JPH06508024A

JPH06508024A - Ｃ型肝炎診断試薬およびワクチン

Info

Publication number: JPH06508024A
Application number: JP4510803A
Authority: JP
Inventors: チョウ，ジョーン・ミュン; リー，ヨン・ボン; パーク，ヨン・ウー; リン，クー・ジン; チョイ，ドク・ヨン; ソ，ホン・ソブ; キム，チュン・ヒュン; キム，スン・タク; ヤン，ジャ・ヨン
Original assignee: ラッキー・リミテッド
Priority date: 1991-06-10
Filing date: 1992-06-08
Publication date: 1994-09-14
Also published as: US6538126B1; AT405053B; EP0521318A2; TW360711B; EP0521318A3; WO1992022655A1; GB2272443A; CN1068335A; ATA901392A; GB2272443B; UA43310C2; CA2111108A1; BR9206131A; GB9324607D0; MX9202783A; AU1902892A; CN1073118C; AU659649B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２７、請求項２２記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項２５記載の宿主細胞。

２８、請求項２４記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項２５記載の宿主細胞。

２９、ＫＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるエピトープを含むポリペプチド。

３０、組換えＫＨＣＶポリペプチドである請求項２９記載のポリペプチド。

３１、請求項１記載のｃＤＮＡによりコードされる請求項２９記載のポリペプチドおよびその断片。

３２、　ＫＨＣＶ　ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである請求項３０記載のポリペプチド。

３３、請求項２５記載の宿主細胞により産生される請求項２９記載のポリペプチド。

３４、ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白、ＫＨＣＶ　８９７蛋白、ＵＢ　Ｅｌ蛋白、ＫＨＣＶ　４０３蛋白、ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶ　５７３蛋白、ＫＨＣＶ　ＵＢ　Ｃ０ＲＥ１７蛋白、Ｅ２Ｎ蛋白、Ｅ２Ｃ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白、ＫＨＣＶ　４２６蛋白、ＫＨＣＶ　５５５蛋白、ＫＨＣＶ　５１３蛋白、ＫＨＣＶ　８１０蛋白、ＫＨＣＶ　７９８蛋白、ＫＨＣＶ　２７１蛋白、ＫＨＣＶ　７５４蛋白、ＫＨＣＶ　６５２蛋白、ＫＨＣＶ　４０３蛋白、ＫＨＣＶ　４９５蛋白またはＫＨＣＶ４９４蛋白である請求項３３記載のポリペプチド。

３５、精製されたＫＨＣＶポリペプチド。

３６、ＫＨＣＶ　４０３蛋白、ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白、ＫＨＣＶ　ＵＢ　Ｃ０ＲＥ１７蛋白、ＵＢ−Ｅｌ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白またはＫＨＣＶ　８９７蛋白である請求項３５記載のポリペプチド。

３７、請求項２５記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養することを特徴とする請求項２９記載のポリペプチドの産生方法。

３８、請求項２９記載のポリペプチドを有効成分として含む、試料中のＫＨＣＶ抗原に対する抗体の存在の検出用診断試薬。

３９、請求項２９ないし３６のいずれか二つ以上のポリペプチドを含む請求１ｒＪｉ３８記載の診断試薬。

４０、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶ　８９７蛋白およびＫＨＣＶ４０３蛋白よりなる群から選択される一つ以上のポリペプチドを含む請求項３８記載の診断試薬。

４１、請求項３８記載の診断試薬を含む診断キット。

４２、試料中のＫＨＣＶ抗原に対する抗体を検出する診断方法において、以下の工程：（ａ）ＫＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるポリペプチドを、固体支持体に吸着させ、（ｂ）該固体支持体に試料を加えて抗原−抗体複合体を形成させ、そして（ｃ）複合体の量を測定することを含むことを特徴とする方法。

４３、請求項４１記載のキットを各段階に用いる請求項４２記載の診断方法。

４４、前記キットが、請求項４０記載の診断試薬を含む請求項４３記載の診断方法。

４５、ＫＨＣＶエピトープに対する単クローン抗体。

４６、ＩｇＧサブクラスに属する請求項４５記載の抗体。

４７、ＫＨＣＶ　８９７蛋白に対する請求項４５記載の抗体。

４８、下記アミノ酸配列：Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＭｅｔＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ＾ｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｉｍ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＧｉｎＴｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇ１．ｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＶａｌＬｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ＾ｌａ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＡｌａＨ４ｓ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ＾ｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＶａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａと免疫反応性である請求項４７記載の抗体。

４９、下記アミノ酸配列：Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｌ１ｅＰｒｏ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＨｉｓＬｅｕ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ＾ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕと免疫反応性である請求項４７記載の抗体。

５０、ＫＨＣＶエピトープに対する抗体を産生ずる細胞株。

５１、ラッキー１．　１またはラッキー１．２である請求項５０記載の細胞株。

５２、請求項４５記載の抗体を有効成分として含む、ＫＨＣＶエピトープを検出するための診断試薬。

５３、請求項５２記載の診断試薬を用いる試料中のＫＨＣＶエピトープの検出方法。

５４、不活化させた精製ＫＨＣＶを含むＫＨＣＶ感染の予防または治療用ワクチン。

５５、請求項３７記載の方法で製造したポリペプチドを有効成分として含有する、Ｋ　ＨＣＶ感染の予防または治療用ワクチン。

５６、Ｅ１蛋白、Ｅ２Ｎ蛋白および／またはＥ２Ｃ蛋白を有効成分として含有する、請求項５５記載のワクチン。

５７、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来の８個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む試料中のＫ　ＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの検出用キット。

５８、請求項５７記載のキットを用いる試料中のＫＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの検出方法。

明細書Ｃ型肝炎診断試薬およびワクチン発明の分野本発明は、新規なタイプのＣ型肝炎ウィルス（ＫＨＣＶ）のｅＤＮＡ由来のポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチドおよび該ポリペプチドに対する抗体；およびこれらの試薬、即ち、前記ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体のいずれかを活性成分として用いる診断試薬およびワクチンに関する。

発明の背景一般に、ウィルス性肝炎は、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、デルタ肝炎ウィルス、Ｅ型肝炎ウィルス、サイトメガロウィルスおよびエプスタイン・バーウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）を含む多様な肝炎ウィルスににって発病すると知られており、１９８０年以降、これらのウィルスの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が糾明されることによって、診断試薬、ワクチンおよび治療剤の開発が容易になった。

また、非Ａ非Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎と称される新しいタイプの肝炎が輸血による肝炎の８０ないし９０％を占め（Ｌａｎｃｅｔ　２，８３８−８４１（１９７５）参照）、かかる輸血性肝炎のうち、約５０％までもが肝硬変症および肝癌へと進行する。

轡者の血液に内在するＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の数は一般に極めて少なく、ＨＣＶ−関連抗原および抗体系の同一性または特異性についてはよく知られていない。したがって、治療剤または診断試薬の開発において多（の困難があった。

したがって、ＨＣＶに関する研究は、多くの研究員らの関心を集めた。

（Ａｌｔｅｒ、Ｈ，、Ｊ、ｅｔ　ａ土、、Ｌａｎｃｅｔ、４５９−４６３（１９７８）；Ｔａｂｏｒ、Ｅ、ｅｔ　ａ上、、Ｌａｎｃｅｔ、４６３−４６６　（１９７８）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ、Ｆ、Ｂ、ｅｔ　ａ上、。

Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙユ、　６０−６８　（１９７８）　；Ｗｙｋｅ。

Ｒ，Ｊ、ｅｔａ土、、Ｌａｎｃｅｔ、５２０−５２４　（１９７９）：Ｂｒａｄｌｅ３’、　Ｄ、　Ｗ、旦旦、　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉ　ｒｏ　１．旦。

２５３−２６９　（１９７９）参照）。

ブラッドレイら［Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｄ、Ｗ、ｅｔ　旦、。

Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　旦旦、７７３−７７９　（１９８５））は、Ｃ型肝炎患者の血清をチンパンジーに感染させてその血清を大量確保し、その血清からＨＣＶを抽出して、それを用いてＨＣＶを分析および研究することによって、ＨＣＶの生化学的および生物理学的特性を明らかにした。

その後、ブラッドレイの方法によって単離されたＨＣＶウィルスを用いて、Ｃ型肝炎の診断、予防および／または治療のための薬剤の開発に関する研究が行なわれた。

チｘ−（Ｃｈｏｏ、Ｑ、Ｌ、）らは、Ｃ型肝炎患者の血清に感染させたチンパンジーの血清から抽出されたＨＣＶの部分ｃＤＮＡ断片をクローン化し７ており、該ｃＤＮＡ断片を大腸菌および酵母で発現させて産生された蛋白がＣ型肝炎患者の血清から得られた抗体と免疫学的に反応することを立証した［５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．３５９−３６２　（１９８９）参照］、。

クーオ（Ｋｕｏ）らは、米国カイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏ、）が同定した部分ＨＣＶｅＤＮＡ断片をスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子と融合して酵母で発現させることによって調製したＣ１００−３蛋白が、Ｃ型肝炎患者の血清、および輸血性肝炎（ＰＴＨ）患者の血清の７０％以上と免疫学的に反応することを明らかにした［Ｋｕｏ、Ｇ、、ｅｔ　ａ上、５ｃｉｅｎｃｅ２４４．３６２−３６４　（１９８９）参照〕。

また、ヒユートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）らは、Ｃ型肝炎チンパンジーから単離されたＨＣＶ　（以下、“米国型ＨＣＶ”と称する）ゲノム配列にコードされたＨＣＶ抗原、特にＣ１００−３が、抗ＨＣＶ抗体を検出し得る診断試薬およびワクチンの製造に有用であると記述しており（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　Ｍ、旦１且土、、ＰＣＴ　Ｗｏ　８９１０４６６９．Ｗｏ　９０／１１０８９参照）；前記抗原、例えばＣ１００−３を用いた酵素免疫測定法を用いる診断法を確立した。

１９９０年、前記発明に基づいて、米国オルソダイアグノスチツクシステムズ社（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）は、抗ＨＣＶ抗体を検出するための診断試薬を開発して販売した。しかし、前記診断試薬の活性成分として用いたＣ１００−３抗原は、慢性Ｃ型肝炎患者の抗体とは反応するが、急性Ｃ型肝炎患者、特にその初期段階の患者の抗体とは反応せず；また、度々、融合されている蛋白であるＳＯＤの反応による偽陽性の結果を示す［Ｓｈ ’ｉｍｉ　ｚｕ、　Ｙ、　Ｋ、　、旦ａ１．　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　旦ヱ、６４４１　（１９９０）］。

一方、日本人Ｃ型肝炎患者の血清から得られたＨＣＶから、ヒユートンらと同一の方法を用いて、５°−末端領域、およびコア蛋白および外膜（エンベロープ）蛋白をコードする構造遺伝子を含む部分ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローンが調製された；ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列が決定されて、この配列が米国型ＨＣＶのヌクレオチド配列と約１０〜１５％差があることが明らかになり、新型、いわゆる日本型ＨＣＶの存在が立証された［Ｋｕｂｏ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、上ヱ、１０３６７−１０３７２　（１９８９）；Ｋａｔｏ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ、　Ａｃａｄ、且。

２１９−２２３　（１９９０）；Ｋａｎｅｋｏ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｌａｎｃｅｔ　３旦旦、９７６　（１９９０）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ、に、ｅｔ且上、、Ｇｅｎｅ　９１，２８７−２９１　（１９９０）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ。

Ｋ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１旦、４６２６（１９９０）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａ、Ａ、旦　見上、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

旦旦、１１０５−１１１３　（１９９１）参照】　；才力モト（Ｏｋａｍｏｔｏ）らは日本型ＨＣＶに対するワクチンおよび診断試薬の製造のための日本型ＨＣＶ由来の抗原の特異性を記述した［Ｏｋａｍｏｔｏ、Ｈ，、旦１　且１．。

Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、旦０．１６７−１７７　（１９９０）参照Ｊ。

また、ハラダ（Ｈａ　ｒ　ａ　ｄ　ａ）らは、構造遺伝子の５°−末端部分にコードされたコア蛋白を、推定患者から得られた試料に存在する可能性のある抗ＨＣＶ抗体の診断に用いる際、Ｃ１００−３を用いる場合より感染時から６〜８週間早（抗体を検出し得ると報告した［Ｈａｒａｄａ、ｓ、、ｅｔ　旦１．Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、旦旦、３０１５　（１９９１）参照〕。

レスニエブスキ（Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ）らも、Ｃ１００−３抗原のみを用いた方法に比べてさらに特異的であり、かつ高感度の複数の抗原を用いる改善された診断方法を記述しており［ＥＰ公報第７２５３５４号（１９９０）参照】。

ワン（Ｗａｎｇ）は、異なる１０種のＨＣＶエピトープから選択されたエピトープを有する１５〜６５個のアミノ酸から成るポリペプチドを抗ＨＣＶ抗体検出用抗原として用いる診断方法を記述している［ＥＰ公報第４４２３９４号（１９９１）参照】。

前記の開示から、一つの抗原だけを用いるがわりに、異なるエピトープを有するポリペプチド混合物を用いることによってＨＣＶの診断を改善させ得ることが示される。

また、ウィルスの表面に糖蛋白の形態で存在する外膜蛋白が、おそらくワクチンと診断試薬の開発に有用な手段として浮上してきた。ＨＣＶと非常に類似なフラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）の場合には、外膜蛋白と非構造蛋白（ＮＳＩ）が宿主細胞の免疫機作の誘導および宿主細胞の受容体への結合に重要な役割をもっと知られている［Ｆ、Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｒｔ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

旦旦、４７４９−４７５８　（１９９１）参照］。また、外膜蛋白に対する抗体の形成は、Ｃ型肝炎からの回復と深い関連があると報告された［Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、ｐ５９；Ｗａｔａｎａｂｅ　ｅｔ且工、、ｐ８２．第３回国際ＨＣＶシンポジウム、Ｓｔｒａｂｏｕｒｇ。

Ｆｒａｎｃｅ　（１９９１）参照Ｊ。

また、ヒユートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）らは、外膜２　（Ｅ２）蛋白のアミン末端領域が、著しい種による異種性（Ｓｐｅｃｉｅｓｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示すので、Ｅ２蛋白は免疫機作との関連性が深いと推定されるため、前記Ｅ２蛋白がＣ型肝炎ワクチンの製造に重要な抗原であることができるという可能性を提示している（第３回国際ＨＣＶシンポジウム、ｐ２０．Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ、１９９１）；また、日本型ＨＣＶゲノムと米国型ＨＣＶゲノム間のヌクレオチド翫ツリの比較がら、コア蛋白をコードするヌクレオチド１ＢＩＪの場合、約９１％の相同性を示すが、外膜蛋白をコードするヌクレオチド配列の場合には、約７４％の相同性を示すことが明らかになった［Ｔａｋｅｕｃｈｉ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ、ヱ１゜３０２７−３０３３　（１９９０）参照〕。

発明の概要前記した通りに、異なる地域（国）で発見されたＨＣＶは、多様な領域で異種性を示し得；かかる異種性はワクチンの有効性および診断試薬の感度および正確度に決定的な要因になり得る。

したがって、本発明は、韓国人Ｃ型肝炎患者から単離され、米国型および日本型を含む既に発見されたＨＣＶとは異なる新しいタイプのＨＣＶ　（ＫＨＣＶ）の単離および特性付けに関するものである。

より詳しくは、本発明は、前記ＫＨＣＶの全て配列決定されたｃＤＮＡおよびいくつかのＨＣＶ変種の部分的に配列決定されたｃＤＮＡを提供する。ＫＨＣＶに由来するｃＤＮＡ配列の部分は、試料中のウィルスの存在を診断するためのプローブまたはプライマーとして有用であり；かかるヌクレオチド配列を用いる診断キットおよび方法も本発明のさらに別の態様を構成する。

また、本発明は、診断試験における試薬として、および／またはワクチンの成分として有用な前記ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドを提供する。

前記ポリペプチドは、非ＨＣＶ蛋白と融合されたポリペプチドのような組換えポリペプチドを初めとして、ＫＨＣＶエピトープを含む多様なポリペプチド、およびその精製された形態を含む。

本発明の他の態様は、目的の宿主との適合性がある調節配列に作動可能に連結されたＫＨＣＶ　ｃＤＮＡのオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む組換え発現ベクターであって、ＫＨＣＶ由来のポリペプチドと他のタイプの蛋白またはポリペプチドとの融合ポリペプチドを製造するために、非ＫＨＣＶ蛋白をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい組換え発現ベクター；該組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞；およびそれから産生されたポリペプチドに関する。

本発明のまた別の態様は、ＫＨＣＶエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養することを特徴とするＫＨＣＶエピトープ含有ポリペプチドの産生方法、およびその方法で産生されたＫＨＣＶエピトープ含有ポリペプチドである。

本発明のまた別の態様は、ＫＨＣＶエピトープに対する単クローン抗体を含む。

本発明のまた別の態様は、前記単クローン抗体を産生ずるバイプリドーマ細胞に関するものである。

本発明のさらに別の態様は、試料中の抗−ＫＨＣＶ抗体を検出するための活性成分として、一つ以上のＫＨＣＶエピトープを含む一つ以上のポリペプチドを含有する診断試薬、およびそのような試薬を含む診断キットである。

本発明のまた別の態様は、試料中のＨＣＶ抗原を検出するための活性成分として、検出しようとするＫＨＣＶ抗原に対する一つ以上の単クローン抗体を含む診断試薬、およびそのような試薬を含む診断キットである。

本発明のまた別の態様は、ＫＨＣＶエピトープ含有ポリペプチドおよび不活化または弱毒化されたＨＣＶを含む、ＨＣＶ感染の治療および／または予防用ワク添付図面を参照すれば、本発明をより容易に理解できる。添付図面において、図１は、多様ｆｌ　Ｋ　ＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａりｏ　−：ｚのＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ上における相対位置を示し、図２−１ないし図２−１６は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩのヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図３は、ＫＨＣＶ− ＬＢＣＩにおける各ｃＤＮＡクローンの始めのヌクレオチド番号および終りのヌクレオチド番号を示し、図４は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ、および米国型ＨＣＶゲノムおよび日本型ＨＣＶゲノムのヌクレオチド配列の比較分析を示し、図５は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ、米国型ＨＣＶおよび日本型ＨＣＶにコードされるアミノ酸配列の比較分析を示し、図６は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ、および米国型ＨＣＶゲノムおよび日本型ＨＣＶゲノムの５′−末端領域のヌクレオチド配列の比較分析を示し、図７は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図８は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図９は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２０のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１０は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２１のヌクレオチドＩ’１１およびそれによリコードされるポリペプチドのアミノａＳりを示し、図１１は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２３のヌクレオチド！Ｅ３ｔ１１およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１２は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２５のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１３は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２６のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１４は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２７のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１５は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２８のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１６は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２９のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１７は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ３０のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１８は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ３１のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図１９は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ３２のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２０は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５５−ＬＢＣ２０のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２１は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５５−ＬＢＣ２１のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２２は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５５−ＬＢＣ２３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２３は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５５−ＬＢＣ２５のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２４は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２７のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２５は、ｃＤＮＡ断片Ｎ５２−ＬＢＣ２８のヌクレオチド配列およびそれによリコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図２６は、サブタイプＫＨＣＶ−ＬｌまたはＫＨＣＶ−Ｌ２に属するＫＨＣＶ変種のｃＤＮＡのＮＳ２領域にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を比較分析したものであり、図２７は、サブタイプＫＨＣＶ−Ｌｌに属するに、　ＨＣＶ変種のｃＤＮＡのＮＳ２領域のヌクレオチド配列を比較分析したものであり、図２８は、サブタイプＫＨＣＶ−Ｌ２に属するＫＨＣＶ変種のｃＤＮＡのＮＳ２領域のヌクレオチド配列を比較分析したものであり、図２９は、各々サブタイプＫＨＣＶ−ＬｌおよびＫＨＣＶ−Ｌ２に属するＫＨＣＶ変種ｃＤＮＡのＮＳ５領域のヌクレオチド配列を比較分析したものであり。

図３０は、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの断片を酵母細胞内で発現させるために構築した発現ベクターを示し、図３１Ａは、酵母細胞でＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を発現させた後の、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示し、図３１Ｂは図３１−Ａのゲルを用いたウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｆｎｇ）分析の結果を示し、図３２は酵母細胞内でのＫＨＣＶ　Ｅ２ＮおよびＥ２Ｃポリペプチドの産生を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図３１Ａ）およびウェスタンブロッティング分析の結果（図３１Ｂ）を示し、図３３は化学的に合成したユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を示し、図３４はＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を大腸菌細胞内で発現するためのｔｒｐプロモーターを含む発現ベクターを示し、図３５はＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を大腸菌細胞内で発現するためのｔａｃプロモーターを含む発現ベクターを示し、図３６ないし図３８は大腸菌細胞内でのＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の発現後のＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅの結果を示し、図３９ないし図４１は前記図３６ないし図３８のゲルを用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示し、図４２はｔａｃプロモーターの調節下でＭＢＰ遺伝子と融合させたＫＨＣＶｃＤＮＡ断片を大腸菌内で発現させた後の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、図４３は図４２のゲルを用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示し、図４４は試料中の抗ＨＣＶ抗体の検出に用いたＫＨＣＶ抗原の濃度による酵素免疫測定（ＥＩＡ）の標準曲線を示し。

図４５は試料中に存在するＫＨＣＶ抗原の濃度関数として、単クローン抗体を用いたＥＩＡの標準曲線を示す。

発明の詳細な説明本明細書に言及された全ての文献は、参照により本明細書に包含されるものである。

本明細書中で用いられる下記用語は、次のような意味を有する。

用語“Ｃ型肝炎ウィルス”は、非Ａ非Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の原因となるウィルスをいう。用語ＨＣＶおよびＮＡＮＢＶ、ならびにＮＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）およびＣ型肝炎は、各々互換的に用いられる。

用語“韓国型Ｃ型肝炎ウィルス”または“ＫＨＣＶ”は、韓国人Ｃ型肝炎患者から単離された新型ＨＣＶをいい、そのｃＤＮＡは８４２番目、８４９番目および８５３番目のアミノ酸が各々フェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニンであるか、各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンであるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のオーブンリーディングフレームを有する。

用語“エピトープは免疫学的能力のある宿主で免疫反応を起し得る、および／またはそれ自体が相補的な抗体に特異的に結合し得るポリペプチドの抗原決定基をいう。本発明の抗原決定基は、一般に少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは７または８個のアミノ酸から成っている。

用語゛断片”は、本発明のｃＤＮＡまたは蛋白のうちの一つの、下位配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。

前記断片は、ＤＮＡには制限エンドヌクレアーゼを、蛋白にはプロテアーゼを用いて、より大きい分子の酵素的切断により産生させ得る。しかし、本発明の断片は、いかなる特定形態の酵素的切断による産物にも限られず、末端がいかなる酵素的切断点にも相当しない下位配列を含むこともできる。前記断片は、例えば、本明細書で提供された配列データを用いて化学的合成により製造し得る。

蛋白断片もまた、これをコードするＤＮＡ断片を発現させることによって産生させ得る。前記蛋白断片は、これが免疫反応性および／または抗原性決定基の構成に十分な数のアミノ酸残基を含んでいる場合、本発明に有用である。

用語“オーブンリーディングフレーム”は、連続的なヌクレオチドトリブレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）がポリペプチドをコードするアミノ酸を指定するコドンとして読まれる、ポリヌクレオチド配列の一領域をいう。

用語“発現ベクター”は、ポリヌクレオチド挿入物（インサート）の発現を促進するように設計されたクローン化媒体をいう。

用語“調節配列”は、例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位およびターミネータ−を含む、ポリヌクレオチド配列の発現調節に関連するＤＮＡ配列を意味する。

用語“組換λＫＨＣＶポリペプチド”は、図２−１ないし２−１６および図７ないし図２５のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡにコードされた、少な（とも６個のアミノ酸配列を含み、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドにおいて連らなっているアミノ酸以外のアミノ酸に連らなったポリペプチドをいう。

用語“精製ＫＨＣＶポリペプチド”は、実質的に純粋で均質であり、天然に伴う細胞成分から分離されたＫＨＣＶポリペプチドまたはその断片をいう。一般に、精製Ｋ　ＨＣＶポリペプチドは、約７０ないし９０％以上のポリペプチド、好ましくは９５％以上のポリペプチドを含む。

本明細書中で用いられるその他の用語は、当該分野で通常に用いられる従来の意味を有する。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡのクローン化ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーを下記のように作製する：韓国人Ｃ型肝炎患者の血清から、ＨＣＶ粒子を超遠心分離機で沈降分離し、該ＨＣＶ粒子からＨＣＶ　ＲＮＡを抽出し；ランダムプライマーまたはオリゴｄ（Ｔ）プライマー、および逆転写酵素を用いて、該ＨＣＶ　ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成し；ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応により増幅した後、または直接、Ｅｃｏ　ＲＩアダプターを付着させてＵＮＩ−ＺＡＰＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、１１０９９　Ｎ、Ｔｏｒｒｅｙ、ＰｉｎｅｓＲｏａｄ、、　（ＣＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ）にクローン化し、該ベクターをウィルス粒子にパッケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する［５ａｉｋｉ、Ｐ。

Ｋ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．１３５０　（１９８５）参照〕。

一般に、肝炎ウィルス粒子は、肝炎患者または感染されたチンパンジーの血清または肝臓から分離し得る。本発明では、Ｃ型肝炎患者の血清から）（ＣＶ粉粒子分離し；超遠心分離機により沈降させたＨＣＶ粒子からＨＣＶの全ＲＮＡを抽出し、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。

その後、前記ＨＣＶ全ＲＮＡを、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｃａｔ。

Ｎｏ、２００４００．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、１１０９９　Ｎ。

Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｄ、、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　９２０３７゜ｔＪ、　Ｓ、　Ａ口を用いた反応において、ｃＤＮＡの作製用鋳型として用いる。

前記ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ、およびランダムプライマーＲＡＮＰＳＨＣＶまたはオリゴｄ　（Ｔ）プライマーを用いて逆転写酵素の反応により合成され、ここで、ブライｖ−ＲＡＮＰＳＨＣＶ　（５’　−ＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮ−３°、ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣを意味する）およびオリゴｄ　（Ｔ）プライマー（５°− ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧ　（Ｔ）＋。−３゛）は、各々の３°末端領域に６個の無作為のヌクレオチド（プライマーＲＡＮＰＳＨＣＶ）または１８個のＴ（オリゴｄ　（Ｔ）プライマー）と、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　Ｉ認識部位とを含む。

容易なりローン化のために、合成されたｃＤＮＡにＥｃｏ　ＲＩ認識部位（５° −ＧＡＡＴＴＣ−３’　）を導入するために、Ｅｃｏ　ＲＩアダプター（５°− ＣＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−３°）、（３’　−ＧＧＧＧＧＧＣＴＴＡＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣ−５°）を合成ｃＤＮＡ断片に連結する。

次いで、プライマーＰＳＨＣＶ　（５°−ＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ−３”）とＥｃｏ　ＲＩプライマー（Ｅｃｏ　ＲＩアダプターの上側の鎖）を用いるＰＣＲによりｃＤＮＡ断片を大量増幅し：該ｃＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　ＲＩとＸｈｏ　Ｉで部分消化し；消化されたｃＤＮＡを、Ｅｃｏ　ＲＩおよびＸｈｏ　Ｉで消化したＵＮＩ−ＺＡＰＸＲベクター（λ　ｇｔｌｌの変種）と連結し：生成したＤＮＡを、インビトロ（試験管内実験）でギガパック■ゴールドパッケージングキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｉ　ＩＧｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ、Ｃａｔ、Ｎｏ、２００２１４゜Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いてλファージの粒子内にパッケージングした後、大腸菌細胞に粒子を感染させて増幅することによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。

ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌細胞上にまいてファージプラークを形成させた？＆、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡから由来するポリペプチドの産生が可能であると考えられる、Ｃ型肝炎患者の血清中の抗体と反応性であるファージクローンを選択するため、前記プラークをフィン（Ｈｕｙｎｈ）により記述された免疫学的な方法によりスクリーニングする［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌ、１、ｐｐ４９−７８、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ｔＪＫ（１９８５）参照］。

一方、ＵＮＩ−ＺＡＰＸＲベクターは、大腸菌細胞内で切除されてＫＨＣＶｃＤＮＡ断片を含むファージミツド、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）を産生ずることができ［５ｈｏｒｔ、ｅｔａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１旦、７５８３−７６００　（１９８８）参照］、これは通常のプラスミドとして扱い易い。また、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）はｆ１複製開始点（ｏ　ｒ　ｉ　ｇ　ｉ　ｎ）およびＣｏ１Ｅ１複製開始点を有するので、場合により一本鎖または二本鎖の形態で得られる。

陽性プラークで感染された大腸菌から単離された二本鎖ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｈｏ　Ｉで消化して、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ認識部位の間に挿入されたＫＨＣＶｃＤＮＡ断片の存在および長さを電気泳動によって確認し；サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、ヱ丘、５４６３　（１９７７）参照】によってｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定する。

その後、クローンｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列に基づいて新たなオリゴヌクレオチドプローブを合成して、全ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの残りの領域を得るために、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、次に、このようにして得た新たなｃＤＮＡクローンを、再びスクリーニングにおいて使用してさらに他のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡクローンを得る。また、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの予め決定されたヌクレオチド配列に基づいて合成されたプライマーを利用して、ＫＨＣＶｃＤＮＡの一部をＰＣＨによって得られる。

重なり合っているｃＤＮＡ断片を連結してＫ）（ＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの全配列を決定することができ；これから一つのオープンリーディングフレームが推定される。

このようにして得た全ｃＤＮＡ配列を有するＫＨＣＶ　ｃＤＮＡをＫＨＣＶ−ＬＢＣｌと命名し、これを、特許出願のための微生物寄託に関するブダペスト条約下の国際寄託機関ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ　ｌ　１ｅｃｔｉｏｎ３に、寄託番号ＡＴＣＣ７５００８号として１９９１年５月１４日付で寄託した。

ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの全ヌクレオチド配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は図２−１ないし図２−１１に示されており；各ｃＤＮＡクローンのＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ配列上の位置は図１ないし図３に示す、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩは５ ′−末端から数えて３４３番目のヌクレオチド（Ａ）から９３７２番目のヌクレオチド（Ｇ）まで、９０３０個のヌクレオチドから成っている一つの長いオーブンリーディングフレームを有する。アミノ酸の識別番号は、前記９０３０個のヌクレオチドに５′−末端から３′−末端の方向ヘコードされたポリペプチド内のアミノ酸の位置によって指定される。

本発明によって製造されたＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの５′−末端領域には、日本型Ｃ型肝炎ウィルスより１３個のヌクレオチドがさらに多く存在することが明らかになった［Ｋ　ａ　ｔ　ｏ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、旦ヱ、９５２２４　（１９９０）参照〕。図６に示したように、米国型Ｃ型肝炎ウィルスと比べると、１個のヌクレオチドがさらに発見され、５′−末端領域のヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を成す２２個のヌクレオチドのうち、３個が異なることが明らかになった。５゛−末端領域は一般にウィルスの遺伝子発現およびその調節に重要な役割をもち；２２個のヌクレオチドから成るヘアピン構造はレプリカーゼおよびコア蛋白の認識部位として考えられ、したがって、前記領域における構造上の僅かな差までも、その役割または特異性において、重要で、具体的な変化を伴うことができる。

同様に、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの全ヌクレオチド配列およびそれにコードされたアミノ酸配列を米国型ＨＣＶおよび日本型ＨＣＶのものと比較した。その結果、米国型の場合には、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌのヌクレオチド配列は約７８．３％のレベルまで相同で、それにコードされたアミノ酸配列は約８４．２％の相同性を示し：日本型の場合、ヌクレオチド配列は９０．９％の相同性を有し、アミノ酸配列は９３％の相同性を示した（図４ないし図６参照）。前記結果から、ＫＨＣＶ− ＬＢＣＬが既に識別されたＨＣＶとは明らかに異なる新たなタイプのＨＣＶであることがわかる。

ＫＨＣＶ変異種の部分ｃＤＮＡ断片の作製Ｃ型肝炎患者の血清から分離した前記ＫＨＣＶから、各々ＫＨＣＶ　ＲＮＡを抽出し；各ＫＨＣＶ　ＲＮＡのＣＤＮＡをＰＣＲによって合成してＮＳ２領域またはＮＳ５領域に相当するｃＤＮＡ断片を得ろ。このようにして得た各ｃＤＮＡ断片の長さは各々約３４０ｂｐ　（ＮＳ２）および３２０ｂｐ　（ＮＳ５）である。

ｃＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、３２　Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

ＭＡＯ１９１５−５５９９、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）に挿入して、それらのヌクレオチド配列を決定する（図７から図２５参照）、それらのヌクレオチド配列は、ＮＳ２領域で９１％ないし９４％（図２７および図２８参照）、ＮＳ５領域で９６％ないし９９％の相同性（図２９参照）を示し、ＮＳ２領域およびＮＳ５領域にコードされたアミノ酸配列は各々９０％ないし９４％および９３％ないし９９％の相同性を示す（図２６参照）。

また、ＫＨＣＶは、ＮＳ２領域にコードされた各々８４２番目、８４９番目および８５３番目のアミノ酸によって、二つのサブタイプ、すなわち、ＫＨＣＶ−ＬｌとＫＨＣＶ−Ｌ２に分けられることが発見された。ＫＨＣＶ−Ｌｌに含まれるＫＨＣＶのｃＤＮＡは、８４２番目アミノ酸としてフェニルアラニンを、８４９番目アミノ酸としてロイシンを、また、８５３番目アミノ酸としてトレオニンを各々コードするが、ＫＨＣＶ−Ｌ２に含まれるｃＤＮＡはロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンを各々コードする。ＫＨＣＶ−Ｌｌのサブタイプとしては、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２０、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２３、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２６およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３２が含まれ、ＫＨＣＶ−Ｌ２（＋）？ブタイブはＫＨＣＶ−ＬＢＣ２、Ｋｌ（ＣＶ−ＬＢＣ３、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２１、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２５、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２７、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２８、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２９、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３０およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３１を含む。

前記の特徴は、アミノ酸がシスティン、フェニルアラニンおよびバリンである米国型ＨＣＶの場合には、見られないことに注意しなければならない。しかしながら、日本型はＫＨＣＶ−Ｌ２と同一の特徴を有する。すなわち、前記位置にあるアミノ酸が各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンである。

ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩを除いて、ＫＨＣＶ−Ｌｌに属するｃＤＮＡ、すなわち、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２０、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２３、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ：２６およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３２の各々を含むＭ１３ｍｐ１８ファージを含むＭ１３ファージ群（Ｍ１３ｍｐ１８−ＮＳ２ＬＬ）は、１９９２年３月１３日付で、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ７５２１１号として寄託しており、ＫＨＣＶ−Ｌ２に属するｃＤＮＡ、即ち、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２１、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２５、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２７、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２８、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２９、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３０およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３１の各々を含むＭ１３ｍｐファージを含むＭ１３ファージ群（Ｍ１３ｍｐ１Ｂ−ＮＳ２Ｌ２）は、同日付でＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ７５２１２として寄託した。

本発明のｃＤＮＡは、下記実施例の方法以外にも、図２−１ないし図２−１６および図７ないし図２５に提供されたヌクレオチド配列情報を使用して化学的に合成することもできる。かかる化学的な合成は、マテウチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）などのホスホアミシト（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ）固体支持方法［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、上見立、３１８５　（１９８１）参照］のような公知方法を使用して行なうことができる。

また、遺伝暗号の縮重によって、図２−１ないし図２−１６および図７ないし図２５に示したアミノ酸配列をコードできる多くの潜在的ヌクレオチド配列が存在することも理解されよう。

発現ベクターの構築およびこれによる蛋白の産生ＫＨＣＶから誘導されたちの以外の他のポリペプチドとの融合蛋白の産生を指令することができるベクターを初めとして、本発明によるＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターの作製のために、多様な発現システムを利用することができる。

たとえば、かかるベクターシステムは、ユビキチン（ｕｌ）ｉｑｕｉｔｉｎｅ）発現システムを使用して構築できる。酵母において、ユビキチンは、ユビキチン分解酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ）によりＡｒ　ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ｇ　ｌ　ｙのすぐ次の位置で切断されると知られている（Ｏｚｋａｙｎａｋ　ｅｔ、ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、見上旦、６６３−６６６　（１９８７）ｌ照〕。また、バクマイル（Ｂａｃｈｍａｉｒ）は、ユビキチンと融合された外来蛋白もまたユビキチンのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに隣接する部位で切断され得ると報告した［Ｂａｃｈｍａｉｒ、　ｅｔ　ａｔ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．１７８−１８６（１９８６）参照］。

したがって、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片とユビキチン遺伝子との融合ポリヌクレオチドを酵母内で発現させると、発現された融合蛋白が酵母細胞のユビキチン分解酵素によって切断されてユビキチンが除去され、その結果、ＫＨＣＶ蛋白のみが残るので、望ましいＫＨＣＶ蛋白が得られる。

また、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片とユビキチン遺伝子を含有する融合ポリヌクレオチドを大腸菌で発現させると、ユビキチンを含有する融合蛋白が得られるであろう。しかしながら、ユビキチンは試験管内でユビキチン分解醪素により切断することができ、ユビキチンを含まないＫＨＣＶ蛋白が得られる。融合蛋白は、もちろんそれ自体として本発明の目的に使用することができ；ＫＨＣＶ蛋白も、ＫＨＣＶ蛋白の必要な特性、たとえば、ＫＨＣＶの抗原性を保持する限り、やはりそれ自体本発明に使用し得る。

前記発現システムは、目的の蛋白が不安定で、宿主細胞内の蛋白分解酵素によって容易に分解され得る場合、ユビキチンが蛋白分解酵素の攻撃から目的の蛋白質を保護するか、これを安定化させ得ることができるので、効果的に使用され得る。

ユビキチンシステムを利用する発現ベクターは、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を、ユビキチン遺伝子含有発現ベクターに挿入することによって作製することができる。

一方、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）システムを利用する融合発現ベクターも本発明の発現ベクターとして使用することができる。このシステムにおいては、ＭＢＰをコードするｍａｌＥｌ遺伝子の後にＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を連結し、これによってＭＢＰとＫ）（ＣＶ蛋白の融合蛋白を産生させる［Ｇｕａｍ、旦工且土、、Ｇｅｎ６　旦ヱ、２１−３０、（１９８７）；Ｍａｉｎａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　ヱユ、３６９−３７３　（１９８８）；Ａｍａｎｎ、ｅｔ　ａｌ。

、Ｇｅｎｅ４０．１８３−１９０　（１９８５）；Ｄｕｐｌａｙ、ｅｔ　ａｌ。

、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２旦旦、１０６０６−１０６’１３　（１９８４）参照〕。

前記ＭＢＰ発現システムは、マルトースに対するＭＢＰの親和力を利用してＭＢＰ含有融合蛋白を容易に精製でき、またＭＢＰがＣ−末端領域に蛋白分解酵素因子Ｘａによって切断可能な部位を有するので、ＫＨＣＶ蛋白をＭＢＰから容易に分離し得るという点で便利である。

目的とするＫＨＣＶ蛋白を得るためには、適合する宿主細胞を、ＫＨＣＶｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターで形質転換させ、形質転換された細胞を発現可能な条件下で培養する。

発現させるＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片は、制限エンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをさらに大きい断片またはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩと共に使用し、また、プライマー、および鋳型としてのＫＨ（１：Ｖ−ＬＢＣｌまたはその断片を使用してＰＣＲを行なうことによって作製し得る。各プライマーの長さおよびヌクレオチド配列は、発現させるＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の位置および長さによって決定することができ；プライマーは二本鎖のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡのいずれかの鎖に完全にまたは部分的に相補的であってよい。

いったん作製し、単離したら、本発明のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片は、挿入された遺伝子配列の転写および翻訳に必要な要素を含む適切な発現ベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）に挿入する。有用なりローン化ベヒクルは、多様な公知の細菌プラスミドのような合成りＮＡ配列を初めとして、他の非ＫＨＣＶポリヌクレオチドのセグメント、ファージＤＮＡ、またはファージＤＮＡもしくは他の発現調節配列を使用するように変更されたプラスミドまたは酵母プラスミドの組合せから成っていてもよい。

適当な宿主生物の選択は、当該分野に公知の多数の要因によって影響を受ける。

これらの要因には、たとえば、選択されたベクターとの適合性、組換えプラスミドによってコードされる蛋白の毒性、目的とする蛋白の回収の容易性、蛋白の特性、生物安全性、費用などが含まれる。前記要因間の平衡は必ず考慮しなければならず、あらゆる宿主が特定の組換えＤＮＡ分子の発現に同等の効果を奏するものではないことは理解されなければならない。

本発明に使用し得る適当な宿主生物としては、植物、哺乳動物、昆虫細胞または酵母細胞、および大腸菌のような細菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来のポリペプチドは、コア蛋白、非構造蛋白および外膜蛋白およびその一部を全部含み、これらは、単独でまたはそれらの混合物の形態で診断試薬またはワクチンの作製に使用し得る。宿主細胞で産生されたポリペプチドは、通常の方法、たとえば、細胞破壊、遠心分離、透析、塩析、クロマトグラフィー、ゲルろ過、電気泳動および電気溶出などの多様な方法を組合わせて使用することによって分離精製できる。

本発明のポリペプチドはまた、ＫＨＣＶ粒子から単離するか、適当な方法、たとえば、排他的固相合成法（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、部分固相法、断片縮合法または通常の液相合成法によって、化学的に合成することもできる。固相合成法は、メリフィールド（ＭｅｒｒｉｆＬｅｌｄ）方法が好ましい［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

見立、２１４９　（１９６３）参照〕。

また、蛋白において、生物学的および免疫学的な活性を実質的に変化させないアミノ酸置換が起こることは広く知られており、例えばＮｅｕｒａｔｈ、旦１ａ１．．　＋Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９７９）、特にその１４頁の図６などに記載されている。最もひんばんに観察されるアミノ酸置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ％Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉ　ｉｓ、Ｌｅｕ／Ｖａ１．Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの置換とその逆の置換である。

本発明の実施態様例の、このような機能的に等価なアミノ酸！換は、生成された蛋白が一つ以上のＫＨＣＶの抗原決定基を保持する限り、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸を示すために標準１文字略字またはｍ準３文字略字を使用する。かかる略字の意味は、通常の生化学教材に示されている〔例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｔｓｈｅｒ　Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ９６．７９８、（１９８４）参照〕。

Ｋ　ＨＣＶ抗体の検出のためにＫＨＣＶ抗原ポリペプチドを使用するＣ型肝炎の診断方法本発明はまた、一つ以上のＫ）ＩＣＶエピトープを有しているＫＨＣＶポリペプチドを含む診断試薬を用いる診断方法に関するものである。ＫＨＣＶポリペプチドを使用した診断方法は、Ｃ型肝炎患者の血清中のＫＨＣＶ抗体を検出することにおいて、既存のいかなる方法より特異的で、かつ正確である。

新規な診断方法は下記工程から成る。

第一に、一つ以上のＫＨＣＶポリペプチドを含む診断試薬を、固体支持体、たとえば、微量適定板（マイクロタイタープレート）のウェル（ｗｅｌｌ）に入れてＫＨＣＶ抗原をウェルの表面に吸着させ、第二に、希釈液で希釈された試料を抗原で被覆されたウェルに加え、ここで血清中に抗ＫＨＣＶ抗体がある場合、抗原 −抗体複合体が形成され、第三に、酵素、たとえば、ＨＲＰ　（西洋ワサビペルオキシダーゼ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と結合された抗ヒトＩｇＧをウェルに加え、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを第二の段階で形成された複合体の抗体に結合させ、最後に、酵素の基質、たとえば、ペルオキシダーゼに対するＯ−フェニレンジアミンニ塩酸塩（ＯＰＤ）および過酸化水素なウェルに加えて発色させる。血清試料が抗ＫＨＣＶ抗体を含む場合、酵素と基質との反応により色が現れる。稀硫酸を添加することによって発色反応を中止させる。

色の強度は、マイクロウェル読取り機によって測定し得、かかる結果に基づいて抗ＨＣＶ抗体の存在を決定することができる。診断方法に使用される固体支持体は、ポリスチレンビーズまたはニトロセルロースストリップでもよい。

また、本発明は、一つ以上のＫＨＣＶエピトープを担持するＫＨＣＶポリペプチドを含む診断試薬から実質的に成る、前記手順を行なうのに必要な試薬を含むＣ型肝炎診断用キット（ｋ　ｉ　ｔ）を提供する。

抗体の作製本発明は、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来のポリペプチドに対する抗体を提供する。

簡単に言えば、適当な動物を選択し、望ましい免疫プロトコールを行なう、適当な時間の後、前記動物の腎臓を切除し、各々の腎細胞を、適当な選択条件下で、通常的には骨髄腫細胞と融合させる。その後、該細胞をクローン的に分離し、各クローンの上清液を使用して抗原の目的領域に対して特異的な適切な抗体の産生を試験する。

動物、たとえば、マウスは次のもののような常法によって免疫され得る。

実質的に精製された抗原を、マウスに筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内へ注射し、さらに詳しくは、−匹当り総投与量１００ないし２００μｇを１４ないし２１日おきに数回注射する。必要であれば、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバントまたは不完全アジュバントのような通常のアジュバントを併用することもできる。最終注射の３日後、生存率９５％以上で、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞との融合のために、マウス腎細胞をとり出す。

細胞の融合は、当該分野に公知された方法にしたがって行なうことができる［例えばＬｏｖｂｏｒｇ、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　＆　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ″、ＷｉｌｌｉａｍＨｅｉｎｅｍａｎｎ％Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ　Ｌｔｄ、（１９８２）参照〕。

このようにして得た融合細胞は、公知の方法を使用して段階的に稀釈して、目的とする抗体を産生ずるクローンを検出する［例えば、“ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ−ｃｏｔｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）参照〕。

目的とするクローンは、酵素免疫測定法、プラーク方法、スポット方法、オフタロニー法および放射性免疫検定法などのような常法にしたがってスクリーニングすることができる［”Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＆Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｅｓｓ、ｐｐ３０−５３　（１９８２）参照Ｊ。

目的とする単クローン抗体は、クローン化された抗体産生細胞株を使用して当該分野の熟練者によって容易に得られ、親和性クロマトグラフィーなどの常法にしたがって精製することができる。

かかる抗体は、ＫＨＣＶ抗原の精製、および試料中のＫＨＣＶ抗原を検出するための改善された診断方法の開発に有用である。

診断用オリゴヌクレオチドプローブおよびキットの作製図２−１ないし図２−１１および図７ないし図２５に示したＫＨＣＶｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列に基づいて、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡｉｌＫのいずれかに相補的な、少な（とも８個のヌクレオチドを、切断によってまたは合成によって作製することができる。オリゴヌクレオチドは、標識、たとえば、放射性標識を使用した標識後にハイブリッド形成用プローブとして、または血清試料中のＫＨＣＶの検出用鋳型としてＫＨＣＶ　ｃＤＮＡを使用するＰＣＲ用ブラプライマーて使用することができる。

オリゴヌクレオチドは、状況によって、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ鎖に完全にまたは部分的に相補的であることもできる。

オリゴヌクレオチドは、少なくとも８個のヌクレオチド、好ましくは１０ないし１２個のヌクレオチド、さらに好ましくは約２０個のヌクレオチドを含有する。

ワクチンの作製および投与当該分野の公知方法を使用して作製された不活化または弱毒化されたＫＨＣＶ、ならびに本発明のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片にコードされた一つ以上のポリペプチドは、生理学的に許容可能な担体と共にワクチンに製剤化し得る。好適な担体は、たとえば、中性ｐＨの０．０１ないしＯ，１Ｍ燐酸塩緩衝液または生理食塩水である。

ＨＣＶに対する強化された免疫は、ワクチンにアジュバントまたは免疫強化剤を加えることによって、またはポリペプチドを架橋結合された複合体または担体に結合された形態として、さらに大きい形態で提供することによって生成することができる。

ワクチンのために好適なアジュバントは、アジュバント６５〔落花生油、マンニドモノオレート（ｍａｎｎｉｄｅ　ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびアルミニウムモノステアレート含有］　；水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウムおよびミョウバン（ａｌｕｍ）のような無機ゲル；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リンレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ′−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオールのような界面活性剤；ビラン、デキストランスルフェート、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボボールのようなポリアニオン：ミュラミルジベブチド、ジメチルグリシンおよびツフッシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）のようなペプチド；およびオイル乳化液を含むことができるが、それに限定されるものではない。

本発明の蛋白は、またリボゾームまたはほかの微細担体内に包含させて投与してもよい。

本発明の蛋白、とくにそれらのさらに小さい断片の免疫原性は、架橋結合によって、または免疫原性担体分子（すなわち、本発明の蛋白および蛋白断片を共有結合により連結し得る、宿主動物で独自に免疫反応を起す特性を有する巨大分子）に対するカップリングによって増加され得る。架橋結合または担体分子に対する結合は、小さい蛋白断片が時にハブテン（抗体に特異的に結合できるが、抗体産生を起さない、すなわち、免疫原性ではない分子）として作用するので、必要となり得る。免疫原性担体分子に対する前記断片の結合は、通常的に“担体効果” として知られた効果を通じて断片を免疫原性にする。

好適な担体分子としては、たとえば、ポリペプチド、ポリサツカリド、リポポリサツカリドなどのような蛋白および天然または合成高分子化合物が挙げられる。

有用な担体中の一つは、キール（Ｑｕｉｌ）Ａと呼ばれるグリコシドである（Ｍｏｒｅｉｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３０旦、４５７　（１９８４）参照］。キーホールウノアシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ　１　ｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ヒトまたはウシのγ−グロブリン、ヒト、ウシまたはウサギの血清アルブミン、または前記蛋白のメチル化誘導体もしくは他の誘導体のような、蛋白の担体分子がと（に好ましいが、これに限定されるものではない。他の使用し得る蛋白担体は、当該分野の熟練者には公知である。

担体分子に対する共有結合カップリングは、当該分野に公知の多様な方法を使用して行なうことができ、その正確な選択は、たとえば、使用する担体分子の性質によって指定され得る。免疫原性担体分子が蛋白である場合、本発明の蛋白またはその断片は、ジシクロへキシルカルボジイミドまたはゲルタールアルデヒドのような水溶性カルボジイミドによって前記担体蛋白にカップリングさせ得る。

前記のようなカップリング剤は、また、別の担体分子を使用せず、蛋白およびその断片をそれ自体で架橋結合させるのに使用し得る。蛋白またはその断片の集合塊間のかかる架橋結合もまた、免疫原性を増加させ得る。

リボゾームまたは他の微細担体内への包含は、ワクチンを長時間にわたって放出させる効果を提供することができる。

ワクチンは一回用量で、好ましくは数回用量で投与できる。ワクチン製剤中に存在するポリペプチドの有効量は、免疫対象個体の体重、抗体を産生ずる個体の免疫系の能力および目的とする免疫の度合いによって、約５ないし約２００μｇの範囲であってよい。好ましくは、初回ワクチン接種の１ないし数ケ月後に追加ワクチン接種（ブースター）を行なう。数回のブースターを投与してもよい。皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与などの標準的投与ルートを用いることができる。

下記実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明をより詳細に説明するためのものであり；実施例において使用した実験方法は、別に言及しない限り次の参考例に従って行なった。

異なることを指示しない限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、液体中の固体について以下に与えるパーセンテージは、各々重量／重量、容量／容量および重量／容量の基準である。

参考例１：制限エンドヌクレアーゼを利用したＤＮＡの切断制限酵素と反応緩衝液はＮＥＢ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、、Ｊｏｌｌａ、ＭＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）社から購入した。

反応は、５０μｍないし１００μｌ容量の滅菌エッペンドルフ管を使用して３７ ℃で１時間ないし２時間行なった。その後、反応混合物を６５℃で１５分間熱処理（耐熱性のエンドヌクレアーゼの場合にはフェノールで抽出してエタノールで沈降させる）して制限エンドヌクレアーゼを不活性化させた。制限エンドヌクレアーゼ反応のため、１０倍反応緩衝液は下記の組成を有する：１０倍ＮＥＢ反応緩衝液１：１００ｍＭ　ビストリスプロパン−ＨＣｌ、１００　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｚ、１０ｍＭジチオトレイトールＤＴＴ、ｐＨ７，０１０倍ＮＥＢ反応緩衝液２＋１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１００ｍＭＭｇＣ１，，５００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＤＴＴ、　ｐＨ７，０１０倍ＮＥＢ反応緩衝液３：１００ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、１００ｍＭＭｇＣ１ｘ、１０００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７，０１０倍ＮＥＢ反応緩衝液４：２００ｍＭ　トリス−アセテート、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、５００ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７，０参考例２：フェノール抽出およびエタノール沈降酵素反応の完了後、酵素を失活させるか、反応混合物中のＤＮＡを回収するために、反応混合物をフェノールで抽出した。ここで、１０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）および１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液で予め平衡化されたフェノールを使用した。フェノール抽出は同容量の試料とフェノールとを振盪して混ぜ、混合物を１５．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離し、水性層を他の管へ移すことによって行なった。前記過程を２回または３回繰返した。

次に、水性層を同容量のクロロホルム（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４　＋　１）で抽出し、水性層をさらに分離した。これに０．１の容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタノールを加え、混合物を一７０℃で３０分間または一２０℃で１２時間静置した後、１５．ＯＯＯｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して核酸を回収した。

参考例３：連結反応ＤＮＡの連結反応は、ＮＥＢ社のＴ、ＤＮＡリガーゼと１０倍連結反応緩衝液（０，５Ｍ　トリス−ＨＣｌ、０．１Ｍ　ＭｇＣｌ□、０．２Ｍ　ＤＴＴ。

１０ｍＭ　ＡＴＰ、０．５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ））を使用して行なった。反応容量は通常２０μｌで、ＤＮＡの接着末端の連結には１０単位のＴ４リガーゼを使用し、平滑末端を有するＤＮＡの連結には、１００単位のものを使用した。

前記反応は１６℃で５時間、または４℃で１４時間以上行なって、反応終了後、６５℃で１５分間加熱してＴ、ＤＮＡリガーゼを失活させた。

参考例４：大腸菌の形質転換下記実施例のために使用された大腸菌菌株は旦、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３６９４）、Ｅ、ｃｏｔｉ　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３８７６）および旦、ｃｏｌｉＪＭ１０５　（ＡＴＣＣ４７０１６）である、大腸菌の形質転換は、当該分野で公知である方法にしたがって行なうことができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｅｔ且工、、＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ。

（１９８２））’またはＣｏｈｅｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、見立、２１１０　（１９７２）参照）。

参考例５：酵母の形質転換文献に記述された方法で酵母を形質転換させた（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ参照）。

参考例６：オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは自動化された固相ホスホアミダイト法を利用するＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、の３８ＯＢ）で合成した。

合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ポリアクリルアミドゲル（２Ｍ尿素、１２％　アクリルアミド：ビーズ（２９：　１）、５０ｍＭ　トリス。

５０ｍＭホウ酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、電気泳動および５ＥＰ−ＰＡＫ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｉｎｃ、製品、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、２６０ｎｍにおける０、Ｄ、を測定することによって定量した。

参考例７：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）１０％ｇないし１１００ｎの鋳型、１０μｌの１０倍濃度Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液（１０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、５００ｍＭ　ＫＣＩ、１５ｍＭＭｇＣ１，，０，１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、ｐＨｓ、３）、ｆｏｕｌのｄＮＴＰの混合液（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰが各々２ｍＭずつである）、２μｇの各々のプライマー（通常、２個のプライマーを使用し、３個のプライマーを使用する場合、中間位置のプライマーは０．０２μｇの量で使用する）および０．５ｕｌのＡｍｐｌＬ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ製品、Ｕ、Ｓ、Ａ、）の混合物に蒸留水を加え、１００μｍの総容量を作った。ここに、５０μｌの鉱油を添加して、反応混合物の蒸発を防いだ。

温度循環機（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ製品、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を使用してＰＣＲを行ない、９５℃で１分−５５℃で１分→７２℃で２分間のサイクルを２５回以上繰り返すようにプログラムし、最終的に７２℃で１０分間反応を行なった。

反応終了後、混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈降させることによってＰＣＲ産物を回収し、沈降物を２０μｍのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）に溶解した。

実施例１：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの作製（１−Ａ）韓国人Ｃ型肝炎患者の血清からＨＣＶの単離及びそれからウィルスゲノムＲＮＡの抽出非Ａ非Ｂ型肝炎と診断された韓国人慢性肝炎患者の血清５０ｍ１（ＡＬＴ＜６０ＩＵ；大韓民国高麗大学医学部内科及びカドリック大学医学部内科提供）をプラトレイ（Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｄ、Ｗ）らの方法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ旦旦、７７３　（１９８５））に見立て超遠心分離してＨＣＶ粒子を沈降させた。

血清５０ｍ１をＴＥＮＢ緩衝液（０，０５Ｍ）リス、ｐＨ８，０゜０、ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）、０、ＬＭ　ＮａＣ１）で６倍稀釈した後、ベックマンローター５Ｗ２８　（Ｂｅｃｋｍａｎ社製。

Ｍｏｄｅｌ　Ｌ８−８０Ｍ）を用いて常温で約６時間２８．ＯＯＯｒｐｍで超遠心分離した。

ウィルス粒子沈降物からウィルスゲノムＲＮＡの抽出はコロジンスキ（Ｃｈｏｌｏｚｙｎｓｋｉ、Ｐ、）とサツキ（Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ）の方法（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、上旦λ、１５６−１５９頁（１９８７）参照）によって次のように行なった。ウィルス粒子沈降物を８ｍｌのＲＮＡ抽出液（４Ｍ　チオシアン酸グアニジン；２４ｍＭＮａ−＜えん酸塩、ｐＨ７，０，０，５％サルコシルおよび０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）に懸濁した。２Ｍ　酢駿ナトリウム（ｐＨ４，０）０．８ｍｌ、フェノール８ｍ１（ＢＲＬ社、Ｕ、Ｓ、Ａ、、蒸留水で飽和された）およびクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：　１．ｖ／ｖ）１．６ｍｌを加えて混合した後、１２．０００　ｘ　ｇで１５分間４℃で遠心分離した。その後、上澄液を新しい試験管に移して同溶量のイソプロパツールと担体としてグリコーゲン（２μｇ／ｍｌ上澄液）を添加した。混合物を一２０℃ の冷蔵庫で約１時間放置した後、１２，０００　ｘ　ｇ、４℃で２０分間遠心分離してＲＮＡ沈降物を得た。この沈降物を７５％エタノールに懸濁した後、前記のように遠心分離して真空条件下で約１０分間乾燥した。ウィルスＲＮＡ沈降物を４００μｍのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　）リス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解して、次の段階に用いた０次に用いるためのウィルスＲＮＡ溶液は、− ７０℃で保持し得る。

（１−Ｂ）ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリ（ｌ　１ｂｒａｒｙ）の作製（１−Ｂ −１）ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの合成ｃＤＮＡの合成のために、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いた。

前記の実施例（１−Ａ）から得たＣ型肝炎ウィルスＲＮＡを逆転写酵素の鋳型として用いて、ヌクレオチド配列５”　−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧ　（Ｔ）、ａ−３’　を有するオリゴ−ｄ　（Ｔ）プライマー及びヌクレオチド配列５’　−ＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＮＮＮＮＮＮ−３°　（ここで、Ｎなどは同じＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢＬｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　。

Ｍｏｄｅ　１　３８０Ｂ）を用いて合成した。

ｃＤＮＡの第一の鎖を次のように合成した。：実施例（１−Ａ）から得られた肝炎ウィルスのＲＮＡ溶液１８μｌを２μｌのＯ，ＬＭ　ＣＨｓ　ＨｇＯＨと混合して、該混合物を常温で１０分間放置してＲＮＡの２次構造を外した。ここに、２μｌのＩＭ　β−メルカプトエタノールを加えて、該混合物を常温で５分間放置した。処理されたＲＮＡ溶液に５μｌの逆転写酵素反応緩衝液（５００ｍＭトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，３，７５０ｍＭ　ＫＣＩ、３０ｍＭ　ＭｇＣ１＊および１０ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　；ＤＴＴ）＋２．５ｕｌの各々１０ｍＭのｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ、２μｍのオリゴ−ｄ　（Ｔ）プライマー（１，４μｇ／μｌ）または２ μ１（７）ＲＡＮＰＳＨＣＶ　（１，０＋ｕｇ／μｌ）、１５ｕｌ（７）ピロカルボン酸ジエチル（ＤＥＰＣ；ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）で処理された蒸留水および１．ＯｕｌのＲＮａｓｅ阻害剤、ＩＵ／ＬＬｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｕ、Ｓ、Ａ、）の順に加えた後、室温で１０分間放置してＲＮＡ鋳型にプライマーを結合させた後、ここに２．５μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（１８Ｕ／μｌ、５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＲＮａｓｅ　Ｈ−ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＢＲＬ社製、Ｃａｔ、Ｎｏ、８８５３３Ａ）を加えた。

反応混合物を３７℃で１時間インキュベートしてｃＤＮＡの第一の鎖を合成した。

ｃＤＮＡの第２の鎖を合成するために、前記第１の鎖溶液４５μｌに４０μｌの１０倍濃度の第２の鎖緩衝液（１８８ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ６，９，９０６ｍＭ　ＫＣｌ、４６ｍＭ　ＭｇＣ１＊、１．５ｍＭ　β−ＮＡＤ　にコチンアミドアデニンジヌクレオチド；ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、１００ｍＭ（ＮＨ４）ｓ　５Ｏ４）、６．０＋ｕｌの１０ｍＭｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ　各々１０ｍＭ）及び２９８μｌの蒸留水を順番に加えた後、試験管の壁に沿って１．０μｌのＲＮａｓｅ　Ｈ（４Ｕ／ｕｌ）および１０．０＋ｕｌのＤＮＡポリメラーゼＩ　（ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ、ＩＩＵ／μｌ）を滴下した後、重速に反応溶液を混合して、１６℃で２．５時間インキュベートした。

その後、この反応溶液を同量のフェノール−クロロホルム（１：　１（Ｖ／Ｖ）、フェノールは０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）および０．１％（Ｖ／Ｖ）β−メルカプトエタノールで予め飽和させた）で３回抽出した。上層の水性相を取って０．１容鳳の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールと混合した。この混合物を一２０℃で１夜放置し、１２．０００　ｘ　ｇ、４℃で２０分間遠心分離してｃＤＮＡ沈降物を回収した。

（１−Ｂ−２）ｃＤＮＡライブラリの作製前記の実施例（１−Ｂ−１）から得た二本鎖ｃＤＮＡを平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）に作るために、前記ｃＤＮＡ沈降物に４３．５μｌの蒸留水を加久て溶かした後、３９μｍのｃＤＮＡ溶液を取ってこれを５．０μｍの７４　ＤＮＡポリメラーゼ反応液（６７０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，８，１６６ｍＭ　＜ＮＨ４）−ＳＯ４，６７ｍＭ　ＭｇＣ１５、ｌｏｏｍＭ　β−メルカプトエタノール、６’ｌｕＭ　ＥＤＴＡ）、２．５μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合物および３．５μｍのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（２，９ｕｌμｍ）と混合した。該反応混合物を３７℃で３０分間放置した後、この反応生成物を実施例（１−Ｂ−１）の方法と同様に、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させた。

その後、５°−末端制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩの認識部位を導入するために、平滑末端を有す２本鎖ｃＤＮＡを次のように処理した：沈降物に平滑末端を有するｃＤＮＡに７．０ｕｌのＥｃｏ　ＲＩ　アダプタ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製。

Ｚａｐ−ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　Ｃａｔ、Ｎｏ。

２００４００、ＣＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、１．０μｌの１０倍濃度連結反応緩衝７？ｌｉ、１．０μｍのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（１００ＯＵ／μｌ）および１．０ μｌの１０ｍＭ　ＡＴＰを加えて、４℃で一夜放置した。生成された混合物７０ ℃で１０分間加熱してリガーゼを失活させた。

このようにして得たｃＤＮＡを直接クローン化し得るが、本実施例では前記ｃＤＮＡを増幅させた後、クローン化段階に用いた。

ｃＤＮＡの増幅のために、そのＰＣＲを次のように行った：前記から得られたｃＤＮＡ溶液に１０μｍの１０倍濃度ＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，１５ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ　、２５０ｍＭ　ＫＣｌ、０．５％ツイーン２０．１ｍｇ／ｍｌ　ゼラチン）、１０μｍの２ｍＭ　ｄＮＴＰａ合物、５ μｌの５°−ＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡ−３°のヌクレオチド配列を有するＰＳＨＣＶプライマーと５μｍのＥｃｏ　ＲＩアダプターの上部配列（５’−ＣＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−３°）、ｌμｌ　（２，５単位）のＴａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ社製、７６１　Ｍａｉｎ　Ａｖｅｎｕｅ。

Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ　０６８５９−００１０．Ｕ、Ｓ、Ａ、）および６９μｍの蒸留水を加え、９５℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で２分間のサイクルを連続２５回繰返するようにプログラミングされた温度循環器（ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ社、Ｕ、　Ｓ、ん）を用いてＰＣＲを行なった。反応完了後、セントリコン　１００（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　ｔｏｏ、Ａｍｌｃｏｎ社製　、Ｃｕｔ、Ｎｏ。

４２００、Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ９１９５４．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ　６０６９３゜Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いて、残留プライマー及びｄＮＴＰを除去した。その後、前記のように生成物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させて沈降物を得た後、１６μｌのＴＥ緩衝液で溶解した。

生成された溶液に、ここに２μｌの１０倍濃度緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１゜０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ、５０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、５ｍＭ　ＤＴＴ。

ｐＨ７，９１とＥｃｏ　ＲＩとＸｈｏ　Ｉ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、、３０Ｔｏｚｅｒ　Ｒｄ、、Ｂｅｒｖｅｒｌｙ。

ＭＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を各々１μｌずつ添加して混合した後、３７℃で１０分間放置してｃＤＮＡ断片を部分切断した。ｃＤＮＡ断片などを前記のようにフェノール／クロロホルム抽出の後、エタノールで沈澱させて、この沈降物を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

このｃＤＮＡ断片をＵＮｌ−ＺＡＰＸＲベクター内へ次のようにクローン化した：前記から得たＥｃｏ　ＲＩ／　Ｘｈｏ　Ｉで処理されたｃＤＮＡ断片１０ｕｌに２．０μｌのｌＯ倍濃度連結反応緩衝液、２．０μｌの１０ｍＭＡＴＰ、４．０μｍのベクターＵＮＩ−ＺＡＰＸＲ溶液（ＥｃｏＲＩ／Ｘｈ。

工で既処理された）（ｌμｇ／μｍ）と２，０μｌの７４　ＤＮＡリガーゼ（４Ｗｅｉｓｓ　Ｕ／μｌ）とを加えた後、反応混合物を１６℃で約１０時間インキュベートした。

、　（実施例１−Ｂ−３）ＣＤＮＡを含むベクターのファージ内へのパッケージングおよびｃＤＮＡライブラリの増幅（試験管内の試験）前記実施例（１−Ｂ− ２）から得られた連結されたＤＮＡをファージ内にパッケージングするために、ギガバック■ゴールドパッケージング抽出物（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ、。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）に実施例（１−Ｂ−２）の最終溶液１０ＬＬＬを加えた後、室温で２時間放置した。

生成混合物に５００１Ｌｌのファージ希釈液（１４２当たり、５．８ｇのＮａＣ１，２，０ｇ（１）ＭｇＳ０．４Ｈ＊　０．５０ｍ１のＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ７，５，５ｍｌの２％　ゼラチン）および２０μｌのクロロホルムを加えた（Ｋｒｅｔｚ、ｅｔ　ａｌ９．Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、上ヱ、５４０９（１９８９））。

感染および増幅は次のように行った。

大腸菌ｍｅｒＡ−１ｍｅｒＢ−菌株、即ちＰＬＫ−Ｆ　′（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＫｉｔＣａｔ、Ｎｏ、２００４００）をＬＢ培地（１２当たり、バタトートリップトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣ１１０ｇ）で０．　Ｄ、　ｇｏｏ　（６００％ｍ波長での光学濃度（ｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ））が０．５となるまで培養した。培養された細胞を沈澱させて１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４に溶かして、１．０の０．Ｄ、６゜。に合わせた。該溶液６００μｌを前記パッケージング混合物２０ＯＬＬＬと混合した後、３７℃で１５分間放置してファージを大腸菌で感染させた。溶融し４８℃に保持した０、７％ＮＺＹ寒天（１２当り、ＮＺアミン７ｇ、ＮａＣ１５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈｉ　Ｏ２ｇ、酵母抽出物５ｇ。

バクトーアガ−７ｇ）を得られた大腸菌に加え、この混合物を１５０ｍｍ直径のＮＺＹ寒天プレート（１β当たり　ＮＺアミン７ｇ、ＮａＣ１５ｇ。

Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈｚ　０　２　ｇ、酵母抽出物５ｇ、バクトーアガ−１６ｇ）の上に加えた後、３７℃で５ないし８時間インキュベートしてファージプラークを形成させた。

次いで、１０ｍ］のファージ希釈液を前記プレート上に注いで、４℃で約１５時間弱（振盪してファージを溶存させた後、４．０００　ｘ　ｇで遠心分離して大腸菌細胞を沈降させて除去した。このようにして得たＨＣＶｃＤＮＡライブラリ溶液に０．３％容量のクロロホルムを加え、ｃＤＮＡライブラリの力価（ｔｉｔｅｒ）を測定して約１０１０ないし１０”ＰＦＵ（プラーク　形成単位）７ｍ１の値をめた。１００％　ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙ　１ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を７％（ｖ／ｖ）の濃度となるように添加して、ｃＤＮＡライブラリを一７０℃で保持した。

（実施例１−Ｃ）免疫測定方法によるｃＤＮＡライブラリのスクリーニング及びｃＤＮＡ配列の決定実施例（１−Ａ）で調製した６倍稀釈血清を超遠心分離して得た上澄液を蛋白Ｇアフィニテーカラムクロマトグラフィ−（Ｇｅｎｅｘ社製、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）で精製したＨＣＶ抗体を用いて、免疫検索（ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）方法（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｖ、ｅｔ　ａｌ、、且にΔ−見見上立上１旦ＩＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ、Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ、ｅｄ、）ｐｐ　４９−７８．ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ（１９８５））によりｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。

前記実施例（１−Ｂ−３）から製造されたｃＤＮＡライブラリ溶液をプレート（直径　１５０ｍｍ）当たり、約５０，０ＯＯＰＦＵとなるように稀釈した後、実施例（１−Ｂ−２）と同じ方法で製造した大腸菌ＸＬＩ−ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｚａｐ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ　Ｃａｔ、Ｎｏ、２００４００）培養液６００μｍ（０，Ｄ、ｓｏｏ　＝Ｑ、５）と混合した後、６．５ｍｌの０．７％　ＮＹＺ寒天をそれに加えた。各混合物を４０個のＮＹＺ寒天プレートの上に各々加えて、３７℃で１２時間培養した後、約２　ｘ　１０’個のファージプラークが形成された。

次に、直径１３７ｍｍのナイロンフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｃｕｔ。

Ｎｏ、１６２−１６３．Ｕ、Ｓ、Ａ、）のプラークリフト膜（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔｍｅｍｂｒａｎｅ）に１０ｍＭ　ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ− ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）溶液を浸み込ませた後、’）トｖン（Ｗｈａｔｍａｎ）３ＭＭ　フィルター上で吸い取り乾燥した。各フィルターをプレートの寒天上に置いて、３７℃で３．５時間インキュベートした。

ファージプラークが吸い取ったフィルターを、各々１５ｍ１の洗浄液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　２０）で洗浄した。このフィルターに１５ｍ１のブロッキング溶液（１％ウシ血清アルブミン２０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ１）を添加して、弱く揺りながら室温で１時間インキュベートした。

その後、各々のフィルターを１５ｍ１のＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％（ｖ／ｖ）ツイーン−２０）で、室温で５分間弱く揺りながら５回洗浄した。精製ＨＣＶ抗体（最終蛋白濃度８．２ｍｇ／ｍｌ）を１％（Ｗ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ　トリス−ＭＣ１，ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ１）で約に２００の割合で稀釈した溶液的１５ｍ１にフィルターに投入し、室温で１時間弱（振盪した後、前記のＴＢＳＴ緩衝液中に室温で５分弱く振盪しながら５回洗浄した。各々のフィルターを、希ビオチン化した山羊　抗−ヒトＩｇＧ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ）とアビジン結合−アルカリホスファターゼ（ａｖｉｄｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ社製、Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｃａｔ、Ｎｏｓ、３１７７０Ｃ。

２１３２１Ｃ）を１％（ｗ／ｖ）ＦＢＳ含有ＴＢＳ緩衝液で１：２０００の割合で稀釈した溶液１５ｍ１中に入れて、室温で１時間弱（振盪した後、約１５ｍ１のＴＢＳＴ緩衝液中で弱く揺りながら室温で５分間５回洗浄した。７８７２３ＭＭフィルターに各フィルターを吸い取り乾燥した。

発色反応のために、各フィルターを１５ｍ１の発色溶液（１００ｍＭトリス−ＭＣＩ、ｐＨ９，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ。

５ｍｇのニトロ　ブルーテトラゾリウム、２．５ｍｇのリン酸５−ブロモ−４− クロロ−３−インドール）中で室温の暗室で約３０分間反応させた。遺伝子組換えＨＣＶ抗原をコード化するｃＤＮＡを発現したものと見える、紫色の陽性ファージプラークを内口で確認した。各フィルター濾過紙をＴＢＳ溶液で一回洗浄し、発色停止溶液（２０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ２，９，１ｍＭＥＤＴＡ）を添加して発色反応を停止させた。各々のフィルターを室温で乾燥した後、ポラロイドフィルムの上に記録した。

陽性プラークを単離して１ｍｌのファージ稀釈液（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，）中で室温で１ないし２時間インキュベートした。単一ファージプラークを得るため前記の免疫スクリーニング分析を繰り返した。

組換えＨＣＶ遺伝子の存在が確認された各々のファージプラークを５００μｍの３Ｍ緩衝液（１β当たり、５．８ｇのＮａＣ１，２，０ｇのＭｇＳＯ４，５０ｕｌのＩＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，５ｍｌの２％　ゼラチン）を含有する滅菌ミクロ遠心分離管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　ｔｕｂｅ）へ移した後、２０μ ｍのクロロボルムをそれに添加し、振盪しながら室温で１ないし２時間分離管の内容物を培養した。２００μｌの前記溶液（１ｘ　１０″′フア一ジ粒子以上）、ｌμｌのへルバーファージＲ４０８（１ｘ　１０’　ＰＦＵ／ｍ１以上、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）と２０μｍの大腸菌ＸＬ−１細胞懸濁液（０，Ｄ、　、。。＝１．０）を混合し、この混合物を３７℃で１５分間培養した。この培養液に５ｍｌの２濃度度ＹＴ培地（１β当たりＬｏｇのＮａＣ１，１０ｇの酵母抽出物、１６ｇのバクトートリップトン）を添加した後、３７℃ で３時間振盪培養し、２０分間７０℃に熱処理した。生成した培養液をｌ：１００倍に稀釈し、稀釈された培養物２００μｍを２００μｌの大腸菌ＸＬＩ−ブルー細胞（０，Ｄ、　８゜。＝１．０）と混合した。３７℃で１時間培養した後、生成した培養液１００μｍを、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍ１）−含有ＬＢプレートに加え、３７℃で１０時間インキュベートして、二本鎖ｃＤＮＡを含有したｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ファージミード（ｐｈａｇｅｍｉｄ）コロニーを得られた。

一本ＭＤＮＡを作製するためには、得られたｐブルースクリプトコロニーを抗生剤テトラサイクリン（１２，５μｇ／ｍ１）−含有ＬＢ寒天培地でインキュベートして、再び陽性コロニーを選別した後、この陽性の単一コロニーをテトラサイクリン＋ＬＢブロス培地（２ないし３ｍ１）で−夜培養した。この培養液を０．３ｍｌのスーパーブロス培地（１β当たり、３５ｇ　バクトートリップトン、２０ｇ　酵母抽出物、５ｇ　ＮａＣ１，ＮａＯＨでｐＨ７，５に調整）に接挿して３７℃で振盪培養した。培養液にヘルパーファージＲ４０８を感染させて、Ｏ，Ｄ、　、。。の値が０．３になるまで８時間続いて培養した。

感染時、ファージ：細胞の割合はｐブルースクリプトに担持されるｃＤＮＡの種類によって太き（変わり、通常２０：１．１０：ｉ、１：１または１：１０であることができる。前記に得られた培養液の上澄液から一本！ｌｌＤＮＡを抽出した。

２本鎖ファージミドおよび１本鎖ファージミドの単離及び精製はサンプルクにより提案された方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ｅｔ　ａｉ、、ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ、１．ｐｐ２．７３−２．８１゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、（１９８９））により行った。

各クローンに含有されたｅＤＮＡ断片の長さを、２本鎖ファージミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ　Ｉで切断し、異なる長さのｃＤＮＡ断片を有する三つのクローンが得られた。

精製された１本鎖組換えｐブルースクリプトファージミドまたは２重鎮ｐブルースクリプトファージミドを鋳型として、Ｍ１３−２０ｍａｒ。

プライマーＴ７、プライマーＫＳ、プライマーＳＫまたはプライマーＴ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いてサンガーの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４，５４０５（１９７７））にしたがって３つの組換えｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定して、得られたｃＤＮＡ断片を各々ＫＨＣＶ　４２６．ＫＨＣＶ　６５２及びＫＨＣＶ　４０３とそれぞれ命名した（図１ないし図３　参照）。

（１−Ｄ）：オリゴヌクレオチドプローブを用いたＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ−担持組換えファージの選別及びそのヌクレオチド配列の決定（１−Ｄ−１）：ＫＨＣＶ　６５２と重なり合っているｃＤＮＡクローンの単離前記免疫検索方法によりスクリーニングされないＨＣＶｃＤＮＡ−担持組換えファージを選別するために、プローブとしてオリゴヌクレオチドＰ６５２ａ（５’ 　−ＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡＣＴ−３゛）とＰ６５２ｂ　（５’　−ＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＡＡＣＴＣＧ−３°）（前記オリゴ−ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、実施例（１−Ｃ）で決定されたｃＤＮＡ　ＫＨＣＶ　６５２のヌクレオチド配列から選ばれたものである）を用いて、文献（（Ｂｅｎｔｏｎ、Ｗ、Ｄ、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅｉ９６，１８０　（１９７７）：Ｃｏｎｎｏｒ、Ｂ。

Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

８０．２７８　（１９８３）及びＪａｃｏｂ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ３１３．８０５　（１９８５））に述られたの方法によりプラークハイブリダイゼーションを行った。

実施例（１−Ｂ）から製造した５０．０ＯＯＰＦＵを含有するｅＤＮＡライブラリ溶液を取り、実施例（１−Ｂ−３）で製造された大腸菌ＸＬＩ−ブルー（０，Ｄ、　＠。。値が０．５になるように稀釈した）６００μｌと混合して０．７％ＮＺＹ寒天と混ぜた。この混合物を１５０ｍｍのＮＺＹプレートに注いで、３７ ℃で１２時間インキュベートした。総３０枚のプレートから１．５ｘｌＯ＠のファージプラークを得られた。

その後、直径１３７ｍｍのナイロンフィルターをプレートの上に置いて、フィルターにプラークを吸い取らせた０次いで、ナイロンフィルターを取り出して空気中で乾燥した。

乾燥したフィルターを、各々０．２Ｍ　ＮａＯＨ／１．５Ｍ　ＮａＣ１で飽和された９８７２３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　３ＭＭ　ｐａｐｅｒ）の上に１ないし２分置き、０．４Ｍ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，６及び２倍濃度の５ＳＣ（ＳＳＣ：１１２当たりＮａＣ１１７，５３ｇ、＜えん酸ナトリウム８．８２ｇ、ｐＨ７，０）で飽和された９８７２３ＭＭ紙の上に１ないし２分装置いた後、８０℃ の真空オーブン中で約２時間乾燥した。

乾燥が終了した後、フィルターを室温で５００ｍ１の３倍濃度のＳＳＣ／領　１％ＳＤＳ溶液で３ないし４回洗浄して、６５℃で同一溶液で２時間洗浄した。フィルターを各々予備ハイブリダイゼーション形成溶液［６Ｘ　ＳＳＣ。

５ｘ　デンハルト溶液（ＩＩ２当たりフィコール０．２ｇ、ポリビニルピロリドン０．２ｇ、ＢＳＡ　０．２ｇ）、０．０５％　ビロリン酸ナトリウム、１００ μｇ／ｍｌの煮た蝕精液　ＤＮＡ、０．５％５ＤＳＩ　５００ｍ１中、３７℃で１時間予備ハイブリダイズさせ、フィルターを再びハイブリダイゼーション溶液（６倍濃度ＳＳＣ、デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｉ酵母　ｔＲＮＡ、０．０５％　ビロリン駿ナトリウム）へ移した後、■Ｐで標識されたＰ６５２ａとＰ６５２ｂの各々３０ｎｇを添加して、４８℃で約２４時間ハイブリダイゼーションを行った。

前記で用いられたプローブは次のように標識した。プローブ３２ｎｇ。

７．５４ｔｌ（７）１００倍濃Ｔ４キナーゼ緩衝液（０，５ＭトリＸ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０，１Ｍ　ＭｇＣ１ｇ　、５０ｍＭ　ＤＴＴ、０．５μｇ／ｍｌ　Ｂ　ＳＡ）、１００μＣｉ（γ−”Ｐ）ＡＴＰおよび５０単位のＴ４ヌクレオチドキナーゼを蒸留水に加えて総量７５μｌにした。キネーシ目ン反応は３７℃で３０分間行った。

ハイブリダイゼーションの完了後、フィルターを室温で６倍濃度の５ＳＣ１０，０５％ビロリン酸ナトリウム溶液で１０分間５回、６０℃で同一溶液で３０分間１回洗浄した。ガイガー計数管（Ｌｕｄｌｕｍ　Ｍｏｄｅｌ　１３）で計数することによって、十分な洗浄が認めるまで洗浄溶液の温度を約２℃ずつ上昇させながら、約１５分間洗浄した。洗浄したフィルターを一７０℃で２４ないし４８時間、Ｘ−線　フィルム（Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＡＲ）に暴露させた。

陽性と認められたプラークを前記と同様な方法によりスクリーニングして単一ファージプラークを選別した。

得られた陽性プラークから二本鎖ファージミドと一本鎖ファージミドを作製して、実施例（１−Ｃ）と同様な方法でヌクレオチド配列を決定した。

ＫＨＣＶ６５２と重なり合っているｃＤＮＡクローンを各々ＫＨＣＶ７５２とＫＨＣＶ６７５と命名し、これらの長さ、位置、ヌクレオチド配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示した。

（１−Ｄ−２）：ＫＨＣＶ４２６と重なり合ているｃＤＮＡの単離実施例（１− Ｃ）から得られたＫＨＣＶ４２６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチドＰ４２６ａ　（５’　−ＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡ、ＣＣ−３°）とＰ４２６ｂ　（５°−ＣＧＴＡＡＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＣＴＣ−３”　）を合成した。このオリゴ−ヌクレオチドＰ４２６ａとＰ４２６ｂをプローブとして用いて、前記実施例（１− Ｄ−１）と同様な方法によりプラークハイブリダイゼーションを行なった。ＫＨＣＶ４２６と重なり合っているｃＤＮＡクローンを実施例（１−Ｃ）と同様な方法により検出して、ＫＨＣＶ２４０と命名し、その長さ、位置およびヌクレオチド翫ｌりとこれによりコード化されるアミノ酸配列は図１ないし図３に示した。

（１−Ｄ−３）：ＫＨＣＶ２４０と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−２）から得られたＫＨＣＶ２４０のヌクレオチド配列、ＫＨＣＶ２４０からオリゴヌクレオチドＰ２４０ｂ　（５°−ＧＴＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡ−３’　）を合成した。このオリゴ−ヌクレオチドＰ２４０ｂをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）で製造したｃＤＮＡライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。その結果、ＫＨＣＶ２４０と重なり合っている約１１０個のヌクレオチド配列を含有するｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ　５１３と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ　５１３のヌクレオチド配列、位置及び長さとそれにコードされたアミノ酸配列は図１ないし図３に示した。

（１−Ｄ−４）：ＫＨＣＶ５１３と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−３）から決定されたＫＨＣＶ５１３のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴ−ヌクレオチドＰ５１３ｂ　（５°−ＣＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧ−３’　）を合成した。このオリゴ−ヌクレオチドＰ５１３ｂをプローブとして用いて実施例（１−Ｂ）から得られたｃＤＮＡライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。ＫＨＣＶ５１３と重なり合っているヌクレオチドの１３０ｂＰを含有する８１０ｂｐのｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ８１０と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガ一方法で決定した。ＫＨＣＶ　８１０の長さ、位置およびヌクレオチド配列とそれによりコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

（１−Ｄ−５）：ＫＨＣＶ８１０と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−４）で決定されたＫＨＣＶ８１０のヌクレオチド配列に基づイテ、オリゴ −ヌクレオチドＰ８１０ｂ（５°−ＡＡＡＴＧＡＧＡＣＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＡＣ−３’　）を合成した。このオリゴーヌクレオチドｐｓｉｏｂをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）で得られたライブラリヲ実施例（ｔ −Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。その結果、ＫＨＣＶ８１０と重なり合っているヌクレオチド約６５ｂｐを有するｃＤＮＡクローンなＫＨＣＶ７９８と命名し、そのヌクレオチド配列なサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ　７９８の長さ、位置およびヌクレオチド配列とＫＨＣＶ７９８によりコードされるアミノ酸配列を図１ないし図３に示す。

（１−Ｄ−６）：ＫＨＣＶ４０３と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−５）で決定されたＫＨＣＶ４０３のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドＰ４０３Ａ　（５°−ＧＴＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＧＣＡＴ−３°）とＰ４０３Ｂ　（５−’　ＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴ−３°）を合成した。このオリゴ−ヌクレオチドＰ４０３ＡＪよびＰ４０３Ｂをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）から得られたライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。その結果、ＫＨＣＶ４０３と重なり合っているヌクレオチドの約１６０ｂｐを有するｃＤＮＡクローンなＫＨＣＶ９３２と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ９３２の長さ１位置及びヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

（１−Ｄ−７）：ＫＨＣＶ９３２と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−６）で決定されたＫＨＣＶ９３２のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴ −ヌクレオチドＰ９３２ｂ　（５°−ＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＧＡＡ−３°）を合成した。このオリゴヌクレオチドＰ９３２ｂをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）から得られたｃＤＮＡライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。

ＫＨＣＶ９３２と重なり合っているヌクレオチドの約１８５ｂｐを有するｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ４９６と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ４９６の長さ、位置及びヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

（１−Ｄ−８）：ＫＨＣＶ４９６と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−７）で決定されたＫＨＣＶ４９６のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドＰ４９６ｂ　（５°−ＣＧＴＧＴＡＴＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＴＧＡＣ−３’　）を合成し、た、このオリゴヌクレオチドＰ４９６ｂをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）で得られたライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。ＫＨＣＶ４９６と重なり合っているヌクレオチドの約１６０ｂｐを有する８４７ｂｐのｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ８４７と命名し、そのヌクレオチド１ＢＩＪをサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ　８４７の長さ、位置及びヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示した。

（１−Ｄ−９）：ＫＨＣＶ８４７と重なり合っているｃＤＮＡの単離実施例（１ −Ｄ−８）で決定されたＫＨＣＶ８４７の３°−末端のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドＰ８４７ｂ　（５°−ＴＧＣＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧ−３’　）を合成した。このオリゴヌクレオチドＰ８４７ａをプローブとして用いて、実施例（１−Ｂ）で製造されたｃＤＮＡライブラリを実施例（１−Ｄ−１）と同様な方法によりスクリーニングした。その結果、ＫＨＣＶ８４７と重なり合っているヌクレオチドの約９４ｂｐを有する４９４ｂｐのｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ４９４と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガーの方法により決定した。ＫＨＣＶ４９４の長さ、位置及びヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

（１−Ｅ）：ＰＣＲによるｃＤＮＡの作製（１−Ｅ−１）：ＫＨＣＶ７９８とＫＨＣＶ７５２間のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの作製ＫＨＣＶ７９Ｂ（７）３’　−末端とＫＨＣＶ７５２（７）５’末端間（７）ＨＣＶｃＤＮＡをクローン化するために、ＫＨＣＶ７９８の３゛−末端のヌクレオチド配列に基づいてプライマーＰ７９８ｂ　（５°−ＣＴＧＧＴＴＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＣ−３’　）　と、ＫＨＣＶ７５２（７）５°−末端ノヌクレオチド配列に基づいてＰ７５２ａ　（５’　−ＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＣＣＡＴ−３′）を合成した。これらプライマーＰ７９８ｂおよびＰ７５２ａと、ＲＡＮＰＳＨＣＶのプライマーを用いて実施例（１−Ｂ−１）で製造したｃＤＮＡライブラリを用いて参考例７のようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。反応の終了後、生成した混合物の一部を５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動（ＰＡＧＥ）してｃＤＮＡの増幅を確認した。残りの混合物にＤＮＡポリメラーゼの一種のフレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片の１０単位を加えた後、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートして両末端を平滑末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）とした。反応混合物をＰＡＧＩ、ＤＮＡを電気作用で溶出して純粋なりＮＡを分離した。精製されたＤＮＡ断片をファージＭ１３ｍｐ１８へクローン化してそのヌクレオチド配列を決定した。得られたＤＮＡをＫＨＣＶ５７０と命名し、このヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。　実施例（１−Ｄ−２）から得られたＫＨＣＶ２４０、実施例（１−Ｄ−３）から得られたＫＨＣＶ５１３、実施例（１−Ｄ−４）から得られたＫＨＣＶ８１０、実施例（１−Ｄ−５）から得られたＫＨＣＶ７９８及び前記から得られたＫＨＣＶ５７０が互いに部分的に重なり合って、一つの長いオーブンリーディングフレームを形成し、これをＫＨＣＶ２６６１と命名した。

（１−Ｅ−２）：ＫＨＣＶ４０３とＫＨＣＶ６７５間のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの作製実施例（１−Ｃ）から製造されたＫＨＣＶ４０３と実施例（１−Ｄ−１）から製造されたＫＨＣＶ６７５との間に残っているＨＣＶｃＤＮＡ断片をクローン化するために、ＫＨＣＶ６７５の３°−末端のヌクレオチド配列に基づいてプライマーＰ６７５ｂ　（５°−ＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＴＧＴ−３°）とＰ６７５ｂ重　（５°−ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＡＣ−３°）と、ＫＨＣＶ４０３の５− 。

末端のヌクレオチド配列に基づいてＰ　４０３　ａ　Ｉ　（５−’　ＣＣＣＣＣＴ　ＣＡ　Ｇ　ＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴ−３°）を合成した。実施例（１−Ｄ−６）から製造したＰ４０３ａと前記で製造したプライマーＰ６７５ｂ、Ｐ６７５ｂ、およびｐ４０３ａｉを用いて、次のようにＰＣＲを行った。

０．２μｇのＰ６７４ｂ、０．２μｇのＰ４０３ａ、無作為プライマーＲＡＮＰＳＨＣＶを用いて実施例（１−Ｂ−１）で製造した２ｕｌのｃＤＮＡ、１０μｍのｌＯ倍濃度ＰＣＲ緩衝液、１０μｍの２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物および２．５単位のＴａｑポリメラーゼの混合物に蒸留水を加えて、総量を１００μｌとした。

混合物を９５℃で２分→５５℃で２分→７２℃で３分のサイクルで１０回繰返して１次のＰＣＲを行った。この反応混合物にＰ６７５ｂ２２μｇとＰ４０３ａｔ　２μｇを添加した後、２次ＰＣＲを前記サイクルで２０回繰返し行なった。

反応の終了後、ｃＤＮＡの増幅を確認し、実施例（１−Ｅ−１）と同様の方法で、ｃＤＮＡの配列を決定した。得られたｃＤＮＡをＫＨＣＶ１７７４と命名し、このヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

（１−Ｅ−３）：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの３°−末端領域のクローン化及びそのヌクレオチド配列の決定ＨＣＶゲノムの３°−末端領域に相当するｃＤＮＡをクローン化するために、プライ’？　−ＲＡＮＰＳＨＣＶとＤＡ１７ＰＳＨＣＶ　（５−’　ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴＡｌ−３°）を用いて、次のようにＰＣＲを行った。

プライマーＰＳＨＣＶＳＬ、５−’　ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴ−３°は実施例（１−Ｂ−１）のプライマーＲＡＮＰＳＨＣＶまたはＤＡ１７ＰＳＨＣＶの２１個の固定ヌクレオチドとＳａｌ　Ｉ認識部位（５°−ＧＴＣＧＡＣ−３°）を含んでおり、一方、プライマーＫＨＣＶＲ６０，５′　−ＧＴＧＴＣＣＧＣＧＣＴＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＣ−３°は実施例（１−Ｄ−９）のＫＨＣＶ４９４の３°−末端領域のヌクレオチド配列から設計されたヌクレオチドを含む。プライマーＰＳＨＣＶとＫＨＣＶＲ６０を用いて、参考例７と同様な方法により１次ＰＣＲを行なった。

２次ＰＣＲにおいて、プライマーＫＨＣＶＲ６１（５−’　ＴＧＴＧＧＣＡＡＧＴＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧ−３°）を合成した。このＫＨＣＶＲ６１はＫＨＣＶ４９４の３°−末端領域のヌクレオチド配列に相補的な配列を含み、ＫＨＣＶＲ６０より３゛−末端側に片寄っている。

１次ＰＣＲから生成された混合物に１０μｌのＫＨＣＶ６１を加え、さらに２次ＰＣＲを参考例７と同様に行った。

反応の終了後、ｃＤＮＡの増幅を確認し、実施例（１−Ｅ−１）と同様な方法によりヌクレオチド配列を決定した。こうして得られた２６６個のヌクレオチドを有するｃｌ）ＮＡをＫＨＣＶ２６６と命名した。ＫＨＣＶ２６６の位置およびヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図１ないし図３に示ｉ６Ｋ　ＨＣＶ　２６６のヌクレオチド配列において、２つの終止コドンを見出したが、ｐｏｘｙ（Ａ）十の尾部は確認できなかった。

（１−Ｅ−４）：ＫＨＣＶ　ｅＤＮＡの５°−末端領域のクローン化おＪひヌクレオチド配列の決定実施例（１−Ｃ）で製造したＫＨＣＶ４２６の５゛−末端ヌクレオチドに基づイテブライ？−ＫＨＣＶＩ、６９　（５’　−ＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ａ　ＣＧ　−３°）を用いて、実施例（１−Ｂ− １）と同様な方法で一本鎖ｃＤＮＡをｆ’１ＥｔＪした。これから生成された混合物５０１ノｌをＩ　Ｉｎ　ｌのＴＥｆｔｉｉｌＴｉｆｆｌ　（ｌ　ＯｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１，ｍｍ　ＥＤＴＡ）で稀釈した。セントリコン１００　（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００、Ａｍｌｅｏｎ社製、Ｉ）、Ｓ、Ａ、、＃４２００）を用いて１０ｕ１に濃縮して、残留プライマーおよびｄ、　Ｎ　Ｐ　Ｔを除去した。

その後、ポリｄ　（Ｔ）の尾またはポリｄ　（Ｇ）の尾−付加ｃＤＮＡの製造のため、４μｌの５倍濃度プーリング緩衝液（０，５Ｍ　カコジル酸カリウム１ｐＨ７，２，１０ｍＭ　ＣｏＣ１ａ、１ｍＭ　ＤＴＴ）、４μｌの１ｍＭｄＴＴＰ（または４μｍのｌｒｒ＋ＭｄＧＴＰ）と１０単位の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＢＲＬ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８８００８５Ｂ）および蒸留水を前記のｃＤＮＡ溶１ｉＪｉｌｏμｍに添加して総容量５０ｕｌになるように加えた。反応混合物を３７℃で３０分間放！した後、６５℃で５分間加熱した。

ポリｄ　（Ｔ）　”の尾付加ｃＤＮＡ　（またはポリｄ　（Ｇ）の尾付加ｃＤＮＡ）を実施例（１−Ｃ）から製造したＫＨＣＶ４２６のヌクレオチド配列から設計されたプライマーＫＨＣＶＬ７０　（５”　−ＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴ−３’　）（またはｄＣ１２ＲＩＲＯ：　５’　−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ　（Ｃ）、、−３°）、ｄＴ１７ＲＩＲＯ（５’　ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ　（Ｔ）、、−３ °）、ＲＯ（５“−ＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＴ−３°）およびＲ１（５’　−ＧＡＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ−３”）を用いてＰｃＲで増幅シタ。

ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａ溶１７Ｖ２１Ｊ、１に５μ、１の１００倍濃Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，５００ｍＭ　ＫＣＩ、１５ｍＭＭｇＣ１ｘ　、０．１％ゼラチン）、５μｌの１．５ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、２、ＯＩＪ、ｇ（７）ＫＨＣＶｉ−６９および２．０μｇ（７）ｄＴ１７ＲＩＲｏおよび蒸留水を加えて、最終容量を５０ｕｌとしたにの混合物を９５℃で７分間加熱した後、７５℃に冷却した。これに２．５単位のＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを加Ａ２、溶液蒸発の防止のために、３０ｕ、ｌの鉱油を添加した。この反応混合物を２分間４５℃に冷却して、プライマーを一本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと相補的に結合させた後、さらに７２℃へ上げて２２分間反応させた。次に１次ＰＣＲを９５℃で４５秒−→５０℃で２５秒−７２℃で２分間のサイクルを３０回繰返し、最後に７２℃で１５分間行った。

この反応混合物１０ｇ１にプライマーＲＯ（またはＲ１）２μｇおよびＫＨＣＶＬ７０　２ａｇを加えた後、前記と同じサイクルを３０回繰返し、２次Ｉ）　ＣＲを実施した。反応終了後、３８０ｂｐを有するｅＤＮＡの増幅を確認し、実施例（１−Ｅ−１）と同様な方法で、そのヌクレオチド配列を決定した。得られたｃＤＮＡクローンをＫＨＣＶ３６６と命名し、ＫＨＣＶ　３６６（７）位置およびヌクレオチド配列とこれからコードされたアミノ酸配列は図１ないし図３に示す。

実施例１で得られたＫＨＣＶ　ｃＤＮＡクローンを９３７２個のヌクレオチドを有する全長のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡに連結し、全長のｃＤＮＡはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩと命名し、これを１９９１年５月１４日付にＡＴＣＣに寄託番号７５００８号として寄託した。

実施例２：ＨＣＶサブタイプｃＤＮＡの作製（２−Ａ）：ＲＮＡの抽出韓国人Ｃ型肝炎患者１３名を対象として血清１００ｕｌずつを採血（試料＃２、試料　＃３、試料　＃２ｏ、試料　＃２１、試料　＃２３、試料＃２５、試料　＃２６、試料　＃２７、試料　＃２８、試料　＃２９、試料＃３０、試料　＃３１および試料　＃３２）して３００ＬＬｌのＲＮＡｚｏｌＢ（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ；Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　１４２１゜Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘａｓ　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を加えて細胞を破壊させ、前記の実施例（１−Ａ＞と同様な方法でＫＨＣＶ　ＲＮＡを抽出した。

１３個の試料カラ抽出されたＫＨＣＶ　ＲＮＡを各々、ＬＢＣ２、ＬＢＣ３、Ｌ、　Ｂ　Ｃ２０、ＬＢＣ２１、ＬＢＣ２３、ＬＢＣ２５、ＬＢＣ２６、ＬＢＣ２７、ＬＢＣ２８、Ｌ、　Ｂ　Ｃ２９、Ｌ　Ｂ　Ｃ３０、ＬＢＣ３１およびＬＢＣ３２と命名した。

（２−Ｂ）：ｅＤＮＡの作製実施例（２−Ａ）から得られたＫＨＣＶＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素のためのプライマーとして、無作為プライマー（５°−ＮＮＮＮＮＮ−３”　、ここでＮは同じであるか異なってよく、Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣが同化で混在する）を用い、実施例（１−Ｂ−１１と同様な方法でｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを各々ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２１ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２３ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２５ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２６ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ− ＬＢＣ２７ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２８ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２９ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３１ｃＤＮＡおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３２ｃＤＮＡと命名した。

（２−Ｃ）：ＰＣＲによるＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの増幅（２−Ｃ−１）ニプライマーの設計ＨＣＶ　ｃＤＮＡのＮＳ２領域とＮＳ５領域の増幅用のためのプライマーは、加藤らにより報告された日本型のヌクレオチド配列（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８７．９５２４−９５２８　（１９９０）＋Ｔａｋａｍｉｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、。

６５．１１０５−１１１３　（１９９１））とチョーらにより報告された米国型のヌクレオチド配列（Ｃｈｏｏ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４，３５９ −３６３　（１９８９））および前記実施例１から作製したＫＨＣＶ−ＬＢＣＩのヌクレオチド配列に共通に存在する領域から設計された。上記で製造されたヌクレオチドの位置はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩのヌクレオチド配列を基準として番号を付けた。

ＨＣＶｃＤＮＡのＮＳ２領域の増幅用プライマーＮ５２Ｓ１　（５°−ＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＴＧ−３’　）はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの２７７６番目から２７９５番目までのヌクレオチド断片の鎖に相当し、Ｎ５２Ｎ１　（５ °−ＡＣＣＴＧＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴ−３”　）　はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ（７）３１８０番目から３１５７番目までのヌクレオチド断片の相補的な鎖に相当するが、これをＨＣＶｃＤＮＡのＮＳ２領域を増幅するための１次ＰＣＲに用いた。Ｎ５２Ｓ２　（５°−ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＣＴＧＧＴ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの２８０３番目から２８２２番目までのヌクレオチド断片の鎖に相当し、これは、容易なりローン化のためのＢａｍＨＩ認識部位を有して；Ｎ５２Ｎ２　（５’　−ＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＧＧＡＣ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの３１５９番目から３１４２番目のヌクレオチド断片の相補的な鎖に相当し、これは容易なりローン化のために、５°−末端にＳａｌ　Ｉの認識部位を有している。これらＮ５２Ｓ２およびＮ５Ｓ２Ｎ２は２次ＰＣＨに用いられる。

ＨＣＶ　ｃＤＮＡのＮＳ５領域の増幅用プライマーＮ５５Ｓ１　（５°−ＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧ（Ｔ／Ｃ）ＴＴＴＧＡ−３°ここで、Ｔ／Ｃはヂミンとシトシンが１：１で混在することを意味する）の１０番目ヌクレオチド（ＮＳ５Ｓ１は５゛末端から起算される）から３°末端まではＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの８２５２番目から８２７３番目までのヌクレオチド断片のヌクレオチド配列である。Ｎ３５Ｎ１　（５’　−ＣＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡ−３’　）において、９番目ヌクレオチドから３゛末端までのヌクレオチド配列は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの８６３５番目から８６１４番目のヌクレオチド断片の相補的な鎖に相当する。プライマーＮ３５Ｎ１はＮＳ５領域の増幅のための１次ＰＣＨに用いられる。

一方、Ｎ５５Ｓ２　（５°−ＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡ　（Ｔ／Ｃ）ＧＡＣＡＴ−３’　、ここで、Ｔ／Ｃは前記定義した通りである）において、１２番目ヌクレオチドから３′末端までのヌクレオチド配列は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの８２７８番目から８２７９番目のヌクレオチド断片の鎖に相当し、Ｎ５５Ｓ２はその５°末端にＢａｍＨＩ認識部位を有している。プライマーＮ５５Ｓ２は２次ＰＣＨに用いられる。

前記のプライマーなどは自動化固相ホスホアミダイト化学（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いるＤＮＡ合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、Ｍｏｄｅ１３８０　Ｂ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）で合成した０合成されたプライマーを変性ポリアクリルアミドゲル（２Ｍ　尿素、１２％アクリルアミド；５０ｍＭ　トリス中のビスアクリルアミド（２９：　１．ｗ／ｗ）、５０ｍＭ　ホウ酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡＮａｇ）を用いた電気泳動で分離した後、５０：５０　（ｖ／ｖ）のアセトニトリルと水の混合液を溶出剤として用いてＣＩ８カラムクロマトグラフィー（ＳＥＰＡＫ：Ｗａｔｅｒｓ　Ｉｎｃｌ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　）で精製した。各プライマーの濃度を２６０ｎｍでの０．Ｄ、値により決定した。

（２−Ｃ−２）：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡのＮＳ２領域の増幅のためのＰＣＲ１次ＰＣＲを次の通りに実施した。実施例（２−Ｂ）から得られたＫＨＣＶ−ＬＢＣ２ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２１ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２３ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２５ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２６ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２７ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２８ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ　−ＬＢＣ２９ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ −ＬＢＣ３０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３１ｃＤＮＡおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３２ｃＤＮＡを各々５μｍずつに１０ｍ１のＩＯＸ　Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，５００ｍＭ　ＨＣＩ、１５ｍＭＭｇＣ１２，０，１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン）、１０ｔＬｌの２ｍＭｄＮＴＰ混合液、０．２μｇのＮ５２ＳＬ、０．２μｇのＮ３２Ｎ１および０．５μｍのＡｍｐｌ、１Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）および蒸留水を加えて、最終容量を１００μｌとした。ここに溶液の蒸発を防止するため、５０μｌの鉱油を添加した。９５℃で２分→５５℃で２分−７２℃で３分間の加熱サイクルを４０回繰返して１次ＰＣＲを実施した。

２次ＰＣＲは１次ＰＣＲ産物１ｍｌと２μｇのＮ５２Ｓ２／Ｎ５２Ｎ２プライマーを用いて２５回繰返すことによって行った。

反応混合物の各々を同量のフェノール／クロロホルムと混合し、残留酵素を除去くため遠心分離した。上澄液の各々に０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２５倍容量の無水エタノールを加え、遠心分離して３４０ｂｐの二本鎖ＤＮＡを得た。

１３個の他の鋳型から得たＤＮＡ断片を各々Ｎ５２−ＬＢＣ２、Ｎ５２−ＬＢＣ３、Ｎ５２−ＬＢＣ２０、Ｎ５２−ＬＢＣ２１、Ｎ５２−ＬＢＣ２３、Ｎ５２− ＬＢＣ２５、Ｎ５２−ＬＢＣ２６、Ｎ５２−ＬＢＣ２７、Ｎ５２−’ＬＢＣ２８、Ｎ５２−ＬＢＣ２９、Ｎ５２−ＬＢＣ３０、Ｎ５２−ＬＢＣ３１及びＮ５２− ＬＢＣ３２と命名した。

（２−Ｃ−３）：ＨＣＶ　ｃＤＮＡのＮＳ５領域の増幅のためのＰＣＲ１次ＰＣＲ用プライマーとしてＮ５５Ｓ１とＮ３５Ｎ１を、また２次ＰＣＲ用プライマーとしてＮ５５Ｓ２とＮ５５Ｎｌを用いて、実施例（２−Ｃ−２）と同様に実施して、３２０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

ＰＣＲの結果、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２１ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２３ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２５ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ− ＬＢＣ２６ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２７ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２８ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ２９ｃＤＮＡ、に、ＨＣＶ−ＬＢＣ３０ｃＤＮＡ、ＫＨＣＶ−ＬＢＣ３１ｃＤＮＡおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ３２ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ断片を各々、Ｎ５５−ＬＢＣ２０，Ｎ５５−ＬＢＣ２１、Ｎ５５−ＬＢＣ２３、Ｎ５５−ＬＢＣ２５、Ｎ５５−ＬＢＣ２７、Ｎ５５−ＬＢＣ２８、Ｎ５５−ＬＢＣ２９、Ｎ５５−ＬＢＣ３０，Ｎ５５−ＬＢＣ３１およびＮ５５−ＬＢＣ３２と命名した。

これら断片の各々を、Ｓａｌ　ＩとＢａｍＨＩにより切断した後、Ｍ１３ｍｐ１９にクローン化した後、サンガーの方法によりヌクレオチド配列を決定した。各ヌクレオチド配列は各々図７ないし図２６に示した。

実施例３：酵母内でＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の発現のためのベクターの作製（３ −Ａ）：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の増幅（３−Ａ−１）：断片に３８４．に５１０．に５７３．に８９７．　Ｋ４ｏ３およびに５９０の作製〈段階１〉前記の実施例（１−Ｃ）、（１−Ｄ）および（１−Ｅ）でクローン化されたＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片をユビキチン遺伝子と連結させて（以下、ユビキチン遺伝子とＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片が連結された遺伝子を“ＵＢ−ＫＨＣＶ’　と命名する）、これを酵母発現ベクターにクローン化するために、次のようなプライマーを合成した。

プライマーＰＣＯＲＥＵＢＩ　（５’　−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ−３°）は５゛− 末端領域の２５個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の３°−末端領域と重なり合っており、残りのヌクレオチドはＫ　ＨＣＶ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの３４３番目から３６０番目の領域に相当する。

プライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ１４　（５°−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣ−３’　）は７２６番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンとＳａｌ　Ｉ認識部位を有している。

プライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ１７　（５°−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡ−３°）は８５２番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンとＳａｌ　Ｉ認識部位を有している。

プライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ２２　（５′−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＧＣＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡ−３’　）は９１５番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンとＳａｌ　Ｉ認識部位を有している。

プライマーＰＫ４０３ＵＢＩ　（５°−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＡＣＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡ−３°）は、ＰＣＯＲＥＵＢＩと同一である５°−末端領域に２５個のヌクレオチドを有し、残りのヌクレオチドはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの６６４９番目のヌクレオチドから翻訳が開始されるように設計されている。

プライマーＰＫ５７３ＵＢＩ　（５°−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡ−３°）は、ＰＣＯＲＥＵＢＩと同一である５゛−末端領域に２５個のヌクレオチドを有し、残りのヌクレオチドはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの７６１２番目のヌクレオチドから翻訳が開始されるように設計されている。

ブライｖ−ＰＫ４０３ＳＡＬ　（５’　−ＧＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＧＴＴ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ（７）７０５０番目の直後に翻訳が終止するように設計されており、Ｓａｌ　Ｉ認識部位と二つの終止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）を含む。

プライマーＰＫ８９７ＵＢＩ　（５’　−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧ−３°）は５°−末端領域にＰＣＯＲＥＵＢＩと同じ２５個のヌクレオチドを有し、残りのヌクレオチドはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの３９１６番目のヌクレオチドから翻訳が開始されるように設計されている。

プライマーＰＫ８９７ＳＡＬ　（５’　−ＧＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡＴＣＡＣ−３’　）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの４７１３番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように設計されており、Ｓａｌ　Ｉ認識部位と二つの終止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）を含む。

プライマーＰＫ５７３ＳＡＬ　（５°−ＧＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＧＧＡＧ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ（７）８１８４番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように設計されており、Ｓａｌ　Ｉ認識部位と３°−末端領域に二つの終止コドン（ＴＡＡＴＡＧ）を含む。

プライマーＰ４２６Ｂ　（５’　−ＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌ（＋）６１６番目から６３６番目ノヌクレオチドノ領域からなっている。

プライマーＰ２４０Ｂ　（５’　−ＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧＣＣＧＴ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの８４２番目から８２１番目のヌクレオチド領域）からなっている。

プライマーＰ６５２Ｂ　（５°−ＧＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＣＡＡＡＧ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ（７）４５２３番目から４５６０番目のヌクレオチドの領域からなっている。

プライマーＰ４０３Ｂ　（５°−ＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの７０１２番目から７０３９番目のヌクレオチドの領域からなっている。

〈段階２〉互に重なり合ってい６ＫＨＣＶ４２６、ＫＨＣＶ２４０およびＫＨＣＶ５１３の３つクローンから次のように一本鎖ｃＤＮＡ断片を作製した。まず、ＰＣＯＲＥＵＢＩ　２゜Ｏｕ、ｇ、Ｐ４２６Ｂ　０．０２μｇ、Ｐ２４ＯＢ２ｕｇおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ　ＤＮＡ　５０μｇ（７）混合物に１０ｕｌ（７）Ｎ。

倍Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物および２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加えた後、蒸留水を加えて総容量を１００μｌとした。次に、前記の参考例７のように加熱サイクルを２５回繰り返して１次ＰＣＲを行った。得られた混合物を、５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動により５００ｂｐのＰＣＲ産物（以下、　’ＰＣＲ産物Ａ°と称する）を単離した。その後、鋳型として、前記ＰＣＲ産物Ａ（７）５０μｇとＫｌ（ＣＶ−ＬＢＣＩＤＮＡ　５０μｇを用い、プライマーとしてＰＣＯＲＥＵＢＩ　２μｇおよびＰＳＡＬＣＯＲＥ２２　２μｇを用いて、前記１次ＰＣＲと同一な条件下で２次ＰＣＲを行った。得られた混合物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して５８０ｂｐの最終産物（以下、　’ＰＣＲ産物Ｂ°と称する）を単離して、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

〈段階３〉前記の段階２から得られたＰＣＲ産物Ｂを鋳型として更にＰＣＲを行うために、３つの異なった試験管を作成した。即ち、ＰＣＯＲＥＵＢＩ　２μｇとＰＳＡＬＣＯＲＥ１４　２μｇを含有する試験管Ａ、ＰＣＯＲＥＵＢＩ　２μｇとＰＳＡＬＣＯＲＥ１７　２μｇを含有する試験管Ｂ、ＰＣＯＲＥＵＢＩ　２μｇとＰＳＡＬＣＯＲＥ２２　２μｇを含有する試験管Ｃの各々に、５０μｇのＰＣＲ産物Ｂを加Ａた。　一方、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ　ＤＮＡを鋳型トシタＰＣＲのために、異なった他の試験管、即ち、ＰＫ８９７ＳＡＬ２μｇ、Ｐ６５２Ｂ０．０２μ ｇおよびＰＥ２ＣＵＢＩ　２μｇを含有する試験管Ｄ、ＰＫ４０３ＳＡＬ２μｇとＰＥ２ＣＵＢＩ　２μｇを含有する試験管Ｅ、ＰＥ２Ｃ３ＡＬ　２μｇ、Ｐ４０３Ｂ　０．０２２μｇとＰＫ５７３ＵＢＩ２μｇを含有する試験管Ｆに、各々５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣＩを加えたものを作成した。

その後、試験管ＡないしＦの各々に１０μｌの１０倍Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１０ＬＬｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合液および２５単位のＴａｑを加え、それに蒸留水を加えて総容量を１００μｌとした。前記段階２と同様の条件でＰＣＲを行った。

く段階４〉前記の段階３から得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、試験管Ａでは３８４ｂｐのＤＮＡ断片が、管Ｂでは５１０ｂｐのＤＮＡが、管Ｃでは５７３ｂｐのＤＮＡが、管りでは８９７ｂｐのＤＮＡが、管Ｅでは４０３ｂｐのＤＮＡが、管Ｆでは５９０ｂｐ（７）ＤＮＡが増幅された。

前記と同一条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離精製したＤＮＡ断片を、各々断片に３８４、Ｋ５２０、Ｋ５７３、Ｋ８Ｏ７、Ｋ２Ｏ２、Ｋ２Ｏ２と命名した。

（３−Ａ−２）：ＫＨＣＶ　外膜蛋白をコードするｃＤＮＡ断片の作製〈段階ｌ〉ＫＨＣＶ　ＬＢＣＩの１５１０番目なレル２０１０番目のヌクレオチド領域と２０１１番目ないし２５２９番目のヌクレオチド領域に各々相当するＥ２Ｎ遺伝子とＥ２Ｃ遺伝子を各々、合成されたユビキチン遺伝子に連結し、かつこれらを酵母の発現ベクターにクローン化するために、次のようなプライマーを合成した。

ブライｖ−ＰＥ２ＮＵＢＩ　（５°　−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＧＣＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＣＧＣＴ−３’　）は５− 末端領域の２５個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の３°−末端領域と重なり合っており、残りのヌクレオチドはＫＨＣＶ　ＬＢＣＩの１５１０番目から１５３０番目のヌクレオチドに相当する。

ブライｖ−ＰＥ２ＮＳＡＬ　（５°−ＧＡＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの２０１０番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンを有しており、かつＳａｌ　Ｉ認識部位を有している。

ブライｖ−ＰＥ２ＣＵＢＩ　（５°−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡ−３°）は５−末端領域の２５個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の３°−末端領域の２５個のヌクレオチドと重なり合っており、残りのヌクレオチドはＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの２０１１番目から２０３１番目のヌクレオチド領域に相当する。

ブライＶ−ＰＥ２ＣＳＡＬ　（５’　−ＧＡＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧ−３’　）は、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの２５２９番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンを有しており、かつＳａｌ　Ｉの認識部位を有する。

く段階２〉試験管ＡにはＰＥ２ＮＵＢＩ　２μｇおよびＰＥ２ＮＳＡＬ　２μｇを、試験管ＢにはＰＥ２ＣＵＢＩ　２μｇおよびＰＥ２Ｃ３ＡＬ　２μｇを入れた。各々の試験管ＡとＢにＫＨＣＶ−ＬＢＣＩ　５０μｇ、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｍの１０ｒｎＭ　ｄＮＴＰａ合物および２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、これに蒸留水を加えて最終容量を１００μｌとした。参考例７と同様な加熱サイクルを２５回繰り返してＰＣＲを実施した。

く段階３〉前記の段階２から得られたＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その結果、試験管Ａでは５００ｂｐのＤＮＡが、試験管Ｂでは５２０ｂｐのＤＮＡがそれぞれ増幅されたことを確認した。前記と同一な条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＤＮＡを精製して、各々、断片Ｅ２Ｎと断片Ｅ２Ｃと命名した。

（３−Ｂ）：酵母用発現ベクターの作製（３−Ｂ−１）＋ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ− ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ　１７、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ　２２、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ　４０３およびｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ− ＵＢ−ＫＨＣＶ　５７３の作製プラスミドｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＨＧＨ（ＡＴＣＣ７４０７］、）２μｇをＮＥＢ緩衝液３中でＰｓｔ　ＩとＳａｌ　Ｉにより完全に切断し、同一のプラスミド２μｇを参考例１のＮＥＢ緩衝液４中でＰｓｔ　ＩとＳａｃ　ＩＩにより完全切断した。生成混合物を０．７％アガロースゲル電気泳動して、９．８４Ｋｂ断片と３．４Ｋｂ断片を分離して、各々断片ＰＬ２、断片ＰＴ２と命名した。

実施例（３−Ａ−１）から得られたに３８４、Ｋ５１０．に５７３、Ｋ９８７、Ｋ２Ｏ２およびに５９０の断片中、断片に８９７、Ｋ２Ｏ２およびに５９０をＮＥＢ緩衝液３中でＳａｌ　ＩとＳａｃ　ＩＩにより完全に切断し、断片に３８４、Ｋ５１０およびに５７３はＮＥＢ緩衝液３中でＳａｌ　Ｉにより完全に切断した。これら産物をフェノール／クロロホルムで抽出しエタノールで沈降させた後、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶した。断片に３８４、Ｋ５１０およびに５７３をＮＥＢ緩衝液４中で１０分間Ｓａｃ　ＩＩによりさらに部分切断した後、これら産物をフェノール／クロロホルムで抽出してエタノールで沈降させた後、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。　前記断片を用いて次のように連結反応を行った。連結反応試験管Ａには１１００ｎの断片に３８４を、連結反応試験管Ｂには１１００ｎの断片に５１０を、連結反応試験管ＣにはＬＯＯｎｇの断片に５７３を、連結反応試験管りには１１００ｎの断片に８９７を、連結反応試験管Ｅには１１００ｎの断片に４０３を、連結反応試験管Ｆには１１００ｎの断片に５７３を入れた。各試験管に１１００ｎの断片ＰＬ２、ｉｌｏｏｎの断片ＰＴ２．２μｌの１０倍連結反応緩衝液、１０単位の７４　ＤＮＡリガーゼを加えた後、最終容量が２０μｌになるように蒸留水を加えた。連結反応を１６℃で１２時間実施した。

各々の連結されたベクターを大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４）に形質転換させた。

Ｋ３８４−含有ベクターを分離してｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４と、Ｋ５１〇−含有ベクターを分離してｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１７と、Ｋ５７３−含有ベクターを分離してｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ２２と、Ｋ８Ｏ７−含有ベクターを分離してｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７と、Ｋ２Ｏ２−含有ベクターを分離してｐ　Ｙ　Ｌ　Ｂ　Ｃ−Ａ／Ｇ　− ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３と、Ｋ５９〇−含有ベクターを分離してｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ５７３と命名した（図３０参照）。

（３−Ｂ−２）：ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２ＮおよびｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ −ＵＢ−Ｅ２Ｇの作製プラスミドｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＨＧＨ（ＡＴＣＣ７４０７１）２μｇをＮＥＢ緩衝液３中でＰｓｔ　ＩとＳａｌ　Ｉにより完全に切断し、同一プラスミド２μｇをＮＥＢ緩衝液４中でＦ’ｓｔ　ＩとＳａｃ　ＩＩにより完全切断した。生成された混合物を０．７％アガロースゲル電気泳動して、９．８ｋｂと３．４ｋｂ断片を各々分離して、各々断片ＰＬ２と断片ＰＴ２と命名した。

実施例（３−Ａ−２）から得られた断片Ｅ２ＮとＥ２ＣをＮＥＢ緩衝液４中でＳａｃ　ＩＩで完全に切断した後、さらにＮＥＢ緩衝液３中でＳａｌ　Ｉで部分切断した。各産物をフェノール／クロロホルムで抽出しエタノールで沈降させた後、２０μｍのＴＥ緩衝液に溶解した。これを各々断片Ｅ２Ｎ−Ｔ２／Ｌと断片Ｅ２Ｃ−７２／Ｌと命名した。

連結反応試験管Ｇには１１００ｎの断片Ｅ２Ｎ−Ｔ２／Ｌを、試験管ＦにはＬＯＯｎｇの断片Ｅ２Ｃ−Ｔ２／Ｌを加えた。各試験管にＬＯＯｎｇのＰＬ２．１１００ｎのＰＴ２．２μｌの１０倍連結反応緩衝液および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、蒸留水で最終容量を２０μｌとした。１６℃で１２時間反応させた。連結された各ベクターで大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換させた。断片Ｅ２Ｎ−７２／Ｌ＝含有ベクターをｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ −Ｅ２Ｎと、Ｅ２Ｃ−Ｔ２／Ｌ−含有ベクターをｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｇと命名した（図３０参照）。

（３−Ｃ）：酵母の形質転換および蛋白の産生前記実施例（３−Ｂ−２）から作製した発現ベクターを用いて、参考例５と同様な方法で酵母を形質転換させた。

形質転換された酵母中、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３により形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣ０４（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３）は寄託番号ＡＴＣＣ７４０７９として、１９９１年６月２７日付国際寄託され、ｐＹＬＢＣ− Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４により形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＤｃ　０４　（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣ０４−ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４）は寄託番号ＡＴＣＣ７４０８１として１９９１年７月１日付国際寄託され、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｃで形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣ０４（Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣ０４−ＵＢ−Ｅ２Ｃ）は寄託番号ＡＴＣＣ７４１１７として１９９１年１２月１日付ブダペスト条約下の国際寄託機関であるＡＴＣＣに国際寄託された。

形質転換された酵母中、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓＬａｅＤＣ０４−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３を３ｍｌのロイシン欠乏培地（培地１２当りアミノ酸非含有酵母窒素源（Ｄｉｆｃｏ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）６．７ｇとロイシン欠乏アミノ酸混合物０．２５ｇおよび５％グルコース含有）中、３０℃で一夜培養した。この培養物をｌｏＯｍｌのＹＥＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）に接種して３０℃で一夜培養してＫＨＣＶ　蛋白を得た。

得られた培養物は、６５０ｎｍでのＯ，Ｄ、値かで２５であった。他の形質転換された酵母を前記と同様に培養して、ＫＨＣＶ蛋白を産生した。

各培養物から１０のＯ，Ｄ、　ａｔ。値に相当する量を収取し、遠心分離した。

各沈降物を４００μｌの緩衝液（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　ＰＭＳＦ　（フッ化フェニルメチルスルホニル）、８Ｍ　尿素）に懸濁して、同量のガラスピーズ（直径０．４ｍｍ）と共に振盪させて細胞壁を破壊した。得られた酵母抽出物をラムリの方法（Ｌａｅｍｍｌｆ。

ｅｔ、ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２７７．６８０　（１９７０））によって１５％ソジウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）させた後、コマシ・ブリリント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）Ｒ２５０で染色してＫＨＣＶ蛋白が産生されたことを確認した（図３１−Ａ参照）。

ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルターにブロッチングした。

このフィルターを０．２％ツイーン−２０を含有するＰＢＳ　（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７，０，０，１５Ｍ塩化ナトリウム）に入れて、室温で２時間振盪してＩｇＧの蛋白に対する非特異的結合を遮断した。０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳを２００倍容量で用いて、韓国人Ｃ型肝炎患者の血清からアフェニティークロマトで分離したＩｇＧ　（８，２ｍｇ／ｍｌ）を１：２００に希釈して製造したＩｇＧ１液中に入れて、室温で１時間弱（揺りながら蛋白とＩｇＧとを反応させた。０．２％ツイーン−２〇−含有ＰＢＳにより５分ずつ４回フィルターを洗浄した。このフィルターを、０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン−２０を含有する２００倍容量のＰＢＳを用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識された抗−ヒトＩｇＧ　ＨＲＰ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、、Ｕ、Ｓ、Ａ。

ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ−ＨＲＰ）を希釈して製造したＩｇＧ溶液中に入れて、室温で１時間振盪した。フィルターを、０．２％゛ツイーンー２０−含有ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄した後、５０ｍＭトＩノス緩衝ｌ夜（ｐＨ７，０）で２回洗浄した。

このフィルターに４００μｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトールと０．０３％過酸化水素水を含有した５０ｍＭトリス緩衝液を加えて発色させた。前記ウェスタンブロッティングの結果を図３ｌ−Ｂｉこ示した。図３１で第２夕１ｊ（１ａｎｅ）はｐＹＬＡＢＣ−Ａ／Ｇ−ＤＢ−ＣＯＲＥ１４で形質転換された酵母抽出物、第３列はｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７で形質転換されり酵母抽出物、第５列１：ｔ、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３でｕ５質転換サレｒ、Ｊｆｆｌ抽出物、第６列はｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ５７３でｆｉ５質転換された酵母抽出物を各々示し、第１列および第４タルよＫＨＣＶベクターを含有しない酵母抽出物に対する結果を示し、Ｍ列は標準蛋白分子量標識（単位（よキロダルトン）である。

また１図３２はＥ２ＮおよびＥ２Ｇ蛋白の産生な確認する５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング結果を示す。図３２ｉこおし１て、第１夕１９よＫＨＣＶ遺伝子がないプラスミドで形質転換された酵母抽出物を、第２夕ｊｌよｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｎで形質転換された酵母抽出物を、第３〜５夕１１１よｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｎで形質転換された酵母抽出物を示し、第６タ＋１ｉよ標準分子量標識として、ゲルの上部から２００．９７．７２．４３．２９．１８および１４キロダルトンを示す。

実施例４：大腸菌内でＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を発現させる発現ベクターの作製（４−Ａ）：ｔｒＰプロモータを有する発現ベクターのイ乍製（４−Ａ−１）：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の作製前記の実施例（３−Ａ−１）および（３−Ａ−２）でイ乍製した断片に３８４、Ｋ５１０、Ｋ５７３、Ｋ２Ｏ２、Ｅ２ＮおよびＥ２Ｃを用し）た。

一方、ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの９１６ないし１５０９５０９番目レオチドにイ装置した外１１１！（Ｅｌ）断片を、次のプライマーを用いて実施例（３−Ａ−１）と同様にＰＣＨにより作製した。

プライマーＰＥＩＵＢＩ　（５°　−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＣＧＴＣＣ−３’　）はユビキチン遺伝子と重なり合っている５゛−末端領域の２５個ヌクレオチド、即ち、ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌの９１６番目から９３６番目のヌクレオチド領域を含む。

プライマーＰＥｌ５ＡＬ（５°−ＧＡＣＴＧＧＡＣＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣ−３°）はＫＨＣＶ−ＬＢＣＩの１５０９５０９番目レオチドの直後に翻訳が終止されるように終止コドンを有しており、同時にＳａｌ　Ｉ認識部位を有する。

（４−Ａ−２）：ユビキチン遺伝子の合成〈段階１〉（Ｏｚｋａｙｎａｋ、ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯ，Ｊ、６．１４２９−１４３９（１９８７））により報告されたユビキチン遺伝子の情報を用いて、次のような３個のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成器で合成した。

ＵＢＩ　１　：　５’　−ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＣＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡ−３゜ＵＢＩ２：５′−ＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＴＣ−３゜ＵＢＩ３：５°−ＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴｌ”ＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡ− ３゜ＵＢＩＩは５°−末端にＮｄｅＩ認識部位（５’−ＣＡＴＡＴＧ−３°）を有すように設計しており、ｔＪＢＩ２と２０＠のヌクレオチドが重なり合ってし入る。

ＵＢＩ３はアミノ酸塩基配列を変えなく、Ｓａｃ　ＩＩの認識部位（５°−ＣＣＧＣＧＧ−３°）を有するように設計した（図３３参照）。

〈段階２〉２μｇのＵＢｌｌ、０．０２μｇのＵＢＩ２および２μｇのＵＢＩ３の混合物に１０ｕｌの１０倍ＰＣＲ＆１ｉｌｉ液、１０ｕｌの１２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物および０．５μｍのＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留水で最終容量が１００ｕｌになるようにした。参照例７と同様にＰＣＲを行った。以後、ＰＣＲ反応産物を５％ポリエステルアクリルアミドゲル電気泳動して２４０ｂｐのＤＮＡ　（以下、゛断片Ｕｂ゛　と略する）を抽出精製した後、これを２０μｌのＴＥ＆ｌ衛液に溶解した。

（４−Ａ−３）：ユビキチン遺伝子とに！（ＣＶ　ｃＤＮＡとの連結前記（４− Ａ−１）から得られた断片を各々、断片Ｕｂと次のようなＰＣＲ反応により連結した。ＰＣＲ用ブラプライマーては、前記実施例（３−Ａ−１）のく段階ｌ〉および実施例（４−Ａ−２）のく段階ｌ〉で製造したものを用いた。

まず、次のように７個の試験管を用意した。

試験管Ａには５０ｎｇの断片に３８４．５０ｎｇの断片ｕｂ、２μｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ１４を、試験管Ｂには５０ｎｇの断片に５１０．５０ｎｇの断片ｕｂ、２μｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＳＡＬＣＯＲＥＩ７を、試験管Ｃには５０ｎｇの断片に５７３．５０ｎｇの断片Ｕｂ、２ｕｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ２２を、試験管りには５０ｎＨの断片に８９７．５０ｎｇの断片ｕｂ、２μｇのブライ？−ＵＢ　１１と２μｇＯ）ブライ７−ＰＫＨＣＶ８９７ＳＡＬを、試験管Ｅには５０ｎＨの断片Ｅ２Ｎ、５０ｎｇの断片Ｕｂ、２μｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＥ２ＮＳＡＬを、試験管Ｆには５０ｎｇの断片Ｅ２Ｃ，５０ｎｇの断片Ｕｂ、２μｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＥ３２Ｃ３ＡＬを、試験管Ｇには５０ｎｇの断片Ｅ１．５０ｎｇの断片ｕｂ、２μｇのプライマーＵＢＩＩと２μｇのプライマーＰＥｌ５ＡＬを入れた。

各試験管に１０μｍの１０倍濃度のポリメラーゼ緩衝液、１０μｍの２ｍＭｄＮＴＰａ合物、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留水を加λて最終容量を１００μｍとした。参照例７と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＮＥＢ緩衝液中で、Ｎｄｅ　ＩとＳａｌ　Ｉで切断し、試験管ＡないしＧがら得た断片を各々、断片ＵＢＣＯＲＥ１４、ＬＩＢＣＯＲＥ１７、ＵＢＣＯＲＥ２２、ＵＢＫＨＣＶ８９７、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＢＥ２ＣおよびＵＢＥＩと略する。

（４−Ａ−４）：発現ベクターの作製段階１ｐｔｒｐ３２２−ＨＧＨ（ＫＦＣＣ１０６６７、大韓民国特許公告第９１−４５７号参照）２μｇをＰｓｔ　ＩとＳａｌ　Ｉで完全に切断し、同一のプラスミド２ｕｇをＮＥＤ緩衝液４中でＰｓｔ　ＩとＮｄｅ　Ｉで完全に切断した。産生物を領　７％アガロースゲルで分離して１．５Ｋｂと０．８Ｋｂの断片を分離して、これらを各々断片ＰＢと断片ＰＳと命名した。

段階２前記段階１と実施例（４−Ａ−３１から得られた断片を用いて、次のような連結反応を実施した。連結反応試験管Ａには１１００ｎの断片ＵＢＣＯＲＥ１４を、連結反応試験管Ｂには１００ｎＨの断片ＵＢＣＯＲＥ１７を、連結反応試験管Ｃには１１００ｎの断片ＵＢＣＯＲＥ２２を、連結反応試験管りには１１００ｎのＵＢＫＨＣＶ８９７を、連結反応試験管Ｅには１１００ｎのＵＢＥ２Ｎを、連結反応試験管Ｆには１１００ｎの断片ＵＢＥ２Ｃを、連結反応試験管Ｇには１１００ｎのＵＢＥＩを加えた。各試験管に１１００ｎの断片ＰＢ、約１１００ｎの断片ＰＳ、２μｌの１０倍濃度の連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、総容量が２０μｌになるように蒸留水を加えた後、１６℃で１２時間反応させた。

連結されたベクターを各々分離して、各々のベクターで大腸菌ＨＢＩＯＩ（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換させた。断片ＵＢＣＯＲＥ１４を含有するベクターを分離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥＩ４と、断片ＵＢＣＯＲＥ１７を含有するベクターを分離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥＩ７と、断片ＵＢＣＯＲＥ２２を含有するベクターを分離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ２２と、断片ＵＢＫＨＣＶ８９７を含有するｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７と、断片ＵＢＥ２Ｎを含有するベクターを分離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ　Ｅ２Ｎと、断片ＵＢＥ２Ｃを含有するベクターを分離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅｌと命名した（図３４参照）。

（４−Ｂ）：ｔａｃプロモータを有するｐＭＡＬ−ＫＨＣＶベクターの作製（４ −Ｂ−１）：ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の増幅段階ＩＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を、ｔａｃプロモータを用いて大腸菌のＭＢＰ−融合蛋白に発現させるために、次のようなプライマーをＤＮＡ合成器で合成した。

プライマー　ＰＫ４２６Ｒ：　５’　−ＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧＴＧＣＣＣＣ−３’ プライマー　ＰＫ４２６Ｘ：５°　−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＡＣ−３゜プライマー　ＰＳＡＬＣＯＲＥ１７　：　５°　−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣ−３゜プライマー　Ｐ４２６Ｂ　：　５’　−ＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧ３゜プライマー　ＰＫ５１３Ｒ：　５’　−ＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＴ−３’プライマー　ＰＫ５１３Ｘ　：　５°−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ −３’ プライマー　ＰＫ８１０Ｒ：５°　−ＣＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴ−３゜プライマー　ＰＫ８１０Ｘ　：　５°−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣ−３’ プライマー　ＰＫ７９８Ｒ＋　５’　−ＣＴＣ：ＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＡＡＣ−３’プライマー　ＰＫ７９８Ｘ：　５’　−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＴＡＣＧＣＣ −３゜プライマー　ＰＫ７５４Ｒ：　５°−ＡＡＡＡＡＧＡＡ、ＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＡＣＡＣＧ−３゜プライマー　ＰＫ７５４Ｘ：　５°−ＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＣＣＡＴＡＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＴＧＡＡＴＴ−３゜プライマー　ＰＫ６５２Ｒ：　５°−ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＧＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧＴＴＧＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡ−３゛プライマー　ＰＫ６５２Ｘ　：　５’　−ＡＴＴＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＴ−３゜プライマー　ＰＫ４０３Ｒ：　５’　−ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣ−３゜プライマー　ＰＫ４０３Ｘ：　５°−ＡＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧ−３゜プライマー　ＰＫ２７１Ｒ：５°−ＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＣＡＧＧＣＣＧＧ−３゜ブライｖ−ＰＫ２７１Ｘ：５°−ＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣ−３’ プライマー　ＰＫ４９５Ｒ：　５°−ＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴ−３゜プライマー　ＰＫ４９５Ｘ　：　５°　−ＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＴＡＡＡＧＧＧＣＣＡ−３“ プライマー　ＰＫ４９４Ｒ：　５’　−ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴ−３゜ブライ？−ＰＫ４９４Ｘ：５′−ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＴ−３゜段階２これらの合成されたプライマーを用いて次のように１１個の試験管を用意した。

試験管ＡニプライマーＰＫ４２６Ｒ２μｇ、プライマーＰＫ４２６Ｘ　２μｇ試験管ＢニプライマーＰＫ４２６Ｒ２μｇ、プライマーＰＫ４２６Ｂ　２０ｎｇ、ＰＳＡＬＣＯＲＥ１７　２０ｕｇ試験管ＣニプライマーＰＫ５１３Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ５１３Ｘ　２ｇｇ試験管ＤニプライマーＰＫ８１０Ｒ２ｍｇ、ブライｖ−ＰＫ８１０Ｘ　２ｍｇ試験管ＥニプライマーＰＫ７９８Ｒ２ｇｇ１プライマーＰＫ７９８Ｘ　２ｇｇ試験管ＦニプライマーＰＫ７５４Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ７５４Ｘ　２ｇｇ試験管ＧニプライマーＰＫ６５２Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ６５２Ｘ　２ｇｇ試験管Ｈニブライｖ−ＰＫ４０３Ｒ２ｍｇ、ブライｖ−ＰＫ４０３Ｘ　２ｇｇ試験管工：プライマーＰＫ２７１Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ２７１Ｘ　２ｇｇ試験管ＪニプライマーＰＫ４９５Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ４９５Ｘ　２ｇｇ試験管にニプライマーＰＫ４９４Ｒ２ｇｇ、プライマーＰＫ４９４Ｘ　２ｇｇ各試験管ニ１０　ｎ　ｇ　（７）　Ｋ　ＨＣＶ　−Ｌ　Ｂ　Ｃ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物および０．５μｌ　（２単位）のＴａｑポリメラーゼを加え、最終容量が１００ＬＬｌになるように蒸留水を加えた。

反応混合物に鉱油５０μｌを加えて溶液の蒸発を防止し、参照例７と同様にＰＣＲ反応を行った。

（４−Ｂ−２）：発現ベクターの作製２ｕｇのｐＭＡＬ−ＣＲＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｉｎｃ、Ｃａｔ、、Ｎｏ、８００．１１０９９　Ｎｏｒｔｈ　ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓ　Ｒｏａｄ、Ｌａ　Ｊｏｌ　ｌａ、ＣＡ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）をＮＥＤ緩衝液３中でＥｃｏＲＩとｓａｌ　Ｉで完全に切断した０次には、フェノール／クロロホルムで抽出してエタノールで沈降させた。沈降物を４０ｕｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

前記（４−Ｂ−１）の段階２から得られたＰＣＲ反応産物をＥｃｏＲｒとＸｈｏ　Ｉで次のように切断した。試験管ＡおよびＣないしＦ、ＨおよびＪないしＭのＰＣＲ産物１μｇずつをＥｃｏＲＩとＸｈｏ　Ｉで完全に切断し、試験管Ｇおよび工のＰＣＲ産物３μｇをＸｈｏ　Ｉで完全に切断した後、ＥｃｏＲＩで部分的に切断し；試験管ＣのＰＣＲ産物１μｇをＥｃｏＲＩとＳａｌ　Ｉで完全に切断した。得られたＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　ＩとＥｃｏＲＩ−３ａｌ　Ｉ断片を分離して参旦召例１のような方法で２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。

ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　ＩおよびＥｃｏＲＩとＳａｌ　Ｉで切断した前記のｃＤＮＡ断片５μｍに１０倍連結反応緩衝液２μ１．ＥｃｏＲＩとＳａｌ　Ｉで切断したｐＭａｌ−ＣＲＩ　Ｉμｌ　（５０ｎｇ）及びＴ、ＤＮＡリガーゼ１０単位を添加し、最終容量が２０μｌになるように蒸留水を加えた後、１６℃で１２時間反応させた。

次いで、連結されたベクターの各々を分離して、これら組換えベクターの各々で大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ＡＴＣＣ３３６９４）を形質転換させた。試験管ＡないしＫのベクターは各々、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４２６、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５５５、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５１３、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ８１０、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７９８．ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７５４、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ６５２、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４０３、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ２７１、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９５およびｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９４と命名した。前記組換えベクターに用いられたベクター、ｐＭＡＬ−ＣＲＩを図３５に示した。

（４−Ｃ）：大腸菌でのＫＨＣＶ　ｃＤＮＡの発現（４−Ｃ−１）：ｔｒｐプロモータを有するベクターによるＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片の発現段階ｌ前記実施例（４−Ａ）から得られた各プラスミドで大腸菌（Ｅ、ｃｏｉｌ）Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３８３３５）を形質転換させた。その中、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ− ＫＨＣＶ８９７で形質転換されたＥ、ｃｏｌ　ｉ　ＷＢ２１０　（Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７）を寄託番号ＡＴＣＣ６９６４０（１９９１，６，２７日付寄託）として、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１７で形質転換されたＥ、ｃｏｔ　Ｌ　ＷＢ２　ｔｏ　（Ｅ、ｃｏｌ　１Ｗ３１１０　ｐｔｒｐＨ−ＵＲ−ＣＯＲＥ１７）を寄託番号ＡＴＣＣ６８６４１（１９９１，６，２７日付寄託）として、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４で形質転換されたＥ、ｃｏｌｔ　Ｗ３１１０　（Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｗ３１１０ｐｔｒｐＨ −ＵＢ−ＣＯＲＥ１４）を寄託番号ＡｒＣＣ６８６４２（１９９１゜７．１日付寄託）として、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅｌで形質転換されたＥ。

ｃｏｌｔ　Ｗ３１１０　（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅｌ）を寄託番号ＡＴＣＣ６８８７８（１９９１，１２，１１日付寄託）として、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｎで形質転換されたＥ、ｃｏｔ　ｉ　ＷＢ２１０　（Ｅ。

ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｎ）を寄託番号ＡＴＣＣ６８９６６（１９９２゜４．２２日付寄託）としてブダペスト条約下の国際寄託機関であるＡＴＣＣに国際寄託した。

ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４で形質転換された大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン−含有液体ＬＢ培地（１％バタトトリブトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣ１）中、３７℃で１２時間振盪培養した後、この中５ｍｌを１１のＭ９培地（４０ｍＭ　Ｋ、ＨＰＯ，，２２ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ，，８，５ｍＭＮａＣ１，１８，７ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、１％グルコース、０．１ｍＭＭｇ５０４．Ｏ，１ｍＭ　ＣａＣ１ｍ　、０．４％カサミノ酸、１０ｇｇ／ｍｌビタミンＢ、、４０μｇ／ｍｌアンピシリン）へ移して３７℃で３−４時間振盪培養した。培養液の０．Ｄ値が６５０ｎｍで０．５に到る時、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて最終濃度が１．４ｍＭになるようにした。５時間経過後、細胞培養液を３０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。

他の組換え大腸菌細胞を前記と同様に培養してＫＨＣＶ蛋白を産生させた。

段階２各細胞を緩衝液に懸濁した後、ラムリの方法（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ’　ｓｍｅｔｈｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０　（１９７０））によって１５％５ＤＳ− ＰＡＧＥしてユビキチンーＫＨＣＶ蛋白の発現を確認した。この結果を図３６ないし図３８に示した。

図３６において、Ｍ列は標準分子量標識として、上部がら７２．４３．２９および１８キロダルトンを示し、第１列はＫＨＣＶ遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌の産物を示し、第２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４で形質転換された大腸菌の産物、即ち２３Ｋｄの蛋白を、第３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥＩ７で形質転換された大腸菌の産物、即ち２７Ｋｄである蛋白を、第４列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ２２で形質転換された大腸菌の産物、即ち２９Ｋｄの蛋白を、第５列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７で形質転換された大腸菌の産物、即ち４０Ｋｄの蛋白を、第６列は精製ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を示す。

また、図３７において、第１列はＫＨＣＶ遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌の産物を、第２列ないし５列はＩＡＡを添加して、各々２．４．６および１２時間経過後、得られたｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅｌで形質転換された大腸菌の産物を、第６列は標準分子量標識として上部から７２．４３．２９．１８および１４キロダルトンを示す。

また、図３８において、第１列はＫＨＣＶ遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌の産物、第２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｃで形質転換された大腸菌の産物、及び第３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２ＣＮで形質転換された大腸菌の産物を示す。

また、前記実施例（３−Ｃ）のような方法でウエストンブロッチングして、組換え大腸菌で産生された蛋白がＫＨＣＶ抗体に特異的に結合することを確認した。

その結果を図３９ないし図４１に示した。

（４−Ｃ−２）：　ｔａｃプロモータを有するベクターの発現段階１前記実施例（４−Ｂ）から得られたプラスミドを用いて参考例４の方法によりＥ、ｃｏｉｌ　Ｄ１２１０（ＡＴＣＣ２７３２５）を形質転換させた。これらの中、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５５５で形質転換されたＥ、ｃｏｉｌ　Ｄ１２１０（Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｄ１２１０　ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５５５）は寄託番号ＡＴＣＣ６８６３９として１９９１年６月２７日付でブダペスト条約下の国際寄託機関であるＡＴＣＣに寄託した。

形質転換されたＥ、ｃｏｌｉを５０μｍ／ｍｌのアンピシリン−含有液体ＬＢ培地で１２時間振盪培養し、培養液５ｍｌを１１のＭ９培地（１１当たりＮａｇ　ＨＰＯ４６ｇ、ＫＨｚ　ＰＯ４３ｇ、ＮａＣ１０，５ｇ、ＮＨ４ＣＩＩｇ、ＩＭ　Ｍｇ５０．２ｕｌ、２０％グルコース１００　ｕ　ｌ　、　Ｃａ　Ｃ１２０，１ｍ１）へ移して３７℃で３ないし４時間振盪培養した。０．Ｄ、値が６５０ｎｍで０．５に至る時、ＩＰＴＧを加えて最終濃度０．２ｍＭとした。５時間経過後、細胞培養液を３０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。

段階２細胞沈降物を緩衝液に懸濁し、ラムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０　（１９７０））によって１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥしてＫＨＣＶ蛋白の発現を確認し、この結果を図４２に示した０図４２において、Ｍ列は標準分子量ａｔ識を示し、第１列はｐＭＡＬ−ＣＲＩで形質転換された大腸菌の産物、即ち４０Ｋｄ蛋白を示し、第２列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４２６で形質転換された大腸菌の産物、即ち６５Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ４２６蛋白）を示し、第３列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５５５で形質転換された大腸菌の産物、即ち７０Ｋｄｌ白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ５５５蛋白）を示し、第４列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５１３で形質転換された大腸菌の産物、即ち６５Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ５１３蛋白）を示し、第５列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ８１０で形質転換された大腸菌の産物、即ち７５Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ８１０蛋白）を示し、第６列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７９８で形質転換された大腸菌の産物、即ち７２Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ７９８）を示し、第７列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ２７で形質転換された大腸菌の産物、即ち５０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ２７１蛋白）を示し、第８列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７５４で形質転換された大腸菌の産物、即ち７２Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ７５４蛋白）を示し、第９列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ６５２で形質転換された大腸菌の産物、即ち７０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ６５２蛋白）を示し、第１０列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４０３で形質転換された大腸菌の産物、即ち６５Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ４０３蛋白）を示し、第１１列ＧｔｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９５で形質転換された大腸菌の産物、即ち７０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ４９５蛋白）を示し、第１２列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９４で形質転換された大腸菌の産物、７０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ６５２蛋白）を示し、第１０列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４０３で形質転換された大腸菌の産物、即ち６５Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ４０３蛋白）を示し、第１１列＋ｉｐＭＡＬ −ＫＨＣＶ４９５で形質転換された大腸菌の産物、即ち７０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ− ＫＨＣＶ４９５蛋白）を示し、第１２列はｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９４で形質転換された大腸菌の産物、７０Ｋｄ蛋白（ＭＢＰ−ＫＨＣＶ４９４蛋白を示す、実施例（３−Ｃ）のような方法でウエスタンブロツチングを行って前記蛋白がＫＨＣＶ抗体に特異的に結合されたことを確認した。その結果は図４３に示した。

（４−Ｃ−３）：ＭＢＰ融合蛋白の切断まず、各ＭＢＰ融合蛋白をＸａ因子の緩衝液（２０ｍＭ　トリス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０，１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍ　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　ｍ、１ｍＭ　アジド）に対して、２４時間透析した。透析された蛋白０．２ｕｇ　（１ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｕｇのＸａ因子（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ、＃８００−ＩＯＬ）と混合して室温で２４時間放置した。

生成した混合物を５分間１００℃に加熱した後、実施例（１−Ｃ）のような方法で５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＭＢＰが融合蛋白から除去されたことを確認した。

ＭＢＰが除去された蛋白を各々、ＫＨＣＶ４２６蛋白、ＫＨＣＶ５５５蛋白、ＫＨＣＶ５１３蛋白、ＫＨＣＶ８１０蛋白、ＫＨＣＶ７９８蛋白、ＫＨＣＶ２７１蛋白、ＫＨＣＶ７５４蛋白、ＫＨＣＶ６５２蛋白、ＫＨＣＶ４０３蛋白、ＫＨＣＶ４９５蛋白およびＫＨＣＶ４９４蛋白と命名した。

前述のように、発現ベクターの作製において、プライマーを組合わせてＰＣＲ方法により多様な長さと配列のＫ）（ＣＶ　ｃＤＮＡが作製でき、当該分野で通常の知識を有している者であれば、他の類似なＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を容易に合成し得るだろう、ＫＨＣＶ抗原蛋白もＫＨＣＶ　ｃＤＮＡにより決定されるので、前記技術に基づいて、多様な種類のＫＨＣＶ抗原蛋白の産生も可能であるということも当該分野で明らかである。また、ＨＣＶｃＤＮＡおよびＫＨＣＶ　抗原蛋白の産生のために、実施例で用いられた酵素、リンカ−および他の物質のみならず、これらの等価物も用いられる。

実施例５：酵母細胞内で発現されたＫＨＣＶ蛋白の精製（５−Ａ）：ＫＨＣＶ４０３蛋白の精製〈段階１〉：組換え酵母細胞の培養ＫＨＣＶ４０３　ｃＤＮＡ断片と、ユビキチン遺伝子を有するベクター（ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣＯ４−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３をロイシン欠乏培地（０，６７％のアミノ酸−非含有酵母窒素基質、５％グルコース、ロイシン欠乏アミノ酸混合物０．２５％）１０ｍｌ中、３０℃で１２時間培養した後、５％グルコース−含有ＹＥＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、５％グルコース）１００ｍｌへ移して、３０℃で６時間振盪培養し、培養物を５％グルコース−含有ＹＥＰＤ培地１１へ移して３０℃で６時間培養して発酵用種菌を得た。　１４１容量の発酵槽（Ｂｅｎｃｈ　ＴｏｐＦｅｒｍｅｎｔｏｒ　：ＮＢＳ社、Ｕ、　Ｓ、　Ａ）に１０１の２％グルコース−含有ＹＥＰＤ培地を入れて、前記の種菌培養液を接種した。２５Ｏｒｐｍの振盪速度および３０℃の温度で４８時間振盪培養した。培養液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ−６Ｂ、Ｒｏｔｏｒ　ＪＳ　４．２）で２５００ｒｐｍの速度で２０分間遠心分離して組換え酵母細胞ペーストを得た。

〈段階２〉：酵母細胞の破壊前記〈段階１〉から得られた組換え酵母細胞を５００ｍ１の緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８，５，５ｍＭ、ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／ｍｌ　ペプスタチンＡ）に懸濁した後、直径０．４ｍｍのガラスピーズを総容量の５０％（ｖ／ｖ）に相当する量で添加した。生成物を均質粉砕機（Ｂｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ。

Ｂｉｏｓｐｅｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）で４℃の温度で５分間均質化して細胞膜を破壊した。破壊された細胞をフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、３ＭＭ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を用いてろ過してガラスピーズを除去し、酵母均質液を得た。

〈段階３〉：特異抗原蛋白の同定少量の前記く段階２〉から得られた酵母均質液を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した結果、ユビキチンが細胞内で単離され、ＫＨＣＶ４０３ｃＤＮＡから発現された蛋白（以下、ＫＨＣＶ４０３蛋白という）は約１７．０００ダルトンの分子量として産生されることを確認した。

次に、ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルター上にブロツチングした後、このフィルターを０．５％ツイーン−２０−含有リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ　：　１０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０）に入れて、室温で２時間弱（攪拌しながら免疫グロブリンＧの非特異結合を遮断した。次いで、０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで韓国人Ｃ型肝炎患者の血清から分離した免疫グロブリンＧ　（８，２ｍｇ／ｍ１）をｌ／２００　（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈されたＩｇＧをフィルターに加えて、室温で１時間弱く振盪した後、フィルターを０．０５％ツイーン−２〇−含有ＰＢＳで５分ずつ４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識した抗−ヒト免疫グロブリンＧ　（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ、、Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ−ＨＲＰ）を、０．５％ゼラチンと、０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで１／２００　（ｖ／ｖ）の割合で希釈してこれをフィルターに添加した。フィルターを室温で１時間弱く振盪しながら反応させた。このフィルターを０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで５分ずつ４回洗浄し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，０）で２回洗浄した。４００ＬＬｇ／ｍｔの４−クロロ−１−ナフトールと０．０３％過酸化水素−含有５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，０）を添加して発色させた。全酵母均質液中でＫＨＣＶ４０３蛋白のみがＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的バンドを形成した。

〈段階４〉：溶解された蛋白の除去前記く段階２〉から得られた酵母均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２− ２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ　１４）によりＬ　１．０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去しＫＨＣＶ４０３蛋白を含有する不溶性沈降物を得た。

く段階５〉：尿素を用いた沈降物の溶解と分別前記段階４から得られた沈降物を８Ｍ尿素−含有緩衝液（５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、ｌ μｇ／ｍｌペプスタチンＡ）７５０ｍｌに溶かした後、遠心分離して不溶解沈降物を除去し上澄液を収集した。この上澄液を２Ｍ尿素−含有緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）で透析した後、遠心分離して、沈降物を除去しＫＨＣＶ４０３蛋白−含有上澄液を得た。

く段階６〉＝１次ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィー前記く段階５〉から得られた上澄液を２Ｍ尿素−含有緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール、）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ％ＦＦ、５ｃｍｘ１５ｃｍ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を通した。結合された蛋白に０．２Ｍ塩化ナトリウム−含有緩衝液（１０ｍＭ）リス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）７５０ｍｌを加えて溶出させた。　゛く段階７〉：２次ＤＥＡＥ−イオン交換りロマトグラフィーＫＨＣＶ４０３蛋白−含有蛋白画分を収集して緩衝液（１０ｍＭ！−リス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に対して透析して尿素を除去した後、同一緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムを通した。０．１Ｍ塩化ナトリウム−含有緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ９，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、４ｍＭ　β−メルカプトエタノール）を加えて、溶出された蛋白を分離し、塩化ナトリウムを０．１Ｍないし０１２Ｍの濃度匂配で加えてカラム−結合蛋白を分別した０画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥした後、高純度のＫＨＣＶ４０３蛋白−含有画分を収集した。

〈段階８＞：　ＦＰＬＣ−フェニルクロマトグラフィー前記段階７から得られた両分を１゜５Ｍ塩化ナトリウム−含有緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，４２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール、）に対して透析した後、同一緩衝液で平衡化したＦＰＬＣ−フェニルセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ％ＨＲ，１０／１０．１ｃｍ　ｘ　８ｃｍ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を通し、１．５ないしＯＭの濃度匂配で塩化ナトリウムを含有する緩衝液１６０ｍ１を加えて蛋白を分別した。これらの画分などを５ＤＳ−ＰＡＧＥして純度を確認し、高純度のＫＨＣＶ４０３蛋白を含有する画分を別に収集して９５％以上の純度のＫＨＣＶ４０３蛋白を得た。

＜５−Ｂ＞：ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ　１４蛋白の精製く段階１〉：組換え酵母細胞の培養ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ　１４蛋白をコードするｃＤＮＡ断片とユビキチン遺伝子を含有するベクター（ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４）で形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＤＣＯ４−ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４を、前記実施例（５−Ａ）のく段階１〉と類似な方法で５％グルコースを含有するロイシン欠乏培地で培養した後、培養液２０ｍ１を１００ｍ１の４％グルコース含有ＹＥＰＤ培地へ移して、３０℃で６時間振盪培養し、１１の２％グルコース−含有ＹＥＰＤ培地へ移して３０℃で２４ないし４８時間培養した。培養液を遠心分離して細胞沈降物を得た。

く段階２〉：酵母細胞の破壊前記〈段階１〉から得られた組換え酵母細胞沈降物を３０ｍ１の緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１Ｍｇ／ｍｌペプスタチン）に懸濁した後、直径Ｑ、４ｍｍのガラスピーズを総容量の５０％に相当する量で添加した。均質粉砕機（Ｂｅａｄ　Ｂｅａｔｅｒ、ＢｉｏｓｐｅｃＰｒｏｄｕｃｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）により４℃で５分間３回均質化して細胞膜を破壊して、酵母均質液を得た。

く段階３〉：特異抗原蛋白の同定小量の前記〈段階２〉から得られた酵母均質液を１５％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した後、コマシブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ）で染色した。その結果、ユビキチンはＫＨＣＶ蛋白から単離され、ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡで発現された蛋白（以下、ＫＨＣＶＣＯＲＥ　１４蛋白という）は、約１６．０００ダルトンの分子量であることを確認した。

前記実施例（５−Ａ）のく段階３〉のような方法でウェスタンブロッチングを行った。

その結果、ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白がＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的バンドを形成することがわかった。

く段階４〉：可溶性蛋白の除去および不溶性沈降物の洗浄前記〈段階２〉から得られた酵母均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１．Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ−１４）により１１．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して溶解された蛋白を除去し、ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白を含有する不溶性沈降物を得た。この沈降物を０．５１の１％トリトンｘ−ｉｏｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭβ−メルカプトエタノール−含有ＰＢＳに懸濁して１０分間攪拌した後、遠心分離した。この沈降物を１０ｍＭリン酸塩溶液（ｐＨ６，５）で１回洗浄した。

く段階５＞：８Ｍ尿素を用いた沈降物の溶解前記〈段階４〉から得られた不溶性沈降物を８Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ　β−メルカプトエタノールが含有された１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６，５）に懸濁した後、４ ℃で１２時間攪拌してＫＨｃＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白を溶解した。この溶液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１゜Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ２０）により１５．ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄液を取った。

く段階６＞：ＣＭ−イオン交換樹脂クロマトグラフィー２５ｍ１のＣＭ（カルボキシメチル）−セファロース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を有するカラム（２，５０ｍｘｌＯｃｍ）を６Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノールおよび１０ｍＭリン酸塩−含有緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化した後、段階５から得られたＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白−含有溶液を分当り１ｍｌの流速で前記カラムを通した。カラム内の遊離の状態の残留物を前記の平衡化溶液で完全に洗浄した。０ないし０．５Ｍ濃度匂配の塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液５００ｍ１でカラム内の蛋白を３ｍ１／分の流速で溶出した。

溶出物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白が、０．３Ｍ塩化ナトリウムで溶出されたことを確認した。ＫＨＣＶＣＯＲＥ１４蛋白−含有画分を収集して次の段階に用いた。

く段階７＞：　Ｓ−２００ゲル透過クロマトグラフイー前記く段階６〉から得られた画分を集めてＹＭ５限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）を通して１０ｍ１に濃縮した。この濃縮液を、６Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ溶液で平衡化したＳ−２００セフアクリルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ：２．５ｃｍ　ｘ　１００ｃｍ）に分当り０．５ｍｌの流速で通過させて、分子量によって分離した。収集された蛋白の両分を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。高純度のＫＨＣＶ　Ｃ０ＲＥ１４蛋白−含有画分を集めて４℃でＰＢＳ緩衝液に対して透析して尿素を除去し、高純度のＫＨＣＶＣＯＲＥ１４蛋白４ｍｇを得た。

酵母で発現された、他のＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片によりコードされた蛋白も前記と類似な方法で精製できる。

実施例６：大腸菌で発現されたＫＨＣＶ蛋白の精製（６−Ａ）：ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白の精製〈段階１〉：組換え大腸菌細胞の培養ＫＨＣＶ８９７ｃＤＮＡ断片とユビキチン遺伝子を含有するベクター（ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７）により形質転換された（Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１１０ｐｔｒｐＨ−ＫＨＣＶ８９７　（ＡＴＣＣ６８６４０）を５０　ｕ　ｇ／ｍ１のアンピシリン−含有ＬＢ培地（１１当り、バクトドリブトンＬｏｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣ１１０ｇ）中で１２時間振盪培養した後、培養液５ｍｌを１１のアンピシリン（４０ｇｇ／ｍ１）−含有Ｍ９培地（４０ｍＭＫ、　ＨＰＯ，，２２ｍＭ　ＫＨｚ　ＰＯ，，８，５ｍＭ　ＮａＣ１，１８，７ｍＭＮＨ４Ｃｌ、１％グルコース、０．１ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，０，１ｍＭＣａＣ１，，０，４％　カザミノ酸、１０ｇｇ／ｍｌ　ビタミンＢｌ）へ移して３７℃で３ないし４時間振盪培養した。培養液の０．Ｄ、値が６５０ｎｍで０．５に到る時、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて最終濃度０．１４ｍＭとし、ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白が産生されるようにした。ＩＡＡを添加して５時間が経過した後、細胞培養液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ−６Ｂ、Ｒｏｔｏｒ　ＪＳ　４．２）により２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を得た。この沈降物をリン酸塩緩衝塩溶液（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７，０，０，１５Ｍ塩化ナトリウム）で１回洗浄した。

く段階２〉：細胞破壊前記〈段階１〉から得られた大腸菌細胞沈降物３ｇを４０ｍ１の緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨｓ、５．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１Ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ）に懸濁した。その懸濁液に５０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液０．３ｍｌを添加して３７℃で１時間放置した後、超音波粉砕機（ＨＥＡＴ　ＳＹＳＴＥＭＳ−ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ３，ＩＮＣ，、Ｗ２２５、ＵＳＡ）を用いて７０％の出力で５分間水浴中の上で超音波処理して細胞を破壊して大腸菌細胞均質液を得た。

く段階３〉：特異抗原蛋白の同定少量のく段階２〉から得られた大腸菌細胞均質液を、１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥした結果、前記ベクターにより発現された蛋白（以下、ＫＨＣＶ　ＵＢ　８９７蛋白という）が　３９，０００ダルトンの分子量を有することを確認した。

その後、ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへ移して、前記実施例（５−Ａ）のく段階３〉と同様な方法でウェスタンブロッチングした。

その結果、ＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白だけがＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的バンドを形成することがわかった。かかる結果から見られるように、前記の発現されたＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白はＨＣＶに対する抗体と結合可能な免疫反応性蛋白である。

く段階４〉：可溶性蛋白の除去前記〈段階２〉から得られた細胞均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２− ２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ　１４）によりｌ　１，００Ｏｒｐｍで２５分間遠心分離して溶解状態の蛋白を除去した後、不溶性沈降物を得た。

〈段階５〉ニトリトンＸ−１００とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前記く段階４〉から得られた沈降物を１％トリトンＸ−１００−含有緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）５０ｍｌに懸濁した。この懸濁液を、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｒｏｔｏｒ　Ｊ２−２１、ＪＡ１４）により１１．０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して上澄液を除去したのち、不溶性沈降物を得た。次いで、この沈降物を緩衝液（５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，５，５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）５０ｍｌに懸濁した。その懸濁液を攪拌しさらに遠心分離して上澄液を除去したのち、不溶性沈降物を得た。

前記のような簡単な洗浄過程だけで、少くとも純度６０％以上のＫＨＣＶＵＢ８９７蛋白を得た。

〈段階６＞：８Ｍ尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記〈段階５〉から得られたＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を含有する不溶性沈降物を８Ｍ尿素を含有する緩衝液（２０ｍＭ　リン酸塩、ｐＨ６，０，２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）５０ｍｌに懸濁した。この懸濁液を室温で１時間攪拌し遠心分離して、不溶性沈降物を除去したのち、上澄液を得た。

く段階７〉：Ｓ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記〈段階６〉から得られた上澄液を、４Ｍ尿素−含有緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）で平衡化したＳ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＦＦ、２．５ｃｍｘ７ｃｍ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）に通過させ、塩化ナトリウムをＯないし０３２Ｍの濃度匂配で含有する６００ｍ１の緩衝液で溶出した。蛋白画分などを５ＤＳ−ＰＡＧＥＬ、て、高純度のＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を含有する両分を収集した。

〈段階８〉：尿素の除去およびＦＰＬＣ−モノＱイオン交換クロマトグラフィー前記く段階７〉から収集したＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を含有する蛋白画分を緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）で透析して尿素を除去した後、同一緩衝液で平衡化したＦＰＬＣ −モノＱイオン交換樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ％ＨＲ５１５）を通過させ、塩化ナトリウムをＯから０．４Ｍまでの濃度匂配で含有する４０ｍ１の緩衝液で溶出した。高純度のＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を含有する画分を収集して、少くとも９０％以上の純度を有するＫＨＣＶ　ＵＢ８９７蛋白を得た。

（６−Ｂ）：ＫＨＣＶ　ＵＢ　Ｃ０ＲＥ１７蛋白の精製く段階１〉二組換え大腸菌細胞の培養Ｃ型肝炎ウィルスのｃＤＮＡとユビキチン遺伝子を含有するベクター（ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１７）により形質転換されたＥ、ｃｏｌｉＷ３１１０　ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１７（ＡＴＣＣ６８６４１）を、５０Ｍｇ／ｍｌアンピシリン、ｌｏｏＬＬｇ／ｍｌトリプトファンを含有するＬＢ培地中、３７℃で１２時間培養した後、培養液５０ｍ１を１１のＭ９培地へ移して３７℃で６ないし８時間培養した後、前記実施例（６−Ａ）のく段階１〉のような方法で細胞沈降物を収集した。

く段階２〉：細胞破壊前記〈段階１〉から得られた大腸菌細胞沈降物３ｇを４℃で緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，５ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１Ｍｇ／ｍｌペプスタチン）２０ｍｌに懸濁した後、リゾチーム３ｍｇを添加して５分間攪拌した。生成物を超音波粉砕機（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍａｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、Ｉｎｃ、、Ｗ２２５、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を用いて水浴中で２０分間超音波処理して細胞を破壊したのち、細胞均質液を得た。

〈段階３〉：特異抗原蛋白の同定前記〈段階２〉から得た大腸菌細胞均質液を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、コマシブルーで染色した結果、約２７，０００ダルトンの分子量を有する蛋白（以下、これをＫＨＣＶＵＢ　Ｃ０ＲＥ１７蛋白という）が産生されたことを確認した。

次いで、ゲル上に分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへ移し、このフィルターを実施例（５−Ａ）のく段階３〉のような方法でウエスタンブロッチングした。その結果、全大腸菌細胞均質液中、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１７だけがＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的なバンドを形成した。

〈段階４〉：尿素処理前記〈段階２〉から得られた細胞均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２− ２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ２）により１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、不溶性物質を除去したのち、上澄液を得た。この上澄液に９Ｍ尿素溶液を添加して最終濃度を６Ｍとして、４℃で１２時間攪拌した。

く段階５〉：酸処理前記〈段階４〉から得られた溶液に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）を添加して１０ｍＭの濃度とし、１Ｍ酢酸を加えてｐＨ５，０になるようにした。１時間攪拌し、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して沈降物を除去したのち上澄液を得た。

く段階６〉：モノーＳ−クロマトグラフィー前記く段階５〉から得られた上澄液を、ＦＰＬＣモノ−Ｓカラム（ＨＲ５１５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通過させて精製した。８Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ酢酸を含有する緩衝液Ａ　（ｐＨ５，０）でカラムを平衡化し、ＵＢ−ＣＯＲＥ１７蛋白溶液を通過させた後、再び緩衝液Ａでカラムを洗浄した。その後、８Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ酢酸および１Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液Ｂを、初の５分間は１７．５％、その次に５５分間は３５％、最終的に１０分間は１００％になるように０．８ｍｌ／分の流速で漸進的に添加して蛋白を溶出した。ＫＨＣＶ　ＵＢ −ＣＯＲＥ１７蛋白は緩衝液Ｂの量が２５％に至る時、即ち、塩化ナトリウムの濃度が０．２５Ｍの場合に溶出された。

く段階７＞：　Ｓ−２００ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階６〉から得た蛋白溶液を、６Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭβ−メルカプトエタノール−含有ＰＢＳ溶液で平衡化したＳ−２００セフアクリルカラム（ＰｈａｒｍａｃＬａ、Ｓｗｅｄｅｎ、２．５ｃｍ　ｘ　１００ｃｍ）に分当り０．５ｍｌの流速で通過させて、これらの分子量によって分離した。蛋白を収集し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、ＫＨＣＶＵＢ−ＣＯＲＥ１７蛋白を含む画分な集めた。この両分を４℃でＰＢＳ溶液に対して透析して少な（とも９０％以上の純度を有するＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１７蛋白４ｍｇを得た。

（６−Ｃ）：ＵＢ−Ｅｌ蛋白の精製く段階ｌ〉：組換え細菌細胞の培養ＫＨＣＶ　Ｅｌ蛋白とユビキチン（ＵＢ）の融合蛋白を産生し得るＥ。

ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅｌ　（ＡＴＣＣ６８８７Ｂ）を前記（６−Ａ）のく段階１〉のような方法で培養し、収集した。

く段階２〉：細胞破壊前記く段階１〉から得られた細菌細胞沈降物を５０ｍ１の緩衝液１　（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１Ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ）に懸濁した後、リゾチーム溶液を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間培養した後、超音波粉砕機により水浴上で７０％の出力で５分間超音波処理して細胞を破壊したのち均質液を得た。

く段階３〉：特異抗原発現の同定前記く段階２〉の均質液を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した結果、約２７，０００ダルトン（ｄａｌｔｏｎ）の分子量を有する蛋白（以下、ＵＢ−Ｅｌ蛋白という）がベクターから発現された。

また、ゲル上で分離された蛋白をインモビロンＰフィルター（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　ｆｉｌｔｅｒ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｃａｔ。

Ｎｏ、ＩＰＵＨ０００１０、細孔の大きさ　０．４５４％ｍ）へプロッチングし、前記実施例（５−Ａ）のく段階３〉のような方法でウェスタンブロッチングした。

その結果、全細胞均質液中、ＵＢ−Ｅｌ蛋白がＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的バンドを形成したことがわかる。

〈段階４〉：可溶性蛋白の除去前記〈段階２〉の細胞均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１゜Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１．ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、不溶性沈降物を得た。

く段階５〉：不溶性沈降物の洗浄前記〈段階４〉の沈降物を３０ｍ１の１％トリトンＸ−１００−含有緩衝液１（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール）に懸濁した。この懸濁液を室温で３０分間攪拌した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−０２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ　１４）を用いて１１．０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して１％トリトンＸ−１００に対して可溶性の蛋白を除去し、不溶性蛋白を得た。この沈降物を攪拌しながら３０ｍ１の緩衝液１に懸濁し、再び遠心分離して不溶性蛋白を得た。

前記の洗浄過程により少なくとも純度６０％以上のＵＢ−Ｅｌ蛋白を得た。

〈段階６〉：不溶性沈降物の溶解及び分別前記〈段階５〉のＵＢ−Ｅ１蛋白を含む不溶性沈降物を５０ｍ１の８Ｍグアニジン塩酸塩−含有緩衝液２　（５０ｍＭ）リス、ｐＨ９，０，１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に懸濁した後、室温で３０分間攪拌し、遠心分離機により１１．ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し、上澄液を得た。前記上澄液を、グアニジン塩酸塩の最終濃度が０．５Ｍになるように緩衝液２で希釈し遠心分離して、上澄液を除去し、ＵＢ−Ｅｌ蛋白−含有沈降物を得た。

く段階７〉：不溶性沈降物の溶解前記〈段階６〉のＬＪＢ−Ｅｌ蛋白−含有不溶性沈降物を、２０ｍ１の８Ｍ尿素 −含有緩衝液３　（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に懸濁した後、室温で１時間攪拌し、遠心分離＊　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１、ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し、その上澄液を得た。

く段階８〉：Ｑ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記く段階７〉の上澄液を、緩衝液３で平衡化したＱ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＦＦ、１．２ｃｍ　ｘ　７ｃｍ）に通過させ、Ｏないし０．４μ濃度匂配の塩化ナトリウムを含むｌｏｏｍｌの緩衝液を加え、結合蛋白を溶出した。蛋白画分を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してＵＢ−Ｅ１蛋白を含む両分を別に収集し、少なくとも純度９０％以上のＵＢ−Ｅ１蛋白を得た。

（６−Ｄ）：ＫＨＣＶ　ＵＢ−Ｃ：０ＲＥ１４蛋白の精製く段階ｌ〉：組換え大腸菌細胞の培養ＫＨＣＶのｃＤＮＡ断片およびユビキチン遺伝子を含むベクター（ｐｔｒｐＨ− ＵＢ−ＣＯＲＥ１４）により形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４　（ＡＴＣＣ６８６４２）を５０　ｕ　ｇ／ｍ　１のアンピシリンと１００μｇ／ｍｌのトリプトファンを含有した培地で１２時間培養した後培養液５０ｍ１を１１（７）Ｍ９培地へ移して３７℃で６−８時間培養した後、実施例（６−Ａ）のく段階１〉のような方法で細胞ペーストを収集した。

〈段階２〉：細胞破壊前記〈段階ｌ〉から得た大腸菌細胞４ｇを４℃で２０ｍ１の緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，５，５ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／ｍｌペプスタチン）に懸濁した後、リゾチームを４ｍｇ添加し５分間攪拌して、水浴上で超音波粉砕機を用いて２０分間超音波処理して細胞を破壊した。

く段階３〉：特異抗原蛋白の同定少量の前記く段階２〉から得られた均質液を、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してコマシーブルーで染色いた結果、約２３，０００ダルトンの分子量の蛋白が（以下、ＫＨＣＶ　ｔＪＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上いう）が発現されたことを確認した。

次いで、ゲル上に分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへブロッチングし、このフィルターを前記実施例（５−Ａ　＞のく段階３〉のような方法でウェスタンブロッチングした。その結果、全大腸菌均質液中、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上Ｃ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的なバンドを形成することがわかった。

〈段階４〉：尿素処理前記〈段階２〉から得られた均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ２０）により１２．００Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離して不溶性物質を除去し、上澄液を得た。この上澄液に９Ｍ尿素を加えて最終濃度を８Ｍにした後、室温で１２時間攪拌した。

く段階５〉：酸処理前記く段階４〉から得られた溶液に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）を添加して、最終濃度１０ｍＭとし、１Ｍ酢酸を加えてｐＨ５，０にした後、室温で１時間攪拌した。この溶液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１．００Ｏｒｐｍで遠心分離して沈降物を除去し、上澄液を得た。

〈段階６＞：ＣＭ−イオン交換クロマトグラフィー２５ｍ１の０Ｍセファロース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を含有するカラム（２，５ｃｍ　ｘ　１０ｃｍ）を、８Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ酢酸塩を含有する緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化した後、〈段階５〉から得たＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上含有する溶液を分当り、１ｍｌの流速で通過させた。カラム内に残っている遊離形態の物質を前記平衡化緩衝液で完全に洗浄した。０ないし０．５Ｍの１度匂配で塩化ナトリウムを含有する５００ｍ１の前記平衡化緩衝溶液でカラム内に結合された蛋白を３ｍ１／分の流速で溶出した。溶出物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、確認した結果、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上０．３Ｍとして溶出された。ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４−含有画分を次の段階に用いるために収集した。

〈段階７＞　：　Ｓ−２００ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階６〉から得られた画分をＹＭ５限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を通して１０ｍ１に濃縮した。この濃縮液を、６Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ溶液で平衡化したＳ−２００セファクリルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ。

２．５ｃｍ　ｘ　ｌｏｏｃｍ）に分当り０．５ｍｌの流速で通過させてそれらの分子量によって分離した。蛋白画分を収集し５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上含む画分な集めた。

〈段階８〉：モノーＳクロマトグラフィー前記く段階７〉から得られたＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白溶液をＦＰＬＣモノ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ、ＨＲ５１５）を通してさらに精製した。ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白溶液を同容量の６Ｍ尿素、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１０ｍＭ燐酸塩を含有する緩衝液Ａ　（ｐＨ７，０）で稀釈し、緩衝液Ａで平衡化したカラムに通過させた後、さらに緩衝液でカラムを洗浄した。その後、６Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１０ｍＭリン駿塩お酸塩０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液Ｂの量を初の５分間は３５％、次いで５５分間は７０％、最終１０分間は１００％に至るように０．８ｍｌ／分の流速で漸進的に増量しながら添加して蛋白を溶出した。ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４ＯＲ上緩衝液Ｂの量が６０％に至った時、即ち、塩化ナトリウム濃度が０．２５Ｍの場合に溶出された。

この画分を４℃でＰＢＳ溶液に対して透析して、少な（とも純度９０％以上のＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白４ｍｇを得た。

（６−Ｅ）：ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白の精製く段階１〉：組換え細菌細胞の培養ＫＨＣＶ　Ｅ２Ｎ蛋白とユビキチンの融合蛋白を産生可能なＥ、ｃｏｌｉ。

ＷＢ２１０ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｎ　（ＡＴＣＣ６８９６６）を、５０　ｕ　ｇ／ｍ１のアンピシリン−含有ＬＢ培地中で１２時間振盪培養した。培養液１０ｍ１を２％カザアミノ酸と１０Ｍｇ／ｍｌのトリプトファン−含有Ｍ９培地１１へ移して３７℃で約３時間振盪培養した。培養液に、０．Ｄ、値が６５０％ｍで０．２になる時インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を加えて最終濃度５０μｇ／ｍ１になるようにして組換えＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白を産生じた。ＩＡＡを添加してから約５時間経過後、培養液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ−６Ｂ、Ｒｏｔｏｒ　ＪＳ４．２）を用いて、３，５００ｒｐｍで２５分間遠心分離してバクテリア細胞沈降物を収集した。この沈降物をＰＢＳで１回洗浄した。

く段階２〉：特異抗原の同定均質液を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。その結果、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白が約２８．０００ダルトンの分子量で発現されたことを確認した。

以後、ゲル上に分離された蛋白をインモビロンＰフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、Ｃａｔ、Ｎｏ、ＩＰＵＨ０００１０，孔の大きさ０．４５μｍ）上にブロッチングした。このフィルターを、０．５％ツイーン２〇−含有ＰＢＳ　（１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ”ｒ、０、領　１５Ｍ　塩化ナトリウム）に入れて室温で２時間振盪して免疫グロブリンＧの非特異結合を遮断した。

これに、０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーンを含有するＰＢＳで前記Ｃ型肝炎患者の血清１０ｍ１を１：２０の割合で稀釈した溶液１０ｍ１を添加した。生成物を室温で１時間弱く振盪しながら反応させた後、０．０５％ツイーン２０− 含有ＰＢＳでそれぞれ５分ずつ４回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）でＦ！識した抗−ヒト免疫グロブリンＧ　（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｃａｔ、Ｎｏ。

６０５　４１５、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ−ＡＬＰ）を０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン２〇−含有ＰＢＳで１：１０００の割合で稀釈し、該稀釈溶／ｆｆ１１０ｍ１をフィルターに添加した。生成物を室温で１時間振盪しながら反応させ、０，０５％ツイーン２〇−含有ＰＢＳで５分ずつ４回、１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ９，５，５ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム）でそれぞれ５分ずつ２回洗浄した。

このフィルターに１２５μｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム（Ｐｉｅｒｃｅ、ＮＢＴ）と２５＋ｕｇ／ｍｌのブロモクロロインドール燐酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ、ＢＣＩＰ）を含有する１００ｍＭ）リス緩衝液を加えて発色させた。その結果、全細胞均質液中、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白がＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的なバンドを形成した。

く段階３〉：細胞破壊及び可溶性蛋白の除去前記段階１から得られた約３ｇのバクテリア細胞沈降物を５０ｍ１の緩衝液１（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１回ｇ／ｍｔペプスタチンＡ）に懸濁し、リゾチーム溶液を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるように加えた後、３７℃で３０分間反応させ、水浴中で超音波粉砕機を利用して７０％の出力で５分間超音波処理して細胞を破壊したのち、溶菌物を得た。前記均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１、ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、不溶性沈降物を得た。

く段階４〉ニトリトンＸ−１００とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前記〈段階３〉の沈降物を３０ｍ１の１％トリトンｘ−ｉｏｏ−含有緩衝液１（２０ｍＭ）リス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール）に懸濁した。該懸濁液を室温で３０分間攪拌した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１　Ｒｏｔｏｒ、ＪＡ１４）を利用して１１、ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、沈降した蛋白を得た。この沈降物を３０ｍ１の緩衝液１に懸濁した。該懸濁液を攪拌し、再び遠心分離して不溶性蛋白を得た。

前記のような簡単な洗浄過程だけで少なくとも純度７０％以上のＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白を得た。

〈段階５＞：８Ｍ尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記く段階４〉のＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白を含む不溶性沈降物を、４０ｍ１の８Ｍ尿素−含有緩衝液２（５０ｍＭ）リス、ｐＨ９，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール）に懸濁した。該懸濁液を室温で１時間攪拌し、遠心分離して不溶性沈降物を除去し、その上澄液を得た。

〈段階６＞　：　Ｓ−２００ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階５〉のＵＢ −Ｅ２Ｎを含む８Ｍ尿素溶液４０ｍ１を、ＹＭＩＯ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて５ｍｌに濃縮した後、４Ｍ尿素−含有緩衝液２で平衡化したＳ−２００樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、２．５ｃｍ　ｘ９０ｃｍ）に時間当り、４０ｍ１の流速で通過させながら、管当たり２ｍｌの画分を収集した。この画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してＵＢ−Ｅ２Ｎを含む画分を収集した。

く段階７〉：Ｑ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記く段階６〉のＵＢ−Ｅ２Ｎを含む溶液を、４Ｍ尿素−含有緩衝液２で平衡化したＱ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、ＦＦ。

Ｌ　２ｃｍ　ｘ　７ｃｍ）に通過させ、０ないし１．０Ｍの濃度勾配で塩化ナトリウムを含む１５０ｍ１の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。これを５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、少なくとも純度８０％以上のＵＢ− Ｅ２Ｎの画分を収集した。

く段階８〉：尿素の除去およびＦＰＬＣ−フェニルクロマトグラフィー前記く段階７〉のＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白を含む４Ｍ尿素溶液をＹＭＩＯ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）で８ｍｌに濃縮した後、透析膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＩＮＣ，、Ｍ、Ｗ、ｃｕｔ　ｏｆｆ６．０００−８，０００）を用いて緩衝液３（２０ｍＭ）リス、ｐＨ９，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム）に対して透析して尿素を除去した。この溶液に塩化ナトリウムを最終濃度ＩＭになるように加えた。生成物をＦＰＬＣ−フェニルセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＨＲ５１５，０，５ｃｍ　ｘ　５ｃｍ）に通過させ、１．０Ｍ−０Ｍの濃度勾配で塩化ナトリウムを含有する４０ｍ１の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。該両分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して少なくとも９０％以上の純度を有するｔＪＢ−Ｅ２Ｎ蛋白を含む画分を収集した。

＜６−Ｆ＞：ｔＪＢ−Ｅ２Ｃ蛋白の精製く段階１＞：　ＫＨＣＶ−Ｅ２Ｃ蛋白とユビキチンの融合蛋白を産生し得るＥ。

ｃｏｉｌ　Ｗ３１１０を５０Ｍｇ／ｍｌのアンピシリン−含有ＬＢ中で１２時間振盪培養した。この培養液２０ｍ１を２％カザミノ酸と１０Ｍｇ／ｍｌのトリプトファンが含有された１１のＭ９培地へ移して３７℃で約２時間振盪培養した。

該培養液に０．Ｄ、値が６５０ｎｍで吸光度が０．３になる時、インドールアクリル＃（ＩＡＡ）を加えて最終濃度が５０Ｍｇ／ｍｌになるようにして組換えＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白を産生させた。ＩＡＡを添加して約３時間経過後、培養液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ６．Ｒｏｔｏｒ　Ｈ３４）を用いて３．５０Ｏｒｐｍで２５分間遠心分離して細胞沈降物を収集した。この沈降物をＰＢＳで１回洗浄した。

く段階２〉；特異抗原の同定沈降物を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。その結果、ｔＪＢ−Ｅ２Ｃ蛋白が約２５，０００ダルトンの分子量として発現されたことを確認した。

以後、ゲル上に分離された蛋白をインモビロンＰフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ｃａｔ、＃ＩＰＵＨ０００１０，孔の大きさ０．４５μｍ）上にブロッチングした。このフィルターを０．５％ツイーン−２０−含有ＰＢＳに入れ、室温で２時間振盪して免疫グロブリンＧの非特異結合を遮断した。これに、０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン−含有−ＰＢＳでＣ型肝炎患者の血清を１＝２０の割合で希釈した溶液１０ｍ１を添加した。この生成物を室温で１時間弱く振盪し、０．０５ツイーン−２０−含有ＰＢＳでそれぞれ５分ずつ４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ−ＨＲＰ）を０，５％ゼラチンと０．０５％ツイーン−２〇−含有ＰＢＳでｌ　：５００の割合で希釈し、この希釈溶液１０ｍ１を前記フィルターに添加した。この生成物を室温で１時間振盪しながら、反応させ、それぞれ５分ずつ０．０５％ツイーン−２〇−含有ＰＢＳで４回、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，０）で２回洗浄した。

このフィルターに４００μｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフトールと０．０３％過酸化水素を含有する５０ｍＭトリス緩衝液を加えて発色させた。その結果、全細胞均質液中、ＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白がＣ型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的バンドを形成した。

く段階３〉：細胞破壊および可溶性蛋白の除去前記段階１から得られた１ｇの細胞沈降物を５０ｍ１の溶菌緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，ＬｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルおよび１Ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ）に懸濁して、リゾチーム溶液を最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間培養した後、水浴中で超音波粉砕機を用いて７０％の出力で５分間超音波処理して細胞を破壊し、均質液を得た。この均質液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１．Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１．００Ｏｒｐｍで２５分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、不溶性沈降物を得た。

〈段階４〉ニトリトンＸ−１００とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前記く段階３〉の沈降物を２０ｍ１の１％トリトンＸ−１００−含有緩衝液１（２０ｍＭ）リス、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に懸濁した。この懸濁液を室温で３０分間攪拌した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ　ＪＡ１４）により１１．０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、沈降蛋白を得た。この沈降物を３０ｍ１の緩衝液１に懸濁した。この懸濁液を攪拌し、再遠心分離して不溶性蛋白を得た。

く段階５＞：８Ｍ尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記〈段階４〉のＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白を含む不溶性沈降物を２０ｍ１の８Ｍ尿素−含有緩衝液２　（５０ｍＭ　炭酸塩ｐＨ９，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール）に懸濁した。この懸濁液を室温で１時間攪拌し、遠心分離して不溶性沈降物を除去したのち、その上澄液を得た。

〈段階６＞：　ＦＰＬＣ−モノＱイオン交換クロマトグラフィー前記〈段階５〉の上澄液を０．１塩化ナトリウム−含有−緩衝液２で平衡化したＦＰＬＣ−モノＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＨＲ５１５，０，５ｃｍｘ　５ｃｍ　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に通過させ、０．１〜０．４Ｍの濃度勾配で塩化ナトリウムを含む４０ｍ１の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。この画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して少なくとも純度８０％以上の画分を収集した。

〈段階７〉：尿素の除去およびＦＰＬＣ−フェニルクロマトグラフィー前記〈段階６〉のＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白を含む８Ｍ尿素溶液なＹＭＩＯ限外濾過膜で１４ｍ１に濃縮した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｍ、Ｗ、ｃｕｔ　ｏｆｆ　６，０００−８．０００）を用いて緩衝液３　（２０ｍＭ　トリス、ｐＨ９，０，１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．２Ｍ塩化ナトリウム）に対して透析して尿素を除去した。この溶液に塩化ナトリウムを最終濃度ＩＭになるように加えた。生成物をＦＰＬＣ−フェニルセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｆ、ａ、ＨＲ５１５，０，５ｃｍ　ｘ　５ｃｍ）に通過させ、ＩＭ−ＯＭの濃度勾配で塩化ナトリウムを含有する４０ｍ１の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。その画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して少なくとも純度９０％以上のＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白を含む画分を収集した。

実施例７　ｎ　ＫＨＣＶ組換え蛋白に対する抗−ＫＨＣＶ抗体の検索（７−Ａ）：抗原濃度による陽性および陰性の混合血清試料の反応性抗原ＫＨＣＶ　４０３．ＫＨＣＶ　８９７およびＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白を各々、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）で各々０．２５μｇ／ｍｌ、２．０ｇｇ／ｍｌおよび２．０μｇ／ｍｌの濃度から２倍ずつ順次希釈した。希釈された蛋白溶液をマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｌｏｎ　ｔｙｐｅ　１　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）の穴に各大当り２００μｌずつ入れた後、３７℃で２時間インキュベートした。この時、プレートをバラフィルムで覆って溶液の蒸発を防止した。

２時間被覆したプレートを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン−２０−含有ＰＢＳ（ｐＨ７，４，以下洗液という）で−回洗浄した。０．１％ゼラチン（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳを２１０μｌずつ各穴に添加し、３７℃で２時間インキュベートさせた。この穴を前記の洗液３００μｍずつで２回洗浄した後、０．２５％ゼラチン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．０％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、および０．０２％チメロザール含有ＰＢ３１９０ｍｌとＨＣＶ患者の混合陽性および陰性血清試料１０μｍを各々の穴に入れて数秒間よく混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。この時、使用したＨＣＶ患者の陽性血清試料と陰性血清試料を使用前にオルト（Ｏｒｔｈｏ）社のＣ−１００抗原を用いたＣ型肝炎診断用キット（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ、Ｊ、、８８８６９．Ｕ、Ｓ、Ａ、）を用いて確認した。

かかる血清試料は大韓民国延世大学医学部内のセブランス病院から提供された。

３７℃で１時間反応させた前記穴を洗液３００μｌで５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ヒトＩｇＧγ鎖免疫グロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　９４８０４、Ｕ、Ｓ、Ａ、、０．１ｍｇ　蛋白／ｍ１）を１０％ウシ胎児血清、１％フィコル（Ｓｉｇｍａ、ｖ／ｖ）、０．０２％チメロザール、および０．０５％ツイーン −２〇−含有ＰＢＳで５０００倍に希釈した後、この希釈溶液を各大当り２００ μｌずつ穴に入れた。その後、３７℃で１時間反応させた後、さらに前記洗液で５回洗浄した。５０ｍＭクエン酸塩緩衝液に溶解して燐酸塩でｐＨ５，５に調整した０−フエニレンジアミンニ塩酸（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ、１０ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌずつ各穴に加えて室温の暗所で３０分間インキュベートした。

各大当たり４Ｎ硫酸を５０μｍずつ添加して発色反応を中止させた後、波長４９２ｎｍでマイクロタイタープレート吸光度測定器（ＤｙｎａｔｅｃｈＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ）を用いて各穴の吸光度を測定した（図１９参照）。

（７−Ｂ）：診断キットの製作診断キットの製作ノタメニ、精製ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ　１４、ＫＨＣＶ８９７およびＫＨＣＶ４０３蛋白の抗原を用いた。その抗原を１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）または５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９０）で最適濃度に希釈し、９６個の穴のイミュロン類型１マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に各大当り１５０〜２００μｌずつ入れた後、４℃で１２〜１８時間インキュベートして抗原をプレートの穴に吸着させた。

各抗原の最適濃度は、ＫＨＣＶ　ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白の場合、０．１８〜０．７５μｇ／ｍｌ、ＫＨＣＶ８９７蛋白の場合、０．０６〜０．３μｇ／ｍ１、ＫＨＣＶ　４０３蛋白の場合、０．１２〜０．５μｇ／ｍｌである。

本実施例においては三つの抗原を各々０．３μｇ／ｍ１ａ度で用いた。

各穴の被覆後、各内容物を吸入器で除去した。プレートを０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン−２０−含有ＰＢＳ　（ｐｉ−ｉ７．４）で洗浄した後、３７℃で２時間０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン−含有−ＰＢＳ　（２１０μｇ／穴）（ｐＨ７，４）で遮凱し、さらに洗液で３回洗浄した。大向の残存水分を吸湿装置で除去した。

各穴に検体試料１０μｌとウシ胎児血清−含有緩衝液（１０ｍＭ　トリス。

ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，２％トリトンＸ−１００、Ｑ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％チメロザール）１９０μｍを加えた後、３７℃で１時間反応させて検体試料内のＨＣＶ抗体と穴に吸着された抗原との結合反応を誘導した。次いで、プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン−２０−含有ＰＢＳ（ｐＨ７，４）で５回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清アルブミン−含有緩衝液（ｌｏｍＭ　トリス、ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０２％チメロザル、１％フィコル）で希釈した抗−ヒトＩ　ｇＧ−ＨＲＰ　（Ｇｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）を２００μｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした後、０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン−２〇−含有ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）で洗浄した。

ＯＰＤ溶液２００μｌを加えて、室温で３０分間発色させた。その後大当り４Ｎ硫酸を５０μｍずつ加えて反応を終止させ、４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。陽性または陰性判定の基準値であるカットオフ値（ｃｕｔ　ｏｆｆｖａｌｕｅ）は陰性血清試料の吸光度平均値に０．４を加えた値と定めた。

前記方法によるＫＨＣＶ蛋白と混合抗原に対する結果は表１に示した。比較用ＨＣＶ診断試薬としてはオルソ（Ｏｒｔｈｏ）社のものを用いており、使用方法は製造業者の指針に従う。

表１．酵素免疫測定法によるＨ　ＣＶに対するＫＨＣＶ蛋白と抗体との反応性注：　１）＋＋＋＋：カットオフ値　＋　１，５〈　吸光度（０，Ｄ、　）＋＋＋：カットオフ値　＋　１．ｏ〈　吸光度　く　カットオフ値＋１．５＋＋：カットオフ値　＋　０．５＜　吸光度　く　カットオフ値＋１．０＋：カットオフ値　く　吸光度　く　カットオフ値＋０．５一：吸光度　く　カットオフ値２）　カットオフ値は抗原ＫＨＣＶ　８９７蛋白の場合０．３２で、ＫＨＣＶ　ＤＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白の場合０．２７で、ＫＨＣＶ４０３蛋白の場合０．３５で、混合抗原の場合は０．４８３で、オルト診断キットの場合は０．４５３であった。

３）　オルソ（Ｏｒｔｈｏ）ＨＣＶ診断キットはオルトダイアグノスチクシステム（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）社から購入し得る。

（７−Ｃ）：診断結果の正確度本発明の診断方法による診断結果の正確性を証明するために、オＪ叶社のＣ型肝炎診断キットで測定した結果、陽性と診断された１７個の血清試料を、本発明の診断キットを用いてさらに診断し、また免疫プロッチングキット（Ｃｈｉｒｏｎ　ＲＩＢＡ　ＨＣＶ　Ｔｅｓｔ−３ｙｓｔｅｍ、２ｎｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、ＰｒｏｄｕｃｔＣｏｄｅ　９３３４９１）で測定した。免疫プロッチングキットは確認分析法（Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）として推薦され、ひとつのＳＯＤ調節抗原を除いた４個の抗原を含む（Ｖａｎｄｅｒ　ｐｏｅｌ、Ｃ，Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ　３３７，３１７−３１９　（１９９１）参照）。

これらの結果は表２に示したが、本発明による診断方法が１３８ページのオルト社のＣ型肝炎診断キットよりずっと低い偽陽性反応（ｆａｌｓｅｐｏｓｆｔｉｖｅ）を示した。

表２二オルソの第２世代免疫プロチングキットと本発明の診断キットによる診断結果の比較注）＊ＳＯＤ対照抗原を除いた少なくとも二つ以上の抗原において陽性反応を示す場合、即ち、十が一つ以上である試料を陽性と判定した。

＊＊実施例（７−Ｂ）から得られた混合抗原を試薬として用いた。

実施例８ニブローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウィルスの存在の確認（８−Ａ）　・Ｃ型肝炎ウィルスからのＲＮＡ抽出検体血清１００ｕｌに１００ｇ１（７）ＴＮＥ溶液（１００ｍＭ　トリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　ＮａＣ１）を加えた後、さらに３００μｌのＲＮＡｚｏｌ溶ン夜（ＴＭ　Ｃ１ｎｎａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ、、Ｔｅｘａｓ、７７５４６、Ｕ、Ｓ、Ａ、）と３００μｍのクロロホルムを添カルで強（振虚しながら混ぜた。生成物を小型高速遠心分離！ｉｌ（、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）を用いて１５．０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離して沈降物を得た。上澄液を集めて、３００ｕｌのフェノールおよび３００ＩＬｌのクロロポルムで抽出した。その抽出物を沈降させた後、その沈降物を１０ＬＬＩ　ＴＥ緩＃Ｉ液（１０ｍＭ　トリスＨＣＩ、ｐＨ８，０，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶がし、−７０”Ｃで保管した。

（８−Ｂ）　ニボリメラーゼ連鎖反応によるＣ型肝炎ウィルスの存在確認前記方法で抽出したＲＮＡを４μｌの蒸留水および１μｍのＯ，ＩＭＣＨ，ＨｇＯＨと混合して室温で１ｏ分間放置した。ここに０．５μｍのＩＭβ−メルカプトエタノール、ＩＣ）ｕｌ　ＲＮａｓｉｎ、５μｌＸ５倍のＲＴ緩衝液（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ、　２０８７７、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、１．２５μ１（７）ｄＮＴＰ　（ｄＧＤＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ各々１０ｍＭずつ）、ｌｕｇの任意プライマー（Ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒ）。

逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｈ−ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＢＲＬ社、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）　１．２５μｌ　（１８単位／μ ｍ）を加え、総容量２５μｌになるように蒸留水を加えた後、４２℃で１時間反応させた。反応終了後、６５℃で１５分間加熱して酵素を失活させた後、ポリメラーゼ連鎖反応に用いた。

第１次ポリメラーゼ連鎖反応は次のように行った。１０μｍの１ｏ倍Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ　）リス−ＭＣＩ、ｐＨ８，３，５００ｍＭＫ　Ｃ１、１５５ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｘ、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１ＯｕｌのｄＮＴＰａ合液（各１．２５ｍＭ）、２μｇのプライマーＡ（５°−ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧ−３°）、２μｇのプライマーＢ（５°−ＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣ−３°）および７５μｍの蒸留水を０．５μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）と混合した。ここに溶液の蒸発を防ぐために５０μ ｍの鉱油を添カルた後、第１次ＰＣＲを９５℃で２分、５５℃で２分、７２℃で３分間の加熱サイクルを４０回繰り返して実施した。

第２次ＰＣＲは第１次ＰＣＲ産物１μｌと１μｍのプライマーｃ（５°−ＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣ−３’　）およびＩμ１（７）ブライ？− Ｄ（５°−ＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧ−３’　）を混合して、第１次ＰＣＲと同一な条件下で２０回繰り返した。

次に、第２次ＰＣＲ産物約５μｍを７％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、Ｃ型肝炎ウィルスの存在可否を測定した。陽性試料存在の場合、１８２ｂｐのＤＮＡバンドを示した。

実施例９　：ＫＨＣＶ蛋白のＣ型肝炎抗原に対する特異抗体の製造（９−Ａ）：免疫生理食塩水に溶かしたＫＨＣＶ８９７蛋白を同量のフロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）とよく混合した後、生後約１０退動のＢａ１ｂ／ｃ種マウスに、５０μｇの蛋白を含有する混合物０．２ｍｌを腹腔内投与した。２−３週おきにフロイント不完全アジュバントと混合された蛋白を３０μｇ注射した。２回目の注射から２週間経過後、マウスの尾から少量採血して、酵素免疫検定法で抗体力価を測定した。力価が１０．０００になると、蛋白５０−１００μｇを含む０．５ｍｌ生理食塩水をさらに注射した。

抗体力価はＥＬＩＳＡの方法に基づいて、０．２吸光単位を表す血清の稀釈度として定義した。３−４日経過後、このマウスの牌臓細胞を融合させて細胞産生単クローン抗体の製造に用いた。

（９−Ｂ）：細胞融合免疫された牌臓細胞をマウスの骨髄腫細胞であるＰ３ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）と融合した。免疫マウスの５Ｘ１０’個牌臓細胞と２　ｘ　１０’個Ｐ３　ｘ　６３−Ａｇ３．６５３骨髄腫細胞を混合し３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞沈降物をＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｕ、Ｓ、Ａ、社）で洗浄した後、遠心分離した。上澄液を傾斜除去し、攪拌しながら５０％ＰＥＧ　（Ｋｏｄａｋ、分子量１４５０ダルトン）１ｍｌを１分に渡って滴加した。生成物をさらに２００Ｘｇで２分間遠心分離した後、５ｍｌのＩＭＤＭ培地を３分間で徐々に添加した後、さらに１０％ウシ胎児血清−含有ＩＭＤＭ培地５ｍｌを５分間徐々に添加しながら攪拌した。

ここに、１０％ウシ胎児血清−含有ＩＭＤＭ培地を加えて最終容量が５０ｍ１になるようにし、１０分間遠心分離した。上澄液を傾斜除去し、Ｐ３　ｘ　６３− Ａｇ、８．６５３の数が５　ｘ　１０’／ｍｌになるように、ＩＭＤＭに１０％ウシ胎児血清、ｌｏｕＭハイポキサンチン、０．４μＭアミノプテリンおよび１６μＭチミジンを含有したＩＭＤＭ−ＨＡＴ培地０．１ｍｌを加えた。生成物を組織培養用９６穴プレートに穴当たりＯ，１ｍｌずつ入れた＊　ｌ　ｘ　１０’ Ｉ１１／ｍｌの腹腔白目食細胞を含有するＩＭＤＭ−ＨＡＴ培地を穴に入れて融合する前に１日培養した。骨髄種細胞および融合されない牌臓細胞はＨＡＴ培地で増殖できない。

したがって、この培地で増殖細胞は融合細胞と見られる。ハイブリドマの成長が１０ないし５０％の上澄液を取って抗体活性の検定を行った。

（９−Ｃ）：単クローン抗体力価のスクリーニング下記の酵素免疫検定方法により段階（９−Ｂ）で得られた単クローン抗体の力価を検索した。

〈段階１〉５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）にＫＨＣＶ８９７蛋白を２μｇ／ｍｌ濃度となるように溶解した。この溶液をイミュロン型プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｍｍｕｌｏｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｐｌａｔｅ）の各穴に穴当り１００ μｍずつ入れた後、３７℃で２時間インキュベートした。

〈段階２〉穴を０．０５％ツイーン−２０（ｖ／ｖ）−含有ＰＢＳ　（ｐＨ７，４、以下洗液という）で１回洗浄し、各穴に残っている蛋白の吸着部位を封止するために０．１％ゼラチン（ｗ／ｖ）−含有ＰＢＳを２００μｍずつ入れて３７℃で１時間振盪した。

く段階３〉前記〈段階２〉の穴を洗液でさらに２回洗浄した後、０．２５％ゼラチン（ｗ／ｖ）、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％トリトン　Ｘ−１００（ｖ／ｖ）および０．０２％チメロザールー含有ＰＢＳ５０ｍｌを加えた。融合細胞が育っている上澄液５０μｍを取って、各穴に加えた後、３７℃で１時間インキュベートした。

〈段階４〉前記〈段階３〉で処理したタイタープレートを洗液で５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗−マウス　ｒｇＧ−ＨＲＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｃａｔ、Ｎｏ、６０５−２５０）を、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）フィニル、０．０２％（ｖ／ｖ）チメロザールおよび０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン−２０（ｖ／ｖ）を含有しているＰＢＳで１：５，０００の割合で希釈した後、この希釈溶液を穴当たり１００μ ｍずつ加えて３７℃で１時間さらにインキュベートした１反応の完了後、プレートをさらに洗液で５回洗浄した。

く段階５〉前記穴に１０ｍｇ／ｍｌの０．Ｐ、Ｄ、（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）を含有する５０ｍＭ＜えん酸塩／燐酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）を１００μｌずつ加えた後、室温の暗所で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸を５０μｍ加えて反応を終止させた。４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。所望の抗体活性を示すハイブリドーマを２４個穴のプレートや、６個穴のプレートに移して増殖させ、必要に応じて、マウスの腹腔内の巨食細胞を適切に培養してフィーダ層として用い、これによって融合細胞の成長に要求される成長因子を提供した。

（９−Ｄ）：抗体の産生所望の単クローン抗体を産生ずる４個の細胞株、即ち、ラッキー１．１゜１．２，１．３および１．４を得た。

本発明の抗体は、常法にしたがってクローンを培養した上澄液またはクローンをＢａ１ｂ／ｃ種マウスの腹腔内で増殖させた腹水液から得た。

０．５ｍｌのブリスタンス（Ｐｒｉｓｔａｎｃｅ、Ｓｉｇｍａ）で７−１４日前に予備処理したＢａ１ｂ／ｃ種マウスに２．５ｘｌＯ’個の融合細胞を腹腔内に注入した。工ないし２週経過後、腹水液が得られ、これらから常法により抗体を分離した。

（９−Ｅ）：単クローン抗体の特性調査前記実施例（９−Ｄ）から得られた各々のクローンから製造した抗体の特性を次の方法で評価した。

〈段階１〉抗体の亜綱マウスの抗体亜綱はハイブリドマ亜綱分析キット（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓｕｂ− Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ）を用いて測定し、その結果を表３に示した。

〈段階２〉酵素免疫検定５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液に２μｇ／ｍｌ濃度となるように溶解したＫＨＣＶ８９７蛋白を２００μｍずつマイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ　ｔｙｐｅ　１）の各穴に入れて３７℃で２時間インキュベートした。プレートを０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン−２〇−含有ＰＢＳで洗浄した。各クローンから得られた抗体を通常の方法により精製して１ｍｇ／ｍｌ濃度と調整した後、０．２５％ゼラチン（Ｖ／Ｖ）、１．０％トリトンＸ−１００，０，０２％チメロザールおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ−含有ＰＢＳで２倍ずつ順次希釈した。０．１％ゼラチン−含有ＰＢＳを２１０μｍずつ各穴に入れて、希釈液を３７℃で１時間さらにインキュベートした。プレートを洗液で洗った。

西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗−マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｃａｔ　Ｎｏ、６０５−２５０）を、１０％ＦＢＳ　（ｖ／ｖ）、１％フィコル（Ｖ／Ｖ）および０．０５％ツイーン−２０を含有するＰＢＳで希釈した後、これを各穴に２００μｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。以下、発色反応は実施例（９−Ｃ）と同様に実施した。各抗体のＥＩＡ効率は４９２ｎｍで吸光度が１．０以上である希釈倍数の逆数と定めた。

その結果を表３に示した。

く段階３〉分子量測定各クローンをプレートまたはマウスの腹膜内で培養した。上澄液または腹水液を蛋白−Ｇセファロースカラムアフニティクロマトグラフイー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりＩｇＧを分離した後、５ＤＳ−ＰＡＧＥして前記から得られたマウス抗体の重鎮と軽鎖の分子量を測定した。その結果を表３に示した。

く段階４〉抗原決定基の測定ＫＨＣＶ８９．７ｃＤＮＡの一部を相異に切除した変種を製造して下記蛋白をコードし、これら蛋白の各単クローン抗体との反応性を調べた。

（１）ＫＨＣＶ８９７蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩにコードされたアミノ酸配列の１１９２番目から１４５７番目のアミノ酸からなる蛋白（２）ＫＨＣＶ２９０蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌにコードされたアミノ酸配列の１１９２番目ないし１２８９番目のアミノ酸からなる蛋白（３）ＫＨＣＶ４３０蛋白：ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌにアミノ酸配列（７）１１９２番目ないし１３３５番目のアミノ酸からなる蛋白（４）ＫＨＣＶ５７０蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩにコードされたアミノ酸配列の１１９２番目ないし１３８２番目のアミノ酸からなる蛋白（５）ＫＨＣＶ６５２蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩにコードされたアミノ酸配列の１１９２番目ないし１４０７番目のアミノ酸からなる蛋白（６）ＫＨＣＶ１５０蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣＩにコードされたアミノ酸配列の１４０８番目ないし１４５７番目のアミノ酸からなる蛋白（７）ＫＨＣＶ２５７蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌにコードされたアミノ酸配列の１３７１番目ないし１４５７番目のアミノ酸からなる蛋白（８）ＫＨＣＶ５１８蛋白：　ＫＨＣＶ−ＬＢＣｌにコードされたアミノ酸８りの１２８５番目ないし１４５７番目のアミノ酸からなる蛋白各ＫＨＣＶ　ｃＤＮＡ断片を発現させた大腸菌細胞に緩衝液（Ｌａｅｍｍｌ　ｔ、　ｕ、　Ｋ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７、６８０　（１９７０）参照）を加えて、１００℃で５分間煮沸して電気泳動用試料を得た。このように製造した試料を免疫プロッチング法（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　７２，３１３−３４０　（１９８４）参照）で抗体との反応性について調べた。

その結果は１表３と表４に示した。

前記結果から見られるように、ラッキー１．１から得られた抗体はＣ型肝炎のアミノ酸配列の１１９２ないし１２８９番目のアミノ酸の認識部位を有し、ラッキー１．２．１．３および１．４は、１３７１番目ないし１４０７番目アミノ酸の認識部位を有する。抗原決定基が相異な二つの単クローン抗体を用いて、サン表３１本発明の単クローン抗体の特性表４．抗体と切除された突然変異種との免疫反応性く段階１〉西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたラッキー１．１の単クローン抗体の櫻識まず、ラッキー１．１細胞を公知の過ヨウ素酸塩法（ｐｅｒｉｏｄａｔｅｍｅｔｈｏｄ、Ｎａｋａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｃｙｔ。

ｃｈｅｍ、、２２．１０８４　（１９７４）参照）により西洋ワサビペルオキシダーゼで次のように標識した。

５ｍｇのペルオキシダーゼを１．２ｍｌの蒸留水に溶かし、ここに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中のＯ，ＩＭ過ヨウ素酸ナトリウム０．３ｍｌを添加し、この混合物を室温で２０分間反応させた。前記反応液を１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で１６時間透析した。２０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，５）に１０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して予め製造された、標識しようとする抗体１ｍｌにペルオキシダーゼ溶液１．５ｍｌを混ぜ、室温で２時間反応させた。

無反応のシッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ’　ｂａｓｅ）を、蒸留水中の４ｍｇ／ｍｌナトリウム・水和物の溶液１００μｍを加えて還元により除去した。続いて、ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）で−夜透析した後、セファクリール５３００クロマトグラフイーカラムを通して非標識の単クローン抗体を除去した。

〈段階２〉ラッキー１．２の単クローン抗体のマイクロタイタープレートへの吸着過程ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌ濃度のラッキー１．２を２００ｍ１ずつ各穴に入れて３７℃で２時間吸着させた。

く段階３〉非特異的結合の遮断前記く段階２〉で用意されたマイクロタイタープレートを０．０５％ツイーン− ２０および０．０２％チメロザールー含有ＰＢＳ　（以下、“洗液”と称する）で１回洗浄した。０．１％ゼラチン−含有ＰＢＳ２００μｌずつを各穴に入れて蛋白吸着部位を１時間に亘って被覆し、さらに前記洗液でプレートを２回洗浄した。

く段階４〉抗原存在の診断０．２５％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、１．０％（ｖ／ｖ）　トリトンＸ−１００，１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０２％チメロザールを含有するＰＢＳで２００ｎｇ／ｍ１濃度で２倍ずつ順次希釈したＫＨＣＶ　８９７抗原蛋白２００μｌを各穴に加えた。比較用として、ＫＨＣＶ蛋白を正常人の血液試料に４００ｎｇ／ｍｌのた後、前記緩衝液１００μｍに前記希釈された血液１００μｌを混ぜて各穴に加えた。血液内でＣ型肝炎の抗原が存在する場合、得られた抗体を用いてサンドウィッチ酵素免疫検定によりその存在を検出し得ることが示されている。

ＫＨＣＶ　８９７抗原を加えなかった正常血液を陰性対照群として用いた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、洗液で５回洗浄した。

く段階５〉ペルオキシダーゼで標識されたラッキー　１．１による抗原のスクリーニング１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１％フィコル、０．０５％ツイーン−２０および０．０２％チメロザールー含有ＰＢＳで５μｇ／ｍｌの濃度に希釈したラッキー１．１の２００ｕｌを各穴に加えた後、３７℃で１時間インキュベートした。

〈段階６〉発色反応前記く段階５〉で処理したプレートを洗液で５回洗浄した後、５０ｍＭ＜えん酸塩／リン酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）に０−フェニレンジアミン（ＳＬｇｍａ）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えて製造したＯ、Ｐ、Ｄ発色反応試薬を２００μｌずつ各穴に加え、室温の暗所で３０分間放置して発色させた。その後、４Ｎ硫酸５０ μｌを加えて反応を終止させた。４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を図４３に示した。

実施例１１：サンドウィッチ酵素免疫検定法を用いたＣ型肝炎患者の血清における抗原スクリーニング実施例１０の段階４で用いた緩衝液１００μｌと混合した分析すべき血清１０μ ｌを、実施例１０のような方法で単ローン抗体が吸着されたマイクロタイタープレートの各穴に加え、前記実施例１０のような方法で血清中の抗原をスクリーニングした。その結果を表５に示した。

この２３１個の試料血清中、２２０個の試料（２２０／２３１）は４９２ｎｍで吸光度が０．１５以下であり、残りの１１個の試料は０．１５〜０．８の吸光度を示し、これを抗原陽性と見なした。ここではハルバートらの方法（Ｈａｌｂｅｒｔ、Ｓ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｉｎ、Ａｃｔａ１２７．６９　（１９８３）ｅ照）によって吸光度０．１５をカットオフ値（ｃｕｔ−ｏｆｆ−ｖａｌｕｅ）とした。

前記実施例７のような方法で、前記１１個の陽性試料を含む１５個の試料のＫＨＣＶに対する抗体をスクリーニングした。その結果を表６に示した。これはＫＨＣＶ８９７抗原検出のためのサンドウィッチＥＬＩＳＡが有用であり、Ｋ　ＨＣＶ　感染の初期検出に用いられることを示している。抗体検出のためのＥＩＡによると、抗原検出のためのＥＬＩＳＡはＨＣＶ患者の治療と予防に有用である。

表５．サンドウィッチ酵素免疫検定法により測定された試料の吸光魔性）ｌ）百分率（％）＝（試験した試料の数）／（試料の総数）表６、Ｃ型肝炎抗体および抗原の検出性）カットオフ値は抗原診断の場合、吸光度０．１５とし、抗体診断の場合、０．３３と設定した。

したがって、３つの蛋白を含有する混合抗原を用いた本発明のＫＨＣＶ蛋白は表１に示した通り、市販用ＨＣＶ診断キットよりＫＨＣＶに対する抗体とさらに反応性があり、本発明の診断キットは市販のキットよりさらに正確な試験結果を示し、表２に示した通り、確認分析キットよりさらに簡便で経済的である。

本発明を特定の実施態様について記述したが、本発明が属する技術分野で熟練された者であれば、添付された特許請求範囲に言及された本発明の範囲内で変更または修正できることが認識されるべきである。

Ｆｉｇ−２−’ＬＦ＝ｇ−２−２Ｆｉｇ−２−３Ｆｉｇ−２−４Ｆｉｇ−２−５Ｆｉｇ−２−６ＦｉＥ；−２７ＰＴＳＧＤＶＶＶＶＡＴＤＡＬＭＴＧＦＴＧＦｉｇ、２−８Ｆｉｇ−２−２一８Ｆｉ　２−：ＬＯＦｉｇ−２２−１１Ｆｉ、２２−４２Ｆｉ、２−２− ４３Ｆｉ　２−１４Ｆｉｇ−２−２− ４５Ｆｉ　２−１６図３図４１　１０００　２０００　３０００　４０００　５０００　６０００　７０００　８０００　９０００（ｂｐ）図５（χ）Ｆｉ、ｇ−６Ｆｉ、ｇ−７ｉｇ−ＢＶａｌＶａｌＧｌｙＧｌｙＨｉｓＴｙｒＦｉｇ−１１１−″ｉミニ−１２Ｆｉｇ−１５Ｆｉｇ−１ｓコ１０Ｆｉ＠−１９ｊｇ−２０Ｆｉｇ−２３Ｆｉｇ−２４！ＩＱ’Ｔ−０！ｎＯＮ　λ−−Ｒｒ工ｓｗα１．−　Ｉ、−Ｖ−−Ｇ−Ｈ−１ −−Ｖ　−Ｍ−Ａ−図３０図３１ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ウェスタンブロッティング図３２ −　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ウェスタンプロ・ンテイングＦｉｇ、３３ニＦｉｇ、３４図３５Ｍ１２３４５６Ｆｉｇ−３６Ｆｉ−ｇ＋　３”７Ｆｉｇ−３８Ｆｉｇ−３９Ｆｉｇ、４０Ｆｉｇ−４４Ｆ　ｉｇ・　４２Ｆｉｇ−４，３図４４ Δ：　希釈緩衝溶液中の抗原口：　血清中の抗原　４９２ｎ＋＋における。、Ｄ２ＫＨＣＶ８９７抗原のｓ度（ｎｇ／＊Ｌ）図４５Ｋｌ（ＣＶ８９７抗原の濃度（ｎｇ／ｍＬ）フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　ｃｔ、　Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／７０　７８２３−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：２１）（７２）発明者　パーク、ヨン・ウー大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、３８６−４（７２）発明者　リン、クー・ジン大韓民国、ソウル、クローク、ドサンー４−トン、１０１８−１８（７２）発明者　チョイ、ドク・ヨシ大韓民国、デジョン、ソーク、ナードン、Ｉ（７２）発明者　ソ、ホン・ツブ大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、３８６−１（７２）発明者　キム、チュン・ヒュン大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、３８６−１（７２）発明者　キム、スジ・タフ大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、３８６−１（７２）発明者　ヤン、ジャ・ヨン大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、３８６−１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＫＨＣＶｃＤＮＡの断片を含むＫＨＣＶｃＤＮＡ。
２．オープンリーディングフレームが、８４２番目、８４９番目および８５３番目のアミノ酸に、各々フェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニンをコードする請求項１記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
３．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
４．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
５．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
６．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項２記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
７．ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１である請求項２記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
８．オープンリーディングフレームが、８４２番目、８４９番目および８５３番目のアミノ酸に、各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンをコードする請求項１記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
９．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１０．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１１．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１２．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１３．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１４．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１５．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１６．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１７．オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列：【配列があります】を含むポリペプチドをコードする請求項８記載のＫＨＣＶｃＤＮＡ。
１８．ＫＨＣＶエピトープをコードするポリヌクレオチド。
１９．請求項１８記載のポリヌクレオチドを含むオープンリーディングフレームを有し、該オープンリーディングフレームが所望の宿主と適合性である調節配列と作用可能に連結されることを特徴とする組換え発現ベクター。
２０．オープンリーディングフレームが、請求項１８記載のポリヌクレオチドと融合されたユビキチンをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１９記載のベクター。
２１．酵母発現ベクターの、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１７、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＣＯＲＥ２２、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ４０３、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−ＫＨＣＶ５７３、ｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２ＮまたはｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ−ＵＢ−Ｅ２Ｃである請求項２０記載のベクター。
２２．大腸菌発現ベクターの、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４、ｐｔｒｐＨ− ＵＢ−ＣＯＲＥ２２、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ− Ｅ２ＮまたはｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ２Ｃである請求項２０記載のベクター。
２３．オープンリーディングフレームが、請求項１８記載のポリヌクレオチドと融合されたマルトース結合蛋白をコードするポリヌクレオチドを含む請求項１９記載のベクター。
２４．大腸菌発現ベクターの、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４２６、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５５５、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ５１３、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ８１０、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７９８、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ７５４、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ６５２、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４０３、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ２７１、ｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９５またはｐＭＡＬ−ＫＨＣＶ４９４である請求項２３記載のベクター。
２５．請求項１９記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
２６．請求項２１記載のベクターにより形質転換された酵母細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
２７．請求項２２記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
２８．請求項２４記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
２９．ＫＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるエピトープを含むポリペプチド。
３０．組換えＫＨＣＶポリペプチドである請求項２９記載のポリペプチド。
３１．請求項１記載のｃＤＮＡによりコードされる請求項２９記載のポリペプチドおよびその断片。
３２．ＫＨＣＶポリペプチドを含む融合ポリペプチドである請求項３０記載のポリペプチド。
３３．請求項２５記載の宿主細胞により産生される請求項２９記載のポリペプチド。
３４．ＫＨＣＶＵＢ８９７蛋白、ＫＨＣＶ８９７蛋白、ＵＢＥ１蛋白、ＫＨＣＶ４０３蛋白、ＫＨＣＶＣＯＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶ５７３蛋白、ＫＨＣＶＵＢＣＯＲＥ１７蛋白、Ｅ２Ｎ蛋白、Ｅ２Ｃ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｃ蛋白、ＫＨＣＶ４２６蛋白、ＫＨＣＶ５５５蛋白、ＫＨＣＶ５１３蛋白、ＫＨＣＶ８１０蛋白、ＫＨＣＶ７９８蛋白、ＫＨＣＶ２７１蛋白、ＫＨＣＶ７５４蛋白、ＫＨＣＶ６５２蛋白、ＫＨＣＶ４０３蛋白、ＫＨＣＶ４９５蛋白またはＫＨＣＶ４９４蛋白である請求項３３記載のポリペプチド。
３５．精製されたＫＨＣＶポリペプチド。
３６．ＫＨＣＶ４０３蛋白、ＫＨＣＶＣＯＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶＵＢ８９７蛋白、ＫＨＣＶＵＢＣＯＲＥ１７蛋白、ＵＢ−Ｅ１蛋白、ＵＢ−Ｅ２Ｎ蛋白、ＵＢ −Ｅ２Ｃ蛋白、ＫＨＣＶＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白またはＫＨＣＶ８９７蛋白である請求項３５記載のポリペプチド。
３７．請求項２５記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項２９記載のポリペプチドの産生方法。
３８．請求項２９記載のポリペプチドを有効成分として含む、試料中のＫＨＣＶ抗原に対する抗体の存在の検出用診断試薬。
３９．請求項２９ないし３６のいずれか二つ以上のポリペプチドを含む請求項３８記載の診断試薬。
４０．ＫＨＣＶＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白、ＫＨＣＶ８９７蛋白およびＫＨＣＶ４０３蛋白よりなる群から選択される一つ以上のポリペプチドを含む請求項３８記載の診断試薬。
４１．請求項３８記載の診断試薬を含む診断キット。
４２．試料中のＫＨＣＶ抗原に対する抗体を検出する診断方法において、以下の工程：（ａ）ＫＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるポリペプチドを、固体支持体に吸着させ、（ｂ）該固体支持体に試料を加えて抗原−抗体複合体を形成させ、そして（ｃ）複合体の量を測定することを含むことを特徴とする方法。
４３．請求項４１記載のキットを各段階に用いる請求項４２記載の診断方法。
４４．前記キットが、請求項４０記載の診断試薬を含む請求項４３記載の診断方法。
４５．ＫＨＣＶエピトープに対する単クローン抗体。
４６．ＩｇＧサブクラスに属する請求項４５記載の抗体。
４７．ＫＨＣＶ８９７蛋白に対する請求項４５記載の抗体。
４８．下記アミノ酸配列：【配列があります】と免疫反応性である請求項４７記載の抗体。
４９．下記アミノ酸配列：【配列があります】と免疫反応性である請求項４７記載の抗体。
５０．ＫＨＣＶエピトープに対する抗体を産生する細胞株。
５１．ラッキ−１．１またはラッキ−１．２である請求項５０記載の細胞株。
５２．請求項４５記載の抗体を有効成分として含む、ＫＨＣＶエピトープを検出するための診断試薬。
５３．請求項５２記載の診断試薬を用いる試料中のＫＨＣＶエピトープの検出方法。
５４．不活化させた精製ＫＨＣＶを含むＫＨＣＶ感染の予防または治療用ワクチン。
５５．請求項３７記載の方法で製造したポリペプチドを有効成分として含有する、ＫＨＣＶ感染の予防または治療用ワクチン。
５６．Ｅ１蛋白、Ｅ２Ｎ蛋白および／またはＥ２Ｃ蛋白を有効成分として含有する、請求項５５記載のワクチン。
５７．ＫＨＣＶｃＤＮＡ由来の８個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む試料中のＫＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの検出用キット。
５８．請求項５７記載のキットを用いる試料中のＫＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの検出方法。