CN100560733C

CN100560733C - 平行，反平行,同源或互补结合的核酸

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Publication number: CN100560733C
Application number: CNB028146891A
Authority: CN
Inventors: 格伦·H·埃里克森; 雅斯曼·I·戴克希斯; 艾万那·坎迪克; 皮埃尔·皮卡德
Original assignee: Ingeneus Corp
Current assignee: Ingeneus Corp
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2022-07-15
Also published as: KR100699367B1; US20020031775A1; ZA200401362B; KR20040023671A; BR0211264A; NZ531258A; EP1463831A4; WO2003010326A2; CO5560626A2; AU2002345301B2; CA2454300C; CA2454300A1; RU2304169C2; WO2003010326A3; MXPA04000626A; US6656692B2; EP1463831A2; RU2004105040A; IL159927A0; JP2005527181A

Abstract

本发明提供一种复合体，所述复合体包括：(1)含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列的探针；以及(2)含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列的靶，其中：(a)探针和靶中的至少一种是纯化的或合成的；以及(b)杂聚探针序列通过沃森—克里克互补碱基相互作用或通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，条件是当复合体为双链体时，杂聚探针序列反平行于杂聚靶序列，杂聚体探针序列通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，以及条件是当复合体为三链体时，复合体不含重组蛋白。本发明还提供了一种分析靶的方法，所述方法包括检测复合体的形成。

Description

平行，反平行，同源或互补结合的核酸

发明背景

1.发明领域

本发明涉及在诸如双链体，三链体和四链体的复合体中的核碱基结合，更具体涉及在含单链或双链核碱基的探针和含单链或双链核碱基的靶序列之间通过特异性结合形成这种复合体的方法。

2.相关技术描述

核酸的沃森-克里克模型近50年来在分子生物学中一直认为是标准。正如James watson在其题为“DNA结构发现的人名册(A PersonalAccount of the Discovery of the Structure of DNA)”(1968)的书中所叙述，沃森-克里克模型使得沃森和克里克荣获诺贝尔奖，源于被他们抛弃的理论的残余，所述理论认为碱基同位于相对链上的类似碱基结合(watson，第125页)。沃森描述了当他认识到基于A:T和G:C结合的模型的优点时如何放弃他的“简单考虑的类似与类似配对(brieflyconsidered like-with-like pairing)”模型。同上。

尽管反平行核酸双链体首先由沃森和克里克提出，是多链核酸结构中研究最广泛的类型，但是已发现核酸在某些条件下还可形成三链体结构和四链体结构。

直到最近，三条核酸链之间的结合形成三链体才被普遍认为局限于很有限的核酸物种(例如，聚嘌呤或聚嘧啶序列]。参见，例如Floris等“阳离子对嘌呤-嘌呤-嘧啶三螺旋在混合价盐溶液中形成的影响”260 Eur.J.Biochem.801-809(1999)。此外，还认为经典三链体结合或杂交是基于有限种类的相邻核碱基之间的Hoogsteen结合，而非沃森-克里克碱基配对，参见，例如，Floris等和授权给Dervan等的美国专利号5,874,555。然而，本发明人近来已在若干个专利申请中公开了基于沃森-克里克碱基配对的特异性结合的混合碱基序列三链体核酸可得以产生，并用作高度准确和灵敏的分析特异结合的基础。参见，分别于2000年7月10日和1999年12月21日提交的美国专利申请号09/613,263和09/468,679。

Zhurkin等239 J.Mol.Biol.181(1994)公开了平行DNA三链体的可能性，然而，这些三链体据说是在诸如RecA蛋白的重组蛋白存在下，由双链体的大沟结合第三条链所产生的。

正如同三链体核酸的情形一样，涉及四链体核酸的传统知识一直认为这种特定的结构仅在相对极端条件下存在于狭窄的核酸种类中。具体而言，Sen等(Nature 334：364-366(1988))公开了富含鸟嘌呤的寡核苷酸可在体外自发地自我组装成四链螺旋。Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))公开了这些四链复合体可进一步结合成由8，12或16寡聚体组成的超结构。

Marsh等(Biochemistry 33：10718-10724(1994)和Nucleic AcidsResearch 23：696-700(1995))公开了一些富含鸟嘌呤的寡核苷酸也可以一种补偿的平行排列的方式组装，形成长的“G-丝”。这些更高级的结构被G-四联体所稳定，所述G-四联体由四个排列在平面上的鸟苷残基组成，并通过Hoogsteen碱基配对结合在一起。根据Sen等(Biochemistry 31：65-70(1992))，寡聚体中的至少三个邻近鸟嘌呤对这些高级结构的形成至关重要。

已有人提出，四链DNA在诸如HIV-1整合酶抑制的各种各样的生物过程中起作用(Mazumder等，Biochemistry 35：13762-13771(1996))，在减数分裂过程中联会染色体形成(Sen等，Nature 334：364-366(1988))和端粒维持(Williamson等，Cell 59：871-880(1989))；Baran等，Nucleic Acids Research 25：297-303(1997))。还有人进一步提出控制富含鸟嘌呤的四链体的产生可能是控制这种生物过程的钥匙。例如，授权给Hardin等的美国专利申请号6,017,709提出端粒酶活性可通过药物抑制形成鸟嘌呤四联体而得以控制。

授权给Pitner等的美国专利号5,888,739公开了基于G-四联体的四链体可用于检测核酸的分析中。当与互补寡核苷酸杂交后，G-四联体解折叠或线性化，由此增加了G-四联体结构中的不同部位上供体和受体部分之间的距离，导致它们相互作用的增加以及自结构中发射的信号(例如，荧光强度)的可检测的变化。

授予Agrawal等的美国专利5,912,332公开了合成寡核苷酸的纯化方法，其中所述合成寡核苷酸特异性与期望的全长寡核苷酸杂交，相伴形成多聚体聚合体，如四链体DNA。多聚体聚合体含有待纯化的寡核苷酸，然后利用大小排阻层析技术加以分离。

尽管有上述进展，但仍有需要进行系统地研究和归类所有在混合的碱基序列核酸之间的特异性相互作用并且创建新型、有效和快速的方法，用于产生和分析在核酸和/或核酸类似物之间的特异性相互作用。

所有在此引用的参考文献以其全文引作参考。

发明简述

本发明提供一种复合体，所述复合体包含：(1)含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列的探针；以及(2)含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列的靶，其中：(a)探针和靶中的至少一种是纯化的或合成的；以及(b)杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用或通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，条件是当复合体为双链体时，杂聚探针序列反平行于杂聚靶序列，多聚体探针序列通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，以及条件是当复合体为三链体时，复合体不含重组蛋白。

本发明还提供一种分析靶的方法，所述方法包括：(1)提供含有靶的样品，所述靶含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列；(2)提供含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列的探针；(3)提供含有靶、探针、水和缓冲液的杂交混合物；(4)将杂交混合物温育一段有效时间，以使杂聚靶序列与杂聚探针序列结合生成复合体；以及(5)检测与探针和靶之间的结合亲和性相关的信号以分析靶，其中杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用或通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，条件是当复合体为双链体时，杂聚探针序列反平行于杂聚靶序列，杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与杂聚靶序列结合，以及条件是当复合体为三链体时，复合体不含重组蛋白。

附图简述

本发明将结合下列附图加以描述，其中相同的标号代表相同的元件，以及其中：

图1A、1B、1C、2A、2B、3A、3B、4、5A、5B、6、7、8、9、10A、10B、11A、11B、12A、2B、13A和13B为各分析样品以波长为函数绘制的荧光强度的合成图；以及

图14A、14B和14C为各分析样品以时间为函数绘制的荧光强度的合成图。

发明详述

本发明阐述杂聚核酸链的特异性结合特性。我们早先已公开了杂聚链与双链体核酸的特异性结合以及双链体核酸与其他双链体核酸的特异性结合。我们现在公开杂聚核酸(和/或其类似物)通过同源碱基结合以及沃森-克里克碱基相互作用可特异性相互结合，并且碱基结合不受限于方向上相互之间反平行的链。因此，杂聚核酸(和/或其类似物)可以平行或反平行方向相互之间特异性结合，其中碱基通过同源碱基结合和/或沃森-克里克碱基结合规则而结合。

本发明不仅仅公开非正统的核酸的结合特性。本发明还包括新型化合物以及核酸的分析方法，诊断方法，治疗方法，预防方法，基因疗法和遗传工程。

本发明包括新型的核酸(和/或其类似物)的双链体，三链体和四链体复合体。

核酸链具有固有的方向性。传统知识认为方向性彼此相对(即，方向反平行)的链可通过其各自碱基的沃森-克里克互补结合而形成双链体。

根据本发明，某些双链体一方面包括两条相互以平行关系杂交的核酸(和/或核酸类似物)链，其中特异性结合或者是通过同源碱基配对或者是沃森-克里克碱基配对。传统知识认为这种双链体不存在，或由于例如主链的不规则性，至少极端不稳定，所述不规则性对平行碱基结合的构象要求是必须的。在适当的杂交条件下，同源结合显示的特异性和稳定性超过了沃森-克里克互补反平行双链体的特异性和稳定性，我们的这一发现甚至更为惊奇。

本发明还包括含有两条相互之间以反平行关系杂交的核酸(和/或核酸类似物)链的双链体，其中特异性结合是通过同源碱基配对。

如本文所用的术语“沃森-克里克碱基配对”，“互补碱基配对”等旨在定义核酸和/或核酸类似物链的相对或相邻碱基对之间通过匹配碱基(例如A:T，G:C和/或A:U)的特异性结合。在本文所述的非经典复合体情形中，包括平行双链体，平行和反平行三链体以及平行和反平行四链体，术语如“沃森-克里克碱基结合”和“互补碱基结合”旨在表示A和T，A和U和/或G和C之间的结合，而不必位于首先由沃森和克里克描述的边缘平面构象中。除了首先由沃森和克里克提出的常规结合基元(“W-C基元”)及其由沃森-克里克碱基结合的前述定义所含括的构象变体以外，本发明还包括由同源碱基结合所形成的复合体。在同源碱基结合中，碱基与相同的碱基而非互补碱基特异性结合。因此，在“同源基元”中，同源碱基对包括A:A，G:G，C:C，T:T和U:U。

核酸链的碱基的结合受到众多因素的影响或制约，特别是根据W-C基元或同源基元链的结合潜力，以及离子条件(例如盐浓度和/或种类)。盐条件利于形成沃森-克里克结合，而不利于形成比同源结合。在相同的缓冲液条件下，同源基元四链体比W-C基元四链体有利，这极可能是因为局部化的环境基于两条双链体核酸的带电主链的存在而变得相对低盐。

本发明复合体中的各条链可包括任何核碱基和/或核碱基类似物的序列，条件是核碱基通过W-C基元或同源基元与它们将要特异性结合的核碱基相关。同现有技术的某些教导相反，靶和探针的结合无需是同多聚体的，即使是在三链体或四链体形成的情形下。因此，在某些实施方案中，探针核碱基在散布的嘌呤和嘧啶的杂聚探针序列中排列，而靶核碱基在至少部分互补或部分同源于探针序列的靶序列中排列。例如，探针序列可以任何顺序含有25％-75％的嘌呤碱基和75％-25％的嘧啶碱基。本发明的复合体可形成自在此定义的杂聚序列，表示在至少它们的杂交区段中含有至少一个嘌呤核碱基或嘌呤类似物以及至少一个嘧啶核碱基或嘧啶类似物的序列。杂聚序列优选缺失长度大于5个碱基的同多聚体片段。其他核碱基也适用于本发明中，例如，天然存在的碱基的合成类似物，与其他碱基具有特异沃森-克里克和/或同源结合亲和性。

除了双链体，本发明复合体还包括三链体和四链体，其中相对的杂聚链通过沃森-克里克互补碱基或通过同源碱基而得以连接，以及结合序列的相对方向彼此平行或反平行。

探针链可特异性结合在双链靶的大沟或小沟中。此外，单链探针的碱基可与双链靶中的一条链或两条链上的碱基特异性相互作用。同样，双链探针中的各条链上的碱基在本发明四链体复合体中可与双链靶中的一条或两条链上的碱基特异性相互作用。

在某些三链体和四链体的实施方案中，各个核碱基与其他一个或两个核碱基结合。因此，除了上述的传统双链体沃森-克里克碱基配对和双链体同源碱基对以外，这种实施方案中包括下列沃森-克里克碱基结合三联体：A:T:A，T:A:T，U:A:T，T:A:U，A:U:A，U:A:U，G:C:G和/或C:G:C(包括C⁺:G:C，和/或任何其他离子化碱基物种)，和/或下列同源碱基三联体：A:A:T，T:T:A，U:U:A，T:U:A，A:A:U，U:T:A，G:G:C和/或C:C:G(包括C:C⁺:G，和/或任何其他离子化碱基物种)。

因此，在某些四链体实施方案中，其中探针定义成第一和第二链的双链体，而靶定义成第三和第四链的双链体，据信第一和第三链的碱基也相互结合，除了：(a)第一和第二链的相对碱基之间的结合；(b)第三和第四链的相对碱基之间的结合；以及(c)第二和第四链的相对碱基之间的结合。

在本发明三链体和四链体的某些实施方案中，没有碱基的结合序列与另一碱基的结合序列相邻。即，存在至少三条单独的链。尽管折叠的构象等(例如，发夹回转等)落入本发明的范围内，但是单链的折叠部分不使链计数多于一次，接近三条单独链的最小值。

本发明的复合体优选不依赖于Hoogsteen键合或G-G四联体来维持复合体结构，尽管可能存在Hoogsteen键合和/或G-G四联体。即，本发明的复合体优选基本上无Hoogsteen键合，并且基本上无G-G四联体。

复合体的各条链独立地包括具有脱氧核糖磷酸或核糖磷酸骨架(例如，DNA，RNA，mRNA，hnRNA，rRNA，tRNA或cDNA)的核酸或核酸类似物。优选的核酸类似物含有不带电荷的或带部分电荷的主链(即，具有电荷的主链，其不如天然DNA主链那样带负电荷)，并且包括例如PNA和LNA。某些实施方案不含PNA。

至少部分复合体是分离的，纯化的，人工的或合成的。

在实施方案中，部分复合体为PCR扩增的产物。

本发明的复合体可以体外或体内或硅片(in silico)形式存在于溶液中，固相支持物上。

其中固相支持物或是导电性的(例如，电极)或是非导电性的。此外，复合体在被延长后可通过光学加以作图或测序，如授权于Schwartz的美国专利号6,147,198和5,720,928所教导的。

本发明的复合体可由一种方法提供，所述方法包括：(a)提供一种含有靶，探针，水和缓冲液的杂交混合物，所述靶含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列，所述探针含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列，以及(b)将所述杂交混合物温育一段有效时间，以使所述杂聚靶序列与所述杂聚探针序列杂交形成复合体。

杂交混合物可包括任何常规的已知适合于保存核苷酸的介质。参见，例如，Sambrook等，“Molecular Cloning：A Lab Manual”Vol.2(1989)。例如，介质可包括核苷酸，水，缓冲液和标准盐浓度。当二价阳离子专门用于促进三链体或四链体形成时，诸如EDTA或EGTA的螯合剂不应包括在反应混合物中。

在很多种条件下发生互补碱基之间的特异性结合，所述条件在温度，盐浓度，静电强度和缓冲液组成方面不同。这些条件及其应用方法的例子在本领域是已知的。我们于2001年6月20提交的在审美国专利申请号09/885,731公开特别适用于本发明中的条件。

与许多Hoogsteen类型的复合体不同，它们在pH值高于约7.6是不稳定或非存在的，本发明的复合体在大范围的pH水平下是稳定的，优选从约pH5到约pH9。

本发明的复合体可用于分析，诊断，治疗和/或工程目的。所述复合体可用于分析，诊断和/或治疗与生物体或病毒感染相关的症状。如果需要，生物体或病毒可进行定量测定。

本发明的复合体可在常规杂交条件，三链体杂交条件，四链体杂交条件或原位杂交条件下得以形成。优选的是复合体在温度为约2-约55℃下形成约2小时或更少。在某些实施方案中，温育时间甚至在室温下优选少于5分钟。更长的反应时间是不需要的，但在大多数情况中，温育长达24小时不会对复合体有不利影响。本发明的复合体的快速结合时间与Hoogsteen结合的复合体需要更长的结合时间形成对照。

杂交介质中的促进剂优选是一种嵌入剂或阳离子，正如在2000年7月10日提交的美国专利申请号09/613,263中所公开的。嵌入剂任选是荧光的。嵌入剂可以是例如荧光团，诸如选自：YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁单体、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭吖啶异型二聚体、单叠氮化乙锭、碘化丙锭、SYTO染料、SYBR绿1、SYBR染料、皮可绿(Pico Green)、SYTOX染料以及7-氨基放线菌素D。

合适的阳离子包括例如，单价阳离子，如Na⁺(优选浓度为40-200mM)，K⁺(优选浓度为40-200mM)及其他碱金属离子；二价阳离子，如碱土金属离子(例如Mg⁺²和Ca⁺²)和二价过渡金属离子(例如Mn⁺²、Ni⁺²、Cd⁺²、Co⁺²和Zn⁺²)；以及正电荷至少为3的阳离子，如Co(NH₃)₆ ⁺³，三价亚精胺和四价精胺。Mn⁺²优选以10-45mM的浓度提供。Mg⁺²优选以10-45mM的浓度提供。Ni⁺²优选以约20mM的浓度提供。在实施方案中，Mg⁺²和Mn⁺²组合分别以1mM、2mM、3mM...40mM(即各为1-40mM)的浓度提供。

阳离子向形成复合体的介质中的加入量依赖于许多因素，包括阳离子的性质、探针的浓度、靶的浓度、其他阳离子的存在以及探针和靶的碱基含量。优选的阳离子浓度和混合物通常可经过实验找到。对于三链体而言，优选以下列量向介质中加入阳离子：(a)10mM-30mMMn⁺²；(b)[10mM-20mM Mg⁺²；(c)20mM Ni⁺²；或(d)Mn⁺²和Mg⁺²各为1mM-30mM。对于四链体而言，优选以下列量向介质中加入阳离子：(a)10mM-45mM Mn⁺²；(b)10mM-45mM Mg⁺²；或(c)Mn⁺²和Mg⁺²各为10mM-40mM。

尽管不需要，其他促进剂包括例如单链结合蛋白，诸如Rec A蛋白质、T4基因32蛋白质、大肠杆菌单链结合蛋白质、大或小核酸沟结合蛋白质、紫罗碱和其他嵌入物质如放线菌素D、补骨脂内酯和当归根素。这样的促进剂可证明在极端操作条件，例如异常pH水平或极端高温下是有用的。某些提供本发明复合体的方法在没有诸如Rec A和/或其他重组蛋白的蛋白促进剂下进行。

本发明提供用于分析结合的快速、灵敏、环保和安全的方法。本发明分析可用于例如识别折叠核苷酸序列中的可接近区域，从而确定杂交复合体中的错配碱基对的数目，并且对基因组进行作图。

本发明分析不仅检测特异性探针一靶结合的存在，而且提供有关探针和靶之间相互作用的性质的定量和定性信息。因此，本发明使得业者能够区分双链探针或单链探针中的序列和双链靶或单链靶中的序列之间出现的完全匹配，单碱基对错配，两碱基对错配，三碱基对错配，单碱基对缺失，两碱基对缺失和三碱基对缺失。

本发明的实施方案包括对照与相同的靶结合的其它探针所显示的相同类型的信号来校正第一探针-靶混合物的测定信号(例如光学、荧光、化学发光、电化学发光、电或电机械特性)，其中其它各个探针与第一探针至少有一个碱基的区别。

形成校正曲线，其中测定信号(例如荧光强度)的大小是靶和探针之间结合亲和力的函数。由于靶和多个不同探针之间的结合亲和力随着复合体内的错配碱基数、错配性质(例如W-C基元中的A:G对A:C对T:G对T:C等)、错配位置等而变化，因此本发明的分析可用于对靶进行测序。

在实施方案中，所测定的信号可以是测试样品中所含荧光团的荧光强度。在这样的实施方案中，探针和靶之间的结合亲和力可以与强度正相关或负相关，这依赖于荧光团是否通过信号猝灭或信号放大对杂交发信号。在选择的条件下，由嵌入剂所产生的荧光强度可以与探针-靶结合亲和力正相关，而在利用非嵌入荧光团共价结合探针的优选实施方案中，强度可以与探针-靶结合亲和力反相关。随着探针和靶之间的匹配程度(例如，匹配对错配的量和/或错配的类型)增加，优选包括0-2个错配和/或缺失的范围内，更优选包括0-3个错配和/或缺失的范围内，非嵌入荧光团的荧光强度降低。

本发明能够定量测定探针和靶之间的结合亲和力。这种信息对各种用途是有价值的，包括设计具有优化结合特征的反义药物。

本发明分析优选是匀相的。该分析的进行无需在检测测定信号大小之前从杂交复合体中分离出游离探针和游离靶。该分析也无需凝胶分离步骤，由此使得测试通量大幅提高。定量分析简便而准确。结果，结合分析节省大量时间和花费，并且可容易加以自动化。另外，其还使得结合变量快速确定，这些变量如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列长度以及可能的必要辅助因子(即促进剂)。

分析可在例如孔内或微通道内的溶液中不可渗透表面或生物芯片上进行。在某些实施方案中，靶在探针前提供给杂交介质，以及探针在通过与杂交介质接触再水合之前以脱水形式提供。

在某些实施方案中，本发明分析的进行优选无需在靶或探针上提供信号猝灭剂。

本发明排除在分析前对靶进行变性的需要。令人惊奇的是，本发明人已经能够特异性测定杂聚三链体和四链体，其中探针和靶之间的相互作用基于沃森-克里克或同源碱基相互作用(至少在A结合T(或U，在RNA的情况下)和G结合C的意义上)，而不是很有限的如Pitner等，同上的复合体杂交的Hoogsteen模型。

合适的靶的长度优选为8-3.3×10⁹碱基对，可以是单链或双链的。

本发明的探针优选长度为2-75个碱基(更优选长度为5-30个碱基)，并且可以是单链或双链的。因此，用于本发明分析中的合适的探针包括例如ssDNA、RNA、ssPNA、LNA、dsDNA、dsRNA、DNA:RNA杂合体、dsPNA、PNA:DNA杂合体，和其它不带电荷或带部分电荷的糖磷酸/肽主链的单链和双链核酸和核酸类似物。可选择探针的长度来匹配靶的长度。

本发明不需要使用放射性探针，它们在使用中是危险、麻烦和耗时的，并需要不断地再生。本发明的探针优选使用时是安全的，并且常年稳定。因此，探针可以大量制造或定购和储存。

复合体优选通过在至少一种探针中的变化而加以检测。所述至少一种标记可连接到探针和/或靶，和/或可游离在测试介质中。所述至少一种标记可包括至少两个部分。

标记优选为至少一个成员，选自自旋标记物，荧光团，发色团，化学发光剂和电化学发光剂，放射性同位素，酶，半抗原，抗体和标记抗体。优选的，复合体通过至少一个来自标记的发射或通过监测复合体的电子特征进行检测。

标记抗体可以是例如一种标记的抗核酸/核酸抗体，其用可检测的部分加以标记，所述可检测的部分选自荧光团，发色团，自旋标记，放射性同位素，酶，半抗原，化学发光剂和电化学发光剂。

复合体可在至少一种不同条件下加以检测，诸如公开在2000年1月24日提交的美国专利申请号09/490,273中。合适的不同条件包括例如，(a)测试介质中非水性组分的变化，(b)测试介质中pH的变化，(c)测试介质中盐浓度的变化，(d)测试介质中有机溶剂含量的变化，(e)测试介质中甲酰胺含量的变化，(f)测试介质中温度的变化，以及(g)测试介质中离液盐浓度的变化。此外，不同条件可以是刺激的应用，例如电流(直流和/或交流电)，光子照射(例如，激光)或电磁力。刺激可以恒定或脉冲方式施加。检测可通过使用单一不同条件或通过组合系列不同的条件进行。

测试介质中复合体的特征对不同条件或刺激的反应可得以监控以检测复合体。特征可以为例如电导率或Q(测试介质中传输线信号传播的振幅或相的变化或传输线的共振结构)。

在实施方案中，所述检测方法包括：(a)检测标记物信号，其中信号与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关；(b)改变测试介质的条件；(c)检测后续信号；以及(d)比较标记物信号和后续信号。改变和检测可重复至少一次或仅仅进行一次。

标记优选为荧光团。嵌入荧光团和非嵌入荧光团均适用于本发明。荧光团可游离在溶液中，共价结合于探针和/或共价结合于靶。当荧光团共价结合于探针时，优选在任一末端与探针结合。优选的荧光标记包括生物素，若丹明，丫啶和荧光素，以及其他标记，这些标记当用激发能照射时发荧光。适当的非嵌入荧光团包括例如Alexa染料、BODIPY染料、生物素结合物、硫醇活性探针、荧光素及其衍生物(包括“笼”型探针)、Oregon绿、若丹明绿、QSY染料(其猝灭可见光激发的荧光团的荧光)。

选择激发波长(通过常规实验和/或常识)，以对应于在用荧光团的激发最大值，优选地是200-1000nm。优先选择荧光团具有200-1000nm的辐射波长。在优选的实施方案中，氩离子激光器用来照射荧光团，其光的波长范围是400-540nm，并在500-750nm的范围内检测荧光辐射。

本发明分析可以在各种温度下进行，如约2℃-约60℃。现有技术的某些分析需要提高温度、增加成本和延迟测定。然而，本发明可在室温或低于室温(例如低于25℃)下进行。

本发明的可靠性不依赖于所述探针或靶中的鸟嘌呤和胞嘧啶的含量。在传统的W-C基元中，G:C碱基对形成三个氢键，而A:T碱基对仅形成两个氢键，具有更高的G或C含量的靶和探针序列更稳定，具有更高的解链温度。结果，提高杂交探针和靶区域的GC含量在完全匹配的杂合体所含的之上，碱基对错配可以抵销与错配探针相关的结合弱化。

本发明分析是极其灵敏的，从而排除了对靶进行PCR扩增的需要。例如，可以分析具有约20微升体积的测试样品，其含有约10fmol的靶和约10fmol的探针。本发明的实施方案是灵敏的，足以测定浓度为5×10^-9M、优选不超过5×10^-10M的靶。本发明的实施方案是灵敏的，足以利用浓度为5×10^-9M、优选不超过5×10^-10M的探针。不用说，前面的值并非旨在提示该方法不能检测更高的浓度。

探针与靶之比优选约1∶1-约1000∶1。

与某些现有技术分析不同，本发明不仅检测杂交(即结合)的存在，而且提供有关探针和靶之间结合性质的定量和定性信息。因此，本发明能使业者：(a)检测测试介质中靶的存在；(b)检测靶中等位或杂合变异；(c)定量分析靶；(d)检测探针和靶之间的互补程度(在W-C基元的结合情形下)或同源程度(在同源基元的结合情形下)；以及(e)检测单元型。

我们已经注意到双链体复合含有互补碱基序列的核酸的平行链，以不同速率结合形成三链体，并且以与通过方向性相反的核酸链所形成的双螺旋中碱基非常相异过程的最高点结合。方向性相反的链(即反平行链)在沿面取向上给与最低骨架扭曲相反的碱基容易地呈现间隔规则的碱基。

本发明的各种复合体包括探针和靶，所述探针含有核碱基和/或核碱基类似物的杂聚探针序列，所述靶含有核碱基和/或核碱基类似物的杂聚靶序列。复合体是合成或纯化的，在于探针或靶中的至少一种是合成或纯化的。探针的骨架是脱氧核糖磷酸骨架，诸如在DNA中，或肽类骨架，诸如在PNA中，或属于其他一些未带电荷或带部分电荷(负或正)的部分。

在某些实施方案中，探针和靶是单链的，以及复合体为双链体。当所述探针和靶为双链体时，它们具有W-C互补或同源结合的平行方向，或具有同源结合的反平行方向。

在其他实施方案中，探针或靶是单链的，所述探针或靶的另一个为双链的，并且所得复合体是三链体。这个复合体可以不含PNA。

在某些实施方案中，三链体含有平行于杂聚靶序列的杂聚探针序列，其中杂聚探针序列通过同源碱基结合或沃森-克里克互补碱基结合与杂聚靶序列结合。在其他某些实施方案中，杂聚探针序列反平行于杂聚靶序列，而杂聚探针序列通过同源碱基结合或沃森-克里克互补碱基结合与杂聚靶序列结合。

在三链体复合体的某些实施方案中，靶包括第一链和第二链，所述第一链含有杂聚靶序列，所述第二链含有沃森-克里克互补和反平行于第一杂聚靶序列的第二杂聚靶系列。杂聚探针序列通过同源碱基结合与第一杂聚靶序列结合，并且还通过沃森-克里克互补碱基结合与第二杂聚靶序列结合。

在三链体复合体的其他某些实施方案中，靶包括第一链和第二链，所述第一链含有杂聚靶序列，所述第二链含有沃森-克里克互补和反平行于第一杂聚靶序列的第二杂聚靶系列。杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基结合与第一杂聚靶序列结合，并且还通过同源碱基结合与第二杂聚靶序列结合。

在某些实施方案中，探针和靶是双链的，并且所得复合体是四链体。这个复合体可以不含PNA。

在某些实施方案中，四链体含有平行或反平行于杂聚靶序列的杂聚探针序列，其中杂聚探针序列通过同源碱基结合或沃森-克里克互补碱基结合与杂聚靶序列结合。在这种实施方案中，四链体复合体含有第一探针链和第二探针链，所述第一探针链含有所述杂聚探针序列，所述第二探针链含有互补和反平行于第一探针序列的第二杂聚探针序列。靶包括第一靶链和第二靶链，所述第一靶链含有杂聚靶序列，所述第二靶链含有互补和反平行于第一靶链的第二杂聚靶序列。

在这种四链体实施方案中，杂聚探针序列可分别通过沃森-克里克互补碱基结合或同源碱基结合与杂聚靶序列结合，以及通过同源碱基结合或沃森-克里克互补碱基结合任选和附加地与第二杂聚靶序列结合。因此，当杂聚探针序列通过同源碱基结合与杂聚靶序列结合时，杂聚探针序列可任选通过沃森-克里克互补碱基结合与第二杂聚靶序列结合，而当杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基结合与杂聚靶序列结合时，杂聚探针序列任选通过同源碱基结合与第二杂聚靶序列结合。

本发明将参照下列实施例更详细加以说明，但应理解本发明不视为受此限制。

实施例

实施例1

互补有义和反义50聚体ssDNA靶序列，衍生自人囊性纤维化基因的外显子10(Nature 380，207(1996))，在DNA合成仪(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)上合成并通过HPLC纯化。将ssDNA寡核苷酸溶解在双蒸馏水中，并且稀释至浓度为1pmol/μl。等摩尔量的互补寡核苷酸在95℃加热10分钟，并随着温度在1.5小时冷却到21℃，允许在10mM Tris pH 7.5、1mM EDTA和100mM NaCl存在下逐渐退火。将dsDNA寡核苷酸以浓度为1pmol/μl稀释在双蒸馏水中。

野生型靶DNA的有义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5′-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3′。

野生型靶DNA的反义链的序列(SEQ ID NO：1)为：5′-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3′。

SEQ ID NO：2为与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置507有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上野生型有义链序列CAT变为CGT。

SEQ ID NO：2的有义链序列为：5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。

SEQ ID NO：2的反义链序列为：5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。

SEQ ID NO：3为与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置506和507有连续两个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上野生型有义链序列CAT变为ACT。

SEQ ID NO：3的有义链序列为：5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。

SEQ ID NO：3的反义链序列为：5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。

SEQID NO：4为与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置506和507有连续三个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上野生型有义链序列CAT变为ACG。

SEQ ID NO：4的有义链序列为：5′-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TAT ACG CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。

SEQ ID NO：4的反义链序列为：5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CAA AGC GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。

SEQ ID NO：5为修饰自SEQ ID NO：1的50聚体dsDNA靶序列，其中GC百分含量从30％变为52％。

野生型靶DNA的有义链序列(SEQ ID NO：5)为：5′-GAG CAC CATGAC AGA CAC TGT CAT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTCTG-3′。

野生型靶DNA的反义链序列(SEQ ID NO：5)为：5′-CAG AGT CATCGT AGG ACA CAC CAG AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGCTC-3′。

SEQ ID NO：6为与SEQ ID NO：5相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上有义链序列CAT变为CGT。

突变SEQ ID NO：6的有义链序列为：5′-GAG CAC CAT GAC AGACAC TGT CGT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。

突变SEQ ID NO：6的反义链序列为：5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGA CGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。

SEQ ID NO：7为与SEQ ID NO：5相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上有义链序列CTC变为CTT。

突变SEQ ID NO：7的有义链序列为：5′-GAG CAC CATGAC AGACAC TGT CAT CTT TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。

突变SEQ ID NO：7的反义链序列为：5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAA AGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。

SEQ ID NO：8为与SEQ ID NO：5相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了有连续两个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上有义链序列CAT变为ACT。

突变SEQ ID NO：8的有义链序列为：5′-GAG CAC CAT GAC AGACAC TGT ACT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。

突变SEQ ID NO：8的反义链序列为：5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGA GTA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。

SEQ ID NO：9为与野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)相同的47聚体突变dsDNA靶序列，除了在氨基酸位置507和508有连续三个碱基对缺失(以三点表示)以外，在该位置上野生型有义链序列CTT缺失。

SEQ ID NO：9的有义链序列为：5′-TGG CAC CAT TAA AGA AAATAT CAT...TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3′。

SEQ ID NO：9的反义链序列为：5′-TAT ATT CAT CAT AGG AAACAC CA...A TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3′。

SEQ ID NO：10为与SEQ ID NO：5相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上有义链序列CAT变为CTT。

突变SEQ ID NO：10的有义链序列为：5′-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT CTT CTC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。

突变SEQ ID NO：10的反义链序列为：5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG AGA AGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。

SEQ ID NO：11为与SEQ ID NO：5相同的50聚体突变dsDNA靶序列，除了有一个碱基对突变(下划线)以外，在该位置上有义链序列CTC变为CCC。

突变SEQ ID NO：11的有义链序列为：5′-GAG CAC CAT GACAGA CAC TGT CAT CCC TGG TGT GTC CTA CGA TGA CTC TG-3′。

突变SEQ ID NO：11的反义链序列为：5′-CAG AGT CAT CGT AGGACA CAC CAG GGA TGA CAG TGT CTG TCA TGG TGC TC-3′。

PNA探针由Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA，USA)合成，HPLC纯化并通过质谱确认。PNA探针首先溶解于0.1％TFA(三氟乙酸)至浓度为10mg/ml，然后加入双蒸馏水稀释至1mg/ml。最终在双蒸馏水中以浓度为1pmol/μl制备终了PNA储液。

探针1号为15聚体PNA，其设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)有义链的15个核苷酸区段，在氨基酸位置505-510上重叠(Nature 380，207(1996))。探针在方向上与靶中有义链相反或反平行。

探针1号的序列(SEQ ID NO：12)为：5′-H-CAC CAA AGA TGATAT-Lys-CONH₂-3′。

探针2号为在序列上与探针1号相同的15聚体PNA，但是与dsDNA靶中的有义链在方向性上相同或平行。

探针2号的序列(SEQ ID NO：13)为：5′-H-TAT AGT AGA AACCAC-Lys-CONH₂-3′。

如上所述合成和通过HPLC纯化15聚体ssDNA探针。将ssDNA探针以浓度为1pmol/μl溶解于双蒸馏水中。

探针3号为15聚体ssDNA探针，其设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：5)有义链的15个核苷酸区段。探针在方向性上与靶中有义链相反或反平行。

探针3号的序列(SEQ ID NO：14)为：5′-CAC CAG AGA TGACAG-3′。

探针4号为在序列上与探针3号相同的15聚体ssDNA探针，但是在方向性上与dsDNA靶中的有义链相同或平行。

探针4号的序列(SEQ ID NO：15)为：5′-GAC AGT AGA GACCAC-3′。

探针5号为与探针3号相同的15聚体反平行ssDNA探针，除了在其5’位置连接荧光素部分以外。

探针5号的序列(SEQ ID NO：16)为：5′-Flu-CAC CAG AGA TGACAG-3′。

探针6号为与探针4号相同的15聚体平行ssDNA探针，除了在其5’位置连接荧光素部分。

探针6号的序列(SEQ ID NO：17)为：5′-Flu-GAC AGT AGA GACCAC-3′。

探针7号为15聚体ssDNA探针，在其5’位置连接荧光素部分，其设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQID NO：1)有义链的15个核苷酸区段。探针在方向性上与靶中的有义链相反或反平行。

探针7号的序列(SEQ ID NO：18)为：5′-Flu-CAC CAA AGA TGATAT-3′。

探针8号为15聚体ssDNA探针，其设计成完全互补于50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：1)有义链的15个核苷酸区段。探针在方向性上与靶中的有义链反平行。

探针8号的序列(SEQ ID NO：19)为：5′-CAC CAA AGA TGATAT-3′。

探针9号和探针10号为在序列上与野生型探针8号相同的15聚体突变ssDNA探针，除了有一个碱基突变(下划线)以外。

探针9号的序列(SEQ ID NO：20)为：5′-CAC GAA AGA TGATAT-3′。

探针10的序列(SEQ ID NO：21)为：5′-CAC CAA ACA TGA TAT-3′。

众所周知，混合碱基序列的ssDNA链当室温下与反平行或平行合成的ssPNA链反应时在沃森-克里克配对基础上容易形成ssPNA:ssDNA双链体。早先我们已显示，这种ssPNA:ssDNA复合体含有完全匹配的序列，当在DNA嵌入剂YOYO-1(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)存在下分析时，可容易地与含有1bp错配的ssPNA:ssDNA复合体加以区分，以及显示PNA链的组装次序对其特异性结合ssDNA靶的能力具有显著意义。实施例1比较了当野生型或突变ssDNA靶序列与沃森-克里克互补反平行ssDNA探针或与同源即同样平行的ssDNA探针反应时，dsDNA双链体的形成效率。

杂交反应混合物产生图1A所示的数据，分别含有下列混合物：2pmol ssDNA靶，2pmol ssDNA探针，0.5xTBE和500nM YOYO-1，终体积为40μl。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

在图1B和1C中，杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmolssDNA靶，2pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH7.5，以及1mM EDTA。将反应混合室温下(21℃)温育30分钟或90分钟。温育后，将各个样品置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

当ssDNA探针3号在YOYO-1存在下与SEQ ID NO：5的50聚体野生型有义链或与SEQ ID NO：7的50聚体突变有义链反应时，形成反平行互补ssDNA:ssDNA双链体(图1A)。由1bp T-G错配的反平行互补双链体(SEQ ID NO：7的有义链+探针3号)发射的荧光强度要比由完全匹配的反平行互补双链体(SEQ ID NO：5的有义链+探针3号)所获得的低56％。

当ssDNA探针3号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链在YOYO-1存在下反应时，平行同源ssDNA:ssDNA双链体形成的效率比反平行互补ssDNA:ssDNA双链体形成的效率仅低3％(图1A)。该结果完全是未预料的。当SEQ ID NO：7的50聚体突变反义链与ssDNA探针3号在YOYO-1存在下反应时所形成的1bp A-G错配的平行同源双链体产生的荧光发射强度要比完全平行同源双链体所发射的低56％(图1A)。含有各个50聚体ssDNA靶加上500nM YOYO-1的对照样品显示出的荧光水平比完全匹配的双链体所观察到的低91％-92％(图1A)。由15聚体ssDNA探针3号加上500nM YOYO-1所发射的荧光水平比单独由YOYO-1所产生的稍高些。用ssDNA靶和探针观察到的荧光发射波长的位移通常属于ssDNA存在下的YOYO-1的发射图谱。

YOYO-1促进了ssDNA探针和反平行ssDNA靶中的互补碱基序列之间或ssDNA探针和平行ssDNA靶中的相同碱基序列之间以类似的功效形成DNA复合体，从而区分完全匹配的复合体和那些含有1bp错配的复合体。在平行同源复合体中，1bp错配为非同源碱基对。

利用ssDNA靶和ssDNA-F探针在缺乏诸如YOYO-1或阳离子的复合体促进剂时，对反平行互补和平行同源dsDNA双链体形成的比较效率进一步加以检查。当ssDNA-F探针5号室温下在Tris缓冲液中与SEQ ID NO：5的50聚体野生型有义链温育30分钟后，沃森-克里克互补反平行ssDNA:ssDNA-F双链体的形成非常有效，导致其荧光发射与单独由探针5号所发射的比较减少53％(图1B)。相比之下，反平行互补ssDNA:ssDNA-F复合体含有1bp T-G错配(SEQ ID NO：7的有义链+探针5号)，较不稳定，导致其荧光发射在温育30分钟后仅比单独由探针5号所发射的降低40％(图1B)。

当ssDNA探针5号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链或与SEQ ID NO：7的50聚体突变反义链反应时形成平行同源ssDNA:ssDNA-F复合体，在温育30分钟生成的荧光发射强度分别比单独由ssDNA探针5号所发射的低44％和37％(图1B)。在缺乏促进剂时渴望形成平行同源ssDNA:ssDNA-F复合体是完全未预料的。从完全匹配的双链体和1bp错配的双链体在缺乏复合体促进剂时所发射的信号之间的区分不如当YOYO-1存在并用作促进剂和信号剂时所观察的那么显著(比较图1A和1B)。这既是反平行双链体的情形也是平行双链体的情形。当平行同源ssDNA靶用于产生ssDNA:ssDNA-F复合体时，比反平行互补ssDNA靶观察到在完全匹配和1bp错配的DNA复合体之间区别稍小(图1B)。

温育90分钟后，沃森-克里克反平行dsDNA:ssDNA-F复合体由完全互补的序列(SEQ ID NO：5的有义链+探针5号)或1bp T-G错配序列(SEQ ID NO：7的有义链+探针5号)组成，产生的荧光发射强度与单独由探针5号所发射的比较分别降低了39％和30％(图1C)。显然，温育90分钟后，平行同源ssDNA:ssDNA-F复合体所显现的稳定性水平与沃森-克里克反平行ssDNA:ssDNA-F复合体相同。温育90分钟后，完全平行的同源双链体(SEQ ID NO：5的反义链+探针5号)和1bp A-G错配的平行同源双链体(SEQ ID NO：7的反义链+探针5号)的荧光强度分别比单独由ssDNA探针5号所发射的低40％和25％(图1C)。

现在还未知平行dsDNA双链体中同源碱基识别和结合的机制。然而，平行同源ssDNA序列识别和结合发生在构象中，使得能区分完全匹配的ssDNA:ssDNA复合体和那些含有1bp或2bp错配的复合体。在这些平行同源复合体中，1bp错配为非同源碱基对。

实施例2

在实施例1中，平行同源ssDNA:ssDNA双链体形成既在诸如YOYO-1的复合体促进剂存在下又在任何复合体促进剂缺乏下均表现出显著效率。平行dsDNA双链体中同源碱基识别和结合使得容易区分完全同源碱基序列和含有1bp错配的平行同源序列。根据沃森-克里克互补识别和结合规则，这些平行同源1bp错配也可清晰识别成错配。实施例2检查含有A-T或G-C碱基配对的平行同源dsDNA双链体的识别和结合效率，从而确定这些沃森-克里克互补配对在平行同源结合反应中是否以错配出现。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmol ssDNA靶，2pmolssDNA探针，0.5xTBE和500nM YOYO-1。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。

当ssDNA探针3号(GC含量为53％)与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链或SEQ ID NO：10的50聚体突变反义链在YOYO-1存在下反应时，形成平行同源ssDNA:ssDNA双链体(图2A)。由1bp A-T错配的平行同源双链体(SEQ ID NO：10反义链+探针3号)所发射的荧光强度比由完全平行同源双链体(SEQ ID NO：5反义链+探针3号)所得到的要低72％(图2A)。含有1bp A-T的平行同源双链体的荧光发射显著降低，这有力提示当部分平行同源链试图获得稳定的双链体时，沃森-克里克A-T结合受到施加在A和T碱基上的空间和/或电荷构象的阻碍。对照样品含有各个50聚体ssDNA靶加上500nMYOYO-1，其所示的荧光水平比用完全匹配的双链体所观察到的低96％-97％(图2A)。由15聚体ssDNA探针3号加上500nM YOYO-1所发射的荧光水平比单独由YOYO-1所产生的稍高些。用ssDNA靶和探针观察到的荧光发射波长的位移通常属于ssDNA存在下的YOYO-1的发射图谱。

当SEQ ID NO：1的50聚体野生型反义链(GC含量为33％)与野生型ssDNA探针8号或与突变ssDNA探针9号和10号在YOYO-1存在下反应时，也形成平行同源ssDNA:ssDNA双链体(图2B)。由1bp G-C错配的平行同源双链体(SEQ ID NO：1的反义链+探针9号)和1bpC-G错配的平行同源双链体(SEQ ID NO：1的反义链+探针10号)分别比完全平行同源双链体(SEQ ID NO：1的反义链+探针8号)所得到的要低67％和66％(图2B)。平行同源双链体中相互作用碱基的构象对沃森-克里克互补G-C结合是不利的，导致荧光发射降低，指示1bp错配。由50聚体ssDNA靶加上500nM YOYO-1或各个15聚体ssDNA探针加上500nM YOYO-1组成的对照样品导致荧光水平比单独由YOYO-1所产生的稍大些(图2B)。

因此，在YOYO-1存在下形成的平行同源dsDNA双链体中的相互作用碱基对所采用的构象对沃森-克里克互补碱基对之间的结合是不利的，导致这种双链体似乎含有1bp错配。

我们面临结合序列中的错配，无论其是作为部分发夹还是以多链复合体出现，如何致使高能运动和重复运动，因为碱基序列在任一结合基元下都试图获得理想结合构象的稳定性。成核位点上游或下游碱基对的结合强度，金属离子和其他因素会对实现结合的努力产生影响，这是可以预料的。

实施例3

本实施例检查由YOYO-1或单价阳离子促进形成反平行同源ssDNA:ssDNA双链体的效率。

杂交反应产生图3A所示的数据，分别含有下列混合物：2pmolssDNA靶，2pmol ssDNA探针，0.5x TBE和500nM YOYO-1，终体积为40μl。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

在图3B中，杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmolssDNA靶，2pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH7.5，以及50mM NaCl。将反应混合室温(21℃)下温育1-60分钟的各种长度的时间。温育后，将样品放置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

ssDNA探针4号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链在YOYO-1存在下温育导致反平行同源ssDNA:ssDNA复合体形成(图3A)。尽管反平行同源复合体形成的效率只有常规反平行互补dsDNA形成的65％(比较图1A和3A)，但是反平行同源ssDNA序列识别和结合还是通过YOYO-1促进而发生了。该结果是完全未预料到的。此外，反平行同源ssDNA:ssDNA复合体含有野生型序列，它们与那些含有1bp或2bp错配的复合体有明显区别。由1bp A-G错配DNA复合体(SEQID NO：7的反义链+探针4号)，1bp C-T错配DNA复合体(SEQ IDNO：6的反义链+探针4号)，以及连续2bp错配DNA复合体(SEQ IDNO：8的反义链+探针4号)所发射的荧光强度分别比由完全反平行同源复合体(SEQ ID NO：5的反义链+探针4号)所得到的要低25％，65％和71％(图3A)。随着探针和靶之间的同源程度降低，荧光发射水平降低。含有各个50聚体ssDNA靶加上500nM YOYO-1的对照样品所示的荧光水平比用完全匹配的复合体所观察到的要低88％-90％(图3A)。由15聚体ssDNA探针4号加上500nM YOYO-1所发射的荧光水平比单独由YOYO-1所产生的稍高些。

利用ssDNA靶和ssDNA-F探针既存在又缺乏50mM NaCl条件下对反平行同源ssDNA:ssDNA复合体形成进一步加以检查。ssDNA-F探针6号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链在50mM NaCl存在下温育15分钟后，形成反平行同源ssDNA:ssDNA-F复合体，正如其观察到的荧光与单独由探针6号所发射的比较降低34％(图3B)。温育15分钟后，反平行同源复合体形成的效率是反平行互补复合体形成的62％(数据未显示)。相比之下，反平行同源ssDNA:ssDNA-F复合体含有1bp A-G错配(SEQ ID NO：7的反义链+探针6号)，1bp C-T错配(SEQ ID NO：6的反义链+探针6号)，1bp A-T错配(SEQ IDNO：10的反义链+探针6号)，以及连续2bp错配(SEQ ID NO：8的反义链+探针6号)，在温育15分钟后，与单独由探针6号发射的比较，荧光分别降低24％，26％，23％和13％(图3B)。反平行同源双链体中相互作用碱基的构象明显不利于沃森-克里克互补A-T结合，导致荧光发射变化，指示1bp错配。较少的反平行同源复合体形成在50mM NaCl存在下温育30分钟后出现(数据未显示)。温育45分钟后，明显没有复合体形成。反平行同源复合体在没有NaCl的Tris缓冲液中观察到相似的形成速率和稳定性(数据未显示)。

由YOYO-1或NaCl促进，反平行同源ssDNA序列识别和结合发生在构象中，使得能区别完全匹配的ssDNA:ssDNA复合体以及那些含有1bp或2bp错配的复合体。反平行同源双链体中的碱基对的相互作用导致常规沃森-克里克A-T碱基对由于错配而去稳定。

实施例4

本实施例显示由单价阳离子促进形成平行互补ssDNA:ssDNA复合体的效率。杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmol ssDNA靶，2pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH 7.5，以及50mM NaCl。将反应混合室温(21℃)下温育1-60分钟的各种长度的时间。温育后，将样品放置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

在50mM NaCl存在下温育15分钟后，由完全互补序列组成的ssDNA:ssDNA-F双链体(SEQ ID NO：5的有义链+探针6号)容易形成，导致其荧光发射强度与单独由探针6号所发射的比较降低41％(图4)。这种平行互补双链体形成的高效是完全未预料的。相比之下，不完全互补ssDNA:ssDNA-F复合体含有1bp T-G错配(SEQ ID NO：7的有义链+探针6号)，1bp G-T错配(SEQ ID NO：6的有义链+探针6号)，1bp T-T错配(SEQ ID NO：10的有义链+探针6号)，以及连续2bp错配(SEQ ID NO：8的有义链+探针6号)生成的荧光发射强度与单独由探针6号所显示的比较，分别降低18％，20％，10％和16％(图4)。

一旦在50mM NaCl存在下形成，完全匹配的平行互补双链体极不稳定，温育30和45分钟后导致其荧光发射与单独由探针6号所发射的比较分别降低40％和47％(数据未显示)。1bp和2bp错配的平行互补复合体在50mM NaCl存在下温育30和45分钟后是非常不稳定的(数据未显示)。平行互补ssDNA:ssDNA-F形成的速率和效率在50mM NaCl存在下前45分钟温育过程中类似于反平行互补ssDNA:ssDNA-F形成(数据未显示)。而反平行互补复合体在50mMNaCl存在下温育60分钟后继续容易形成，此时没有明显的平行互补复合体形成(数据未显示)。

NaCl以类似功效促进了ssDNA-F探针和反平行互补ssDNA靶之间或ssDNA-F探针和平行互补ssDNA靶之间的DNA复合体形成，从而使得能区分完全匹配的复合体和那些含有1bp或2bp错配的复合体。

实施例5

实施例1-4表明了交替碱基识别和结合基元发生在反平行或平行ssDNA探针和互补或同源ssDNA靶之间生成ssDNA:ssDNA双链体，而非常规的反平行沃森-克里克互补dsDNA复合体。本实施例将显示碱基能够同时识别和相互作用于互补和同源碱基。

将2pmol ssDNA探针3号的样品在95℃下加热10分钟，并在各种浓度的游离碱基存在下冷却至室温，历时30分钟，产生含有共轭碱基的ssDNA探针。ssDNA探针3号的复制样品在没有外加的游离碱基条件下进行类似的变性和冷却，从而生成非共轭的ssDNA探针。然后，将2pmol的这些共轭或非共轭的ssDNA探针与2pmol ssDNA靶在500nM YOYO-1和0.5xTBE存在下混合，终反应体积为40μl。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。

当非共轭的ssDNA探针3号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型有义链或SEQ ID NO：7的50聚体突变有义链在YOYO-1存在下反应时，形成反平行互补ssDNA:ssDNA复合体(图5A)。由1bp T-G错配的反平行互补双链体(SEQ ID NO：7的有义链+探针3号)所发射的荧光强度要比由完全匹配的反平行互补双链体(SEQ ID NO：5的有义链+探针3号)所得到的低45％。对照样品含有各个50聚体ssDNA靶加上500nM YOYO-1，所示的荧光水平比用完全匹配的双链体所观察到的要低92％-93％(图5A)。由15聚体ssDNA探针3号加上500nM YOYO-1所发射的荧光水平比单独由YOYO-1所产生的稍高些。

当ssDNA探针3号与SEQ ID NO：5的50聚体野生型反义链在YOYO-1存在下反应时，平行同源ssDNA:ssDNA双链体形成的效率要比反平行互补ssDNA:ssDNA双链体形成的效率低14％(比较图5A和5B)。当SEQ ID NO：7的50聚体突变反义链与ssDNA探针3号在YOYO-1存在下反应时形成1bp A-G错配平行同源双链体，其产生的荧光发射强度要比由完全平行同源双链体所发射的低47％(图5B)。

15聚体ssDNA探针3号含有6个腺嘌呤碱基。2pmol ssDNA探针3号与3pmol游离胸腺嘧啶的共轭可导致探针3号内25％互补A或100％同源T结合到外加的胸腺嘧啶上。互补A-T结合在能量上是优选的。2pmol ssDNA探针3号(与3pmol胸腺嘧啶共轭)与2pmol SEQID NO：5的野生型反义链在YOYO-1存在下反应导致平行同源ssDNA:ssDNA复合体形成显著提高(图5B)。ssDNA探针与3pmol胸腺嘧啶共轭25％使得完全同源序列之间的平行同源复合体形成增加了78％。这种平行同源复合体形成的增加可归功于探针3号中的腺嘌呤与共轭互补胸腺嘧啶碱基以及与ssDNA靶中的同源腺嘌呤碱基能同时相互作用。此外，与可用的互补碱基相互作用对同源碱基及其相邻碱基所采用的同源结合构象是无害的。

相比之下，含有1bp A-G错配的平行同源复合体(SEQ ID NO：7的反义链+探针3号)形成的效率当用胸腺嘧啶将探针3号共轭25％时比用非共轭探针3号增加了16％(图5B)。这对应于当利用T-共轭的探针3号时，1bp A-G错配的平行同源复合体的荧光发射强度与完全匹配的平行同源复合体所观察到的相比降低了65％。ssDNA探针的共轭增加了区分完全匹配的平行同源复合体和1bp错配平行同源复合体的特异性。

显然，当用胸腺嘧啶共轭25％的探针3号与SEQ ID NO：5的有义链在YOYO-1存在下反应时(图5A)，完全匹配的反平行互补ssDNA:ssDNA复合体形成增强了48％。探针3号中的腺嘌呤与共轭的互补胸腺嘧啶和ssDNA靶中的互补T同时相互作用增加了完全匹配的反平行互补复合体的形成。显然，1bp T-G错配反平行互补复合体的形成当采用T-共轭的探针3号时非常低效，导致其荧光发射强度与由含有共轭T的完全匹配的反平行互补复合体所生成的比较降低了88％(图5A)。通过利用共轭的ssDNA探针在YOYO-1存在下极大提高了完全匹配和1bp错配的反平行互补ssDNA:ssDNA复合体之间的区分，这也是显著的。

用胞嘧啶或鸟苷使探针3号共轭25％，也提高了在YOYO-1存在下反平行互补和平行同源ssDNA:ssDNA复合体形成的效率以及改进了完全匹配的复合体和1bp错配的复合体之间区分的特异性(数据未显示)。

含有共轭碱基的ssDNA:ssDNA复合体的形成证明，序列中的碱基可特异性和同时识别和相互作用于互补碱基和同源碱基，条件是共轭碱基为沃森-克里克互补碱基，其位于一条链上与另一条链特异性结合。ssDNA探针中的碱基、共轭碱基和ssDNA靶中的碱基之间的识别和结合构象可类似于本文所述的反平行和平行dsDNA:ssDNA复合体中所形成的碱基构象。

实施例6

实施例6表明在含有混合碱基序列的dsDNA靶和标记有荧光素的同源dsDNA探针之间形成四链体DNA。四链体DNA形成由反应中加入的单价阳离子的存在而得以增强。

如上所述，将互补有义和反义15聚体ssDNA序列合成，通过HPLC纯化以及退火，生成15聚体dsDNA探针。使dsDNA探针以浓度为1pmol/μl稀释在双蒸馏水中。

探针11号为在其各个5’位置连接有荧光素部分的15聚体dsDNA探针，并且设计成与50聚体野生型靶DNA(SEQ ID NO：5)的中央15bp区段完全同源。

探针11号的有义链序列(SEQ ID NO：22)为：5′-Flu-CTG TCA TCTCTG GTG-3′。

探针11号的反义链序列(SEQ ID NO：22)为：5′-Flu-CAC CAG AGATGA CAG-3′。

各个杂交反应混合物(40μl)含有下列组分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′-荧光素标记的dsDNA探针11号，10mM Tris-HCl pH 7.5和100mM KCl。将反应混合物室温(21℃)下温育1小时，无需预变性。将样品置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。图6示出对各个分析样品以波长为函数作图的荧光强度。

在缺乏KCl时，未检测到dsDNA靶和探针11号之间的结合，导致当野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)或突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)与dsDNA探针11号混合时或当dsDNA探针11号单独存在时所观察到的荧光强度相似(数据未显示)。

在21℃存在100mM KCl条件下温育1小时后，由dsDNA靶(SEQID NO：5)和dsDNA探针11号上完全同源序列组成的dsDNA:dsDNA-F四链体容易形成，导致荧光发射强度与单独由dsDNA探针11号(标记dsDNA-F)所发射的比较降低62％(图6)。相比之下，不完全同源的dsDNA:dsDNA-F四链体(SEQ ID NO：7+探针11号)含有1碱基对错配在这些反应条件下是较不稳定的，与单独由dsDNA探针11号所显示的比较，其荧光强度仅有18％的降低。

以特定浓度存在的诸如K⁺的单价阳离子足以使得在缺乏预变性条件下在dsDNA靶和标记有荧光素的dsDNA探针之间形成四链体。四链体形成发生在同源碱基对亲和性基础之上，在完全同源双链体链之间形成的四链体是可测量的和其量显著更大。此外，利用天然dsDNA，室温下温育仅1小时就发生了反应，探针∶靶的比率为10∶1。本实施例中所用的dsDNA靶和dsDNA探针是同源的，GC含量为53％，并且在任何DNA链上不含有同型嘌呤或同型嘧啶延伸。本发明的分析利用dsDNA探针能鉴定完全同源的dsDNA序列和那些含有一对错配碱基的dsDNA序列。

实施例7

在实施例6中进行的四链体DNA分析受到了反应混合物中外加的单价阳离子的促进。利用二价阳离子对分析的特异性进一步加以检查，以促进dsDNA靶和GC含量为53％的dsDNA-F探针形成四链体DNA。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′荧光素标记的dsDNA探针11号，10mM Tris-HCl pH 7.5，以及20mM MnCl₂和20mM MgCl₂。将反应混合物室温(21℃)下温育1小时，无需预变性。样品置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。图7示出对各个分析样品以波长为函数作图的荧光强度。

当dsDNA-F探针11号(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)或突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)在20mM MnCl₂和20mM MgCl₂存在下温育时，四链体在非变性条件下室温下形成。当完全同源的DNA四链体产生的荧光强度最大降低34％时，较不利的含有1bp错配的dsDNA:dsDNA-F(SEQ ID NO：7+探针11号)所产生的荧光强度与单独用dsDNA探针11号所观察的大约相同(图7)。

诸如Mn⁺²和Mg⁺²的二价阳离子的存在促进了非变性条件下四链体的形成，使得能准确区分完全同源的dsDNA靶和dsDNA探针的四链体和含有一对错配碱基的四链体序列。

实施例8

实施例6和7中进行的四链体DNA分析受到了反应混合物中外加单价阳离子或二价阳离子的促进。下一个实施例表明当利用DNA嵌入剂YOYO-1时，同源四链体DNA分析的特异性。

如上所述，互补有义和反义15聚体ssDNA序列合成，通过HPLC纯化以及退火，生成15聚体dsDNA探针。将dsDNA探针以浓度为1pmol/μl稀释在双蒸馏水中。

探针12号为在序列上与探针11号相同的15聚体dsDNA探针，但是没有连接5′荧光素部分。

探针12号的有义链序列(SEQ ID NO：23)为：5′-CTG TCA TCT CTGGTG-3′。

探针12号的反义链序列(SEQ ID NO：23)为：5′-CAC CAG AGATGA CAG-3′。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：0.4pmol dsDNA靶，4pmol dsDNA探针12号，0.5xTBE和500nM YOYO-1。将反应混合物21℃下温育5分钟，放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

没有探针或靶，只有YOYO-1存在时所观察到的荧光强度示于图8中。图8还显示当dsDNA探针12号与含有同源序列的野生型50聚体dsDNA靶(SEQ ID NO：5)或与其他四个dsDNA靶组成反应混合物时所观察到的荧光强度，所述其他四个dsDNA靶如没有一个错配碱基对，就含有与dsDNA探针12号中碱基序列同源的序列。当同源野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)与dsDNA探针12号存在于反应混合物中时，产生了最大的荧光强度。当错配的dsDNA靶与dsDNA探针12号在反应混合物中温育时，与由完全匹配的四链体所获得的比较，生成的荧光强度从对dsDNA靶(SEQ ID NO：10)而言低20％，至对dsDNA靶(SEQ ID NO：11)而言低80％(图8)。

当探针含有完全同源序列时，比当有单一碱基对，其与dsDNA靶中的碱基对不同源，也就是相同时，观察到由YOYO-1嵌入稳定的同源四链体在dsDNA靶和dsDNA探针之间更容易形成。上文三个实施例中所述的四链体复合体被我们称为镜像同源。

实施例9

在此实施例中，将50聚体dsDNA靶与GC含量为53％的15聚体dsDNA探针(探针13号)接触，其中当一条双链体的大沟放置于其他双链体的小沟中时，探针链的碱基和靶链的近碱基之间存在沃森-克里克互补性。双链体探针中的碱基序列不是同源的，但是它们与双链体靶中的那些碱基序列的关系是颠倒的。当把大沟嵌套在小沟中时，双链体相互是平行的，并被我们称为嵌套互补性。

探针13号的有义链序列(SEQ ID NO：24)为：5′-GAC AGT AGAGAC CAC-3′。

探针13号的反义链序列(SEQ ID NO：24)为：5′-GTG GTC TCT ACTGTC-3′。

杂交反应混合物(40μl)分别含有下列组分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol dsDNA探针13号，0.5xTBE和100nM YOYO-1。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，放置在石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

图9举例说明在缺乏预变性的条件下，当野生型50聚体dsDNA靶(SEQ ID NO：5)与15聚体dsDNA探针13号反应时，得到最高的荧光强度，所述探针13号在嵌套互补性基础上完全匹配于dsDNA靶(SEQID NO：5)。在dsDNA靶和嵌套互补性dsDNA探针之间形成四链体的情形下，荧光强度是DNA结合发生的指征。

突变dsDNA靶与双链体探针有单一碱基对的错配，当匹配在嵌套互补性的反向同源性基础上加以评价时，该突变dsDNA靶比完全互补性野生型dsDNA靶与dsDNA探针可测量地形成更少的四链体复合体。各种错配在实施例8中基于镜像同源性加以分析，而在本实施例中基于嵌套互补性加以分析。

如图9所示，以1bp错配的dsDNA靶加上dsDNA探针13号形成四链体，其所产生的荧光强度比由完全匹配的四链体(SEQ ID NO：5+探针13号)所得到的少8％-16％。

在实施例8中完全同源和部分同源的四链体之间观察到荧光最大的区别。这提示完全互补或1bp错配的嵌套互补性dsDNA探针比镜像同源dsDNA探针与dsDNA靶的结合更不易区分，后者结合具有更高的特异性。

本实施例表明，嵌套互补性DNA双链体之间的沃森-克里克四链体结合在YOYO-1存在下容易发生。

实施例10

实施例10表明，当阳离子解缩合剂，诸如DNA嵌入剂YOYO-1存在时，本发明的分析可区分完全匹配的沃森-克里克互补dsDNA:ssPNA复合体以及含有1bp，2bp和3bp错配的dsDNA:ssPNA复合体。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmol靶dsDNA，2pmol ssPNA探针，0.5xTBE和500nM YOYO-1。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。

没有DNA或PNA，只有YOYO-1存在时或野生型SEQ ID NO：1，突变SEQ ID NO：2或突变SEQ ID NO：3与反平行PNA探针1号或平行PNA探针2号反应时所观察到的荧光强度分别示于图10A和10B中。由完全互补序列组成的dsDNA:ssPNA复合体(SEQ ID NO：1+探针1号)使得在YOYO-1和复合体之间相互作用最大，生成最高的荧光强度(图10A)。一个碱基对错配的dsDNA:ssPNA复合体(SEQ ID NO：2+探针1号)和两个碱基对错配的dsDNA:ssPNA复合体(SEQ ID NO：3+探针1号)的荧光强度分别比完全匹配的dsDNA:ssPNA复合体低97％和99％(图10A)。同样，当平行PNA探针2号与靶dsDNA序列结合时，一个和两个碱基对错配的dsDNA:ssPNA复合体所示的荧光强度分别比完全互补的dsDNA:ssPNA复合体(SEQ ID NO：1+探针号2)低92％和97％(图10B)。三个碱基对错配的dsDNA:ssPNA复合体由SEQ IDNO：4和探针1号，或者由SEQ ID NO：4和探针2号组成，其产生的荧光强度分别比完全匹配的dsDNA:ssPNA复合体低99％和97％(数据未显示)。对照样品含有50聚体dsDNA靶加上500nM YOYO-1，其所示的荧光水平等于或低于用3bp错配的复合体所观察的荧光水平(数据未显示)。由ssPNA探针加上500nM YOYO-1一起发射的荧光水平与单独由YOYO-1所发射的相同(数据未显示)。随着探针和靶之间的错配程度增加，YOYO-1与错配复合体的相互作用水平降低。因而，荧光发射强度降低。无论采用反平行或平行PNA探针，都存在这种关系。由各个复合体所发射的荧光特征水平随时间加以监控，并在5分钟-24小时之间稳定。

有趣的是，当15聚体靶dsDNA序列与15聚体PNA探针序列反应时，采用平行PNA探针比采用反平行PNA探针在完全匹配的复合体和1或2bp错配的复合体之间观察到的荧光发射差异更大(数据未显示)。

因此，荧光强度分析测定dsDNA:ssPNA复合体形成，能区分野生型序列和那些含有1bp，2bp或3bp突变的序列，无需对双链体DNA靶进行预变性。

实施例11

分析测定由YOYO-1促进形成三链体的特异性，通过野生型和混合碱基序列的突变dsDNA靶与反平行和平行ssDNA探针在缺乏dsDNA靶的预变性条件下反应而加以进一步研究。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：2pmol靶dsDNA，2pmol ssDNA探针，0.5xTBE和500nM YOYO-1。将反应混合物室温(21℃)下温育5分钟，置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。

当反平行ssDNA探针3号(GC含量为53％)与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：8)反应时，室温下在非变性条件下形成dsDNA:ssDNA复合体(图11A)。当完全匹配的DNA复合体发射最高的荧光强度时，含有1bp错配的不完全互补复合体(SEQ ID NO：6+探针3号)和连续2bp错配的不完全互补复合体(SEQ ID NO：8+探针3号)产生的荧光强度分别比用完全匹配序列所观察到的低63％和95％(图11A)。随着探针和靶之间错配程度增加，荧光水平降低。由各个复合体所示的特征荧光强度随时间加以监测，并在5分钟-24小时之间稳定。对照样品含有50聚体dsDNA靶加上500nM YOYO-1，所示的荧光水平低于用2bp错配的DNA复合体所观察到的荧光水平(数据未显示)。由ssDNA探针加上500nM YOYO-1所产生的荧光水平与单独由YOYO-1所得到的相同(数据未显示)。当15聚体反平行ssDNA探针与GC含量为33％和73％的野生型或突变50聚体dsDNA靶在同样反应条件下反应时获得十分类似的结果，这表明了利用反平行ssDNA探针进行dsDNA:ssDNA复合体形成分析的可靠性，其不依赖于ssDNA探针和dsDNA靶的GC百分比含量(数据未显示)。

同样，当平行ssDNA探针4号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ IDNO：5)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8)在YOYO-1存在下反应时形成dsDNA:ssDNA复合体。1bp错配的DNA复合体(SEQID NO：6+探针4号)和连续2bp错配的DNA复合体(SEQ ID NO：8+探针4号)的荧光强度分别比由完全匹配的序列所得到的低48％和65％(图11B)。随着探针和靶之间的错配程度增加，荧光发射水平减少。利用平行ssDNA探针生成dsDNA:ssDNA复合体比利用反平行ssDNA探针生成dsDNA:ssDNA复合体，观察到完全匹配和错配的DNA复合体之间区分稍少些。

YOYO-1促进了反平行ssDNA探针和dsDNA靶之间以及平行ssDNA探针和dsDNA靶之间形成DNA复合体，从而区分完全匹配的复合体和那些含有1bp或2bp错配的复合体，无需对dsDNA靶进行预变性。

实施例12

实施例10和11中形成的复合体被存在于反应混合物中的DNA嵌入剂YOYO-1稳定。利用二价阳离子促进和稳定dsDNA靶和ssDNA-F探针之间形成的复合体，对分析的特异性进一步加以检查。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH 7.5，以及MnCl₂和MgCl₂各为1-20mM。将反应混合物室温(21℃)下温育1分钟-2小时的各种时间长度，无需对dsDNA靶进行预变性。温育后，将样品置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

当反平行ssDNA-F探针5号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ IDNO：5)在15mM MgCl₂和15mM MnCl₂存在下温育1小时时，非常有效地形成完全互补dsDNA:ssDNA-F复合体，生成的荧光与单独由探针5号获得的比较降低74％(图12A)。相比之下，含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)在15mM MgCl₂和15mM MnCl₂存在下很不稳定，温育1小时后，生成的荧光与单独由探针5号所发射的比较减少15％(图12A)。当探针号5(GC含量为53％)与dsDNA靶SEQ ID NO：9(GC含量为33％)反应时，观察到的荧光与单独由探针5号所获得的比较增加了3％(图12A)，指示没有DNA复合体形成。考虑到这种探针和靶的组合会导致5bp错配，该结果是预料中的。

在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下，dsDNA:ssDNA-F复合体具有53％GC含量，并含有完全互补序列(SEQ ID NO：5+探针5号)或1bp T-G错配的序列(SEQ ID NO：7+探针号5)，温育1小时后，生成的荧光强度与单独由探针5号所发射的比较，分别低68％和20％，而温育30分钟后分别低76％和16％(数据未显示)。温育1小时后测试，加入5mM MgCl₂和5mM MnCl₂(或更低浓度)不足以让复合体在反平行ssDNA-F探针5号和所有dsDNA靶之间形成(数据未显示)。

当平行ssDNA探针6号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5)和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)反应时也形成dsDNA:ssDNA复合体。在这种情形下，用更低浓度的MgCl₂和MnCl₂(即各为1-5mM)促进DNA复合体形成，要求更短的温育期。在1mM MgCl₂和1mM MnCl₂或2mM MgCl₂和2mM MnCl₂的存在下温育15分钟足以生成DNA复合体(数据未显示)。在3mM MgCl₂和3mM MnCl₂存在下温育45分钟后，完全匹配的DNA复合体(SEQ ID NO：5+探针6号)和1bp错配的DNA复合体(SEQ ID NO：7+探针6号)的荧光强度分别比单独由平行ssDNA探针6号所获得的要低29％和6％(图12B)。

尽管在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂下温育1小时后，容易形成DNA复合体，但采用平行ssDNA探针时，观察到在完全匹配和错配的复合体之间没有区别。高于15mM MgCl₂和15mM MnCl₂的浓度对采用平行ssDNA探针形成DNA复合体有抑制作用(数据未显示)。

加入盐桥，诸如二价阳离子的缩合剂，促进在非变性dsDNA靶和荧光标记的反平行或平行ssDNA探针之间形成DNA复合体，从而使得准确和可靠的区别完全互补序列和那些含有1bp突变的序列。反应发生在室温下温育15-60分钟内，探针∶靶的比率为10∶1。dsDNA靶和ssDNA探针不含有DNA同型嘌呤或同型嘧啶的延伸。尽管有5个嘧啶碱基散布在15个核苷酸ssDNA探针内，但是以序列特异的方式容易形成DNA复合体。

实施例13

当利用单价阳离子来促进和稳定利用dsDNA靶形成的复合物时，不同方向性的探针的效用也得到评价。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：0.4pmol靶dsDNA，4pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH 7.5，以及10-150mM NaCl。将反应混合室温(21℃)下温育1分钟-2小时的各种长度的时间，无需对dsDNA靶进行预变性。温育后，将样品放置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。最大荧光强度出现在波长525nm处，这是荧光素的辐射波长。对各个分析样品以波长为函数将荧光辐射强度绘图。

在缺乏NaCl或存在10mM或25mM NaCl时，在全部温育期后，都未检测到dsDNA靶(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)与反平行ssDNA-F探针7号之间的结合(数据未显示)。

在50mM NaCl存在下温育1小时后，由完全互补序列(SEQ IDNO：1+探针7号)组成的dsDNA:ssDNA-F复合体容易形成，导致荧光发射强度与同样温育在反应混合物中的对照探针7号所发射的比较降低49％(图13A)。相比之下，不完全互补的dsDNA:ssDNA-F复合体含有1bp G-T错配(SEQ ID NO：2+探针7号)，生成的荧光发射强度与由探针7号对照样品所示的比较降低11％。

在反应混合物中存在75mM，100mM和125mM NaCl也导致荧光发射猝灭，这与完全匹配的SEQ ID NO：1靶和反平行探针7号之间形成显著量的复合体一致，以及当1bp G-T错配的SEQ ID NO：2靶和探针号7存在时，导致显著较少的猝灭，产生的荧光强度与在50mMNaCl存在下所观察到的相似(数据未显示)。

当平行ssDNA探针6号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ ID NO：5和突变dsDNA靶(SEQ ID NO：7)在50mM，75mM，100mM或150mMNaCl存在下反应时，也形成dsDNA:ssDNA复合体。最佳的结果在100mM NaCl存在下获得。在含有100mM NaCl的反应混合物中室温下温育75分钟后，完全匹配的DNA复合体(SEQ ID NO：5+探针号6)和1bp错配的DNA复合体(SEQ ID NO：7+探针号6)的荧光发射强度分别比由对照平行ssDNA探针6号在相同条件下反应所获得的要低53％和9％(图13B)。在温育45分钟期间50mM NaCl促进了完全匹配和错配的复合体之间最大的区分(数据未显示)。总之，含有反平行或平行ssDNA探针的复合体似乎以类似的效率、在类似的NaCl浓度和温育期下形成。

利用已知是DNA缩合剂的单价阳离子，促进了在非变性dsDNA靶和荧光标记的反平行或平行ssDNA探针之间形成DNA复合体，从而允许可靠地区分含有完全互补序列的复合体和那些含有1bp错配序列的复合体。

实施例14

室温下温育5分钟内容易形成由YOYO-1促进的dsDNA:ssDNA复合体，并以同样水平的强度生成荧光发射数小时。含有碱基对错配的复合体类似地发射持续的荧光信号，这说明随时间形成同样水平的复合体。为了检查在诸如阳离子的缩合剂存在下形成的dsDNA:ssDNA复合体的形成速率，稳定性和解离速率，进行时间过程实验。

杂交反应混合物(40μl)各含有下列组分：0.4pmol非变性靶dsDNA，4pmol 5′荧光素标记的ssDNA探针，10mM Tris-HCl pH 7.5，以及10mM MgCl₂和10mM MnCl₂。将反应混合室温(21℃)下温育1分钟-2小时的各种期间。温育后，将样品放置于石英杯中，用波长为488nm的氩离子激光束照射，并且检测荧光辐射。在所示时间，在后续多激光照射后，进一步对相同样品进行荧光测定(图14)。对各个分析样品以波长为函数将荧光强度绘图。

由含有4pmol探针5号加上10mM MgCl₂和10mM MnCl₂的对照样品在缺乏靶dsDNA时发射的荧光，在仅仅温育5分钟内就显著降低了3倍(数据未显示)，然后在接着的数小时内以更慢的速率稳定地下降(图14A)。这种效应我们称作“阳离子猝灭”。此荧光抑制，与ssDNA-F探针与特异阳离子温育期的增加相关，通常在二价阳离子存在下发生，但是在单价阳离子存在下不发生(数据未显示)。该观察使得以与实验的测试样品反应完全相同的条件在实验中温育对照样品的重要性显而易见。温育不同期间后，各个ssDNA-F对照样品的多激光抑制了荧光团的进一步猝灭，导致其后荧光水平的稳定(图14A)。此结果是完全未预料到的。

当反平行ssDNA-F探针5号与50聚体野生型dsDNA靶(SEQ IDNO：5)在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下温育时，温育15分钟后，明显形成dsDNA:ssDNA-F复合体，导致荧光降低，其比对照探针5号的进行性阳离子猝灭高出6％(比较图14A和14B)。SEQ ID NO：5与探针5号在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下温育30和60分钟后，大大显示复合体形成，生成的荧光与单独由阳离子猝灭的探针5号所获得的比较，分别降低76％和61％(图14B)。在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下温育90和120分钟后，没有信号显示形成复合体(图14B)。90和120分钟所见的荧光发射水平可完全归功于阳离子猝灭效应(比较图14A和14B)。

相比之下，含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA-F复合体(SEQ IDNO：7+探针5号)以更慢的速率形成，并且一旦在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下形成更不稳定。温育30分钟后，首先观察到1bp T-G错配的复合体，而温育60分钟后，又似乎已得以消除(图14C)。再一次，探针反平行于双链体中的互补链(图14C)。

多激光照射在10mM MgCl₂和10mM MnCl₂存在下温育30或60分钟后形成的完全互补的dsDNA:ssDNA复合体(SEQ ID NO：5+探针5号)，导致荧光发射以含有反平行ssDNA探针的DNA复合体特有的速率与这些复合体的破坏一致(图14B)。当30分钟时对完全互补的复合体发射激光后，在45分钟时进行随后的测定，发射强度为1869，这是复合体迅速破坏的证据(数据未显示)。荧光发射水平在多激光发射后，返回到单独由未复合的探针5号对照所观察到的阳离子猝灭值(比较图14A和14B)。唯一的例外是温育15分钟后形成并在其后反复照射的完全匹配的复合体(图14B)。在这种情形下，荧光发射与复合体破坏不一致(图14B)，即使进一步阳离子猝灭探针5号，当温育15分钟后加以多照射时，受到完全抑制(图14A)。含有1bp T-G错配的dsDNA:ssDNA复合体(SEQ ID NO：7+探针5号)同样受到多激光发射的明显破坏(图14C)。

进行实验以确定多激光发射对复合体影响的基础。当新鲜阳离子加入到已被激光发射两次的反应混合物中时，发现在由ssDNA-F探针所发射的荧光中抑制阳离子猝灭可能不是反向的，此外，阳离子猝灭不发生在进一步温育后，这强烈提示ssDNA-F探针通过仍未知的机制被多照射失活(数据未显示)。同样，当新鲜ssDNA-F探针加入到已经被激光发射两次的反应混合物中时，在对新鲜探针的荧光发射增加规格化后，在进一步温育反应混合物时，没有观察到随后的进行性阳离子猝灭，这强烈提示激光发射的阳离子不知何故失效了(数据未显示)。

在前述实施例和说明中，我们已经阐述了杂聚核酸链基于同源碱基配对可特异性结合。这些结合可发生在平行或反平行链中。

我们还阐述了结合在沃森-克里克互补双链体中的核酸碱基相对于邻近核酸链的碱基不是静止不动的，并且阐述了依据由可能的结合基元所确定的碱基邻近序列的结合潜力，基于沃森-克里克互补碱基配对或同源碱基配对，这些碱基可相互作用。双链体中的碱基是否与第三链中的碱基相互作用形成特异性结合的三链体结构或者双链体的碱基是否与自身偶合到沃森-克里克互补双链体中的邻近碱基特异性相互作用，这是真实的。因此，本发明包括下列发现：沃森-克里克偶合的碱基作为与其他链上的邻近碱基相互作用和结合的特异碱基保留活性，并且这样做具有更高的特异性和敏捷性。虽然所有这一切是显而易见的，但是尤其显著的想法是A:T和G:C配对作为结合反应中的错配而加以检测，其中同源结合基元是显性的，并通过链宽规则被强迫在所有碱基对上。同样显而易见的是，同源四链体结合比沃森-克里克互补四链体结合更特异。不可避免，四链体结合发生在双链体偶合碱基或碱基对的大沟一侧以及双链体偶合的碱基或碱基对的小沟一侧之间。迄今为止，虽然进一步通过已经复合在双链体中的碱基结合的潜力是未知的，但是已经假定双链体中碱基的第三条链识别唯一发生在双链体的大沟中。我们所示的不是这种情形。我们还已经表明公认的骨架排斥不是双链体：双链体相互作用的障碍。

本发明涉及容易实现的结合反应，其在室温下通常以短的温育期获得，以及其不依赖于过摩尔量的试剂以驱动反应。因此，本发明显示不仅容易获得，而且显然是生物相关的。

最后，我们已经显示与游离碱基的部分沃森-克里克互补共轭可归功于双链体结合增加和特异性增加。

本发明组成了对碱基结合的知识的实质增加，并且同样将是阐明许多生物功能的核心，这些功能的机制目前是神秘的，诸如基因沉默。

最明显的是通过事先和稳定地偶合到沃森-克里克互补双链体中的碱基来检测特异同源识别和结合。

我们相信，我们已经阐明的东西将要求放弃许多“经典的”理念，并且重新打开了核酸结合力的潘多拉盒。

虽然本发明参照其特异实施例已详细加以描述，但对本领域专业人员来说在不背离本发明实质和范围的情形下，可对其进行各种改变和修饰将是一目了然的。

序列表

<110>英詹尼斯公司(Ingeneus Research)

<120>核酸及其类似物的平行或反平行，同源或互补结合形成双链体，三链体或四链体复

合体(Parallel and Antiparallel Duplex，Triplex and Quadruplex Complexes ofNucleic Acids and Analogues thereof)

<130>SCT040187-47

<150>US 09/664,827

<151>2000-09-19

<150>US 09/613,263

<151>2000-07-10

<160>24

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人囊性纤维化基因的外显子10

<400>1

tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50

<210>2

<211>50

<212>DNA

<213>人囊性纤维化基因的外显子10

<400>2

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<210>3

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<400>3

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<210>4

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<210>5

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<210>6

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gagcaccatg acagacactg tactctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50

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tggcaccatt aaagaaaata tcattggtgt ttcctatgat gaatata 47

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gagcaccatg acagacactg tcttctctgg tgtgtcctac gatgactctg 50

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<221>misc_特征

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<223>5′端以H开始，3′端以赖氨酸-CONH2结束

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<221>misc_特征

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<223>5′端以H开始，3′端以赖氨酸-CONH2结束

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tatagtagaa accac 15

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<223>5′位上连接荧光素部分

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<223>5′位上连接荧光素部分

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<223>5′位上连接荧光素部分

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<223>5′位上连接荧光素部分

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<400>24

gacagtagag accac 15

Claims

1.一种复合体，其包含：

含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列的探针；以及

含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列的靶，

其中：(a)所述探针和所述靶中的至少一种是纯化的或合成的；以及(b)所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用或通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，其特征在于(i)所述复合体为双链体，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合；(ii)所述复合体为双链体，所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列平行于所述杂聚靶序列；(iii)所述复合体为不含重组蛋白的三链体；或(iv)所述复合体为四链体。

2.权利要求1的复合体，其中所述复合体为双链体。

3.权利要求1的复合体，其中所述探针和所述靶中的一种为单链的，而另一种为双链的，以及所述复合体为三链体。

4.权利要求3的复合体，其中所述复合体不含PNA。

5.权利要求3的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

6.权利要求3的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

7.权利要求3的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行；(b)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二链；以及(c)所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述第二杂聚靶序列结合。

8.权利要求3的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性反平行，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

9.权利要求3的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性反平行，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

10.权利要求3的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性反平行；(b)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二链；以及(c)所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述第二杂聚靶序列结合。

11.权利要求1的复合体，其中所述探针和所述靶是双链的，以及所述复合体是四链体。

12.权利要求11的复合体，其中所述复合体不含有PNA。

13.权利要求11的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

14.权利要求11的复合体，其中所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合。

15.权利要求11的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行；(b)所述探针包括含有所述杂聚探针序列的第一探针链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚探针序列的第二杂聚探针序列的第二探针链；(c)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一靶链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二靶链；以及(d)所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用任选与所述第二杂聚靶序列结合。

16.权利要求11的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性平行；(b)所述探针包括含有所述杂聚探针序列的第一探针链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚探针序列的第二杂聚探针序列的第二探针链；(c)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一靶链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二靶链；以及(d)所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用任选与所述第二杂聚靶序列结合。

17.权利要求11的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性反平行；(b)所述探针包括含有所述杂聚探针序列的第一探针链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚探针序列的第二杂聚探针序列的第二探针链；(c)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一靶链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二靶链；以及(d)所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用任选与所述第二杂聚靶序列结合。

18.权利要求11的复合体，其中：(a)所述杂聚探针序列和所述杂聚靶序列的方向性反平行；(b)所述探针包括含有所述杂聚探针序列的第一探针链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚探针序列的第二杂聚探针序列的第二探针链；(c)所述靶包括含有所述杂聚靶序列的第一靶链以及含有互补和反平行于所述第一杂聚靶序列的第二杂聚靶序列的第二靶链；以及(d)所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用任选与所述第二杂聚靶序列结合。

19.权利要求1的复合体，其中所述探针位于所述靶的小沟中。

20.权利要求1的复合体，其中所述探针位于所述靶的大沟中。

21.权利要求3的复合体，其中所述探针的碱基同时与所述靶的两条链上的碱基相互作用。

22.权利要求11的复合体，其中所述探针的碱基同时与所述靶的两条链上的碱基相互作用。

23.权利要求1的复合体，其中探针的骨架包括脱氧核糖磷酸。

24.权利要求1的复合体，其中探针的骨架为不带电荷、带部分负电荷或带正电荷的。

25.权利要求1的复合体，其中所述探针中的至少一个碱基是天然存在的碱基的合成类似物，根据沃森-克里克互补性或同源结合具有特异的结合亲和力。

26.权利要求1的复合体，其进一步包括至少一种与所述探针和所述靶中的至少一种结合的游离碱基，核苷酸或核苷。

27.权利要求1的复合体，进一步包括至少一种与所述探针和所述靶中的至少一种结合的蛋白或酶。

28.权利要求1的复合体，其中所述复合体以体外，体内或硅片形式存在于溶液中，固相支持物上。

29.权利要求1的复合体，其中所述探针为通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合的杂聚PNA，以及所述靶为双链体。

30.权利要求29的复合体，其中所述探针侵入所述双链体靶中从而结合到所述杂聚靶序列上。

31.权利要求1的复合体，其中所述探针为双链体，以及所述探针中的至少一条链是不带电荷，带部分负电荷或带正电荷的，并且所述靶是单链或双链的。

32.权利要求1的复合体，进一步包括至少一种结合促进剂。

33.一种分析靶的方法，所述方法包括：

提供含有靶的样品，所述靶含有核酸或核酸类似物的杂聚靶序列；

提供含有核酸或核酸类似物的杂聚探针序列的探针；

提供含有所述靶、所述探针、水和缓冲液的杂交混合物；

将上述杂交混合物温育一段有效时间，以使所述杂聚靶序列与所述杂聚探针序列结合生成复合体；以及

检测与所述探针和所述靶之间的结合亲和性相关的信号以分析所述靶，

其中所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用或通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，条件是当所述复合体为双链体且所述杂聚探针序列反平行于所述杂聚靶序列时，所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，以及条件是当所述复合体为三链体时，所述复合体不含重组蛋白。

34.权利要求33的方法，其中所述杂聚探针序列的碱基和所述杂聚靶序列的碱基之间的匹配和错配得以检测。

35.权利要求33的方法，其中所述探针和所述靶是单链的，以及所述复合体为双链体，其中(a)所述杂聚探针序列通过同源碱基相互作用与所述杂聚靶序列结合，并且所述杂聚探针序列平行或反平行于所述杂聚靶序列；(b)所述杂聚探针序列通过沃森-克里克互补碱基相互作用与与所述杂聚靶序列结合，并且所述杂聚探针序列平行于所述杂聚靶序列。

36.权利要求33的方法，其中所述探针和所述靶中的一种是单链的，而另一种是双链的，以及所述复合体为三链体。

37.权利要求33的方法，其中所述探针和所述靶是双链的，以及所述复合体为四链体。

38.权利要求33的方法，其中所述靶共价结合到支持物、表面或半渗透的膜上。

39.权利要求33的方法，其中所述探针共价结合到支持物、表面或半渗透的膜上。

40.权利要求33的方法，其中将电流或电磁力施加到所述复合体上以生成或改变所述信号。

41.权利要求33的方法，其中所述探针或所述靶共价结合到支持物、表面或半渗透的膜上，并把电流或电磁力施加到所述复合体上以生成或改变所述信号。

42.权利要求33的方法，其进一步包括反复改变所述杂交混合物的条件以改变所述信号，其中所述靶响应于所述改变以信号方差为函数加以分析。

43.权利要求42的方法，其中所述改变导致所述探针从所述复合体中与所述靶解离。

44.权利要求42的方法，其中所述改变包括向所述杂交混合物施加第一刺激和第二刺激，所述第一刺激与所述第二刺激的大小相同但极性相反。

45.权利要求42的方法，其中所述改变包括施加一系列刺激，各种所述刺激都是相同的。

46.权利要求33的方法，其中所述信号由至少一种共价结合到所述探针上的标记所发射。

47.权利要求33的方法，其中所述信号由至少一种共价结合到所述靶上的标记所发射。

48.权利要求33的方法，其中所述信号由至少一种非共价与所述复合体结合的标记所发射。

49.权利要求33的方法，其中所述探针侵入所述靶，取代与所述杂聚靶序列结合的碱基序列，以便杂聚探针序列的碱基根据沃森-克里克碱基识别或同源碱基识别与杂聚靶序列的碱基结合。

50.权利要求33的方法，其中将所述探针和所述靶中的至少一种以脱水形式导入所述杂交混合物中。

51.权利要求33的方法，其中所述方法的进行无需使所述探针或所述靶变性。

52.权利要求33的方法，其中所述杂交混合物进一步包括至少一种结合促进剂。

53.权利要求52的方法，其中所述至少一种促进剂为缩合剂或解缩合剂。

54.权利要求52的方法，其中所述促进剂选自：YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花菁二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、花菁单体、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1、乙锭同型二聚体-2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭吖啶异型二聚体、单叠氮化乙锭、碘化丙锭、SYTO染料、SYBR绿1、SYBR染料、皮可绿、SYTOX染料以及7-氨基放线菌素D。

55.权利要求52的方法，其中所述至少一种促进剂的浓度有利于所述复合体的一种结合基元，而不利于所述复合体的其他可能的结合基元。

56.权利要求33的方法，其进一步包括对所述靶通过光学制作图谱或进行测序。

57.权利要求33的方法，其中所述信号包括一系列在连续变化的条件下检测的信号。

58.权利要求33的方法，其中所述解离的所述特性与所述探针和所述靶之间的结合亲和力相关。

59.权利要求33的方法，其中：(a)提供同源结合条件，以及不完全同源探针以减小的效率与所述靶不结合或结合，或者(b)提供沃森-克里克互补结合条件，以及不完全互补探针以减小的效率与所述靶不结合或结合。