデータは示さない）。プローブと標的
との間の誤対合の程度が増加するにつれ、ＹＯＹＯ−１の挿入のレベルが減少し
、蛍光強度のレベルが減少した。ＤＮＡおよびＰＮＡが存在しない（ＹＯＹＯ−
１のみである）と蛍光のバックグラウンドレベルのみが観察された（図５Ａ）。

【００９２】完全対合のｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドに１Ｖの電気を４秒間６５℃で印
加しても、蛍光強度はかなり一定のままで、２％だけ減少した（図５Ａ）。対照
的に、１塩基対誤対合（図５Ｂ）、２塩基対誤対合（図５Ｃ）、および３塩基対
誤対合（図示しない）を含む不完全に相補的な二本鎖に１Ｖを印加すると、得ら
れた蛍光強度はそれぞれ、通電なしで照射した同じ試料で達成された値よりも１
８％、３９％および７１％だけ低かった。低レベルの電気（例えば１Ｖ）で処理
すると、さらに塩基対誤対合を含むｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイブリッドの安定性が
減少した。プローブと標的との間の配列相補性の程度が減少するにつれ、電気が
存在すると蛍光強度が著しく減少し、このため、完全対合の配列と１塩基対、２
塩基対または３塩基対変異を含む配列とを区別できる信頼性の高い正確な第２の
測定法が提供される。

【００９３】（実施例６）実施例５のハイブリダイゼーション測定法はｄｓＤＮＡ標的配列の変性後に実
行され、ｄｓＤＮＡ標的の融点（Ｔ_ｍ）より高い温度でｓｓＤＮＡ：ＰＮＡハイ
ブリッド形成が測定された。実施例６は、予め変性を行わずに、電気が存在する
場合および存在しない場合において、完全対合と塩基対誤対合とを区別する蛍光
強度測定法の信頼性を証明するものである。

【００９４】ハイブリダイゼーション反応混合物（８０μｌ）は下記のものを含んでいた：
４ｐｍｏｌｅｓの標的ｄｓＤＮＡ、４ｐｍｏｌｅｓの第１番逆平行ＰＮＡプロー
ブ、０．５ＸＴＢＥおよび２５０ｎＭのＤＮＡ挿入剤ＹＯＹＯ−１。試料を石
英キュベットに入れ、４８８ｎｍの波長を有するアルゴンイオンレーザービーム
で８０ｍｓｅｃ間照射し、２３℃における蛍光放出についてモニタした。試料の
同時温度測定は、各試料内に直接配置された、ソフトウェア制御の温度プローブ
により達成された。最大蛍光強度は５３６ｎｍの波長で得られ、ＰＮＡ：ＤＮＡ
ハイブリッド中へのＹＯＹＯ−１の挿入が示された。第２の測定として、各試料
に最初のレーザ照射を行った後、同じ試料に２０ＶＤＣを４秒間通電した。３
秒通電した後直ちに、試料の２度目の照射をアルゴンイオンレーザーを用いて８
０ｍｓｅｃ間行い、２３℃における蛍光放出についてモニタした。分析した各試
料に対し、蛍光強度を波長の関数としてプロットした。

【００９５】挿入剤ＹＯＹＯ−１により増強され、ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖が２３℃で形
成された。野生型５０ｍｅｒｄｓＤＮＡ標的配列（配列番号１）が１５ｍｅｒ
第１番逆平行ＰＮＡプローブとハイブリダイズされた場合最も高い蛍光強度が
達成された（図６）。対照的に、１塩基対誤対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖（
配列番号２＋第１番プローブ）および連続２塩基対誤対合ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三
本鎖（配列番号３＋第１番プローブ）に対する蛍光強度はそれぞれ、完全対合の
ｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖に対し２３℃で観察された蛍光強度よりも６０％、９
１％だけ低かった（図６）。ＹＯＹＯ−１を含む反応混合物中にＤＮＡおよびＰ
ＮＡが存在しないと、蛍光のバックグラウンドレベルのみが観察された。

【００９６】完全に相補的な三本鎖と１塩基対または２塩基対誤対合三本鎖との間の蛍光強
度の差は、完全対合の二本鎖と不完全に相補的な二本鎖との間で達成される差よ
りもかなり大きかった（図５および６を比較せよ）。明らかに、三本鎖形成の蛍
光強度測定法では、塩基対誤対合を検出する識別能力が増強した。

【００９７】さらに、二次的な電気の印加により野生型配列と変異配列との間の区別も可能
となった。完全対合のｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖を３秒間２０Ｖで処理すると、
電気処理を行っていない同じ試料で達成されたものと視覚的に同一な蛍光強度ス
ペクトルが得られた（図６）。しかしながら、１塩基対誤対合および２塩基対誤
対合を含む不完全に相補的な三本鎖に２０Ｖを３秒間印加すると、得られた蛍光
強度はそれぞれ、電気無しで照射した同じ試料で得られた蛍光強度よりも２３％
および７１％だけ低かった（図６）。２０Ｖの電気処理では、完全に相補的な三
本鎖の安定性は影響されなかったが、プローブと標的間の配列相補性の程度に依
存するレベルで塩基対誤対合を含むｄｓＤＮＡ：ＰＮＡ三本鎖の安定性は弱くな
った。そのため、蛍光強度測定法に電気印加を適用すると、配列を予め変性させ
ずに、野生型配列と１塩基対または２塩基対の変異を含む配列とを識別するより
信頼性の高い測定法が提供された。

【００９８】本発明を詳細かつその特定の例を参照しながら説明してきたが、当業者には、
種々の変更および改変を、本発明の範囲の精神及び範囲から逸脱せずに行い得る
ことが明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】温度および相補性の関数としての電流のグラフ。

【図１Ｂ】温度および相補性の関数としての電流のグラフ。

【図１Ｃ】温度および相補性の関数としての電流のグラフ。

【図１Ｄ】温度および相補性の関数としての電流のグラフ。

【図２Ａ】温度、相補性および他の因子の関数としての電流のグラフ。

【図２Ｂ】温度、相補性および他の因子の関数としての電流のグラフ。

【図２Ｃ】温度、相補性および他の因子の関数としての電流のグラフ。

【図３Ａ】温度、相補性および他の因子の関数としての電流のグラフ。

【図３Ｂ】温度、相補性および他の因子の関数としての電流のグラフ。

【図４】時間および相補性の関数としての電流のグラフ。

【図５Ａ】蛍光強度スペクトル。

【図５Ｂ】蛍光強度スペクトル。

【図５Ｃ】蛍光強度スペクトル。

【図６】蛍光強度スペクトル。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/26 ３８１Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｆ 27/416 33/53 Ｍ 27/447 33/58 Ａ 33/483 37/00 １０２ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｈ 37/00 １０２３２５Ａ３２５Ｃ 27/46 ３０１Ｍ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ダクシス、ジャスミンアイ．カナダ国Ｌ４Ｃ２Ｎ２オンタリオ州リッチモンドヒルカルティエクレセント 36 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 DA08 EA01 EA19 KA01 KA02 KA03 KA05 KA09 NA13 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FA34 FB02 FB07 FB12 GC15 GC16 GC20 2G060 AA06 AC10 AD06 AE17 AE40 AF02 AF03 AF08 AF20 FA01 HA01 HA02 HC07 HC10 HD03 HE01 HE03 KA05 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 HA19 HA20 4B063 QA13 QQ41 QR32 QR35 QR55 QR66 QR82 QS34 QS36 QX02 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列特異的なハイブリッド形成を測定する方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料に第１刺激を与えて、第１刺激された試験試料を提供する工程と
、前記第１刺激された試験試料から、前記プローブと前記標的間の結合親和性と
相関する第１信号を検出する工程と、前記標的と結合された少なくとも１つの基準プローブを含む基準試料が示す基
準信号に対して前記第１信号を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記
プローブおよび前記少なくとも１つの基準プローブの各々は、完全対合、１塩基
誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠
失から成る群より選択された異なるメンバーである工程と、前記較正から、前記プローブと前記標的間の対合の程度の第１決定値を決定す
る工程と、前記第１刺激された試験試料に第２の刺激を加えて、第２刺激された試験試料
を提供する工程と、前記第２刺激された試験試料から、前記プローブと前記標的間の前記結合親和
性と相関する第２信号を検出する工程と、前記第２信号の前記検出から、前記プローブと前記標的間の対合の程度の第２
決定値を決定する工程と、前記第１決定値と前記第２決定値を比較する工程と、から成る方法。
【請求項２】前記結合親和性を定量化する工程をさらに含む、請求項１に記
載の方法。
【請求項３】前記標的を前もって変性せずに行われる均質測定法である、請
求項１に記載の方法。
【請求項４】前記標的をＰＣＲ増幅せずに行われる均質測定法である、請求
項１に記載の方法。
【請求項５】前記試験試料はさらに挿入剤を含み、前記標的はｄｓＤＮＡで
あり、前記プローブは前記標的と特異的にハイブリダイズして三本鎖を形成する
、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記プローブはｓｓＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記
載の方法。
【請求項７】前記プローブは部分的に荷電したバックボーンを有する、請求
項１の方法。
【請求項８】前記プローブは非荷電のバックボーンを有する、請求項１に記
載の方法。
【請求項９】前記プローブはｓｓＰＮＡ配列を有する、請求項８に記載の方
法。
【請求項１０】前記プローブは平行合成によって調製されたｓｓＰＮＡであ
る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記プローブと前記標的は同じ長さである、請求項１に記載
の方法。
【請求項１２】前記プローブは６〜３０ヌクレオチド長である、請求項１に
記載の方法。
【請求項１３】ウェル内の溶液中または不浸透性表面上で行われる、請求項
１に記載の方法。
【請求項１４】バイオチップ上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記第２刺激の前記適用の前に、前記第１刺激された試験試
料の条件を変化させる工程であって、前記変化が、前記プローブと前記標的間の
不完全に相補的なハイブリッド形成に有意な影響を及ぼすには十分であり、かつ
前記プローブと前記標的間の完全に相補的なハイブリッド形成に有意な影響を及
ぼすには不十分である工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記変化は前記第１刺激された試験試料に電圧を印加するこ
とから成り、前記結合親和性は、前記第１信号と前記第２信号間の差と直接相関
している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記電圧は約１〜約２０ボルトである、請求項１６に記載の
方法。
【請求項１８】前記電圧は直流または交流のいずれかである、請求項１６に
記載の方法。
【請求項１９】前記第１信号または前記第２信号は電気的コンダクタンスで
ある、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記電気的コンダクタンスは、前記プローブと前記標的間の
対合の程度を示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記電気的コンダクタンスは、前記プローブと前記標的を加
える前の、前記ハイブリダイゼーション媒質の基準電気的コンダクタンスと比較
される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】達成された最大の初期アンペア数が測定される、請求項２０
に記載の方法。
【請求項２３】前記最大の初期ピークアンペア数からのアンペア数の下降率
が測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記電圧の前記印加の期間にわたるアンペア数が測定される
、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】前記方法は１塩基対誤対合プローブ−標的複合体を、２塩基
対誤対合プローブ−標的複合体から区別するのに十分に感度が高い、請求項２０
に記載の方法。
【請求項２６】前記方法は完全に相補的なプローブ−標的複合体を、１塩基
対誤対合プローブ−標的複合体ならびに２塩基対誤対合プローブ−標的複合体か
ら区別するのに十分に感度に高い、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】前記試験試料は挿入剤をさらに含み、前記標的はｄｓＤＮＡ
であり、前記プローブは前記標的と特異的にハイブリダイズして三本鎖を形成す
る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】前記プローブはｓｓＤＮＡである、請求項２０に記載の方法
。
【請求項２９】前記プローブはＰＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】前記試験試料中に蛍光発色団を提供する工程と、前記第２信号を第２の基準信号に対して較正する工程とをさらに含み、（ａ）前記第１刺激は電圧であり、前記第１信号は電気的コンダクタンスであ
り、前記第２刺激は励起放射線であり、前記第２信号は蛍光強度であるか、また
は（ｂ）前記第１刺激は励起放射線であり、前記第１信号は蛍光強度であり、前
記第２刺激は電圧であり、前記第２信号は電気的コンダクタンスである、請求項
１に記載の方法。
【請求項３１】前記蛍光発色団は、前記蛍光発色団が隣接する塩基の間に入
らないように前記プローブに共有結合によって取り付けられ、前記強度は前記プ
ローブと前記標的増加間の対合の程度が増加するにつれて減少する、請求項３０
に記載の方法。
【請求項３２】前記蛍光発色団は挿入剤であり、前記強度は前記プローブと
前記標的間の対合の程度と共に増加する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】前記蛍光発色団は前記プローブに共有結合で結び付けられた
挿入剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】前記蛍光発色団は、前記プローブも前記標的もない形式で前
記ハイブリダイゼーション媒質に加えられた挿入剤である、請求項３０に記載の
方法。
【請求項３５】前記試験試料は挿入剤をさらに含み、前記標的はｄｓＤＮＡ
であり前記プローブは前記標的と特異的にハイブリダイズして三本鎖を形成する
、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】前記試験試料中に蛍光発色団を提供する工程をさらに含み、
前記変化は、前記第１刺激された試験試料に電圧を印加することから成り、前記
第１刺激および前記第２刺激は励起放射線であり、前記第１信号および前記第２
信号は蛍光強度である、請求項１５に記載の方法。
【請求項３７】前記第２信号を前記第１信号に対して較正し、前記プローブ
と前記標的間の対合の程度を決定する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方
法。
【請求項３８】前記蛍光発色団は、前記蛍光発色団が隣接する塩基の間に入
らないように前記プローブに共有結合によって取り付けられ、前記強度は前記プ
ローブと前記標的増加間の対合の程度が増加するにつれて減少する、請求項３６
に記載の方法。
【請求項３９】前記蛍光発色団は挿入剤であり、前記強度は前記プローブと
前記標的間の対合の程度と共に増加する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】前記蛍光発色団は前記プローブに共有結合で結び付けられた
挿入剤である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】前記蛍光発色団は、前記プローブも前記標的もない形式で前
記ハイブリダイゼーション媒質に加えられた挿入剤である、請求項３６に記載の
方法。
【請求項４２】前記挿入剤は、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、臭化エチジウ
ム、エチジウムホモ二量体−１、エチジウムホモ二量体−２およびアクリジンか
ら成る群より選択されたメンバーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】前記試験試料は挿入剤をさらに含み、前記標的はｄｓＤＮＡ
であり、前記プローブは前記標的と特異的にハイブリダイズして三本鎖を形成す
る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】前記方法が、前記標的上または前記プローブ上で信号消光剤
を与えずに行われた均質測定法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】前記励起放射線はアルゴンイオンレーザーから約２００ｎｍ
〜約１０００ｎｍの波長で放射される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】５〜８５℃の範囲の温度で行われる、請求項３６に記載の方
法。
【請求項４７】２５℃より低い温度で行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】前記方法の信頼性が、プローブまたは標的の塩基配列とは無
関係であり、かつ、プローブまたは標的のグアニンおよびシトシン含量とも無関
係である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】前記試験試料は、約１０フェムトモルの標的と約１０フェム
トモルのプローブを含む約２０マイクロリットルの体積を有する、請求項３６に
記載の方法。
【請求項５０】前記試験試料は、約１ピコモルの標的と約１ピコモルのプロ
ーブを含む約４０マイクロリットルの体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】前記試料中の前記標的の濃度は多くて５×１０^−１０Ｍであ
る、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】前記試料中の前記プローブの濃度は多くて５×１０^−１０Ｍ
である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記蛍光発色団は挿入剤であり、前記挿入剤が蛍光を発する
波長は、挿入時に蛍光を発すると共に第２波長に遷移し、前記波長と前記第２波
長間の差は、前記プローブと前記標的間の複合体が二本鎖であるか三本鎖である
か、ならびに、前記標的がＤＮＡであるかＲＮＡであるかを示す、請求項３６に
記載の方法。
【請求項５４】ハイブリッド形成を測定する方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料の第１条件の第１信号を測定し、前記プローブと前記標的間のハ
イブリッド形成に関する第１決定値を提供する工程であって、前記第１信号は前
記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に相関する工程と、前記試験試料の第２条件の第２信号を測定し、前記プローブと前記標的間のハ
イブリッド形成に関する第２決定値を提供する工程であって、前記第２信号は前
記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に相関し、前記第１条件と前記第２
条件が類似しているとすれば、前記第１信号の測定後で、かつ前記第２信号の測
定前に、刺激が前記試験試料に加えられ、前記刺激は前記プローブと前記標的間
の不完全に相補的なハイブリッド形成に有意な影響を及ぼすが、前記プローブと
前記標的間の完全に相補的なハイブリッド形成には有意に影響を及ぼさない工程
と、前記第１決定値と前記第２決定値を比較して、それらの間の不一致が再試験を
必要とするものであるかどうかを評価する工程と、から成る方法。
【請求項５５】前記第１信号は蛍光の発光であり、前記第２信号は電気的コ
ンダクタンスである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】前記第１信号の測定前か測定中に、前記試験試料に電圧を印
加する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】前記第１決定値が前記第２決定値と異なる場合に、前記試験
試料を再試験することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】ハイブリッド形成を測定する方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料の通電前の蛍光強度を測定し、前記プローブと前記標的間のハイ
ブリッド形成に関する第１決定値を提供する工程であって、前記通電前の蛍光強
度は前記プローブと前記標的間のハイブリッド形成に相関する工程と、前記試験試料に電圧を印加する工程と、前記電圧の印加中か印加後に前記試験試料の通電後の蛍光強度を測定し、前記
プローブと前記標的間のハイブリッド形成に関する第２決定値を提供する工程で
あって、前記通電後の蛍光強度は前記プローブと前記標的間のハイブリッド形成
に相関する工程と、前記第１決定値と前記第２決定値を比較して、それらの間の不一致が再試験を
必要とするものであるかどうかを評価する工程と、から成る方法。
【請求項５９】前記試験試料に印加された前記電圧は、完全に相補的なプロ
ーブ−標的複合体が測定された時には通電前の強度と前記通電後の強度とが相対
的に一定であり、不完全に相補的なプローブ−標的複合体が測定された時には前
記通電後の強度が通電前の強度とは異なっており、通電前の強度と前記通電後の
強度の差は、前記プローブと前記標的間の誤対合の程度を示す、請求項５８に記
載の方法。
【請求項６０】前記標的がホモ接合型またはヘテロ接合型の対立遺伝子を含
むかどうかを検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】配列特異的なハイブリッド形成を測定する方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する標的を提供する工程と、核酸または核酸類似体の配列を有するプローブを提供する工程と、前記プローブおよび前記標的をハイブリダイゼーション媒質に加えて、試験試
料を提供する工程と、前記試験試料に電圧を印加する工程と、前記電圧の印加中か印加後に、前記プローブと前記標的間の結合親和性と相関
する前記試験試料の信号を検出する工程と、前記標的と結合された少なくとも１つの基準プローブを含む基準試料が示す基
準信号に対して前記第１信号を較正する工程であって、前記標的に比べて、前記
プローブおよび前記少なくとも１つの基準プローブの各々は、完全対合、１塩基
誤対合、２塩基誤対合、３塩基誤対合、１塩基欠失、２塩基欠失および３塩基欠
失から成る群より選択された異なるメンバーである工程と、前記較正から、前記プローブと前記標的間の対合の程度を決定する工程と、か
ら成る方法。