JPH06508024A - C型肝炎診断試薬およびワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
27、請求項22記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項
25記載の宿主細胞。
28、請求項24記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項
25記載の宿主細胞。
29、KHCVに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるエピトー
プを含むポリペプチド。
30、組換えKHCVポリペプチドである請求項29記載のポリペプチド。
31、請求項1記載のcDNAによりコードされる請求項29記載のポリペプチ
ドおよびその断片。
32、 KHCV ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである請求項30記載
のポリペプチド。
33、請求項25記載の宿主細胞により産生される請求項29記載のポリペプチ
ド。
34、KHCV UB897蛋白、KHCV 897蛋白、UB El蛋白、K
HCV 403蛋白、KHCV C0RE14蛋白、KHCV 573蛋白、K
HCV UB C0RE17蛋白、E2N蛋白、E2C蛋白、UB−E2N蛋白
、UB−E2C蛋白、KHCV 426蛋白、KHCV 555蛋白、KHCV
513蛋白、KHCV 810蛋白、KHCV 798蛋白、KHCV 27
1蛋白、KHCV 754蛋白、KHCV 652蛋白、KHCV 403蛋白
、KHCV 495蛋白またはKHCV494蛋白である請求項33記載のポリ
ペプチド。
35、精製されたKHCVポリペプチド。
36、KHCV 403蛋白、KHCV C0RE14蛋白、KHCV UB8
97蛋白、KHCV UB C0RE17蛋白、UB−El蛋白、UB−E2N
蛋白、UB−E2C蛋白、KHCV UB−CORE14蛋白またはKHCV
897蛋白である請求項35記載のポリペプチド。
37、請求項25記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で
培養することを特徴とする請求項29記載のポリペプチドの産生方法。
38、請求項29記載のポリペプチドを有効成分として含む、試料中のKHCV
抗原に対する抗体の存在の検出用診断試薬。
39、請求項29ないし36のいずれか二つ以上のポリペプチドを含む請求1r
Ji38記載の診断試薬。
40、KHCV UB−CORE14蛋白、KHCV 897蛋白およびKHC
V403蛋白よりなる群から選択される一つ以上のポリペプチドを含む請求項3
8記載の診断試薬。
41、請求項38記載の診断試薬を含む診断キット。
42、試料中のKHCV抗原に対する抗体を検出する診断方法において、以下の
工程:
(a)KHCVに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるポリペプ
チドを、固体支持体に吸着させ、
(b)該固体支持体に試料を加えて抗原−抗体複合体を形成させ、そして(c)
複合体の量を測定すること
を含むことを特徴とする方法。
43、請求項41記載のキットを各段階に用いる請求項42記載の診断方法。
44、前記キットが、請求項40記載の診断試薬を含む請求項43記載の診断方
法。
45、KHCVエピトープに対する単クローン抗体。
46、IgGサブクラスに属する請求項45記載の抗体。
47、KHCV 897蛋白に対する請求項45記載の抗体。
48、下記アミノ酸配列:
Ala Val Glu Phe lie Pro Val Glu Ser
MetGlu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val P
he Thr^sp Asn Pro Ser Pro Pro Aim Va
l Pro GinThr Phe G1.n Val Ala His Le
u His Ala Pr。
Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Arg Val
Pr。
Ala Ala Tyr^la Ala Gin Gly Tyr Lys V
alLeu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala^la
ThrLeu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser
Lys AlaH4s Gly lie Asp Pro^sn Leu Ar
g Thr GlyVal Arg Thr lie Thr Thr Gly
Alaと免疫反応性である請求項47記載の抗体。
49、下記アミノ酸配列:
Gly Glu lie Pro Phe Tyr Gly Lys Ala
l1ePro lie Glu Ala lie Lys Gly Gly A
rg HisLeu lie Phe Cys His Ser Lys Ly
s Lys Cys^sp Glu Leu Ala Ala Lys Leu
と免疫反応性である請求項47記載の抗体。
50、KHCVエピトープに対する抗体を産生ずる細胞株。
51、ラッキー1. 1またはラッキー1.2である請求項50記載の細胞株。
52、請求項45記載の抗体を有効成分として含む、KHCVエピトープを検出
するための診断試薬。
53、請求項52記載の診断試薬を用いる試料中のKHCVエピトープの検出方
法。
54、不活化させた精製KHCVを含むKHCV感染の予防または治療用ワクチ
ン。
55、請求項37記載の方法で製造したポリペプチドを有効成分として含有する
、K HCV感染の予防または治療用ワクチン。
56、E1蛋白、E2N蛋白および/またはE2C蛋白を有効成分として含有す
る、請求項55記載のワクチン。
57、KHCV cDNA由来の8個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を
含む試料中のK HCV由来のポリヌクレオチドの検出用キット。
58、請求項57記載のキットを用いる試料中のKHCV由来のポリヌクレオチ
ドの検出方法。
明細書
C型肝炎診断試薬およびワクチン
発明の分野
本発明は、新規なタイプのC型肝炎ウィルス(KHCV)のeDNA由来のポリ
ヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチドおよび該ポリペプチドに対
する抗体;およびこれらの試薬、即ち、前記ポリヌクレオチド、ポリペプチドお
よび抗体のいずれかを活性成分として用いる診断試薬およびワクチンに関する。
発明の背景
一般に、ウィルス性肝炎は、A型肝炎ウィルス、B型肝炎ウィルス、デルタ肝炎
ウィルス、E型肝炎ウィルス、サイトメガロウィルスおよびエプスタイン・バー
ウィルス(Epstein Barr Virus)を含む多様な肝炎ウィルス
ににって発病すると知られており、1980年以降、これらのウィルスの遺伝子
型(genotype)が糾明されることによって、診断試薬、ワクチンおよび
治療剤の開発が容易になった。
また、非A非B型肝炎またはC型肝炎と称される新しいタイプの肝炎が輸血によ
る肝炎の80ないし90%を占め(Lancet 2,838−841(197
5)参照)、かかる輸血性肝炎のうち、約50%までもが肝硬変症および肝癌へ
と進行する。
轡者の血液に内在するC型肝炎ウィルス(HCV)の数は一般に極めて少なく、
HCV−関連抗原および抗体系の同一性または特異性についてはよく知られてい
ない。したがって、治療剤または診断試薬の開発において多(の困難があった。
したがって、HCVに関する研究は、多くの研究員らの関心を集めた。
(Alter、H,、J、et a土、、Lancet、459−463(19
78);Tabor、E、et a上、、Lancet、463−466 (1
978);Hollinger、F、B、et a上、。
Intervirologyユ、 60−68 (1978) ;Wyke。
R,J、eta土、、Lancet、520−524 (1979):Brad
le3’、 D、 W、旦旦、 、 J、 Med、 Vi ro 1.旦。
253−269 (1979)参照)。
ブラッドレイら[Bradley、D、W、et 旦、。
Gastroenterology 旦旦、773−779 (1985))は
、C型肝炎患者の血清をチンパンジーに感染させてその血清を大量確保し、その
血清からHCVを抽出して、それを用いてHCVを分析および研究することによ
って、HCVの生化学的および生物理学的特性を明らかにした。
その後、ブラッドレイの方法によって単離されたHCVウィルスを用いて、C型
肝炎の診断、予防および/または治療のための薬剤の開発に関する研究が行なわ
れた。
チx−(Choo、Q、L、)らは、C型肝炎患者の血清に感染させたチンパン
ジーの血清から抽出されたHCVの部分cDNA断片をクローン化し7ており、
該cDNA断片を大腸菌および酵母で発現させて産生された蛋白がC型肝炎患者
の血清から得られた抗体と免疫学的に反応することを立証した[5cience
244.359−362 (1989)参照]、。
クーオ(Kuo)らは、米国カイロン社(Chiron Co、)が同定した部
分HCVeDNA断片をスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)遺伝子と融合
して酵母で発現させることによって調製したC100−3蛋白が、C型肝炎患者
の血清、および輸血性肝炎(PTH)患者の血清の70%以上と免疫学的に反応
することを明らかにした[Kuo、G、、et a上、5cience244.
362−364 (1989)参照〕。
また、ヒユートン(Houghton)らは、C型肝炎チンパンジーから単離さ
れたHCV (以下、“米国型HCV”と称する)ゲノム配列にコードされたH
CV抗原、特にC100−3が、抗HCV抗体を検出し得る診断試薬およびワク
チンの製造に有用であると記述しており(Houghton M、旦1且土、、
PCT Wo 89104669.Wo 90/11089参照);前記抗原、
例えばC100−3を用いた酵素免疫測定法を用いる診断法を確立した。
1990年、前記発明に基づいて、米国オルソダイアグノスチツクシステムズ社
(Ortho Diagnostic Systems Inc、)は、抗HC
V抗体を検出するための診断試薬を開発して販売した。しかし、前記診断試薬の
活性成分として用いたC100−3抗原は、慢性C型肝炎患者の抗体とは反応す
るが、急性C型肝炎患者、特にその初期段階の患者の抗体とは反応せず;また、
度々、融合されている蛋白であるSODの反応による偽陽性の結果を示す[Sh
’imi zu、 Y、 K、 、旦a1. 、 Proc、 Natl、 A
cad。
Sci、、USA 旦ヱ、6441 (1990)]。
一方、日本人C型肝炎患者の血清から得られたHCVから、ヒユートンらと同一
の方法を用いて、5°−末端領域、およびコア蛋白および外膜(エンベロープ)
蛋白をコードする構造遺伝子を含む部分HCV cDNAクローンが調製された
;cDNAクローンのヌクレオチド配列が決定されて、この配列が米国型HCV
のヌクレオチド配列と約10〜15%差があることが明らかになり、新型、いわ
ゆる日本型HCVの存在が立証された[Kubo、Y、et al、。
Nucl、Ac1d、Res、上ヱ、10367−10372 (1989);
Kato、 N、 et al、 、 Proc、 Japan、 Acad、
且。
219−223 (1990);Kaneko、S、et al、。
Lancet 3旦旦、976 (1990);Takeuchi、に、et且
上、、Gene 91,287−291 (1990);Takeuchi。
K、et al、、Nucl、Ac1d、Res、1旦、4626(1990)
;Takamizawa、A、旦 見上、、J、Virol。
旦旦、1105−1113 (1991)参照】 ;才力モト(Okamoto
)らは日本型HCVに対するワクチンおよび診断試薬の製造のための日本型HC
V由来の抗原の特異性を記述した[Okamoto、H,、旦1 且1.。
Japan、J、Exp、Med、旦0.167−177 (1990)参照J
。
また、ハラダ(Ha r a d a)らは、構造遺伝子の5°−末端部分にコ
ードされたコア蛋白を、推定患者から得られた試料に存在する可能性のある抗H
CV抗体の診断に用いる際、C100−3を用いる場合より感染時から6〜8週
間早(抗体を検出し得ると報告した[Harada、s、、et 旦1.J。
Virol、旦旦、3015 (1991)参照〕。
レスニエブスキ(Lesniewski)らも、C100−3抗原のみを用いた
方法に比べてさらに特異的であり、かつ高感度の複数の抗原を用いる改善された
診断方法を記述しており[EP公報第725354号(1990)参照】。
ワン(Wang)は、異なる10種のHCVエピトープから選択されたエピトー
プを有する15〜65個のアミノ酸から成るポリペプチドを抗HCV抗体検出用
抗原として用いる診断方法を記述している[EP公報第442394号(199
1)参照】。
前記の開示から、一つの抗原だけを用いるがわりに、異なるエピトープを有する
ポリペプチド混合物を用いることによってHCVの診断を改善させ得ることが示
される。
また、ウィルスの表面に糖蛋白の形態で存在する外膜蛋白が、おそらくワクチン
と診断試薬の開発に有用な手段として浮上してきた。HCVと非常に類似なフラ
ビウィルス(Flavivirus)の場合には、外膜蛋白と非構造蛋白(NS
I)が宿主細胞の免疫機作の誘導および宿主細胞の受容体への結合に重要な役割
をもっと知られている[F、Preugschart、J、Virol。
旦旦、4749−4758 (1991)参照]。また、外膜蛋白に対する抗体
の形成は、C型肝炎からの回復と深い関連があると報告された[Lesniew
ski、R,et al、、p59;Watanabe et且工、、p82.
第3回国際HCVシンポジウム、Strabourg。
France (1991)参照J。
また、ヒユートン(Houghton)らは、外膜2 (E2)蛋白のアミン末
端領域が、著しい種による異種性(Speciesheterogeneity
)を示すので、E2蛋白は免疫機作との関連性が深いと推定されるため、前記E
2蛋白がC型肝炎ワクチンの製造に重要な抗原であることができるという可能性
を提示している(第3回国際HCVシンポジウム、p20.Strasbour
g、France、1991);また、日本型HCVゲノムと米国型HCVゲノ
ム間のヌクレオチド翫ツリの比較がら、コア蛋白をコードするヌクレオチド1B
IJの場合、約91%の相同性を示すが、外膜蛋白をコードするヌクレオチド配
列の場合には、約74%の相同性を示すことが明らかになった[Takeuch
i、に、et al、、J、Gen、Vir、ヱ1゜3027−3033 (1
990)参照〕。
発明の概要
前記した通りに、異なる地域(国)で発見されたHCVは、多様な領域で異種性
を示し得;かかる異種性はワクチンの有効性および診断試薬の感度および正確度
に決定的な要因になり得る。
したがって、本発明は、韓国人C型肝炎患者から単離され、米国型および日本型
を含む既に発見されたHCVとは異なる新しいタイプのHCV (KHCV)の
単離および特性付けに関するものである。
より詳しくは、本発明は、前記KHCVの全て配列決定されたcDNAおよびい
くつかのHCV変種の部分的に配列決定されたcDNAを提供する。KHCVに
由来するcDNA配列の部分は、試料中のウィルスの存在を診断するためのプロ
ーブまたはプライマーとして有用であり;かかるヌクレオチド配列を用いる診断
キットおよび方法も本発明のさらに別の態様を構成する。
また、本発明は、診断試験における試薬として、および/またはワクチンの成分
として有用な前記cDNAにコードされたポリペプチドを提供する。
前記ポリペプチドは、非HCV蛋白と融合されたポリペプチドのような組換えポ
リペプチドを初めとして、KHCVエピトープを含む多様なポリペプチド、およ
びその精製された形態を含む。
本発明の他の態様は、目的の宿主との適合性がある調節配列に作動可能に連結さ
れたKHCV cDNAのオーブンリーディングフレーム(ORF)を含む組換
え発現ベクターであって、KHCV由来のポリペプチドと他のタイプの蛋白また
はポリペプチドとの融合ポリペプチドを製造するために、非KHCV蛋白をコー
ドするヌクレオチド配列を含んでいてもよい組換え発現ベクター;該組換え発現
ベクターによって形質転換された宿主細胞;およびそれから産生されたポリペプ
チドに関する。
本発明のまた別の態様は、KHCVエピトープを含むポリペプチドをコードする
配列を含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養することを特徴
とするKHCVエピトープ含有ポリペプチドの産生方法、およびその方法で産生
されたKHCVエピトープ含有ポリペプチドである。
本発明のまた別の態様は、KHCVエピトープに対する単クローン抗体を含む。
本発明のまた別の態様は、前記単クローン抗体を産生ずるバイプリドーマ細胞に
関するものである。
本発明のさらに別の態様は、試料中の抗−KHCV抗体を検出するための活性成
分として、一つ以上のKHCVエピトープを含む一つ以上のポリペプチドを含有
する診断試薬、およびそのような試薬を含む診断キットである。
本発明のまた別の態様は、試料中のHCV抗原を検出するための活性成分として
、検出しようとするKHCV抗原に対する一つ以上の単クローン抗体を含む診断
試薬、およびそのような試薬を含む診断キットである。
本発明のまた別の態様は、KHCVエピトープ含有ポリペプチドおよび不活化ま
たは弱毒化されたHCVを含む、HCV感染の治療および/または予防用ワク添
付図面を参照すれば、本発明をより容易に理解できる。添付図面において、図1
は、多様fl K HCV c D N Aりo −:zのKHCV−LBCl
上における相対位置を示し、
図2−1ないし図2−16は、KHCV−LBCIのヌクレオチド配列およびそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図3は、KHCV−
LBCIにおける各cDNAクローンの始めのヌクレオチド番号および終りのヌ
クレオチド番号を示し、図4は、KHCV−LBCl、および米国型HCVゲノ
ムおよび日本型HCVゲノムのヌクレオチド配列の比較分析を示し、図5は、K
HCV−LBCI、米国型HCVおよび日本型HCVにコードされるアミノ酸配
列の比較分析を示し、
図6は、KHCV−LBCl、および米国型HCVゲノムおよび日本型HCVゲ
ノムの5′−末端領域のヌクレオチド配列の比較分析を示し、図7は、cDNA
断片N52−LBC2のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペ
プチドのアミノ酸配列を示し、図8は、cDNA断片N52−LBC3のヌクレ
オチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、
図9は、cDNA断片N52−LBC20のヌクレオチド配列およびそれにより
コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図10は、cDNA断片N5
2−LBC21のヌクレオチドI’11およびそれによリコードされるポリペプ
チドのアミノaSりを示し、図11は、cDNA断片N52−LBC23のヌク
レオチド!E3t11およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、図12は、cDNA断片N52−LBC25のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図13は、cD
NA断片N52−LBC26のヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図14は、cDNA断片N52−LBC2
7のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、図15は、cDNA断片N52−LBC28のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図16は、cD
NA断片N52−LBC29のヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図17は、cDNA断片N52−LBC3
0のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、図18は、cDNA断片N52−LBC31のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図19は、cD
NA断片N52−LBC32のヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図20は、cDNA断片N55−LBC2
0のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、図21は、cDNA断片N55−LBC21のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図22は、cD
NA断片N55−LBC23のヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図23は、cDNA断片N55−LBC2
5のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、図24は、cDNA断片N52−LBC27のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図25は、cD
NA断片N52−LBC28のヌクレオチド配列およびそれによリコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、図26は、サブタイプKHCV−Llまた
はKHCV−L2に属するKHCV変種のcDNAのNS2領域にコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列を比較分析したものであり、
図27は、サブタイプKHCV−Llに属するに、 HCV変種のcDNAのN
S2領域のヌクレオチド配列を比較分析したものであり、図28は、サブタイプ
KHCV−L2に属するKHCV変種のcDNAのNS2領域のヌクレオチド配
列を比較分析したものであり、図29は、各々サブタイプKHCV−Llおよび
KHCV−L2に属するKHCV変種cDNAのNS5領域のヌクレオチド配列
を比較分析したものであり。
図30は、KHCV cDNAの断片を酵母細胞内で発現させるために構築した
発現ベクターを示し、
図31Aは、酵母細胞でKHCV cDNA断片を発現させた後の、SDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)の結果を示し、図31Bは図
31−Aのゲルを用いたウェスタンブロッティング(Westernblott
fng)分析の結果を示し、図32は酵母細胞内でのKHCV E2NおよびE
2Cポリペプチドの産生を示す5DS−PAGEの結果(図31A)およびウェ
スタンブロッティング分析の結果(図31B)を示し、
図33は化学的に合成したユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を示し、図34
はKHCV cDNA断片を大腸菌細胞内で発現するためのtrpプロモーター
を含む発現ベクターを示し、
図35はKHCV cDNA断片を大腸菌細胞内で発現するためのtacプロモ
ーターを含む発現ベクターを示し、
図36ないし図38は大腸菌細胞内でのKHCV cDNA断片の発現後のS
D S −P A G Eの結果を示し、図39ないし図41は前記図36ない
し図38のゲルを用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示し、
図42はtacプロモーターの調節下でMBP遺伝子と融合させたKHCVcD
NA断片を大腸菌内で発現させた後の5DS−PAGEの結果を示し、図43は
図42のゲルを用いたウェスタンブロッティング分析の結果を示し、図44は試
料中の抗HCV抗体の検出に用いたKHCV抗原の濃度による酵素免疫測定(E
IA)の標準曲線を示し。
図45は試料中に存在するKHCV抗原の濃度関数として、単クローン抗体を用
いたEIAの標準曲線を示す。
発明の詳細な説明
本明細書に言及された全ての文献は、参照により本明細書に包含されるものであ
る。
本明細書中で用いられる下記用語は、次のような意味を有する。
用語“C型肝炎ウィルス”は、非A非B型肝炎またはC型肝炎の原因となるウィ
ルスをいう。用語HCVおよびNANBV、ならびにNANB肝炎(NANBH
)およびC型肝炎は、各々互換的に用いられる。
用語“韓国型C型肝炎ウィルス”または“KHCV”は、韓国人C型肝炎患者か
ら単離された新型HCVをいい、そのcDNAは842番目、849番目および
853番目のアミノ酸が各々フェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニンであ
るか、各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンであるアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列のオーブンリーディングフレームを有する。
用語“エピトープは免疫学的能力のある宿主で免疫反応を起し得る、および/ま
たはそれ自体が相補的な抗体に特異的に結合し得るポリペプチドの抗原決定基を
いう。本発明の抗原決定基は、一般に少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは7
または8個のアミノ酸から成っている。
用語゛断片”は、本発明のcDNAまたは蛋白のうちの一つの、下位配列(su
bsequence)を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
前記断片は、DNAには制限エンドヌクレアーゼを、蛋白にはプロテアーゼを用
いて、より大きい分子の酵素的切断により産生させ得る。しかし、本発明の断片
は、いかなる特定形態の酵素的切断による産物にも限られず、末端がいかなる酵
素的切断点にも相当しない下位配列を含むこともできる。前記断片は、例えば、
本明細書で提供された配列データを用いて化学的合成により製造し得る。
蛋白断片もまた、これをコードするDNA断片を発現させることによって産生さ
せ得る。前記蛋白断片は、これが免疫反応性および/または抗原性決定基の構成
に十分な数のアミノ酸残基を含んでいる場合、本発明に有用である。
用語“オーブンリーディングフレーム”は、連続的なヌクレオチドトリブレット
(triplet)がポリペプチドをコードするアミノ酸を指定するコドンとし
て読まれる、ポリヌクレオチド配列の一領域をいう。
用語“発現ベクター”は、ポリヌクレオチド挿入物(インサート)の発現を促進
するように設計されたクローン化媒体をいう。
用語“調節配列”は、例えば、プロモーター、リボゾーム結合部位およびターミ
ネータ−を含む、ポリヌクレオチド配列の発現調節に関連するDNA配列を意味
する。
用語“組換λKHCVポリペプチド”は、図2−1ないし2−16および図7な
いし図25のKHCV cDNAにコードされた、少な(とも6個のアミノ酸配
列を含み、KHCV cDNAにコードされたポリペプチドにおいて連らなって
いるアミノ酸以外のアミノ酸に連らなったポリペプチドをいう。
用語“精製KHCVポリペプチド”は、実質的に純粋で均質であり、天然に伴う
細胞成分から分離されたKHCVポリペプチドまたはその断片をいう。一般に、
精製K HCVポリペプチドは、約70ないし90%以上のポリペプチド、好ま
しくは95%以上のポリペプチドを含む。
本明細書中で用いられるその他の用語は、当該分野で通常に用いられる従来の意
味を有する。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
KHCV cDNAのクローン化
KHCV cDNAライブラリーを下記のように作製する:韓国人C型肝炎患者
の血清から、HCV粒子を超遠心分離機で沈降分離し、該HCV粒子からHCV
RNAを抽出し;ランダムプライマーまたはオリゴd(T)プライマー、およ
び逆転写酵素を用いて、該HCV RNAから二本鎖cDNAを合成し;cDN
A断片を、PCR反応により増幅した後、または直接、Eco RIアダプター
を付着させてUNI−ZAPXRベクター(Stratagene Co、11
099 N、Torrey、PinesRoad、、 (CA、U、S、A)に
クローン化し、該ベクターをウィルス粒子にパッケージングしてcDNAライブ
ラリーを作製する[5aiki、P。
K、et al、、5cience、230.1350 (1985)参照〕。
一般に、肝炎ウィルス粒子は、肝炎患者または感染されたチンパンジーの血清ま
たは肝臓から分離し得る。本発明では、C型肝炎患者の血清から)(CV粉粒子
分離し;超遠心分離機により沈降させたHCV粒子からHCVの全RNAを抽出
し、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行う。
その後、前記HCV全RNAを、Zap−cDNA合成キット(Cat。
No、200400.Stratagene Co、11099 N。
Torrey Pines Rd、、La Jolla、CA 92037゜t
J、 S、 A口を用いた反応において、cDNAの作製用鋳型として用いる。
前記cDNAは、全RNA、およびランダムプライマーRANPSHCVまたは
オリゴd (T)プライマーを用いて逆転写酵素の反応により合成され、ここで
、ブライv−RANPSHCV (5’ −TTTTTCATGATTGGTG
GTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN−3°、ここで、N
はA、G、TまたはCを意味する)およびオリゴd (T)プライマー(5°−
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAG (T)
+。−3゛)は、各々の3°末端領域に6個の無作為のヌクレオチド(プライマ
ーRANPSHCV)または18個のT(オリゴd (T)プライマー)と、制
限エンドヌクレアーゼXho I認識部位とを含む。
容易なりローン化のために、合成されたcDNAにEco RI認識部位(5°
−GAATTC−3’ )を導入するために、Eco RIアダプター(5°−
CCCCCCGAATTCGGCACGAG−3°)、(3’ −GGGGGG
CTTAAGCCGTGCTC−5°)を合成cDNA断片に連結する。
次いで、プライマーPSHCV (5°−TTTTCATGATTGGTGGT
GGA−3”)とEco RIプライマー(Eco RIアダプターの上側の鎖
)を用いるPCRによりcDNA断片を大量増幅し:該cDNA断片を制限エン
ドヌクレアーゼEco RIとXho Iで部分消化し;消化されたcDNAを
、Eco RIおよびXho Iで消化したUNI−ZAPXRベクター(λ
gtllの変種)と連結し:生成したDNAを、インビトロ(試験管内実験)で
ギガパック■ゴールドパッケージングキット(Gigapack I IGol
d Packaging Kit、Cat、No、200214゜Strata
gene Co、、U、S、A、)を用いてλファージの粒子内にパッケージン
グした後、大腸菌細胞に粒子を感染させて増幅することによってcDNAライブ
ラリーを作製する。
cDNAライブラリーを大腸菌細胞上にまいてファージプラークを形成させた?
&、KHCV cDNAから由来するポリペプチドの産生が可能であると考えら
れる、C型肝炎患者の血清中の抗体と反応性であるファージクローンを選択する
ため、前記プラークをフィン(Huynh)により記述された免疫学的な方法に
よりスクリーニングする[DNA Cloning:A PracticalA
pproach、Vol、1、pp49−78、IRL Press、tJK(
1985)参照]。
一方、UNI−ZAPXRベクターは、大腸菌細胞内で切除されてKHCVcD
NA断片を含むファージミツド、pブルースクリプト(pBluescript
)を産生ずることができ[5hort、etal、、Nucl、Ac1d、Re
s、1旦、7583−7600 (1988)参照]、これは通常のプラスミド
として扱い易い。また、pブルースクリプト(pBluescript)はf1
複製開始点(o r i g i n)およびCo1E1複製開始点を有するの
で、場合により一本鎖または二本鎖の形態で得られる。
陽性プラークで感染された大腸菌から単離された二本鎖pブルースクリプト(p
Bluescript)DNAをエンドヌクレアーゼEcoRIとXho Iで
消化して、EcoRIおよびXhoI認識部位の間に挿入されたKHCVcDN
A断片の存在および長さを電気泳動によって確認し;サンガー(Sanger)
の方法(Proc、Natl、Acad、Sci、U、S。
A、ヱ丘、5463 (1977)参照】によってcDNA断片のヌクレオチド
配列を決定する。
その後、クローンcDNAの決定されたヌクレオチド配列に基づいて新たなオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成して、全KHCV cDNAの残りの領域を得る
ために、cDNAライブラリーをスクリーニングし、次に、このようにして得た
新たなcDNAクローンを、再びスクリーニングにおいて使用してさらに他のK
HCV cDNAクローンを得る。また、KHCV cDNAの予め決定された
ヌクレオチド配列に基づいて合成されたプライマーを利用して、KHCVcDN
Aの一部をPCHによって得られる。
重なり合っているcDNA断片を連結してK)(CV c D N Aの全配列
を決定することができ;これから一つのオープンリーディングフレームが推定さ
れる。
このようにして得た全cDNA配列を有するKHCV cDNAをKHCV−L
BClと命名し、これを、特許出願のための微生物寄託に関するブダペスト条約
下の国際寄託機関ATCC(American Type Cu1tureCo
l 1ection3に、寄託番号ATCC75008号として1991年5
月14日付で寄託した。
KHCV−LBClの全ヌクレオチド配列およびこれによりコードされるアミノ
酸配列は図2−1ないし図2−11に示されており;各cDNAクローンのKH
CV−LBCI配列上の位置は図1ないし図3に示す、KHCV−LBCIは5
′−末端から数えて343番目のヌクレオチド(A)から9372番目のヌクレ
オチド(G)まで、9030個のヌクレオチドから成っている一つの長いオーブ
ンリーディングフレームを有する。アミノ酸の識別番号は、前記9030個のヌ
クレオチドに5′−末端から3′−末端の方向ヘコードされたポリペプチド内の
アミノ酸の位置によって指定される。
本発明によって製造されたKHCV−LBCIの5′−末端領域には、日本型C
型肝炎ウィルスより13個のヌクレオチドがさらに多く存在することが明らかに
なった[K a t o、N、et al、、Proc、Natl、Acad。
Sci、U、S、A、旦ヱ、95224 (1990)参照〕。図6に示したよ
うに、米国型C型肝炎ウィルスと比べると、1個のヌクレオチドがさらに発見さ
れ、5′−末端領域のヘアピン(hairpin)構造を成す22個のヌクレオ
チドのうち、3個が異なることが明らかになった。5゛−末端領域は一般にウィ
ルスの遺伝子発現およびその調節に重要な役割をもち;22個のヌクレオチドか
ら成るヘアピン構造はレプリカーゼおよびコア蛋白の認識部位として考えられ、
したがって、前記領域における構造上の僅かな差までも、その役割または特異性
において、重要で、具体的な変化を伴うことができる。
同様に、KHCV−LBClの全ヌクレオチド配列およびそれにコードされたア
ミノ酸配列を米国型HCVおよび日本型HCVのものと比較した。その結果、米
国型の場合には、KHCV−LBClのヌクレオチド配列は約78.3%のレベ
ルまで相同で、それにコードされたアミノ酸配列は約84.2%の相同性を示し
:日本型の場合、ヌクレオチド配列は90.9%の相同性を有し、アミノ酸配列
は93%の相同性を示した(図4ないし図6参照)。前記結果から、KHCV−
LBCLが既に識別されたHCVとは明らかに異なる新たなタイプのHCVであ
ることがわかる。
KHCV変異種の部分cDNA断片の作製C型肝炎患者の血清から分離した前記
KHCVから、各々KHCV RNAを抽出し;各KHCV RNAのCDNA
をPCRによって合成してNS2領域またはNS5領域に相当するcDNA断片
を得ろ。このようにして得た各cDNA断片の長さは各々約340bp (NS
2)および320bp (NS5)である。
cDNA断片をM13mp18およびM13mp19(New England
Biolabs、32 Tozer Road Beverly。
MAO1915−5599、U、 S、 A、 )に挿入して、それらのヌクレ
オチド配列を決定する(図7から図25参照)、それらのヌクレオチド配列は、
NS2領域で91%ないし94%(図27および図28参照)、NS5領域で9
6%ないし99%の相同性(図29参照)を示し、NS2領域およびNS5領域
にコードされたアミノ酸配列は各々90%ないし94%および93%ないし99
%の相同性を示す(図26参照)。
また、KHCVは、NS2領域にコードされた各々842番目、849番目およ
び853番目のアミノ酸によって、二つのサブタイプ、すなわち、KHCV−L
lとKHCV−L2に分けられることが発見された。KHCV−Llに含まれる
KHCVのcDNAは、842番目アミノ酸としてフェニルアラニンを、849
番目アミノ酸としてロイシンを、また、853番目アミノ酸としてトレオニンを
各々コードするが、KHCV−L2に含まれるcDNAはロイシン、フェニルア
ラニンおよびアラニンを各々コードする。KHCV−Llのサブタイプとしては
、KHCV−LBCI、KHCV−LBC20、KHCV−LBC23、KHC
V−LBC26およびKHCV−LBC32が含まれ、KHCV−L2(+)?
ブタイブはKHCV−LBC2、Kl(CV−LBC3、KHCV−LBC21
、KHCV−LBC25、KHCV−LBC27、KHCV−LBC28、KH
CV−LBC29、KHCV−LBC30およびKHCV−LBC31を含む。
前記の特徴は、アミノ酸がシスティン、フェニルアラニンおよびバリンである米
国型HCVの場合には、見られないことに注意しなければならない。しかしなが
ら、日本型はKHCV−L2と同一の特徴を有する。すなわち、前記位置にある
アミノ酸が各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンである。
KHCV−LBCIを除いて、KHCV−Llに属するcDNA、すなわち、K
HCV−LBC20、KHCV−LBC23、KHCV−LBC:26およびK
HCV−LBC32の各々を含むM13mp18ファージを含むM13ファージ
群(M13mp18−NS2LL)は、1992年3月13日付で、ATCCに
寄託番号ATCC75211号として寄託しており、KHCV−L2に属するc
DNA、即ち、KHCV−LBC2、KHCV−LBC3、KHCV−LBC2
1、KHCV−LBC25、KHCV−LBC27、KHCV−LBC28、K
HCV−LBC29、KHCV−LBC30およびKHCV−LBC31の各々
を含むM13mpファージを含むM13ファージ群(M13mp1B−NS2L
2)は、同日付でATCCに寄託番号ATCC75212として寄託した。
本発明のcDNAは、下記実施例の方法以外にも、図2−1ないし図2−16お
よび図7ないし図25に提供されたヌクレオチド配列情報を使用して化学的に合
成することもできる。かかる化学的な合成は、マテウチ(Matteucci)
などのホスホアミシト(phosphoamidite)固体支持方法[J、A
m、Chem。
Soc、上見立、3185 (1981)参照]のような公知方法を使用して行
なうことができる。
また、遺伝暗号の縮重によって、図2−1ないし図2−16および図7ないし図
25に示したアミノ酸配列をコードできる多くの潜在的ヌクレオチド配列が存在
することも理解されよう。
発現ベクターの構築およびこれによる蛋白の産生KHCVから誘導されたちの以
外の他のポリペプチドとの融合蛋白の産生を指令することができるベクターを初
めとして、本発明によるKHCV cDNA断片を含む発現ベクターの作製のた
めに、多様な発現システムを利用することができる。
たとえば、かかるベクターシステムは、ユビキチン(ul)iquitine)
発現システムを使用して構築できる。酵母において、ユビキチンは、ユビキチン
分解酵素(ubiquitinase)によりAr g−G 1 y−G l
yのすぐ次の位置で切断されると知られている(Ozkaynak et、al
、。
Nature、見上旦、663−666 (1987)l照〕。また、バクマイ
ル(Bachmair)は、ユビキチンと融合された外来蛋白もまたユビキチン
のArg−Gly−Glyに隣接する部位で切断され得ると報告した[Bach
mair、 et at、 、 5cience 234.178−186(1
986)参照]。
したがって、KHCV cDNA断片とユビキチン遺伝子との融合ポリヌクレオ
チドを酵母内で発現させると、発現された融合蛋白が酵母細胞のユビキチン分解
酵素によって切断されてユビキチンが除去され、その結果、KHCV蛋白のみが
残るので、望ましいKHCV蛋白が得られる。
また、KHCV cDNA断片とユビキチン遺伝子を含有する融合ポリヌクレオ
チドを大腸菌で発現させると、ユビキチンを含有する融合蛋白が得られるであろ
う。しかしながら、ユビキチンは試験管内でユビキチン分解醪素により切断する
ことができ、ユビキチンを含まないKHCV蛋白が得られる。融合蛋白は、もち
ろんそれ自体として本発明の目的に使用することができ;KHCV蛋白も、KH
CV蛋白の必要な特性、たとえば、KHCVの抗原性を保持する限り、やはりそ
れ自体本発明に使用し得る。
前記発現システムは、目的の蛋白が不安定で、宿主細胞内の蛋白分解酵素によっ
て容易に分解され得る場合、ユビキチンが蛋白分解酵素の攻撃から目的の蛋白質
を保護するか、これを安定化させ得ることができるので、効果的に使用され得る
。
ユビキチンシステムを利用する発現ベクターは、KHCV cDNA断片を、ユ
ビキチン遺伝子含有発現ベクターに挿入することによって作製することができる
。
一方、マルトース結合蛋白(MBP)システムを利用する融合発現ベクターも本
発明の発現ベクターとして使用することができる。このシステムにおいては、M
BPをコードするmalEl遺伝子の後にKHCV cDNA断片を連結し、こ
れによってMBPとK)(CV蛋白の融合蛋白を産生させる[Guam、旦工且
土、、Gen6 旦ヱ、21−30、(1987);Maina、et al、
、Gene ヱユ、369−373 (1988);Amann、et al。
、Gene40.183−190 (1985);Duplay、et al。
、J、Biol、Chem、2旦旦、10606−106’13 (1984)
参照〕。
前記MBP発現システムは、マルトースに対するMBPの親和力を利用してMB
P含有融合蛋白を容易に精製でき、またMBPがC−末端領域に蛋白分解酵素因
子Xaによって切断可能な部位を有するので、KHCV蛋白をMBPから容易に
分離し得るという点で便利である。
目的とするKHCV蛋白を得るためには、適合する宿主細胞を、KHCVcDN
A断片を含む発現ベクターで形質転換させ、形質転換された細胞を発現可能な条
件下で培養する。
発現させるKHCV cDNA断片は、制限エンドヌクレアーゼまたはヌクレア
ーゼをさらに大きい断片またはKHCV−LBCIと共に使用し、また、プライ
マー、および鋳型としてのKH(1:V−LBClまたはその断片を使用してP
CRを行なうことによって作製し得る。各プライマーの長さおよびヌクレオチド
配列は、発現させるKHCV cDNA断片の位置および長さによって決定する
ことができ;プライマーは二本鎖のKHCV cDNAのいずれかの鎖に完全に
または部分的に相補的であってよい。
いったん作製し、単離したら、本発明のKHCV cDNA断片は、挿入された
遺伝子配列の転写および翻訳に必要な要素を含む適切な発現ベヒクル(vehi
cle)に挿入する。有用なりローン化ベヒクルは、多様な公知の細菌プラスミ
ドのような合成りNA配列を初めとして、他の非KHCVポリヌクレオチドのセ
グメント、ファージDNA、またはファージDNAもしくは他の発現調節配列を
使用するように変更されたプラスミドまたは酵母プラスミドの組合せから成って
いてもよい。
適当な宿主生物の選択は、当該分野に公知の多数の要因によって影響を受ける。
これらの要因には、たとえば、選択されたベクターとの適合性、組換えプラスミ
ドによってコードされる蛋白の毒性、目的とする蛋白の回収の容易性、蛋白の特
性、生物安全性、費用などが含まれる。前記要因間の平衡は必ず考慮しなければ
ならず、あらゆる宿主が特定の組換えDNA分子の発現に同等の効果を奏するも
のではないことは理解されなければならない。
本発明に使用し得る適当な宿主生物としては、植物、哺乳動物、昆虫細胞または
酵母細胞、および大腸菌のような細菌が挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。
KHCV cDNA由来のポリペプチドは、コア蛋白、非構造蛋白および外膜蛋
白およびその一部を全部含み、これらは、単独でまたはそれらの混合物の形態で
診断試薬またはワクチンの作製に使用し得る。宿主細胞で産生されたポリペプチ
ドは、通常の方法、たとえば、細胞破壊、遠心分離、透析、塩析、クロマトグラ
フィー、ゲルろ過、電気泳動および電気溶出などの多様な方法を組合わせて使用
することによって分離精製できる。
本発明のポリペプチドはまた、KHCV粒子から単離するか、適当な方法、たと
えば、排他的固相合成法(exclusive 5olid phasesyn
thesis)、部分固相法、断片縮合法または通常の液相合成法によって、化
学的に合成することもできる。固相合成法は、メリフィールド(MerrifL
eld)方法が好ましい[J、Am、Chem、Soc。
見立、2149 (1963)参照〕。
また、蛋白において、生物学的および免疫学的な活性を実質的に変化させないア
ミノ酸置換が起こることは広く知られており、例えばNeurath、旦1a1
.. +The Proteins”Academic Press、NewY
ork (1979)、特にその14頁の図6などに記載されている。最もひん
ばんに観察されるアミノ酸置換は、Ala/Ser%Val/Ile、Asp/
Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、
Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/
Arg、Asp/Asn、Leu/I is、Leu/Va1.Ala/Glu
、Asp/Glyの置換とその逆の置換である。
本発明の実施態様例の、このような機能的に等価なアミノ酸!換は、生成された
蛋白が一つ以上のKHCVの抗原決定基を保持する限り、本発明の範囲内に含ま
れる。
本明細書においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸を示すために標準1文字略字
またはm準3文字略字を使用する。かかる略字の意味は、通常の生化学教材に示
されている〔例えば、Lehninger”Pr1nciples ofBio
chemistry+、Worth Publtsher Inc、。
New York、pp96.798、(1984)参照〕。
K HCV抗体の検出のためにKHCV抗原ポリペプチドを使用するC型肝炎の
診断方法
本発明はまた、一つ以上のK)ICVエピトープを有しているKHCVポリペプ
チドを含む診断試薬を用いる診断方法に関するものである。KHCVポリペプチ
ドを使用した診断方法は、C型肝炎患者の血清中のKHCV抗体を検出すること
において、既存のいかなる方法より特異的で、かつ正確である。
新規な診断方法は下記工程から成る。
第一に、一つ以上のKHCVポリペプチドを含む診断試薬を、固体支持体、たと
えば、微量適定板(マイクロタイタープレート)のウェル(well)に入れて
KHCV抗原をウェルの表面に吸着させ、第二に、希釈液で希釈された試料を抗
原で被覆されたウェルに加え、ここで血清中に抗KHCV抗体がある場合、抗原
−抗体複合体が形成され、第三に、酵素、たとえば、HRP (西洋ワサビペル
オキシダーゼ;horseradish peroxidase)と結合された
抗ヒトIgGをウェルに加え、抗ヒトIgG−HRPを第二の段階で形成された
複合体の抗体に結合させ、最後に、酵素の基質、たとえば、ペルオキシダーゼに
対するO−フェニレンジアミンニ塩酸塩(OPD)および過酸化水素なウェルに
加えて発色させる。血清試料が抗KHCV抗体を含む場合、酵素と基質との反応
により色が現れる。稀硫酸を添加することによって発色反応を中止させる。
色の強度は、マイクロウェル読取り機によって測定し得、かかる結果に基づいて
抗HCV抗体の存在を決定することができる。診断方法に使用される固体支持体
は、ポリスチレンビーズまたはニトロセルロースストリップでもよい。
また、本発明は、一つ以上のKHCVエピトープを担持するKHCVポリペプチ
ドを含む診断試薬から実質的に成る、前記手順を行なうのに必要な試薬を含むC
型肝炎診断用キット(k i t)を提供する。
抗体の作製
本発明は、KHCV cDNA由来のポリペプチドに対する抗体を提供する。
簡単に言えば、適当な動物を選択し、望ましい免疫プロトコールを行なう、適当
な時間の後、前記動物の腎臓を切除し、各々の腎細胞を、適当な選択条件下で、
通常的には骨髄腫細胞と融合させる。その後、該細胞をクローン的に分離し、各
クローンの上清液を使用して抗原の目的領域に対して特異的な適切な抗体の産生
を試験する。
動物、たとえば、マウスは次のもののような常法によって免疫され得る。
実質的に精製された抗原を、マウスに筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内へ注射
し、さらに詳しくは、−匹当り総投与量100ないし200μgを14ないし2
1日おきに数回注射する。必要であれば、フロイント(Freund)の完全ア
ジュバントまたは不完全アジュバントのような通常のアジュバントを併用するこ
ともできる。最終注射の3日後、生存率95%以上で、対数増殖期にあるマウス
骨髄腫細胞との融合のために、マウス腎細胞をとり出す。
細胞の融合は、当該分野に公知された方法にしたがって行なうことができる[例
えばLovborg、”Monoclonal antibodies:Pro
duction & maintenance″、WilliamHeinem
ann%Medical Books Ltd、(1982)参照〕。
このようにして得た融合細胞は、公知の方法を使用して段階的に稀釈して、目的
とする抗体を産生ずるクローンを検出する[例えば、“CurrentProt
o−cots in Immunology”、WileyInterscie
nce (1991)参照〕。
目的とするクローンは、酵素免疫測定法、プラーク方法、スポット方法、オフタ
ロニー法および放射性免疫検定法などのような常法にしたがってスクリーニング
することができる[”Hybridoma Methods &Monoclo
nal Antibodies”、Re5earch andDevelopm
entPress、pp30−53 (1982)参照J。
目的とする単クローン抗体は、クローン化された抗体産生細胞株を使用して当該
分野の熟練者によって容易に得られ、親和性クロマトグラフィーなどの常法にし
たがって精製することができる。
かかる抗体は、KHCV抗原の精製、および試料中のKHCV抗原を検出するた
めの改善された診断方法の開発に有用である。
診断用オリゴヌクレオチドプローブおよびキットの作製図2−1ないし図2−1
1および図7ないし図25に示したKHCVcDNAの決定されたヌクレオチド
配列に基づいて、KHCV cDNAilKのいずれかに相補的な、少な(とも
8個のヌクレオチドを、切断によってまたは合成によって作製することができる
。オリゴヌクレオチドは、標識、たとえば、放射性標識を使用した標識後にハイ
ブリッド形成用プローブとして、または血清試料中のKHCVの検出用鋳型とし
てKHCV cDNAを使用するPCR用ブラプライマーて使用することができ
る。
オリゴヌクレオチドは、状況によって、KHCV cDNA鎖に完全にまたは部
分的に相補的であることもできる。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも8個のヌクレオチド、好ましくは10ないし
12個のヌクレオチド、さらに好ましくは約20個のヌクレオチドを含有する。
ワクチンの作製および投与
当該分野の公知方法を使用して作製された不活化または弱毒化されたKHCV、
ならびに本発明のKHCV cDNA断片にコードされた一つ以上のポリペプチ
ドは、生理学的に許容可能な担体と共にワクチンに製剤化し得る。好適な担体は
、たとえば、中性pHの0.01ないしO,1M燐酸塩緩衝液または生理食塩水
である。
HCVに対する強化された免疫は、ワクチンにアジュバントまたは免疫強化剤を
加えることによって、またはポリペプチドを架橋結合された複合体または担体に
結合された形態として、さらに大きい形態で提供することによって生成すること
ができる。
ワクチンのために好適なアジュバントは、アジュバント65〔落花生油、マンニ
ドモノオレート(mannide monooleate)およびアルミニウム
モノステアレート含有] ;水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウムおよびミョ
ウバン(alum)のような無機ゲル;ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミ
ン、リンレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、N、N−ジオク
タデシル−N’、N′−ビス(2−ヒドロキシメチル)プロパンジアミン、メト
キシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニック(pluronic)ポリオ
ールのような界面活性剤;ビラン、デキストランスルフェート、ポリIC、ポリ
アクリル酸およびカルボボールのようなポリアニオン:ミュラミルジベブチド、
ジメチルグリシンおよびツフッシン(tuftsin)のようなペプチド;およ
びオイル乳化液を含むことができるが、それに限定されるものではない。
本発明の蛋白は、またリボゾームまたはほかの微細担体内に包含させて投与して
もよい。
本発明の蛋白、とくにそれらのさらに小さい断片の免疫原性は、架橋結合によっ
て、または免疫原性担体分子(すなわち、本発明の蛋白および蛋白断片を共有結
合により連結し得る、宿主動物で独自に免疫反応を起す特性を有する巨大分子)
に対するカップリングによって増加され得る。架橋結合または担体分子に対する
結合は、小さい蛋白断片が時にハブテン(抗体に特異的に結合できるが、抗体産
生を起さない、すなわち、免疫原性ではない分子)として作用するので、必要と
なり得る。免疫原性担体分子に対する前記断片の結合は、通常的に“担体効果”
として知られた効果を通じて断片を免疫原性にする。
好適な担体分子としては、たとえば、ポリペプチド、ポリサツカリド、リポポリ
サツカリドなどのような蛋白および天然または合成高分子化合物が挙げられる。
有用な担体中の一つは、キール(Quil)Aと呼ばれるグリコシドである(M
orein、et al、、Nature 30旦、457 (1984)参照
]。キーホールウノアシガイ(keyhole 1 impet)ヘモシアニン
、ヒトまたはウシのγ−グロブリン、ヒト、ウシまたはウサギの血清アルブミン
、または前記蛋白のメチル化誘導体もしくは他の誘導体のような、蛋白の担体分
子がと(に好ましいが、これに限定されるものではない。他の使用し得る蛋白担
体は、当該分野の熟練者には公知である。
担体分子に対する共有結合カップリングは、当該分野に公知の多様な方法を使用
して行なうことができ、その正確な選択は、たとえば、使用する担体分子の性質
によって指定され得る。免疫原性担体分子が蛋白である場合、本発明の蛋白また
はその断片は、ジシクロへキシルカルボジイミドまたはゲルタールアルデヒドの
ような水溶性カルボジイミドによって前記担体蛋白にカップリングさせ得る。
前記のようなカップリング剤は、また、別の担体分子を使用せず、蛋白およびそ
の断片をそれ自体で架橋結合させるのに使用し得る。蛋白またはその断片の集合
塊間のかかる架橋結合もまた、免疫原性を増加させ得る。
リボゾームまたは他の微細担体内への包含は、ワクチンを長時間にわたって放出
させる効果を提供することができる。
ワクチンは一回用量で、好ましくは数回用量で投与できる。ワクチン製剤中に存
在するポリペプチドの有効量は、免疫対象個体の体重、抗体を産生ずる個体の免
疫系の能力および目的とする免疫の度合いによって、約5ないし約200μgの
範囲であってよい。好ましくは、初回ワクチン接種の1ないし数ケ月後に追加ワ
クチン接種(ブースター)を行なう。数回のブースターを投与してもよい。皮下
、皮内、筋肉内または静脈内投与などの標準的投与ルートを用いることができる
。
下記実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明をより詳細に説明
するためのものであり;実施例において使用した実験方法は、別に言及しない限
り次の参考例に従って行なった。
異なることを指示しない限り、固体混合物中の固体、液体中の液体、液体中の固
体について以下に与えるパーセンテージは、各々重量/重量、容量/容量および
重量/容量の基準である。
参考例1:制限エンドヌクレアーゼを利用したDNAの切断制限酵素と反応緩衝
液はNEB (New EnglandBiolabs、、Jolla、MA、
U、S、A、)社から購入した。
反応は、50μmないし100μl容量の滅菌エッペンドルフ管を使用して37
℃で1時間ないし2時間行なった。その後、反応混合物を65℃で15分間熱処
理(耐熱性のエンドヌクレアーゼの場合にはフェノールで抽出してエタノールで
沈降させる)して制限エンドヌクレアーゼを不活性化させた。制限エンドヌクレ
アーゼ反応のため、10倍反応緩衝液は下記の組成を有する:10倍NEB反応
緩衝液1:100mM ビストリスプロパン−HCl、100 m M M g
Cl z、10mMジチオトレイトールDTT、pH7,0
10倍NEB反応緩衝液2+100mM トリス−HCl、100mMMgC1
,,500mM NaC1,10mMDTT、 pH7,0
10倍NEB反応緩衝液3:100mM トリス−MCI、100mMMgC1
x、1000mM NaC1,10mMDTT、pH7,0
10倍NEB反応緩衝液4:200mM トリス−アセテート、100mM酢酸
マグネシウム、500mM 酢酸カリウム、10mM DTT、pH7,0
参考例2:フェノール抽出およびエタノール沈降酵素反応の完了後、酵素を失活
させるか、反応混合物中のDNAを回収するために、反応混合物をフェノールで
抽出した。ここで、10mM トリス−HCI(pH8,0)および1mM E
DTAを含む緩衝液で予め平衡化されたフェノールを使用した。フェノール抽出
は同容量の試料とフェノールとを振盪して混ぜ、混合物を15.OOOrpmで
5分間遠心分離し、水性層を他の管へ移すことによって行なった。前記過程を2
回または3回繰返した。
次に、水性層を同容量のクロロホルム(クロロホルム:イソアミルアルコール=
24 + 1)で抽出し、水性層をさらに分離した。これに0.1の容量の3M
酢酸ナトリウムと2.5容量のエタノールを加え、混合物を一70℃で30分間
または一20℃で12時間静置した後、15.OOOrpm、4℃で20分間遠
心分離して核酸を回収した。
参考例3:連結反応
DNAの連結反応は、NEB社のT、DNAリガーゼと10倍連結反応緩衝液(
0,5M トリス−HCl、0.1M MgCl□、0.2M DTT。
10mM ATP、0.5mg/mlの牛血清アルブミン(BSA))を使用し
て行なった。反応容量は通常20μlで、DNAの接着末端の連結には10単位
のT4リガーゼを使用し、平滑末端を有するDNAの連結には、100単位のも
のを使用した。
前記反応は16℃で5時間、または4℃で14時間以上行なって、反応終了後、
65℃で15分間加熱してT、DNAリガーゼを失活させた。
参考例4:大腸菌の形質転換
下記実施例のために使用された大腸菌菌株は旦、coli HBIOI(ATC
C33694)、E、coti W3110 (ATCC27325)、E、c
olt JMIOI (ATCC33876)および旦、coliJM105
(ATCC47016)である、大腸菌の形質転換は、当該分野で公知である方
法にしたがって行なうことができる(Maniatis、et且工、、+Mo1
ecular cloning:A LaboratoryManual、Co
1d Spring Harbor Press、N、Y。
(1982))’またはCohen、Proc、Natl、Acad、Sci。
U、S、A、見立、2110 (1972)参照)。
参考例5:酵母の形質転換
文献に記述された方法で酵母を形質転換させた(Beggs、Nature参照
)。
参考例6:オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは自動化された固相ホスホアミダイト法を利用するDNA合
成機(Applied Biosystems、Inc、の38OB)で合成し
た。
合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ポリアクリルアミドゲル(2M尿素、1
2% アクリルアミド:ビーズ(29: 1)、50mM トリス。
50mMホウ酸、1mM EDTA)、電気泳動および5EP−PAK(Wat
ers Inc、製品、U、 S、 A、 )カラムクロマトグラフィーを使用
して精製し、260nmにおける0、D、を測定することによって定量した。
参考例7:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)10%gないし1100nの鋳型、
10μlの10倍濃度Taqポリメラーゼ反応緩衝液(10mM トリス−MC
I、500mM KCI、15mMMgC1,,0,1%(W/V)ゼラチン、
pHs、3)、foulのdNTPの混合液(dGTP、dATP、dTTPお
よびdCTPが各々2mMずつである)、2μgの各々のプライマー(通常、2
個のプライマーを使用し、3個のプライマーを使用する場合、中間位置のプライ
マーは0.02μgの量で使用する)および0.5ulのAmplL TaqD
NAポリメラーゼ(PerkinElmer Cetus製品、U、S、A、)
の混合物に蒸留水を加え、100μmの総容量を作った。ここに、50μlの鉱
油を添加して、反応混合物の蒸発を防いだ。
温度循環機(Perkin Elmer Cetus製品、U、 S、 A、
)を使用してPCRを行ない、95℃で1分−55℃で1分→72℃で2分間の
サイクルを25回以上繰り返すようにプログラムし、最終的に72℃で10分間
反応を行なった。
反応終了後、混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈降させることによっ
てPCR産物を回収し、沈降物を20μmのTE緩衝液(10mMトリス−HC
l、1mMEDTA、pH7,5)に溶解した。
実施例1:KHCV cDNA KHCV−LBCIの作製(1−A)韓国人C
型肝炎患者の血清からHCVの単離及びそれからウィルスゲノムRNAの抽出
非A非B型肝炎と診断された韓国人慢性肝炎患者の血清50m1(ALT<60
IU;大韓民国高麗大学医学部内科及びカドリック大学医学部内科提供)をプラ
トレイ(Bradley、D、W)らの方法(Gastroenterolog
y旦旦、773 (1985))に見立て超遠心分離してHCV粒子を沈降させ
た。
血清50m1をTENB緩衝液(0,05M)リス、pH8,0゜0、OOIM
EDTA (エチレンジアミン四酢酸)、0、LM NaC1)で6倍稀釈し
た後、ベックマンローター5W28 (Beckman社製。
Model L8−80M)を用いて常温で約6時間28.OOOrpmで超遠
心分離した。
ウィルス粒子沈降物からウィルスゲノムRNAの抽出はコロジンスキ(Chol
ozynski、P、)とサツキ(Sacchi、N)の方法(Anal、Bi
ochem、、上旦λ、156−159頁(1987)参照)によって次のよう
に行なった。ウィルス粒子沈降物を8mlのRNA抽出液(4M チオシアン酸
グアニジン;24mMNa−<えん酸塩、pH7,0,0,5%サルコシルおよ
び0.1M2−メルカプトエタノール)に懸濁した。2M 酢駿ナトリウム(p
H4,0)0.8ml、フェノール8m1(BRL社、U、S、A、、蒸留水で
飽和された)およびクロロホルム−イソアミルアルコール(49: 1.v/v
)1.6mlを加えて混合した後、12.000 x gで15分間4℃で遠心
分離した。その後、上澄液を新しい試験管に移して同溶量のイソプロパツールと
担体としてグリコーゲン(2μg/ml上澄液)を添加した。混合物を一20℃
の冷蔵庫で約1時間放置した後、12,000 x g、4℃で20分間遠心分
離してRNA沈降物を得た。この沈降物を75%エタノールに懸濁した後、前記
のように遠心分離して真空条件下で約10分間乾燥した。ウィルスRNA沈降物
を400μmのTE緩衝液(10mM )リス、pH7,5,1mM EDTA
)に溶解して、次の段階に用いた0次に用いるためのウィルスRNA溶液は、−
70℃で保持し得る。
(1−B)KHCV cDNAライブラリ(l 1brary)の作製(1−B
−1)KHCV cDNAの合成cDNAの合成のために、Zap−cDNA合
成キット(Stratagene社製、U、S、A、)を用いた。
前記の実施例(1−A)から得たC型肝炎ウィルスRNAを逆転写酵素の鋳型と
して用いて、ヌクレオチド配列5” −GAGAGAGAGAGAGAGAGA
GAACTAGTCTCGAG (T)、a−3’ を有するオリゴ−d (T
)プライマー及びヌクレオチド配列5’ −TTTTTCATGATTGGTG
GTGGAACTGGACCGTCTCGAGNNNNNN−3° (ここで、
Nなどは同じDNA合成器(Applied BLosystems社製、U、
S、 A、 。
Mode 1 380B)を用いて合成した。
cDNAの第一の鎖を次のように合成した。:実施例(1−A)から得られた肝
炎ウィルスのRNA溶液18μlを2μlのO,LM CHs HgOHと混合
して、該混合物を常温で10分間放置してRNAの2次構造を外した。ここに、
2μlのIM β−メルカプトエタノールを加えて、該混合物を常温で5分間放
置した。処理されたRNA溶液に5μlの逆転写酵素反応緩衝液(500mMト
リス−MCI、pH8,3,750mM KCI、30mM MgC1*および
10mMジチオトレイトール(dithiothreitol ;DTT)+2
.5ulの各々10mMのdATPおよびdGTP、dTTP、5−メチル−d
CTP、2μmのオリゴ−d (T)プライマー(1,4μg/μl)または2
μ1(7)RANPSHCV (1,0+ug/μl)、15ul(7)ピロカ
ルボン酸ジエチル(DEPC;diethylpyrocarbonate)で
処理された蒸留水および1.OulのRNase阻害剤、IU/LLl、Pro
mega社製、U、S、A、)の順に加えた後、室温で10分間放置してRNA
鋳型にプライマーを結合させた後、ここに2.5μlのMMLV逆転写酵素(1
8U/μl、5uperscript RNase H−reversetra
nscriptase、BRL社製、Cat、No、88533A)を加えた。
反応混合物を37℃で1時間インキュベートしてcDNAの第一の鎖を合成した
。
cDNAの第2の鎖を合成するために、前記第1の鎖溶液45μlに40μlの
10倍濃度の第2の鎖緩衝液(188mM トリス−HCl、 pH6,9,9
06mM KCl、46mM MgC1*、1.5mM β−NAD にコチン
アミドアデニンジヌクレオチド;nicotinamide adenined
inucleotide)、100mM(NH4)s 5O4)、6.0+ul
の10mMdNTP混合物(dATP、dCTP、dTTPおよびdGTP 各
々10mM)及び298μlの蒸留水を順番に加えた後、試験管の壁に沿って1
.0μlのRNase H(4U/ul)および10.0+ulのDNAポリメ
ラーゼI (DNA polymerase I、IIU/μl)を滴下した後
、重速に反応溶液を混合して、16℃で2.5時間インキュベートした。
その後、この反応溶液を同量のフェノール−クロロホルム(1: 1(V/V)
、フェノールは0.5M Tris−MCI (pH7,5)および0.1%(
V/V)β−メルカプトエタノールで予め飽和させた)で3回抽出した。上層の
水性相を取って0.1容鳳の3M酢酸ナトリウムおよび2倍容量の100%エタ
ノールと混合した。この混合物を一20℃で1夜放置し、12.000 x g
、4℃で20分間遠心分離してcDNA沈降物を回収した。
(1−B−2)cDNAライブラリの作製前記の実施例(1−B−1)から得た
二本鎖cDNAを平滑末端(blunt−end)に作るために、前記cDNA
沈降物に43.5μlの蒸留水を加久て溶かした後、39μmのcDNA溶液を
取ってこれを5.0μmの74 DNAポリメラーゼ反応液(670mM トリ
ス−HCl、pH8,8,166mM <NH4)−SO4,67mM MgC
15、loomM β−メルカプトエタノール、6’luM EDTA)、2.
5μlの2.5mMdNTP混合物および3.5μmのT4 DNAポリメラー
ゼ(2,9ulμm)と混合した。該反応混合物を37℃で30分間放置した後
、この反応生成物を実施例(1−B−1)の方法と同様に、フェノール−クロロ
ホルムで抽出し、エタノールで沈降させた。
その後、5°−末端制限酵素Eco RIの認識部位を導入するために、平滑末
端を有す2本鎖cDNAを次のように処理した:沈降物に平滑末端を有するcD
NAに7.0ulのEco RI アダプタ(Stratagene社製。
Zap−cDNA 5ynthesis Kit Cat、No。
200400、CA、U、S、A、)、1.0μlの10倍濃度連結反応緩衝7
?li、1.0μmのT4 DNAリガーゼ(100OU/μl)および1.0
μlの10mM ATPを加えて、4℃で一夜放置した。生成された混合物70
℃で10分間加熱してリガーゼを失活させた。
このようにして得たcDNAを直接クローン化し得るが、本実施例では前記cD
NAを増幅させた後、クローン化段階に用いた。
cDNAの増幅のために、そのPCRを次のように行った:前記から得られたc
DNA溶液に10μmの10倍濃度PCR緩衝液(200mM Tris−HC
l、pH8,3,15mM MgC1g 、250mM KCl、0.5%ツイ
ーン20.1mg/ml ゼラチン)、10μmの2mM dNTPa合物、5
μlの5°−TTTTTCATGATTGGTGGTGGA−3°のヌクレオチ
ド配列を有するPSHCVプライマーと5μmのEco RIアダプターの上部
配列(5’−CCCCCCGAATTCGGCACGAG−3°)、lμl (
2,5単位)のTaq DNA ポリメラーゼ(PerkinElmer−Ce
tus社製、761 Main Avenue。
Norwalk、CT 06859−0010.U、S、A、)および69μm
の蒸留水を加え、95℃で30秒→55℃で30秒→72℃で2分間のサイクル
を連続25回繰返するようにプログラミングされた温度循環器(Thermal
Cycler、 Perkin Elmer−Cetus社、U、 S、ん)を
用いてPCRを行なった。反応完了後、セントリコン 100(Centric
on too、Amlcon社製 、Cut、No。
4200、P、O,BOX91954.Chicago、IL 60693゜U
、S、A、)を用いて、残留プライマー及びdNTPを除去した。その後、前記
のように生成物をフェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降させて
沈降物を得た後、16μlのTE緩衝液で溶解した。
生成された溶液に、ここに2μlの10倍濃度緩衝液(0,5M NaC1゜0
.5M Tris−MCI、50mM MgC1g、5mM DTT。
pH7,91とEco RIとXho I (New EnglandBiol
abs、Inc、、30Tozer Rd、、Berverly。
MA、U、S、A、)を各々1μlずつ添加して混合した後、37℃で10分間
放置してcDNA断片を部分切断した。cDNA断片などを前記のようにフェノ
ール/クロロホルム抽出の後、エタノールで沈澱させて、この沈降物を10μl
のTE緩衝液に溶解した。
このcDNA断片をUNl−ZAPXRベクター内へ次のようにクローン化した
:前記から得たEco RI/ Xho Iで処理されたcDNA断片10ul
に2.0μlのlO倍濃度連結反応緩衝液、2.0μlの10mMATP、4.
0μmのベクターUNI−ZAPXR溶液(EcoRI/Xh。
工で既処理された)(lμg/μm)と2,0μlの74 DNAリガーゼ(4
Weiss U/μl)とを加えた後、反応混合物を16℃で約10時間インキ
ュベートした。
、 (実施例1−B−3)CDNAを含むベクターのファージ内へのパッケージ
ングおよびcDNAライブラリの増幅(試験管内の試験)前記実施例(1−B−
2)から得られた連結されたDNAをファージ内にパッケージングするために、
ギガバック■ゴールドパッケージング抽出物(GigapackII Gold
Packaging Extract、。
Stratagene社製、U、 S、 A、 )に実施例(1−B−2)の最
終溶液10LLLを加えた後、室温で2時間放置した。
生成混合物に5001Llのファージ希釈液(142当たり、5.8gのNaC
1,2,0g(1)MgS0.4H* 0.50m1のIM Tris−HCI
。
pH7,5,5mlの2% ゼラチン)および20μlのクロロホルムを加えた
(Kretz、et al9.Nucl、Ac1d、Res、上ヱ、5409(
1989))。
感染および増幅は次のように行った。
大腸菌merA−1merB−菌株、即ちPLK−F ′(Stratagen
e社製、Zap−cDNA 5ynthesis KitCat、No、200
400)をLB培地(12当たり、バタトートリップトン10g、酵母抽出物5
g、NaC110g)で0. D、 goo (600%m波長での光学濃度(
optical density))が0.5となるまで培養した。培養された
細胞を沈澱させて10 m M M g S O4に溶かして、1.0の0.D
、6゜。に合わせた。該溶液600μlを前記パッケージング混合物20OLL
Lと混合した後、37℃で15分間放置してファージを大腸菌で感染させた。溶
融し48℃に保持した0、7%NZY寒天(12当り、NZアミン7g、NaC
15g、MgSO4・7Hi O2g、酵母抽出物5g。
バクトーアガ−7g)を得られた大腸菌に加え、この混合物を150mm直径の
NZY寒天プレート(1β当たり NZアミン7g、NaC15g。
M g S O4・7 Hz 0 2 g、酵母抽出物5g、バクトーアガ−1
6g)の上に加えた後、37℃で5ないし8時間インキュベートしてファージプ
ラークを形成させた。
次いで、10m]のファージ希釈液を前記プレート上に注いで、4℃で約15時
間弱(振盪してファージを溶存させた後、4.000 x gで遠心分離して大
腸菌細胞を沈降させて除去した。このようにして得たHCVcDNAライブラリ
溶液に0.3%容量のクロロホルムを加え、cDNAライブラリの力価(tit
er)を測定して約1010ないし10”PFU(プラーク 形成単位)7m1
の値をめた。100% DMSO(dimethy 1sulfoxide)を
7%(v/v)の濃度となるように添加して、cDNAライブラリを一70℃で
保持した。
(実施例1−C)免疫測定方法によるcDNAライブラリのスクリーニング及び
cDNA配列の決定
実施例(1−A)で調製した6倍稀釈血清を超遠心分離して得た上澄液を蛋白G
アフィニテーカラムクロマトグラフィ−(Genex社製、U、 S、 A、
)で精製したHCV抗体を用いて、免疫検索(immunoscreening
)方法(Huynh、T、V、et al、、且にΔ−見見上立上1旦ITec
hni ues:A Practical Approach(D、M。
Glover、ed、)pp 49−78.IRL Press、0xford
(1985))によりcDNAライブラリをスクリーニングした。
前記実施例(1−B−3)から製造されたcDNAライブラリ溶液をプレート(
直径 150mm)当たり、約50,0OOPFUとなるように稀釈した後、実
施例(1−B−2)と同じ方法で製造した大腸菌XLI−ブルー(Strata
gene社製、U、S、A、Zap−cDNASynthesis Kit C
at、No、200400)培養液600μm(0,D、soo =Q、5)と
混合した後、6.5mlの0.7% NYZ寒天をそれに加えた。各混合物を4
0個のNYZ寒天プレートの上に各々加えて、37℃で12時間培養した後、約
2 x 10’個のファージプラークが形成された。
次に、直径137mmのナイロンフィルター(Bio−Rad社、Cut。
No、162−163.U、S、A、)のプラークリフト膜(plaqueli
ftmembrane)に10mM IPTG(isopropyl−β−D−
thiogalactopyranoside)溶液を浸み込ませた後、’)ト
vン(Whatman)3MM フィルター上で吸い取り乾燥した。各フィルタ
ーをプレートの寒天上に置いて、37℃で3.5時間インキュベートした。
ファージプラークが吸い取ったフィルターを、各々15m1の洗浄液(10mM
Tris−HCI、pH8,0,150mM NaC1,0,05%Twe e
n 20)で洗浄した。このフィルターに15m1のブロッキング溶液(1%
ウシ血清アルブミン20mM トリス−MCI、pH7,5,150mMNaC
1)を添加して、弱く揺りながら室温で1時間インキュベートした。
その後、各々のフィルターを15m1のTBST緩衝液(20mM トリス−H
Cl、pH7,5,150mM NaC1,0,05%(v/v)ツイーン−2
0)で、室温で5分間弱く揺りながら5回洗浄した。精製HCV抗体(最終蛋白
濃度8.2mg/ml)を1%(W/V)牛胎児血清(FBS)を含むTBS緩
衝液(20mM トリス−MC1,pH7,5,150mMNaC1)で約に2
00の割合で稀釈した溶液的15m1にフィルターに投入し、室温で1時間弱(
振盪した後、前記のTBST緩衝液中に室温で5分弱く振盪しながら5回洗浄し
た。各々のフィルターを、希ビオチン化した山羊 抗−ヒトIgG(bioti
nylated−goat anti−humanIgG)とアビジン結合−ア
ルカリホスファターゼ(avidinconjugated−alkaline
phosphatase)(Pierce社製、U、S、A、、Cat、No
s、31770C。
21321C)を1%(w/v)FBS含有TBS緩衝液で1:2000の割合
で稀釈した溶液15m1中に入れて、室温で1時間弱(振盪した後、約15m1
のTBST緩衝液中で弱く揺りながら室温で5分間5回洗浄した。78723M
Mフィルターに各フィルターを吸い取り乾燥した。
発色反応のために、各フィルターを15m1の発色溶液(100mMトリス−M
CI、pH9,5,100mM NaC1,5mM MgC1g。
5mgのニトロ ブルーテトラゾリウム、2.5mgのリン酸5−ブロモ−4−
クロロ−3−インドール)中で室温の暗室で約30分間反応させた。遺伝子組換
えHCV抗原をコード化するcDNAを発現したものと見える、紫色の陽性ファ
ージプラークを内口で確認した。各フィルター濾過紙をTBS溶液で一回洗浄し
、発色停止溶液(20mM トリス−MCI、pH2,9,1mMEDTA)を
添加して発色反応を停止させた。各々のフィルターを室温で乾燥した後、ポラロ
イドフィルムの上に記録した。
陽性プラークを単離して1mlのファージ稀釈液(10mM トリス−HCl、
pH7,5,10mM MgC1,)中で室温で1ないし2時間インキュベート
した。単一ファージプラークを得るため前記の免疫スクリーニング分析を繰り返
した。
組換えHCV遺伝子の存在が確認された各々のファージプラークを500μmの
3M緩衝液(1β当たり、5.8gのNaC1,2,0gのMgSO4,50u
lのIM トリス−HCl、 pH7,5,5mlの2% ゼラチン)を含有す
る滅菌ミクロ遠心分離管(microfuge tube)へ移した後、20μ
mのクロロボルムをそれに添加し、振盪しながら室温で1ないし2時間分離管の
内容物を培養した。200μlの前記溶液(1x 10″′フア一ジ粒子以上)
、lμlのへルバーファージR408(1x 10’ PFU/m1以上、St
ratagene社、U、 S、 A、 )と20μmの大腸菌XL−1細胞懸
濁液(0,D、 、。。=1.0)を混合し、この混合物を37℃で15分間培
養した。この培養液に5mlの2濃度度YT培地(1β当たりLogのNaC1
,10gの酵母抽出物、16gのバクトートリップトン)を添加した後、37℃
で3時間振盪培養し、20分間70℃に熱処理した。生成した培養液をl:10
0倍に稀釈し、稀釈された培養物200μmを200μlの大腸菌XLI−ブル
ー細胞(0,D、 8゜。=1.0)と混合した。37℃で1時間培養した後、
生成した培養液100μmを、アンピシリン(50gg/m1)−含有LBプレ
ートに加え、37℃で10時間インキュベートして、二本鎖cDNAを含有した
pブルースクリプト(pBluescript)ファージミード(phagem
id)コロニーを得られた。
一本MDNAを作製するためには、得られたpブルースクリプトコロニーを抗生
剤テトラサイクリン(12,5μg/m1)−含有LB寒天培地でインキュベー
トして、再び陽性コロニーを選別した後、この陽性の単一コロニーをテトラサイ
クリン+LBブロス培地(2ないし3m1)で−夜培養した。この培養液を0.
3mlのスーパーブロス培地(1β当たり、35g バクトートリップトン、2
0g 酵母抽出物、5g NaC1,NaOHでpH7,5に調整)に接挿して
37℃で振盪培養した。培養液にヘルパーファージR408を感染させて、O,
D、 、。。の値が0.3になるまで8時間続いて培養した。
感染時、ファージ:細胞の割合はpブルースクリプトに担持されるcDNAの種
類によって太き(変わり、通常20:1.10:i、1:1または1:10であ
ることができる。前記に得られた培養液の上澄液から一本!llDNAを抽出し
た。
2本鎖ファージミドおよび1本鎖ファージミドの単離及び精製はサンプルクによ
り提案された方法(Sambrook、J、et ai、、inMolecul
ar Cloning、Vol、1.pp2.73−2.81゜Co1d Sp
ring Harbor、N、Y、(1989))により行った。
各クローンに含有されたeDNA断片の長さを、2本鎖ファージミドを制限エン
ドヌクレアーゼEcoRIおよびXho Iで切断し、異なる長さのcDNA断
片を有する三つのクローンが得られた。
精製された1本鎖組換えpブルースクリプトファージミドまたは2重鎮pブルー
スクリプトファージミドを鋳型として、M13−20mar。
プライマーT7、プライマーKS、プライマーSKまたはプライマーT3(St
ratagene社製、U、S、A、)を用いてサンガーの方法(Proc、N
atl、Acad、Scf、U、S、A、、74,5405(1977))にし
たがって3つの組換えcDNAのヌクレオチド配列を決定して、得られたcDN
A断片を各々KHCV 426.KHCV 652及びKHCV 403とそれ
ぞれ命名した(図1ないし図3 参照)。
(1−D):オリゴヌクレオチドプローブを用いたKHCV cDNA−担持組
換えファージの選別及びそのヌクレオチド配列の決定(1−D−1):KHCV
652と重なり合っているcDNAクローンの単離
前記免疫検索方法によりスクリーニングされないHCVcDNA−担持組換えフ
ァージを選別するために、プローブとしてオリゴヌクレオチドP652a(5’
−TTCATACCCGTTGAGTCTATGGAAACTACT−3゛)
とP652b (5’ −GCCATTCCAAGAAGAAGTGTGACG
AACTCG−3°)(前記オリゴ−ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、実施
例(1−C)で決定されたcDNA KHCV 652のヌクレオチド配列から
選ばれたものである)を用いて、文献((Benton、W、D、etal、、
5ciencei96,180 (1977):Connor、B。
J、et al、、Proe、Natl、Acad、Sci、U、S、A。
80.278 (1983)及びJacob、に、et al、、Nature
313.805 (1985))に述られたの方法によりプラークハイブリダイ
ゼーションを行った。
実施例(1−B)から製造した50.0OOPFUを含有するeDNAライブラ
リ溶液を取り、実施例(1−B−3)で製造された大腸菌XLI−ブルー(0,
D、 @。。値が0.5になるように稀釈した)600μlと混合して0.7%
NZY寒天と混ぜた。この混合物を150mmのNZYプレートに注いで、37
℃で12時間インキュベートした。総30枚のプレートから1.5xlO@のフ
ァージプラークを得られた。
その後、直径137mmのナイロンフィルターをプレートの上に置いて、フィル
ターにプラークを吸い取らせた0次いで、ナイロンフィルターを取り出して空気
中で乾燥した。
乾燥したフィルターを、各々0.2M NaOH/1.5M NaC1で飽和さ
れた98723MM紙(Whatman 3MM paper)の上に1ないし
2分置き、0.4M トリス−MCI、pH7,6及び2倍濃度の5SC(SS
C:112当たりNaC117,53g、<えん酸ナトリウム8.82g、pH
7,0)で飽和された98723MM紙の上に1ないし2分装置いた後、80℃
の真空オーブン中で約2時間乾燥した。
乾燥が終了した後、フィルターを室温で500m1の3倍濃度のSSC/領 1
%SDS溶液で3ないし4回洗浄して、65℃で同一溶液で2時間洗浄した。フ
ィルターを各々予備ハイブリダイゼーション形成溶液[6X SSC。
5x デンハルト溶液(II2当たりフィコール0.2g、ポリビニルピロリド
ン0.2g、BSA 0.2g)、0.05% ビロリン酸ナトリウム、100
μg/mlの煮た蝕精液 DNA、0.5%5DSI 500m1中、37℃で
1時間予備ハイブリダイズさせ、フィルターを再びハイブリダイゼーション溶液
(6倍濃度SSC、デンハルト溶液、100μg/mi酵母 tRNA、0.0
5% ビロリン駿ナトリウム)へ移した後、■Pで標識されたP652aとP6
52bの各々30ngを添加して、48℃で約24時間ハイブリダイゼーション
を行った。
前記で用いられたプローブは次のように標識した。プローブ32ng。
7.54tl(7)100倍濃T4キナーゼ緩衝液(0,5MトリX−HCl、
pH7,5,0,1M MgC1g 、50mM DTT、0.5μg/ml
B SA)、100μCi(γ−”P)ATPおよび50単位のT4ヌクレオチ
ドキナーゼを蒸留水に加えて総量75μlにした。キネーシ目ン反応は37℃で
30分間行った。
ハイブリダイゼーションの完了後、フィルターを室温で6倍濃度の5SC10,
05%ビロリン酸ナトリウム溶液で10分間5回、60℃で同一溶液で30分間
1回洗浄した。ガイガー計数管(Ludlum Model 13)で計数する
ことによって、十分な洗浄が認めるまで洗浄溶液の温度を約2℃ずつ上昇させな
がら、約15分間洗浄した。洗浄したフィルターを一70℃で24ないし48時
間、X−線 フィルム(Kodak X−Omat AR)に暴露させた。
陽性と認められたプラークを前記と同様な方法によりスクリーニングして単一フ
ァージプラークを選別した。
得られた陽性プラークから二本鎖ファージミドと一本鎖ファージミドを作製して
、実施例(1−C)と同様な方法でヌクレオチド配列を決定した。
KHCV652と重なり合っているcDNAクローンを各々KHCV752とK
HCV675と命名し、これらの長さ、位置、ヌクレオチド配列およびこれによ
りコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示した。
(1−D−2):KHCV426と重なり合ているcDNAの単離実施例(1−
C)から得られたKHCV426cDNAのヌクレオチド配列からオリゴヌクレ
オチドP426a (5’ −ACGAGACCTCCCGGGGCACTCG
CAAGCA、CC−3°)とP426b (5°−CGTAATTTGGGT
AAGGTCATCGACACCCTC−3” )を合成した。このオリゴ−ヌ
クレオチドP426aとP426bをプローブとして用いて、前記実施例(1−
D−1)と同様な方法によりプラークハイブリダイゼーションを行なった。KH
CV426と重なり合っているcDNAクローンを実施例(1−C)と同様な方
法により検出して、KHCV240と命名し、その長さ、位置およびヌクレオチ
ド翫lりとこれによりコード化されるアミノ酸配列は図1ないし図3に示した。
(1−D−3):KHCV240と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−2)から得られたKHCV240のヌクレオチド配列、KHCV240か
らオリゴヌクレオチドP240b (5°−GTCCGGGTGCTGGAGG
ACGGCGTGAACTA−3’ )を合成した。このオリゴ−ヌクレオチド
P240bをプローブとして用いて、実施例(1−B)で製造したcDNAライ
ブラリを実施例(1−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。その結
果、KHCV240と重なり合っている約110個のヌクレオチド配列を含有す
るcDNAクローンをKHCV 513と命名し、そのヌクレオチド配列をサン
ガーの方法により決定した。KHCV 513のヌクレオチド配列、位置及び長
さとそれにコードされたアミノ酸配列は図1ないし図3に示した。
(1−D−4):KHCV513と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−3)から決定されたKHCV513のヌクレオチド配列に基づいて、オリ
ゴ−ヌクレオチドP513b (5°−CGCATGGCCTGGGATATG
ATGATGAACTGG−3’ )を合成した。このオリゴ−ヌクレオチドP
513bをプローブとして用いて実施例(1−B)から得られたcDNAライブ
ラリを実施例(1−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。KHCV
513と重なり合っているヌクレオチドの130bPを含有する810bpのc
DNAクローンをKHCV810と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガ一方
法で決定した。KHCV 810の長さ、位置およびヌクレオチド配列とそれに
よりコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示す。
(1−D−5):KHCV810と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−4)で決定されたKHCV810のヌクレオチド配列に基づイテ、オリゴ
−ヌクレオチドP810b(5°−AAATGAGACGGACGTGCTGC
TCCTTAAC−3’ )を合成した。このオリゴーヌクレオチドpsiob
をプローブとして用いて、実施例(1−B)で得られたライブラリヲ実施例(t
−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。その結果、KHCV810
と重なり合っているヌクレオチド約65bpを有するcDNAクローンなKHC
V798と命名し、そのヌクレオチド配列なサンガーの方法により決定した。K
HCV 798の長さ、位置およびヌクレオチド配列とKHCV798によりコ
ードされるアミノ酸配列を図1ないし図3に示す。
(1−D−6):KHCV403と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−5)で決定されたKHCV403のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドP403A (5°−GTGAAGAATTCGGGGGCCGG
AACCTGGCAT−3°)とP403B (5−’ GCTGACCTCA
TTGAGGCCAACCTCTTGT−3°)を合成した。このオリゴ−ヌク
レオチドP403AJよびP403Bをプローブとして用いて、実施例(1−B
)から得られたライブラリを実施例(1−D−1)と同様な方法によりスクリー
ニングした。その結果、KHCV403と重なり合っているヌクレオチドの約1
60bpを有するcDNAクローンなKHCV932と命名し、そのヌクレオチ
ド配列をサンガーの方法により決定した。KHCV932の長さ1位置及びヌク
レオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示す。
(1−D−7):KHCV932と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−6)で決定されたKHCV932のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴ
−ヌクレオチドP932b (5°−CCGGGACGTGCTTAAGGAG
ATGAAGGCGAA−3°)を合成した。このオリゴヌクレオチドP932
bをプローブとして用いて、実施例(1−B)から得られたcDNAライブラリ
を実施例(1−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。
KHCV932と重なり合っているヌクレオチドの約185bpを有するcDN
AクローンをKHCV496と命名し、そのヌクレオチド配列をサンガーの方法
により決定した。KHCV496の長さ、位置及びヌクレオチド配列とそれから
コードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示す。
(1−D−8):KHCV496と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−7)で決定されたKHCV496のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴ
ヌクレオチドP496b (5°−CGTGTATGCGAGAAGATGGC
CCTTTATGAC−3’ )を合成し、た、このオリゴヌクレオチドP49
6bをプローブとして用いて、実施例(1−B)で得られたライブラリを実施例
(1−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。KHCV496と重な
り合っているヌクレオチドの約160bpを有する847bpのcDNAクロー
ンをKHCV847と命名し、そのヌクレオチド1BIJをサンガーの方法によ
り決定した。KHCV 847の長さ、位置及びヌクレオチド配列とそれからコ
ードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示した。
(1−D−9):KHCV847と重なり合っているcDNAの単離実施例(1
−D−8)で決定されたKHCV847の3°−末端のヌクレオチド配列に基づ
いて、オリゴヌクレオチドP847b (5°−TGCGTGGGAGACAG
CTAGACACACTCCAG−3’ )を合成した。このオリゴヌクレオチ
ドP847aをプローブとして用いて、実施例(1−B)で製造されたcDNA
ライブラリを実施例(1−D−1)と同様な方法によりスクリーニングした。そ
の結果、KHCV847と重なり合っているヌクレオチドの約94bpを有する
494bpのcDNAクローンをKHCV494と命名し、そのヌクレオチド配
列をサンガーの方法により決定した。KHCV494の長さ、位置及びヌクレオ
チド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示す。
(1−E):PCRによるcDNAの作製(1−E−1):KHCV798とK
HCV752間のKHCV cDNAの作製
KHCV79B(7)3’ −末端とKHCV752(7)5’末端間(7)H
CVcDNAをクローン化するために、KHCV798の3゛−末端のヌクレオ
チド配列に基づいてプライマーP798b (5°−CTGGTTCCCGGA
GCGGCATAC−3’ ) と、KHCV752(7)5°−末端ノヌクレ
オチド配列に基づいてP752a (5’ −CCAGGTGATGACTTT
GGTCTCCAT−3′)を合成した。これらプライマーP798bおよびP
752aと、RANPSHCVのプライマーを用いて実施例(1−B−1)で製
造したcDNAライブラリを用いて参考例7のようにポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)を行なった。反応の終了後、生成した混合物の一部を5%ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動(PAGE)してcDNAの増幅を確認した。残りの混合
物にDNAポリメラーゼの一種のフレナラ(Klenow)断片の10単位を加
えた後、反応混合物を37℃で30分間インキュベートして両末端を平滑末端(
blunt end)とした。反応混合物をPAGI、DNAを電気作用で溶出
して純粋なりNAを分離した。精製されたDNA断片をファージM13mp18
へクローン化してそのヌクレオチド配列を決定した。得られたDNAをKHCV
570と命名し、このヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は
図1ないし図3に示す。 実施例(1−D−2)から得られたKHCV240、
実施例(1−D−3)から得られたKHCV513、実施例(1−D−4)から
得られたKHCV810、実施例(1−D−5)から得られたKHCV798及
び前記から得られたKHCV570が互いに部分的に重なり合って、一つの長い
オーブンリーディングフレームを形成し、これをKHCV2661と命名した。
(1−E−2):KHCV403とKHCV675間のKHCV cDNAの作
製
実施例(1−C)から製造されたKHCV403と実施例(1−D−1)から製
造されたKHCV675との間に残っているHCVcDNA断片をクローン化す
るために、KHCV675の3°−末端のヌクレオチド配列に基づいてプライマ
ーP675b (5°−TCGATTCTTCGGTCCTGTGTGAGTG
T−3°)とP675b重 (5°−AAAAAGAATTCGGATCCAT
GACGCGGTTGTGCGTGGTAC−3°)と、KHCV403の5−
。
末端のヌクレオチド配列に基づいてP 403 a I (5−’ CCCCC
T CA G AGTCGACTCAACTTCACGTTGTCAGTGGT
CAT−3°)を合成した。実施例(1−D−6)から製造したP403aと前
記で製造したプライマーP675b、P675b、およびp403aiを用いて
、次のようにPCRを行った。
0.2μgのP674b、0.2μgのP403a、無作為プライマーRANP
SHCVを用いて実施例(1−B−1)で製造した2ulのcDNA、10μm
のlO倍濃度PCR緩衝液、10μmの2mM dNTP混合物および2.5単
位のTaqポリメラーゼの混合物に蒸留水を加えて、総量を100μlとした。
混合物を95℃で2分→55℃で2分→72℃で3分のサイクルで10回繰返し
て1次のPCRを行った。この反応混合物にP675b22μgとP403at
2μgを添加した後、2次PCRを前記サイクルで20回繰返し行なった。
反応の終了後、cDNAの増幅を確認し、実施例(1−E−1)と同様の方法で
、cDNAの配列を決定した。得られたcDNAをKHCV1774と命名し、
このヌクレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に
示す。
(1−E−3):KHCV cDNAの3°−末端領域のクローン化及びそのヌ
クレオチド配列の決定
HCVゲノムの3°−末端領域に相当するcDNAをクローン化するために、プ
ライ’? −RANPSHCVとDA17PSHCV (5−’ TGGTGG
TGGAACTGGACCGTAl−3°)を用いて、次のようにPCRを行っ
た。
プライマーPSHCVSL、5−’ AAAAGTCGACTGGTGGTGG
AACTGGACCGT−3°は実施例(1−B−1)のプライマーRANPS
HCVまたはDA17PSHCVの21個の固定ヌクレオチドとSal I認識
部位(5°−GTCGAC−3°)を含んでおり、一方、プライマーKHCVR
60,5′ −GTGTCCGCGCTAAGCTACTGTCC−3°は実施
例(1−D−9)のKHCV494の3°−末端領域のヌクレオチド配列から設
計されたヌクレオチドを含む。プライマーPSHCVとKHCVR60を用いて
、参考例7と同様な方法により1次PCRを行なった。
2次PCRにおいて、プライマーKHCVR61(5−’ TGTGGCAAG
TACCTCTTCAACTGG−3°)を合成した。このKHCVR61はK
HCV494の3°−末端領域のヌクレオチド配列に相補的な配列を含み、KH
CVR60より3゛−末端側に片寄っている。
1次PCRから生成された混合物に10μlのKHCV61を加え、さらに2次
PCRを参考例7と同様に行った。
反応の終了後、cDNAの増幅を確認し、実施例(1−E−1)と同様な方法に
よりヌクレオチド配列を決定した。こうして得られた266個のヌクレオチドを
有するcl)NAをKHCV266と命名した。KHCV266の位置およびヌ
クレオチド配列とそれからコードされるアミノ酸配列は図1ないし図3に示i6
K HCV 266のヌクレオチド配列において、2つの終止コドンを見出した
が、poxy(A)十の尾部は確認できなかった。
(1−E−4):KHCV eDNAの5°−末端領域のクローン化おJひヌク
レオチド配列の決定
実施例(1−C)で製造したKHCV426の5゛−末端ヌクレオチドに基づイ
テブライ?−KHCVI、69 (5’ −GTCCTGTGGGCGGCGG
TTG G T G T T A CG −3°)を用いて、実施例(1−B−
1)と同様な方法で一本鎖cDNAをf’1EtJした。これから生成された混
合物501ノlをI In lのTEftiilTiffl (l OmM ト
リス−HCl、pH7,5,1,mm EDTA)で稀釈した。セントリコン1
00 (Centricon 100、Amleon社製、I)、S、A、、#
4200)を用いて10u1に濃縮して、残留プライマーおよびd、 N P
Tを除去した。
その後、ポリd (T)の尾またはポリd (G)の尾−付加cDNAの製造の
ため、4μlの5倍濃度プーリング緩衝液(0,5M カコジル酸カリウム1p
H7,2,10mM CoC1a、1mM DTT)、4μlの1mMdTTP
(または4μmのlrr+MdGTP)と10単位の末端デオキシヌクレオチド
トランスフェラーゼ(terminal deoxynucleotidetr
ansferase、BRL、U、S、A、、880085B)および蒸留水を
前記のcDNA溶1iJiloμmに添加して総容量50ulになるように加え
た。反応混合物を37℃で30分間放!した後、65℃で5分間加熱した。
ポリd (T) ”の尾付加cDNA (またはポリd (G)の尾付加cDN
A)を実施例(1−C)から製造したKHCV426のヌクレオチド配列から設
計されたプライマーKHCVL70 (5” −TTGAGGTTTAGGAT
TCGTGCTCAT−3’ )(またはdC12RIRO: 5’ −AAG
GATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGG
A (C)、、−3°)、dT17RIRO(5’ AAGGATCCGTCG
ACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA (T)、、−3
°)、RO(5“−AAGGATCCGTCGACACT−3°)およびR1(
5’ −GACATCGATAATACGACTCAC−3”)を用いてPcR
で増幅シタ。
c I) N A溶17V21J、1に5μ、1の100倍濃Taqポリメラー
ゼ緩衝液(100mM トリス−HCl、pH8,3,500mM KCI、1
5mMMgC1x 、0.1%ゼラチン)、5μlの1.5mM dNTP混合
物、2、OIJ、g(7)KHCVi−69および2.0μg(7)dT17R
IRoおよび蒸留水を加えて、最終容量を50ulとしたにの混合物を95℃で
7分間加熱した後、75℃に冷却した。これに2.5単位のTaq DNAポリ
メラーゼを加A2、溶液蒸発の防止のために、30u、lの鉱油を添加した。こ
の反応混合物を2分間45℃に冷却して、プライマーを一本鎖c D N Aと
相補的に結合させた後、さらに72℃へ上げて22分間反応させた。次に1次P
CRを95℃で45秒−→50℃で25秒−72℃で2分間のサイクルを30回
繰返し、最後に72℃で15分間行った。
この反応混合物10g1にプライマーRO(またはR1)2μgおよびKHCV
L70 2agを加えた後、前記と同じサイクルを30回繰返し、2次I) C
Rを実施した。反応終了後、380bpを有するeDNAの増幅を確認し、実施
例(1−E−1)と同様な方法で、そのヌクレオチド配列を決定した。得られた
cDNAクローンをKHCV366と命名し、KHCV 366(7)位置およ
びヌクレオチド配列とこれからコードされたアミノ酸配列は図1ないし図3に示
す。
実施例1で得られたKHCV cDNAクローンを9372個のヌクレオチドを
有する全長のKHCV cDNAに連結し、全長のcDNAはKHCV−LBC
Iと命名し、これを1991年5月14日付にATCCに寄託番号75008号
として寄託した。
実施例2:HCVサブタイプcDNAの作製(2−A):RNAの抽出
韓国人C型肝炎患者13名を対象として血清100ulずつを採血(試料#2、
試料 #3、試料 #2o、試料 #21、試料 #23、試料#25、試料
#26、試料 #27、試料 #28、試料 #29、試料#30、試料 #3
1および試料 #32)して300LLlのRNAzolB(Cinna/Bi
otecx;P、O,Box 1421゜Friendswood、Texas
U、S、A、)を加えて細胞を破壊させ、前記の実施例(1−A>と同様な方
法でKHCV RNAを抽出した。
13個の試料カラ抽出されたKHCV RNAを各々、LBC2、LBC3、L
、 B C20、LBC21、LBC23、LBC25、LBC26、LBC2
7、LBC28、L、 B C29、L B C30、LBC31およびLBC
32と命名した。
(2−B):eDNAの作製
実施例(2−A)から得られたKHCVRNAを鋳型として、逆転写酵素のため
のプライマーとして、無作為プライマー(5°−NNNNNN−3” 、ここで
Nは同じであるか異なってよく、G、A、T又はCが同化で混在する)を用い、
実施例(1−B−11と同様な方法でcDNAを得た。得られたcDNAを各々
KHCV−LBC2cDNA、KHCV−LBC3cDNA、KHCV−LBC
20cDNA、KHCV−LBC21cDNA、KHCV−LBC23cDNA
、KHCV−LBC25cDNA、KHCV−LBC26cDNA、KHCV−
LBC27cDNA、KHCV−LBC28cDNA、KHCV−LBC29c
DNA、KHCV−LBC30cDNA、KHCV−LBC31cDNAおよび
KHCV−LBC32cDNAと命名した。
(2−C):PCRによるKHCV cDNAの増幅(2−C−1)ニプライマ
ーの設計
HCV cDNAのNS2領域とNS5領域の増幅用のためのプライマーは、加
藤らにより報告された日本型のヌクレオチド配列(Kato et al、。
Proc、Natl、Acad、Sci、U、S、A、、87.9524−95
28 (1990)+Takamizawa et al、、J、Virol、
。
65.1105−1113 (1991))とチョーらにより報告された米国型
のヌクレオチド配列(Choo et al、5cience 244,359
−363 (1989))および前記実施例1から作製したKHCV−LBCI
のヌクレオチド配列に共通に存在する領域から設計された。上記で製造されたヌ
クレオチドの位置はKHCV−LBCIのヌクレオチド配列を基準として番号を
付けた。
HCVcDNAのNS2領域の増幅用プライマーN52S1 (5°−CGGG
AGATGGCCGCATCGTG−3’ )はKHCV−LBCIの2776
番目から2795番目までのヌクレオチド断片の鎖に相当し、N52N1 (5
°−ACCTGCTAGTGCGGCCAGCTTCAT−3” ) はKHC
V−LBCI(7)3180番目から3157番目までのヌクレオチド断片の相
補的な鎖に相当するが、これをHCVcDNAのNS2領域を増幅するための1
次PCRに用いた。N52S2 (5°−TTTTGGATCCGCGGTTT
TTGTAGGTCTGGT−3°)はKHCV−LBClの2803番目から
2822番目までのヌクレオチド断片の鎖に相当し、これは、容易なりローン化
のためのBamHI認識部位を有して;N52N2 (5’ −AAAGTCG
ACATGAAGACCATTTGGAC−3°)はKHCV−LBCIの31
59番目から3142番目のヌクレオチド断片の相補的な鎖に相当し、これは容
易なりローン化のために、5°−末端にSal Iの認識部位を有している。こ
れらN52S2およびN5S2N2は2次PCHに用いられる。
HCV cDNAのNS5領域の増幅用プライマーN55S1 (5°−ATG
GGGATCCATATGACACCCGCTG(T/C)TTTGA−3°こ
こで、T/Cはヂミンとシトシンが1:1で混在することを意味する)の10番
目ヌクレオチド(NS5S1は5゛末端から起算される)から3°末端まではK
HCV−LBCIの8252番目から8273番目までのヌクレオチド断片のヌ
クレオチド配列である。N35N1 (5’ −CCCCGTCGACCTAG
TCATAGCCTCCGTGAA−3’ )において、9番目ヌクレオチドか
ら3゛末端までのヌクレオチド配列は、KHCV−LBClの8635番目から
8614番目のヌクレオチド断片の相補的な鎖に相当する。プライマーN35N
1はNS5領域の増幅のための1次PCHに用いられる。
一方、N55S2 (5°−TTTGAGGATCCACGGTCACTGAG
AA (T/C)GACAT−3’ 、ここで、T/Cは前記定義した通りであ
る)において、12番目ヌクレオチドから3′末端までのヌクレオチド配列は、
KHCV−LBCIの8278番目から8279番目のヌクレオチド断片の鎖に
相当し、N55S2はその5°末端にBamHI認識部位を有している。プライ
マーN55S2は2次PCHに用いられる。
前記のプライマーなどは自動化固相ホスホアミダイト化学(SolidPhas
e Phosphoamidite Chemistry)を用いるDNA合成
器(Applied Biosystems、Inc、、Mode1380 B
、 U、 S、 A、 )で合成した0合成されたプライマーを変性ポリアクリ
ルアミドゲル(2M 尿素、12%アクリルアミド;50mM トリス中のビス
アクリルアミド(29: 1.w/w)、50mM ホウ酸、1mM EDTA
Nag)を用いた電気泳動で分離した後、50:50 (v/v)のアセトニト
リルと水の混合液を溶出剤として用いてCI8カラムクロマトグラフィー(SE
PAK:Waters Incl、U、S、A、 )で精製した。各プライマー
の濃度を260nmでの0.D、値により決定した。
(2−C−2):KHCV cDNAのNS2領域の増幅のためのPCR1次P
CRを次の通りに実施した。実施例(2−B)から得られたKHCV−LBC2
cDNA、KHCV−LBC3cDNA、KHCV−LBC20cDNA、KH
CV−LBC21cDNA、KHCV−LBC23cDNA、KHCV−LBC
25cDNA、KHCV−LBC26cDNA、KHCV−LBC27cDNA
、KHCV−LBC28cDNA、KHCV −LBC29cDNA、KHCV
−LBC30cDNA、KHCV−LBC31cDNAおよびKHCV−LBC
32cDNAを各々5μmずつに10m1のIOX Taqポリメラーゼ緩衝液
(10mM トリス−HCl pH8,3,500mM HCI、15mMMg
C12,0,1%(W/V)ゼラチン)、10tLlの2mMdNTP混合液、
0.2μgのN52SL、0.2μgのN32N1および0.5μmのAmpl
、1Taq DNAポリメラーゼ (Perkin Elmer−Cetus、
U、S、A、)および蒸留水を加えて、最終容量を100μlとした。ここに溶
液の蒸発を防止するため、50μlの鉱油を添加した。95℃で2分→55℃で
2分−72℃で3分間の加熱サイクルを40回繰返して1次PCRを実施した。
2次PCRは1次PCR産物1mlと2μgのN52S2/N52N2プライマ
ーを用いて25回繰返すことによって行った。
反応混合物の各々を同量のフェノール/クロロホルムと混合し、残留酵素を除去
くため遠心分離した。上澄液の各々に0.1容量の3M酢酸ナトリウムと25倍
容量の無水エタノールを加え、遠心分離して340bpの二本鎖DNAを得た。
13個の他の鋳型から得たDNA断片を各々N52−LBC2、N52−LBC
3、N52−LBC20、N52−LBC21、N52−LBC23、N52−
LBC25、N52−LBC26、N52−LBC27、N52−’LBC28
、N52−LBC29、N52−LBC30、N52−LBC31及びN52−
LBC32と命名した。
(2−C−3):HCV cDNAのNS5領域の増幅のためのPCR1次PC
R用プライマーとしてN55S1とN35N1を、また2次PCR用プライマー
としてN55S2とN55Nlを用いて、実施例(2−C−2)と同様に実施し
て、320bpのDNA断片を得た。
PCRの結果、KHCV−LBC20cDNA、KHCV−LBC21cDNA
、KHCV−LBC23cDNA、KHCV−LBC25cDNA、KHCV−
LBC26cDNA、KHCV−LBC27cDNA、KHCV−LBC28c
DNA、KHCV−LBC29cDNA、に、HCV−LBC30cDNA、K
HCV−LBC31cDNAおよびKHCV−LBC32cDNAから増幅され
たDNA断片を各々、N55−LBC20,N55−LBC21、N55−LB
C23、N55−LBC25、N55−LBC27、N55−LBC28、N5
5−LBC29、N55−LBC30,N55−LBC31およびN55−LB
C32と命名した。
これら断片の各々を、Sal IとBamHIにより切断した後、M13mp1
9にクローン化した後、サンガーの方法によりヌクレオチド配列を決定した。各
ヌクレオチド配列は各々図7ないし図26に示した。
実施例3:酵母内でKHCV cDNA断片の発現のためのベクターの作製(3
−A):KHCV cDNA断片の増幅(3−A−1):断片に384.に51
0.に573.に897. K4o3およびに590の作製
〈段階1〉
前記の実施例(1−C)、(1−D)および(1−E)でクローン化されたKH
CV cDNA断片をユビキチン遺伝子と連結させて(以下、ユビキチン遺伝子
とKHCV cDNA断片が連結された遺伝子を“UB−KHCV’ と命名す
る)、これを酵母発現ベクターにクローン化するために、次のようなプライマー
を合成した。
プライマーPCOREUBI (5’ −CTTGGTGTTGAGACTCC
GCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAACC−3°)は5゛−
末端領域の25個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の3°−末端領域と重なり
合っており、残りのヌクレオチドはK HCV c D N Aの343番目か
ら360番目の領域に相当する。
プライマーPSALCORE14 (5°−GGGGTCGACTATTAGC
ATGTGAGGGTGTGGATGAC−3’ )は726番目のヌクレオチ
ドの直後に翻訳が終止するように終止コドンとSal I認識部位を有している
。
プライマーPSALCORE17 (5°−GGGGTCGACTATTAGG
GCAGATTCCCTGTTGCATA−3°)は852番目のヌクレオチド
の直後に翻訳が終止するように終止コドンとSal I認識部位を有している。
プライマーPSALCORE22 (5′−GGGGTCGACTATTAAG
CGGAACTGGGGATGGTCAA−3’ )は915番目のヌクレオチ
ドの直後に翻訳が終止するように終止コドンとSal I認識部位を有している
。
プライマーPK403UBI (5°−CTTGGTGTTGAGACTCCG
GTGGTACGGGCATGACCACTGACAA−3°)は、PCORE
UBIと同一である5°−末端領域に25個のヌクレオチドを有し、残りのヌク
レオチドはKHCV−LBCIの6649番目のヌクレオチドから翻訳が開始さ
れるように設計されている。
プライマーPK573UBI (5°−CTTGGTGTTGAGACTCCG
CGGTGGTACATGGACAGGCGCCCTGA−3°)は、PCOR
EUBIと同一である5゛−末端領域に25個のヌクレオチドを有し、残りのヌ
クレオチドはKHCV−LBCIの7612番目のヌクレオチドから翻訳が開始
されるように設計されている。
ブライv−PK403SAL (5’ −GACTGGTCGACTATTAC
TCTTGCCGCCACAAGAGGTT−3°)はKHCV−LBCl(7
)7050番目の直後に翻訳が終止するように設計されており、Sal I認識
部位と二つの終止コドン(TAATAG)を含む。
プライマーPK897UBI (5’ −CTTGGTGTTGAGACTCC
GCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG−3°)は5°−末
端領域にPCOREUBIと同じ25個のヌクレオチドを有し、残りのヌクレオ
チドはKHCV−LBCIの3916番目のヌクレオチドから翻訳が開始される
ように設計されている。
プライマーPK897SAL (5’ −GACTGGTCGACTATTAA
CACGTATTACAGTCGATCAC−3’ )はKHCV−LBClの
4713番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように設計されており、S
al I認識部位と二つの終止コドン(TAATAG)を含む。
プライマーPK573SAL (5°−GACTGGTCGACTATTAGT
ACTGGAATCCGTATGAGGAG−3°)はKHCV−LBCl(7
)8184番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように設計されており、
Sal I認識部位と3°−末端領域に二つの終止コドン(TAATAG)を含
む。
プライマーP426B (5’ −GGGTGGGCAGGATGGCTCCT
G−3°)はKHCV−LBCl(+)616番目から636番目ノヌクレオチ
ドノ領域からなっている。
プライマーP240B (5’ −CCTGTTGCATAGTTCACGCC
GT−3°)はKHCV−LBClの842番目から821番目のヌクレオチド
領域)からなっている。
プライマーP652B (5°−GTCATTCCAAGAAGAAATGTG
ACGAGCTCGCTGCAAAG−3°)はKHCV−LBCI(7)45
23番目から4560番目のヌクレオチドの領域からなっている。
プライマーP403B (5°−GCTGACCTCATTGAGGCCAAC
CTCTTGT−3°)はKHCV−LBClの7012番目から7039番目
のヌクレオチドの領域からなっている。
〈段階2〉
互に重なり合ってい6KHCV426、KHCV240およびKHCV513の
3つクローンから次のように一本鎖cDNA断片を作製した。まず、PCORE
UBI 2゜Ou、g、P426B 0.02μg、P24OB2ugおよびK
HCV−LBCI DNA 50μg(7)混合物に10ul(7)N。
倍Taqポリメラーゼ緩衝液、10μlの10mM dNTP混合物および2.
5単位のTaqポリメラーゼを加えた後、蒸留水を加えて総容量を100μlと
した。次に、前記の参考例7のように加熱サイクルを25回繰り返して1次PC
Rを行った。得られた混合物を、5%のポリアクリルアミドゲル電気泳動により
500bpのPCR産物(以下、 ’PCR産物A°と称する)を単離した。そ
の後、鋳型として、前記PCR産物A(7)50μgとKl(CV−LBCID
NA 50μgを用い、プライマーとしてPCOREUBI 2μgおよびPS
ALCORE22 2μgを用いて、前記1次PCRと同一な条件下で2次PC
Rを行った。得られた混合物を5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して58
0bpの最終産物(以下、 ’PCR産物B°と称する)を単離して、50μl
のTE緩衝液に溶解した。
〈段階3〉
前記の段階2から得られたPCR産物Bを鋳型として更にPCRを行うために、
3つの異なった試験管を作成した。即ち、PCOREUBI 2μgとPSAL
CORE14 2μgを含有する試験管A、PCOREUBI 2μgとPSA
LCORE17 2μgを含有する試験管B、PCOREUBI 2μgとPS
ALCORE22 2μgを含有する試験管Cの各々に、50μgのPCR産物
Bを加Aた。 一方、KHCV−LBCI DNAを鋳型トシタPCRのために
、異なった他の試験管、即ち、PK897SAL2μg、P652B0.02μ
gおよびPE2CUBI 2μgを含有する試験管D、PK403SAL2μg
とPE2CUBI 2μgを含有する試験管E、PE2C3AL 2μg、P4
03B 0.022μgとPK573UBI2μgを含有する試験管Fに、各々
50ngのKHCV−LBCIを加えたものを作成した。
その後、試験管AないしFの各々に10μlの10倍Taqポリメラーゼ緩衝液
、10LLlの10mM dNTP混合液および25単位のTaqを加え、それ
に蒸留水を加えて総容量を100μlとした。前記段階2と同様の条件でPCR
を行った。
く段階4〉
前記の段階3から得たPCR産物を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。その結果、試験管Aでは384bpのDNA断片が、管Bでは510bpの
DNAが、管Cでは573bpのDNAが、管りでは897bpのDNAが、管
Eでは403bpのDNAが、管Fでは590bp(7)DNAが増幅された。
前記と同一条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離精製したDNA断
片を、各々断片に384、K520、K573、K8O7、K2O2、K2O2
と命名した。
(3−A−2):KHCV 外膜蛋白をコードするcDNA断片の作製〈段階l
〉
KHCV LBCIの1510番目なレル2010番目のヌクレオチド領域と2
011番目ないし2529番目のヌクレオチド領域に各々相当するE2N遺伝子
とE2C遺伝子を各々、合成されたユビキチン遺伝子に連結し、かつこれらを酵
母の発現ベクターにクローン化するために、次のようなプライマーを合成した。
ブライv−PE2NUBI (5° −CTTGGTGTTGAGACTCCG
CGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT−3’ )は5−
末端領域の25個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の3°−末端領域と重なり
合っており、残りのヌクレオチドはKHCV LBCIの1510番目から15
30番目のヌクレオチドに相当する。
ブライv−PE2NSAL (5°−GACTGGACTATTAATTCAT
CCAGGTACAACCGAACCA−3°)はKHCV−LBClの201
0番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンを有しており、
かつSal I認識部位を有している。
ブライv−PE2CUBI (5°−CTTGGTGTTGAGACTCCGC
GGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA−3°)は5−末端
領域の25個のヌクレオチドがユビキチン遺伝子の3°−末端領域の25個のヌ
クレオチドと重なり合っており、残りのヌクレオチドはKHCV−LBCIの2
011番目から2031番目のヌクレオチド領域に相当する。
ブライV−PE2CSAL (5’ −GACTGGACTATTACGCGT
CCGCCAGAAGAAGGAAGAG−3’ )は、KHCV−LBClの
2529番目のヌクレオチドの直後に翻訳が終止するように終止コドンを有して
おり、かつSal Iの認識部位を有する。
く段階2〉
試験管AにはPE2NUBI 2μgおよびPE2NSAL 2μgを、試験管
BにはPE2CUBI 2μgおよびPE2C3AL 2μgを入れた。各々の
試験管AとBにKHCV−LBCI 50μg、10μlの10倍ポリメラーゼ
緩衝液、10μmの10rnM dNTPa合物および2.5単位のTaqポリ
メラーゼを加え、これに蒸留水を加えて最終容量を100μlとした。参考例7
と同様な加熱サイクルを25回繰り返してPCRを実施した。
く段階3〉
前記の段階2から得られたPCR産物を5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行った。その結果、試験管Aでは500bpのDNAが、試験管Bでは520b
pのDNAがそれぞれ増幅されたことを確認した。前記と同一な条件のポリアク
リルアミドゲル電気泳動によりDNAを精製して、各々、断片E2Nと断片E2
Cと命名した。
(3−B):酵母用発現ベクターの作製(3−B−1)+pYLBC−A/G−
UB−CORE 14、pYLBC−A/G−UB−CORE 17、pYLB
C−A/G−UB−CORE 22、pYLBC−A/G−UB−KHCV89
7、pYLBC−A/G−UB−KHCV 403およびpYLBC−A/G−
UB−KHCV 573の作製プラスミドpYLBC−A/G−UB−HGH(
ATCC7407]、)2μgをNEB緩衝液3中でPst IとSal Iに
より完全に切断し、同一のプラスミド2μgを参考例1のNEB緩衝液4中でP
st IとSac IIにより完全切断した。生成混合物を0.7%アガロース
ゲル電気泳動して、9.84Kb断片と3.4Kb断片を分離して、各々断片P
L2、断片PT2と命名した。
実施例(3−A−1)から得られたに384、K510.に573、K987、
K2O2およびに590の断片中、断片に897、K2O2およびに590をN
EB緩衝液3中でSal IとSac IIにより完全に切断し、断片に384
、K510およびに573はNEB緩衝液3中でSal Iにより完全に切断し
た。これら産物をフェノール/クロロホルムで抽出しエタノールで沈降させた後
、20μlのTE緩衝液に溶した。断片に384、K510およびに573をN
EB緩衝液4中で10分間Sac IIによりさらに部分切断した後、これら産
物をフェノール/クロロホルムで抽出してエタノールで沈降させた後、20μl
のTE緩衝液に溶解した。 前記断片を用いて次のように連結反応を行った。連
結反応試験管Aには1100nの断片に384を、連結反応試験管Bには110
0nの断片に510を、連結反応試験管CにはLOOngの断片に573を、連
結反応試験管りには1100nの断片に897を、連結反応試験管Eには110
0nの断片に403を、連結反応試験管Fには1100nの断片に573を入れ
た。各試験管に1100nの断片PL2、iloonの断片PT2.2μlの1
0倍連結反応緩衝液、10単位の74 DNAリガーゼを加えた後、最終容量が
20μlになるように蒸留水を加えた。連結反応を16℃で12時間実施した。
各々の連結されたベクターを大腸菌HBIOI (ATCC33694)に形質
転換させた。
K384−含有ベクターを分離してpYLBC−A/G−UB−CORE14と
、K51〇−含有ベクターを分離してpYLBC−A/G−UB−CORE17
と、K573−含有ベクターを分離してpYLBC−A/G−UB−CORE2
2と、K8O7−含有ベクターを分離してpYLBC−A/G−UB−KHCV
897と、K2O2−含有ベクターを分離してp Y L B C−A/G −
UB−KHCV403と、K59〇−含有ベクターを分離してpYLBC−A/
G−UB−KHCV573と命名した(図30参照)。
(3−B−2):pYLBC−A/G−UB−E2NおよびpYLBC−A/G
−UB−E2Gの作製
プラスミドpYLBC−A/G−UB−HGH(ATCC74071)2μgを
NEB緩衝液3中でPst IとSal Iにより完全に切断し、同一プラスミ
ド2μgをNEB緩衝液4中でF’st IとSac IIにより完全切断した
。生成された混合物を0.7%アガロースゲル電気泳動して、9.8kbと3.
4kb断片を各々分離して、各々断片PL2と断片PT2と命名した。
実施例(3−A−2)から得られた断片E2NとE2CをNEB緩衝液4中でS
ac IIで完全に切断した後、さらにNEB緩衝液3中でSal Iで部分切
断した。各産物をフェノール/クロロホルムで抽出しエタノールで沈降させた後
、20μmのTE緩衝液に溶解した。これを各々断片E2N−T2/Lと断片E
2C−72/Lと命名した。
連結反応試験管Gには1100nの断片E2N−T2/Lを、試験管FにはLO
Ongの断片E2C−T2/Lを加えた。各試験管にLOOngのPL2.11
00nのPT2.2μlの10倍連結反応緩衝液および10単位のT4DNAリ
ガーゼを加え、蒸留水で最終容量を20μlとした。16℃で12時間反応させ
た。連結された各ベクターで大腸菌HBIOI (ATCC33694)を形質
転換させた。断片E2N−72/L=含有ベクターをpYLBC−A/G−UB
−E2Nと、E2C−T2/L−含有ベクターをpYLBC−A/G−UB−E
2Gと命名した(図30参照)。
(3−C):酵母の形質転換および蛋白の産生前記実施例(3−B−2)から作
製した発現ベクターを用いて、参考例5と同様な方法で酵母を形質転換させた。
形質転換された酵母中、pYLBC−A/G−UB−KHCV403により形質
転換されたSaccharomycescerevisiae DC04(S、
cerevisiaeYLBC−A/G−UB−KHCV403)は寄託番号A
TCC74079として、1991年6月27日付国際寄託され、pYLBC−
A/G−UB−CORE14により形質転換されたSaccharomyces
。
cerevisiaeDc 04 (S、cerevisiae DC04−U
B−CORE 14)は寄託番号ATCC74081として1991年7月1日
付国際寄託され、pYLBC−A/G−UB−E2Cで形質転換されたSacc
haromyces cerevisiae DC04(S。
cerevisiae DC04−UB−E2C)は寄託番号ATCC7411
7として1991年12月1日付ブダペスト条約下の国際寄託機関であるATC
Cに国際寄託された。
形質転換された酵母中、Saccharomyces cerevisLaeD
C04−UB−KHCV403を3mlのロイシン欠乏培地(培地12当りアミ
ノ酸非含有酵母窒素源(Difco、U、S、A、)6.7gとロイシン欠乏ア
ミノ酸混合物0.25gおよび5%グルコース含有)中、30℃で一夜培養した
。この培養物をloOmlのYEPD培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、2
%グルコース)に接種して30℃で一夜培養してKHCV 蛋白を得た。
得られた培養物は、650nmでのO,D、値かで25であった。他の形質転換
された酵母を前記と同様に培養して、KHCV蛋白を産生した。
各培養物から10のO,D、 at。値に相当する量を収取し、遠心分離した。
各沈降物を400μlの緩衝液(10mM トリス−HCl、 pH7,5,1
mM EDTA、2mM PMSF (フッ化フェニルメチルスルホニル)、8
M 尿素)に懸濁して、同量のガラスピーズ(直径0.4mm)と共に振盪させ
て細胞壁を破壊した。得られた酵母抽出物をラムリの方法(Laemmlf。
et、al、、Nature、277.680 (1970))によって15%
ソジウムドデシルスルフェート(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(
SDS−PAGE)させた後、コマシ・ブリリント・ブルー(Coomassi
e brilliant blue)R250で染色してKHCV蛋白が産生さ
れたことを確認した(図31−A参照)。
ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルターにブロッチングした。
このフィルターを0.2%ツイーン−20を含有するPBS (10mMリン酸
塩、pH7,0,0,15M塩化ナトリウム)に入れて、室温で2時間振盪して
IgGの蛋白に対する非特異的結合を遮断した。0.5%ゼラチンと0.05%
ツイーン−20を含有するPBSを200倍容量で用いて、韓国人C型肝炎患者
の血清からアフェニティークロマトで分離したIgG (8,2mg/ml)を
1:200に希釈して製造したIgG1液中に入れて、室温で1時間弱(揺りな
がら蛋白とIgGとを反応させた。0.2%ツイーン−2〇−含有PBSにより
5分ずつ4回フィルターを洗浄した。このフィルターを、0.5%ゼラチンと0
.05%ツイーン−20を含有する200倍容量のPBSを用いて西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)で標識され
た抗−ヒトIgG HRP (Bio−Rad Lab、、U、S、A。
goat anti human IgG−HRP)を希釈して製造したIgG
溶液中に入れて、室温で1時間振盪した。フィルターを、0.2%゛ツイーンー
20−含有PBSで5分ずつ4回洗浄した後、50mMトIノス緩衝l夜(pH
7,0)で2回洗浄した。
このフィルターに400μg/mlの4−クロロ−1−ナフトールと0.03%
過酸化水素水を含有した50mMトリス緩衝液を加えて発色させた。前記ウェス
タンブロッティングの結果を図3l−Biこ示した。図31で第2夕1j(1a
ne)はpYLABC−A/G−DB−CORE14で形質転換された酵母抽出
物、第3列はpYLBC−A/G−UB−KHCV897で形質転換されり酵母
抽出物、第5列1:t、pYLBC−A/G−UB−KHCV403でu5質転
換サレr、Jffl抽出物、第6列はpYLBC−A/G−UB−KHCV57
3でfi5質転換された酵母抽出物を各々示し、第1列および第4タルよKHC
Vベクターを含有しない酵母抽出物に対する結果を示し、M列は標準蛋白分子量
標識(単位(よキロダルトン)である。
また1図32はE2NおよびE2G蛋白の産生な確認する5DS−PAGEおよ
びウェスタンブロッティング結果を示す。図32iこおし1て、第1夕19よK
HCV遺伝子がないプラスミドで形質転換された酵母抽出物を、第2夕jlよp
YLBC−A/G−UB−E2Nで形質転換された酵母抽出物を、第3〜5夕1
11よpYLBC−A/G−UB−E2Nで形質転換された酵母抽出物を示し、
第6タ+1iよ標準分子量標識として、ゲルの上部から200.97.72.4
3.29.18および14キロダルトンを示す。
実施例4:大腸菌内でKHCV cDNA断片を発現させる発現ベクターの作製
(4−A):trPプロモータを有する発現ベクターのイ乍製(4−A−1):
KHCV cDNA断片の作製前記の実施例(3−A−1)および(3−A−2
)でイ乍製した断片に384、K510、K573、K2O2、E2NおよびE
2Cを用し)た。
一方、KHCV−LBCIの916ないし1509509番目レオチドにイ装置
した外111!(El)断片を、次のプライマーを用いて実施例(3−A−1)
と同様にPCHにより作製した。
プライマーPEIUBI (5° −CTTGGTGTTGAGACTCCGC
GGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC−3’ )はユビキ
チン遺伝子と重なり合っている5゛−末端領域の25個ヌクレオチド、即ち、K
HCV−LBClの916番目から936番目のヌクレオチド領域を含む。
プライマーPEl5AL(5°−GACTGGACTATTACCCTGTCA
CGTGGGTGGTGGTTCC−3°)はKHCV−LBCIの15095
09番目レオチドの直後に翻訳が終止されるように終止コドンを有しており、同
時にSal I認識部位を有する。
(4−A−2):ユビキチン遺伝子の合成〈段階1〉
(Ozkaynak、et al、、EMBO,J、6.1429−1439(
1987))により報告されたユビキチン遺伝子の情報を用いて、次のような3
個のオリゴヌクレオチドをDNA合成器で合成した。
UBI 1 : 5’ −CCCCATATGCAAATTTTCGTCAAA
ACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCTAGAGGTTGAA
TCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA−3゜
UBI2:5′−TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTC
TGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAAT
TTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC−3゜
UBI3:5°−ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGA
AGAGTAGATTCCTl”TTGGATGTTGTAGTCAGACAA
GGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA−
3゜
UBIIは5°−末端にNdeI認識部位(5’−CATATG−3°)を有す
ように設計しており、tJBI2と20@のヌクレオチドが重なり合ってし入る
。
UBI3はアミノ酸塩基配列を変えなく、Sac IIの認識部位(5°−CC
GCGG−3°)を有するように設計した(図33参照)。
〈段階2〉
2μgのUBll、0.02μgのUBI2および2μgのUBI3の混合物に
10ulの10倍PCR&1ili液、10ulの12mM dNTP混合物お
よび0.5μmのTaqポリメラーゼを加え、蒸留水で最終容量が100ulに
なるようにした。参照例7と同様にPCRを行った。以後、PCR反応産物を5
%ポリエステルアクリルアミドゲル電気泳動して240bpのDNA (以下、
゛断片Ub゛ と略する)を抽出精製した後、これを20μlのTE&l衛液に
溶解した。
(4−A−3):ユビキチン遺伝子とに!(CV cDNAとの連結前記(4−
A−1)から得られた断片を各々、断片Ubと次のようなPCR反応により連結
した。PCR用ブラプライマーては、前記実施例(3−A−1)のく段階l〉お
よび実施例(4−A−2)のく段階l〉で製造したものを用いた。
まず、次のように7個の試験管を用意した。
試験管Aには50ngの断片に384.50ngの断片ub、2μgのプライマ
ーUBIIと2μgのプライマーPSALCORE14を、試験管Bには50n
gの断片に510.50ngの断片ub、2μgのプライマーUBIIと2μg
のプライマーPSALCOREI7を、試験管Cには50ngの断片に573.
50ngの断片Ub、2ugのプライマーUBIIと2μgのプライマーPSA
LCORE22を、試験管りには50nHの断片に897.50ngの断片ub
、2μgのブライ?−UB 11と2μgO)ブライ7−PKHCV897SA
Lを、試験管Eには50nHの断片E2N、50ngの断片Ub、2μgのプラ
イマーUBIIと2μgのプライマーPE2NSALを、試験管Fには50ng
の断片E2C,50ngの断片Ub、2μgのプライマーUBIIと2μgのプ
ライマーPE32C3ALを、試験管Gには50ngの断片E1.50ngの断
片ub、2μgのプライマーUBIIと2μgのプライマーPEl5ALを入れ
た。
各試験管に10μmの10倍濃度のポリメラーゼ緩衝液、10μmの2mMdN
TPa合物、0.5μlのTaqポリメラーゼを加え、蒸留水を加λて最終容量
を100μmとした。参照例7と同様にPCRを行った。PCR産物をNEB緩
衝液中で、Nde IとSal Iで切断し、試験管AないしGがら得た断片を
各々、断片UBCORE14、LIBCORE17、UBCORE22、UBK
HCV897、UBE2N、UBE2CおよびUBEIと略する。
(4−A−4):発現ベクターの作製
段階1
ptrp322−HGH(KFCC10667、大韓民国特許公告第91−45
7号参照)2μgをPst IとSal Iで完全に切断し、同一のプラスミド
2ugをNED緩衝液4中でPst IとNde Iで完全に切断した。産生物
を領 7%アガロースゲルで分離して1.5Kbと0.8Kbの断片を分離して
、これらを各々断片PBと断片PSと命名した。
段階2
前記段階1と実施例(4−A−31から得られた断片を用いて、次のような連結
反応を実施した。連結反応試験管Aには1100nの断片UBCORE14を、
連結反応試験管Bには100nHの断片UBCORE17を、連結反応試験管C
には1100nの断片UBCORE22を、連結反応試験管りには1100nの
UBKHCV897を、連結反応試験管Eには1100nのUBE2Nを、連結
反応試験管Fには1100nの断片UBE2Cを、連結反応試験管Gには110
0nのUBEIを加えた。各試験管に1100nの断片PB、約1100nの断
片PS、2μlの10倍濃度の連結反応緩衝液、10単位のT4DNAリガーゼ
を添加し、総容量が20μlになるように蒸留水を加えた後、16℃で12時間
反応させた。
連結されたベクターを各々分離して、各々のベクターで大腸菌HBIOI(AT
CC33694)を形質転換させた。断片UBCORE14を含有するベクター
を分離してptrpH−UB−COREI4と、断片UBCORE17を含有す
るベクターを分離してptrpH−UB−COREI7と、断片UBCORE2
2を含有するベクターを分離してptrpH−UB−CORE22と、断片UB
KHCV897を含有するptrpH−UB−KHCV897と、断片UBE2
Nを含有するベクターを分離してptrpH−UB E2Nと、断片UBE2C
を含有するベクターを分離してptrpH−UB−Elと命名した(図34参照
)。
(4−B):tacプロモータを有するpMAL−KHCVベクターの作製(4
−B−1):KHCV cDNA断片の増幅段階I
KHCV cDNA断片を、tacプロモータを用いて大腸菌のMBP−融合蛋
白に発現させるために、次のようなプライマーをDNA合成器で合成した。
プライマー PK426R: 5’ −CTCCGAATTCGGTGCTTG
CGAGTGCCCC−3’
プライマー PK426X:5° −CACGCTCGAGGCATGTGAG
GGTGTCGATGAC−3゜
プライマー PSALCORE17 : 5° −GGGGTCGACTATT
AGGGCAGATTCCCTGTTGC−3゜プライマー P426B :
5’ −GGGTGGGCAGGATGGCTCCTG3゜
プライマー PK513R: 5’ −CTCCGAATTCGGCACGAG
GCTGGAGGACGGCGTGAACT−3’プライマー PK513X
: 5°−CACGCTCGAGAGGCGACCAGTTCATCATCAT
−3’
プライマー PK810R:5° −CTCCGAATTCGGCACGAGG
GTTTCCCAGCTGTTCACCTT−3゜プライマー PK810X
: 5°−CACGCTCGAGATTCAGCCATGTACAACCGAA
CC−3’
プライマー PK798R+ 5’ −CTC:CGAATTCGGCACGA
GGGACGTGCTGCTCCTTAAC−3’プライマー PK798X:
5’ −CACGCTCGAGCAGAAGCAGCGGCCATACGCC
−3゜
プライマー PK754R: 5°−AAAAAGAA、TTCGGCACGA
GGCTGCGAGATTGGGCTCACACG−3゜
プライマー PK754X: 5°−AAAAACTCGAGCCGCATAG
TAGTTTCCATAGACTCAACGGGTATGAATT−3゜
プライマー PK652R: 5°−AAAAAGAATTCGGCACGAG
GTTCATACCCGTTGAGTCTATGGAA−3゛
プライマー PK652X : 5’ −ATTATTGTCGACTATCT
ATCTACTCGAGTCACAGCTTTGCAGCGAGCTCGT−3
゜
プライマー PK403R: 5’ −AAAAAGAATTCACGGGCA
TGACCACTGAC−3゜
プライマー PK403X: 5°−ATTATTCTCGAGTATCACT
CTTGCCGCCACAAGAG−3゜プライマー PK271R:5°−A
AAAAGAATTCACTAGCCTTACAGGCCGG−3゜
ブライv−PK271X:5°−CACGCTCGAGTCACGTGACCA
GGTAAAGGTC−3’
プライマー PK495R: 5°−CCCCCGAATTCGGCACGAG
CGCTGCGGAGGAAAGCAAGTT−3゜プライマー PK495X
: 5° −AAAAACTCGAGGACCACGTCATAAAGGGC
CA−3“
プライマー PK494R: 5’ −AAAAGAATTCGGCACGAG
CGATGCATCTGGTAAAAGGGT−3゜ブライ?−PK494X:
5′−AAAACTCGAGATTGGAGTGAGTTTGAGCTT−3゜
段階2
これらの合成されたプライマーを用いて次のように11個の試験管を用意した。
試験管AニプライマーPK426R2μg、プライマーPK426X 2μg試
験管BニプライマーPK426R2μg、プライマーPK426B 20ng、
PSALCORE17 20ug試験管CニプライマーPK513R2gg、プ
ライマーPK513X 2gg試験管DニプライマーPK810R2mg、ブラ
イv−PK810X 2mg試験管EニプライマーPK798R2gg1プライ
マーPK798X 2gg試験管FニプライマーPK754R2gg、プライマ
ーPK754X 2gg試験管GニプライマーPK652R2gg、プライマー
PK652X 2gg試験管Hニブライv−PK403R2mg、ブライv−P
K403X 2gg試験管工:プライマーPK271R2gg、プライマーPK
271X 2gg試験管JニプライマーPK495R2gg、プライマーPK4
95X 2gg試験管にニプライマーPK494R2gg、プライマーPK49
4X 2gg各試験管ニ10 n g (7) K HCV −L B C1(
A T CC75008)、10μlの10倍ポリメラーゼ緩衝液、10μlの
10mM dNTP混合物および0.5μl (2単位)のTaqポリメラーゼ
を加え、最終容量が100LLlになるように蒸留水を加えた。
反応混合物に鉱油50μlを加えて溶液の蒸発を防止し、参照例7と同様にPC
R反応を行った。
(4−B−2):発現ベクターの作製
2ugのpMAL−CRI (New England Biolabs。
Inc、Cat、、No、800.11099 North TorreyPi
nes Road、La Jol la、CA、U、S、A、)をNED緩衝液
3中でEcoRIとsal Iで完全に切断した0次には、フェノール/クロロ
ホルムで抽出してエタノールで沈降させた。沈降物を40ulのTE緩衝液に溶
解した。
前記(4−B−1)の段階2から得られたPCR反応産物をEcoRrとXho
Iで次のように切断した。試験管AおよびCないしF、HおよびJないしMの
PCR産物1μgずつをEcoRIとXho Iで完全に切断し、試験管Gおよ
び工のPCR産物3μgをXho Iで完全に切断した後、EcoRIで部分的
に切断し;試験管CのPCR産物1μgをEcoRIとSal Iで完全に切断
した。得られたEcoRI−Xho IとEcoRI−3al I断片を分離し
て参旦召例1のような方法で20μlのTE緩衝液に溶解した。
EcoRI−Xho IおよびEcoRIとSal Iで切断した前記のcDN
A断片5μmに10倍連結反応緩衝液2μ1.EcoRIとSal Iで切断し
たpMal−CRI Iμl (50ng)及びT、DNAリガーゼ10単位を
添加し、最終容量が20μlになるように蒸留水を加えた後、16℃で12時間
反応させた。
次いで、連結されたベクターの各々を分離して、これら組換えベクターの各々で
大腸菌HBIOI (ATCC33694)を形質転換させた。試験管Aないし
Kのベクターは各々、pMAL−KHCV426、pMAL−KHCV555、
pMAL−KHCV513、pMAL−KHCV810、pMAL−KHCV7
98.pMAL−KHCV754、pMAL−KHCV652、pMAL−KH
CV403、pMAL−KHCV271、pMAL−KHCV495およびpM
AL−KHCV494と命名した。前記組換えベクターに用いられたベクター、
pMAL−CRIを図35に示した。
(4−C):大腸菌でのKHCV cDNAの発現(4−C−1):trpプロ
モータを有するベクターによるKHCV cDNA断片の発現
段階l
前記実施例(4−A)から得られた各プラスミドで大腸菌(E、coil)W3
110(ATCC38335)を形質転換させた。その中、ptrpH−UB−
KHCV897で形質転換されたE、col i WB210 (E。
coli W3110 ptrpH−UB−KHCV897)を寄託番号ATC
C69640(1991,6,27日付寄託)として、ptrpH−UB−CO
RE17で形質転換されたE、cot L WB2 to (E、col 1W
3110 ptrpH−UR−CORE17)を寄託番号ATCC68641(
1991,6,27日付寄託)として、ptrpH−UB−CORE14で形質
転換されたE、colt W3110 (E、colt W3110ptrpH
−UB−CORE14)を寄託番号ArCC68642(1991゜7.1日付
寄託)として、ptrpH−UB−Elで形質転換されたE。
colt W3110 (E、coli W3110 ptrpH−UB−El
)を寄託番号ATCC68878(1991,12,11日付寄託)として、p
trpH−UB−E2Nで形質転換されたE、cot i WB210 (E。
coli W3110 ptrpH−UB−E2N)を寄託番号ATCC689
66(1992゜4.22日付寄託)としてブダペスト条約下の国際寄託機関で
あるATCCに国際寄託した。
ptrpH−UB−CORE14で形質転換された大腸菌を50μg/mlのア
ンピシリン−含有液体LB培地(1%バタトトリブトン、0.5%酵母抽出物、
1%NaC1)中、37℃で12時間振盪培養した後、この中5mlを11のM
9培地(40mM K、HPO,,22mM KH,PO,,8,5mMNaC
1,18,7mM NH4Cl、1%グルコース、0.1mMMg504.O,
1mM CaC1m 、0.4%カサミノ酸、10gg/mlビタミンB、、4
0μg/mlアンピシリン)へ移して37℃で3−4時間振盪培養した。培養液
の0.D値が650nmで0.5に到る時、インドールアクリル酸(IAA)を
加えて最終濃度が1.4mMになるようにした。5時間経過後、細胞培養液を3
000rpmで25分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。
他の組換え大腸菌細胞を前記と同様に培養してKHCV蛋白を産生させた。
段階2
各細胞を緩衝液に懸濁した後、ラムリの方法(Laemml i’ smeth
od、Nature 227.680 (1970))によって15%5DS−
PAGEしてユビキチンーKHCV蛋白の発現を確認した。この結果を図36な
いし図38に示した。
図36において、M列は標準分子量標識として、上部がら72.43.29およ
び18キロダルトンを示し、
第1列はKHCV遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌の産物を示し、第2列は
ptrpH−UB−CORE14で形質転換された大腸菌の産物、即ち23Kd
の蛋白を、
第3列はptrpH−UB−COREI7で形質転換された大腸菌の産物、即ち
27Kdである蛋白を、
第4列はptrpH−UB−CORE22で形質転換された大腸菌の産物、即ち
29Kdの蛋白を、
第5列はptrpH−UB−KHCV897で形質転換された大腸菌の産物、即
ち40Kdの蛋白を、
第6列は精製KHCV UB897蛋白を示す。
また、図37において、第1列はKHCV遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌
の産物を、第2列ないし5列はIAAを添加して、各々2.4.6および12時
間経過後、得られたptrpH−UB−Elで形質転換された大腸菌の産物を、
第6列は標準分子量標識として上部から72.43.29.18および14キロ
ダルトンを示す。
また、図38において、第1列はKHCV遺伝子がないプラスミド−含有大腸菌
の産物、第2列はptrpH−UB−E2Cで形質転換された大腸菌の産物、及
び第3列はptrpH−UB−E2CNで形質転換された大腸菌の産物を示す。
また、前記実施例(3−C)のような方法でウエストンブロッチングして、組換
え大腸菌で産生された蛋白がKHCV抗体に特異的に結合することを確認した。
その結果を図39ないし図41に示した。
(4−C−2): tacプロモータを有するベクターの発現段階1
前記実施例(4−B)から得られたプラスミドを用いて参考例4の方法によりE
、coil D1210(ATCC27325)を形質転換させた。これらの中
、pMAL−KHCV555で形質転換されたE、coil D1210(E、
colt D1210 pMAL−KHCV555)は寄託番号ATCC686
39として1991年6月27日付でブダペスト条約下の国際寄託機関であるA
TCCに寄託した。
形質転換されたE、coliを50μm/mlのアンピシリン−含有液体LB培
地で12時間振盪培養し、培養液5mlを11のM9培地(11当たりNag
HPO46g、KHz PO43g、NaC10,5g、NH4CIIg、IM
Mg50.2ul、20%グルコース100 u l 、 Ca C120,
1m1)へ移して37℃で3ないし4時間振盪培養した。0.D、値が650n
mで0.5に至る時、IPTGを加えて最終濃度0.2mMとした。5時間経過
後、細胞培養液を3000rpmで25分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収
集した。
段階2
細胞沈降物を緩衝液に懸濁し、ラムリ(Laemml i)の方法(Natur
e227,680 (1970))によって15%5DS−PAGEしてKHC
V蛋白の発現を確認し、この結果を図42に示した0図42において、M列は標
準分子量at識を示し、第1列はpMAL−CRIで形質転換された大腸菌の産
物、即ち40Kd蛋白を示し、第2列はpMAL−KHCV426で形質転換さ
れた大腸菌の産物、即ち65Kd蛋白(MBP−KHCV426蛋白)を示し、
第3列はpMAL−KHCV555で形質転換された大腸菌の産物、即ち70K
dl白(MBP−KHCV555蛋白)を示し、第4列はpMAL−KHCV5
13で形質転換された大腸菌の産物、即ち65Kd蛋白(MBP−KHCV51
3蛋白)を示し、第5列はpMAL−KHCV810で形質転換された大腸菌の
産物、即ち75Kd蛋白(MBP−KHCV810蛋白)を示し、第6列はpM
AL−KHCV798で形質転換された大腸菌の産物、即ち72Kd蛋白(MB
P−KHCV798)を示し、第7列はpMAL−KHCV27で形質転換され
た大腸菌の産物、即ち50Kd蛋白(MBP−KHCV271蛋白)を示し、第
8列はpMAL−KHCV754で形質転換された大腸菌の産物、即ち72Kd
蛋白(MBP−KHCV754蛋白)を示し、第9列はpMAL−KHCV65
2で形質転換された大腸菌の産物、即ち70Kd蛋白(MBP−KHCV652
蛋白)を示し、第10列はpMAL−KHCV403で形質転換された大腸菌の
産物、即ち65Kd蛋白(MBP−KHCV403蛋白)を示し、第11列Gt
pMAL−KHCV495で形質転換された大腸菌の産物、即ち70Kd蛋白(
MBP−KHCV495蛋白)を示し、第12列はpMAL−KHCV494で
形質転換された大腸菌の産物、70Kd蛋白(MBP−KHCV652蛋白)を
示し、第10列はpMAL−KHCV403で形質転換された大腸菌の産物、即
ち65Kd蛋白(MBP−KHCV403蛋白)を示し、第11列+ipMAL
−KHCV495で形質転換された大腸菌の産物、即ち70Kd蛋白(MBP−
KHCV495蛋白)を示し、第12列はpMAL−KHCV494で形質転換
された大腸菌の産物、70Kd蛋白(MBP−KHCV494蛋白を示す、実施
例(3−C)のような方法でウエスタンブロツチングを行って前記蛋白がKHC
V抗体に特異的に結合されたことを確認した。その結果は図43に示した。
(4−C−3):MBP融合蛋白の切断まず、各MBP融合蛋白をXa因子の緩
衝液(20mM トリス−MCI、pH8,0,100mM NaC1,2m
M Ca Cl m、1mM アジド)に対して、24時間透析した。透析され
た蛋白0.2ug (1mg/ml)を0.2ugのXa因子(New Eng
land Biolabs、Cat、#800−IOL)と混合して室温で24
時間放置した。
生成した混合物を5分間100℃に加熱した後、実施例(1−C)のような方法
で5DS−PAGEによりMBPが融合蛋白から除去されたことを確認した。
MBPが除去された蛋白を各々、KHCV426蛋白、KHCV555蛋白、K
HCV513蛋白、KHCV810蛋白、KHCV798蛋白、KHCV271
蛋白、KHCV754蛋白、KHCV652蛋白、KHCV403蛋白、KHC
V495蛋白およびKHCV494蛋白と命名した。
前述のように、発現ベクターの作製において、プライマーを組合わせてPCR方
法により多様な長さと配列のK)(CV cDNAが作製でき、当該分野で通常
の知識を有している者であれば、他の類似なKHCV cDNA断片を容易に合
成し得るだろう、KHCV抗原蛋白もKHCV cDNAにより決定されるので
、前記技術に基づいて、多様な種類のKHCV抗原蛋白の産生も可能であるとい
うことも当該分野で明らかである。また、HCVcDNAおよびKHCV 抗原
蛋白の産生のために、実施例で用いられた酵素、リンカ−および他の物質のみな
らず、これらの等価物も用いられる。
実施例5:酵母細胞内で発現されたKHCV蛋白の精製(5−A):KHCV4
03蛋白の精製〈段階1〉:組換え酵母細胞の培養
KHCV403 cDNA断片と、ユビキチン遺伝子を有するベクター(pYL
BC−A/G−UB−KHCV403)で形質転換されたSaccharomy
ces cerevisiae DCO4−UB−KHCV403をロイシン欠
乏培地(0,67%のアミノ酸−非含有酵母窒素基質、5%グルコース、ロイシ
ン欠乏アミノ酸混合物0.25%)10ml中、30℃で12時間培養した後、
5%グルコース−含有YEPD培地(2%ペプトン、1%酵母抽出物、5%グル
コース)100mlへ移して、30℃で6時間振盪培養し、培養物を5%グルコ
ース−含有YEPD培地11へ移して30℃で6時間培養して発酵用種菌を得た
。 141容量の発酵槽(Bench TopFermentor :NBS社
、U、 S、 A)に101の2%グルコース−含有YEPD培地を入れて、前
記の種菌培養液を接種した。25Orpmの振盪速度および30℃の温度で48
時間振盪培養した。培養液を遠心分離機(Beckman J−6B、Roto
r JS 4.2)で2500rpmの速度で20分間遠心分離して組換え酵母
細胞ペーストを得た。
〈段階2〉:酵母細胞の破壊
前記〈段階1〉から得られた組換え酵母細胞を500m1の緩衝液(50mMト
リス、pH8,5,5mM、EDTA、10mM β−メルカプトエタノール、
1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、1μg/ml ペプスタチンA)に懸
濁した後、直径0.4mmのガラスピーズを総容量の50%(v/v)に相当す
る量で添加した。生成物を均質粉砕機(Bead Beater。
Biospec Product、U、S、A、)で4℃の温度で5分間均質化
して細胞膜を破壊した。破壊された細胞をフィルター(Whatman、3MM
、U、S、A)を用いてろ過してガラスピーズを除去し、酵母均質液を得た。
〈段階3〉:特異抗原蛋白の同定
少量の前記く段階2〉から得られた酵母均質液を15%5DS−ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動した結果、ユビキチンが細胞内で単離され、KHCV40
3cDNAから発現された蛋白(以下、KHCV403蛋白という)は約17.
000ダルトンの分子量として産生されることを確認した。
次に、ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルター上にブロツチング
した後、このフィルターを0.5%ツイーン−20−含有リン酸塩緩衝食塩水(
PBS : 10mMリン酸塩、0.15M NaC1,pH7,0)に入れて
、室温で2時間弱(攪拌しながら免疫グロブリンGの非特異結合を遮断した。次
いで、0.5%ゼラチンと0.05%ツイーン20を含有するPBSで韓国人C
型肝炎患者の血清から分離した免疫グロブリンG (8,2mg/m1)をl/
200 (v/v)に希釈し、希釈されたIgGをフィルターに加えて、室温で
1時間弱く振盪した後、フィルターを0.05%ツイーン−2〇−含有PBSで
5分ずつ4回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish
peroxidase)で標識した抗−ヒト免疫グロブリンG (Bio−Ra
dLab、、Goat Anti−Human IgG−HRP)を、0.5%
ゼラチンと、0.05%ツイーン−20を含有するPBSで1/200 (v/
v)の割合で希釈してこれをフィルターに添加した。フィルターを室温で1時間
弱く振盪しながら反応させた。このフィルターを0.05%ツイーン−20を含
有するPBSで5分ずつ4回洗浄し、50mMトリス緩衝液(pH7,0)で2
回洗浄した。400LLg/mtの4−クロロ−1−ナフトールと0.03%過
酸化水素−含有50mMトリス緩衝液(pH7,0)を添加して発色させた。全
酵母均質液中でKHCV403蛋白のみがC型肝炎患者の血清と免疫学的に反応
して可視的バンドを形成した。
〈段階4〉:溶解された蛋白の除去
前記く段階2〉から得られた酵母均質液を遠心分離機(Beckman J2−
21、Rotor JA 14)によりL 1.000rpmで遠心分離して上
澄液を除去しKHCV403蛋白を含有する不溶性沈降物を得た。
く段階5〉:尿素を用いた沈降物の溶解と分別前記段階4から得られた沈降物を
8M尿素−含有緩衝液(50mM)リス、pH8,5,5mM EDTA、10
mM β−メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、l
μg/mlペプスタチンA)750mlに溶かした後、遠心分離して不溶解沈降
物を除去し上澄液を収集した。この上澄液を2M尿素−含有緩衝液(10mMト
リス、pH9,0,2mM EDTA、5mM β−メルカプトエタノール)で
透析した後、遠心分離して、沈降物を除去しKHCV403蛋白−含有上澄液を
得た。
く段階6〉=1次DEAE−イオン交換クロマトグラフィー前記く段階5〉から
得られた上澄液を2M尿素−含有緩衝液(10mMトリス、pH9,0,2mM
EDTA、5mM β−メルカプトエタノール、)で平衡化したDEAE−セ
ファロースカラム(Pharmacia%FF、5cmx15cm、U、S、A
)を通した。結合された蛋白に0.2M塩化ナトリウム−含有緩衝液(10mM
)リス、pH9,0,2mM EDTA、5mM β−メルカプトエタノール)
750mlを加えて溶出させた。 ゛く段階7〉:2次DEAE−イオン交換り
ロマトグラフィーKHCV403蛋白−含有蛋白画分を収集して緩衝液(10m
M!−リス、pH9,0,2mM EDTA、5mM β−メルカプトエタノー
ル)に対して透析して尿素を除去した後、同一緩衝液で平衡化したDEAE−セ
ファロースカラムを通した。0.1M塩化ナトリウム−含有緩衝液(10mMト
リス、pH9,0,2mM EDTA、4mM β−メルカプトエタノール)を
加えて、溶出された蛋白を分離し、塩化ナトリウムを0.1Mないし012Mの
濃度匂配で加えてカラム−結合蛋白を分別した0画分を5DS−PAGEした後
、高純度のKHCV403蛋白−含有画分を収集した。
〈段階8>: FPLC−フェニルクロマトグラフィー前記段階7から得られた
両分を1゜5M塩化ナトリウム−含有緩衝液(50mMトリス、pH7,42m
M EDTA、5mM β−メルカプトエタノール、)に対して透析した後、同
一緩衝液で平衡化したFPLC−フェニルセファロースカラム(Pharmac
ia%HR,10/10.1cm x 8cm、U、S、A)を通し、1.5な
いしOMの濃度匂配で塩化ナトリウムを含有する緩衝液160m1を加えて蛋白
を分別した。これらの画分などを5DS−PAGEして純度を確認し、高純度の
KHCV403蛋白を含有する画分を別に収集して95%以上の純度のKHCV
403蛋白を得た。
<5−B>:KHCV C0RE 14蛋白の精製く段階1〉:組換え酵母細胞
の培養
KHCV C0RE 14蛋白をコードするcDNA断片とユビキチン遺伝子を
含有するベクター(pYLBC−A/G−UB−CORE 14)で形質転換さ
れたSaccharomyces cerevisiae DCO4−UB−C
ORE 14を、前記実施例(5−A)のく段階1〉と類似な方法で5%グルコ
ースを含有するロイシン欠乏培地で培養した後、培養液20m1を100m1の
4%グルコース含有YEPD培地へ移して、30℃で6時間振盪培養し、11の
2%グルコース−含有YEPD培地へ移して30℃で24ないし48時間培養し
た。培養液を遠心分離して細胞沈降物を得た。
く段階2〉:酵母細胞の破壊
前記〈段階1〉から得られた組換え酵母細胞沈降物を30m1の緩衝液(50m
Mトリス、pH7,5,10mM EDTA、5mM β−メルカプトエタノー
ル、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、1Mg/mlペプスタチン)に懸
濁した後、直径Q、4mmのガラスピーズを総容量の50%に相当する量で添加
した。均質粉砕機(Bead Beater、BiospecProduct、
U、S、A、)により4℃で5分間3回均質化して細胞膜を破壊して、酵母均質
液を得た。
く段階3〉:特異抗原蛋白の同定
小量の前記〈段階2〉から得られた酵母均質液を15% 5DS−ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動した後、コマシブルー(coomassiebrill
iant blue)で染色した。その結果、ユビキチンはKHCV蛋白から単
離され、KHCV cDNAで発現された蛋白(以下、KHCVCORE 14
蛋白という)は、約16.000ダルトンの分子量であることを確認した。
前記実施例(5−A)のく段階3〉のような方法でウェスタンブロッチングを行
った。
その結果、KHCV C0RE14蛋白がC型肝炎患者の血清と免疫学的に反応
して可視的バンドを形成することがわかった。
く段階4〉:可溶性蛋白の除去および不溶性沈降物の洗浄前記〈段階2〉から得
られた酵母均質液を遠心分離機(Beckman J2−21.Rotor J
A−14)により11.OOOrpmで遠心分離して溶解された蛋白を除去し、
KHCV C0RE14蛋白を含有する不溶性沈降物を得た。この沈降物を0.
51の1%トリトンx−ioo、1mM EDTA。
10mMβ−メルカプトエタノール−含有PBSに懸濁して10分間攪拌した後
、遠心分離した。この沈降物を10mMリン酸塩溶液(pH6,5)で1回洗浄
した。
く段階5>:8M尿素を用いた沈降物の溶解前記〈段階4〉から得られた不溶性
沈降物を8M尿素、1mM EDTAおよび10mM β−メルカプトエタノー
ルが含有された10mMリン酸ナトリウム溶液(pH6,5)に懸濁した後、4
℃で12時間攪拌してKHcV C0RE14蛋白を溶解した。この溶液を遠心
分離機(Beckman J2−21゜Rotor JA20)により15.O
OOrpmで20分間遠心分離した後、上澄液を取った。
く段階6>:CM−イオン交換樹脂クロマトグラフィー25m1のCM(カルボ
キシメチル)−セファロース樹脂(Pharmacia、Sweden)を有す
るカラム(2,50mxlOcm)を6M尿素、1mM EDTA、10mMメ
ルカプトエタノールおよび10mMリン酸塩−含有緩衝液(pH6,5)で平衡
化した後、段階5から得られたKHCV C0RE14蛋白−含有溶液を分当り
1mlの流速で前記カラムを通した。カラム内の遊離の状態の残留物を前記の平
衡化溶液で完全に洗浄した。0ないし0.5M濃度匂配の塩化ナトリウムを含有
する平衡化緩衝液500m1でカラム内の蛋白を3m1/分の流速で溶出した。
溶出物のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、KHCV C0RE1
4蛋白が、0.3M塩化ナトリウムで溶出されたことを確認した。KHCVCO
RE14蛋白−含有画分を収集して次の段階に用いた。
く段階7>: S−200ゲル透過クロマトグラフイー前記く段階6〉から得ら
れた画分を集めてYM5限外ろ過膜(Amicon、USA)を通して10m1
に濃縮した。この濃縮液を、6M尿素、1mMEDTAおよび10mMβ−メル
カプトエタノールを含有するPBS溶液で平衡化したS−200セフアクリルカ
ラム(Pharmacia、Sweden:2.5cm x 100cm)に分
当り0.5mlの流速で通過させて、分子量によって分離した。収集された蛋白
の両分を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。高純度のKHC
V C0RE14蛋白−含有画分を集めて4℃でPBS緩衝液に対して透析して
尿素を除去し、高純度のKHCVCORE14蛋白4mgを得た。
酵母で発現された、他のKHCV cDNA断片によりコードされた蛋白も前記
と類似な方法で精製できる。
実施例6:大腸菌で発現されたKHCV蛋白の精製(6−A):KHCV UB
897蛋白の精製〈段階1〉:組換え大腸菌細胞の培養
KHCV897cDNA断片とユビキチン遺伝子を含有するベクター(ptrp
H−UB−KHCV897)により形質転換された(E、coliW3110p
trpH−KHCV897 (ATCC68640)を50 u g/m1のア
ンピシリン−含有LB培地(11当り、バクトドリブトンLog、酵母抽出物5
g、NaC110g)中で12時間振盪培養した後、培養液5mlを11のアン
ピシリン(40gg/m1)−含有M9培地(40mMK、 HPO,,22m
M KHz PO,,8,5mM NaC1,18,7mMNH4Cl、1%グ
ルコース、0.1mM Mg5O,,0,1mMCaC1,,0,4% カザミ
ノ酸、10gg/ml ビタミンBl)へ移して37℃で3ないし4時間振盪培
養した。培養液の0.D、値が650nmで0.5に到る時、インドールアクリ
ル酸(IAA)を加えて最終濃度0.14mMとし、KHCV UB897蛋白
が産生されるようにした。IAAを添加して5時間が経過した後、細胞培養液を
遠心分離機(Beckman J−6B、Rotor JS 4.2)により2
,500rpmで20分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を得た。この沈降物を
リン酸塩緩衝塩溶液(10mMリン酸塩、pH7,0,0,15M塩化ナトリウ
ム)で1回洗浄した。
く段階2〉:細胞破壊
前記〈段階1〉から得られた大腸菌細胞沈降物3gを40m1の緩衝液(50m
Mトリス、pHs、5.5mM EDTA、2mM β−メルカプトエタノール
、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル、1Mg/mlペプスタチンA)に懸
濁した。その懸濁液に50mg/mlのリゾチーム溶液0.3mlを添加して3
7℃で1時間放置した後、超音波粉砕機(HEAT SYSTEMS−ULTR
ASONIC3,INC,、W225、USA)を用いて70%の出力で5分間
水浴中の上で超音波処理して細胞を破壊して大腸菌細胞均質液を得た。
く段階3〉:特異抗原蛋白の同定
少量のく段階2〉から得られた大腸菌細胞均質液を、12%5DS−PAGEし
た結果、前記ベクターにより発現された蛋白(以下、KHCV UB 897蛋
白という)が 39,000ダルトンの分子量を有することを確認した。
その後、ゲル上で分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへ移して、前記
実施例(5−A)のく段階3〉と同様な方法でウェスタンブロッチングした。
その結果、KHCV UB897蛋白だけがC型肝炎患者の血清と免疫学的に反
応して可視的バンドを形成することがわかった。かかる結果から見られるように
、前記の発現されたKHCV UB897蛋白はHCVに対する抗体と結合可能
な免疫反応性蛋白である。
く段階4〉:可溶性蛋白の除去
前記〈段階2〉から得られた細胞均質液を遠心分離機(Beckman J2−
21、Rotor JA 14)によりl 1,00Orpmで25分間遠心分
離して溶解状態の蛋白を除去した後、不溶性沈降物を得た。
〈段階5〉ニトリトンX−100とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前
記く段階4〉から得られた沈降物を1%トリトンX−100−含有緩衝液(50
mMトリス、pH8,5,5mM EDTA、2mM β−メルカプトエタノー
ル)50mlに懸濁した。この懸濁液を、室温で30分間攪拌した後、遠心分離
機(Beckman Rotor J2−21、JA14)により11.000
rpmで25分間遠心分離して上澄液を除去したのち、不溶性沈降物を得た。次
いで、この沈降物を緩衝液(50mM)リス、pH8,5,5mMEDTA、2
mM β−メルカプトエタノール)50mlに懸濁した。その懸濁液を攪拌しさ
らに遠心分離して上澄液を除去したのち、不溶性沈降物を得た。
前記のような簡単な洗浄過程だけで、少くとも純度60%以上のKHCVUB8
97蛋白を得た。
〈段階6>:8M尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記〈段階5〉から得られた
KHCV UB897蛋白を含有する不溶性沈降物を8M尿素を含有する緩衝液
(20mM リン酸塩、pH6,0,2mMEDTA、2mM β−メルカプト
エタノール)50mlに懸濁した。この懸濁液を室温で1時間攪拌し遠心分離し
て、不溶性沈降物を除去したのち、上澄液を得た。
く段階7〉:S−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記〈段階6〉か
ら得られた上澄液を、4M尿素−含有緩衝液(20mMリン酸塩、pH6,0,
2mM EDTA、2mM β−メルカプトエタノール)で平衡化したS−セフ
ァロースカラム(Pharmacia、FF、2.5cmx7cm、U、S、A
、)に通過させ、塩化ナトリウムをOないし032Mの濃度匂配で含有する60
0m1の緩衝液で溶出した。蛋白画分などを5DS−PAGEL、て、高純度の
KHCV UB897蛋白を含有する両分を収集した。
〈段階8〉:尿素の除去およびFPLC−モノQイオン交換クロマトグラフィー
前記く段階7〉から収集したKHCV UB897蛋白を含有する蛋白画分を緩
衝液(10mMトリス、pH8,5,2mM EDTA、2mM β−メルカプ
トエタノール)で透析して尿素を除去した後、同一緩衝液で平衡化したFPLC
−モノQイオン交換樹脂カラム(Pharmacia%HR515)を通過させ
、塩化ナトリウムをOから0.4Mまでの濃度匂配で含有する40m1の緩衝液
で溶出した。高純度のKHCV UB897蛋白を含有する画分を収集して、少
くとも90%以上の純度を有するKHCV UB897蛋白を得た。
(6−B):KHCV UB C0RE17蛋白の精製く段階1〉二組換え大腸
菌細胞の培養
C型肝炎ウィルスのcDNAとユビキチン遺伝子を含有するベクター(ptrp
H−UB−CORE17)により形質転換されたE、coliW3110 pt
rpH−UB−CORE17(ATCC68641)を、50Mg/mlアンピ
シリン、looLLg/mlトリプトファンを含有するLB培地中、37℃で1
2時間培養した後、培養液50m1を11のM9培地へ移して37℃で6ないし
8時間培養した後、前記実施例(6−A)のく段階1〉のような方法で細胞沈降
物を収集した。
く段階2〉:細胞破壊
前記〈段階1〉から得られた大腸菌細胞沈降物3gを4℃で緩衝液(50mMト
リス、pH7,5,5mMEDTA、10mM β−メルカプトエタノール、1
mMフッ化フェニルメチルスルホニル、1Mg/mlペプスタチン)20mlに
懸濁した後、リゾチーム3mgを添加して5分間攪拌した。生成物を超音波粉砕
機(Heat Systemas−Ultrasonics、Inc、、W22
5、 U、 S、 A、 )を用いて水浴中で20分間超音波処理して細胞を破
壊したのち、細胞均質液を得た。
〈段階3〉:特異抗原蛋白の同定
前記〈段階2〉から得た大腸菌細胞均質液を15%5DS−ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動し、コマシブルーで染色した結果、約27,000ダルトンの
分子量を有する蛋白(以下、これをKHCVUB C0RE17蛋白という)が
産生されたことを確認した。
次いで、ゲル上に分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへ移し、このフ
ィルターを実施例(5−A)のく段階3〉のような方法でウエスタンブロッチン
グした。その結果、全大腸菌細胞均質液中、KHCV UB−CORE17だけ
がC型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的なバンドを形成した。
〈段階4〉:尿素処理
前記〈段階2〉から得られた細胞均質液を遠心分離機(Beckman J2−
21、Rotor JA2)により12,000rpmで20分間遠心分離して
、不溶性物質を除去したのち、上澄液を得た。この上澄液に9M尿素溶液を添加
して最終濃度を6Mとして、4℃で12時間攪拌した。
く段階5〉:酸処理
前記〈段階4〉から得られた溶液に1M酢酸ナトリウム(pH4,5)を添加し
て10mMの濃度とし、1M酢酸を加えてpH5,0になるようにした。1時間
攪拌し、遠心分離機(Beckman J2−21、Rotor JA14)に
より11.OOOrpmで遠心分離して沈降物を除去したのち上澄液を得た。
く段階6〉:モノーS−クロマトグラフィー前記く段階5〉から得られた上澄液
を、FPLCモノ−Sカラム(HR515、Pharmacia、Sweden
)に通過させて精製した。8M尿素、1mM EDTA、1mMβ−メルカプト
エタノール、10mM酢酸を含有する緩衝液A (pH5,0)でカラムを平衡
化し、UB−CORE17蛋白溶液を通過させた後、再び緩衝液Aでカラムを洗
浄した。その後、8M尿素、1mMEDTA、1mMβ−メルカプトエタノール
、10mM酢酸および1M塩化ナトリウムを含有する緩衝液Bを、初の5分間は
17.5%、その次に55分間は35%、最終的に10分間は100%になるよ
うに0.8ml/分の流速で漸進的に添加して蛋白を溶出した。KHCV UB
−CORE17蛋白は緩衝液Bの量が25%に至る時、即ち、塩化ナトリウムの
濃度が0.25Mの場合に溶出された。
く段階7>: S−200ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階6〉から得た
蛋白溶液を、6M尿素、1mM EDTAおよび1mMβ−メルカプトエタノー
ル−含有PBS溶液で平衡化したS−200セフアクリルカラム(Pharma
cLa、Sweden、2.5cm x 100cm)に分当り0.5mlの流
速で通過させて、これらの分子量によって分離した。蛋白を収集し、5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動して、KHCVUB−CORE17蛋白を含む画
分な集めた。この両分を4℃でPBS溶液に対して透析して少な(とも90%以
上の純度を有するKHCV UB−CORE17蛋白4mgを得た。
(6−C):UB−El蛋白の精製
く段階l〉:組換え細菌細胞の培養
KHCV El蛋白とユビキチン(UB)の融合蛋白を産生し得るE。
coli W3110、ptrpH−UB−El (ATCC6887B)を前
記(6−A)のく段階1〉のような方法で培養し、収集した。
く段階2〉:細胞破壊
前記く段階1〉から得られた細菌細胞沈降物を50m1の緩衝液1 (20mM
トリス、pH7,5,1mM EDTA、2mMβ−メルカプトエタノール、1
mMフッ化フェニルメチルスルホニル、1Mg/mlペプスタチンA)に懸濁し
た後、リゾチーム溶液を最終濃度0.2mg/mlになるように加え、37℃で
30分間培養した後、超音波粉砕機により水浴上で70%の出力で5分間超音波
処理して細胞を破壊したのち均質液を得た。
く段階3〉:特異抗原発現の同定
前記く段階2〉の均質液を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
した結果、約27,000ダルトン(dalton)の分子量を有する蛋白(以
下、UB−El蛋白という)がベクターから発現された。
また、ゲル上で分離された蛋白をインモビロンPフィルター(Immobilo
n P filter、MILLIPORE、Cat。
No、IPUH00010、細孔の大きさ 0.454%m)へプロッチングし
、前記実施例(5−A)のく段階3〉のような方法でウェスタンブロッチングし
た。
その結果、全細胞均質液中、UB−El蛋白がC型肝炎患者の血清と免疫学的に
反応して可視的バンドを形成したことがわかる。
〈段階4〉:可溶性蛋白の除去
前記〈段階2〉の細胞均質液を遠心分離機(Beckman J2−21゜Ro
tor JA14)により11.OOOrpmで25分間遠心分離して可溶性蛋
白を除去し、不溶性沈降物を得た。
く段階5〉:不溶性沈降物の洗浄
前記〈段階4〉の沈降物を30m1の1%トリトンX−100−含有緩衝液1(
20mMトリス、pH7,5,1mM EDTA、2mMβ−メルカプトエタノ
ール)に懸濁した。この懸濁液を室温で30分間攪拌した後、遠心分離機(Be
ckman J2−021、Rotor JA 14)を用いて11.000r
pmで25分間遠心分離して1%トリトンX−100に対して可溶性の蛋白を除
去し、不溶性蛋白を得た。この沈降物を攪拌しながら30m1の緩衝液1に懸濁
し、再び遠心分離して不溶性蛋白を得た。
前記の洗浄過程により少なくとも純度60%以上のUB−El蛋白を得た。
〈段階6〉:不溶性沈降物の溶解及び分別前記〈段階5〉のUB−E1蛋白を含
む不溶性沈降物を50m1の8Mグアニジン塩酸塩−含有緩衝液2 (50mM
)リス、pH9,0,1mMEDTA、2mM β−メルカプトエタノール)に
懸濁した後、室温で30分間攪拌し、遠心分離機により11.OOOrpmで2
5分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し、上澄液を得た。前記上澄液を、グア
ニジン塩酸塩の最終濃度が0.5Mになるように緩衝液2で希釈し遠心分離して
、上澄液を除去し、UB−El蛋白−含有沈降物を得た。
く段階7〉:不溶性沈降物の溶解
前記〈段階6〉のLJB−El蛋白−含有不溶性沈降物を、20m1の8M尿素
−含有緩衝液3 (50mM炭酸ナトリウム、pH9,5,1mM EDTA、
2mM β−メルカプトエタノール)に懸濁した後、室温で1時間攪拌し、遠心
分離* (Beckman J2−21、Rotor JA14)により11、
OOOrpmで25分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し、その上澄液を得た
。
く段階8〉:Q−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記く段階7〉の
上澄液を、緩衝液3で平衡化したQ−セファロースカラム(Pharmacia
、FF、1.2cm x 7cm)に通過させ、Oないし0.4μ濃度匂配の塩
化ナトリウムを含むloomlの緩衝液を加え、結合蛋白を溶出した。蛋白画分
を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してUB−E1蛋白を含
む両分を別に収集し、少なくとも純度90%以上のUB−E1蛋白を得た。
(6−D):KHCV UB−C:0RE14蛋白の精製く段階l〉:組換え大
腸菌細胞の培養
KHCVのcDNA断片およびユビキチン遺伝子を含むベクター(ptrpH−
UB−CORE14)により形質転換されたE、coli W3110ptrp
H−UB−CORE 14 (ATCC68642)を50 u g/m 1の
アンピシリンと100μg/mlのトリプトファンを含有した培地で12時間培
養した後培養液50m1を11(7)M9培地へ移して37℃で6−8時間培養
した後、実施例(6−A)のく段階1〉のような方法で細胞ペーストを収集した
。
〈段階2〉:細胞破壊
前記〈段階l〉から得た大腸菌細胞4gを4℃で20m1の緩衝液(50mM、
pH7,5,5mMEDTA、10mMβ−メルカプトエタノール、1mMフッ
化フェニルメチルスルホニル、1μg/mlペプスタチン)に懸濁した後、リゾ
チームを4mg添加し5分間攪拌して、水浴上で超音波粉砕機を用いて20分間
超音波処理して細胞を破壊した。
く段階3〉:特異抗原蛋白の同定
少量の前記く段階2〉から得られた均質液を、15%5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動してコマシーブルーで染色いた結果、約23,000ダルト
ンの分子量の蛋白が(以下、KHCV tJB−CORE14OR上いう)が発
現されたことを確認した。
次いで、ゲル上に分離された蛋白をニトロセルロースフィルターへブロッチング
し、このフィルターを前記実施例(5−A >のく段階3〉のような方法でウェ
スタンブロッチングした。その結果、全大腸菌均質液中、KHCV UB−CO
RE14OR上C型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可視的なバンドを形成
することがわかった。
〈段階4〉:尿素処理
前記〈段階2〉から得られた均質液を遠心分離機(Beckman J2−21
、Rotor JA20)により12.00Orpmで20分間遠心分離して不
溶性物質を除去し、上澄液を得た。この上澄液に9M尿素を加えて最終濃度を8
Mにした後、室温で12時間攪拌した。
く段階5〉:酸処理
前記く段階4〉から得られた溶液に1M酢酸ナトリウム(pH4,5)を添加し
て、最終濃度10mMとし、1M酢酸を加えてpH5,0にした後、室温で1時
間攪拌した。この溶液を遠心分離機(Beckman J2−21、Rotor
JA14)により11.00Orpmで遠心分離して沈降物を除去し、上澄液
を得た。
〈段階6>:CM−イオン交換クロマトグラフィー25m1の0Mセファロース
樹脂(Pharmacia、Sweden)を含有するカラム(2,5cm x
10cm)を、8M尿素、1mM EDTA、10mMβ−メルカプトエタノ
ール、10mM酢酸塩を含有する緩衝液(pH5,0)で平衡化した後、〈段階
5〉から得たKHCV UB−CORE14OR上含有する溶液を分当り、1m
lの流速で通過させた。カラム内に残っている遊離形態の物質を前記平衡化緩衝
液で完全に洗浄した。0ないし0.5Mの1度匂配で塩化ナトリウムを含有する
500m1の前記平衡化緩衝溶液でカラム内に結合された蛋白を3m1/分の流
速で溶出した。溶出物を5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、確認し
た結果、KHCV UB−CORE14OR上0.3Mとして溶出された。KH
CV UB−CORE14−含有画分を次の段階に用いるために収集した。
〈段階7> : S−200ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階6〉から得
られた画分をYM5限外濾過膜(Amicon、U、S、A)を通して10m1
に濃縮した。この濃縮液を、6M尿素、1mMEDTAおよび1mMβ−メルカ
プトエタノールを含有するPBS溶液で平衡化したS−200セファクリルカラ
ム(Pharmacia、Sweden。
2.5cm x loocm)に分当り0.5mlの流速で通過させてそれらの
分子量によって分離した。蛋白画分を収集し5DS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で確認した。KHCV UB−CORE14OR上含む画分な集めた。
〈段階8〉:モノーSクロマトグラフィー前記く段階7〉から得られたKHCV
UB−CORE14蛋白溶液をFPLCモノ−5カラム(Pharmacia
、Sweden、HR515)を通してさらに精製した。KHCV UB−CO
RE14蛋白溶液を同容量の6M尿素、1mM EDTA、1mMβ−メルカプ
トエタノールおよび10mM燐酸塩を含有する緩衝液A (pH7,0)で稀釈
し、緩衝液Aで平衡化したカラムに通過させた後、さらに緩衝液でカラムを洗浄
した。その後、6M尿素、1mMEDTA、1mMβ−メルカプトエタノール、
10mMリン駿塩お酸塩0.5M塩化ナトリウムを含有する緩衝液Bの量を初の
5分間は35%、次いで55分間は70%、最終10分間は100%に至るよう
に0.8ml/分の流速で漸進的に増量しながら添加して蛋白を溶出した。KH
CV UB−CORE14OR上緩衝液Bの量が60%に至った時、即ち、塩化
ナトリウム濃度が0.25Mの場合に溶出された。
この画分を4℃でPBS溶液に対して透析して、少な(とも純度90%以上のK
HCV UB−CORE14蛋白4mgを得た。
(6−E):UB−E2N蛋白の精製
く段階1〉:組換え細菌細胞の培養
KHCV E2N蛋白とユビキチンの融合蛋白を産生可能なE、coli。
WB210ptrpH−UB−E2N (ATCC68966)を、50 u
g/m1のアンピシリン−含有LB培地中で12時間振盪培養した。培養液10
m1を2%カザアミノ酸と10Mg/mlのトリプトファン−含有M9培地11
へ移して37℃で約3時間振盪培養した。培養液に、0.D、値が650%mで
0.2になる時インドールアクリル酸(IAA)を加えて最終濃度50μg/m
1になるようにして組換えUB−E2N蛋白を産生じた。IAAを添加してから
約5時間経過後、培養液を遠心分離機(Beckman J−6B、Rotor
JS4.2)を用いて、3,500rpmで25分間遠心分離してバクテリア
細胞沈降物を収集した。この沈降物をPBSで1回洗浄した。
く段階2〉:特異抗原の同定
均質液を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。その結果、
UB−E2N蛋白が約28.000ダルトンの分子量で発現されたことを確認し
た。
以後、ゲル上に分離された蛋白をインモビロンPフィルター(MILLIPOR
E、Cat、No、IPUH00010,孔の大きさ0.45μm)上にブロッ
チングした。このフィルターを、0.5%ツイーン2〇−含有PBS (10m
M燐酸塩、pH”r、0、領 15M 塩化ナトリウム)に入れて室温で2時間
振盪して免疫グロブリンGの非特異結合を遮断した。
これに、0.5%ゼラチンと0.05%ツイーンを含有するPBSで前記C型肝
炎患者の血清10m1を1:20の割合で稀釈した溶液10m1を添加した。生
成物を室温で1時間弱く振盪しながら反応させた後、0.05%ツイーン20−
含有PBSでそれぞれ5分ずつ4回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ(al
kaline phosphatase)でF!識した抗−ヒト免疫グロブリン
G (Boeringer Manheim、Cat、No。
605 415、Anti−Human IgG−ALP)を0.5%ゼラチン
と0.05%ツイーン2〇−含有PBSで1:1000の割合で稀釈し、該稀釈
溶/ff110m1をフィルターに添加した。生成物を室温で1時間振盪しなが
ら反応させ、0,05%ツイーン2〇−含有PBSで5分ずつ4回、100mM
トリス緩衝液、pH9,5,5mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナトリウ
ム)でそれぞれ5分ずつ2回洗浄した。
このフィルターに125μg/mlのニトロブルーテトラゾリウム(Pierc
e、NBT)と25+ug/mlのブロモクロロインドール燐酸塩(Pierc
e、BCIP)を含有する100mM)リス緩衝液を加えて発色させた。その結
果、全細胞均質液中、UB−E2N蛋白がC型肝炎患者の血清と免疫学的に反応
して可視的なバンドを形成した。
く段階3〉:細胞破壊及び可溶性蛋白の除去前記段階1から得られた約3gのバ
クテリア細胞沈降物を50m1の緩衝液1(20mMトリス、pH7,5,1m
M EDTA、2mMβ−メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチル
スルホニル、1回g/mtペプスタチンA)に懸濁し、リゾチーム溶液を最終濃
度0.2mg/mlになるように加えた後、37℃で30分間反応させ、水浴中
で超音波粉砕機を利用して70%の出力で5分間超音波処理して細胞を破壊した
のち、溶菌物を得た。前記均質液を遠心分離機(Beckman J2−21、
Rotor JA14)により11、OOOrpmで25分間遠心分離して可溶
性蛋白を除去し、不溶性沈降物を得た。
く段階4〉ニトリトンX−100とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前
記〈段階3〉の沈降物を30m1の1%トリトンx−ioo−含有緩衝液1(2
0mM)リス、pH7,5,1mM EDTA、2mMβ−メルカプトエタノー
ル)に懸濁した。該懸濁液を室温で30分間攪拌した後、遠心分離機(Beck
man J2−21 Rotor、JA14)を利用して11、OOOrpmで
25分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、沈降した蛋白を得た。この沈降物を
30m1の緩衝液1に懸濁した。該懸濁液を攪拌し、再び遠心分離して不溶性蛋
白を得た。
前記のような簡単な洗浄過程だけで少なくとも純度70%以上のUB−E2N蛋
白を得た。
〈段階5>:8M尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記く段階4〉のUB−E2
N蛋白を含む不溶性沈降物を、40m1の8M尿素−含有緩衝液2(50mM)
リス、pH9,0,1mM EDTA、2mMβ−メルカプトエタノール)に懸
濁した。該懸濁液を室温で1時間攪拌し、遠心分離して不溶性沈降物を除去し、
その上澄液を得た。
〈段階6> : S−200ゲル透過クロマトグラフイー前記〈段階5〉のUB
−E2Nを含む8M尿素溶液40m1を、YMIO限外濾過膜(Amicon)
を用いて5mlに濃縮した後、4M尿素−含有緩衝液2で平衡化したS−200
樹脂カラム(Pharmacia、2.5cm x90cm)に時間当り、40
m1の流速で通過させながら、管当たり2mlの画分を収集した。この画分をS
DSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してUB−E2Nを含む画分を収集し
た。
く段階7〉:Q−セファロースイオン交換クロマトグラフィー前記く段階6〉の
UB−E2Nを含む溶液を、4M尿素−含有緩衝液2で平衡化したQ−セファロ
ースカラム(Pharmacia、U、S、A、、FF。
L 2cm x 7cm)に通過させ、0ないし1.0Mの濃度勾配で塩化ナト
リウムを含む150m1の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。これを5DS−
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、少なくとも純度80%以上のUB−
E2Nの画分を収集した。
く段階8〉:尿素の除去およびFPLC−フェニルクロマトグラフィー前記く段
階7〉のUB−E2N蛋白を含む4M尿素溶液をYMIO限外濾過膜(Amic
on)で8mlに濃縮した後、透析膜(SpectrumMedical In
dustries、INC,、M、W、cut off6.000−8,000
)を用いて緩衝液3(20mM)リス、pH9,0,1mM EDTA、2mM
β−メルカプトエタノール、0.2M塩化ナトリウム)に対して透析して尿素を
除去した。この溶液に塩化ナトリウムを最終濃度IMになるように加えた。生成
物をFPLC−フェニルセファロースカラム(Pharmacia、HR515
,0,5cm x 5cm)に通過させ、1.0M−0Mの濃度勾配で塩化ナト
リウムを含有する40m1の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。該両分を5D
S−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して少なくとも90%以上の純度を有
するtJB−E2N蛋白を含む画分を収集した。
<6−F>:tJB−E2C蛋白の精製く段階1>: KHCV−E2C蛋白と
ユビキチンの融合蛋白を産生し得るE。
coil W3110を50Mg/mlのアンピシリン−含有LB中で12時間
振盪培養した。この培養液20m1を2%カザミノ酸と10Mg/mlのトリプ
トファンが含有された11のM9培地へ移して37℃で約2時間振盪培養した。
該培養液に0.D、値が650nmで吸光度が0.3になる時、インドールアク
リル#(IAA)を加えて最終濃度が50Mg/mlになるようにして組換えU
B−E2C蛋白を産生させた。IAAを添加して約3時間経過後、培養液を遠心
分離機(Beckman J6.Rotor H34)を用いて3.50Orp
mで25分間遠心分離して細胞沈降物を収集した。この沈降物をPBSで1回洗
浄した。
く段階2〉;特異抗原の同定
沈降物を15%5DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。その結果、
tJB−E2C蛋白が約25,000ダルトンの分子量として発現されたことを
確認した。
以後、ゲル上に分離された蛋白をインモビロンPフィルター(MILLIPOR
E、cat、#IPUH00010,孔の大きさ0.45μm)上にブロッチン
グした。このフィルターを0.5%ツイーン−20−含有PBSに入れ、室温で
2時間振盪して免疫グロブリンGの非特異結合を遮断した。これに、0.5%ゼ
ラチンと0.05%ツイーン−含有−PBSでC型肝炎患者の血清を1=20の
割合で希釈した溶液10m1を添加した。この生成物を室温で1時間弱く振盪し
、0.05ツイーン−20−含有PBSでそれぞれ5分ずつ4回洗浄した。西洋
ワサビペルオキシダーゼで標識された抗−ヒト免疫グロブリンG(Bio−Ra
d Lab、Anti−Human IgG−HRP)を0,5%ゼラチンと0
.05%ツイーン−2〇−含有PBSでl :500の割合で希釈し、この希釈
溶液10m1を前記フィルターに添加した。この生成物を室温で1時間振盪しな
がら、反応させ、それぞれ5分ずつ0.05%ツイーン−2〇−含有PBSで4
回、50mMトリス緩衝液(pH7,0)で2回洗浄した。
このフィルターに400μg/mlの4−クロロ−1−ナフトールと0.03%
過酸化水素を含有する50mMトリス緩衝液を加えて発色させた。その結果、全
細胞均質液中、UB−E2C蛋白がC型肝炎患者の血清と免疫学的に反応して可
視的バンドを形成した。
く段階3〉:細胞破壊および可溶性蛋白の除去前記段階1から得られた1gの細
胞沈降物を50m1の溶菌緩衝液(20mMトリス、pH7,5,LmM ED
TA、2mM β−メルカプトエタノール、1mMフッ化フェニルメチルスルホ
ニルおよび1Mg/mlペプスタチンA)に懸濁して、リゾチーム溶液を最終濃
度0.5mg/mlになるように加え、37℃で30分間培養した後、水浴中で
超音波粉砕機を用いて70%の出力で5分間超音波処理して細胞を破壊し、均質
液を得た。この均質液を遠心分離機(Beckman J2−21.Rotor
JA14)により11.00Orpmで25分間遠心分離して可溶性蛋白を除
去し、不溶性沈降物を得た。
〈段階4〉ニトリトンX−100とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗浄前
記く段階3〉の沈降物を20m1の1%トリトンX−100−含有緩衝液1(2
0mM)リス、pH7,5,1mM EDTA、2mM β−メルカプトエタノ
ール)に懸濁した。この懸濁液を室温で30分間攪拌した後、遠心分離機(Be
ckman J2−21、Rotor JA14)により11.000rpmで
25分間遠心分離して可溶性蛋白を除去し、沈降蛋白を得た。この沈降物を30
m1の緩衝液1に懸濁した。この懸濁液を攪拌し、再遠心分離して不溶性蛋白を
得た。
く段階5>:8M尿素を用いた不溶性沈降物の溶解前記〈段階4〉のUB−E2
C蛋白を含む不溶性沈降物を20m1の8M尿素−含有緩衝液2 (50mM
炭酸塩pH9,5,1mM EDTA、2mM β−メルカプトエタノール)に
懸濁した。この懸濁液を室温で1時間攪拌し、遠心分離して不溶性沈降物を除去
したのち、その上澄液を得た。
〈段階6>: FPLC−モノQイオン交換クロマトグラフィー前記〈段階5〉
の上澄液を0.1塩化ナトリウム−含有−緩衝液2で平衡化したFPLC−モノ
Qカラム(Pharmacia、HR515,0,5cmx 5cm U、S、
A、)に通過させ、0.1〜0.4Mの濃度勾配で塩化ナトリウムを含む40m
1の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。この画分を5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動して少なくとも純度80%以上の画分を収集した。
〈段階7〉:尿素の除去およびFPLC−フェニルクロマトグラフィー前記〈段
階6〉のUB−E2C蛋白を含む8M尿素溶液なYMIO限外濾過膜で14m1
に濃縮した後、透析膜(Spectrum MedicalIndustrie
s、Inc、、M、W、cut off 6,000−8.000)を用いて緩
衝液3 (20mM トリス、pH9,0,1mMEDTA、2mM β−メル
カプトエタノール、0.2M塩化ナトリウム)に対して透析して尿素を除去した
。この溶液に塩化ナトリウムを最終濃度IMになるように加えた。生成物をFP
LC−フェニルセファロースカラム(Pharmacf、a、HR515,0,
5cm x 5cm)に通過させ、IM−OMの濃度勾配で塩化ナトリウムを含
有する40m1の緩衝液を加えて結合蛋白を溶出した。その画分を5DS−ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動して少なくとも純度90%以上のUB−E2C
蛋白を含む画分を収集した。
実施例7 n KHCV組換え蛋白に対する抗−KHCV抗体の検索(7−A)
:抗原濃度による陽性および陰性の混合血清試料の反応性抗原KHCV 403
.KHCV 897およびKHCV UB−CORE14蛋白を各々、50mM
ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9,0)で各々0.25μg/ml、2.0gg
/mlおよび2.0μg/mlの濃度から2倍ずつ順次希釈した。希釈された蛋
白溶液をマイクロタイタープレート(Dynatech、Immulon ty
pe 1 m1crotiterplate)の穴に各大当り200μlずつ入
れた後、37℃で2時間インキュベートした。この時、プレートをバラフィルム
で覆って溶液の蒸発を防止した。
2時間被覆したプレートを0.05%(v/v)ツイーン−20−含有PBS(
pH7,4,以下洗液という)で−回洗浄した。0.1%ゼラチン(v/v)を
含有するPBSを210μlずつ各穴に添加し、37℃で2時間インキュベート
させた。この穴を前記の洗液300μmずつで2回洗浄した後、0.25%ゼラ
チン、1mM EDTA、1.0%(v/v)トリトンX−100、および0.
02%チメロザール含有PB3190mlとHCV患者の混合陽性および陰性血
清試料10μmを各々の穴に入れて数秒間よく混合した後、37℃で1時間イン
キュベートした。この時、使用したHCV患者の陽性血清試料と陰性血清試料を
使用前にオルト(Ortho)社のC−100抗原を用いたC型肝炎診断用キッ
ト(Ortho Diagnostic Systems。
Raritan、N、J、、88869.U、S、A、)を用いて確認した。
かかる血清試料は大韓民国延世大学医学部内のセブランス病院から提供された。
37℃で1時間反応させた前記穴を洗液300μlで5回洗浄した後、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された抗ヒトIgGγ鎖免疫グロブリン(
Bio−Rad Company、 Richmond、 CA 94804、
U、S、A、、0.1mg 蛋白/m1)を10%ウシ胎児血清、1%フィコル
(Sigma、v/v)、0.02%チメロザール、および0.05%ツイーン
−2〇−含有PBSで5000倍に希釈した後、この希釈溶液を各大当り200
μlずつ穴に入れた。その後、37℃で1時間反応させた後、さらに前記洗液で
5回洗浄した。50mMクエン酸塩緩衝液に溶解して燐酸塩でpH5,5に調整
した0−フエニレンジアミンニ塩酸(OPD、Sigma、10mg/ml)を
200μlずつ各穴に加えて室温の暗所で30分間インキュベートした。
各大当たり4N硫酸を50μmずつ添加して発色反応を中止させた後、波長49
2nmでマイクロタイタープレート吸光度測定器(DynatechMicro
titer Plate Reader)を用いて各穴の吸光度を測定した(図
19参照)。
(7−B):診断キットの製作
診断キットの製作ノタメニ、精製KHCV UB−CORE 14、KHCV8
97およびKHCV403蛋白の抗原を用いた。その抗原を10mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液(pH9,5)または50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH90)
で最適濃度に希釈し、96個の穴のイミュロン類型1マイクロタイタープレート
(Dynatech)に各大当り150〜200μlずつ入れた後、4℃で12
〜18時間インキュベートして抗原をプレートの穴に吸着させた。
各抗原の最適濃度は、KHCV UB−CORE14蛋白の場合、0.18〜0
.75μg/ml、KHCV897蛋白の場合、0.06〜0.3μg/m1、
KHCV 403蛋白の場合、0.12〜0.5μg/mlである。
本実施例においては三つの抗原を各々0.3μg/m1a度で用いた。
各穴の被覆後、各内容物を吸入器で除去した。プレートを0.05%(V/V)
ツイーン−20−含有PBS (pi−i7.4)で洗浄した後、37℃で2時
間01%(w/v)ゼラチン−含有−PBS (210μg/穴)(pH7,4
)で遮凱し、さらに洗液で3回洗浄した。大向の残存水分を吸湿装置で除去した
。
各穴に検体試料10μlとウシ胎児血清−含有緩衝液(10mM トリス。
pH7,5,150mM NaC1,0,2%トリトンX−100、Q、1mM
EDTA、0.02%チメロザール)190μmを加えた後、37℃で1時間反
応させて検体試料内のHCV抗体と穴に吸着された抗原との結合反応を誘導した
。次いで、プレートを0.05%(v/v)ツイーン−20−含有PBS(pH
7,4)で5回洗浄した後、10%(v/v)ウシ胎児血清アルブミン−含有緩
衝液(lomM トリス、pH7,5,150mM NaC1,0,02%チメ
ロザル、1%フィコル)で希釈した抗−ヒトI gG−HRP (Goatan
ti−human IgG−HRP、Bio−Rad Lab、。
U、S、A、)を200μlずつ加え、37℃で1時間インキュベートした後、
0.05%(V/V)ツイーン−2〇−含有PBS (pH7,4)で洗浄した
。
OPD溶液200μlを加えて、室温で30分間発色させた。その後大当り4N
硫酸を50μmずつ加えて反応を終止させ、492nmの波長で吸光度を測定し
た。陽性または陰性判定の基準値であるカットオフ値(cut offvalu
e)は陰性血清試料の吸光度平均値に0.4を加えた値と定めた。
前記方法によるKHCV蛋白と混合抗原に対する結果は表1に示した。比較用H
CV診断試薬としてはオルソ(Ortho)社のものを用いており、使用方法は
製造業者の指針に従う。
表1.酵素免疫測定法によるH CVに対するKHCV蛋白と抗体との反応性注
: 1)++++:カットオフ値 + 1,5〈 吸光度(0,D、 )+++
:カットオフ値 + 1.o〈 吸光度 く カットオフ値+1.5
++:カットオフ値 + 0.5< 吸光度 く カットオフ値+1.0
+:カットオフ値 く 吸光度 く カットオフ値+0.5
一:吸光度 く カットオフ値
2) カットオフ値は抗原KHCV 897蛋白の場合0.32で、KHCV
DB−CORE14蛋白の場合0.27で、KHCV403蛋白の場合0.35
で、混合抗原の場合は0.483で、オルト診断キットの場合は0.453であ
った。
3) オルソ(Ortho)HCV診断キットはオルトダイアグノスチクシステ
ム(Ortho Diagnostic Systems。
U、S、A、)社から購入し得る。
(7−C):診断結果の正確度
本発明の診断方法による診断結果の正確性を証明するために、オJ叶社のC型肝
炎診断キットで測定した結果、陽性と診断された17個の血清試料を、本発明の
診断キットを用いてさらに診断し、また免疫プロッチングキット(Chiron
RIBA HCV Test−3ystem、2ndGeneration、
OrthoDiagnostic Systems。
U、S、A、、ProductCode 933491)で測定した。免疫プロ
ッチングキットは確認分析法(Confirmation assay)として
推薦され、ひとつのSOD調節抗原を除いた4個の抗原を含む(Vander
poel、C,L、、et al、、Lancet 337,317−319
(1991)参照)。
これらの結果は表2に示したが、本発明による診断方法が138ページのオルト
社のC型肝炎診断キットよりずっと低い偽陽性反応(falseposftiv
e)を示した。
表2二オルソの第2世代免疫プロチングキットと本発明の診断キットによる診断
結果の比較
注)*SOD対照抗原を除いた少なくとも二つ以上の抗原において陽性反応を示
す場合、即ち、十が一つ以上である試料を陽性と判定した。
**実施例(7−B)から得られた混合抗原を試薬として用いた。
実施例8ニブローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応によるC型肝炎ウィルスの存
在の確認
(8−A) ・C型肝炎ウィルスからのRNA抽出検体血清100ulに100
g1(7)TNE溶液(100mM トリスHCI、pH8,0,0,2mM
EDTA、0.2M NaC1)を加えた後、さらに300μlのRNAzol
溶ン夜(TM C1nnaScientific、Inc、、Texas、77
546、U、S、A、)と300μmのクロロホルムを添カルで強(振虚しなが
ら混ぜた。生成物を小型高速遠心分離!il(、Eppendorf micr
ofuge)を用いて15.000rpmで4℃で5分間遠心分離して沈降物を
得た。上澄液を集めて、300ulのフェノールおよび300ILlのクロロポ
ルムで抽出した。その抽出物を沈降させた後、その沈降物を10LLI TE緩
#I液(10mM トリスHCI、pH8,0,0,1mM EDTA)に溶が
し、−70”Cで保管した。
(8−B) ニボリメラーゼ連鎖反応によるC型肝炎ウィルスの存在確認前記方
法で抽出したRNAを4μlの蒸留水および1μmのO,IMCH,HgOHと
混合して室温で1o分間放置した。ここに0.5μmのIMβ−メルカプトエタ
ノール、IC)ul RNasin、5μlX5倍のRT緩衝液(BRL、 G
aithersburg、 MD、 20877、 U、 S、 A、 )、1
.25μ1(7)dNTP (dGDP、dTTP、dCTPおよびdATP各
々10mMずつ)、lugの任意プライマー(Random primer)。
逆転写酵素(Superscript H−ReverseTranscrip
tase、BRL社、 U、 S、 A、 ) 1.25μl (18単位/μ
m)を加え、総容量25μlになるように蒸留水を加えた後、42℃で1時間反
応させた。反応終了後、65℃で15分間加熱して酵素を失活させた後、ポリメ
ラーゼ連鎖反応に用いた。
第1次ポリメラーゼ連鎖反応は次のように行った。10μmの1o倍Taqポリ
メラーゼ緩衝液(10mM )リス−MCI、pH8,3,500mMK C1
、155m M M g C1x、0.1%(w/v)ゼラチン)、1Oulの
dNTPa合液(各1.25mM)、2μgのプライマーA(5°−CATAG
TGGTCTGCGGAACCG−3°)、2μgのプライマーB(5°−TT
GAGGTTTAGGATTCGTGC−3°)および75μmの蒸留水を0.
5μlのAmplitaq DNA ポリメラーゼ(PerkinElmer
Cetus、U、S、A、)と混合した。ここに溶液の蒸発を防ぐために50μ
mの鉱油を添カルた後、第1次PCRを95℃で2分、55℃で2分、72℃で
3分間の加熱サイクルを40回繰り返して実施した。
第2次PCRは第1次PCR産物1μlと1μmのプライマーc(5°−TAC
ACCGGAATTGCCAGGAC−3’ )およびIμ1(7)ブライ?−
D(5°−TCATGGTGCACGGTCTACGAG−3’ )を混合して
、第1次PCRと同一な条件下で20回繰り返した。
次に、第2次PCR産物約5μmを7%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、C
型肝炎ウィルスの存在可否を測定した。陽性試料存在の場合、182bpのDN
Aバンドを示した。
実施例9 :KHCV蛋白のC型肝炎抗原に対する特異抗体の製造(9−A):
免疫
生理食塩水に溶かしたKHCV897蛋白を同量のフロイント完全アジュバント
(Freund complete adjuvant)とよく混合した後、生
後約10退動のBa1b/c種マウスに、50μgの蛋白を含有する混合物0.
2mlを腹腔内投与した。2−3週おきにフロイント不完全アジュバントと混合
された蛋白を30μg注射した。2回目の注射から2週間経過後、マウスの尾か
ら少量採血して、酵素免疫検定法で抗体力価を測定した。力価が10.000に
なると、蛋白50−100μgを含む0.5ml生理食塩水をさらに注射した。
抗体力価はELISAの方法に基づいて、0.2吸光単位を表す血清の稀釈度と
して定義した。3−4日経過後、このマウスの牌臓細胞を融合させて細胞産生単
クローン抗体の製造に用いた。
(9−B):細胞融合
免疫された牌臓細胞をマウスの骨髄腫細胞であるP3x63−Ag8.653
(ATCCCRL 1580)と融合した。免疫マウスの5X10’個牌臓細胞
と2 x 10’個P3 x 63−Ag3.653骨髄腫細胞を混合し300
gで10分間遠心分離した。細胞沈降物をIMDM培地(Gibco、U、S、
A、社)で洗浄した後、遠心分離した。上澄液を傾斜除去し、攪拌しながら50
%PEG (Kodak、分子量1450ダルトン)1mlを1分に渡って滴加
した。生成物をさらに200Xgで2分間遠心分離した後、5mlのIMDM培
地を3分間で徐々に添加した後、さらに10%ウシ胎児血清−含有IMDM培地
5mlを5分間徐々に添加しながら攪拌した。
ここに、10%ウシ胎児血清−含有IMDM培地を加えて最終容量が50m1に
なるようにし、10分間遠心分離した。上澄液を傾斜除去し、P3 x 63−
Ag、8.653の数が5 x 10’/mlになるように、IMDMに10%
ウシ胎児血清、louMハイポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよび1
6μMチミジンを含有したIMDM−HAT培地0.1mlを加えた。生成物を
組織培養用96穴プレートに穴当たりO,1mlずつ入れた* l x 10’
I11/mlの腹腔白目食細胞を含有するIMDM−HAT培地を穴に入れて融
合する前に1日培養した。骨髄種細胞および融合されない牌臓細胞はHAT培地
で増殖できない。
したがって、この培地で増殖細胞は融合細胞と見られる。ハイブリドマの成長が
10ないし50%の上澄液を取って抗体活性の検定を行った。
(9−C):単クローン抗体力価のスクリーニング下記の酵素免疫検定方法によ
り段階(9−B)で得られた単クローン抗体の力価を検索した。
〈段階1〉
50mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH9,0)にKHCV897蛋白を2μg
/ml濃度となるように溶解した。この溶液をイミュロン型プレート(Dyna
tech、Immulon type I Plate)の各穴に穴当り100
μmずつ入れた後、37℃で2時間インキュベートした。
〈段階2〉
穴を0.05%ツイーン−20(v/v)−含有PBS (pH7,4、以下洗
液という)で1回洗浄し、各穴に残っている蛋白の吸着部位を封止するために0
.1%ゼラチン(w/v)−含有PBSを200μmずつ入れて37℃で1時間
振盪した。
く段階3〉
前記〈段階2〉の穴を洗液でさらに2回洗浄した後、0.25%ゼラチン(w/
v)、1.0mM EDTA、1%トリトン X−100(v/v)および0.
02%チメロザールー含有PBS50mlを加えた。融合細胞が育っている上澄
液50μmを取って、各穴に加えた後、37℃で1時間インキュベートした。
〈段階4〉
前記〈段階3〉で処理したタイタープレートを洗液で5回洗浄した。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)で標識された抗−マウス rgG−HRP(Boe
hringer Manheim、Cat、No、605−250)を、10%
(V/V)ウシ胎児血清、1%(v/v)フィニル、0.02%(v/v)チメ
ロザールおよび0.05%(V/V)ツイーン−20(v/v)を含有している
PBSで1:5,000の割合で希釈した後、この希釈溶液を穴当たり100μ
mずつ加えて37℃で1時間さらにインキュベートした1反応の完了後、プレー
トをさらに洗液で5回洗浄した。
く段階5〉
前記穴に10mg/mlの0.P、D、(Sigma ChemicalCo、
)を含有する50mM<えん酸塩/燐酸塩緩衝液(pH5,5)を100μlず
つ加えた後、室温の暗所で30分間反応させ、2N硫酸を50μm加えて反応を
終止させた。492nmの波長で吸光度を測定した。所望の抗体活性を示すハイ
ブリドーマを24個穴のプレートや、6個穴のプレートに移して増殖させ、必要
に応じて、マウスの腹腔内の巨食細胞を適切に培養してフィーダ層として用い、
これによって融合細胞の成長に要求される成長因子を提供した。
(9−D):抗体の産生
所望の単クローン抗体を産生ずる4個の細胞株、即ち、ラッキー1.1゜1.2
,1.3および1.4を得た。
本発明の抗体は、常法にしたがってクローンを培養した上澄液またはクローンを
Ba1b/c種マウスの腹腔内で増殖させた腹水液から得た。
0.5mlのブリスタンス(Pristance、Sigma)で7−14日前
に予備処理したBa1b/c種マウスに2.5xlO’個の融合細胞を腹腔内に
注入した。工ないし2週経過後、腹水液が得られ、これらから常法により抗体を
分離した。
(9−E):単クローン抗体の特性調査前記実施例(9−D)から得られた各々
のクローンから製造した抗体の特性を次の方法で評価した。
〈段階1〉抗体の亜綱
マウスの抗体亜綱はハイブリドマ亜綱分析キット(Hybridomasub−
Isotyping Kit;Calbiochem、 U、 S、 A)を用
いて測定し、その結果を表3に示した。
〈段階2〉酵素免疫検定
50mMホウ酸ナトリウム緩衝液に2μg/ml濃度となるように溶解したKH
CV897蛋白を200μmずつマイクロタイタープレート(Dynatech
Immunolon type 1)の各穴に入れて37℃で2時間インキュ
ベートした。プレートを0.05%(v/v)ツイーン−2〇−含有PBSで洗
浄した。各クローンから得られた抗体を通常の方法により精製して1mg/ml
濃度と調整した後、0.25%ゼラチン(V/V)、1.0%トリトンX−10
0,0,02%チメロザールおよび1mM EDTA−含有PBSで2倍ずつ順
次希釈した。0.1%ゼラチン−含有PBSを210μmずつ各穴に入れて、希
釈液を37℃で1時間さらにインキュベートした。プレートを洗液で洗った。
西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗−マウスIgG(Boehring
er Manheim、Cat No、605−250)を、10%FBS (
v/v)、1%フィコル(V/V)および0.05%ツイーン−20を含有する
PBSで希釈した後、これを各穴に200μlずつ加え、37℃で1時間インキ
ュベートした。以下、発色反応は実施例(9−C)と同様に実施した。各抗体の
EIA効率は492nmで吸光度が1.0以上である希釈倍数の逆数と定めた。
その結果を表3に示した。
く段階3〉分子量測定
各クローンをプレートまたはマウスの腹膜内で培養した。上澄液または腹水液を
蛋白−Gセファロースカラムアフニティクロマトグラフイー(Pharmaci
a)によりIgGを分離した後、5DS−PAGEして前記から得られたマウス
抗体の重鎮と軽鎖の分子量を測定した。その結果を表3に示した。
く段階4〉抗原決定基の測定
KHCV89.7cDNAの一部を相異に切除した変種を製造して下記蛋白をコ
ードし、これら蛋白の各単クローン抗体との反応性を調べた。
(1)KHCV897蛋白: KHCV−LBCIにコードされたアミノ酸配列
の1192番目から1457番目のアミノ酸からなる蛋白
(2)KHCV290蛋白: KHCV−LBClにコードされたアミノ酸配列
の1192番目ないし1289番目のアミノ酸からなる蛋白
(3)KHCV430蛋白:KHCV−LBClにアミノ酸配列(7)1192
番目ないし1335番目のアミノ酸からなる蛋白(4)KHCV570蛋白:
KHCV−LBCIにコードされたアミノ酸配列の1192番目ないし1382
番目のアミノ酸からなる蛋白
(5)KHCV652蛋白: KHCV−LBCIにコードされたアミノ酸配列
の1192番目ないし1407番目のアミノ酸からなる蛋白
(6)KHCV150蛋白: KHCV−LBCIにコードされたアミノ酸配列
の1408番目ないし1457番目のアミノ酸からなる蛋白
(7)KHCV257蛋白: KHCV−LBClにコードされたアミノ酸配列
の1371番目ないし1457番目のアミノ酸からなる蛋白
(8)KHCV518蛋白: KHCV−LBClにコードされたアミノ酸8り
の1285番目ないし1457番目のアミノ酸からなる蛋白
各KHCV cDNA断片を発現させた大腸菌細胞に緩衝液(Laemml t
、 u、 K、 、 Nature 277、680 (1970)参照)を加
えて、100℃で5分間煮沸して電気泳動用試料を得た。このように製造した試
料を免疫プロッチング法(Towbin、H,、J、Immunol。
Methods 72,313−340 (1984)参照)で抗体との反応性
について調べた。
その結果は1表3と表4に示した。
前記結果から見られるように、ラッキー1.1から得られた抗体はC型肝炎のア
ミノ酸配列の1192ないし1289番目のアミノ酸の認識部位を有し、ラッキ
ー1.2.1.3および1.4は、1371番目ないし1407番目アミノ酸の
認識部位を有する。抗原決定基が相異な二つの単クローン抗体を用いて、サン表
31本発明の単クローン抗体の特性
表4.抗体と切除された突然変異種との免疫反応性く段階1〉西洋ワサビペルオ
キシダーゼを用いたラッキー1.1の単クローン抗体の櫻識
まず、ラッキー1.1細胞を公知の過ヨウ素酸塩法(periodatemet
hod、Nakane et al、、J、Histochemcyt。
chem、、22.1084 (1974)参照)により西洋ワサビペルオキシ
ダーゼで次のように標識した。
5mgのペルオキシダーゼを1.2mlの蒸留水に溶かし、ここに10mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7,0)中のO,IM過ヨウ素酸ナトリウム0.3m
lを添加し、この混合物を室温で20分間反応させた。前記反応液を1mM酢酸
ナトリウム緩衝液で16時間透析した。20mM炭酸ナトリウム(pH9,5)
に10mg/ml濃度で溶解して予め製造された、標識しようとする抗体1ml
にペルオキシダーゼ溶液1.5mlを混ぜ、室温で2時間反応させた。
無反応のシッフ塩基(Schiff’ base)を、蒸留水中の4mg/ml
ナトリウム・水和物の溶液100μmを加えて還元により除去した。続いて、P
BS (pH7,4)で−夜透析した後、セファクリール5300クロマトグラ
フイーカラムを通して非標識の単クローン抗体を除去した。
〈段階2〉ラッキー1.2の単クローン抗体のマイクロタイタープレートへの吸
着過程
PBSで希釈した5μg/ml濃度のラッキー1.2を200m1ずつ各穴に入
れて37℃で2時間吸着させた。
く段階3〉非特異的結合の遮断
前記く段階2〉で用意されたマイクロタイタープレートを0.05%ツイーン−
20および0.02%チメロザールー含有PBS (以下、“洗液”と称する)
で1回洗浄した。0.1%ゼラチン−含有PBS200μlずつを各穴に入れて
蛋白吸着部位を1時間に亘って被覆し、さらに前記洗液でプレートを2回洗浄し
た。
く段階4〉抗原存在の診断
0.25%(W/V)ゼラチン、1.0%(v/v) トリトンX−100,1
mM EDTAおよび0.02%チメロザールを含有するPBSで200ng/
m1濃度で2倍ずつ順次希釈したKHCV 897抗原蛋白200μlを各穴に
加えた。比較用として、KHCV蛋白を正常人の血液試料に400ng/mlの
た後、前記緩衝液100μmに前記希釈された血液100μlを混ぜて各穴に加
えた。血液内でC型肝炎の抗原が存在する場合、得られた抗体を用いてサンドウ
ィッチ酵素免疫検定によりその存在を検出し得ることが示されている。
KHCV 897抗原を加えなかった正常血液を陰性対照群として用いた。プレ
ートを37℃で1時間インキュベートし、洗液で5回洗浄した。
く段階5〉ペルオキシダーゼで標識されたラッキー 1.1による抗原のスクリ
ーニング
10%(v/v)ウシ胎児血清、1%フィコル、0.05%ツイーン−20およ
び0.02%チメロザールー含有PBSで5μg/mlの濃度に希釈したラッキ
ー1.1の200ulを各穴に加えた後、37℃で1時間インキュベートした。
〈段階6〉発色反応
前記く段階5〉で処理したプレートを洗液で5回洗浄した後、50mM<えん酸
塩/リン酸塩緩衝液(pH5,5)に0−フェニレンジアミン(SLgma)を
2mg/mlの濃度で加えて製造したO、P、D発色反応試薬を200μlずつ
各穴に加え、室温の暗所で30分間放置して発色させた。その後、4N硫酸50
μlを加えて反応を終止させた。492nmの波長で吸光度を測定した。その結
果を図43に示した。
実施例11:サンドウィッチ酵素免疫検定法を用いたC型肝炎患者の血清におけ
る抗原スクリーニング
実施例10の段階4で用いた緩衝液100μlと混合した分析すべき血清10μ
lを、実施例10のような方法で単ローン抗体が吸着されたマイクロタイタープ
レートの各穴に加え、前記実施例10のような方法で血清中の抗原をスクリーニ
ングした。その結果を表5に示した。
この231個の試料血清中、220個の試料(220/231)は492nmで
吸光度が0.15以下であり、残りの11個の試料は0.15〜0.8の吸光度
を示し、これを抗原陽性と見なした。ここではハルバートらの方法(Halbe
rt、S、P、et al、、C11n、Chin、Acta127.69 (
1983)e照)によって吸光度0.15をカットオフ値(cut−off−v
alue)とした。
前記実施例7のような方法で、前記11個の陽性試料を含む15個の試料のKH
CVに対する抗体をスクリーニングした。その結果を表6に示した。これはKH
CV897抗原検出のためのサンドウィッチELISAが有用であり、K HC
V 感染の初期検出に用いられることを示している。抗体検出のためのEIAに
よると、抗原検出のためのELISAはHCV患者の治療と予防に有用である。
表5.サンドウィッチ酵素免疫検定法により測定された試料の吸光魔性)l)百
分率(%)=(試験した試料の数)/(試料の総数)表6、C型肝炎抗体および
抗原の検出
性)カットオフ値は抗原診断の場合、吸光度0.15とし、抗体診断の場合、0
.33と設定した。
したがって、3つの蛋白を含有する混合抗原を用いた本発明のKHCV蛋白は表
1に示した通り、市販用HCV診断キットよりKHCVに対する抗体とさらに反
応性があり、本発明の診断キットは市販のキットよりさらに正確な試験結果を示
し、表2に示した通り、確認分析キットよりさらに簡便で経済的である。
本発明を特定の実施態様について記述したが、本発明が属する技術分野で熟練さ
れた者であれば、添付された特許請求範囲に言及された本発明の範囲内で変更ま
たは修正できることが認識されるべきである。
Fig−2−’L
F=g−2−2
Fig−2−3
Fig−2−4
Fig−2−5
Fig−2−6
FiE;−27
PTSGDVVVVATDALMTGFTGFig、2−8
Fig−2−2
一8Fi 2−:LO
Fig−22−1
1Fi、22−4
2Fi、2−2−
43Fi 2−14
Fig−2−2−
45Fi 2−16
図3
図4
1 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
8000 9000(bp)図5
(χ)
Fi、g−6
Fi、g−7
ig−B
ValValGlyGlyHisTyrFig−11
1−″iミニ−12
Fig−15
Fig−1s
コ10
Fi@−19
jg−20
Fig−23
Fig−24
!IQ’T−0!nON λ−−Rr工swα1.− I、−V−−G−H−1
−−V −M−A−図30
図31
SDS−PAGE ウェスタンブロッティング図32
− 5DS−PAGE ウェスタンプロ・ンテイングFig、33
ニ
Fig、34
図35
M123456
Fig−36
Fi−g+ 3”7
Fig−38
Fig−39
Fig、40
Fig−44
F ig・ 42
Fig−4,3
図44
Δ: 希釈緩衝溶液中の抗原
口: 血清中の抗原 492n++における。、D2KHCV897抗原のs度
(ng/*L)図45
Kl(CV897抗原の濃度(ng/mL)フロントページの続き
(51) Int、 ct、 S 識別記号 庁内整理番号Cl2P 2110
2 C8214−4B21108 8214−4B
C12Q 1/70 7823−4B
GOIN 33153 D 8310−2J331576 Z 8310−2J
//(C12N 1/19
C12R1:865)
(C12N 1/21
C12R1:19)
(C12P 21102
C12R1:19)
(C12P 21102
C12R1:21)
(72)発明者 パーク、ヨン・ウー
大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、386−4
(72)発明者 リン、クー・ジン
大韓民国、ソウル、クローク、ドサンー4−トン、1018−18
(72)発明者 チョイ、ドク・ヨシ
大韓民国、デジョン、ソーク、ナードン、I
(72)発明者 ソ、ホン・ツブ
大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、386−1
(72)発明者 キム、チュン・ヒュン大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリ
ョンードン、386−1
(72)発明者 キム、スジ・タフ
大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、386−1
(72)発明者 ヤン、ジャ・ヨン
大韓民国、デジョン、ユソンーク、ドリョンードン、386−1
Claims (58)
- 1.KHCVcDNAの断片を含むKHCVcDNA。
- 2.オープンリーディングフレームが、842番目、849番目および853番 目のアミノ酸に、各々フェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニンをコードす る請求項1記載のKHCVcDNA。
- 3.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列があります 】 を含むポリペプチドをコードする請求項2記載のKHCVcDNA。
- 4.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列があります 】 を含むポリペプチドをコードする請求項2記載のKHCVcDNA。
- 5.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列があります 】 を含むポリペプチドをコードする請求項2記載のKHCVcDNA。
- 6.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列があります 】 を含むポリペプチドをコードする請求項2記載のKHCVcDNA。
- 7.KHCV−LBC1である請求項2記載のKHCVcDNA。
- 8.オープンリーディングフレームが、842番目、849番目および853番 目のアミノ酸に、各々ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンをコードする 請求項1記載のKHCVcDNA。
- 9.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列があります 】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 10.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 11.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 12.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 13.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 14.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 15.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 16.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 17.オープンリーディングフレームが、下記のアミノ酸配列:【配列がありま す】 を含むポリペプチドをコードする請求項8記載のKHCVcDNA。
- 18.KHCVエピトープをコードするポリヌクレオチド。
- 19.請求項18記載のポリヌクレオチドを含むオープンリーディングフレーム を有し、該オープンリーディングフレームが所望の宿主と適合性である調節配列 と作用可能に連結されることを特徴とする組換え発現ベクター。
- 20.オープンリーディングフレームが、請求項18記載のポリヌクレオチドと 融合されたユビキチンをコードするポリヌクレオチドを含む請求項19記載のベ クター。
- 21.酵母発現ベクターの、pYLBC−A/G−UB−CORE14、pYL BC−A/G−UB−CORE17、pYLBC−A/G−UB−CORE22 、pYLBC−A/G−UB−KHCV897、pYLBC−A/G−UB−K HCV403、pYLBC−A/G−UB−KHCV573、pYLBC−A/ G−UB−E2NまたはpYLBC−A/G−UB−E2Cである請求項20記 載のベクター。
- 22.大腸菌発現ベクターの、ptrpH−UB−CORE14、ptrpH− UB−CORE22、ptrpH−UB−KHCV897、ptrpH−UB− E2NまたはptrpH−UB−E2Cである請求項20記載のベクター。
- 23.オープンリーディングフレームが、請求項18記載のポリヌクレオチドと 融合されたマルトース結合蛋白をコードするポリヌクレオチドを含む請求項19 記載のベクター。
- 24.大腸菌発現ベクターの、pMAL−KHCV426、pMAL−KHCV 555、pMAL−KHCV513、pMAL−KHCV810、pMAL−K HCV798、pMAL−KHCV754、pMAL−KHCV652、pMA L−KHCV403、pMAL−KHCV271、pMAL−KHCV495ま たはpMAL−KHCV494である請求項23記載のベクター。
- 25.請求項19記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 26.請求項21記載のベクターにより形質転換された酵母細胞である請求項2 5記載の宿主細胞。
- 27.請求項22記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項 25記載の宿主細胞。
- 28.請求項24記載のベクターにより形質転換された大腸菌細胞である請求項 25記載の宿主細胞。
- 29.KHCVに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるエピトー プを含むポリペプチド。
- 30.組換えKHCVポリペプチドである請求項29記載のポリペプチド。
- 31.請求項1記載のcDNAによりコードされる請求項29記載のポリペプチ ドおよびその断片。
- 32.KHCVポリペプチドを含む融合ポリペプチドである請求項30記載のポ リペプチド。
- 33.請求項25記載の宿主細胞により産生される請求項29記載のポリペプチ ド。
- 34.KHCVUB897蛋白、KHCV897蛋白、UBE1蛋白、KHCV 403蛋白、KHCVCORE14蛋白、KHCV573蛋白、KHCVUBC ORE17蛋白、E2N蛋白、E2C蛋白、UB−E2N蛋白、UB−E2C蛋 白、KHCV426蛋白、KHCV555蛋白、KHCV513蛋白、KHCV 810蛋白、KHCV798蛋白、KHCV271蛋白、KHCV754蛋白、 KHCV652蛋白、KHCV403蛋白、KHCV495蛋白またはKHCV 494蛋白である請求項33記載のポリペプチド。
- 35.精製されたKHCVポリペプチド。
- 36.KHCV403蛋白、KHCVCORE14蛋白、KHCVUB897蛋 白、KHCVUBCORE17蛋白、UB−E1蛋白、UB−E2N蛋白、UB −E2C蛋白、KHCVUB−CORE14蛋白またはKHCV897蛋白であ る請求項35記載のポリペプチド。
- 37.請求項25記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で 培養することを特徴とする、請求項29記載のポリペプチドの産生方法。
- 38.請求項29記載のポリペプチドを有効成分として含む、試料中のKHCV 抗原に対する抗体の存在の検出用診断試薬。
- 39.請求項29ないし36のいずれか二つ以上のポリペプチドを含む請求項3 8記載の診断試薬。
- 40.KHCVUB−CORE14蛋白、KHCV897蛋白およびKHCV4 03蛋白よりなる群から選択される一つ以上のポリペプチドを含む請求項38記 載の診断試薬。
- 41.請求項38記載の診断試薬を含む診断キット。
- 42.試料中のKHCV抗原に対する抗体を検出する診断方法において、以下の 工程: (a)KHCVに含まれるエピトープと免疫学的に実質的に同一であるポリペプ チドを、固体支持体に吸着させ、 (b)該固体支持体に試料を加えて抗原−抗体複合体を形成させ、そして(c) 複合体の量を測定すること を含むことを特徴とする方法。
- 43.請求項41記載のキットを各段階に用いる請求項42記載の診断方法。
- 44.前記キットが、請求項40記載の診断試薬を含む請求項43記載の診断方 法。
- 45.KHCVエピトープに対する単クローン抗体。
- 46.IgGサブクラスに属する請求項45記載の抗体。
- 47.KHCV897蛋白に対する請求項45記載の抗体。
- 48.下記アミノ酸配列: 【配列があります】 と免疫反応性である請求項47記載の抗体。
- 49.下記アミノ酸配列: 【配列があります】 と免疫反応性である請求項47記載の抗体。
- 50.KHCVエピトープに対する抗体を産生する細胞株。
- 51.ラッキ−1.1またはラッキ−1.2である請求項50記載の細胞株。
- 52.請求項45記載の抗体を有効成分として含む、KHCVエピトープを検出 するための診断試薬。
- 53.請求項52記載の診断試薬を用いる試料中のKHCVエピトープの検出方 法。
- 54.不活化させた精製KHCVを含むKHCV感染の予防または治療用ワクチ ン。
- 55.請求項37記載の方法で製造したポリペプチドを有効成分として含有する 、KHCV感染の予防または治療用ワクチン。
- 56.E1蛋白、E2N蛋白および/またはE2C蛋白を有効成分として含有す る、請求項55記載のワクチン。
- 57.KHCVcDNA由来の8個以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含 む試料中のKHCV由来のポリヌクレオチドの検出用キット。
- 58.請求項57記載のキットを用いる試料中のKHCV由来のポリヌクレオチ ドの検出方法。
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