JP2020511955A - Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｂｙ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法におけるイメージング試薬としての光防護性混合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、例えばｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を用いる、記載される方法、組成物、装置、システムおよびキット（ヌクレオチド配列内の核酸の正体を決定するための試薬および混合物を含むが、これらに限定されない）に関連する。特に、本発明は、イメージング試薬として化合物の光防護性混合物を使用して、蛍光化合物（蛍光標識された核酸を含むが、これに限定されない）の安定性および保存を向上することを企図する。

Description

発明の分野
本発明は、例えばｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を用いる、記載される方法、組成物、装置、システムおよびキット（ヌクレオチド配列内の核酸の正体を決定するための試薬および混合物を含むが、これらに限定されない）に関連する。特に、本発明は、イメージング試薬として化合物の光防護性混合物を使用して、蛍光化合物（蛍光標識された核酸を含むが、これに限定されない）の安定性および保存を向上することを企図する。
背景
過去２５年に渡り、生成され、そしてＧｅｎｂａｎｋへ預けられるＤＮＡ配列情報の量は、指数関数的に増大している。伝統的なシークエンシング法（例えばサンガーシークエンシング法）は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法の形態を用いる次世代シークエンシング技術に置き換えられている。ＳＢＳ法では、特別に設計されたヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼが用いられ、チップに結合された１本鎖ＤＮＡテンプレートの配列を制御された方法で解読する。高スループットを達成するために、そのようなテンプレートの何百万ものスポットが、シークエンシングチップのいたる所に整列され、そしてこれらの配列が独立して読み出され、そして記録される。
ＤＮＡシークエンシングのためにアレイを用いるシステムは、周知である（例えばＪｕら、米国特許第６，６６４，０７９号）。しかし、自動化シークエンシングを用いて核酸配列をシークエンシングするため、効率性および／または試薬の安定性を高めるための方法および組成物が、引き続き必要とされている。
米国特許第６，６６４，０７９号明細書
発明の要約
本発明は、例えばｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を用いる、記載される方法、組成物、装置、システムおよびキット（ヌクレオチド配列内の核酸の正体を決定するための試薬および混合物を含むが、これらに限定されない）に関連する。特に、本発明は、イメージング試薬として化合物の光防護性試薬混合物を使用して、蛍光化合物（蛍光標識された核酸を含むが、これに限られない）の安定性および保存を向上することを企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法におけるヌクレオチドの組み込みの後の蛍光体検出ステップの間の、イメージング試薬としての化合物の光防護性混合物（例えばカクテル）を企図する。１つの実施形態では、光防護性混合物は、少なくとも１種の有効な抗酸化物質（例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）；３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）、または３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル（プロトカテク酸エチルエステル）であるが、これらに限定されない）、少なくとも１種の蛍光消光阻害剤（例えば６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（ｔｒｏｌｏｘ）であるが、これに限定されない）、および少なくとも１種のラジカル補捉剤（例えばカルニチンであるが、これに限定されない）を含む。
１つの実施形態では、本発明は、以下を含む標識ヌクレオチドの組み込み法を企図する。この方法は、ａ）ｉ）複数の核酸プライマーおよびテンプレート分子、ｉｉ）ポリメラーゼ、ｉｉｉ）化合物の光防護性混合物を含むイメージング試薬、ならびにｉｖ）複数のヌクレオチドアナログ（少なくともその一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識される）を提供することと、ｂ）前記プライマーの少なくとも一部を、前記テンプレート分子の少なくとも一部へとハイブリダイズ（例えば高いストリンジェンシーで）して、ハイブリダイズされたプライマーを作り出すことと、ｃ）第１の標識ヌクレオチドアナログを、前記ポリメラーゼを用いて前記ハイブリダイズされたプライマーの少なくとも一部へと組み込み、組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを含む伸長プライマーを作り出すことと；ｄ）前記組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを、前記イメージング試薬存在下でイメージングすることとを含む。１つの実施形態では、イメージング試薬は蛍光消光阻害剤を含む。１つの実施形態では、蛍光消光阻害剤はｔｒｏｌｏｘである。１つの実施形態では、光防護性混合物は、少なくとも１種の抗酸化物質、少なくとも１種の消光阻害剤、および少なくとも１種のラジカル捕捉化合物を含む。１つの実施形態では、抗酸化物質はゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される。１つの実施形態では、ラジカル捕捉化合物はカルニチンである。１つの実施形態では、当該方法はさらに、ｅ）第２のヌクレオチドアナログを、前記ポリメラーゼを用いて前記伸長プライマーの少なくとも一部へと組み込むことを含む。１つの実施形態では、標識は蛍光である。
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種の抗酸化物質、少なくとも１種の蛍光消光阻害薬、そして緩衝液を含むイメージング試薬を企図する。１つの実施形態では、抗酸化物質はゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される化合物を含む。１つの実施形態では、イメージング試薬はさらにラジカル捕捉剤を含む。１つの実施形態では、ラジカル捕捉剤はカルニチンである。１つの実施形態では、蛍光消光阻害薬はｔｒｏｌｏｘである。１つの実施形態では、緩衝液はＴＲＩＳ緩衝液である。１つの実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液である。
１つの実施形態では、本発明は、以下を含むキットを企図する。ｉ）イメージング試薬（少なくとも１種の抗酸化物質、少なくとも１種の蛍光消光阻害薬、および緩衝液を含む）を含む第１の容器、ならびにｉｉ）複数のヌクレオチドアナログ（少なくともその一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識される）含む第２の容器を含む。１つの実施形態では、イメージング試薬はさらにラジカル捕捉剤を含む。１つの実施形態では、ラジカル捕捉剤はカルニチンである。１つの実施形態では、蛍光消光阻害剤はｔｒｏｌｏｘである。１つの実施形態では、緩衝液はＴＲＩＳ緩衝液である。１つの実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液である。
１つの実施形態では、本発明は、切断可能な標識を取り付けられた複数のヌクレオチドアナログを含むテンプレートにハイブリダイズされるプライマーの溶液、ならびに少なくとも１種の抗酸化物質、少なくとも１種の蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含むイメージング試薬を含むシステムを企図する。１つの実施形態では、ハイブリダイズされたプライマーおよび前記テンプレートは、固定される。１つの実施形態では、ハイブリダイズされたプライマーおよび前記テンプレートは、フローセル内にある。１つの実施形態では、イメージング試薬はさらにラジカル捕捉剤を含む。１つの実施形態では、ラジカル捕捉剤はカルニチンである。１つの実施形態では、蛍光消光阻害剤はｔｒｏｌｏｘである。１つの実施形態では、緩衝液はＴＲＩＳ緩衝液である。１つの実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳ緩衝液である。
１つの実施形態では、本発明は、ｉ）ＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液；ｉｉ）およそ５〜５０ｍＭの範囲内の濃度のカルニチン；ｉｉｉ）およそ５〜１５ｍＭの範囲内の濃度のｔｒｏｌｏｘ；ｉｖ）およそ１０〜５０ｍＭの範囲内の濃度の２，５ジヒドロキシ安息香酸；およびｖ）およそ１０〜２０ｍＭの範囲内の濃度の３，４，ジヒドロキシ安息香酸エチルエステルを含むイメージング試薬を企図する。
定義
本発明についての理解を促進するために、以下で多数の用語が定義される。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する当業者によって一般的に理解されるような意味を有する。”ａ”、”ａｎ”、および”ｔｈｅ”といった用語は、単一の実体のみならず複数の実体をも指すよう意図され、そして例示のために用いられ得る具体例の汎用のクラスをも含む。本明細書における用語法は、本発明の特定の実施形態を記載するために用いられるが、しかし、これらの使用は、特許請求の範囲において概説される場合を除いて、本発明の範囲を定めない。
本明細書における用語「約」は、任意のアッセイ測定の任意の文脈において、所定の測定の＋／−５％を指す。
本明細書における用語「イメージング試薬」は、標識の発光強度の増強および／または蛍光体の検出を、少なくとも１桁、向上し得る化合物の混合物を指す。何らかの特定の機構へと本発明を限定することを意図しないが、本明細書に記載される混合物は、シグナル−ノイズ比を増強するか、あるいは蛍光の退色および／または蛍光体の「ブリンキング」を減らすと考えられる。イメージング試薬において有用な化合物の１つのクラスは、蛍光消光阻害剤である。
本明細書における用語「蛍光消光阻害剤」は、蛍光標識のシグナルの質を向上する化合物のクラスを指す。いかなる機構にも拘束されることなく、そのような化合物は、非特異的な蛍光退色現象によって蛍光シグナルの消光という結果をもたらす酸化性の化合物と反応することにより働くと考えられる。例えば、そのような化合物の１つはｔｒｏｌｏｘ（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）である。
本明細書における互換的に使用される用語「混合物」または「カクテル」は、ヌクレオチド配列内の標識ヌクレオチドアナログを検出するためのイメージング試薬を一緒になって作る、一般に、例えば緩衝溶液のような溶液内の複数の化合物を指す。
本明細書における用語「光防護性」は、蛍光化合物の安定性および保存可能期間の増強という、イメージング試薬の混合物またはカクテルの最終結果を指す。理論に拘束されないが、光防護性化合物は、ｉ）ヌクレオチド蛍光標識の光退色；ｉｉ）シグナルの消光；およびｉｉｉ）ラジカルで誘導されるＤＮＡの光損傷および光切断、に対して防護することによって働くと考えられる。
本明細書における用語「抗酸化化合物」は、フリーラジカルを生成し得る化学反応を阻害する分子を指す。例えば、特定の酵素（カタラーゼおよびスーパーオキシドディスムターゼ）に加えて多くのビタミン（例えば、ビタミンＥおよびビタミンＣ）は、天然由来の抗酸化物質である。他の化学物質（ゲンチジン酸、プロトカテク酸、および／またはプロトカテク酸エチルエステルを含むが、これらに限定されない）も、これらの特性を有する。
本明細書における用語「ラジカル捕捉化合物」は、不純物および望まぬ反応産物、例えば酸素、を除去または不活化する分子を指す。ラジカル捕捉化合物は抗酸化物質の最終結果をもたらすが、抗酸化化合物とは異なる機構で働くと考えられる。例えば、そのようなラジカル捕捉化合物の１つとして、トコフェロール、カルニチン、および／またはナリンゲニンが挙げられるが、これらに限定されない。そうであっても、いくつかのラジカル捕捉化合物が、例えば抗酸化作用および一重項酸素除去のような他の生化学的作用を有するということが知られている。
本明細書における用語「緩衝液」は、水素イオンの濃度変化を含む幅広い範囲の環境条件（例えば温度、塩分濃度）に渡って安定なｐＨレベルを維持し得る、塩基性塩および水素交換化合物（弱酸または弱塩基のいずれか）の混合物を指す。そのような緩衝液として例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、および／またはトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書における用語「リンカー」は、切断可能な標識および／または化学部分を取り付けできる任意の分子（または分子の一群）を指す。１つの実施形態では、リンカーの切断は毒性のラジカル生成物を生成し得る。リンカーとして例えば、ジスルフィドリンカーおよび／またはアジドリンカーが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書における用語「取り付けられる」は、第１の分子（例えば核酸）と第２の分子（例えば標識分子）との間の任意の相互作用を指す。取り付けは、可逆性または不可逆性であり得る。そのような取り付けとして、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力、または摩擦などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書における「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびこれらの断片または一部を指し、そしてゲノムまたは合成起源の１本鎖または２本鎖であり得るＤＮＡまたはＲＮＡを指し、そしてセンス鎖またはアンチセンス鎖を示す。そのような核酸として、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他の核酸配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書における用語「単離された核酸」は、その天然の状態から取り除かれている（例えば、細胞から取り除かれ、そして好ましい実施形態においては、他のゲノム核酸を含まない）任意の核酸分子を指す。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を一緒にハイブリダイズすることを企図する。このためには、ある程度の相補性が必要とされる。本明細書における用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合の規則によって関係付けられる「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（これらは、ヌクレオチドの配列を指す互換的な用語である）を参照して用いられる。例えば、配列「Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。相補性は、「部分的」または「全体的」であり得る。「部分的」な相補性では、１つまたは複数の核酸塩基が塩基対合規則に従ってマッチしない。核酸間の「全体的」または「完全な」相補性では、核酸塩基の各々かつ全てが、他の塩基と、塩基対合規則に従ってマッチする。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な影響を有する。これは、増幅反応と同様に核酸間の結合に依存する検出の方法においても、特に重要である
本明細書における、ヌクレオチド配列に関して用いられる用語「相同」および「相同な」は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を指す。部分的な相同または完全な相同（すなわち、同一）があり得る。ある核酸に対して部分的に相補的、すなわち「実質的に相同」な核酸配列は、完全に相補的な配列が標的核酸配列にハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害するものである。完全に相補的な配列が標的配列へとハイブリダイズすることの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法など）を用いて、ストリンジェンシーの低い条件下で検査され得る。実質的に相同な配列またはプローブは、完全に相同な配列の標的配列への結合（すなわちハイブリダイゼーション）を、ストリンジェンシーの低い条件下で競合および阻害する。これは、ストリンジェンシーの低い条件なので、非特異的な結合が許されているということではない；ストリンジェンシーの低い条件では、２つの配列の結合が互いに、特異的な（すなわち選択的な）相互作用をすることを要する。非特異的な結合のないことは、ある程度の相補性を欠く（例えば、同一性約３０％未満）第２の標的配列を用いることによって試験され得る；非特異的な結合の非存在下では、プローブは、第２の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
約５００ヌクレオチドの長さのプローブが用いられる場合、ストリンジェンシーの低い条件は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、および１．８５ｇ／ｌＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬｛５０×デンハルトは５００ｍｌあたり以下を含む：５ｇフィコール（４００型、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇＢＳＡ（フラクションＶ；Ｓｉｇｍａ）｝、ならびに１００μｇ／ｍｌ断片処理済みサケ精子ＤＮＡからなる溶液内で４２℃での結合またはハイブリダイゼーションと、続く５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液内で４２℃での洗浄、に相当する条件を含む。ストリンジェンシーの低い条件を構成するために、相当する多数の条件も使用され得る；例えば、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液内に存在するか固定されているかなど）、ならびに塩および他の構成要素（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸塩、ポリエチレングリコールの有無）の濃度、ならびにハイブリダイゼーション溶液の構成要素、といった要素が、上に列挙された条件とは異なるがこれに相当するストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーションの条件を生成するために変動され得る。さらに、ストリンジェンシーの高い条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階での温度上昇、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など）もまた、使われ得る。
本明細書における用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸鎖が相補鎖と塩基対合を介して結合して、ハイブリダイゼーション複合体を形成するような任意のプロセスを用いる、相補的な核酸の対合を参照する際に用いられる。ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の関連の強さ）は、例えば、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比率といった要素に影響される。
本明細書における用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、２つの核酸配列間で、相補的なＧ塩基とＣ塩基との間、および相補的なＡ塩基とＴ塩基との間での水素結合形成により生じる複合体を指す；これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化され得る。２つの相補的な核酸配列は、逆平行な形状をとって水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液内（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析）において、または溶液内に存在する１つの核酸配列と固体の支持体（例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングに用いられるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法を含むｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで用いられるガラススライド）に固定されたもう１つの核酸配列との間で形成され得る。
本明細書における用語「Ｔｍ」は、「融解温度」を参照する際に用いられる。融解温度とは、２本鎖核酸分子の集団が、１本鎖へと半解離する温度である。標準的な参考文献で示されるように、Ｔｍ値の簡単な推定値は、次の方程式により計算され得る：８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）、ただし核酸が１ＭＮａＣｌ溶液内に存在する場合。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｉｎ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）。さらに洗練された計算では、構造の特性と同様に配列の特性も、Ｔｍ算出のために考慮する。
本明細書における用語「ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および他の化合物（例えば有機溶媒）の存在、といった条件を参照する際に用いられる。典型的には、「ストリンジェンシー」は、約Ｔｍから、Ｔｍから約２０℃−２５℃低い範囲内で生じる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、同一なポリヌクレオチド配列の特定もしくは検出に用いられ得るか、または類似もしくは関連するポリヌクレオチド配列の特定もしくは検出に用いられ得る。例えば断片が、ハイブリダイゼーション反応にストリンジェントな条件下で使用される場合には、特有の配列（すなわち、非相同的であるか、または約５０％未満の相同性もしくは相補性を含む配列）を含んでいる断片のハイブリダイゼーションが好まれる。一方では、ストリンジェンシーの「弱い」または「低い」条件が用いられる場合には、ハイブリダイゼーションは、遺伝的に多様な生物（すなわち、例えば、そのような生物間では通常、相補的な配列の頻度が低い）に由来する核酸であっても、起こり得る。
本明細書における用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法によって増幅され得る核酸を参照する際に用いられる。「増幅可能な核酸」は、通常、「試料テンプレート」を含むものと企図される。
本明細書における用語「試料テンプレート」または（より簡潔に）「テンプレート」は、試料に由来する、目的の標的配列の存在を解析される核酸を指す。対照的に、「背景テンプレート」は、試料テンプレート以外の核酸を参照する際に用いられ、これは、試料内に存在することもあれば、存在しないこともある。背景テンプレートは、ほとんどの場合、偶発的である。これは、キャリーオーバーによるものであり得るか、または、試料から精製されて除かれるべき核酸汚染物質の存在によるものである。例えば、生物に由来する検出されるべき核酸以外の核酸が、背景として試験試料内に存在し得る。
「増幅」は、核酸配列の追加コピーの産生として定義され、一般にポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ．Ｗ．およびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）Ｉｎ：ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．。
本明細書における用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（”ＰＣＲ”）は、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号（本明細書に参考として援用される）の方法を指す。これらの特許は、標的配列のセグメントの濃度を、ゲノムＤＮＡの混合物内でクローニングまたは精製を行わずに増加させるための方法を記載する。所望の標的配列の増幅されるセグメントの長さは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーの相対位置によって互いに決められ、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスには繰り返しという側面があるため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下”ＰＣＲ”）と呼ばれる。標的配列の所望の増幅セグメントが混合物内で支配的な配列（濃度に関して）になるゆえに、このセグメントが「ＰＣＲで増幅される」と言われる。ＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ内の単一コピーの特定の標的配列を、いくつかの異なる方法論（例えば、標識されたプローブによるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込みと、続くアビジン−酵素抱合体による検出；例えば、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド３リン酸の増幅セグメントへの組み込み）によって検出できる水準まで増幅することができる。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列も、適切なプライマー分子のセットを用いて増幅され得る。特に、ＰＣＲプロセス自体により作り出された増幅セグメントは、これ自体が、続くＰＣＲ増幅のための有効なテンプレートである。
本明細書における用語「プライマー」は、精製された制限酵素分解物のような天然由来であるか、または合成により産生されたかを問わず、核酸に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチド、および例えばＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤が存在し、そして適切な温度およびｐＨである）に置かれたときに、合成開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅の効率を最大にするために１本鎖が好ましいが、代替として２本鎖でもあり得る。２本鎖である場合には、プライマーは、伸長産物の調製に用いられる前にまず、鎖を分離するよう処置される。プライマーは、オリゴデオキシ−リボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始できるように、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの要素（例えば、温度、プライマーの供給源、および使用する方法を含むが、これらに限定されない）に依存する。
本明細書における用語「プローブ」は、以下を指す；精製された制限酵素分解物のような天然由来であるか、または合成、組み換え、もしくはＰＣＲ増幅によって産生されたかを問わず、目的の他のヌクレオチドとハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）。プローブは、1本鎖または２本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、特定、および単離に有用である。本発明で用いられる任意のプローブは、任意の「レポーター分子」によって標識され、そのために、例えば、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、および酵素に基づく組織化学アッセイ）、蛍光性、放射性、および発光性システムが挙げられるが、これらに限定されない任意の検出システムによって検出され得ることが企図される。本発明が、任意の特定の検出システムおよび標識に限定されることは、意図されない。
本明細書における用語「標識」および「検出可能な標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手法により検出可能な、任意の組成物を指す。そのような標識として、標識ストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチンと、磁気ビーズ（例えばダイナビーズ（登録商標））と、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）と、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）と、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に用いられる他の酵素）と、例えば金コロイドまたは色ガラスビーズもしくは色プラスティック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ｅｔｃ．）ビーズのような熱量測定標識とが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号（全て、本明細書に参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、典型的に、標識は蛍光性あり、そしてヌクレオチドの塩基へと連結される。シトシンおよびチミンに関しては、取り付けは通常５位である。他の塩基に関しては、デアザ誘導体が作り出され、そして標識はデアザ−アデニンまたはデアザ−グアニンの７位に連結される。
本発明で企図される標識は、多くの方法によって検出され得る。例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーション検出器を用いて検出され得、蛍光マーカーは、放出された光を検出するための光検出器を用いて検出され得る。典型的には、酵素による標識は、酵素に基質を提供し、そして酵素の基質に対する作用によって産生される反応産物を検出することによって検出される。そして、熱量測定標識は、単純に色付きの標識を視覚化することで検出される。
本明細書における用語「発光」および／または「蛍光」は、電磁放射（光）を物体、化学物質、および／または化合物から放射させる、任意のプロセスを指す。発光および／または蛍光は、光子の形でのエネルギーの開放に相当し、励起状態からより低い状態へと「リラックス」させる系に起因する。これらの状態は、電子的、振電的、回転的、またはこれら３つの任意の組み合わせであり得る。発光の原因となる遷移は、系内部で化学的に蓄えられたエネルギー、または外部供給源から系に加えられたエネルギーの開放を介して刺激され得る。エネルギーの外部供給源は、様々なタイプであり得る（例えば、化学的、熱的、電気的、磁気的、電磁的、物理的、または系を基底状態より高い状態へと励起させ得る任意の他のタイプが挙げられるが、これらに限定されない）。例えば系は、光の光子の吸収、磁場内への設置、または化学的な酸化還元反応を介して励起され得る。発光の間に放出される光子のエネルギーは、低エネルギーなマイクロ波放射から高エネルギーなＸ線放射までの範囲内であり得る。典型的には、発光はＵＶからＩＲ放射の範囲内の光子を指す。
図１は、従来のイメージング緩衝液構成と光防護性緩衝液構成との間の、ワークフローの比較を提示する。 図１Ａ：従来のイメージング緩衝液キット構成のための例示的なワークフロー。 図１Ｂ：新規かつ向上された、切断およびイメージング緩衝液消耗品を含む光防護性イメージング緩衝液キット構成。 図２は、ＳＢＳ評価指標が従来のイメージング緩衝液と光防護性イメージング緩衝液７Ｂとの間で同等である、ということを示す例示的なデータを提示する。 図３は、従来のイメージング緩衝液と光防護性イメージング緩衝液７Ｂとの間の、各ＳＢＳラン後のリード長の分布の比較を示す例示的なデータを提示する。 図３Ａ：ラン８．３ 図３Ｂ：ラン８．５ 図３Ｃ：ラン８．６ 図３Ｄ：ラン８．４１（再試験） 同上 図４は、従来のイメージング緩衝液と光防護性イメージング緩衝液７Ｂとの間の、各ＳＢＳラン後の生エラープロットを示す例示的なデータを提示する。 図４Ａ：ラン８．３ 図４Ｂ：ラン８．５ 図４Ｃ：ラン８．６ 図４Ｄ：ラン８．４１（再試験） 同上 図５は、従来のイメージング緩衝液（ＩＢ＿ベースライン）と３バージョンの光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐバージョン９との間の、平均リード長のデータの比較を示す例示的なデータを提示する。 図６は、従来のイメージング緩衝液（ＩＢ＿ベースライン）と３バージョンの光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐバージョン９との間の、生エラープロットのデータの比較を示す例示的なデータを提示する。 図６Ａ：光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐ９。 図６Ｂ：光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐ９Ｂ。 図６Ｃ：光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐ９Ｃ。 同上 図７は、ヌクレオチドシグナルの保持における、イメージング緩衝液中のイオンおよび芳香族化合物の濃度の低下の影響を示す例示的なデータを提示する。 図８は、ＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬を用いるシークエンシングランにおける生エラー率を、ベースラインＩＢに対して示す例示的なデータを提示する。 図９は、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＴＲＩＳ緩衝液で調合されたＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬を用いるシークエンシングランにおける生エラー率を、ベースラインＩＢに対して示す例示的なデータを提示する。 図９Ａ：ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いる結果。 図９Ｂ：ＴＲＩＳ緩衝液を用いる結果。 図１０は、カルニチン濃度がＭＦＳＴデータ出力へと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１１は、カルニチン濃度が完全パラメーターのパーセントへと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１２は、カルニチン濃度が平均リード長へと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１３は、カルニチン濃度がエラー率のパーセントへと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１４は、カルニチン濃度が生エラー率へと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１４Ａ：ＳＣ−９ＩＢおよびＳＣ９ＢＩＢ 対 リファレンスＩＢ。 図１４Ｂ：ＳＣ−９ＤＩＢ 対 リファレンスＩＢ。 図１５は、カルニチン濃度がリード長の分布へと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。 図１５Ａ：ＳＣ−９ＩＢおよびＳＣ９ＢＩＢ 対 リファレンスＩＢ。 図１５Ｂ：ＳＣ−９ＤＩＢ 対 リファレンスＩＢ。 図１６は、カルニチン濃度がヌクレオチドシグナルの保持へと与える影響を、１０１ｘ遺伝子パネル（青）およびＢＲＣＡ遺伝子パネル（赤）の両方について示す例示的なデータを提示する。
本発明の詳細な記載
本発明は、例えばｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法を用いる、記載される方法、組成物、装置、システムおよびキット（ヌクレオチド配列内の核酸の正体を決定するための試薬および混合物を含むが、これらに限定されない）に関連する。特に、本発明は、イメージング試薬として化合物の光防護性緩衝液混合物を使用して、蛍光化合物（蛍光標識された核酸を含むが、これに限定されない）の安定性および保存を向上することを企図する。
１つの実施形態では、本発明は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法の間のイメージング試薬としての光防護性混合物を含む組成物を企図する。１つの実施形態では、イメージングを含む方法は、蛍光体検出ステップの間に生じる。１つの実施形態では、イメージングを含む方法は、ヌクレオチド組み込みの後に生じる。１つの実施形態では、光防護性混合物は例えば以下の化合物を含むが、これらに限定されない：カルニチン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（ｔｒｏｌｏｘ）；２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）；３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）；３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル（プロトカテク酸エチルエステル）；４−ヒドロキシケイ皮酸；３，４−ジヒドロキシベンゼンアクリル酸；１，４−ジアザビシクロ［２，２，２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）；リポ酸および／またはアセチルカルニチン。
１つの実施形態では、本発明は、１５０ｂｐリード長のシークエンシングのための方法を企図する。以下を含むがこれらに限定されない、他の有意な追加利益も提供される：製造、保存および品質制御プロセスの向上、キットのコンセプトおよびワークフローが使用者に分かりやすいことによる利便性の向上、次世代シークエンシングプラットフォームであるフルイディクスを通じて個々の構成要素を混合する必要がない、単一構成要素の溶液の送達に起因する機器の信頼性の向上。
Ｉ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｂｙ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法
１つの実施形態では、本発明は、自動化ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ装置（例えば次世代シークエンシングプラットフォーム）によって実施される一連の方法ステップを企図する。米国特許第９，１４５，５８９号（本明細書に参考として援用される）を参照。１つの実施形態では、当該装置は多数の試薬リザーバーから構成される。各試薬リザーバーは、ＳＢＳプロセスをサポートするためにリザーバー内に分配された特定の反応試薬を有し、例えば：
１つの実施形態では、ＳＢＳ法は異なるステーションで異なるステップを行うことを含む。例として、各ステーションは、特定のステップと関連する。特定の調合物に限定されないが、これらのステップおよび関連する試薬のいくつかの例が、以下に示される：
１）伸長Ａ試薬：可逆的に終結される標識ヌクレオチド、およびポリメラーゼを含む。伸長Ａ試薬の１つの組成は、以下であり得る：
２）伸長Ｂ試薬：可逆的に終結される無標識ヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むが、標識ヌクレオチドアナログを欠く。伸長Ｂ試薬の１つの組成は、以下であり得る：
３）洗浄剤（例えばポリソルベート２０）、クエン酸緩衝液（例えば生理食塩水）を有する、洗浄溶液１
４）切断試薬：切断試薬の１つの組成は、以下であり得る：
５）洗浄剤（例えばポリソルベート２０）、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液を有する、洗浄溶液２。
ＩＩ．従来のイメージング溶液
現在イメージング試薬（ＩＢ）として用いられている酵素の調合物の１つは、４つの構成要素を含む。これら４つの構成要素は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グルコースオキシダーゼ、グルコース、およびｔｒｏｌｏｘを含み、そして、ＳＢＳ法をサポートするに先立って、組み合わされて２つの別々の溶液を作る必要がある。グルコースオキシダーゼおよびグルコースが時期尚早に酸素と反応し、酵素系の分解およびＨ２Ｏ２の放出を引き起こすことを防ぐため、これらの２つの溶液は、シークエンシングプロセスに渡って分けられていなければならない。これらの２つの最終溶液は、ＳＢＳの間に混合弁を介して、各イメージングステップでフローセルに導入される前に混合される。このタイプのイメージング方法ステップの使用は、有効ではあるが、いくつかの分野において、以下を含むがこれらに限定されない困難をもたらす：ｉ）製造プロセスの安定性；ｉｉ）複雑なｅｘｏ／ｅｎｄｏ仕様パラダイムゆえの品質制御の維持；ｉｉｉ）複雑なキット構成およびワークフローゆえの使いにくさ；ｉｖ）混合弁の信頼性の問題を原因とする送達量の失敗様式ゆえの、限定的な機器の信頼性。本明細書に見られるように、従来の、またはベースラインのイメージング試薬（ＩＢ）は、本開示の光防護性混合物イメージング試薬の様々な実施形態の性能ベンチマークのために用いられる。
ＩＩＩ．光防護性イメージング溶液
１つの実施形態では、ＳＢＳ法のための有効なイメージング溶液および緩衝液調合物は、露光の間の光防護を確実にする分子構成要素を含む。理論に拘束されないが、これらの構成要素は、３つの主要な現象を防ぐと考えられる：ｉ）ヌクレオチド蛍光標識の光退色；ｉｉ）シグナルの消光；およびｉｉｉ）ラジカルで誘導されるＤＮＡの光損傷および光切断。イメージング溶液は、酵素システムとしてか、または様々な化学物質混合物（例えば、分子的な酸素「捨て場」、つまり、抗酸化物質／ラジカル捕捉剤および一重項酸素クエンチャーを含むが、これに限定されない混合物）を含む混合物のいずれかとして調合され得る。これらの混合物内のいくつかの構成要素は、長期保存の際の酸化ストレスおよびイメージング溶液の分解に対するさらなる保護も提供する。
発明の機構について理解する必要はないが、「混合物」または「カクテル」によるアプローチは、保存期間の長いイメージング試薬を調合するために最適であると考えられる。これは、当該アプローチが、機能的な性能および調合の安定性から、製造性、利便性および保存に渡る、製品設計の頑健性に付属する様々な機能的な側面を最もサポートするからである。
１つの実施形態では、本発明は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）法におけるヌクレオチドの組み込みの後の蛍光体検出ステップの間の、イメージング試薬としての光防護性混合物を企図する。これらの光防護性混合物イメージング試薬は、有効な抗酸化物質（例えば、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）；３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）、または３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル（プロトカテク酸エチルエステル）であるが、これらに限定されない）、蛍光消光阻害剤（例えば６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（ｔｒｏｌｏｘ）であるが、これに限定されない）、ならびにラジカル補捉剤（例えばカルニチン）、抗酸化物質および／または一重項酸素クエンチャーを含む。
１つの実施形態では、光防護性カクテルは、以下の構成要素を含む混合物（例えばイメージング試薬ＳＣ−Ｐ７Ｂ）を含む：
１つの実施形態では、光防護性カクテルは、以下の構成要素を含む混合物（例えばイメージング試薬ＳＣ−Ｐ９Ｃ）を含む：
上で例示された光防護性カクテル混合物は、光防護性、安定性、製造性、長期保存性、および利便性を含むが、これらに限定されない特性を考慮して設計されている。これらの混合物はまた、入手可能なシークエンシングキット（すなわち、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ（登録商標）１．１シークエンシングキット）との互換性のためにも設計されている。特にカルニチンは、酸化ストレスの減少、ならびに化学活性および／または生物学的機能の保存を、生物学的な液体または機能的な緩衝液の長期保存の後であっても誘導することが見出されている。理論に拘束されないが、カルニチンはおそらく、酸素、ペルオキシラジカル、または一重項酸素を含むがこれらに限定されない分子に起因する酸化ストレスの減少ゆえに、複雑な分子混合物の保存性の増強をサポートし得る。発明の機構を理解する必要はないが、例えばカルニチンのような化合物は、その保護的な特性（分子の還元状態および化学結合の切断（例えば、ラジカルまたは光による切断）に対する安定性を含むが、これらに限られない）を、たとえ調合物としての長期保存の時でも保持すると考えられる。
本明細書において提供されるデータは、イメージング試薬としての化合物の様々な光防護性イメージング混合物についての照会能力を実証する。さらに、シークエンスの最後に装置および液体廃棄物の両方の検査から観察されているように、ＳＢＳ装置ハードウェアとの完全な互換性が全ての構成要素に対して確認される。本開示の光防護性混合物イメージング試薬の向上が、シークエンシングワークフローの比較と共に例示される。
例えば、光防護性混合物イメージング試薬のための予想されるキットの構成が、−２０℃の保存条件と相性の良いキットボックス内で保存される、単一構成要素の消耗品として示される。図１を参照。従来のイメージング試薬キット構成のための比較ワークフロー（図１Ａ）は、本開示の光防護性イメージング試薬キット構成（図１Ｂ）とは反対に、複雑性の増加を示している。発明の機構を理解する必要はないが、本開示の光防護性イメージング試薬のキット構成は、キットおよびワークフロー内の必要とされる構成要素の数を減らすことにより、ＳＢＳ法の間の利便性を大きく向上させると考えられる。
本発明で企図される光防護性イメージング試薬は、長いリード長のシークエンスの実施（例えば、およそ１５０ｂｐ）について試験されている。これらの試験のいくつかは、１５７サイクルのシークエンシング、および従来のイメージング試薬（例えばベースラインＩＢ試薬）に対する光防護性混合物イメージング試薬の一対一の比較を伴った。研究は、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ装置および２つのタイプのＤＮＡライブラリー、すなわちＮＡ１２８７８／１０１Ｘ遺伝子パネルおよびＮＡ１２８７８／ＢＲＣＡ遺伝子パネルを用いて実施された。シークエンシング評価指標が、例えば、生エラー率、平均リード長、出力（Ｇｂ）のような比較システム性能指標を提供するために解析された。
例えばＧＤＰ４試験は、実施例ＩＩに従って作られた光防護性イメージング緩衝液ＳＣ−Ｐ７Ｂを用いて実施された。当該試験は、１５７サイクルおよび１３０タイルを含むＡＰＦプロトコルｖ２を用いて、ＳＰ１０１ｘ遺伝子パネルを利用してランされた。実施されたランのうちの１つ（例えば８．４１）は、無効とみなされて再試験された（”**”で注釈）。従来のイメージング試薬（ベースラインＩＢ）および光防護性イメージング試薬ＳＣ−Ｐ７Ｂは、全てのシークエンシング評価指標に渡って同等であったということが分かる。図２および表１を参照。
表１：シークエンシング評価指標の比較：従来のＩＢ（ベースライン）対ＳＣ−Ｐ７ＢＩＢ
これらのデータは、光防護性イメージング試薬ＳＣ−Ｐ７Ｂを用いて検定した場合、評価指標のラグのみが、３０％低いラグで統計学的に関連のある違いを２つのイメージング試薬間で示す、ということを示す。２つのイメージング試薬間で検定した場合、４ラン間でのリード長の分布は同等であった。図３Ａ−３Ｄを参照。２つのイメージング試薬間で検定した場合、４ラン間での生エラープロットも同等であった。図４Ａ−４Ｄを参照。
試験は、実施例ＩＩＩに従って作られる例示的な光防護性イメージング試薬９ＣＶ２Ｔの様々な実施形態を用いても実施された。３つの異なるバージョンの９ＣＶ２Ｔ試薬が作られた。発明の機構を理解する必要はないが、３つの試薬の内の少なくとも１つは、シグナル保持の向上という結果をもたらしたと考えられる。例えば、３つの試験されたバージョンの９ＣＶ２Ｔイメージング試薬は、以下を含んだ：
または
および
基本的なシークエンシング評価指標の比較が、これら３つのＳＣ−Ｐバージョン９ＣＶ２Ｔイメージング試薬と従来のＩＢ試薬との間において、１３７サイクルのシークエンシングプロトコルでワクチニアウイルス（ＶＡＣＶ）株ＴｉａｎＴａｎＴＰ０３ゲノムを用いてなされた。表２を参照。
表２：ＳＣ−Ｐバージョン９ＩＢと従来のＩＢ（ＩＢ＿ベースライン）との間の、シークエンシング評価指標の比較
相対的な同等性が、これらのＳＣ−Ｐバージョン９ＣＶ２Ｔイメージング試薬とベースラインイメージング試薬との間において、平均リード長の点で見られた。図５を参照。このような同等性は、ＳＣ−Ｐバージョン９ＣＶ２Ｔイメージング試薬とベースラインイメージング試薬との間の生データプロットについても見られた。図６Ａ−Ｃを参照。これらのデータは、イオンおよび芳香族化合物（例えばそれぞれ、カルニチンおよびプロトカテク酸）の濃度低下がシグナル保持を向上させるということを実証する。図７を参照。発明の機構を理解する必要はないが、この観察結果はおそらく、シグナル消光（通常、光防護性緩衝液中の蛍光体と芳香族／イオン種との間の相互作用によって生ずる）の軽減ゆえと考えられる。
ＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬が、１５７サイクルの非ＡＰＦ／８８タイルプロトコルにおいて、ＢＲＣＡ遺伝子パネルに対して用いられた（ラン８．１７；８．２４；８．２６）。シークエンシング評価指標は、リファレンスイメージングＩＢに対して比較された。表３を参照。
表３：ＢＲＣＡ遺伝子パネルにおける、ベースラインＩＢに対するＳＣ−Ｐ９Ｃのシークエンス評価指標の比較
生エラー率の比較は、２つのイメージング試薬間の同等性を実証した。図８を参照。ＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬のシークエンシング評価指標はまた、ＨＥＰＥＳ緩衝液とＴＲＩＳ緩衝液との間においても、１５７サイクルの非ＡＰＦ／８８タイルプロトコルを用いて、ＤＨＭＧ０２ＢＲＣＡ遺伝子パネルにおいて比較された。表４を参照。
表４：ＨＥＰＥＳ緩衝液とＴＲＩＳ緩衝液とを比較する、ＢＲＣＡ遺伝子パネルにおけるベースラインＩＢに対するＳＣ−Ｐ９Ｃのシークエンス評価指標の比較
このデータは、ＨＥＰＥＳ緩衝液で調合されたＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬はＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液で調合されたＳＣ−Ｐ９Ｃイメージング試薬よりも優れる、ということを実証する。同様に生エラー率は、ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いる際にＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液と比較して低く、そしてベースラインＩＢにより近い。図９Ａおよび９Ｂを参照。
これらのデータは、プロトカテク酸エチルエステルを有する光防護性イメージング試薬は、ゲンチジン酸を有する光防護性イメージング試薬より、シグナルの安定性および質という点で優れているということを実証する。発明の機構を理解する必要はないが、シグナルの安定性および質は、シークエンシングの性能品質に関与すると考えられる。それでもなお、ゲンチジンおよびプロトカテクに基づくカクテル化学物質（すなわち、それぞれＳＣ−Ｐ７ＢおよびＳＣ−Ｐ９Ｃ）はいずれも、長いリードのシークエンシングのための性能の比較に関して、競合的にベンチマークすることを期待される。しかし製造の観点から、当該調合物の生成におけるより良い柔軟性および費用対効果ゆえに、プロトカテク酸エチルエステルを有する光防護性イメージング試薬が、ゲンチジン酸を有する光防護性イメージング試薬よりも好ましくあり得る。
光防護性イメージング試薬内のカルニチン濃度の減少（例えば、およそ５０ｍＭから５ｍＭの間）がシークエンシング性能に影響するかどうかを決定するために、さらなる研究が実施された。試験された光防護性カルニチンイメージング試薬（例えば、ＳＣ−Ｐ９、ＳＣ−Ｐ９Ｂ、およびＳＣ−Ｐ９Ｃ）の組成は、以下である：
シークエンシングラン（８．１７、８．２４、８．２６）セットアップは、試料ＮＡ１２８７８／１０１Ｘ（ＩＤ：ＴＰ０３）またはＮＡ１２８７８／ＢＲＣＡ（ＩＤ：ＤＨＭＧ０２）を用いる、リファレンスならびに／またはベースラインＩＢ試薬および光防護性ＩＢ試薬の両方についての１３２サイクルを含んだ。当該データは、平均リード長およびシグナル保持に基づいて、１５ｍＭカルニチンが最適な作業濃度を提供するということを示す。表５を参照。
表５．カルニチン濃度解析からのＡＤＡＭ結果
特にカルニチン濃度の減少は、１０１ｘ遺伝子パネルおよびＢＲＣＡ遺伝子パネルの両方において濃度依存的に、データ出力（ＭＦＳＴ）を低下させる。図１０を参照。この出力データは、リファレンスＩＢ試薬と比較して完全パラメーターのパーセントが変わらなかった条件下で集められた。図１１を参照。しかし、光防護性イメージング試薬がカルニチンを含む場合、平均リード長が全体的に低下することが分かった。図１２を参照。それでもなお、リファレンスＩＢと比較された場合、エラー率のパーセントにおいてカルニチンを含む光防護性イメージング試薬の影響はなかった。図１３を参照。しかし、異なるカルニチン濃度を有する光防護性イメージング試薬の間では、生エラー率パラメーターの点で違いがあった。例えば、ＳＣ−９ＩＢ試薬（５０ｍＭカルニチン）およびＳＣ−９ＢＩＢ試薬（１５ｍＭカルニチン）は、リファレンスＩＢに類似する生エラー率を有した。図１４Ａを参照。しかし、ＳＣ−９ＤＩＢ試薬（５ｍＭカルニチン）は、リファレンスＩＢ試薬と比較してより高い生エラー率を示した。図１４Ｂを参照。このデータパターンは、試験されたイメージング試薬間において、リード長の分布について見られた。ＳＣ−９ＩＢ試薬（５０ｍＭカルニチン）およびＳＣ−９ＢＩＢ試薬（１５ｍＭカルニチン）は、リファレンスＩＢ試薬に類似したリード長分布を有した。図１５Ａを参照。しかし、ＳＣ−９ＤＩＢ試薬（５ｍＭカルニチン）は、初期サイクルへバイアスがかかり、そしてリファレンスＩＢ試薬と比較してやや低いリード長分布を示した。図１５Ｂを参照。光防護性ＩＢ試薬のカルニチン濃度（例えば、ＳＣ−９Ｂにおいては１５ｍＭ）が下がると、シグナル保持が最高になるということが示すように、すべてのヌクレオチドに関するシグナル保持はカルニチンの存在下において減少した。図１６を参照。
全体として、本明細書において提供されるデータは、光防護性ＳＣ−Ｐ７ＢＩＢ試薬およびＳＣ−Ｐ９ＣＩＢ試薬が、従来のイメージング緩衝液試薬（例えば、ベースラインＩＢ）と同様の性能を有し、そして本分野の遺伝子リーダーの状態と互換的な、平均リード長の必要最小限を送達する、ということを示す。特に、当該データは、およそ１１０ｂｐの平均リード長をスキャンする場合、本明細書において企図される光防護性イメージング緩衝液試薬は、本分野の遺伝子リーダーの最適スキャニング幅（およそ１１０〜１３０ｂｐの間）の状態と比較して有効である、ということを示す。
実験
実施例I
光防護性イメージング調合物の安定性および保存
本明細書に記載される様々な光防護性イメージング混合液の構成要素を、溶解性、沈殿に対する安定性、およびＴｒｉｓ ＨＣｌを緩衝塩基として用いるイメージング溶液調合物内での変色のために試験した。様々な構成要素のための最適濃度ウィンドウは、以下のように見出されている：カルニチン（５〜５０ｍＭ）；Ｔｒｏｌｏｘ（５〜１５ｍＭ）；２，５−ジヒドロキシ安息香酸（１０〜５０ｍＭ）；および３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル（プロトカテク酸エチルエステル）（１０〜２０ｍＭ）。
実施例ＩＩ
光防護性イメージング試薬ＳＣ−Ｐ７Ｂの組成および調合
以下の例は、およそ２００ミリリットルの、４ＦＣ／１５７サイクルのＳＢＳ法をサポートすることが期待されるイメージング試薬の調製について記載する。
・５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液：１２１．４ｇ／ｍｏｌ＝１．２１ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｔ１３７８−１ｋｇ）
・５０ｍＭ Ｌカルニチン：１９７．６６ｇ／ｍｏｌ＝１．９８ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｃ０２８３−１００Ｇ）
・１５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ：２５０．２９ｇ／ｍｏｌ＝０．７５ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃２３８８１３−５Ｇ）
・５０ｍＭ ゲンチジン酸：１７６．１ｇ／ｍｏｌ＝１．７６ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｇ５１２９−１０Ｇ）
１．Ｔｒｉｓ塩基を１８０ｍＬミリＱ水に溶解する。
２．ステップ１のトリス緩衝液にＴｒｏｌｏｘを添加する。
３．上記溶液にＬカルニチンを添加する。
４．ゲンチジン酸ナトリウム塩水和物を添加し、そして溶解する。
５．ｐＨをチェックする：約４。
６．１０ＭＮａＯＨ溶液によってｐＨを７．８に調整する。
７．ミリＱ水によって総体積を２００ｍＬにする。
８．フィルター滅菌。
９．単一ＦＣ ＧＲランのために、イメージング緩衝液を２つのコニカルチューブに分ける（それぞれ分割量およそ２５ｍＬ）。
実施例ＩＩＩ
光防護性イメージング試薬９ＣＶ２Ｔの組成および調合
以下の例は、およそ２００ミリリットルのイメージング試薬の調製について記載する。
・５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液：１２１．４ｇ／ｍｏｌ＝０．６０７ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃ Ｔ１３７８−１ｋｇ）
・１５ｍＭ Ｌカルニチン：１９７．６６ｇ／ｍｏｌ＝０．２９６ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｃ０２３８−１００Ｇ）
・１５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ：２５０．２９ｇ／ｍｏｌ＝０．３７５ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃２３８８１３−５Ｇ）
・１０ｍＭ プロトカテク酸エチルエステル：１８２．１７ｇ／ｍｏｌ＝１８２．１７ｍｇ ミリグラム（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｅ２４８５９−５Ｇ）
１．Ｔｒｉｓ塩基を７５ｍＬミリＱ水に溶解する。
２．Ｔｒｏｌｏｘを添加し、そして完全に溶解する
３．プロトカテク酸を添加する
４．Ｌカルニチンを添加し、そして完全に溶解する。
５．ｐＨをチェックする：
６．１０ＭＮａＯＨ溶液によってｐＨを８．５に調整する。
７．任意：よく溶けるまで超音波処理する
８．ミリＱ水によって総体積を１００ｍＬにする。
９．フィルター滅菌。
実施例ＩＶ
光防護性イメージング試薬９ＣＶ２Ｈの組成および調合
以下の例は、およそ１００ミリリットルのイメージング試薬の調製について記載する。
・１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ：２３８．３ｇｒ／ｍｏｌｅ＝２．３９ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｈ４０３４）
・１５ｍＭ Ｌカルニチン：１９７．６６ｇ／ｍｏｌ＝０．２９６ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｃ０２８３−１００Ｇ）
・１５ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ：２５０．２９ｇ／ｍｏｌ＝０．３７５ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃２３８８１３−５Ｇ）
・１０ｍＭ プロトカテク酸エチルエステル：１８２．１７ｇ／ｍｏｌ＝．１８２ｇ（Ｓｉｇｍａ：Ｃａｔ＃Ｅ２４８５９−５Ｇ）
１リットルの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ
２３．９ｇ ＨＥＰＥＳ
ミリＱ水に溶解−終体積１リットル
ｐＨを７．０に調整。
１．７５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液を得る（上（ｂｅｌｌｏｗ）を参照）。
２．Ｔｒｏｌｏｘを添加し、そして完全に溶解する
３．プロトカテク酸を添加する。
４．Ｌカルニチンを添加し、そして完全に溶解する。
５．ｐＨをチェックする：約５
６．１０ＭＮａＯＨ溶液によってｐＨを７．５に調整する。
７．任意：よく溶けるまで超音波処理する。
８．ミリＱ水によって総体積を１００ｍＬにする。
９．フィルター滅菌。

Claims (30)

  1. 標識ヌクレオチドを組み込む方法であって：
    ａ）ｉ）複数の核酸プライマーおよびテンプレート分子、
    ｉｉ）ポリメラーゼ、
    ｉｉｉ）化合物の光防護性混合物を含むイメージング試薬、ならびに
    ｉｖ）複数のヌクレオチドアナログであって、該ヌクレオチドアナログの少なくとも一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識されているヌクレオチドアナログ、
    を提供することと；
    ｂ）ハイブリダイズされたプライマーを作り出すために、該プライマーの少なくとも一部を該テンプレート分子の少なくとも一部へとハイブリダイズすることと；
    ｃ）組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを含む伸長プライマーを作り出すために、第１の標識ヌクレオチドアナログを、該ポリメラーゼを用いて、該ハイブリダイズされたプライマーの少なくとも一部へと組み込むことと；
    ｄ）該組み込まれた標識ヌクレオチドアナログを、該イメージング試薬の存在下でイメージングすることと
    を含む、方法。
  2. 前記光防護性混合物が、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記光防護性混合物が、少なくとも１つの抗酸化物質および少なくとも１つのラジカル捕捉化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つの抗酸化物質が、ゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つのラジカル捕捉化合物が、カルニチンである、請求項４に記載の方法。
  7. ステップ（ｅ）第２のヌクレオチドアナログを、前記ポリメラーゼを用いて、前記伸長プライマーの少なくとも一部へと組み込むこと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記標識が蛍光性である、請求項１に記載の方法。
  9. 少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含む、イメージング試薬。
  10. 前記少なくとも１つの抗酸化物質が、ゲンチジン酸、プロトカテク酸、およびプロトカテク酸エチルエステルからなる群から選択される化合物を含む、請求項９に記載のイメージング試薬。
  11. 少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項９に記載のイメージング試薬。
  12. 前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、請求項１１に記載のイメージング試薬。
  13. 前記蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項９に記載のイメージング試薬。
  14. 前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、請求項９に記載のイメージング試薬。
  15. 前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項９に記載のイメージング試薬。
  16. ｉ）少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも1つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含むイメージング試薬を含む第１の容器、ならびに
    ｉｉ）複数のヌクレオチドアナログを含む第２の容器であって、該ヌクレオチドアナログの少なくとも一部が、切断可能なリンカーを介して塩基へと取り付けられた標識により標識されている、第２の容器、
    を含むキット。
  17. 前記第１の容器が、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、請求項１７に記載のキット。
  19. 前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項１６に記載のキット。
  20. 前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、請求項１６に記載のキット。
  21. 前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１６に記載のキット。
  22. 切断可能な標識を取り付けられた複数のヌクレオチドアナログを含むテンプレートへとハイブリダイズされるプライマーの溶液と、少なくとも１つの抗酸化物質、少なくとも１つの蛍光消光阻害剤、および緩衝液を含むイメージング試薬とを含む、システム。
  23. 前記ハイブリダイズされるプライマーおよび前記テンプレートが、固定されている、請求項２２に記載のシステム。
  24. 前記ハイブリダイズされるプライマーおよび前記テンプレートが、フローセル内にある、請求項２２に記載のシステム。
  25. 前記イメージング試薬が、少なくとも１つのラジカル捕捉剤をさらに含む、請求項２２に記載のシステム。
  26. 前記少なくとも１つのラジカル捕捉剤が、カルニチンである、請求項２５に記載のシステム。
  27. 前記少なくとも１つの蛍光消光阻害剤が、ｔｒｏｌｏｘである、請求項２２に記載のシステム。
  28. 前記緩衝液が、ＴＲＩＳ緩衝液である、請求項２２に記載のシステム。
  29. 前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項２２に記載のシステム。
  30. ｉ）ＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液；
    ｉｉ）およそ５〜５０ｍＭの範囲内の濃度のカルニチン；
    ｉｉｉ）およそ５〜１５ｍＭの範囲内の濃度のｔｒｏｌｏｘ；
    ｉｖ）およそ１０〜５０ｍＭの範囲内の濃度の２，５−ジヒドロキシ安息香酸；および
    ｖ）およそ１０〜２０ｍＭの範囲内の濃度の３，４−ジヒドロキシ安息香酸エチルエステル、
    を含むイメージング試薬。
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