JP2008125425A - 核酸の増幅反応に用いる繰返し配列結合プライマー及びその利用 - Google Patents

核酸の増幅反応に用いる繰返し配列結合プライマー及びその利用 Download PDF

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Abstract

【課題】核酸増幅反応後に、迅速、簡便、安価かつ高感度に核酸増幅を確認する方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合している。さらに、本発明に係る核酸増幅確認方法は、上記繰返し配列結合プライマーを用いて、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行なった後、繰返し配列検出分子を用いて、当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する。また、例えば、アレル特異的ＰＣＲに上記核酸増幅確認を適用することで、迅速、簡便、安価かつ高感度にＳＮＰを検出することができる。
【選択図】図２

Description

本発明は、核酸の増幅反応に用いる繰返し配列結合プライマー、及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、核酸の増幅を容易に確認するために、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡを結合した繰返し配列結合プライマー、及び、これを利用した核酸増幅確認方法、ＳＮＰ検出方法及び当該ＤＮＡ断片を含む試薬キットに関するものである。
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの、特定の核酸を増幅する手法はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている（以下、本明細書において、ＰＣＲ等の、核酸を増幅する反応を「核酸増幅反応」と表記する。）。
一般に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応では、標的とする核酸が特異的に増幅されたか否かを確認する工程が必要である。（なお、本明細書において、ＰＣＲなどの核酸増幅手段による核酸の増幅を、単に「核酸増幅」と表記する。）
核酸増幅を確認する方法としては、例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応に供した後の反応液を、ポリイミドなどのゲルを用いてゲル電気泳動に供した後、ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片を染色することにより行なう方法がある。
また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認する方法、増幅対象の核酸に特異的に結合するプローブを備えたマイクロアレイを用いる方法、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光標識プローブや、目的とするＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムに増幅を確認するリアルタイムＰＣＲ等も、従来、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なう方法として用いられている。
ＰＣＲ等の核酸増幅反応は、例えば、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；以下「ＳＮＰ」と表記する。）の解析にも用いられており、上述のような核酸増幅の確認方法が用いられている。
特許文献１では、解析対象のＳＮＰ部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼと共に作用させ、プライマーに基づく伸長の有無を調べる解析方法が提案されており、増幅した核酸を確認する方法として、電気泳動が用いられている。
また、特許文献２では、ＳＮＰ部位を含む基準配列用及び変異配列用の２種の特異的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、目的配列部分を増幅するＳＮＰ解析方法が提案されており、特許文献１と同様に、得られた反応液を電気泳動に供することで、増幅産物の有無を確認している。
特許文献３では、解析対象のゲノムＤＮＡと複数対のプライマーとを用いて、ＳＮＰ部位を含む核酸を増幅し、タイピングを行なう方法が提案されている。そして、得られた増幅産物に対して、標識化したプローブ等を用いてハイブリダイゼーションすることなどにより、上記タイピングが行われている。
ＳＮＰ解析を迅速かつ簡便に行なうことができれば、例えば、患者のベッドサイド等で最適な治療法、投薬法などを診断するテーラーメード医療が可能となり、有力なＰＯＣ（Point Of Care）技術となるため、そのためにも、さらに迅速かつ簡便に核酸増幅反応後の核酸増幅を確認する方法が望まれている。
国際公開第０１／０４２４９８号パンフレット（平成１３年６月１４日公開） 特開２００３−５２３７２号公報（平成１５年２月２５日公開） 特開２００２−３００８９４号公報（平成１４年１０月１５日公開）
上述したＰＣＲなどの核酸増幅反応において、核酸の増幅が得られたか否かの確認は、煩雑な作業や長時間を要し、高コストであるという問題を有している。
核酸増幅反応に供された後の反応液を電気泳動した後、増幅した核酸断片を染色するという方法は、電気泳動および染色に長時間を要する。また、電気泳動装置、電気泳動に用いるゲル、染色用試薬等が必要であるため、高コストである。
また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認する方法は、極めて大量に核酸増幅産物を得る必要があるため、増幅条件の設定が煩雑であり、微量のサンプルに対して適用できないなどの課題がある。
ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法は、マイクロアレイ上のプローブに蛍光標識等を施す必要があり、また高価なチップを作製する必要がある。
リアルタイムＰＣＲにおいても蛍光標識したプローブ等が必要であり、さらに、リアルタイムＰＣＲを実施するための装置や試薬も高価である。
例えば、上記特許文献１及び２に係る方法においても、電気泳動した後、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を染色することにより、ＰＣＲ増幅の確認を行なう必要がある。このため、上述したように長時間を要するという問題や高コストであるとの問題がある。また、特許文献３においては、プライマーの他に、別途、標的ゲノムにハイブリダイズさせるプローブが必要であり、さらに当該プローブを蛍光標識させるなどの化学修飾が必要であるなど、タイピングのための条件の検討が複雑である。
核酸増幅反応を用いないＳＮＰ解析方法も提案されているが、もともと、ＳＮＰを解析する方法は、莫大な数のサンプル（被検体）のＳＮＰを網羅的に探索する技術の延長として開発が進められてきた。そのため、患者から採取した血液を、ＳＮＰ解析する設備がある検査センターなどの検査施設まで持ち帰ることが必要となる。これでは、長時間を要し、簡易かつ迅速にＳＮＰ解析をすることは不可能であり、ＰＯＣ技術としては全く不十分である。さらに、近年脅威となりつつあるウィルス感染の診断の場合、感染後いかに短時間で診断できるかが、治療による患者の回復に極めて重要となる。このような場合は、採血後すぐに診断することが必要となる。
以上のように、ＰＣＲなどの核酸増幅反応は、その増幅の確認に煩雑な作業や長時間を要する。そのため、迅速、簡便、安価にその増幅の確認を行なうことが可能な方法が望まれている。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、核酸増幅反応における増幅を、迅速、簡便、安価に確認する方法を実現し、ひいては迅速、簡便、安価なＳＮＰ解析方法を提供することにある。
発明者らは、上記課題の解決のため、鋭意検討を行なった。その結果、核酸増幅反応に用いるプライマーとして、ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）からなる繰返し配列結合プライマーを用いて核酸増幅反応を行なえば、繰返し配列結合プライマーは相補鎖の伸長により、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを形成し、その結果、繰返し配列検出分子を用いて反応前後の当該繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡの量を検出、比較することで核酸の増幅を容易に確認することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
つまり、上記繰返し配列結合プライマーに結合している、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡは、核酸増幅反応により好適に伸長され、かつ、当該一本鎖ＤＮＡが、繰返し配列結合分子に結合するという条件が要求される。本発明者らは鋭意検討した結果、その条件を新たに見出した。本発明はこの新たな知見に基づいて成されたものである。
即ち、本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、上記課題を解決するために、ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していることを特徴としている。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーでは、上記繰返し単位は、ＴＧＧであることがより好ましい。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーでは、上記繰返し配列中には、ＴＧＧが５〜１５回繰返されていることがより好ましい。
本発明に係る核酸増幅確認方法は、上記課題を解決するために、核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、上記の本発明に係る繰返し配列結合プライマーを、少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応前の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応前繰返し配列結合プライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応終了後の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応後繰返し配列結合プライマー測定工程とを含むことを特徴としている。
本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記繰返し配列検出分子は、下記式（１）
（（１）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、あるいは炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されている有機基を示し、Ｒは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基あるいは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基であって該アルキレン基骨格を構成する１つ以上の炭素原子が酸素原子若しくはイオウ原子で置換されている有機基を示す。）
で表される化合物であることがより好ましい。
本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記繰返し配列検出分子は、下記式（２）
で表される化合物であることがより好ましい。
本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記繰返し配列結合プライマーの量の測定は、上記繰返し配列検出分子で表面を修飾したＳＰＲ用金属固体基板を備えるＳＰＲ装置を用いることがより好ましい。
本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記核酸増幅反応はＰＣＲであることがより好ましい。
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記課題を解決するために、上記の本発明に係る核酸増幅確認方法を用いることを特徴としている。
本発明に係るＳＮＰ検出方法では、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることがより好ましい。
本発明に係るＳＮＰ検出方法では、上記３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーに繰返し配列結合プライマーを用いることがより好ましい。
本発明に係るＳＮＰ検出方法では、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、上記繰返し配列結合プライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記繰返し配列結合プライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することがより好ましい。
本発明に係る試薬キットでは、核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも本発明に係る繰返し配列結合プライマーを含むことを特徴としている。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、以上のように、ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合している。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーを、核酸増幅反応に供し標的の核酸が増幅されれば、当該繰返し配列結合プライマーが有する繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡを形成する。
そのため、公知の繰返し配列検出分子等を用いて、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡを検出することで、核酸増幅反応前後における、本発明に係る繰返し配列結合プライマーの量を比較することができ、核酸の増幅の確認を行なうことができる。従って、電気泳動や増幅されたＰＣＲ産物の染色による方法に比べて短時間で核酸の増幅を確認でき、また、電気泳動装置や得られたＰＣＲ産物の染色用試薬などが不要となる。
即ち、本発明を用いれば、核酸増幅反応における核酸の増幅を、迅速、簡便、安価かつ高感度に確認することができるという効果を奏する。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。
〔本発明に係る繰返し配列結合プライマー〕
本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）（以下、単に「ＸＧＧ」と表記する）を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していればよい。
後述する繰返し配列検出分子は、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに結合して、これを検出することができる。そして本発明に係る繰返し配列結合プライマーが核酸増幅反応に供されると、当該一本鎖ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成するが、繰返し配列検出分子は当該二本鎖ＤＮＡに結合することができない。
従って、核酸増幅反応の前後で、本発明に係る繰返し配列結合プライマーの量を測定して比較することによって、核酸増幅が得られたか否かを確認することができる。
本明細書において「繰返し配列結合プライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に、特定の塩基配列の繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合したものを意図する。即ち、本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、増幅の標的となる核酸にアニールする領域と、ＸＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡの領域とから構成されている。
本明細書において「繰返し配列」とは、特定の塩基配列が複数存在する塩基配列を意図し、当該特定の塩基配列は、連続して直列していてもよく、散在していてもよい。また、本明細書において「繰返し単位」とは、繰返し配列中に、複数存在する塩基配列のうち、個々の塩基配列を意図する。
つまり、本発明に係る繰返し配列結合プライマーの有する繰返し配列中には、繰り返し単位が、連続して直列していてもよく、散在していてもよいが、連続していることが好ましい。換言すれば、繰返し配列には、繰り返し単位以外の塩基を含んでいてもよいが、当該繰り返し単位以外の塩基を含まないことが好ましい。後述するナフチリジンダイマーは、ＸＧＧからなる繰り返し単位が、連続して繰返す繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに好適に結合する。なお、当該繰り返し単位以外の塩基を含む場合、その数は、当該繰り返し単位以外の塩基の種類及び位置、並びにＸの種類に応じて適宜設定すればよいが、１〜３であることが好ましい。この範囲であれば核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し単位は、ＸＧＧであればよいが、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧが好ましく、ＴＧＧがさらに好ましい。ＡＧＧ、ＴＧＧ又はＧＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡは、当該一本鎖ＤＮＡ内で対合することが無く、そのため核酸増幅反応を阻害することが無い。よって、より高感度に、核酸増幅の確認を行なうことができる。さらに、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片は、後述するナフチリジンカーバメートと好適に結合する。よって、さらに高感度に、核酸増幅の確認を行なうことができる。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し単位の数は、２以上である限り特に限定されるものではないが、５〜１５が好ましく、さらに好ましくは８〜１２である。５以上であれば、後述する繰返し配列検出分子と好適に結合することができ、１５以下であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。
つまり、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し配列中には、ＴＧＧが８〜１２回繰返されていることが最も好ましい。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、標的とする核酸を増幅可能なように、任意に設計した塩基配列の５’末端に、上述の繰返し配列が連結するように設計すればよい。なお、設計した配列に基づく、繰返し配列結合プライマーの合成は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、例えば化学合成により合成すればよい。
また、予め、上述の繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を合成しておき、別途合成した核酸増幅反応に用いるプライマーに、当該一本鎖ＤＮＡ断片を結合してもよい。なお、核酸増幅反応に用いるプライマーに、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合する方法は、従来公知のＤＮＡリガーゼを用いればよい。
本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、様々な核酸増幅反応に好適に用いることができる。上記核酸増幅反応としては、例えば、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ等のＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。中でもＰＣＲに好適に用いることができる。ＰＣＲは核酸増幅反応の中でも簡便に行なうことができるため、ＰＣＲに本発明に係る繰返し配列結合プライマーを用いることで、標的となる核酸の増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便に行なうことができる。
〔本発明に係る核酸増幅確認方法〕
本発明に係る核酸増幅確認方法は、本発明に係る繰返し配列結合プライマーを、少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応前の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応前繰返し配列結合プライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応終了後の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応後繰返し配列結合プライマー測定工程とを含めばよい。
後述する繰返し配列検出分子は、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに結合して、これを検出することができる。そして本発明に係る繰返し配列結合プライマーが核酸増幅反応に供されると、当該一本鎖ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成するが、繰返し配列検出分子は当該二本鎖ＤＮＡに結合することができない。
そのため、繰返し配列検出分子を用いれば、核酸増幅反応前後における、上記反応液中の本発明に係る繰返し配列結合プライマーの量を比較することができる。即ち、当該繰返し配列結合プライマーの量が、当該増幅反応前に比べて当該増幅反応後で減少していれば、核酸の増幅が生じたことが確認でき、減少していなければ、核酸の増幅が生じなかったことが確認できる。
ここで、ＸＧＧを繰り返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに、繰返し配列結合分子が結合する原理について図１に基づいて説明する。
図１は、ＸＧＧを繰り返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに、繰返し配列結合分子が結合する原理を模式的に表す図であり、繰返し配列結合分子として、後述するナフチリジンカーバメートダイマー（以下、「ＮＣ」と表記する。）を用いた場合について示している。
図１（１）に示すように、ＸＧＧからなるＤＮＡを複数有する当該一本鎖ＤＮＡが形成する立体構造中では、ＸＧＧとＸＧＧとが対向することが可能である。より詳細には、一方のＸＧＧのＸに、他方のＸＧＧの３位のＧが近接する。これにより、ＸＧＧとＧＧＸとで、あたかも塩基対を形成するような位置関係で存在する。
そして、図１（２）に示すように、ＮＣは、対向しているＸＧＧ同士を繋ぐようにして結合する。
つまり、ＮＣが備える二つのナフチリジン環のうち、一方のナフチリジン環は、対向しているＸＧＧ同士のうち、一方のＸＧＧの２位のＧと擬似的に塩基対を形成して対合する。さらに当該ＮＣが備える他方のナフチリジン環は、他方のＸＧＧの３位のＧと擬似的に塩基対を形成して対合する。これにより、ＮＣは、二つのＸＧＧのＧ同士を繋ぐように結合する。
一方で、ＸＧＧが、ＹＣＣ（ＹはＸに相補的な塩基）と二本鎖ＤＮＡを形成した場合、ＸＧＧ中のＧは、Ｃと対合して塩基対を形成しており、当該Ｇと擬似塩基を形成することができない。よって、核酸増幅反応に供された本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、繰返し配列検出分子で検出することができない。
ナフチリジンダイマーが、対向するＸＧＧ同士を繋ぐように結合する詳細な原理は、T. Peng, C. Dohno, and K. Nakatani,Mismatch-Binding Ligands Function as a Molecular Glue for DNA, Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5623-5626、及び、T. Peng and K. Nakatani, Binding of Naphthyridine Carbamate Dimer to the (CGG)n Repeat Results in the Disruption of the G-C Base Pairing, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7280-7283に説明されている。
次に、本発明に係る核酸増幅確認方法の一実施形態を、図２に基づいて説明する。
図２は、本実施の形態に係る核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図である。なお、図２では核酸増幅反応としてＰＣＲを用いた場合を示している。
図２（１）において、下側の線分は増幅対象の核酸を含むＤＮＡを示している。即ち、図２（１）は、ＰＣＲ前の、当該核酸を増幅可能なプライマーの５’末端に、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合した、本発明に係る繰返し配列結合プライマー、及び、解析対象の核酸を含む反応液を示している。そして、当該反応液をＰＣＲに供すると、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。なお、図２においてｎは、当該繰返し配列中に、ＴＧＧがｎ回繰返されていることを示している。
次いで、図２（２）に示すように、（１）で合成されたＤＮＡ鎖にリバースプライマーがアニールし、破線方向、つまり（１）と逆方向にＤＮＡ鎖が合成される。
（１）、（２）のようにＰＣＲが進行した結果、図２（３）に示すようにフォワード側のＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列に相補的な、ＡＣＣを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡ鎖が合成され、当該ＤＮＡ断片と、当該ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡ断片とが対合して二本鎖ＤＮＡを形成する。
図２（４）は、（１）のように、ＰＣＲ前の、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡ断片を結合した、本発明に係る繰返し配列結合プライマー、及び、解析対象の核酸を含む反応液を示している。
ここで、当該反応液を、繰返し配列検出分子２で表面修飾したＳＰＲ用金属固体基板１を備える表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」と表記する）装置に供すると、上述のように、繰返し配列検出分子２は、当該繰返し配列結合プライマー中の、近接しているＴＧＧ同士を繋ぐように結合する。そのため、当該ＳＰＲ装置により、ＰＣＲ前の反応液に含まれる繰返し配列結合プライマーを検出することができる。
図２（５）は、ＰＣＲ終了後の反応液を示している。ここで、本発明に係る繰返し配列結合プライマー中のＴＧＧは、二本鎖ＤＮＡを形成している。そのため、当該反応液を、繰返し配列検出分子２で表面修飾したＳＰＲ用金属固体基板１を備えるＳＰＲ装置に供しても、繰返し配列検出分子２は、ＴＧＧ同士を繋ぐように結合することができず、当該二本鎖ＤＮＡに結合することができない。よって、当該ＳＰＲ装置では、核酸増幅反応に供された繰返し配列結合プライマーを検出することができない。
このようにＰＣＲの前後において、本発明に係る繰り返し配列結合プライマーの量を測定し、これが減少すれば、目的の核酸領域が増幅されたことが確認できる。
なお、核酸増幅反応は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、反応条件は、用いる試料やプライマー等に応じて適宜設定すればよい。
また、本発明に係る核酸増幅確認方法に適用可能な試料は、核酸を含むものであれば特に限定されることはない。例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、植物、微生物を挙げることができる。
上記試料に由来する核酸は特に限定されるものではなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡの場合には、逆転写反応によりＤＮＡを合成する工程を含むことが好ましい。
（繰返し配列検出分子）
反応前繰り返し配列結合プライマー測定工程及び反応後繰返し配列結合プライマー測定工程は、繰返し配列検出分子を、本発明に係る繰り返し配列結合プライマーが有する、繰返し配列からなるＤＮＡ断片に結合させて行なう。
本発明に係る核酸増幅確認方法に用いる繰返し配列検出分子は、ＸＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡに結合可能である限り限定されるものではないが、下記式（１）
（（１）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、あるいは炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されている有機基を示し、Ｒは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基あるいは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基であって該アルキレン基骨格を構成する１つ以上の炭素原子が酸素原子若しくはイオウ原子で置換されている有機基を示す。）
で示されるナフチリジンダイマーを用いることが好ましく、ナフチリジンダイマーの中でも下記式（２）
で示されるＮＣがさらに好ましい。ナフチリジンダイマーは、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する、繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片に好適に結合することができる。ＮＣは、特にＣＧＧとＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片に好適に結合することができる。
ナフチリジンダイマーは、従来公知の方法により合成すればよく、例えば特開２００６−１０４１５９号公報に記載の方法により合成すればよい。
なお、ナフチリジンダイマーを用いて、本発明に係る繰返し配列結合プライマーを検出するときのｐＨは、特に限定されるものではないが、好ましくは５〜９である。この範囲であれば、ＤＮＡは安定であるため、ナフチリジンダイマーは、好適に本発明に係る繰返し配列検出分子に結合する。よって、さらに高精度に核酸増幅の確認を行なうことができる。
ナフチリジンダイマーの使用量は、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが有する繰返し単位からなるＤＮＡの個数によって適宜設定すればよいが、例えばＴＧＧを１０回繰返した繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡを有する繰返し配列結合プライマー１モルに対して、１モル以上であることが好ましく、２モル以上であることがさらに好ましい。また、当該使用量の上限は、特に限定されるものではなく、検出条件等に応じて適宜設定すればよい。
（繰返し配列検出分子の使用方法）
本発明に係る核酸増幅確認方法の、反応前繰返し配列結合プライマー測定工程、及び反応後繰返し配列結合プライマー測定工程で、繰返し配列検出分子を用いて繰返し配列結合プライマーの量を測定する方法は、特に限定されるものではない。例えば、アフィニティクロマトグラフィーの担体に固定して用いてもよいが、繰返し配列検出分子によって表面を修飾したＳＰＲ装置用金属固定基板を備えたＳＰＲ装置を用いることが好ましい。この場合、核酸増幅反応の反応液をＳＰＲ装置用金属固定基板表面に流すだけで、本発明に係る繰返し配列結合プライマーの検出が可能となる。即ち、簡便かつ高感度に、核酸増幅を確認することができる。
ＳＰＲ装置用金属固定基板としては、従来公知のＳＰＲ装置に用いられる、ガラスに金属薄膜を貼り付けたチップ等の担体を用いればよい。そして、当該担体の表面上に、化学結合等によって、繰返し配列検出分子を固定すればよい。
ＳＰＲ装置用金属固定基板の表面に、繰返し配列検出分子を結合する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、繰返し配列検出分子を、直接、担体に共有結合させもよく、アルキレン基、ポリエチレンオキシ基等を有するリンカー化合物を介して結合させてもよい。なお、ＳＰＲ装置用の金属固定基板の表面は、繰返し配列検出分子を固定化しやすいように、表面処理してもよい（例えば、カルボキシメチルデキストラン化処理等）。
ＳＰＲ装置としては、従来公知の装置を用いればよい。例えば本発明者らは、ビアコア社製（Ｂｉａｃｏｒｅ２０００）のＳＰＲ装置を用いた。
〔ＳＮＰ検出方法〕
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いればよい。
検出対象のＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて、核酸増幅反応による核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように増幅条件を設定した核酸増幅反応に、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いることで、当該核酸におけるＳＮＰ部位の塩基の種類を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。
つまり、本発明に係るＳＮＰ検出方法で用いるプライマーは、ＳＮＰ検出対象の核酸の、ＳＮＰ部位の塩基に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように設計されれば、限定されるものではないが、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることが好ましい。
プライマーの３’末端に位置する塩基と、核酸増幅反応に供する核酸とで、正常な塩基対を形成するか否かは、核酸増幅反応の進行に大きな影響を与える。よって、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置を、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計することで、ＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なる増幅条件を、容易に見出すことができる。
本発明に係るＳＮＰ検出方法で用いる、３’末端が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されたプライマーの、当該３’末端の塩基の種類は、ＳＮＰ検出の目的や、ＳＮＰ部位における検出対象の塩基に応じて、適宜選択すればよい。
例えば、ＳＮＰ部位の塩基が、特定の塩基か、他の塩基に変異しているかを検出する場合は、当該３’末端の塩基を当該特定の塩基に相補的な塩基とすればよい。これにより、核酸が増幅されれば、当該ＳＮＰ部位の塩基は当該特定の塩基であることが判定でき、核酸が増幅されなければ、当該ＳＮＰ部位の塩基が当該特定の塩基とは異なる塩基に変異していることが判定できる。
また、予め、ＳＮＰ部位の塩基の種類が予測可能な場合は、３’末端の塩基を当該予測される種類に相補的な塩基としたプライマーを、それぞれ用意して、それぞれのプライマーを用いた核酸増幅反応を行なえば、さらに検出結果の信頼性を向上させることができる。つまり、いずれかのプライマーを用いた核酸増幅反応では、核酸が増幅され、他のプライマーを用いた核酸増幅反応では核酸が増幅されないため、よって、さらに確実にＳＮＰ部位の塩基の種類を特定することができる。
以下に、本発明に係るＳＮＰ検出方法の一実施形態を、図３に基づいて説明する。
図３は、本実施の形態に係るＳＮＰ検出方法の原理を模式的に表した図である。なお、図３では核酸増幅反応としてＰＣＲを用いた場合を示している。
図３（１）においてＧ（グアニン）が含まれている直線は、Ｇの位置にＳＮＰを有する解析対象の核酸を示している。即ち、図３（１）は、３’末端に当該Ｇに相補的な塩基であるＣ（シトシン）を備えるプライマーの５’末端に、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡが結合した本発明に係る繰返し配列結合プライマー、及び、解析対象の核酸を含む、ＰＣＲ前の反応液を示している。そして、当該反応液をＰＣＲに供すると、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。なお、図３においてｎは、当該繰返し配列中に、ＴＧＧがｎ回繰返されていることを示している。
次いで、図３（２）に示すように、（１）で合成されたＤＮＡ鎖にリバースプライマーがアニールし、破線方向、つまり（１）と逆方向にＤＮＡ鎖が合成される。なお、ここで用いるリバースプライマーは、ＳＮＰの位置より下流側に設計されていればよい。
（１）、（２）のようにＰＣＲが進行した結果、図３（３）に示すように、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列に相補的な、ＡＣＣを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡ鎖が合成され、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡは二本鎖ＤＮＡを形成する。
図３（４）は、（１）のように、ＰＣＲ前の、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなるＤＮＡ断片を結合した、本発明に係る繰返し配列結合プライマー、及び、解析対象の核酸を含む反応液を示している。
ここで、当該反応液を、繰返し配列検出分子２で表面修飾したＳＰＲ用金属固体基板１を備えるＳＰＲ装置に供すると、上述のように、繰返し配列検出分子２は、当該繰返し配列結合プライマー中の、近接しているＴＧＧ同士を繋ぐように結合する。そのため、ＰＣＲ前の反応液に含まれる繰返し配列結合プライマーを検出することができる。
図３（５）は、ＰＣＲ終了後の反応液を示している。ここで、元の繰返し配列結合プライマー中のＴＧＧは、二本鎖ＤＮＡを形成している。そのため、当該反応液を、繰返し配列検出分子２で表面修飾したＳＰＲ用金属固体基板１を備えるＳＰＲ装置に供しても、繰返し配列検出分子２は、ＴＧＧ同士を繋ぐように結合することができず、当該二本鎖ＤＮＡに結合することができない。よって、当該ＳＰＲ装置では、核酸増幅反応に供された繰返し配列結合プライマーを検出することができない。従って、ＳＰＲ装置により測定される繰返し配列結合プライマーの量は、図３（４）の場合に比べて少なくなる。
これにより、解析対象の核酸が有するＳＮＰの位置の塩基は、Ｇであることが判定できる。
図３（６）は、３’末端にＡ（アデニン）を備え、３’末端に当該Ｇに相補的な塩基であるＣ（シトシン）を備えるプライマーの５’末端に、ＴＧＧを繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡが結合した本発明に係る繰返し配列結合プライマーを、フォワードプライマーとして用いたＰＣＲに、（１）と同じ核酸を解析対象として供した状態を表している。当該Ａは、解析対象の核酸がＳＮＰを有しており、当該ＳＮＰの位置にある塩基がＴ（チミン）である場合に、ＰＣＲが進行するように設計されたものである。
しかし、（６）の場合、ＰＣＲに供した核酸のＳＮＰの位置にある塩基はＴではなくＧである。そのため、ＰＣＲは進行せず、当該ＰＣＲ後の反応液中には、未反応の繰返し配列結合プライマーが多量に残存することとなる。
図３（７）は、（６）に示したＰＣＲが行なわれた後の状態を表している。上述の通り、（６）においてＰＣＲは進行していないため、本発明に係る繰返し配列結合プライマーは、未反応のまま残存している。このため、ＳＰＲ用金属固体基板１上の繰返し配列検出分子２は、当該繰返し配列結合プライマー中のＴＧＧからなる塩基配列を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片と結合し、当該ＳＰＲ用金属固体基板１を備えるＳＰＲ装置によって検出される。従って、（６）に示したＰＣＲの前後において、当該ＳＰＲ装置により検出される繰返し配列結合プライマーの量はほとんど変化しない。
これにより、解析対象の核酸が有するＳＮＰの位置の塩基は、Ｔではないことが判定できる。
このように、例えば、アレル特異的ＰＣＲのように、標的とする核酸がＳＮＰ等の変異を有するか否かにより、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように増幅条件を設定した核酸増幅反応に、本発明に係る繰返し配列結合プライマーを用いることで、当該核酸における変異の有無を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。
（コンペティタープライマー）
本発明に係るＳＮＰ検出方法では、上述した３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーに、本発明に係る繰返し配列結合プライマーを用いればよい。さらに、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、上記繰返し配列結合プライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記繰返し配列結合プライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することが好ましい。
これにより、例えば、野生型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーを用いる場合、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが、優先して変異型核酸にアニールする。よって、当該繰返し配列結合プライマーが、変異型核酸にアニールすることを防ぐことができる。つまり、野生型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーが変異型核酸の増幅に用いられることを防ぐので、変異型核酸の増幅を、野生型核酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従って、ＳＮＰ検出の検出結果の信頼性が向上する。
また、例えば、変異型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーを用いる場合、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが、優先して野生型核酸にアニールする。よって、上述の野生型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーを用いる場合と同様に、野生型核酸の増幅を、変異型核酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従って、ＳＮＰ検出の検出結果の信頼性が向上する。
なお、本明細書において「コンペティタープライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーが、非増幅確認対象核酸にアニールする可能性があるとき、非増幅確認対象核酸に対して、当該プライマーより優先的にアニールするプライマーをいう。
また、本明細書において「野生型核酸」とは、検出対象のＳＮＰの位置に、高い頻度で現れる塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸」とは、検出対象のＳＮＰの位置に、低い頻度で現れる塩基を有する核酸をいう。
本発明に係るＳＮＰ検出方法に用いるコンペティタープライマーの塩基配列の設計は、３’末端の塩基を、野生型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーを用いる場合は、変異型核酸のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基とし、変異型核酸の増幅を目的とした繰返し配列結合プライマーを用いる場合は、野生型核酸のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基とすればよい。
例えば、上述の図３（６）に示した繰返し配列結合プライマーであって、Ａに相補的な塩基であるＴを３’末端に備えた以外は、当該繰返し配列結合プライマー中のＴＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡを除いた部分と同一の塩基配列からなるように設計したプライマーは、図３（６）に示すＰＣＲにおいてコンペティタープライマーとして用いることができる。そして、当該コンペティタープライマーは、当該繰返し配列結合プライマーより優先して、図３（６）に示したＰＣＲに供した核酸にアニールする。よって、図３（６）に示した繰返し配列結合プライマーの一部が、図３（６）において、検出対象ではない塩基であるＡを有する核酸にアニールして、ＰＣＲが進行することを防ぎ、当該ＳＮＰ部位の塩基がＣであるという誤認を防ぐことができる。
なお、リアルタイムＰＣＲでは、増幅を目的としない核酸が増幅されても蛍光が検出されるため、これをＳＮＰ検出に用いても、結果の信頼性に欠ける。そのため、信頼性を向上させるために、別途、ＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブなどを用いる必要があり、作業も煩雑となる。
しかし、コンペティタープライマーを用いた本発明に係るＳＮＰ検出方法によれば、ＳＮＰ部位の塩基が、検出対象ではない塩基に変異した核酸の増幅に、繰返し配列結合プライマーが用いられることを防ぐことができる。よって、確認される核酸増幅の結果の信頼性が向上し、リアルタイムＰＣＲよりも信頼性の高いＳＮＰ検出を、簡便に行なうことができる。
なお、コンペティタープライマーを用いれば、ＳＮＰ検出のみに限らず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応において、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが、増幅確認対象ではない核酸に、アニールすることを防ぐことができる。つまり、増幅確認対象ではない核酸の増幅を、目的の核酸増幅が得られたものと誤認することを防ぐことができる。
この場合、コンペティタープライマーの塩基配列は、増幅確認対象ではない核酸に対して、本発明に係る繰返し配列結合プライマーがアニールする恐れのある領域を含む領域に、アニールするように設計し、かつ、当該コンペティタープライマーが、当該増幅確認対象ではない核酸にアニールする領域における、当該増幅確認対象ではない核酸に対する相同性が、当該繰返し配列結合プライマーより高くなるように、設計すればよい。なお、当該繰返し配列結合プライマーがアニールする恐れのある領域の塩基配列は、既知であることが必要である。
これにより、増幅確認対象ではない核酸の増幅に、本発明に係る繰返し配列結合プライマーが用いられることを防ぐことができる。つまり、誤った核酸増幅反応に起因する、上述したバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度の低下を防ぐことができ、増幅確認の特異性が向上する。
〔本発明に係る試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、少なくとも本発明に係る繰返し配列結合プライマーを含めばよい。
さらに、本発明に係る試薬キットには、既知のＳＮＰ情報に基づき、特定のＳＮＰを検出可能な、本発明に係る繰返し配列結合プライマーを含んでいてもよいし、上述したＮＣ等の繰返し配列検出分子を含んでもよい。また、上述したコンペティタープライマーを含んでもよい。
また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用試薬・器具を含んでもよいし、繰返し配列結合プライマーを安定的に保持するための試薬や緩衝液、繰返し配列検出分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。
上記の何れの構成であっても、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうために好ましい薬剤等が含まれている。そのため、本発明に係る試薬キットを用いることで、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
また、本発明に係る試薬キットの提供形態は、本発明に係る繰返し配列検出分子、繰返し配列検出分子、その他の試薬全てを、適切な容量及び／又は形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係る試薬キットには、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうための手順等を記載した説明書を含んでもよい。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
〔実施例１；ＮＣによるＴＧＧ繰返し配列の検出〕
本実施例では、ＮＣが、ＴＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片に結合することを確認した。
一本鎖ＤＮＡ断片としては、ＴＧＧが、連続して１０回繰返した塩基配列のみからなる一本鎖ＤＮＡ断片を用いた。なお、以下、ＴＧＧが、連続してｎ回繰返した塩基配列のみからなる一本鎖ＤＮＡ断片を「ｄ（ＴＧＧ）ｎ」と表記する。即ち、本実施例では、ｄ（ＴＧＧ）１０を用いた。また、以下の実施例に示す「ｄ（ＴＧＧ）ｎ」は、全てビアコア社製のものを用いており、予めＨＢＳ緩衝液に溶解されている。
まず、ｄ（ＴＧＧ）１０ １０μＭ、塩化ナトリウム １００ｍＭを含むカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、ＮＣを、ｄ（ＴＧＧ）１０の３倍量（３０μＭ）となるように添加した溶液、及び、ｄ（ＴＧＧ）１０の６倍量（６０μＭ）となるように添加した溶液を調製した。
次に、２５℃で、それぞれの溶液のＣＤスペクトルを測定した。その結果を図４に示す。図４において、実線は、ＮＣを添加する前の溶液を、ＣＤスペクトルに供した結果を示し、ＴＧＧ１０−３ＮＣと付した破線は、ｄ（ＴＧＧ）１０の３倍量のＮＣを添加した溶液をＣＤスペクトルに供した結果を示し、ＴＧＧ１０−６ＮＣと付した破線は、ｄ（ＴＧＧ）１０の６倍量のＮＣを添加した溶液をＣＤスペクトルに供した結果を示す。なお、ＣＤスペクトルの測定には、日本分光社製Ｊ−７２５を用いた。
図４に示すように、二つの破線で示すスペクトルは共に、実線で示すスペクトルと比べて大きく変化した。これにより、ＮＣがｄ（ＴＧＧ）１０に結合することが確認された。
〔実施例２；結合したＮＣ及びＴＧＧの繰返し配列からなるＤＮＡ断片の融解温度〕
本実施例では、結合したＮＣ及びＴＧＧの繰返し配列からなるＤＮＡ断片の融解温度を、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を用いて確認した。
まず、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を、それぞれ、５μＭとなるように、塩化ナトリウム １００ｍＭを含むカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。得られた溶液のそれぞれに、ＮＣが１００μＭとなるように添加した。次に、それぞれの溶液を、１分間に１℃の割合で昇温させながら、２６０ｎｍの吸光度を測定した。同様に、ＮＣを添加する前の、それぞれの溶液についても、１分間に１℃の割合で昇温させながら、２６０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果を図５に示す。図５において、縦軸は吸光度を示し、横軸は温度（℃）を示す。また、ＴＧＧ４、ＴＧＧ６、ＴＧＧ１０と付した実線又は破線は、それぞれ、ＮＣを添加する前の、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０の溶液の吸光度を示し、ＴＧＧ４−ＮＣ、ＴＧＧ６−ＮＣ、ＴＧＧ１０−ＮＣと付した破線は、それぞれ、ＮＣを添加したｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０の溶液の吸光度を示す。
図５に示すように、ＮＣを添加した溶液では融解温度が観測された。観測された融解温度は、ＮＣを添加したｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０で、それぞれ、７７．６℃、８５℃、９２℃であった。
〔実施例３；ＳＰＲチップへのＮＣの固定〕
本実施例では、ＮＣにリンカー化合物を結合した上で、ＮＣをＳＰＲチップ（ＳＰＲ用金属固体基板）に固定した。
図６に、ＮＣをリンカー化合物に結合するまでの反応を模式的に示す。
図６に示すように、まず、ＮＣと、Ｂｏｃ基で保護したリンカー化合物及びシアノホウ素化ナトリウムとを反応させた。具体的には、ＮＣ０．０１ｍｍｏｌを含むメタノール溶液を、少量の酢酸を用いてｐＨ７に調整した後、リンカー化合物０．０１３ｍｍｏｌ、シアノホウ素化ナトリウム５ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ）を添加して攪拌した。
次に、当該攪拌後の溶液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離した。当該分離により得た物質を酢酸エチルに溶解後、４Ｍ塩酸の酢酸エチル溶液を添加して攪拌することで、Ｂｏｃ基を外して、ＮＣ−リンカー化合物を得た。
得られたＮＣ−リンカー化合物を、ＳＰＲチップ（ビアコア社製；ＣＭ５）に、アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、固定化した。これによりＮＣ固定化ＳＰＲチップを得た。なお、当該ＳＰＲチップは、予め、表面がカルボキシメチルデキストランで修飾された状態で市販されていた。
〔実施例４；ＮＣ固定化ＳＰＲチップを用いた、ＴＧＧ繰返し配列の検出〕
本実施例では、実施例３で得たＮＣ固定化ＳＰＲチップを用いて、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の検出を行なった。実施例３で得たＮＣ固定化ＳＰＲチップは、ＳＰＲ装置（ビアコア社製；Ｂｉａｃｏｒｅ２０００）に設置して用いた。
まず、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を１００ｎＭ含むＨＢＳ緩衝液、及び、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を１μＭ含むＨＢＳ緩衝液を調製した。
次に、ＳＰＲ装置による測定開始後９０秒後から２１０秒後までの間、調製したそれぞれのＨＢＳ緩衝液を、ＮＣ固定化ＳＰＲチップの表面上に流した。その後、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を含まない新鮮なＨＢＳ緩衝液を、当該ＮＣ固定化ＳＰＲチップ上に流した。この結果を図７及び図８に示す。
図７及び図８において、縦軸はＮＣと結合した物質の量を示し、横軸は測定開始から経過した時間を示す。また、図７及び図８において、ＴＧＧ４と付した破線、ＴＧＧ６と付した破線、ＴＧＧ１０と付した実線は、それぞれ、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を含むＨＢＳ緩衝液を、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。また、図７は１００ｎＭ、図８は１μＭの濃度の、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、ｄ（ＴＧＧ）１０を含むＨＢＳ緩衝液を、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。
図７及び図８に示すように、ｄ（ＴＧＧ）１０を用いた場合に、最も検出感度が良いことが示された。また、図８に示すように、ｄ（ＴＧＧ）１０は、１００ｎＭで検出可能であることが示された。なお、測定開始後２１０秒後から、ＮＣと、ｄ（ＴＧＧ）４、ｄ（ＴＧＧ）６、又はｄ（ＴＧＧ）１０とが解離していく様子が確認された。
〔実施例５；ＰＣＲ前後の、ＮＣによるＴＧＧ繰返し配列の検出〕
本実施例では、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合したプライマーを用いたＰＣＲ前後に、ＮＣを用いて当該ＴＧＧ繰返し配列の検出を行なった。
ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
ＰＣＲ反応液は全量を５０μｌとし、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ１８（GenBank Accession Number L09136）を２ｐｇ、フォワードプライマーを１μＭ、リバースプライマーを２μＭ、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μlを混合し、残部はＨ２Ｏとした。リバースプライマーとしては、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを用いた。フォワードプライマーについては後述する。
ＰＣＲの温度条件は、９５℃で５分間静置した後、９５℃６秒、５５℃１５秒、７５℃３０秒のサイクルを３５回繰り返し、７５度で７分間静置して、その後４℃で保存した。
ＮＣによるＴＧＧ繰返し配列の検出には、実施例３で得たＮＣ固定化ＳＰＲチップを備えたＳＰＲ装置（ビアコア社製；Ｂｉａｃｏｒｅ２０００）を用いた。
ＳＰＲ装置には、ＰＣＲ反応液を、ＨＢＳ緩衝液で４倍に希釈した溶液を供した。具体的には、測定開始後９０秒後から２１０秒後までの間、４倍に希釈したＰＣＲ反応液を、ＮＣ固定化ＳＰＲチップの表面上に滴下した。その後、新鮮なＨＢＳ緩衝液を、当該ＮＣ固定化ＳＰＲチップ上に滴下した。
（ＴＧＧ繰返し配列を含まない塩基配列からなるプライマーを用いた検討）
フォワードプライマーとして、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、当該プライマーを「ＷＴ」と表記する）を用いて、上述の条件にてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ前後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、上述の方法でＳＰＲ装置に供した。その結果を図９に示す。図９において、縦軸はＮＣと結合した物質の量を示し、横軸は測定開始後に経過した時間を示す。また、図９において、Ｔと付した実線は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応液を、Ｔ−ＰＣＲと付した破線は、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。
図９に示すように、ＰＣＲの前後で、ＳＰＲ装置による測定の結果は、ほとんど変化しなかった。
（ＴＧＧ繰返し配列を含む塩基配列からなるプライマーを用いた検討−１）
フォワードプライマーとして、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、当該プライマーを「ＷＴ（ＴＧＧ）１０」と表記する）を用いて、ｐＵＣ１８を混合しなかった以外は、上述の条件にてＰＣＲを行なった。なお、ＷＴ（ＴＧＧ）１０は、ＷＴの５’末端に、ＴＧＧを１０回連続して繰返した塩基配列からなるＤＮＡを連結したものである。
ＰＣＲ前後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、上述の方法でＳＰＲ装置に供した。その結果を図１０に示す。図１０において、縦軸はＮＣと結合した物質の量を示し、横軸は測定開始後に経過した時間を示す。また、図１０において、ＴＧＧ１０−０と付した実線は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応液を、ＴＧＧ１０−０−ＰＣＲと付した破線は、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。
図１０に示すように、ＰＣＲの前後で、ＳＰＲ装置による測定の結果は、ほとんど変化しなかった。
（ＴＧＧ繰返し配列を含む塩基配列からなるプライマーを用いた検討−２）
フォワードプライマーとして、ＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いて、上述の条件にてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ前後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、上述の方法でＳＰＲ装置に供した。その結果を図１１に示す。図１１において、縦軸はＮＣと結合した物質の量を示し、横軸は測定開始から経過した時間を示す。また、図１１において、実線は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応液を、破線は、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。
図１１に示すように、ＰＣＲの前に比べて、ＰＣＲの後の方が、ＮＣと結合した物質の量が少ないことが確認された。これは、ＰＣＲが進行したことにより、当該フォワードプライマー中のＴＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡを形成したことで、ＮＣ固定化ＳＰＲチップ上のＮＣと結合しなかったことを示している。
（ＰＣＲの進行の確認）
８重量％未変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、ＰＣＲの進行を確認した。
電気泳動には、フォワードプライマーとしてＷＴを用い、ＰＣＲ反応液にｐＵＣ１８を混合せずにＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル１）、フォワードプライマーとしてＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いてＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル２）、フォワードプライマーとしてＷＴの５’末端に、ＴＧＧを６回連続して繰返した配列からなるＤＮＡ断片を結合したＤＮＡ（以下、当該プライマーを「ＷＴ（ＴＧＧ）６」と表記する）を用いて、ＰＣＲ反応液にｐＵＣ１８を混合せずにＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル３）、フォワードプライマーとしてＷＴ（ＴＧＧ）６を用いてＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル４）、フォワードプライマーとしてＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いて、ＰＣＲ反応液にｐＵＣ１８を混合せずにＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル５）、フォワードプライマーとしてＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いてＰＣＲを行なった後のＰＣＲ反応液（サンプル６）を、それぞれ供した。なお、ここに示した構成以外のＰＣＲ条件は、上述のＰＣＲ条件と同じ条件でとした。
電気泳動は、トリスほう酸ＥＤＴＡ緩衝液中で行ない、電圧１００Ｖを５分間印加した後、１５０Ｖを３５分間印加した。また、電気泳動後のゲルの染色には、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） ｌを用いた。染色後、デジタルビデオカメラにより撮影した。結果を図１２に示す。図１２において、０を付したレーンはＤＮＡラダー（ladder）を示し、１〜６を付したレーンは、それぞれ、上述のサンプル１〜６に対応している。また、７、８と付したレーンは、共に、ＷＴ（ＴＧＧ）６のみを、電気泳動に供した結果を示す。
図１２に示すように、レーン２、４、６に供したサンプルでは、ＰＣＲが進行していたことが確認された。
〔実施例６；アレル特異的ＰＣＲ〕
本実施例では、本発明に係る核酸増幅確認方法を、アレル特異的ＰＣＲに適用することで、鋳型ＤＮＡ上の一塩基の変異を検出した。
フォワードプライマーとして、配列番号２〜５に示される塩基配列からなるＤＮＡを、それぞれ用いた以外は、実施例５に記載の方法と同様にしてＰＣＲを行ない、ＳＰＲ装置に供した。結果を図１３〜１５に示す。
図１３は配列番号２、図１４は配列番号４、図１５は配列番号３、図１６は配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡを、それぞれフォワードプライマーとして用いたＰＣＲの前後の、ＰＣＲ反応液をＳＰＲ装置に供した結果を示す。なお、図１３〜１６において、縦軸はＮＣと結合した物質の量を示し、横軸は測定開始後に経過した時間を示す。また、図１３〜１６において、実線は、ＰＣＲ前のＰＣＲ反応液を、破線は、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液を、それぞれ、当該ＳＰＲ装置に供した結果を示す。
なお、配列番号４に示される塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列の３’末端の塩基をＣからＡに置換した以外は同じ塩基配列である（以下、当該塩基配列からなるプライマーを「ＭＵ」と表記する）。また、配列番号５に示される塩基配列は、配列番号３に示される塩基配列の３’末端の塩基をＣからＡに置換した以外は同じ塩基配列である（以下、当該塩基配列からなるプライマーを「ＭＵ（ＴＧＧ）１０」と表記する）。
図１３、１４、１６では、ＰＣＲの前後でＳＰＲ装置による測定の結果が、ほとんど変化しなかったことに対し、図１５では、ＰＣＲの前に比べて、ＰＣＲの後の方が、ＮＣと結合した物質の量が少ないことが確認された。この結果から、フォワードプライマーとして、ＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いたＰＣＲの結果と、ＭＵ（ＴＧＧ）１０を用いたＰＣＲの結果とを比較することで、それぞれのプライマーの３’末端に相当する位置の、ｐＵＣ１８上の塩基が、Ｇであることが確認できた。
なお、ＷＴ、ＷＴ（ＴＧＧ）１０、ＭＵ、ＭＵ（ＴＧＧ）１０を、それぞれフォワードプライマーとして用いたＰＣＲを行なった後の、ＰＣＲ反応液を、実施例５に記載の方法と同様にして電気泳動に供した。結果を図１７に示す。図１７において、０を付したレーンはＤＮＡラダー（ladder）を示し、１〜４を付したレーンは、それぞれ、ＷＴ、ＷＴ（ＴＧＧ）１０、ＭＵ、ＭＵ（ＴＧＧ）１０を、それぞれフォワードプライマーとして用いたＰＣＲを行なった後の、ＰＣＲ反応液を、電気泳動に供した結果を示している。
図１７に示したように、フォワードプライマーとしてＷＴ及びＷＴ（ＴＧＧ）１０を用いたＰＣＲでは、ＰＣＲが進行していたことが示された。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明に係る核酸増幅確認方法は、遺伝子解析や遺伝子をモニタリングすることにより行われるバイオアッセイなど、ＰＣＲを用いるあらゆる産業で利用可能である。また、本発明に係るＳＮＰ解析方法は、テーラーメード医療における臨床検査産業や医薬品産業等などに利用可能である。
本発明の一実施の形態の、ＸＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡとＮＣとが結合する原理を模式的に表した図である。 本発明の一実施の形態の核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図である。 本発明の一実施の形態のＳＮＰ解析方法の原理を模式的に表した図である。 実施例において、ＮＣとＴＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片との結合を、ＣＤスペクトルにより測定した結果を示す図である。 実施例において、結合した、ＮＣ及びＴＧＧの繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の融解温度を観測した結果を示す図である。 実施例において、ＮＣ−リンカー化合物を得るまでの、反応を模式的に示す図である。 実施例において、ＮＣ固定化ＳＰＲチップを用いて、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を検出した結果を示す図である。 実施例において、ＮＣ固定化ＳＰＲチップを用いて、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を検出した結果を示す図である。 実施例において、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合していないプライマーを用いたＰＣＲ前後に、ＮＣを用いて当該プライマーの検出を試みた結果を示す図である。 実施例において、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合したプライマーを用いたＰＣＲ前後に、ＮＣを用いて当該プライマーの検出を試みた結果を示す図である。 実施例において、ＴＧＧ繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片を結合したプライマーを用いたＰＣＲ前後に、ＮＣを用いて当該プライマーの検出を試みた結果を示す図である。 実施例において、電気泳動によりＰＣＲの進行を確認した結果を示す図である。 実施例において、本発明に係る核酸増幅確認方法を、アレル特異的ＰＣＲに適用することで、鋳型ＤＮＡ上の一塩基の変異を検出した結果を示す図である。 実施例において、本発明に係る核酸増幅確認方法を、アレル特異的ＰＣＲに適用することで、鋳型ＤＮＡ上の一塩基の変異を検出した結果を示す図である。 実施例において、本発明に係る核酸増幅確認方法を、アレル特異的ＰＣＲに適用することで、鋳型ＤＮＡ上の一塩基の変異を検出した結果を示す図である。 実施例において、本発明に係る核酸増幅確認方法を、アレル特異的ＰＣＲに適用することで、鋳型ＤＮＡ上の一塩基の変異を検出した結果を示す図である。 実施例において、電気泳動によりＰＣＲの進行を確認した結果を示す図である。
符号の説明
１ ＳＰＲ用金属固体基板
２ 繰返し配列検出分子

Claims (13)

  1. ＸＧＧ（ＸはＡ、Ｔ、Ｃ及びＧのうち、いずれか一つの塩基）を繰返し単位とする繰返し配列からなる一本鎖ＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していることを特徴とする繰返し配列結合プライマー。
  2. 上記繰返し単位は、ＴＧＧであることを特徴とする請求項１に記載の繰返し配列結合プライマー。
  3. 上記繰返し配列中には、ＴＧＧが５〜１５回繰返されていることを特徴とする請求項１に記載の繰返し配列結合プライマー。
  4. 核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の繰返し配列結合プライマーを、少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、
    繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応前の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応前繰返し配列結合プライマー測定工程と、
    核酸増幅反応を行なう工程と、
    繰返し配列検出分子を用いて、核酸増幅反応終了後の当該繰返し配列結合プライマーの量を測定する反応後繰返し配列結合プライマー測定工程とを含むことを特徴とする核酸増幅確認方法。
  5. 上記繰返し配列検出分子は、下記式（１）
    （（１）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、あるいは炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子および／または酸素原子で置換されている有機基を示し、Ｒは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基あるいは炭素数１〜５の炭化水素基を置換基として有するまたは有しない炭素数４〜６のアルキレン基であって該アルキレン基骨格を構成する１つ以上の炭素原子が酸素原子若しくはイオウ原子で置換されている有機基を示す。）
    で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅確認方法。
  6. 上記繰返し配列検出分子は、下記式（２）
    で表される化合物であることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅確認方法。
  7. 上記繰返し配列結合プライマーの量の測定は、上記繰返し配列検出分子で表面を修飾したＳＰＲ用金属固体基板を備えるＳＰＲ装置を用いることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅確認方法。
  8. 上記核酸増幅反応はＰＣＲであることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅確認方法。
  9. 請求項４〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅確認方法を用いることを特徴とするＳＮＰ検出方法。
  10. 上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることを特徴とする請求項９に記載のＳＮＰ検出方法。
  11. 上記３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーに繰返し配列結合プライマーを用いることを特徴とする請求項１０に記載のＳＮＰ検出方法。
  12. 上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
    当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、
    上記繰返し配列結合プライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、
    上記繰返し配列結合プライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することを特徴とする請求項１１に記載のＳＮＰ検出方法。
  13. 核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも請求項１〜３のいずれか１項に記載の繰返し配列結合プライマーを含むことを特徴とする試薬キット。
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