JP5692774B2 - 一塩基多型を検出する方法および試薬キット - Google Patents
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Description
本発明に係るSNPを検出する方法は、ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、SNPを検出する方法である。この方法は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含していればよい。試料核酸には、野生型核酸および/または野生型核酸に対してSNPの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれる。
ヘアピンプライマーにより変異型核酸を増幅する場合、このヘアピンプライマーは、変異型核酸に対して相補的な領域、およびこの領域の5’末端に結合された一本鎖DNA断片からなるプライマーである。ヘアピンプライマーの3’末端の位置は、変異型核酸におけるSNPの位置になるように設計されている。
本発明に係るSNPを検出する方法に用いるバルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合可能である限り限定されるものではないが、蛍光物質であって、バルジ構造と結合することで、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフト、または、蛍光が消光する等、蛍光の発光状態が変化する物質を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できるからである。なお、蛍光物質ではないバルジ構造結合分子を用いてもよく、この場合、バルジ構造結合分子を別途蛍光物質等により標識化したり、バルジ構造結合分子をアフィニティクロマトグラフィーのカラムに充填したりして用いればよい。
測定工程は、バルジ構造結合分子を用いて、ヘアピンプライマーの量を測定する工程であればよい。
本発明に係る試薬キットは、上述した試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、SNPを検出するための試薬キットであって、上述したヘアピンプライマーを含むプライマーセット、および上述したコンペティタープライマーを含むプライマーセットを包含していればよい。
M13M3:GTTGTAAAACGACGGCCAGT(配列番号3)
HP−C :ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAC(配列番号4)
HP−A :ATCATCTACAACTTTTGTCTGTAATGATCAGGAAACAGCTATGAA(配列番号5)
CP−C :CAGGAAACAGCTATGAC(配列番号6)
CP−C1:ACAGGAAACAGCTATGAC(配列番号7)
CP−C2:CACAGGAAACAGCTATGAC(配列番号8)
CP−A :CAGGAAACAGCTATGAA(配列番号9)
CP−A1:ACAGGAAACAGCTATGAA(配列番号10)
CP−A2:CACAGGAAACAGCTATGAA(配列番号11)。
M13M3は、テンプレートGまたはテンプレートTの376位〜395位の塩基配列の相補鎖に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。
〔実施例1〕
本実施例におけるPCRには、テンプレートとしてテンプレートG、リバースプライマーとしてHP−C、コンペティタープライマーとしてCP−A1、フォワードプライマーとしてM13M3を用いた。
コンペティタープライマーとしてCP−A2を用いたこと以外は、実施例1と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(a)において「2」の凡例で示す。
テンプレートとしてテンプレートTを用いたこと以外は、実施例1と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(b)において「3」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−A2を用いたこと以外は、実施例3と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(b)において「4」の凡例で示す。
テンプレートとしてテンプレートT、ヘアピンプライマーとしてHP−A、コンペティタープライマーとしてCP−C1を用いたこと以外は、実施例1と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(c)において「5」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−C2を用いたこと以外は、実施例5と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(c)において「6」の凡例で示す。
テンプレートとしてテンプレートGを用いたこと以外は、実施例5と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(d)において「7」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−C2を用いたこと以外は、実施例7と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(d)において「8」の凡例で示す。
実施例1と同様の条件にて、PCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(a)において「9」の凡例で示す。
リバースプライマーとしてHP−A1を用い、コンペティタープライマーとしてCP−C2を用いたこと以外は、実施例9と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(a)において「10」の凡例で示す。
実施例3と同様の条件にて、PCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(b)において「11」の凡例で示す。
リバースプライマーとしてHP−A1を用い、コンペティタープライマーとしてCP−C2を用いた以外は、実施例11と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(b)において「12」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−Aを用いたこと以外は、実施例1と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(a)において「1’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−Aを用いたこと以外は、実施例3と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(b)において「2’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−Cを用いたこと以外は、実施例5と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(c)において「3’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーとしてCP−Cを用いたこと以外は、実施例7と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図2の(d)において「4’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例9と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(a)において「9’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例10と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(a)において「6’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例11と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(b)において「7’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例12と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(b)において「8’」の凡例で示す。
テンプレートGから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例1〜4,9,11のPCRの結果と比較例1,2,5,7のPCRの結果とを比較して説明する。
テンプレートTから増幅した核酸の特異的な確認について、実施例5〜8,10,12のPCRの結果と比較例3,4,6,8のPCRの結果とを比較して説明する。
〔実施例13〕
テンプレートとしてテンプレートGとテンプレートTとの混合物を用い、リバースプライマーとしてHP−Cを用い、コンペティタープライマーとしてCP−A1を用いたこと以外は、実施例1と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。なお、上記混合物中のテンプレートGとテンプレートTとの割合は、1:1(各2ng)であった。
リバースプライマーとしてHP−A1を用い、コンペティタープライマーとしてCP−C2を用いたこと以外は、実施例13と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(c)において「14」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例13と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(c)において「9’」の凡例で示す。
コンペティタープライマーを用いなかったこと以外は、実施例14と同様にPCRを実施し、反応液の蛍光強度を測定した。このPCRにおける蛍光強度の測定結果を図4の(c)において「10’」の凡例で示す。
テンプレートGまたはテンプレートTの何れから一方から増幅した核酸の特異的な確認について、実施例13,14のPCRの結果と比較例9,10のPCRの結果とを比較して説明する。
2 ・・・一本鎖DNA
3 ・・・二本鎖DNA
4 ・・・野生型のテンプレート
5 ・・・二本鎖DNA
11・・・ヘアピンプライマー
12・・・コンペティタープライマー
13・・・リバースプライマー
20・・・蛍光分子
30・・・HP−CのテンプレートGに対して相補的な領域
31・・・CP−AのテンプレートTに対して相補的な領域
32・・・CP−A1のテンプレートTに対して相補的な領域
40・・・ヘアピン構造(一本鎖DNA断片)
Claims (5)
- ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、バルジ構造結合分子および試料核酸、を用いて核酸増幅反応を行い、SNPを検出する方法であって、
該バルジ構造結合分子を用いて、該ヘアピンプライマーの量を測定する測定工程、を包含し、
該試料核酸には、野生型核酸および/または野生型核酸に対してSNPの位置において一塩基変異している変異型核酸が含まれ、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の5’末端に結合された一本鎖DNA断片からなるものであって、
該一本鎖DNA断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの3’末端の位置は、該試料核酸におけるSNPの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、5’末端側に少なくとも1塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの3’末端の位置は、該試料核酸におけるSNPの位置になるように設計されており、
(1)該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの3’末端は、該変異型核酸における該SNPの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
(2)該ヘアピンプライマーにより、該変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの3’末端は、該野生型核酸における該SNPの位置の塩基に相補的な塩基であり、
上記バルジ構造は、シトシンバルジ構造であり、
上記バルジ構造結合分子は、下記式(2)
- 上記コンペティタープライマーは、上記ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、5’末端側に1塩基〜3塩基長くなるように設計されたものであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記コンペティタープライマーは、上記ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、5’末端側に2塩基長くなるように設計されたものであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記測定工程は、上記バルジ構造結合分子の蛍光強度を測定することによって、上記核酸増幅反応におけるヘアピンプライマーの量を測定する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 野生型核酸および/または野生型核酸に対してSNPの位置において一塩基変異している変異型核酸を含む試料核酸を用いて核酸増幅反応を行い、SNPを検出するための試薬キットであって、
ヘアピンプライマーを含むプライマーセット、コンペティタープライマーを含むプライマーセット、およびバルジ構造結合分子を包含し、
該ヘアピンプライマーは、該試料核酸に対して相補的な領域、および該領域の5’末端に結合された一本鎖DNA断片からなるものであって、
該一本鎖DNA断片は、ヘアピン構造を形成し、該ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであり、
該ヘアピンプライマーの3’末端の位置は、該試料核酸におけるSNPの位置になるように設計されており、
該コンペティタープライマーは、該ヘアピンプライマーの試料核酸に対して相補的な領域よりも、5’末端側に少なくとも1塩基長いものであり、該コンペティタープライマーの3’末端の位置は、該試料核酸におけるSNPの位置になるように設計されており、
(1)該ヘアピンプライマーにより、該野生型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの3’末端は、変異型核酸における該SNPの位置の塩基に相補的な塩基である、または、
(2)該ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、該コンペティタープライマーの3’末端は、該野生型核酸における該SNPの位置の塩基に相補的な塩基であり、
上記バルジ構造結合分子は、下記式(2)
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