JP4752071B2 - 一塩基多型の検出方法 - Google Patents
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Description
〔1〕 (A)i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記(B)の化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法であって、
前記(B)バルジ塩基認識可能な化合物が、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物である、一塩基多型の検出方法、
〔2〕 下記1)〜4):
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記(B)のバルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、前記〔1〕記載の検出方法、
〔3〕 前記シグナルが蛍光である前記〔1〕又は〔2〕に記載の検出方法、
〔4〕 前記2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物が、下記式(II):
〔5〕 i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
バルジ塩基認識可能な2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物と
を含有してなる、前記〔1〕〜〔4〕いずれか1項に記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット、
に関する。
II)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記(B)の化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする方法である。
に示される2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物等が挙げられる。前記第1級アミン残基としては、−NH2基が挙げられる。また、前記第2級アミン残基としては、例えば、−NH(CH2)3NH2基、−NH(CH2)2NH2基、−NH(CH2)2NH(CH3)基等が挙げられる。さらに、前記第3級アミン残基としては、例えば、−N(CH3)(CH2)2NH2基等が挙げられる。本発明においては、バルジ塩基との水素結合形成の観点から、好ましくは、第2級アミン残基であることが望ましく、より好ましくは、前記R1及びR2の両方が、第2級アミン残基であることが望ましい。
に示される化合物等が挙げられる。
II)一塩基多型の存在するヌクレオチドを含む連続した塩基配列に相当する塩基配列であり、前記一塩基多型存在位置に対応する位置の5’若しくは3’末端側に隣接してシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を含有した核酸プローブ、と言い換えることもできる。
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
が好ましい。
ii)一塩基多型の存在するヌクレオチドを含む連続した塩基配列に相当する塩基配列であり、前記一塩基多型存在位置に対応する位置の5’若しくは3’末端側に隣接してシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を含有した核酸プローブ、
である。
II’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、
i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
等が挙げられる。
II’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加された塩基配列を有する核酸プローブ、
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
等が挙げられる。
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記(B)のナフチリジン環を含む化合物に基づく前記シグナルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する。標的対象核酸に対する前記核酸プローブの使用例の1例を示す模式図を、図1に示す。
2)シトシンバルジに隣接した塩基対がCG塩基対でない場合
にのみ観察できた。したがって、Cアレルは、2,7−ジアミノ−1,8−ナフチリジンの蛍光のネガティブシグナルとして検出された。
Claims (5)
- (A)i)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、又は
ii)少なくとも一つの一塩基多型を含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
(B)バルジ塩基認識可能な化合物と、
(C)前記評価対象核酸と、
を混合し、
前記核酸プローブと評価対象核酸とがハイブリダイズした際に形成されるシトシンバルジ又はチミンバルジを認識する前記(B)の化合物に基づくシグナルを検出し、
前記一塩基多型を評価することを特徴とする一塩基多型の検出方法であって、
前記(B)バルジ塩基認識可能な化合物が、2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物である、一塩基多型の検出方法。 - 下記1)〜4):
1)前記一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む野生型評価対象核酸と、該野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
2)前記一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む変異型評価対象核酸と、該変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
3)前記野生型評価対象核酸と、前記変異型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、及び
4)前記変異型評価対象核酸と、前記野生型評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能である核酸プローブとの間に形成されたバルジ、
のそれぞれに結合した前記(B)のバルジ塩基を認識可能な化合物に基づくシグナルの変動に基づき、評価対象核酸における一塩基多型を同定する、請求項1記載の検出方法。 - 前記シグナルが蛍光である請求項1又は2に記載の検出方法。
- i’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に野生型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
i’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基に置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
ii’’)少なくとも一つの一塩基多型を含み、該一塩基多型存在位置に変異型ヌクレオチドを含む評価対象核酸のアンチセンス鎖に対し相補的にハイブリダイズ可能であって、前記アンチセンス鎖上の一塩基多型に対合する位置の5’若しくは3’末端側に隣接した位置にシトシン残基若しくはチミン残基が付加され、かつ該シトシン残基若しくはチミン残基に隣接して存在するグアニン残基の少なくとも1がイノシン残基にさらに置換された塩基配列を有する核酸プローブ、
と、
バルジ塩基を認識可能な2,7−ジアミノナフチリジン誘導体化合物と
を含有してなる、請求項1〜4いずれか1項に記載の核酸中の一塩基多型の検出方法に用いるためのキット。
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