JP2004033003A - Ｐｎａおよび一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを用いた一塩基多型を含む核酸内の変異の非標識検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、変異の簡便かつ安価な検出方法を提供する。
【解決手段】核酸内の変異を検出する方法であって、（ａ）　　ハイブリダイズ可能な条件下で、試験サンプル核酸とペプチド核酸プローブとを共にインキュベートして、核酸−ペプチド核酸複合体を形成させ、そして、（ｂ）　　上記複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼと接触させることを含む、上記方法に関する。
【選択図】　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸またはプローブの標識化を必要としない、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む核酸内の変異の簡便な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の変異は、種々の疾患に関与することが判っており、また様々な生物学的活性および生物学的形質に影響を与えることが判っているため、これらを検出することは、当技術分野において大変興味深い。
【０００３】
特に、一塩基多型（ＳＮＰ；　Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、多数の疾患の病因となるゲノム中に存在する一塩基のみ異なっていることを特徴とする多型であり、疾患易羅患性（即ち、疾患へのかかりやすさ）、疾患の治療に対する感受性、疾患治療薬に対する副作用の危険性などの個人差にも関与している。ＳＮＰの型決定はこれらの予見および／または予測を可能とするため、医学および薬学的な利用価値が大きい。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６における一塩基多型は、個体の薬物代謝速度を予測するために用いることができる。
【０００４】
さらに、薬理ゲノム学の分野における変異（特にＳＮＰ）の重要性は年々増大している。薬理ゲノム学への広範囲に及ぶ変異の応用およびゲノム内に広く存在する疾患感受性遺伝子を同定するための方法の開発が必要とされている。数年来、ローリングサークル型増幅（Ｈａｔｃｈ，　ら　（１９９９）　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，　Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１５：３５−４０）、フローサイトメトリー、および一塩基鎖伸長法（Ｃｈｅｎ，　ら　（２０００）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　１０：５４９−５５７；　Ｉａｎｎｏｎｅ，　ら　（２０００）　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　３９：１３１−１４０）、高密度オリゴヌクレオチドアレイ（Ｗａｎｇ，　ら　（１９９８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８０：１０７７−１０８２；　Ｆａｎ，　ら　（２０００）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　１０：８５３−８６０）、および光ファイバー遺伝子アレイ（Ｓｔｅｅｍｅｒｓ，　ら　（２０００）　Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１８：９１−　９４）などの固相基板（ビーズを含む）を用いる方法をはじめとし、多様なＳＮＰ検出手法が開示されている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ら　（１９９８）　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　８：７６９−７７６参照のこと）。これらは、ＰＣＲ反応、および標識化合物を利用する手法である。これらの方法は、ＳＮＰの型決定および変異の正確な検出ができるが、工程が複雑でありかつ従事者の熟練を要する。さらに、複数種の高価な実験設備を必要とするなど、経費の面でも不利な点が多い。
【０００５】
そこで、当技術分野において、簡便かつ安価に実施できるＳＮＰを含む遺伝子の変異を検出する方法が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試験サンプル核酸またはプローブを標識化することなく、試験サンプル核酸内の変異を迅速かつ簡便に検出する方法を提供することを目的とする。さらに、検出機器を必要としない、視覚的観察により変異が検出できる方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、変異を有する核酸に対するプローブとしてペプチド核酸（ＰＮＡ；　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を用いて、該核酸とＰＮＡとの複合体を形成させ、該複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ消化に供すると、ミスマッチによる非会合塩基対を含有する複合体は一本鎖核酸切断ヌクレアーゼにより消化されるが、フルマッチ複合体（即ち、プローブが核酸の対応する配列と完全に会合した場合）は一本鎖核酸切断ヌクレアーゼによる消化を受けないので複合体のまま存在するため、シアニン染料を加えると、ミスマッチプローブとの複合体を含む試料はその吸収極大が６４６ｎｍ付近に存在するのに対して、フルマッチプローブとの複合体を含む試料はその吸収極大が５３４ｎｍ付近に変化することを見出した。
この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は以下の態様；
１．　核酸内の変異を検出する方法であって、
（ａ）　　ハイブリダイズ可能な条件下で、試験サンプル核酸とペプチド核酸プローブとを共にインキュベートして、核酸−ペプチド核酸複合体を形成させ、そして、
（ｂ）　　上記複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼと接触させること、
を含む、上記方法、
２．　上記ステップ（ｂ）を、ミスマッチ塩基の酵素的切断が起こらないがその他の１本鎖核酸が切断可能な条件下で実施することを特徴とする、上記１記載の方法、
３．　上記ステップ（ｂ）を、ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件下で実施することを特徴とする、上記１記載の方法、
４．　ステップ（ｂ）における一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応の後、さらに、
（ｃ）　　該反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体に含まれる核酸の塩基長または質量を特定することにより、用いたペプチド核酸プローブに対して試験した核酸がミスマッチであるかフルマッチであるかを判定すること、
を含む、上記１〜３のいずれかに記載の方法、
５．　上記ステップ（ｃ）における該反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体に含まれる核酸の質量の特定が、ＴＯＦ／ＭＳ分析を含むものである、上記４記載の方法、
６．　一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、上記１〜５のいずれかに記載の方法、
７．　核酸内の変異を検出する方法であって、
（ａ）　　ハイブリダイズ可能な条件下で、試験サンプル核酸とペプチド核酸プローブとを共にインキュベートして、核酸−ペプチド核酸複合体を形成させ、
（ｂ）　　ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能であり、ミスマッチ塩基の切断の結果生じた切断産物中の核酸がＰＮＡプローブから解離し、解離した塩基が切断される条件下で、上記複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼと接触させてインキュベートし、そして、
（ｃ）　　一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体を検出することにより、用いたペプチド核酸プローブに対して試験した核酸がミスマッチであるかフルマッチであるかを判定すること、
を含む、上記方法、
８．　上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出がＴＯＦ／ＭＳ分析を含むものである、上記７記載の方法、
９．　上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が電気泳動手法を含むものである、上記７記載の方法、
１０．　上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が二本鎖核酸を検出可能な染料を用いる手法を含むものである、上記７記載の方法、
１１．　二本鎖核酸を検出可能な染料がシアニン染料である、上記１０記載の方法、
１２．　上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が、染料を含有する試験サンプルの光吸収スペクトルの変化を分光光度計により測定することをさらに含む、上記１０または１１記載の方法、
１３．　核酸−ペプチド核酸複合体の検出が、染料を含有する試験サンプルの色調変化を視覚的に観察することにより行われる、上記１０または１１記載の方法、
１４．　一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、上記７〜１３のいずれかに記載の方法、
１５．　核酸−ペプチド核酸複合体を検出するためのキットであって、
（ａ）　　１種以上のペプチド核酸プローブ、
（ｂ）　　１種以上の一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ、
を含む、上記キット、
１６．　（ｃ）　　１種以上の二本鎖核酸を検出可能な染料をさらに含む、上記１５記載のキット、
１７．　二本鎖核酸を検出可能な染料がシアニン染料である、上記１６記載のキット、
１８．　一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、上記１５〜１７のいずれかに記載のキット、
１９．　１種以上のペプチド核酸プローブが固相に固定化されていることを特徴とする、上記１〜１４のいずれかに記載の方法に使用するための核酸内の変異を検出するためのアレイ、ならびに、
２０．　１種以上のペプチド核酸プローブが上記１９記載のアレイの形態である、上記１５〜１８のいずれかに記載のキット、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本明細書中に記載する、「核酸」とは、天然に存在するまたは人工的に合成／構築されたＤＮＡおよびＲＮＡを含むあらゆるポリヌクレオチドを包含する。
【００１０】
本明細書中に記載する、「変異」とは、核酸内の塩基配列において、連続した５塩基以下、好ましくは２〜３塩基、最も好ましくは１塩基が対象とする塩基配列の対応する部分の塩基と異なっていることを指し、一塩基多型（ＳＮＰ）を包含する。
【００１１】
本明細書中に記載する「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」とは、ポリペプチド骨格に核酸塩基が結合した構造を有する化合物である。ポリペプチド骨格の例としては、２−アミノエチルグリシンを骨格単位とするものが挙げられるが、これに限定はされない。該ＰＮＡは、核酸分解酵素により分解されないため、ＤＮＡまたはＲＮＡより安定性に優れている。さらに、ペプチド分解酵素によっても分解されない。さらに、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡと強いＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することができ、ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの二本鎖複合体は、ＤＮＡ−ＤＮＡ複合体またはＲＮＡ−ＤＮＡ複合体より安定性が高い。したがって、ＰＮＡは、それをプローブに用いることにより、ＤＮＡまたはＲＮＡをプローブとした場合には困難なハイブリダイゼーションを容易にする。ＰＮＡの核酸へのハイブリダイゼーションは、核酸同士のハイブリダイゼーションと同様に実施することができるので、本明細書中、ＰＮＡと核酸との複合体を形成させる際の「ハイブリダイズ可能な条件」とは、ミスマッチプローブおよびフルマッチプローブの双方ともが試験サンプル核酸の対応する塩基配列中に特異的にハイブリダイズし得る条件をいい、使用するプローブの配列および長さに応じて、温度ならびに／または塩および／もしくは界面活性剤等のバッファー組成および／もしくは濃度等を変更することにより設定することが可能であり、当業者には容易に設定することができる。また、ＰＮＡプローブを（好ましくは、該核酸分子の濃度に対して１倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上）の濃度となるようにＰＮＡプローブを該溶液中に添加し、溶液中に含まれる二本鎖核酸を熱変性などの当業者には周知の方法によって一本鎖にし、時間をかけて室温にまで冷ますという方法で、核酸−ＰＮＡ複合体を形成させることができるが、この方法に限らない。核酸−ＰＮＡ複合体を形成させるための種々の方法および条件は当業者には公知である。さらに、予め固相に結合させたＰＮＡプローブを用いても、核酸−ＰＮＡ複合体を形成させることができる。
【００１２】
本発明の方法に用いるＰＮＡプローブは、試験サンプル中の核酸（ゲノムの二本鎖核酸である場合は、いずれかの鎖でもよい）の検出すべき変異塩基を含む配列に相補的になるように設計する。「変異塩基」とは、核酸内の変異を有していると考えられ得る位置に存在する塩基を指し、即ち、異なる変異型では、変異塩基が異種の塩基である。該ＰＮＡプローブ中に含まれる変異塩基は、その異種の塩基のうちのいずれかに対する相補的塩基となるように設計すればよい。遺伝子内の変異は、さまざまなものが公知であり、今後もゲノム解析およびそれに続く研究により多くのものが報告されるであろう。検出すべき変異がＳＮＰである場合でも、これらのＳＮＰ塩基およびその近隣の核酸配列は、さまざまなデータベースおよび文献に見出すことができる。該ＰＮＡプローブ中の変異塩基以外の塩基は、その変異が存在する一本鎖核酸に対して完全に相補的であるように設計する。該ＰＮＡプローブのどの位置に変異塩基を含んでもよいが、該ＰＮＡプローブの核酸配列の両端の塩基は変異塩基ではないことが好ましい。さらには、該ＰＮＡプローブの核酸配列の両端から３塩基以内、好ましくは５塩基以内の塩基には変異塩基が含まれないことが好ましく、該ＰＮＡプローブの核酸配列の真ん中付近に変異塩基が存在するように該ＰＮＡプローブを設計することが最も望ましい。該ＰＮＡプローブの塩基長は、５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１５塩基以上、最も好ましくは１８塩基以上であり、特にヒトゲノム中の変異を検出するためには、１７塩基または１８塩基以上が好ましいが、さらにＰＮＡプローブの溶解性の問題および／または調製の便宜の点から、５０塩基以下、好ましくは３０塩基以下のものが好ましい。このような条件に沿ったＰＮＡプローブの設計は、当業者であれば容易に達成し得る。
【００１３】
本明細書に用いる「フルマッチ」という用語は、試験サンプル核酸中の該変異塩基が、用いたＰＮＡプローブ中に含まれる変異塩基と相補的であり、ＰＮＡプローブとサンプル中の核酸の対応する部分の全ての塩基との間で相補的塩基対形成が起こることを指し、「フルマッチプローブ」とは試験サンプル核酸中の変異塩基に相補的な塩基を変異塩基の位置に含んでおり、変異塩基以外の位置もまた試験サンプル核酸の対応する塩基に相補的な塩基からなっているプローブをいう。「ミスマッチ」とは、試験サンプル核酸中の該変異塩基が、用いたＰＮＡプローブ中に含まれる変異塩基に相補的ではなく、これらの変異塩基同士が塩基対形成しないことを指し、「ミスマッチプローブ」とは、変異塩基の位置に試験サンプル核酸中の変異塩基に対して非相補的であり、かつ変異塩基以外の位置には「フルマッチプローブ」と同じく、試験サンプル核酸の対応する塩基に相補的な塩基を有しているプローブをいう。
【００１４】
本明細書中に用いる「一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ」とは、一本鎖核酸を切断可能なエンドヌクレアーゼを指し、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００１５】
本明細書中に用いる「ミスマッチ塩基の酵素的切断が起こらないがその他の一本鎖核酸が切断可能な条件」とは、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが塩基対形成していない一本鎖核酸を切断するが、ミスマッチ塩基とそれに隣接する塩基との間の結合は切断しない条件をいう。一般的には、下記の「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件」より、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応が進行し難い、すなわち弱い条件ということができる。
【００１６】
本明細書中に用いる「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件」とは、使用する一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが塩基対形成していない一本鎖核酸に加えて、ミスマッチ塩基とそれに隣接する塩基との間の結合をも切断し得るが、ＰＮＡプローブ中の塩基と塩基対形成した核酸は切断し得ない条件をいい、例えば、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを含有する一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応用バッファー（例えば、３０ｍＭ　酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１．０ｍＭ　ＺｎＳＯ_４、５％（ｖ／ｖ）　グリセロール）中に１〜１００μＭ好ましくは５〜５０μＭ、特に好ましくは１０〜３０μＭの濃度となるように核酸−ＰＮＡ複合体が含まれており、温度は１５℃〜３７℃、好ましくは２０〜２５℃であり、かつ反応時間は１０分以上、好ましくは２０分以上である条件を指す。通常、この条件に用いる一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの濃度は０．５〜５　Ｕ／μｌの範囲内である。該酵素濃度を１Ｕ／μｌ以上に設定した場合、反応温度は２０〜２５℃、反応時間は２０分以上という条件が特に好ましい。しかし、これらの条件は、ＰＮＡプローブとハイブリダイズし得る試験サンプル核酸の配列、および条件中の他の要件などに応じて変化し得る。当業者であれば、これらの条件は通常の知識および／または日常的かつ簡単な実験を予め実施することにより設定できる。このような条件では、核酸−ＰＮＡ複合体中の核酸のミスマッチ塩基とそれに隣接する塩基との間の結合も一本鎖核酸切断ヌクレアーゼによる分解を受ける。しかし、このような反応条件下でも、フルマッチプローブを含む核酸−ＰＮＡ複合体は、完全な相補的塩基対形成した二本鎖であるため、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ分解は受けない。本発明の方法はこの事実に基づいている。
【００１７】
本明細書中に用いる、「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能であり、ミスマッチ塩基の切断の結果生じた切断産物中の核酸がＰＮＡプローブから解離し、解離した塩基が切断される条件」とは、使用する一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、ＰＮＡプローブと塩基対形成していない一本鎖核酸およびミスマッチ塩基とそれに隣接する塩基との間の結合を切断し得、かつＰＮＡプローブと塩基対形成している試験サンプル核酸中の塩基がＰＮＡプローブの塩基から解離し、この解離した塩基が一本鎖核酸切断ヌクレアーゼにより該核酸から切断され得る条件をいう。すなわち、このような条件下では、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼによりＰＮＡプローブと塩基対形成していない一本鎖核酸およびミスマッチ塩基と隣接する塩基との間の結合が切断されて、ＰＮＡプローブ１分子に対して該切断により生じる２つの核酸分子がハイブリダイズした形態の産物が反応溶液中に生じるが、該産物はフルマッチＰＮＡプローブとハイブリダイズした核酸−ＰＮＡ複合体より１分子あたりの核酸に含まれる塩基の数が少ないため、１分子あたりの核酸のハイブリダイゼーション強度はフルマッチ核酸−ＰＮＡ複合体のそれと比較すると弱いので、解離し易く、フルマッチＰＮＡプローブとハイブリダイズした核酸−ＰＮＡ複合体は解離せず安定して複合体を維持できるが、ミスマッチ塩基対を含む核酸−ＰＮＡ複合体は解離してヌクレアーゼにより分解される。このような条件下では、上記の「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件」下の場合と比較して、核酸−ＰＮＡ複合体が解離し易く、かつ／または解離した塩基を速やかに核酸分子から切断するために十分な一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ活性を含有していることが望ましい。例えば、上記の「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件」と同様の反応溶液組成を用いることもできるが、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの活性が十分に維持できる限度内で温度を上昇させるか、温度を上昇させることにより喪失される酵素活性を補充するため、もしくは解離した塩基をより速やかに分解できるように酵素濃度を上げるか、または反応時間を延長することも可能である。通常、この条件に用いる一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの濃度は１〜１０Ｕ／μｌ、好ましくは１．５〜５Ｕ／μｌの範囲内である。これらの条件は、ＰＮＡプローブとハイブリダイズし得る試験サンプル核酸の配列、および条件中の他の要件などに応じて変化し得る。当業者であれば、これらの条件は通常の知識および／または日常的かつ簡単な実験を予め実施することにより設定できる。
【００１８】
本発明の１つの態様として、本発明の方法により得られた反応産物溶液中に残存する核酸−ＰＮＡ複合体または該複合体中に含まれる核酸を電気泳動的に検出することが可能である。該複合体をＴＯＦ／ＭＳ解析に供して、含有される核酸の質量によりその配列を特定することもできる。さらに、「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件」を用いて反応を実施した場合は、該複合体中に試験サンプル核酸に対してＰＮＡプローブがミスマッチであるために変異塩基の位置で切断された短い核酸が検出され、試験サンプル核酸に対してＰＮＡプローブがフルマッチであったため変異塩基の位置で切断を受けていない核酸が検出されるかということにより、変異を判定できる。あるいは、「ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能であり、ミスマッチ塩基の切断の結果生じた切断産物中の核酸がＰＮＡプローブから解離し、解離した塩基が切断される条件」を用いて反応を実施した場合は、試験サンプル核酸に対してＰＮＡプローブがミスマッチであった場合は核酸は検出されないか、上記変異塩基の位置で切断された短い核酸よりもさらに短い核酸となって検出されるため、変異を判定できる。
【００１９】
二本鎖核酸を検出可能な染料を用いると、ＴＯＦ／ＭＳまたは電気泳動による解析よりもさらに簡便に変異を検出できる。本発明の方法に用いる二本鎖核酸を検出可能な染料は、二本鎖核酸に吸着または結合して、光学的特徴により二本鎖核酸を検出することができる任意の化合物である。即ち、二本鎖核酸を含む試料溶液中に混合すると、二本鎖核酸に吸着または結合して、その光吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルの変化が起こるという特徴を有するいかなる化合物でもよい。該光吸収スペクトルの変化は、可視光領域内に限らず、赤外、近赤外または紫外光領域で起こる場合もあり、これらを検出することも可能である。かかる染料の例としては、シアニン染料（ｃｙａｎｉｎ　ｄｙｅ　ＤｉＳｃ_２）、臭化エチジウム、アクリジンオレンジなどが挙げられるがこれらには限定されない。このような光吸収スペクトルまたは蛍光スペクトルの変化は、公知の方法で測定することができ、そのための分析機器も多種多様な機種が当業者には普及しており、適宜選択して用いるとよい。特に好ましい本発明の方法に用いる二本鎖核酸を検出可能な染料は、シアニン染料ＤｉＳｃ_２である。該染料溶液は、二本鎖核酸に結合していない状態では６４０〜６５０ｎｍ付近（具体的には６４６ｎｍ）に吸収極大波長を有し青色を呈するが、二本鎖核酸に結合した状態では５３０〜５４０ｎｍ付近（具体的には５３４ｎｍ）に吸収極大波長を有し紫色を呈する。このような吸収極大波長の変化は、一般的な可視光用の分光光度計により測定することができる。さらに、青色から紫色への色調変化を視覚的観察により判断することもできる。即ち、本発明の方法においてシアニン染料を用いる態様では、プローブと試験サンプル核酸とがミスマッチである場合は青色を呈するのに対して、フルマッチである場合は紫色を呈し、この試験サンプル溶液の色調の相違は肉眼で容易に観察でき、変異を肉眼による視覚的観察によって検出し得る。
【００２０】
このような検出アッセイは、安価な、試験管、マイクロチューブ、９６または３８４ウェル等のマルチウェルプレートなどの容器内で実施でき、ハイブリダイゼーションおよび一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ消化の温度条件を設定し得る設備等（インキュベーター、温度調節用水浴など）の安価かつ汎用な設備さえあれば、実施できる。さらに、本発明の方法は、作業行程が簡便かつ単純であることから、自動化が極めて容易であり、多検体を短時間で試験するハイスループットスクリーニング系への利用が可能である。さらに、本発明の方法は、標識化合物を用いる必要がないということが大きな利点である。
【００２１】
さらに、本発明の他の態様は、ＰＮＡ−核酸複合体を検出するためのキットである。該キットは、上記のように設計された１種以上のＰＮＡプローブ、１種以上の一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼまたはＰ１ヌクレアーゼが例として挙げられるが、これらに限定はされない）を含む。さらに、１種以上の二本鎖核酸を検出可能な染料（例えば、シアニン染料）を含んでもよい。ＰＮＡプローブとしては、変異の検出をより確実なものとするために、変異塩基のみが異なる２種以上のプローブを含むこともできる。さらに、上記プローブ、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼおよび染料は、キットを使用する者の便宜に合わせて、かつ保存および／または輸送期間中の安定性を付与し得る形態でキットに含ませることができる。さらに、該キットには、本発明の方法に使用するバッファー又はバッファー組成物、反応停止液および反応容器を合わせて提供することもでき、使用方法を解説した使用説明書を添付することが好ましい。
【００２２】
１種以上の変異検出用のＰＮＡプローブが固相に固定化されている変異検出用アレイも本発明の範囲に包含することができる。このようなアレイはまた、上記キットの一部として提供され得る。該アレイに用いる固相は、通常の核酸アレイに用いるものでよく、固定化の方法も様々なものが当業者に公知である。ＰＮＡは核酸に比べて、非常に安定性が高いため、該アレイは公知の方法でハイブリダイズしたサンプルを洗浄することにより、核酸を接着させたアレイに比べて再利用性に優れている。該アレイを利用して、試験サンプル核酸とインキュベートして、上記と同様な方法で一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応に供して変異の検出を行うことができ、生物ゲノム中のさまざま位置に存在する複数の変異を一度に検出することができる。複数の変異に対するＰＮＡプローブの設計および反応条件の設定は、当業者の通常の知識および日常的な試験により容易になし得る。反応条件（例えば、温度、塩濃度など）を経時的にシフトさせることも可能であり、また経時的に光吸収スペクトルの変化を検出することも可能である。このような手法により、異なる反応条件を要求する複数のＰＮＡプローブを用いて、複数の変異を一度に検出することが可能であることは、当業者には理解できる。
【００２３】
このことから、本発明の方法は、非常に簡便かつ安価な変異検出法であるという大きな利点を有している。さらに、本発明の方法の利点としては、ＰＣＲ反応を必要としないこと、検出工程が単純で非常に簡単に習得できること、および短時間で実施できることが挙げられる。また、反応後の溶液中には、最初の試験サンプル中に含有されていた核酸二本鎖が存在しないため、検出の際のバックグラウンドの影響がないかもしくは非常に低いレベルであるということも本発明の方法の利点である。
【００２４】
【実施例】
試験サンプル ＤＮＡ および ＰＮＡ プローブ
試験サンプルＤＮＡとしては、配列番号１〜４に示す配列を有するＤＮＡ（ＤＮＡ−３０Ｇ、ＤＮＡ−３０Ｃ、ＤＮＡ−３０ＡおよびＤＮＡ−３０Ｔ）を合成機により合成した後、常法により精製した。これらは１５塩基目の塩基のみを異にする配列を有している。ＰＮＡプローブには、配列番号５に示す配列を有するＰＮＡをＷ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ（Ｆｍｏｃ　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　２０００中、４１頁の題「Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ」の章参照のこと）の方法により合成した。該ＰＮＡプローブは、ＤＮＡ−３０Ｃに対してフルマッチプローブとなり、ＤＮＡ−３０Ｇ、ＤＮＡ−３０ＡおよびＤＮＡ−３０Ｔに対しては一塩基のみミスマッチするミスマッチプローブとなる。
【００２５】
１． ＴＯＦ／ＭＳ 分析による検出
ＤＮＡ−ＰＮＡ 複合体形成
各試験サンプルＤＮＡ（１０μＭ）およびＰＮＡプローブ（２０μＭ）をＮａＣｌまたは酢酸ナトリウム（１０　ｍＭ）溶液（１０μｌ）中で９０℃で５０分間加熱し、２時間かけて室温まで徐々に冷却した。この冷却の際にＤＮＡ−ＰＮＡ複合体が形成する。
【００２６】
Ｓ １ヌクレアーゼ反応
上記複合体を含有する溶液を、３０ｍＭ　酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１．０ｍＭ　ＺｎＳＯ_４、５％（ｖ／ｖ）　グリセロールという反応液（１５０μｌ）の組成になるように調製し、１０℃で３０分水浴中でインキュベートした。その後Ｓ１ヌクレアーゼを０．２５Ｕ／μＬとなるように添加して反応を開始させ、１０℃で２０分水浴中でインキュベートした。ＥＤＴＡ溶液を用いて反応を停止させ、ＴＯＦ／ＭＳ分析に供した。その結果を図１および表１に示す。なお、ＰＮＡの代わりに、用いたＰＮＡと同様の配列を有するＤＮＡをプローブとして用いた場合には、重量体が検出されず、変異塩基の検出は不可能であった。
【００２７】
【表１】

【００２８】
２．色素による検出
Ｓ １ヌクレアーゼ反応
上記と同様の複合体を含有する溶液を、３０ｍＭ　酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１．０ｍＭ　ＺｎＳＯ_４、５％（ｖ／ｖ）　グリセロールという反応液（１５０μｌ）の組成になるように調製し、２０℃で３０分水浴中でインキュベートした。その後、Ｓ１ヌクレアーゼを５．０Ｕ／μＬとなるように添加して反応を開始させ、２０℃で２０分水浴中でインキュベートした。ＥＤＴＡ溶液を用いて反応を停止させ、シアニン色素（３’，３’−ｄｉｅｔｈｙｌｔｈｉｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ　ｉｏｄｉｄｅ；　Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液（メタノール中、１．５ｍＭ、１０μｌ）を加えて、可視−ＵＶスペクトル（ＪＡＳＣＯ，　Ｖ−５３０）を分析した。その結果を図１に示す。また、該溶液の染料の色調変化を視覚的に検出することができた。なお、ＰＮＡの代わりに、用いたＰＮＡと同様の配列を有するＤＮＡをプローブとして用いた場合には、変異塩基の検出は不可能であった。
【００２９】
【発明の効果】
以上の実施例に示したように、本発明は塩基配列中の一塩基の相違を非常に簡便に検出し得、検出装置を必要としない視覚的観察により変異を検出し得る。
【００３０】
したがって、本発明は、非常に簡便かつ安価な変異検出法およびそれに有用なキットを提供し得る。本発明による検出方法は、実施例の実験手法に拘束されることなく、染料を用いた染色法以外にも電気泳動的手法、ＴＯＦ／ＭＳ分析などの手法のなかから好都合のものを、当業者の通常の知識に基づいて選択して用いることが可能である。本発明の方法のさらなる利点としては、ＰＣＲ反応を必要としないこと、検出工程が単純で非常に簡単に習得できること、および短時間で実施できることと共に、核酸およびプローブのいずれをも標識化合物で標識する必要がないこと、さらに、反応後の溶液中には最初の試験サンプル中に含有されていた核酸二本鎖が存在しないため、検出の際のバックグラウンドの影響がないかもしくは非常に低いレベルであるという利点がある。
【００３１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＯＦ／ＭＳ分析により解析した結果のうち、フルマッチのＤＮＡ−３０Ｇ（左）およびミスマッチのＤＮＡ−３０Ｔ（右）の解析結果を示す。
【図２】図２は、シアニン色素（３’，３’−ｄｉｅｔｈｙｌｔｈｉｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ　ｉｏｄｉｄｅ）溶液を用いて、配列番号１〜４に示す配列を有するＤＮＡ（ＤＮＡ−３０Ｇ、ＤＮＡ−３０Ｃ、ＤＮＡ−３０ＡおよびＤＮＡ−３０Ｔ）中の変異を、配列番号５に示す配列を有するＰＮＡプローブを用いて検出した可視−ＵＶスペクトルを示す。

Claims (20)

1. 核酸内の変異を検出する方法であって、
   （ａ）　　ハイブリダイズ可能な条件下で、試験サンプル核酸とペプチド核酸プローブとを共にインキュベートして、核酸−ペプチド核酸複合体を形成させ、そして、
   （ｂ）　　上記複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼと接触させること、
   を含む、上記方法。
2. 上記ステップ（ｂ）を、ミスマッチ塩基の酵素的切断が起こらないがその他の１本鎖核酸が切断可能な条件下で実施することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 上記ステップ（ｂ）を、ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能な条件下で実施することを特徴とする、請求項１記載の方法。
4. ステップ（ｂ）における一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応の後、さらに、
   （ｃ）　　該反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体に含まれる核酸の塩基長または質量を特定することにより、用いたペプチド核酸プローブに対して試験した核酸がミスマッチであるかフルマッチであるかを判定すること、
   を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 上記ステップ（ｃ）における該反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体に含まれる核酸の質量の特定が、ＴＯＦ／ＭＳ分析を含むものである、請求項４記載の方法。
6. 一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 核酸内の変異を検出する方法であって、
   （ａ）　　ハイブリダイズ可能な条件下で、試験サンプル核酸とペプチド核酸プローブとを共にインキュベートして、核酸−ペプチド核酸複合体を形成させ、
   （ｂ）　　ミスマッチ塩基の酵素的切断が可能であり、ミスマッチ塩基の切断の結果生じた切断産物中の核酸がＰＮＡプローブから解離し、解離した塩基が切断される条件下で、上記複合体を一本鎖核酸切断ヌクレアーゼと接触させてインキュベートし、そして、
   （ｃ）　　一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ反応溶液中に残存する核酸−ペプチド核酸複合体を検出することにより、用いたペプチド核酸プローブに対して試験した核酸がミスマッチであるかフルマッチであるかを判定すること、
   を含む、上記方法。
8. 上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出がＴＯＦ／ＭＳ分析を含むものである、請求項７記載の方法。
9. 上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が電気泳動手法を含むものである、請求項７記載の方法。
10. 上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が二本鎖核酸を検出可能な染料を用いる手法を含むものである、請求項７記載の方法。
11. 二本鎖核酸を検出可能な染料がシアニン染料である、請求項１０記載の方法。
12. 上記ステップ（ｃ）における核酸−ペプチド核酸複合体の検出が、染料を含有する試験サンプルの光吸収スペクトルの変化を分光光度計により測定することをさらに含む、請求項１０または１１記載の方法。
13. 核酸−ペプチド核酸複合体の検出が、染料を含有する試験サンプルの色調変化を視覚的に観察することにより行われる、請求項１０または１１記載の方法。
14. 一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 核酸−ペプチド核酸複合体を検出するためのキットであって、
    （ａ）　　１種以上のペプチド核酸プローブ、
    （ｂ）　　１種以上の一本鎖核酸切断ヌクレアーゼ、
    を含む、上記キット。
16. （ｃ）　　１種以上の二本鎖核酸を検出可能な染料をさらに含む、請求項１５記載のキット。
17. 二本鎖核酸を検出可能な染料がシアニン染料である、請求項１６記載のキット。
18. 一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼおよびＰ１ヌクレアーゼからなる群より選択されるものである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のキット。
19. １種以上のペプチド核酸プローブが固相に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に使用するための核酸内の変異を検出するためのアレイ。
20. １種以上のペプチド核酸プローブが請求項１９記載のアレイの形態である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のキット。

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