KR100204258B1 - 재조합 고양이 코로나바이러스 에스 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 갈락토키나제/FIVP에스 융합단백질, 백신성분, 치료제 및 진단제로서의 그들의 용도, 및 이들의 제조방법을 제공한다.
한가지 관점으로서, 본 발명은 고양이 코로나바이러스에스 유전자의 단백질 및 펩타이드 단편을 제공한다. 이들 펩타이드들은 재조합적으로 발현되거나 합성될 수 있으며 진단용성분, 치료용성분 또는 백신용성분으로서 유용하다. 한가지양태로서, 고양이 코로나바이러스에스-유도된 펩타이드들은 여러 가지의 FIVP 스트레인의에스 게놈의 아미노산 1번 내지 약 1454번의 범위 및 FECV에스 게놈의 1번 내지 약 1454번의 범위, 또는 이들 보다 좀더 작은 펩타이드 단편에 속한다. 바람직한 양태로서, 고양이 코로나바이러스에스-유도된 펩타이드는 FIVP 스트레스인의에스 유전자의 아미노산 1번 내지 약 748번의 범위 또는 FIVP에스게놈의 1내지 약 748번 범위[서열동정번호 : 32]에 속한다. 더욱 특히, FIVP 또는 FECV에스 게놈의 약 아미노산 94번 내지 약 아미노산 223번의 범위에 속하는 펩타이드가 바람직하다. 특히 바람직한 양태로서, 고양이 코로나바이러스에스-유도된 펩타이드는 FIVP 또는 FECV에스 게놈의 아미노산 92번 내지 222번의 범위에 속하는 것으로 발견된다.
또다른 양태로서, FIVP 또는 FECV 게놈의 약 아미노산 121번 내지 약 아미노산 180번의 범위에 속하는 펩타이드가 기술된다.
본발명의 펩타이드 단편은 효소 연결된 면역흡착검정(ELISA)또는 웨스턴 블룻과 같은 진단검정법에 사용할 때 FIVP와 FECV를 구분하거나 FIVP의 스트레인들을 구분할 수 있다. 또한, 이들 펩타이드들은 항체의 존재를 파악하기위해 고양이 혈청을 선별하는 항원으로서, 또는 FEPV와 FECV를 구분하거나 FIVP의 상이한 스트레인들을 구분할 수 있는 항체를 유도하는 항원으로서 사용될 수 있다.
또다른 관점에서 본 발명은 상기된 펩타이들을 암호화하거나 상기된 펩타이드-암호화서열을 플랭킹한, 뉴클레오타이드 1번 내지 약 4365번 및 1번 내지 약2246번의 영역에 속하는 FIVP와 FECV의 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 이들 뉴믈레오타이드들은 PCR 프라이머 또는 하이브리드화 탐침으로서 진단검정에 사용할 때 FIVP와 FECV에스 게놈을 구분할 수 있다. 본 발명의 또다른 관점은 신규한 재조합 FIVP 또는 FECV에스 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 고양이 코로나바이러스에스-유도된 펩타이드들은에스 펩타이드의 재조합 발현시에 필요한 이점을 부여하는 선별된 단백질과 융합시킬 수 있다. 예를 들면, 융합 파트너는 바람직한 숙주 세포 시스템에서 고도로 발현되거나 고도의 분비정도에의해 특징지워지는 단백질일 수 있다. 융합 파트너는, 또한, 시그날서열이거나, 선별된 숙주 세포 시스템내에서 S-유도된 펩타이드의 안정성을 강화하는 서열일 수 있다.
본 발명의 이러한 관점에서 한가지 양태로서, 고양이 코로나바이러스의에스 유전자로부터 유도된 펩타이드들은 갈락토키나제(Galk)의 N-말단 52개 아미노산과 융합시킨다.
또다른 관점으로서 본 발명은 임의로 검출가능한 가벨과 연결된, 본 발명의 FIVP에스-유도된 펩타이드 또는 융합 단백질을 함유한 진단용시약 조성물을 제공한다. 이러한 진단용 시약은 표 준 검정절차를 사용하여 고양이 체내에서 FIVP 또는 FECV의 존재에 대하여 검정하기 위해 사용될 수 있다.
유사한 관점으로 본 발명은 본 발명의 FIVP에스-유도된 펩타이드 또는 융합 단백질을 암호화하거나 플랭킹하고, 임의로, 검출가능한 표 지와 연결된 뉴클레오타이드 서열을 함유한 진단용 시약 조성물을 제공한다. 이러한 진단용 시약은 하이브리드화 검정 또는 PCR기술에서 고양이 체내의 FIVP또는 FECV의 존재에 대해 검정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 관점으로서, 에스-우도된 펩타이드 및/또는에스-유도된 융합 단백질은 FIVP 또는 FECV의 감염에 대하여 동물을 보호하는 백신중에서 활성성분으로서 사용될 수 있다. 백신 조성물은 하나이상의 병원성 고양이 코로나바이러스에 대하여 면역성을 자극할 수 있는 유효량의 본 발명의 FIVP 또는 FECV에스-유도된 펩타이드 또는 융합 단백질과 체내 투여에 적합한 담체를 함유한다. 또한, 이들 펩타이드 및 단백질에 대한 면역반응의 특성화는 백신중에 함유되어야하는 FIVP또는 FECV 서열의 다른 영역(들)을 제시한다.
또다른 양태로서, 본 발명은 치료 유효향의 본 발명의 FIVP 도는 FECV에스-유도된 펩타이드 또는 융합단백질과 약제학적으로 유효한 량의 담체를 함유한 FIVP 또는 FECV 감염증 치료용 약제 조성물을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 수의사가 FECV 또는 천연FIVP에 노출되었거나 비감염된 고양이들을 분류하기위해 사용할 수 있는 진단용 키트를 제공한다. 이 키트는 상기 질병에 대하여 면역화된 고양이들을 선별가케한다. 또한 이 키트는 FIVP의 상이한 스트레인들을 구분하거나 FIVP감염의 발전단계별로 고양이들을 분류할 수 있게 한다.
이 키트는에스 유전자 뉴클레오타이드 서열들로부터 선택된 본 발명의 PCR프라이며 선별된 FIVP에스-유도된 펩타이드 또는 융합단백질 관련되거나 유사한 바이러스의 프라이머, 펩타이드 및 융합단백질 및 하기된 컨센서스 서열로부터의 프라이머, 펨타이드 및 융합단백질-암호화영역으로 이루어질 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 이미 노출된 고양이와 순수한 고양이들을 분류할 뿐만 아니라FIVP에 노출된 경우를 다른 연관된 코로나바이러스에 노출된 경우로부터 분리하기 위하여 본 발명의 PCR에스-유도된 프라이머 및 /또는에스-유도된 펩타이드와 융합단백질을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또다른 진단방법은 고양이 혈청에서 본 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위하여 ELISA에서에스-유전자 유도된 펩타이드를 사용가능케 한다.
본 발명의 또다른 관점은 유효 백신량의 본 발명의 에스-유도된 펩타이드 또는에스-유도된 융합 단백질을 투여하여 FIVP의 감염에 대하여 동물을 면역화하는 방법과 관련이 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 동물에 투여하여 FIVP 감염증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은 FIVP 또는 FECV, 또는 연관된 코로나바이러스에피토프에 대한 항체를 제공하며, 이 항체는 이들 바이러스들을 구분지을 수 있다.
이들 항체는 본 발명의 펩타이드 또는 융합단백질을 항원으로서 사용하여 생성한다.
이러한 항체들은 또한 진단용 또는 치료용 시약으로서 사용할 수 있으며 검출가능한 라벨 또는 독소, 또는 다른 치료화합물에 임의로 부착시킬 수 있다.
본 발명의 다른 관점 및 이점들은 본 발명의 양태에 대한 상세한 설명에서 추가로 하기된다.
Description
제1도는 pOTSKF33 세균발현벡터의 도식적 다이아그램이다.
제2도는 pOTSKF33의 XmaI-StuI 부위내로 클로닝된 PCR-증폭된 단편을 함유한 플라스미드를 도해한 것이다.
제3도는 PCR 발현 클론 AR58-3 뉴클레오타이드서열[서열동정번호 : 19] 및 아미노산서열[서열동정번호 : 20]을 도해한 것이다.
제4도는 DF2 FIVP의 에스 유전자 뉴클레오타이드 및 아미노산서열을 도해한 것이다. 또한, DF2-HP서열의 튜클레오타이드 변화(상단) 및 아미노산 차이(하단)를 제외하고 DF FIVP의 서열과 동일한(DF2 FIVP가 서열분석된 정도로) DF2-HP의 서열[서열동정번호 : 23 및 24]의 단편이 도해되어 있다.
제5도는 TS FIVP의 서열[서열동정번호 : 25 및 26] 과 다른 서열의 위치를 표 시하여에스 유전자 TS-BP 뉴클레오타이드서열[서열동정번호 : 27] 및 아미노산서열[서열동정번호 : 28]의 단편을 도해한 것이다. 와전한 TS FIVP에스 유전자서열이 제공된다.
제6도는 TN406의 에스 유전자 튜클레오타이드 및 아미노산서열[서열 동정번호 : 29ALD 30]의 단편을 도해한 것이다.
제7도는 FECV에스 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열[서열동정번호 : 31 및 32]을 도해한 것이다.
제8도는 UCD-2에스 유전자의 뉴클레오타이드 및 아미노산서열의 단편을 도해한 것이다.
제9도는 컨센서는 부분에스 유전자서열의 뉴클레오타이드 및 아미노산서열[서열동정번소 : 33 및 34]을 도해한 것이다.
본 발명은 일반적으로, 고양이의 감염성 복막염 바이러스 질병을 진단하고 예방치료에 유용한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 더욱 특히, 발명은 신규한 재조합 고양이 코로나바이러스에스 단백질 및 융합 단백질에 관한 것이다.
고양이 감영서 복막영(Feline Infectious Peritonitis : Fip)은 모든 연령의 고양이들이 민감하지만 주로 어린 야생형 및 애완용 고양이에게 대단히 치명적인 질병이다. FIP의 증세로서 는 빈혈, 중성호성증, 면역글로블린 및 /또는 피브리노겐의 농도증가, 요소 및 크레아티닌의 높은 수준에의한 신장손상, 및 전염된 정맥내 응고가 포함될 수 있다.
유효한 FIVP백신을 개발하려는 본 발명 이전의 시도들은 거의 성공하지 못해왔다. 기존의 불활성화된 와한 바이러스 백신을 투여했을 때, 실질적으로, 고양이들은 FIP에 걸려 더욱더 급속하고 전격적으로 질병이 확산되었다. FIVP의 비병원성 스트레인으로 면역접종된 고양이들은 도전후 일관성없는 보호를 보여준 아치사용량의 병원성 FIVP로 면역접종된 비-면역화된 고양이 및 동물보다 더욱 쉽게 감염되었다.[Pedersen and black, am.j.vet. res., 44 : 229-234(1983)].
고양이를 다른 항원적으로 연관된 코로나바이러스로 면역화하는 것도 성공을 이루지 못했다. 대부분의 실험에서, TGEV, CCV 및 사람 코로나바이러스 229E의 투여는 고양이를 감작화시키거나 보호하지 못했다. [Woods and Pedersen, Vet. microbiol., 4 : 11-16(1979) : Toma et al, Rec.Med..Vet., 155 : 788-803(1979) : Barlough et al, L뮤. Anim. S챠., 34 : 592-597(1984) : Stoddart et al, Res.Vet. Sci., 45 : 383-388(1988)]
최근에, 비후내로 투여하여 FIVP 도전했을 때, 효과적이고 안전한 온도-민갑성 FIVP(TS-FIVP) 백신이 개발되었다.[(Christianson et al, Arch. Virol., 109 : 185-196(1989)]. 이 백신은 피하투여됐을 때 한정된 효능을 갖지만, 동종 및 이종 스트레인에 대해서는 효과적으로 나타난다. 일반적으로, 비후내 투여는 다른 경로에 비하여 용량을 정하기가 어렵기 때문에 바람직하지 못하다.
따라서, FIVP 및 혈청학적으로 연관된 감염증에 대하여 동물을 진단, 치료 및 면역화하는데 사용 할 수 있는 효과적인 진단용, 치료용 및 보호용 조성믈의 필요성이 남아있다.
본 발명은 FIVP 및 FECV 진단용, 치료용 조성물에 유용한 신규의조성물 뿐만아니라 FIP의진단, 예방 및 치료에 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명에 유용한 펩타이드를 작제하기 위하여 FIVP 도는 FECV에스 유전자 도는 이들의 일부를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 다른 코로나바이러스로부터의에스 유전자도 본 발명에 개시된 것과 동일한 방식으로 유용할 수 있다.
공개된FIVP WT WSU 1146 스트레인으로부터의에스 유전자 서열은 실시예 1에 상세히 기술된 바와 같이 컴퓨터 분석에의해 분석되었으며, 이에따라, 바이러스 스트레인을 분별할 수 있는 영역이 예상될 수 있다. 본 발명자들은 FIVP의 여러 가지 바이러스, 이의 자매 바이러스 FECV 사이의 차이점이 페플로머 바이러스의 아미노 말단 절반내에 위치하고 있음을 예상하였다. 아미노산서열에서 상이한에스 단백질의 구분되는 부분들을 사용하여 폴리펩타이드들을 혈청학적으로 유사한 바이러스들을 서로 구분하는 시약을 제조하는데 사용할 수 있었다.
하기의 실시예들은, 특정적으로, 공개된 FIVP 스트레인 WT WSU 1146[Degroot et al., J.Gen.Virol., 68 : 2639-2646(1987)], 및 스트레인 WT DF2, WT-FIVP, WT 수 406, WT UCD-1 및 WT UCD-2 로부터 새로이동정된 서열, 및 백신 스트레인 WT FIVP DF2 고계대(DF2-HP) 및 TS FIVP DF2 역계대(DF2-BP)를 예시한다.
WT FIVP DF2-HP는 조직배양에서 99회 연속계대에의해 WT DF2로 유도되었다.
그런다음, DF2-HP를 자외선에 노출시켜 돌연변이화시켜 TS FIVP 바이러스를 생성하였다.
TS FIVP 바이러스의 안정성을 결정하기위하여, TS FIVP 바이러스를 고양이 및 조직배양을 통해 5회 계대시켜 TS FIVP 스트레인을 생성하였다.
FECV에스 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 및 아미노산서열이 특정적으로 개시된다. 추정된 컨센서스서열의 DNA 및 아미노산서열은 본 발명의 뉴클레오타이드 및 펩타이드서열을 제공하는데 유용하다. 본 발명은 실시예에 사용된 특정 FIVP 스트레인으로 한정죄지 않는다. 본발명의 교시에 따라, 다른 병원성 또는 비병원성 고양이 또는 다른 코로나바이러스 스트레인으로부터, 유사결과로서, 동일한 분석이 이루어질 수 있다.
비공개된 또는 새로이 동정된 FIVP 또는 FIVP-연관된 바이러스 스트레인으로부터의 본원에 기술된에스-유도된 펩타이드 및 DNA서열의 아미노산 및 뉴클레오타이드번호들은 공개된 ST1146에스 유전자의 번호지정 시스템에 따른 것이다.
그러나, 제3도 내지 8도에 나타나는 바이러스서열에서 표 시되고 제9도의 컨센서스서열의 형성에의해 나타나있고 실시예 12에 상세히 기술된 바와 같이, 다른 바이러스들의 서열은 동정된 상동성 WT ESU 1146 펩타이드들보다 어느정도 더욱 길거나 더욱 짧으며, 이들 공지된 바이러스서열에서 상동성 WT WSU1146 서열영역의 실질적인 아미노산 번호지정은 상이하다. 제9도의 컨센서스서열은 FIVP 서열 WT WSU1146, WT DF2, DF2-HP, TS, TS-BP, WT TN-406 및 FECV들 가운데 각각의 위치에서 가장 흔히 사용된 아미노산을 포함한 인위적인 서열이다.
FIVP 스트레인과FECV 사이를 구분하기위한 것으로서 적합한 영역으로부터의 DNA 및 단백질서열들이 동정되었으며 FIVP 스트레인, 컨센서스서열 및 FECV의 에스 유전자의 가변성N-말단 절반에 존재한다.에스 유전자의 카르복시 절반으로부터의 DNA 및 단백질서열도, 도한, 가능한 백신용성분으로서 동정되었다. 이들 모든 영역들은 통상의 수단에 위해 클로닝되고 발현될 수 있다. 폴리머라제 쇄 반응(PER) 프라이머의 위치를 변경시켜 완전한에스 유전자를 포함한 서열 및에스 유전자의 구분되는 부분들을 증폭시킬 수 있다.
본 발명을 실행하기 위하여, FIVP에스 유전자내의 특정 부위에서 CDNA 합성을 개시할 수 있도록 올리고 튜클레오타이드서열을 고안하였다.
FIVP에스 유전자의 DNA서열에 대해 특이적인 올리고 뉴클레오타이드 프라이머들은 실시예 2에 상세히 기술된 바와 같이 고안되었다. 하기표2는 표 지된에스 유전자 아미노산서열의 뉴클레오타이드서열 및 일부에의해 5' 및 3' FIVP에스 올리고뉴클레오타이드 프라이머[서열동정번호 : 1-9 및 10-18]를 특정적으로 분류하고 있다.에스 유전자의 아미노산서열 영역에 상당하는 뉴클레오타이드서열을 제공하는 것 외에도, 표 11에 특정적으로 분류된 프라이머[서열동정번호 : 1-18]들은, 또한, 본 발명의 융합단백질을 생성하기위해 선택된 발현백터내로 고양이 코로나바이러스에스 유전자 단편을 특정 배향으로 도입하기 위한 서열을 함유한다. 고양이 코로나바이러스 RNA로부터의 단편들의 PCR중폭을 위해 최적화된 하기의 조건, 예를 들면 하기11의 프라이머[서열동정번호 : 1-18] 뿐만 아니라 이들과 동일한 프라이머들은, 또한 FIVP 또는 FIVP-유사 바이러스의 존재를 확인하기 위하여 PCR기술을 사용하는 전단방법에서 시약으로서 사용될 수 있다.
이들 프라이머들은 포스포르아미다이트 방법에의해 합성되고 사용전에 겔 정제하였다. 그런다음 프라이머를 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 분석[참조예 : Arnheim et al., Chem. Eng. News, pages 36-47(1990년 10월 1일)-이의 문헌은 본원의 참증으로 인용된다.]기술에 사용하였다.
PCR 기술은 FIVP 및 FECV 페플로머 유전자의 구분되는 영역을 나타내는 추가의 단편을 제조하기위해 사용될 수 있다. 따라서, 이 기술은 고양이 코로나바이러스의 주요 스트레인들 사이의 상동성 도는 이질성의 영역을 나타내는 FIVP 및 FECV 서열들의 분리, 동정, 및 증폭을 가능케한다. 이러한 DNA서열 또는 이의 단편들은 감염동불의 진단 및 치료 모두에 유용하다. 이질성 유전자서열의 동정은 특정 바이러스의 존재를 검출하고 이들을 서로로부터 구분짓는 진단검정에, 예를 들면 통상의 검정절차를 이용하여 한종의 코로나바이러스를 또다른 종의 코로나바이러스와 구분짓거나 하나의 고양이 코로나바이러스를 다른 고양이 코로나바이러스와 구분 짓는데 유용한 시약을 제공한다.
관련된 고양이 코로나바이러스들의 PCR분석은, 또한, 상이한 질병-유발 특징을 갖는 바이러스 스트레인들간에 상동성 도는 비-상동성의 영역에 대한 정보를 제공한다.
고양이 코로나바이러스 및 기타 관련된 바이러스(예, 돼지 전파성 위장염 바이러스(TGEV)[J et al., Virus Res., 8 : 363-371(1987)], 개 CCV 및 사람 229E)의 PCR 지도작성에의해 수득된 정보는 다른 밀접히 관련된 코로나바이러스 또는 하나이상의 PRPV
스트레인에 대해 효과적인 백신을 제조하는데 유용하다.
예를 들면, 예시된 백신은 가능한 하나이상의 코로나바이러스종에 대해 효과적인 유효량의 상기된 상동성 증폭서열을 함유할 수 있다.
요약컨데, PCR은 목적하는 이중가닥 핵산의 상대가닥에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하며 여기서, 이중가닥은 이들이 DNA 폴리머라제에의해 연장될 때 올리고뉴클레오타이드를 부리하는 영역을 따라 합성이 일어나도록 배향된다.
열변성, 상보서열에 프라이머의 어닐링 및 온도 안정성 DVA 폴리머라제로 어닐링된 프라이머의 연장의 반복도니 주기에의해, 수백만개의 목적 유전자 서열복제물이 형성된다.
이 반응을 위한 주형은 FIVP 감염세포로부터 분리된 전체 RNA이다.
PCR에의해 형성된 DNA단편들은 이 RNA로부터 합성된 CDNA로부터 증폭되었다.
최초실험에서, RNA를 정제하고 FIVP 또는 FIVP-연관된 바이러스의 다음 스트레인들로부터 제조하였다 : WT FIVP UCD-2, WT FIPY 수 406, FECV 및 WT FIVP UCD-1.
RNA 및 CDNA 제조는 하기 실시예 3에 상세히 기술된다. FIVP 또는 FIVP-연관된 서열의 다른 스트레인들은, 또한, 유사한 방식으로 PCR주형을 제공할 수 있다.
PCR에의해 증폭되는에스 유전자의 특정 영역은 고양이 코로나바이러스 및 다른 관려된 바이러스들의 선별을 가능케한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 혼합하고 교합했을 때에스의 105개 아미노산보다 적은 또는 1454개 아미노산 보다 큰(완전한에스)영역이 합성되었다. 이러한 프라이머들은 하기표11에 분류되어 있다.
하기 실시예에 기술된 바와 같이 아미노산 94번 내지 223번에 상응하도록 고안된 PCR 프라이머로부터 이상응된 영역보다 짧은 펩타이드인 FIVP에스 유전자의 하기 증폭된 단편이 생성되었다. 현재 바람직한 펩타이드는 FIVP에스 게놈, 켄센서스서열 및 FECV 게놈이 아미노산 약94번 내지 아미노산 약223번에 상응하는 것, 더욱특히 FIVP에스 게놈, 컨센서스서열 및 FECV 게놈의 아미노산 약 97번 내지 아미노산 약222번에 상당하는 것이다.
본 발명의 FIVP 스트레인 및 FECV의 특정 증폭된 서열은 하기 수록된 영역을 포함한다 :
[WT DF2로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산]
#1-105, 1-223, 1-362, 1-555, 1-748, 1-1040, 1-1203, 1-1452, 94-223, 94-363, 94-555, 94-748,
94-1040, 94-1203, 94-1452, 213-362, 213-555, 213-748, 213-1040, 213-1203, 213-1452, 352-555, 213-748, 544-748, 544-905, 544-1040, 554-1203, 554-1452, 737-905, 737-1040, 737-1203, 737-1452, 894-1040, 894-1203, 894-1452, 1029-1203, 1029-1452, 및 1192-1452.
[TS DF2로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산]
#1-105, 1-223, 1-362, 1-555, 1-748, 1-1040, 1-1203, 94-223, 94-362, 94-555, 94-748, 94-1040, 94-1203, 94-1452, 213-362, 213-555, 213-748, 213-1040, 213-1203, 213-1452, 352-748, 544, 748, 544-905, 544-1040, 544-1203, 544-1452, 737-905, 737-1040, 737-1203, 737-1452, 894-1040, 894-1203, 894-1452, 1029-1203, 1029-1452, 및 1192-1452,
[FECV 로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산]
#1-105' 1-223, 1-362, 94-223, 94-362, 94-555, 94-748, 94-1040, 213-362, 213-748, 352-555, 352-748, 544-748, 544-905, 544-1040, 544-1203, 544-1452, 737-905, 737-905, 737-1040, 737-1203, 737-1452, 894-1040, 894-1203, 8941452, 1029-1203, 1029-1452 및 1192-1452.
[WT WSU 1146 으로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산]
#1-105, 1-223, 1-555, 94-223, 94-362, 94-555, 94-748, 213-362, 213-748, 352-555, 352-748, 544-748, 544-905, 544-1040, 544-1203, 797-905, 737-1040, 737-1203, 894-1040, 894-1203, 894-1452, 1029-1203, 1029-1452, 및 1192-1452,
[WT UCD-1 로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산]
#94-223, 94-362, 352-555, 352-748, 544-748, 737-905, 737-1040, 737-1203, 894-1040, 894-1203, 1029-1203, 1029-1452, 및 1192-1452.
WT TN406D으로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산 #94-223. WT UCD-4로부터의 증폭된 영역에 상당한 아미노산 #94-223.
이들 단편중 많은 것이 클롤닝되고 GALK 융합단백질로서 발현되었다.
이들은 하기 실시예 5의 표 Ⅳ에 수록되어 있다.
유사하게, 상이한 스트레인들간에 상동성 도는 이질성의 영역을 보여주는 PCR DNA 단편들이 분리되었다. 예를 들면, FIVP또는 FECV에스 게놈의 아미노산 737 내지 1452번에 인접한 DNA 프라이머는 예상된 크기의 단편(2168bp)을 제공하고, FIVP 및 FECV 서열의 아미노산 1029번 내지 1452번에 인접한 DNA 프라이머는 예상된 크기의 단편(1290bp)을 제공한다.이들 단편들은 DF2, TS 및 FECV 바이러스 주형 각각으로부터 증폭되었다.
아미노산 1-7848 번에 상당한 DNA 단편은 DF2, DF2-HP, TS-BP, TS 및 FECV 로부터 증폭되었다. 또한, 아미노산 94-223번에 상당한 DNA 단편이 WT TN406 으로부터 증폭되었다.
적절한 프라임에도 불구하고 증폭되지 않은 특정 단편으로서는 FECV에 대한 아미노산 1-555번 및 352-555번의 단편이 포함되며, 이는 WSU1146 기본 프라이머와 예상된 이질성의 영역을 나타낸다. 이들 폴리펨타이드 또는 이보다 짧은 단편들은 FECV 를FIVP 스트레인으로부터 구분하는데 유용하다.
에스 유전자 및 이에의해 암호화된 아미노산서열의 불정확한 상동성 영역을 동정한 후, 이들 서열을 비교하여 이들의 상동율을 결정하였다. 일반적으로, 95% 미만의 핵산 및 아미노산 상동성은 바이러스의 특정영역이 비병원성 FECV 와 병원성 FIVP 사이를 구분지을 수 있는 진단제로서 유용할 수 있다. 하기표I은 표시된 FIVP 스트레인과FECV의 에스 유전자 영역 사이의 상동성을 도해한 것이며, 이것은 FECV 및 FIP 바이러스는 진단 및 치료에 상용하기에 유용한 선별서열을 공급하기에 충분히 상이하였음을 나타낸다.
표 1에 기록된 상동성은 백분율로 나타낸 것이며 부정교합/ 비교합 염기쌍 또는 아미노산의 수는 괄호안에 표 시되어 있다. AA(I) 는 완전한 교합 아미노산 상동성을 나타낸다. AA(S)는 엠, 오, 데이호프의 규칙[Sequence and Atlas of Protein Structure, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, MD(1968)]을 기초로하여 유사성 교합 아미노산 상동성을 나타낸다.
6종류의 FIP 코로나바이러스 WT2, WT WSU1146, DF2-HP, TS, TS-BP, 및 WT 수406DML 뉴클레오타이드 및 아미노산서열을 FECV 및 컨센서스서열(제9도)의 것과 비교한 결과 FECV는FIVP 스트레인과 단지 약 93.0%의 상동성은 나타냈다.
FECV 와 도해된 FIVP 스트레인은에스 유전자의 처음 748개 아미노산에서 50개 이상의 아미노산이 상이하였다. 이들 차이중 일부는 FIVP 서열의 상동영역과 상이한 FECV서열의 영역에서 집단으로 드러났다. 이러한 집단영역은 바이러스를 선별하기 위한 부위를 나타낸며 FIVP 와 FECV를 구분할 수 있는 진단시약으로서 또는 치료용 도는 백신용제제로서 바람직하다. FIVP 스트레인으로부터의 집단적 아미노산 차이를 동일 방식으로 사용될 수 있다. FECV의 에스 유전자의 뉴클레오타이드서열, 예를 들면 염기쌍 1-1080 사이의 서열은 하이브리드화 탐침 및 PCR 프라이머에 바람직한 서열을 제공한다.
상응하는 아미노산서열, 예를 들면 아미노산 1 내지 360 사이의 서열은 ELISA 또는 웨스턴검정에 유용하거나, 항체의 개발 또는 혈청의 선별을 위한 항원으로서 유용한 펩타이드를 제공한다. 이러한 탐침, 프라이머, 항원 및 항체는 FECV에 감염된 고양이의 조직 또는 혈청샘플과 양성반응하지만 FIVP 스트레인에 감염된 고양이의 것과는 음성반응을 나타낼 것이다. 특히, FECV의 하기영역은 이러한 목적을 위한 펩타이드 단편 및 DNA 서열의 제조에 특히 적합한 것으로 나타난다. FIVP 스트레인과 컨센서스서열의 상응하는 영역은, 도한, 동일한 목적에 유용할 수 있다.
이들 FECV 영역은 다음과 같다 : 아미노산잔기 19-26[서열동정번호 : 36], 46-53[서열동정번호 : 38], 73-78[서열동정번호 : 40], 124-174[서열동정번호 : 42], 145-150[서열동정번호 : 44], 138-159-[서열동정번호 : 46], 143-150[서열동정번호 48], 200-205[서열동정번호 50], 및 529--536[ 서열동정번호 : 52] 및 상응하는 누클레오타이드 단편 52-78[서열동정번호 : 35], 136-159[서열동정번호 : 37], 214-231[서열동정번호 : 39], 370-519[서열동정번호 : 41], 433-450[서열동정번호 : 43], 412-477[서열동정번호 : 45], 427-450[서열동정번호47], 598-615[서열동정번호 : 49], 및 1585-1608[서열동정번호 : 51].
이들 영역에서 보다 작은 펩타이드 단편 또는 이들 영역을 함유한 보다 큰 단편, 예를 들면 10개 이상의 아미노산 길이인 단편은 생물학적 및 혈청학적 검정에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 15개 아미노산의 펩타이드에서 적어도 7개 도는 8개의 상이한 아미노산의 서열이 통상 수의사에의해 수행된 대부분의 검정을 위해 필요하다. [참조 : Posthums et al., J. Virol., 68 : 2639-2646(19870)].n 물론, 유전학적 기술은 작은 펩타이드에서 단일의 아미노산 변경을 검출할 수 있다.
또한, 이들 영역에서의 보다 작거나 보다 큰 DNA단편들은 큼 PCR 프라이머 또는 하이브리드화 탐침으로서 사용될 수 있다. 바람직한 PCR 프라이머서열은 통상의 PCR 기술에 따라 적어도 100개 염기 내지 1500개 이상의 염기의 서열이 삽입되는 길이가 15 내지 30개 염기이다. 그러나, PCR 기술의 변형법을 기초로하여 좀더 크거나 좀더 작은 서열이 유용하게 사용될 수도 있다. 일반적으로, 만족할 만한 선별에 이르기위하여, 이들 서열주 하나 이상으로 구성된 탐침은 현재의 기술에 따라 15내지 50개 염기로 구성된다. 그러나, 좀더 짧은 영역이, 담체에 결합하여, 사용될 수 있다, 적합한 담체로서는 난알부민, 키홀삿갓조개헤모시아닌, 소혈청알부민, 세파로즈비드 및 폴리덱스트란비드가 포함된다.
PCR 증폭기술은 그 자체로 진단도구로서 이용될 수 있다. 본 목적에 사용된 것과 유사한 원한을 사용하여 FIVP 감염된 것으로 예측되는 고양이로부터 조직 또는 혈액샘플을 상기 표 Ⅱ에 나타낸DNA 서열과 같은 선별된 FIVP-특정 세트의 프라이머로 PCR 증폭시킨다.
DNA의 증폭은 FIVP의 존재와 상호관계가 있다. 샘플증의 FIVP의 부재는 증폭이 없다는 결과이다. 유사하게, 특정 세트의 에스 프라이머의 선정은, 또한 FIVP의 특정 스트레인의 선별을 가능케한다. FIVP 스트레인에 대한 이질성의 다른 영역의 FECV 프라이머를 사용하여 FECV를 진단함으로써 유사한 결과를 얻을 수 있다.
진단시약으로서 사용될 때 본 발명의 프라이머, 팀첨 및 펩타이드는 본 분야의 전문가에 알려진 검출가능한 라벨 또는 라벨 시스템과 임의로 연결시킬 수 있다. 진단검정은 샌드위치 ELISA검정, 웨스턴블롯, 사우썬블롯 등과 같은 통상의 모든 검정법일 수있다.
PCR 프라이머, 하이브리드화탐침 및 펩타이드 진단시약은 유사하게 FICV로부터 CCV 와TGEV를 구별하도록 고안될 수 있다. 예를 들면, 감염된 것으로 예상되는 동물로부터의 샘플조직 또는 생물학적 유액에서 얻어진 핵산을 바이러스 유전자서열의 영역에 독특한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 특정 바이러스의 존재를 동정할 수 있다. 따라서, 감염된 동물에 대해 적절한 조치가 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 고양이 코로나바이러스의에스 유전자의 튜클레오타이드 및 페바이드 단편은 통상의 방법, 예를 들면 메리필드 합성법[Merrifeld, J.A.C.S., 85 : 2149-2154(1963)]에 의해 쉽게 합성될 수 있다. 다른 방법으로서, 이들은 재조합 방법에의해 제조될 수 있다. 클로닝 절차는 통상적인 것으로 문헌 [T. Maniatis et al., Molecular Cloning(ALabordtory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory(1982
)]에 기술된 바와같다.
PCR동안 생성된 단편에의해 결정된에스 유전자서열의 일부를 나타낸는 본 발명의 선택된 PCR-유도된 단편은 선별된 발현 벡터내로 클로닝시킨다.에스 유전자 단백질의 제법에 사용하기위한 벡터는 본 발명의 신규한에스 유전자 단편 DNA서열 및 이 DNA암호서열과 작동적으로 연결되어 선정된 숙주세포내에서에스 -유도된 펩타이드의 복제 및 발현을 지시할 수 있는 선택된 조절서열을 함유한다.
상기의 에스 유전자 뉴클레오타이드서열, 단백질 및 펩타이드 단편은 또한 바람직하게는 융합단백질의 형태로 생성된다. 이러한 융합단백질은 펩타이드 단편 자체에 대해 상술한 바와 같이 합성적으로 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명의 융합단백질의 제조를 촉진하기 위해서는 재조합 방법이 바람직하다. 본 발명의 융합단백질을 제조하기위해 선별된 발현베터내로 턱정의 배향으로 고양이 코로나바이러스에스 유전자 단편을 도입하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 절단부위 서열-함유한 PCR 증폭된 단편을 제조하기 위하여 PCR 반응에 사용된 프라이머 세트를 고안할 수 있다. 벡터는 융합단백질을 생성하도록 프레임내에에스 유젖자 단편이 융합된 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 함유할 수 있다.
선별된에스 유전자 서열과의 융합단백질을 형성하기 위한 단백질 또는 펩타이드는 많은 것을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 에스-유도된 단편을 위한 융합파트너는 선택된 숙주세포 시스템에 고도로 발현되기 때문에 선정될 수 있으며 이에 융합된에스-유도된 선정된 융합단백질은 세균내에서 갈락토즈 대사의 제1단계를 촉매하는 세균효소 갈락토키나제(GALK)의 52개 아미노산에 선정된에스 유전자 서열을 프레임으로 융하시키으로써 제조한다. 이 효소의 서열 외해 유전자의 삽입 및 융합 단백질의 작제를 가케하도록 조작되었다.
GALK는 이. 콜라이 발현 시스템에서 고도로 발현된다.
유사하게, 융합 파트너는 바람직한 시그날서열, 선정된 숙주세포 시스템에서 증진된 분비에의해 특뻘지워지는 서열, 또는에스-유도된 펩타이드의 안정성을 강화시켜즈는 서열일 수 있다. 갈락토키나제 대사에 선정될 수 있는 몇가지 다른 대표 적인 융합파트너로서는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 효소발현 시스템용 유비퀴틴 및 α 교배인자, 및 세균시스템용 β-갈각토시다제 및 인플루엔자 NS-1단백질이 포함된다. 본 분야 전문가는 선정된 발현 시스템에 적절한 융합파트너를 쉽게 선정할 수 있다.
본 발명은 어떤 특정의 융합파트너의 사용으로만 한정되지 않는다.
본 발명의 벡터는 세균, 포유류세포, 진균세포 또는 곤충세포에서 또는 선정된 바이러스내에서에스 유전자 펩타이드 또는 융합단백질의 발현을 위해 고안될 수 있다. 적합한 벡터는 본 분야 전분가에게 알려져 있으며 문헌 또는 공급업자에의해 쉽게 입수가능하다.
하기 실시예의 융합단백질을 작제하는데 사용된 벡터는 세균성 PBR322-pOTSKF33(참조 : 제1도 및 실시예 5)이다. 플라스미드pOTSKF33은 PBR322[Bethes
-da Research Labortories]의 유도체이며 박테리오파아지람다로부터의 조절 시그날을 함유한다. 파아지 조절정보가 이 고효능성 및 조절능력 때문에 선택되었다. 이 시스템은 조절될 수 있는 프로머터(, 유전자 삽입체를 따랄 효율적인 전사를 조절서열의 유전자 하향부의 삽입을 위한 유동부위를 제공한다.에스 유전자 서열PCR단편은 pOTSKF33의 독특한 제한부위내로의 클로닝(Xmai 및 Stui이용)결과 갈락토키나제/ FIVP에스 페플로머 융합유전자가 작제되도록 공학적으로 조작되었다. 이러한 한가지 융합분자가 제2도에 도해되어 있다.
이어서, 고양이 코로나바이러스에스-유도된 펩타이드의 암호화서열 또는 융합 유전자를 함유한DNA 분자 또는 벡터 생성불을 숙주 세포내로 도입시키고 이질성 단백질의 발현을 유도한다. 본 발명의 에스-유도된 펩타이드 또는 융합단백질을 발현시키는데 사용하기에 적합한 세포 또는 세포주는 세균세포가 바람직하다. 예를 들면, 이. 콜라이의 여러 가지 균주(예, HB101, MC1061) 는 생명공학분야에서 숙주세포로 잘 알려져 있다. 또한 본 발명 방법에는 바실러스 서브틸리스(B.Subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 기타 바실러스종의 여러 균주들이 사용될 수 있다.
또한, 챠이니즈 햅스터 난세포(cho) cos-1 세포와 같은 포유동물 세포들도 본 발명의 단백질, 펩타이드 및 융합단백질의 발현에 사용될 수 있다. 다른 적합한 포유동물 숙주세포의 선별, 형질전환방법, 배양방법, 증폭방법, 스크리닝(선별방법), 생성불 제조방법 및 정제방법은 본 분야에 공지되어 있다. [참조 : Gething and Sambrook, Nature, 293 : 620-625(1981), Kaufman et al, mol. cell. biol., 5(7) : 1750-1759(1985), 또는 Howley등의 미합중국 특허제4, 419, 446호].
마찬가지로, 많은 효모균주 또는 본 분야 전문가에 공지된 다른 진균세포들도 본 발명의 단백질, 펩타이드 및 융합단백질의 발현을 위한 숙주세포로서 이용가능하다. 효모 발현 벡터는 세포의 활성 억제인자를 분비하도록 효모세포에서 단백질, 펩타이드 또는 융합단백질의 암호화 움 FMF 발현하는 효보 조절서열을 사용하여 작제한다.[참조예 : 공개된 PCT W086/00639 및 유럽 특허원 EP123, 289GHDP 기술된 방법]. 곤충세포도 또한 재조합 단백질의 발현에 사용되는 공지된 숙주세포이며 본원의 숙주세포로서 사용될 수 있다. 도다른 발현 시스템으로서는 백시니아, 전염성상피종, 가두와 같은 공지된 바이러스 발현 시스템이 포함될 수 있다. 또한, 발현벡터의 고안은 숙주세포의 선택에의해 좌우된다. 여러 가지 적합한 발현 시스템이 본 분야 전분가에게 알려져 있다.
형질전환된 숙주세포를 본 분야 전문가에 공지된 적합한 배양조건하에 적합한 시간동안 배양한 후, 세포를 요해시킬 수 있다. 또한, 사용된 작제로에 다라 재조할 단백질을 세포외로 분비시켜 배양배지로부터 수득하는 것도 가능하다. 그런다음, 세포용해를 도는 배양배지를 FIVP, 경우 융합파트너(예, 이.콜라이 갈락토키나제)에 대한 항체(바람직하게는 mab)에의해 인지되는에스-유도된 펩타이드 또는 융합단백질의 존재에 대해 선별한다.
에스-유도된 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 함유한 조세포용해물은 백신성분, 치료용 조성물 또는 진단용 시약으로서 직접 사용할 수 있다. 다른 받도로서, 에스-유도된 펩타이드 또는 융합 단백질은 통상의 수단에의해 조용해물 또는 배지로부터 정제할 수 있다.
예를 들면, 갈락토키나제/FIVP에스 융합 폴리펩타이드는 친화성 크로마토그래피에의해 세균성 용해물로부터 정제할 수 있다. 요약하면 커럼은 갈락토키나제에 대한 모노클로날 항체로 제조한다. 선별된Mab는 본 효소의 처음 52개 아미노산내의 에피토프를 인지한다. 융합단백질이 함유된 세균성 용해물은 컬럼에 통과시킴에 따라 항원-항체 복합체를 형성하면서 친화성 매트릭스상에 흡착한다. 컬럼을 세척한 후, 결합된 galk/에스 페플로머(FIVP, fecv또는 컨센서스)융합단백질을 산, 염기 또는 효란제로 처리하여 용출시킨다. 이때 정제된에스-유도된 페바이드 도는 융합단백질은 백신성분 또는 진단시약으로 사용하기에 더욱 바람직하다. 따라서, 숙주세포에서pcr 증폭된에스 유전자서열 또는 에스 유전자/ 융합 파트너 dna서열(예, 세균세포내에서 생성된galk/FIVP 또는 fecv에스단편)의 발현은 진단검정에서 사용되거나 치료 및 백신용 조성물의 성분으로서 사요될 수 있느 재조합 단백질을 생성한다.
한가지 예로서, 본 발명에 따라 제조된 정제된 재조합 융합단백질 58-3(서열동정번호 : 19 및 20, 각각 핵산서열 및 아미노산서열)은 TS FIVP의 아미노산 97 내지 223에 상응하는 고양이 코로나바이러스에스 유전자 일부를 함유한다. 동일한 방식으로 본원에 기술된 다른 FIP 스트레인의 아미노산서열 또는 FECV 아미노산서열과 융합단백질을 형성할 수 있다.
본 발명의 재조합 단백질은 백신 조성물내에 혼입될 수 있다. 이러한 백신 조성물은 본 발명의 방법에 따라 제조된 융합단백질 또는, 예를 들면 FECV의 완전한에스 유전자서열에의해 암호돠된 하나이상의 선택된에스-유도된 펩타이드 면역원량을 FIVP 감염의 예방치료용 백신 조성물로서 비경구 투여하기에 적합한 담체와 함게 함유할 수 있다. 바람직한 것은 백신 조성물에 사용된 재조합 단백질은 FIVP 감염의 예방치료용 백신 조성물로서 비경구 투여하기에 적합한 담체와 함께 함유할 수 있다.
바람직한 것은 백신 조성물에 사용된 재조합 단백질은 FIVP의 한 개이상 스트레인에 대해 보호적 면역반응을 유도하는에스 유전자 서열을 함유하는 것이다.
또한, 본 발명의 에스-유도된 펩타이드, 단백질 또는 융합단백질을 추가의 항원(예, 다른 코로나바이러스 또는 일반적인 다른 병원체)을 함유한 백신 조성물에 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 에스-유도된 펩타이드, 단백질 또는 융합단백질은 본원의 참조문헌으로 인용되는 공동수유의 공동계류중인 1989년10월 30일자 미합중국 특허원제 07/428, 796호에 상세히 기술된 온도 민감성 FIVP 백신에 추가의 항원으로서 사용될 수 있다.
다른 방식으로, 본 발명의 펩타이드, 단백질 및 융합단백질은 고양이 백혈병용 백신과 같은 다른 고양이 백신 조성물에 함유시킬 수 있다.
적절한 pH등 장성, 안정성 및 기타 통상의 특징을 갖는 약제학적으로 허용되는 백신 조성불의 제법은 본 분야의 기술에 속한다. 이러한 백신은 부형제 및/또는 담체(예, 수산화알루미늄 및 마그네슘의 수성현탁액, 리포좀 등)와 간은 통상의 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 백신조성물은 FIP와 연관된 임상학적 증세에 대해 동물을 면역시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 백신은 경구, 비후내, 피하, 복강내 또는 근융내 경로와 같은 적절한 경로에의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방법은 피하 및 비내경로이다.
개개의 백신용량에서 본 발명의 에스-유도된 펩타이다, 단백질 또는 융합단백질의 양은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 제조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질 또는 펩타이드의 면역원량의 멸균용액 mL당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다.필요한 경우 초기용량에 이어 임의로 반복된 향원자극을 수행할 수 있다.
현재 바람직한 백신 조성물은 mL당 최소 1내지 10개 융합단백질을 함유한다. 본 발명의 또다른 백신제는 제4도 내지 8도의 서열로 형성된 안티-센스 RNA서열이다.
이 서열은 본 분야 전문가라면 누구나 합성적으로 또는 재조합 방식으로 쉽게 제조할 수 있다. 적절한 전달하에, 감염된 동물에 투여했을 때 안티-센스 RNA서열은 바이러스의 RNA와 겨합할 수 있어야 함으로써 세포내에서의 바이러스 복제를 억제시킨다.
본 발명은, 또한 본 발명에 따라 제조된에스-유도된 펩타이드, 단백질 또는 융합단백질과 약제학적으로 유효한 담체를 함유한 약제학적 조성물을 제공한다.
내부투여에 적합한 약제학적으로 효과적인 담체는 본 분야 전문가에 잘알려져 있다.
한가지 선정된 담체는 멸균염수이다. 약제조성물은 어떠한 경로에의해서도 투여를 위해 제형될 수 있으나, 주사 또는 비내투여에 적합하도록 고안되는 것이 바람직하다.
상기와 같이 생성된 PCR 프라이머뿐만 아니라에스-유도된 단백질, 융합단백질 또는 펩타이드 단편은, 또한, 혈청인지용 표 적물로서 재조합유도된 단백질 면역원에 좌우되는 진단검정법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은고양이 코로나바이러스의에스 유전자로부터 유도되고 임의로 갈락토키나제의 N-말단 52개 아미노산 같은 것과 같은 것과 융합되는 펩타이드를 FIVP에 노출된 경우와 다른 연관된 코로나바이러스에 노출된 경우를 구별하는데 뿐만아니라 이미 노출된 고양이와 순수한 고양이를 선별하기에 유용한 진단테로서 사용하는 방법을 제공한다. FECV 및 FIVP혈청에 대해 상이한 반응성을 보여주는 다른 GALK/ FIVP에스 펩타이드 또는 융합 단백질은, 또한 고양가 FIVP에 노출된 것을 검출하는 ELISA-기본 스크리닝 검정에서 FIVP 특이적 시약으로서 유용할 수 있다.
유사하게, FECV 감염 고양이로부터의 혈청 또는 FIVP 양성 고양이로부터의 혈청에의해서만 인지된에피토프를 함유한에스-유도된 펩타이드 또는 융합단백질은 코로나바이러스 감염들 사이를 구분짓거나 선별하기 위해 사용될 수 있다,
한가지 검정절차로서, 고양이 생물학적 체액 도는 세포에 대한 친화성 정제된 FIVP 또는 FECV에스 단백질, 펩타이드 또는 융합폴리펩타이드(예, GALK/에스단편)의 반응은 웨스턴 블릇에의해 검정할 수 있다. 이 검정은 이 혈청에 사용하는 것이 바람직하지만, 다른 적절한 체액 또는 세포, 예를 들면 대식세포 또는 백혈구세포에 대해서도 수행할 수 있다.
웨스턴 블릇기술에서, 예비된 겔에의해 불리된 단백질 정제물을 니트로셀로로즈에 뎄기고 수개의 띠로 절단시킨다. 그런다음, 비감염된 고양이 또는 감염된 고양이로부터의 고양이 혈청으로 띠를 탐침시킨다. 단 백질에 고양이 혈청의 결합은 알카리성 포스파타제 부착된 염소 항-고양이 IgG에 이어서 효소기질 Bcip/nbt와 함께 배양하여 검출한다. 띠를 물에 세척함으로써 색깔전개가 정지된다.
고양이 혈청 샘플의 웨스턴 블릇선별은 본 발명에 따라 제조되었고 실시에 5 내지 7에 상세히 기술된 정제된 제조합 융합단백질 58-3(서열동정번호 : 20)으로 수행하였다. 이 재조합 단백질의 고양이 코로나에스 유전자 일부는 ts FIVP로부터 수득되고 공개된 wsu 1146 스트레인의 아미노산 97 내지 223번에 상응한다. 고양이 혈청의 배터리로 선별할 때, DF2 또는 WSU1146 FIVP에의해 아프거나 사멸된 고양이들의 혈청만을 58-3 폴리펩타이드(서열동정번호 : 20)와 반응하였다. 건강한 고양이는 이 펩타이드와 잠응하지 않았으며, 또한 비병원성 FECV 코로나바이러스 스트레인으로 도전된 고양이도 반응하지 않았다. 본 발명의 다른 펩타이드는, 유사하게, FIVP 스트레인과 FECV 사이 eh는 FIVP의 다른 스트레인 사이를 구분짓기위해 사용될 수 있다.
융합단백질 58-3(서열동정번호 : 20)은 FIVP 질병을 검출하기위한 ELISA기본 검저업에 사용할 수 있다. FECV 및 FIVP에 상이한 반응성을 보이는 기타에스 유도된 펩타이드 또는 융합단백질도, 또한 고양이의 FIVP 노출을 검출하기 위한 ELISA-기본 선별검정에서 FIVP-특이적 시약으로서 유용할 수 있다.
전형적인 ELISA 원안은 96-웰 트레이의 웰 트레이의 웰에 항원(재조합 GALK/에스 융합단백질)의 흡착과 연관이 있다. 시험대상 혈청을 첨가한다. 혈청이 그 항원에 대한 항체를 함유한다면, 이는 결합할 것이다. 반응의 특이성은 평판에 흡착된 항원에의해 결정된다. 58-3 GALK/FIVP에스 융합단백질(서열동정번호 : 20)과 함께, FIVP에의해 병들었거나 사멸한 고양이로부터의 혈청만이 평판에 결합한다. 순수하거나 건강한 바이러스 노출된 고양이는 결합하지 않는다.
유사하게 FECV 감염 고양이로부터의 혈청 또는 FIVP 양성 고양이로 부터의 혈청에의해서만 인지된에피토프를 함유한에스-유도된 단백질, 펩타이드 또는 융합단백질은 코로나바이러스 감염증을 구별하는데 사용할 수 있다. 일차항체가 결합한 후, 혈청룰 시험코져하는 동물의 글로불린에 대한 효소-표 지된 항체를 첨가한다. 이어서, 기질을 첨가한다. 웰에 결합된 항체에 연결된 효소는 기질을 눈에 보이는 형태로 전환시킨다. 측정된 색깔의 양은 시험재료중의 항체의 양에 비례한다. 이와같은 방법으로, FIVP로 이미 감염된 고양이를 선별하고 치료하거나 바이러스 감염되지 않은 고양이를 면역화에의해 보호할 수 있다.
본 발명은, 또한, 다른 코로나바이러스(예, FIVP)와 반응하지 않는 영역으로서 FECV의 상기 아미노산 잔기 영역중 하나에 대한 항체 또는 이러한 영역을 함유한 융합단백질에 대한 항체의 개발을 포함한다. 한가지 양태로서, 본 항체은 제3도 내지 제8도에 도시된 DNA 서열 전부 또는 일부에의해 암호화된 FECV 항원성 부위를 동정하거나 이에 결합할 수 있다. 이러한 항체는 진단용 선별시험에서 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 검정에서 사용하기 위한 것으로 FIVP와 FECV를 구별할 수 있는 상기 영역의 펩타이드 또는 기타 다른 영역에 대한 항체는 폴리클로날일 수 있다.
그러나, 본 발명의 검정에서 또는 효능있는 치료 및 예방제로서, 증가된 표 적 특이성의 목적상 모노클로날 항체(MAB)를 이용함이 바람직하다, 추가로, 합성적으로 고안된 모노클로날 항체는 공지된 유전공학기술에의해 제조될 수 있으며, [W.D.Huseet al. Science, 246 : 1275-1281(1989)], 본원에 기술된 방법에서 이용될 수 있다. 간략하게 나타내기 위하여 본 명세서 전반에 걸쳐 M뮤(s) 용어를 사용할 것이다. 그러나 특정의 폴리클로날 항체, 특히 고역가 폴리클로날항체 및 재조합 항체도 사용될 수 있다.
Mab는 널리 알려진 퀼러와 밀스타인 기술이거나 이의 변형법으로 제조할 수 있으며, 상기된 아미노산 잔기 영역중 하나이상에 대한 것이거나, 하기 실시에 12에 기술된 것과 같은 다른 fecv-암호화된 펩타이드 또는 fecv와FIVP 사이의 차이를 함유한 애피토프에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, FIVP의 것과 상이한 항원부위를 암호화한 fecv서열의 일부가 MAb의 개발을 위한 통상의 기술에서 항원으로서 제시될 수 있다.
FIVP 또는 어떠한 다른 코로나바이러스도 아닌 오로지 FECV만의 에피토프를 인지하는 항체를 분비하는 세포주가 그러한 사용을 위해 동정될 수 있다.
본 분야 전문가라면 누구나 면역원으로서 본 원에 등정된 아미노산 잔기 영역의 단편을 이요하고 이들 기술을 사용함으로써 많은 MAb를 생성할 수 있을 것이다.
진단목적을 위해서는 항체(뿐만아니라 진단용탐침)를 개개의 라벨과 연결시킬 수 있으며, 진단방법에서 한 개이상의 항체가 사용되는 경우 라벨과 연결시킬 수 있으며, 진단방법에서 한 개이상의 항체가 사용되는 경우 라벨은 검출가능한 시그날을 제공하도록 상호작용을 나타내는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 라벨은 가시적으로 검출가능한 것(예, 색도게)이다. 본 발명의 진단검정에 유용한 항체에 부착하기위한 검출가능한 라벨은 진단검정분야의 전문가에의해 쉽게 선택될 수 있다. 시각적으로 검출 가능한 라벨이 시그날의 신속성 및 간단한 판독성 때문에 임상적인 사용시에 바람지하다. 색도검출의 경우 적절히 작동하는 여러종류의 효소계가 문헌에 공지되어 있다. 색도용 효소계로서는 양고추냉이 페록시다제(HRP) 또는 알카리성 프스파타제(AP)를 예를들 수 있다.
글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제와 연결되는 핵소키나제를 포함하여 다른 유사한 효소계들이 당업자들에게 알려져 있다. 또한 NAD 옥시도리덕타제를 투시페라제 및 기질 NADH 와 FMN과 함께 사용하거나 페록시다제를 루미놀 및 기질 과산화물과 함계 사용하여 생발광 도는 화학발광을 검출할 수 있다. 사용될 수 있는 기타 통상의 라벨 시스템으로서는 형광 화합물, 방사성 화합물 또는 원소, 또는 면역전극이 포함된다.
이런저런 적절한 라벨 시스템은 이들을 항체 도는 펩타이드에 연결시키는 방법과 함께 당업자에게 잘 알려져 있다.
FECD와 결합할 수 없는 것으로 FIVP상의 에피토프에 특이적인 항체 또는 FIVP의 병원성 스트레인상의에피토프에 대해 특이적이지만 비병원성 스트레인의에피토프에 대해서는 특이적이지 않은 항체는 또한, 바이럭스-독성 또는, 감염세포-독성물질을 감염세포에 전달하는 표 적물로서 치료학적으로 사용될 수 있다. 치료제는, 진단용 라벨과 연결되기보다는, 바이러스의 복제기작을 무능하게 만들거나 바이러스-감염된 세포를 파괴시킬 수 있는 물질 또는 리간드에 연결된 항체를 이용한다. 독성리간드의 실체가 본 발명을 한 장하는 것은 아니다. 본원에 동정된 서열에의해 암호화된 펩타이드에 대한 바람직한 항체는 감염된 세포내로 유입하고 리간드를 세포내로 전달하는 능력에 대해 선별될 수 있다.
본원에 기술된 검정방범, PCR 프라이머, 에스-유도된 단백질, 펩타이드 및 융합단백질, 및 항체는 수의사가 사용하는 진단용키트에 효율적으로 이용될 수 있다. 본 키트는 FIVP 노출된 동물과 면역화된 동물 뿐만 아니라 비-노출된 고양이들을 상호 구별하는데 유용하며, 또한 FIVP-감염된 동물과 FECV 와 같이 혈청학적으로 연관된 바이러스에 감염된 동물들을 서로 구별하는데 유용하다. 이러한 진단용 키트는 상기된 검정법을 실행하는데 필요한 서운들을 함유한다.
따라서, 키트는 본 발명의 융합단백질 적어도 하나 또는에스 유전자 단백질 또는 펩타이드 적어도 하나 또는 PCR 프라이머쌍의 충분량, FIVP에스 단편상의 제1에피토프에 대한 mab(이 mab 는 라벨로 부착될 수 있다), 검출가능한 라벨 시스템의 임의적인 추가성분, 혈청 샘플과 단백질 샘플등을 함유하는 바이알, 및 제1효소에 인접하여 가시적인 생성물을 형성하느 제2효소에 연결된 제2mAb를 함유할 수 있다. 이러한 진단용 키트에는 기타 통상적인 성분들이 함유될 수 있다.
또한, 키트는 선택된 FIVP에스 펩타이드 또는 융합단백질, 고체 표 면에 결합되고 제1효소와 연결된 FIVP에스 펩타이드 단편에 대한 mab, 제2효소와 연결된 상이한 mab, 및 제1효소에 대한 충분량의 기질(이것은 혈청과 mab에 첨가됐을 때 제2효소에 대한 반응물을 제공하며 그결과 색변화를 일으킨다)을 함유할 수 있다.
기타 공지된 검정절차는 본 발명에 따른 진단용 키트에 대한 추가의 성분의 함유를 가리킨다. 하기 실시예는 본 발명은 상세히 설명하고자하는 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1-잠재적 항원성부위의 결정]
공개된 FIVP wsu 1146 스트레인(분양요청시 워싱턴 주립대학으로부터 입수가능함)의 아미노산 서열에 대한 잠재적 항원성부위를 결정하기 위해 쟈메슨과 볼프[Jameson and Wolf, Cabios, 4 : 181-186(1988)].에의해 개발된 컴퓨터프로그램을 이용하였다. 이 프로그램은 항원성부 우의 정확한 예보에 중요하게 작용하는 다섯가지 주요 요인이 미치는 영향을 통합하도록 고려되었다. 친수성 값은 호프와 우드[Hopp and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 : 3824-3828(1981)에 다라 측정된다. 잠재적 표 면확률은 쟈닌의 방법[Janin et al., J Mol.Biol., 125 : 357-386(1978)]에의해 주로 측정되며 최근에는에미니의 변형방법[Emini et al. J. Virol., 55 : 836-839(1985)]이 사용된다.
단백질의 골격유연성은 문헌[Karplus and Shultz, Naturwissenscfaften, 72 : 212-213(1985)]에 기술된 바와 같이 결정된 한편 단백질의 이차구조에 대한 분석은 두가지 방법에의해 산정되었다. 전체확률을 포함하도록 니시카와[Nishikava Biochem. BiopHys Acta, 748 : 285-299(1983)]에의해 변형된 쵸우와 파스만[Chou and Fasman, Adv. Enzymol., 47 : 145-147(1978)]의 연산법이 이차구조의 분석에 사용된 방법이다. 또한 가르니어[Garnier et al, J. Mol. Biol., 120 : 97-120(1978)]에의해 개발된 프로그램이 쵸우-파스만의 지지를 위해 사용되었다. 이차구조분석의 최상의 정확도는 두 개의 상이한 서브우틴이 일치하는 포인트에서 일어난다.[상기의 Jameson and Wolf].
이들 각각의 요인들을 일제히 산정하여 요약치 즉 항원성지수를 얻는다. 프로그램의 출력이에스 유전자의 아미노산 서열을 따라 직선으로 점착되었다. FIVP에스 단백질의 분성을 VMS 작동시스템하에 Vax 8800시리즈(Digital Equipment Corporation) 집단시행으로 이루어진 호스트컴퓨터로 수행하였다. 이들 프로그램은 유니버시티 오브 위스콘신 컴퓨터 그룸(GCG)패키지 인바이어론먼트[Devereux Nucleic Acids Research, 12 : 387-395(1984)]의 일부로서 용이하게 입수가능하다. WT WSU 1146 및 TGE 코로나바이러스 서열을 사용한 단백질 서열의 분석결과, FIVP에스단백질이 C 말단에 보호되어 있는 한편(유전자의 2/3), 변이가 N-말단에 집적되어 있는 것(유전자의 1/3)으로 나타났다. 컴퓨터분석에의해 파악되는 바와 같이에스 유전자의 카르복시말단에 변이가 거의 없다.
[실시예 2-올리고뉴클레오타이드 고안]
4500개 염기쌍(1452개 아미노산)의 WUS 1146에스유전자를 약 300 내지 500개 염기쌍 단편은 상술된 컴퓨터분석으로부터 결정된 하나 이상의 주 항원피크를 포함하도록 선택되었다.프라이머는 길이가 전형적으로 30 내지 40개 염기쌍이며 상향(5') 프라이머내에 Xmai 제한부위를 하향(3') 프라이머내에 stui 제한부위를 포함한다[하기표 I참조 : 서열 동정번호 : 1-18]. 이들 부위를 발현벡터내로 일정방향의 인-프레임 클로닝이 이루어지도록 프라이머내로 삽입시켰다. 또한, DNA-RNA 하이브리드를 안정화시키고 증폭이 효율적으로 일어나도록 하기 위하여 각 제한부위의 상향부에 다섯 개의 추가의 FIVP 교합 염기쌍을 첨가하였다. 올리뉴클레오타이드들은 하이브리드에 추가의 안정성이 제공되도록 비교적 높은G-C 함량(약 50%이상)을 갖도록 고안 되었다.
프라이머서열이 단지 특정영역만을 푸라이밍하고, 다른 프라이머와 프라이머 이량체 구조를 형성하지 않고, 증폭동안에 코로나바이러스 RNA/움DHK 적절한 하이브리드화를 억제할 수 있는 내부이차구조를 갖지 않음이 보잗되도록, 프라이머서열을 공개된 WSU1146 서열에 대하여 컴퓨터로 비교하였다.표 Ⅱ는 PCR 기술에의해 증폭된 FIVP에스 올리고뉴클레오타이드 프라이머(5'-3')(서열동정번호 : 1-18)를 도해한 것이다. 상기된 바와 같이 고안된 이들 프라이머는 포스포르아미다이트 방법에의해 어프라이드 바이오시스템 모델 380BDNA 합성기상에서 합성하고 사용하기 전에 21도 정제하였다. 뉴클레오타이드 6번-11번에서, 프라이머 서열동정번호 : 1-9는 Xma 부위(CCCGGG)를 함유하고 프라이머 서열동정번호 : 10-18은 STU I부위를 함유한다.
PCR 증폭을 위해 사용되었고 본 발명의 융합단백질을 유도한 프라이머들은 GALK와 융합후 정지코돈을 함유할 수 있다. 그러나, 올리고, 뉴클레오타이드의 효과적인 결합은 효과적인 PCR 프라이밍을 위해 중요하며, 이는 발현에의존하지 않으며 따라서 프라이버내에 정지코돈의 존재에의해 여향을 받지 않는다.
프라이머수준에서 뉴클레오타이드를 변형시켜 정지코돈 문제점을 해소시킬 수 있으며 몇가지 이러한 변형은 하기표 Ⅱ에 별표로 나타나 있다. 예를 들면 제2, 제3, 제5, 제6, 및 제9 5' 프라이머[서열동정번호 : 2, 3, 5, 및 9]는각각의 서열에서 별표 된 뉴클레오타이드를 결실시켜 변형시킬수 있다. 제4 및 제8 5' 프라이머[서열동정번호 : 4 및 8] 는 별표 된 뉴클레오타이드앞에 T 또는 A를 첨가하여 변형시킬 수 있다. 또한, PCR 및/또는 세균내에서의 유전자 발현의 결과로서 DNA 서열을 가하고, 결실시키고, 변경시킬 수 있다.
따라서, 모든 클론의 서열은 서열에서의 착오를 검출하도록 입증되어야 한다. 어떠한 서열의 착오도 통상의 기술을 이용한 본 분야 전문가에의해 발현클론내의 뉴클레오타이드 수준에서 교정될 수 있다.
표 2 프라이머 [서열동정번호 : 1-18]을 이용하여 PCR 데이터가 얻어졌다. 또한, 프라이머들은 이하 상세히 기술된 발현융합단백질을 제조하는데 사용되었다. 그러나, 생성된 클론증 일부는 효과적인 발현데이타를 얻도록 교정되었다.
3'[공개된 wsu 1146의 역상보서열은 stu I 부위를 함유한다.]
[실시예 3-PCR을 위한RNA 와 cDNA의 제조]
본 발명에 유용한 PCR 증폭된 단편의 제조용 주형으로서 사용된 RNA를 다음의 코로나 바이러스로부터 수득하였다. 워싱턴 주립대학으로부터 입수된 WT WSU `1146 및 FECV(WSU 1683), 캘리포니아-데이비스 대학의 앤, 페더센(N, Pedersen)으로부터 입수된 wt ucd-1, wt ucd-2 및wt ucd-4, 테네시소재의 제이. 블랙(J, BLACK)박사로부터 입수된 WT, TN 406, 및 TS DF2, WT UCD-1, WT WSU 1146, 및 WSU 1683은 매릴랜드 락빌리소재의 더 아메리칸 타입 컬렉션으로부터 입수가능한다. 다른 스트레인들은 이들 각각의 공급자에게 요청했을 때 쉽게 얻을 수 있다.
바이러스들은 다음과 같이 배양하였다. 전면성장된 노르된 노르덴 라보라토리즈 고양이신장 세포의 롤러병을 다음의 원안을 사용하여 WT DF2, WT WSU 1146 또는 FECV1683 으로 감염시켰다. WT DF-2 FIP 바이러스는 본래 고양이 체외이식조직으로부터 분리되었다.
특정의 병원체가 없는 고양이 체내로 조직 균질화물을 수회 계대시킨 후 바이어스를 감염된 일차 비장과 공동배양시켜 노르덴 라보라토리 고양이 신장(NKLF)세포를 적용시켰다.
NKLF 세포상에 39℃하에서 60회 계대시킨 후 31℃하에서 39회 계대시킨 WT DF2 FIP바이러스로부터 TS DF-2 바이러스 돌연변이체가 유도되었다.
99회 계대째 수거된 바이러스를 5분 동안 자외선 조사시킨다음 사용하기전에 문헌[Christianson et al, Arch. Virol., 109 : 185-196(1989)]에 기술된 바와 같이 플라그를 정제하였다. 성장배지를 제거하고 바이러스(MOI=0.1)를 2% FBS가 보충된 BME 50㎖중에 흡수시켰다. 바이러스를 2시간동안 흡수시킨다음 250㎖의, 성장배지를 첨가하였다.
배양물을 세포병변효과(CPE)에 대해 모니터하고 감염후 24-36시간째 수거하였다.
동일한 원안으로 TS FIVP 스트레인을 감염처리하였다. 그러나, 모든 배양은 31℃에서 수행하였다. WT TN 406, WT UCD-1 및 WT UCD-2를 유럽산 고양이 전 태야(FCWF)세포의 T150 플라스크에서 성장시켰다. 세포를 1 : 2로 나누고 50㎖의 BME+2% FBS 중에서 약10TCID의 바이러스와 함께 배양시켰다. 배양물은 CPE에 대해 모니터하고 감염후 48내지 72시간째 수거하였다.
문헌[Chirgwin, Biochemistry, 18 : 5294(1979)]의 구아니딘 이소티오시아네이트 추출법에의해 감염된 단일층으로부터 전체 세포질 RNA를 제조 하였다. 전체 RNA로부터 흡착 및 올리고 dT셀룰로즈로 부터의 배취식 용출에의해 폴리 A＋mRNA를 분리하였다. cDNA를 표 준기술에의해 전체 RNA로부터 합성하였다.
[실시예 4 : PCR 증폭]
하기 조건하에서 실시예 3의 FIVP의 CDNA에 대하여 PCR 증폭을 수행하였다. 20㎖의 1ⅹPCR 완충액(10ⅹPCR 완충액 : 100mM 트리스-HCI, 500mM KCL, 15mM Mgc12, 0.01%(W/V)젤라틴)의 최종반응 용량증에 다음의 서웁을 RNAse 배제된 규소화 500㎕ 미소원시분리튜브에 집적시켰다. : 1.0mM의 dATP, dETP, dGTP, 및 dTTP(dNTP), 20 단위의 RNAsin(Promega Corp), 100 피코물의 무작위 6량체 올리고 튜믈레오타이드(pHarmacid, TE 완충액(10mM 트리스-HCI, 1mM EDTA, pH7.5)중의 100피코몰/용액㎕), 200단위의 역전사효소(Moloney MuLV, Bethesda Research Labs) 및 상기 와 같이 분리된 1.0㎕의 개개 RNA.
피펫팅의 실수와 오염을 방지하기 위하여, 모든 용액을 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 물로 만들어졌으며 마지막에 첨가된 RNA를 제외하고 모든 반응성분으로 구성된 마스터혼합물로부터 분취시켰다. 혼합물을 프로그램과 열순환기(Perkin-Elmer Cetus) 내에서 21℃로 10분간 이어서 42℃에서 1시간 및 95℃에서 5분간 배양한 다음 pcr증폭때까지 4℃에 방치해 두었다.
cDNA 증폭은 Taq 폴리머라제를 사용하여 문헌[Saiki et al., Science, 230 : 1350-1354(1985)]의 방법에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 상기의 cDNA 반응혼합불 20㎕에 8.0㎕ 10хPCR완충액, 수증에 1㎕당 30피코물로 희석된 1.0ML의 각 상향 및 하향 프라이머 및 5.0단위의 Taq 폴리머라제(Perkin-Elmer Cetus)를 처리된 물을 사용하여 100㎕ 이하로 만들고 100㎕의 무기오일과 겹쳐두었다. 오염을 피하기 위해 마스터 혼합물을 제조하였다.
95℃에서 1분동안 변성시키고, 37℃에서 2 분동안 어닐힝시킨다음 72℃에서 40분동안 연장시키는 것을 1주기로 하여 1회 퍼킨-엘머 세투스 열순환기에서 반응을 수행하였다. 이 최초주기과정에의해 제1가닥 DNA의 합성이 증가되었다. 이어서, 95℃-1분변성, 37℃-2분어닐링, 72℃-3분 연장을 1주기로 하여 40회 반복하여 표 준 PCR 프로파일을 수행하였다.
최종연장 프로파일은 95℃-1분씩 변성, 37℃-2분 어닐링, 72℃-15분 연장으로 수행하고 분석할 때까지 4℃에 유지시켜두었다.
소량(5㎕)의 완성된 PCR 반응물을 아가로즈 겔 전기영등으로 분석하여 결정된 DNA 단편의 증폭을 확인하였다.
galk/FIVP 에스클론 58-3[서열동정번호 : 19 및 20] [제3도 참조]의 경우, ts FIVP 감염된 NLFK 세포로부터 분리된 2㎎폴림A＋mRNA를 사용하여 이중가닥 cDNA를 합성하였다. 뵈링거 만하임의 cDNA 합성키트를 제조업자의 지시내용에 따라 사용하였다. cDNA를 페놀/ 클로로포름(1 : 1)로 추출하고, 에탄올로 침강시킨다음 1.4% 알카리성 아가로즈겔상에서 크기별로 분류하였다. cDNA의 수율은 뵈링거에의해 지시된 바대로 측정하였다. PCR반응시, 100ng의 cDNA 및 100ng의 각 프라이머를 상기된 농도 [표 2 참조]로 존재하는 100㎕ 표 준반응혼합물중의 모든 4개 dNTP, MgCl2, 및 5단위 Taq 폴리머라제에 첨가하였다. 혼합물을 100㎕ 무기오일과 중첩시키고 퍼킨 엘머세투스 열순환기에서 30주기동안 배양하였다. 미주기마다 샘플 94℃에서 1분간, 37℃에서 2분간, 72℃에서 3분간 차례로 배양하였다.
5.0㎕의 혼합물을 1.2% 아가로즈겔상에서 밤새 전기영동하여 PCR 증폭된 생성물을 분석하였다. 겔을 염색하는에티디움 브로마이드 및 UV 형광에의해 밴드를 가시화되었다. 폴라로이드형 55필름이 이용된 사진은 각각의 젤레 시행된 마커에 대해 샘플거리이동 및 비교에 대해 계수 될 수 있는 네가티브를 제공하였다. 이어서, IBN AT에서 실행되는 마이크제니(Beckman)소프트웨어를 사용하여 밴드의 실제크기를 계산하였다. WT UCD-1 및 FECV로부터 WT WSU 1146또는 WT DF2를 구별하는 반응이 표 3에 하기된다.
표 3에 제시된 결과는 1번위CL에서 출발한 5' 프라이머는 WT WSU1146 및 WT DF2를 제외한 어떠한 주형으로 부터도 DNA 합성을 효율적으로 개시할 수 없음을 나타낸다. 그러나, 352번 위치에서 출발한 5' 프라이머는 모든 스트레인 주형에서 작동한다. 555번 위치에서 출발한 3' 프라이머는 제시된 모든 스트레인에 대하여 효율적으로 프라이밍한다. 894번 위치 및 1452번 위치의 각 5' 및 3' 프라이머는 WT UCD-1을 제외한 WT WSU 1146, WT DF2 및 FECV 주형으로부터 DNA합성을 프라이밍한다. 이러한 방식에 따라 고양이 코로나바이러스의 상이한 스트레인들을 구별할 수 있다.
PCR증폭의 결과는 WT DF2, TS 및 FECV 스트레인에 대한 아미노산 범위 737 내지 1452의 증폭을 보여주었다. 각 바이러스로부터 결정된 크기(2168bp)의 단편을 수득하였다.
제2의 보다작은 영역(아미노산범위 1029-1452)의 증폭은 스트레인들간에 유사성의 추가증거를 제공하였다. 결정된 크기(1290bp)의 단편을 WT DF2, 및 FECV 바이러스주형으로부터 재차 수득하였다.스트레인들간의 차이는 아미노말단내의 부위의 증폭에의해 입증될 수 있다. 결과는 WT DF2 및 TS에 대한 아미노산범위 1-748의 증폭을 보여주었다. 결정된 크기(2261bp)의 단편이 수득되었다. FECV바이러스로부터 동일한 영역을 증폭시키기 위한 반복된 시도에서 어떠한 단편도 얻지 못했다. 도한 아미노산 범위1-223의 PCR은 정확한 단편(685bp) 이 WT DF2 및 TS 스트레인에 대해 수득되었고 헥스트라단편이 FECV 바이러스에 대해 수득되었음을 입증하였다. 각각의 바이러스 스트레인에 대해 PCR에의해 제조된 다른에스유전자서열은 하기표 Ⅳ에 수록되어있다.
[실시예 5-FIVP에스영역의 클로닝]
PCR에의해 제조된 FIVP 페플로머단편의 클로닝을 위해 이. 클라이유도된 벡터pOTSKF33을 선택하였다. 크로닝절차는 상기 인용된 문헌 T. Maniatis에 기술되어있다. 제1도에 도식된 세균성발현벡터 pOTSKF33은 스미스클라인 비참 라보라토리즈에 보존되어 있으며 일반공증에 분양되고 있다.
이 플라스미드는 pBR322[Bethesda Research Laboratories]의 유도체이며 박테리오파아지 λ로부터의 저절시그날을 보유한다. 이 시스템은 조절될 수 있는 프로모터(λPL), 유전자 삽입체를 따라 효율적인 전사를 보장하는 안티종결기작, 높은 벡터안정성, 항생물질선별 및 조절서열의 유전자 하향삽입을 위한 유연성부위를 제공한다. pOTSKF33 벡터는 또한 λPL프로모터 조립한 효소 갈락토나제의 52개 아미노산의 암호서열을 함유한다. 이 효소의 서열은 융합단백질의 작제 및 외래유전자의 삽입을 허용하도록 조작되었다.
세개의 판독프레임증의 융합을 위한 제한부위를 함유한 링커, 각 단계를 위한 정지코돈 및 세 개의 판독프레임증의 융합을 위한 일부추가의 클로닝부위가 가락토키나제의 처음 52개 아미노산 이후에 도입되었다.
PL프로모터로 부터의 전사는 Cl+레프레서 단백질을 발현하는 세균내에 플라스미드를 유지시킴으로써 엄격히 통제된다. 외래단백질 발현의 유도는 레프레서를 제거함으로써 얻는다. 본 발명에서 사용된 세균 스트레인에서, 레프레서 단백질은 온도-민감성이다. 허용온도 32℃에서, 레프레서는 PL조절서열로부터 잔사를 억제시키는 작용을 한다. 성장온도를 42℃로 증가시켰을 때 레프레서가 분해되고 융합단백질의 발현이 유도된다.
일부경우에, 융합단백질은 총세균단백질의 20% 이하를 차지할 수 있다. 이들 융합단백질은 총세균단백질은 galk에 대한 모노클로날항체로 검출할 수 있다.
대표 적인 galk /FIVP에스융합단백질 58-3 [서열동정번호 : 20]의 클로닝 방법은 다음과 같다. PCR 반응혼합물로부터 중첩무기오일을 제거하고, 100㎕의 최종용량으로 하요 37℃에서 18시간동안 XmaI 및 StuI으로 분해시켰다. 분해된 DNA를 페놀 및 페놀/클로로포름(1 : 1)로 차례로 추출한 후 -20℃에서에탄올로 침강시켰다. XmaI/StuI 분해된 DNA를 XmaI/ StuI에의해 분해되고 인산화된 pOTSKF33 벡터 DNA를 함유한 연결 혼합물중에서 15℃, 하에서 24시간동안 배양하였다.
이.콜라이 HB101 세포를 형질전환시키고 미니 프렘 DNA의 제한분해에의해 삽입체-함유한 클론을 동정하였다. 이어서, 검증된 클론으로 부터의 미니 프렙 DNA를 사용하여 이.크라이의 열-유도성 AR58균주[Smithkline Beecham Laboratories]를 형질전환시켰다. AR58의 검증된 클론 저장물을 사용하여 발현분석을 위해유도된 배양물을 제조하였다. 본 분야 전문가에 알려져 있는 바와 같이 HB101 세포는 λcI857+이 아니다. 결국, 이 균주의 배양동안에 PL 프로모터가 정확히 조절되지 않을 것이다. AR120이 λcI+인 것으로 특징지워져 있기 때문에 추가의 형질 전환이 이. 콜라이 균주 AR120 대해 수행되었다.
pOTSKF33의 XmaI-StuI부위내로 클로닝된 PCR-중폭된 단편을 함유한 플라스미드느 제2도에 도시되어 있다.
galk/FIVP에스 융합단백(서열동정번호 : 20)을 함유한 클론 중 나머지는 하기 절차를 이용하여 분리하였다. 2㎕의 pcr즈폭된 반응혼합물(약 500-1000ng DNA)을 30㎕ 용량의 50mM 트리스(pH 7.5), 10mM Mgcl₂, 10mM BME 및 10㎕/㎖ BSA에서 37℃하에 밤새 Xmai 및 stui 으로 부해시켰다. 분해 반응물증 절반은 1% 저-융점 온도 아가로즈(Seakem) 겔에 적재하고 TBE에서 시행하였다. DNA단편을 상기의 문헌 [T. Maniatis et al]에 기술된 바와 같이 분리하고 용출시켰다.
요약하면, DNA 단편을에티디움 브로마이드로 염색시킨 후 가시화시키고 메스를 이용하여 겔로부터 절단해낸 다음에펜도르프 튜브에 옮겼다. 겔 슬라이스를 65℃에서 5분동안 배양하고 와동시킨 다음 5용량의 20mM 트리스(pH8.0), 1mM EDTA를 첨가하였다. 샘플을 65℃에서 추가로 2분동안 배양한 다음 페놀로1회, 페놀 : 클로로포름으로 1회 추출하였다. DNA를 1/10용량의 3M NAOAC 및 2.5용량의 냉 95% ETOH로 -20℃에서 밤새 침강시켰다. DNA 펠렛을 재현탁시키고, Xmai 및 Stui로 분해시키고 인산화시킨 pOTSKF33 플라스미드 DNA에 15℃에서 밤샘 연결시켰다.
이.콜라이 균주 AR120[Smithkline Beecham Laboratories]세포를 연결 혼합물로 형질전환시키고 엠피실린-내성 형질 전환테를 선별하였다. 클론을 미니 프렙 DNA의 Bamhi 및 Psti 분해에의해 삽입체의 존재에 대해 선별하였다. 삽입체-함유 클론으로부터의 미니 프렙 DNA를 사용하여 AS58세포를 형질전환시켰다. AR58의 검증된 클론을 사용하여 웨스턴 블릇 분석을 위해 유도된 용해물을 제조하였다.
제3도는 PCR 발현 클론 AR58-3[서열동정번호 : 뉴클레오타이드 19 및 아미노산20]을 도해한 것이다. 주형으로서 이중가닥 플라스미드를 사용하여 서열분석을 수행하였다. 작제물은 하기 서열로 구성된다. : 뉴클레오타이드 1-168은 pOTSKF33의 뉴클레오타이드 1880-2047에서 유래한 것이며 GALK의 52개 아미노산을 암호화한다. AR58-3의 뉴클레오타이드 169-181은 5개의 외래 아미노산을 암호화한다. 클론의 뉴클레오타이드 182-573은 FIVP TS의 뉴클레오타이드 356-734로부터 유래된 것이며 공개된 WSU 1146 스트레인 아미노산 97번-222번에 상응하는 128개 아미노산에스 유전자를 암호화한다. 전체 단백질은 188개 아미노산 또는 평균 아미노산 중량으로서 120을 이용한 약22, 500KD이다.
결정된 단백질 크기는 쿠마시겔과 웨스턴 블릇 모두에서 나타난 밴드와 일치하며 작용성 XmaI 및 StuI 부위를 함유한다. 한 개의 추가 아미노산이 pOTSKF33 내로 stui의 재연결 때문에 FIVP 단백질의 말단에 존재하게 된다. WSU 1146 공개된 스트레인과 비교했을 때 세 개의 염기쌍차는 명백하다. 첫 번째 차이는 제3도에서 염기번소 312번[공개된 서열의 480]에 존재한다. WSU 1146은 C를 보이는 반면에, AR58-3은 T를 나타낸다. 아미노산 변경은 없다. 두 번째 차이는 제3도의 염기번호 349[공개된 서열의 517]에 존재한다. WSU 1146은 A를 보이는 반면 AR58-3은G를 함유한다. 아미노산은 트레오닌으로부터 알라닌으로 변경되었다. 세 번째 차이는 제3도의 염기번호 399번[공개된 서열의 567번]에 존재한다. 공개된 스트레인은 T를 보이는 반면 AR58-3은C를 함유한다. 아미노산에 변경은 없다. 추가로, 두 개의 아미노산 삽입체 [TYR ILE]가 제3도에서 AR58-3의 아미노산 84 및 85번에 존재한다. 이들 아미노산은 공개된 WT WSU 1146서열에서 상등위치에서 나타나지 않는다.
[실시예 6-유도된 용해물의 웨스턴 블릇]
galk/FIVP에스 융합유전자를 함유한한 세균 클론을 웨스턴 분석에의해 발현에 대하여 선별한다.
pOTSKF33 내에에스 서열을 함유한 AR58 클론내의 융합단백질의 발현 용해물은 다음과 같이 제조하였다. 마스터 평판으로 부터의 세균 몰로니를 멸균 이쑤시개를 사용하여 3㎖의 LB+50㎕/㎖ 앰피실린(amp)에 접종하였다. 밤새 배양된 배양물 1㎖를 사용하여 250㎖엘른메이어 플라스크내의 50㎖의 새로운 LB+amp에 a650= 0.5-0.6 일때까지 접종시켰다. 이 시점에서, 1㎖의 to샘플을 취하고 65℃로 미리 가열된 1/3 용량의 lb를 첨가하여 유도하였다. 플라스크를 진탕수욕에 즉시 옮기고 42℃에서 4시간동안 배양하였다. A650값을 재차 측정하고 1.3㎖의 t4샘플을 취하였다.
세포를 펠렛화하고 샘플 완충액[0.1m DTT, 2%SDS, 80mM 트리스, pH 6.8, 10%글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루] 중에 재현탁시킨다음 20℃에서 저장하였다. 전기영동전에 샘플을 5분동안 100℃에서 끓임으로서 변성시켰다. 샘플을 와동시키고 문헌[Laemmli, Nature, 227 : 680-685(1970)]에 기술된 바와 같이 15% SDS-플리아크릴아미드겔상에 15-20㎕를 적재시켰다. 단백질을 밀리블릇장치 [BIORAD]를 이용하여 드리스/ 그리신 완충액에서 250ma, 4℃ 이하에 2시간동안 0.2㎛ 쉴라이커+슈엘 BAS/NC 니트로셀롤로즈에 옮긴다.
필터를 2%분유 1%젤라틴, TBS[20mM트리스, pH 7.5, 500mM NACI]중에서 실온하에 1시간동안 봉쇄시키고, ttbs[tbs+0.05%트윈-20]으로 세정한 다음 토끼 폴리클로날 galk 항혈청, 도는 마우스 복수중의 galk모노클로날 항체 HIV env 41 ASI[Beckman Instruments]와 함께 TTBS와 1%중의 1 : 1000 희석비로 실온에서 1시간동안 배양하였다. 필터를 TTBS중에서 3% × 10분동안 세척하고 실온하에서 1시간동안 TTBS 및 1%젤라틴중의 I125 프로테인A로 표 지시켰다. 전과같이 필터를 세척하고, 공기-건조시킨 다음 -70℃에서 여러 시간별로 XAR필름에 노출시켰다.
표 4 수개의 FIVP 에스/pOTSKF33 AR58 클론의 발현 결과를 요약한 것이다. 세균용해물을 준비하고 SDS 폴리아크릴아미드겔 상에서 시행한 다음 니트로셀롤로즈 옮기고 상술한 바와 같이 폴리클로날 및 모노클로날 galk 항혈청을 사용하여 웨스턴 블릇에의해 분석하였다. PCR 증폭을 위해 RNA를 추출한 바이러스, pOTSKF33에 클로닝된에스 아미노산 영역 및 galk/s 융합단백질의 크기가 또한 제시되고 있다.
* 아미노산 번호는 WT WSU 1146의 공개된 아미노산 서열에 상응하는 서열을 나타낸다.
표 4의 결과는 S/pOTSKF33 AR58클론의 유도된 용해물이 폴리클로날 및 모노클로날 galk 항혈청에의해 검출된 바와같은 결정된 크기의 융합단백질을 발현함을 보여준다. 융합단백질을 나타낸는 밴드는 pOTSKF33 단독의 비유도된 용해물 또는 대조 용해물에서 검출되지 않았다. 발현수준은 표 4에서 +++ 또는 ++로서 정량되고 있다. 심볼 +++는 클론 58-3에의해 생성된 발현수준에 비교될 만한 염색된 폴리아크릴아미드겔 상에서 쉽게 육안으로 파악되고 총 세포 단백질의 5내지 10%를 나타낼 수 있다. 심볼 ++는 58-3[서열동정번호 : 20]에서 생성된 것보다 적은 발현 수준을 가리킨다. 일반적으로, 이들 클론으로부터의 유합단백질은 쿠마시 블루로 염색된 용해물중에서 쉽게 파악되지 않으며 총 세포 단백질중 1-2%를 나타낸수 있다.
[실시예 7-GALK/FIVP에스 융합단백질을 발현하는 세균의 다량 배양물의 유도]
융합 플라스미드를 함유한 AR58 이.콜라이 균주의 밤새동안의 정지 배양물을 500㎖의 L육즙+100㎕/㎖의 앰피실린에 대한 접종물로서 사용하였다. 배양물을 OD이0.5-0.6에 도달할 때까지 32℃에서 배양하였다. 65℃로 미리 열처리된 L육즙중1/3용량을 첨가하고 배양온도를 42℃로 높인 후 4시간동안 추가로 성장시켰다. 세균을 원심분리[3500, 10℃, 15분]로 수거하고 100㎖H₂중에 재현탁시켰다. 리소자임 및 EDTA[각각 1% 및 200mM의 100㎖]를 세포 펠렛에 첨가하고 배양물을 빙상에서 1시간도안 배양하였다. 이어서, 배양물을 50㎖분량으로 빙상에서 6분간 음파처리[Branson sonfier]하여 세균을 완전히 마쇄시켰다. 음파처리후, 티머로실을 4℃하에 4-18시간동안 0.01 내지 0.2%의 최종농도로 첨가하여 용해물을 불활성화 시켰다. 불활성화된 물질의 분취량을 사용하여 엠피실린이 함유된 것과 함유되지 않은 LB 평판에 접종하였다. 어떠한 배양물도 24시간의 배양후에 가시적인 성장을 보여주지 못했다.
[실시예8-세균으로부터 GALK/FIVP에스 융합단백질의 가용화]
발현의유도후, 세균 용해물로부터 순수한 galk/FIVP에스 융합단백질의 분리를 위해 하기의 정체원안을 수행했다.
불활성화된 추출물 10㎖를 27000 × g에서 30q분간 원심불리시켰다(JA20). 상등액을 딸아내고 펠렛을 0.2%의 나트륨 데옥시콜릭산 및 1%의 트리톤 x-100을 가한 10㎖의 완충액a중에서 10분동안 와동시킴으로서 제현탁시켰다. 완충액A는 50mM트리스-HCl, pH 8.5, 5mM의 EDTA, 1mM의 DTT 및 5%의 글리세롤을 포함한다. 추출물을 27000 × g에서 30분간 원심분리시키고 생성된 상등액을 다시 딸아냈다. 펠렛은 트리톤 x-100(1%) 및 0.5M KCL을 포함하는 10ml의 완통액A중에 10분간 와동시킴으로서 재현탁시켰다.
원심분리후(27000 × g, 30분)후 , 펠렛은 8M 요소를 포함하는 2㎖의 완충액A중에서 10분간 와동시킴으로서 재현탁시켰다. 용액은 다시 27000 × g에서 30분간 원심분리시키고 펠렛을 딸아냈다. 상등액의 pH를 10mM의 인산나트륨 완충액을 단계적으로 가함으로서 pH를 7.4로 조절한 후 용액을 20㎖의 용적에 도달하게 했다.[최종 요소농도, 0.8m]
[실시예9-항-갈락토키나제 모노클로날 항테의 정제]
항-갈락토키나제 mAbs를 포함하는 복수를 galk 예, HIV env41 AS1[Beckman Instrument]의 처음 52아미노산에 대하여 생쥐중에서 생성시켰다.
바이신코닌산 용액 및 황산구리 용액으로 이루어진bca 단백질 검정키트[Pierce Chemica Co.]를 제조자의지시에 따라 사요하여 액체에서 단백질의 농도를 측정한다. 검정에서 구리 2+ 이온은 단백질의 존재하에서 구리 1+로 전환된다. 구리+1 이온을 그후 BCA 분자에 킬레이트시키고 비색계상 변화가 생기게 한다. 단백질의 농도가 높으며 높을수록 색깔은 더욱더 짙어진다. 단백질 농도가 562nm에서 흡광도 측정으로부터 측정한다.
90mg의 전체 단백질을 멸균된 인산염 완층 식염수[PBS], pH7.4에 가했다.황산암모늄을 45%의 최종농도에 가하는 동안 물질을 얼음상에서 교반시켰다. 얼으상에서 2시간 교반 후 4℃하 3000 × g에서 30분간 원심분리로 침전물을 수집했다. 상등액을 딸아내고 서서히 와동시키면서 펠렛을 PBS중에 재현탁시켰다. 다시 얼음상에서 서서히 교반시키는 동안 포화된 황산암모늄을 40%까지 가한다. 1시간후 앞에서 기재한 바와 같이 원심분리하여 침전물을 수집했다.
상등액을 딸아내고 와동시킴으로서 펠렛을 PBS 중에서 재현탁시켰다. mAB 혼합물을 스텍트라포 막 튜브[M.W.Cutoff 12내지 14000] [Fisher Scientific]에 가하고 4ℓ의 PBS, pH 7.4의 4회 변화에 대하여 투석시켰다. 투석체에는 19.5mg의 전체 단백질이 포함되었다.
[실시예 10-galk/FIVP에스 융합 단백질의 친화성 정제]
Immunopure Ag/Ab 고정화 키트 [Pierce Chemical Co.]를 사용하여 항-갈락토키나제 mAbs를 컬럼 매트릭스에 커플링시켰다. 10mg의 항-갈락토키나아제 abs를 제조자가 상기에서 기재한 바와 같이 Aminolink [아가로스]상에 고정시켰다. 컬럼을 4℃에서 저장했다.
융합단백질을 포함하는 컬럼 및 예비 컬럼용액 둘다를 실온으로 했다. 컬럼은 16㎖, 의 10mM인산나트륨 완충액, pH7.4로 평형화시켰다. 예비 컬럼용액은 제 부분의 5㎖ 각각으로 된 컬럼에 적요시켰다. 전체 예비컬럼 용출액을 3회에 걸쳐 컬럼에 다시 가했다.
그후 컬럼은 6㎖의 0.8M 요소로 세척한 후 10mM 인산여 완충액, pH 7.4(16mg)를 사용하여 세척했다. 결합 융합단백질은 5㎖의 0.1M 글리신, pH2.8을 가함으로서 용출시켰다. 5개의 1㎖, 짜리 분획을 수집하고 50㎕의 1n트리스-HCL, pH9.5로 중화시켰다. 컬럼은 10mM 인산나트륨 완충액, pH7.4로 다시 평형화시켰다.
갈락토키나제ELISA 친화성 컬럼 용출된 분획을 10mM 봉산여완충액, pH9.6wnddptj 1 : 100으로 희석시키고 100㎕부분을 96 웰 평판의 각 웰에 가했다. [Nunc 면역평판]. 평판을 4℃에서 하룻밤동안 배양시킨 후 실온으로 하고 0.05%의 트윈-20_PBS-트윈)을 포함하는 pbs(pH 7.4)로 1회 세척했다. 차단제(PBS+1%의 폴리비닐알콜, pva중에 있는 생쥐 항 -락락토키나제 mab(1 : 1000)을 각 웰에 가했다.
37℃ 1시간 후 평판을 PBS-트윈으로 1회 세척했다. 염소 항-생쥐 IgG퍼옥시다제 라벨이 붙은 접합체[Kirkegaad and Perry]를 PBS+1% PVA중에서 1 : 1000으로 희석시키고 100㎕의 분취량을 각웰에 가했다. 평판을 37℃에서 1시간동안 배양시킨후 PBS-트윈으로 1회 세척했다. ABTS퍼옥시다제 기질계 [Kirkegaad and Perry]의 100㎕분취량을 각 웰에 가하고 실온에서 10분간 배양후 크로모겐 반응의 강도를 Molecularv Devices Vmax 평판 기록계상의 405mM에서 측정했다.
[실시예 11-고양이 혈청을 사용한 웨스턴 분석]
융합단백질의 친유성 컬럼 용출된 분획을 Laemmli 시료 완충액으로 변성시키고 제조한 10% SDS-폴리아크릴아마이드겔 상에서 전기영동시켰다. 전기영동 후 단백질을 문헌[참조 : Towbin et al, Proc. Natl. Acad. SCI. USA, 76 : 4350-4354]의 방법에 따라 니트로셀롤로스로 전환시켰다. 니트노셀롤로스를 50mM트리스, pH 7.4, 150mM Nacl 및 5%의 탈유지 건조된 우유를 포함하는 차단용액(완충액a) 중에서 실온에서 하룻밤동안 배양시켰다. 차단 후 니트로셀롤로스를 5mm조각으로 잘라내고 각 배양 방안에 놓았다.
각 조각을 3㎖의 50mM 트리스, pH 7.4, 150mM Nacl, 0.2%트리톤 X-100 및 5% 탈유지 건조된 우유(완충액B)중에서 1 : 30으로 희석시킨 독특한 고양이 혈청을 사용하여 실온에서 1시간동안 배양시켰다. 그후 조각을 완충액a로 15분간 세척한 후 완충액B로 1회 세척했다. 완충액A중에서 1 : 1000으로 희석된 염소 항-고양이 IgG 인산효소 라벨링 붙은 접합체[Kirkegaard and Perry]를 각 방에 실온에서 1시간동안 가했다. 그 후 니트로셀롤로스 조각을 완충액B, 완충액A 및 완충액C로 2회[20mM 트리스, pH 7.4, 500mM NACL, 5%탈유지 건조된 우유]를 계속해서 세척했다.
BCIP/NBT 인산효소 기질계 [Kirkegaard and Perry]를 각 조각에 가하고 : 반응은 기질을 딸아내고 실온에서 30분후 HO로세척함으로서 정지 시켰다.
웨스턴 블릇을 수행하여 WT DF2 FIVP 또는WT WUS 1146 중의 어느 하나를 도전시킨 고양이로부터 혈청에 정제된 융합 단백질의 결합성 친화력을 측정한다. WT DF2 FIVP를 도전시킨 고양이에 대하여 다음과 같이 수행하였다 : 비증상의 HR양이 #IR03 로부터 얻은 3주후 제2 TS-FIVP 면역화된 혈청 및 4주후의 WT DF2 FIVP 도전된 혈청 : 비증상 고양이 #G26으로부터 얻은 1L-면역화된 미리 도전시킨 혈청 및 4주후 WT DF2 FIVP 도전시킨 혈청 :(mAb)항-갈락토키나제 모노클로날 항체 :(J736)S 펩타이드 접합체 난안부민-글로타르알데히드-137-151 아미노산 단편으로 면역화된 집토끼로부터 얻은 혈청 : 및(J739)S 펩타이드 접합체 오발부민-글루타르알데히드-150-180 아미노산 단편으로 염역화된 집토끼로부터 얻은 혈청.
증상을 나타내는 고양이로부터 얻은 단지 후 FIVP 도전된 혈청은 재조합 58-3[서열동정번호 : 19 및 20]로 발현된 22KD FIVP galk/S 융합단백질을 인식했다. 항-갈락토키나제 mab 및 집토끼 혈청은 양성은 억제자로서 역할을 했다.
WT WUS1146 으로 도전시킨 고양이에 관하여 다음을 수행하였다 : 비증상 고양이 #EU6으로부터 얻은 3주후 제2 TS-FIVP 면역화된 혈청 및 4주후 WT WUS 1146 FIVP 도전된 혈청 : 증상 고양이 #FW3 으로부터 얻은 3주후 제2 TS-FIVP 면역화된 혈청 및 4주후 WT WUS 1146 FIVP 도전시킨 혈청 : 비증상 고양이 #FV 로 얻은 비-면역화시킨 미리 도전된 혈청 및 4주후 WT WUS 1146 FIVP 도전된 혈청 : 증상 고양이 #PB2로부터 얻은 비-면역화된 미리 도전시킨 혈청 및 4주후 WT WSU 1146 FIVP 도전시킨 혈청 :(J736) S 펩타이드 접합체 난알부민-글루타르알데히드-137aa-151aa로 면역화된 집토끼로부터 얻은 혈청 및 단지 제2 접합된 염소-항-고양이 IgG-인산효소 항체를 획득한 대조군. 증상 고양이로부터 얻은 단지 후 FIVP 도전된 혈청은 재조합 58-3(서열동정번호 : 19 및 20)으로 발현된 22KD FIVP gakK/S 융합단백질을 인식했다. 항-갈락토키나제 mAb 및 집토끼 혈청은 양성 억제자로서 역할을 했다.
[실시예 12-다른 스트레스인의 부분 서열]
본 발명의 과정에서 다음의 완전한에스 유전자 WT DF2 FIVP의DNA 및 아미노산서열(서열동정번호 : 21 및 22, 각각), DF2-HP의 에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 23 및 24, 각각), 완전한 유전자 TS(서열동정번호 : 25 및 26, 각각), TS-BP의 에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 27및 28, 각각 ), WT TN 406의 에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 29 및 30, 각각), UCD-2의 에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 53 및 54, 각각) 및 FECV의 완전한에스 유전자(서열동정번호 : 31 및 32, 각각)을 WT WUS 1146에 관하여 실시예 1에서 기재한 바와같은 실질적으로 유사한 방법에의하여 얻었다.
제4도는 WT FIVP DF2 바이러스의 오나전한에스 유전자의 서열(서열동정번호 : 21 및22) 및 FIVP DF2-HP 바이러스의에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 23 및 24)를 제공한다. 굵은 선의 프린트는 DF2-HP의 서열이 WT DF2와 다른 위치를 나타낸다. WT DF 로 얻은 DF2-HP에서 뉴클리오타이드 변화는 별표로 된 상기 WT DF2 로 나타내고 아미노산 차이는 별표로 표시된 하기의 WT DF2 서열을 나타낸다.
제5도는 아미노산 1-748로부터 얻은TS FIVP의 완전한에스 유전자의 서열(서열동정번호 : 25 및 26) 및 TS-BP의 에스 유전자의 단편(서열동정번호 : 27 및 28)을 제공하고, 각각은 AR58-3에스 유도된 펩타이드와 유사한 서열(서열동정번호 : 20)을 포함한다. TS로부터 얻은 TS-BP서열에서의 뉴클레오타이드 차이드 별표로 표시된 상부의 TS 서열의 야생형으로 나타나고 아미노산 차이는 하기 TS서열로 유사하게 나타난다.
제3도에서 예시된 바와같은 AR58-3사이의 상동성 어떤 부위(서열동정번호 : 20) 및 TS FIVP의 서열(서열동정번호 : 25 및 26), WT DF2 FOPV(서열동정번호 : 21 및22)는 하기의 제4도 및 제5도에서 밑줄친 것으로 나타난다.
제6도는 아미노산 102내지 223으로부터 얻은 WT TN 406 FIVP(서열동정번호 : 29 및 30)의 서열을 제공한다.
제7도는 아미노산1 내지 1452로부터 얻은 FECV 바이러스의에스 유전자(서열동정번호 : 31 및 32)의 서열을 제공한다.
제8도는 아미노산 1내지 125로부터 얻은 UCD-2 바이러스의에스 유전자(서열동정번호 : 53)의 서열을 제공한다.
FIVP, 스트레인 WT WSU 1146, WT DF2, DF2-HP, TS TS-BP, WT TN406, FECV, UCD-2의 뉴클레오타이드 및 아미노산서열과에스 유전자의 뉴클레오타이드 1-2246(아미노산 1내지 748을 암호화한 것)으로부터 확장시킨 컨센스스서열의 차이는 참고로 제공된 제9도에서 예시된 켄센서스서열(서열동정번호 : 33 및 34)로 된 것이다. 컨서스서열은 아미노산 748(염기쌍 2246)을 지난 유전자의 그 부위에대하여 획득되지 않았다. 따라서 유전자가 이 포인트를 지나 서열화된 스트레인에 관하여 공개된 WT WSU 1146 서열이 참고 되어진다.
WT WSU 1146은 다음 뉴클레오타이드 변화 : 849에서 C; 2029에서 A; 1346에서 G 및 결실 : 351 - 356에 의한 컨센서스서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. WT WSU 1146은 다음 아미노산 변화 : 449에서 Gly 및 677에서 Asn 및 결시리 199 및 120을 포함한다.
WT WUS 1146은 다음 뉴클레오타이드 변화 : 849에서 C : 2029에서 A : 1346에서 G 및 결실 : 351-356에의한 컨센서스서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. WT WUS 1146 은 다음 아미노산 변화 : 449에서 GLY및 677에서 ASN을 포함한다.
게다가 WT DF2(서열동정 번호 : 21)은 다음 뉴클레오타이드 변화(상응하는 WT WSU 1146 숫자는 괄호에의한다) : 2541, 에서 C(2601에서 T) : 4121에서 C(4185에서 A) : 4210에서 C(4273에서 T) : 4330에서 T(4394에서A)에의한 공개된 wt wus 1146 서열과 다르다.
WT DF2(서열동정번호 : 22)는 다음 아미노산 차이 : 1374에서 Thr(1372에서 Asn) 및 1444에서 Tyr(1442에서 Asn)에의한 공개된 WT WUS 1146 서열과 다르다.
DF2-HP(서열동정번호 : 23)은 다음 뉴클레오타이드 변화 : 400에서 G : 1083에서 C; 849에서 T; 1346에서 G; 1791에서, C 및 2029에서 G에의한 컨 센서스서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. DF2-HP(서열동정번호 : 24)는 다음 아미노산 변화 : 134에서 Glu : 449에서 Gly 및 677에서 Asp를 포함한다.
TS(서열동정번호 : 25)는 다음 뉴클레오타이드 변화 : 90에서T : 849에서 T : 956에서 T : 1346에서 A; 1889에서 C; 1984에서 A 및 2029에서 G에의한 컨센서스서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. TS(서열동정번호 : 26)은 다음 아미노산 변화 : 319에서 Val :에서Thr : 663에서 ile : 449에서 Asp : 및 677에서 Asp를 포함한다.
게다가 TS(서열동정번호 : 25)는 다음 뉴클레오타이드 변화 : 2309에서 T(2372에서 C) : 2541에서C(2604에서 T) : 4042에서 A(4087에서 G) 및 4074에서 G(4137에서 A)에의한 공개된 WT WSU 1146 서열과 다르다. TS(서열동정번호 : 26)은 다음 아미노산 변화 : 770에서 ILE(768에서Thr) 및 1342에서 THR(1340에서 ALA)에의한 WT WUS 1146의 아미노산서열과 다르다.
TS-BP(서열동정번호 : 27)은 다음 뉴클레오타이드 변화 : 849에서 T : 1346에서 A : 2029에서 G에의한 컨센서스서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. TS-BP(서열동정번호 : 28)은 다음 아미노산 삽입물 : 449에서 ASP 및 677에서 ASP를 포함한다.
WT TN 406(서열동정번호 : 29)는 다음 뉴클레오타이드 변화 : 659에서 T에의한 컨센서스 서열(서열동정번호 : 33)과 다르다. WT TN 406(서열동정번호 : 30)은 위치 220에서 ILE로 아미노산 포함한다.
또한, WT WSU 1146 은 다음의 변화(WT WSU 1146 뉴클레오타이드는 괄호에 들어있는 FECV 뉴클레오타이드 번호와 뉴클레오타이드 앞에 나타나있다)에의해 FECV의 뉴클레오타이드서열과 상이하다.
UCD-2(셔열동정번호 : 54)는 다음 아미노산 변화 : 21 번에서 TYR, 22번에 ILE에의해 컨센서스서열의 아미노산서열과 다르다. UCD-2 핵산서열과컨센서스서열 사이에서 뉴클레오타이드 차이가 없다.다음의 일반적인 결론은 이정보로부터 유도할 수 있다.
FECV 및, WT DF2로부터 유도된 모든 바이러스는 WT, WSU 1146에스 유전자에 존재하지 않는 위치 #119 및 120에서 2 아미노산 삽입물(Tyr ile)을 포함한다. 일반적으로 그러나 WT WSU 1146 및 WT DF2유도된 스트레인 사이의 상동성은 아주 높다(99.0% 이상).
6개의 변화는 WT DF2 서열과 비교한 바와 같이 DF2-HP에스 유전자의 첫 번째 748 아미노산에서 존재한다. 대다수의 변화는 보존적이지만 몇 개(#459, #533)는 단백질 형상을 와해시킬 수 있다. DF2 HP 및 DF2 사이의 모든 아미노산 상동성은 99.0%이상 남아있다.
에스 유전자의 처음 반에서, DF2 HP의 돌연변이화는 TS FIVP에서 관찰된 5개의 아미노산 변화를 유발시킬수 있다. 또한 대다수의 변화는 원래대로 보존적이다. 그러나 위치 #630에서 아미노산 치환은 단백질 플릇 구조에서 변화를 야기시킬수 있다.
2개의 바이러스의 유사성은 99.0% 이상이다.
TS FIVP(서열동정번호 : 26) 및 TS-BP(서열동정번호 : 28)의 1-748 아미노산서열은 매우 상동적이다(99.0%이상). 그러나 TS FIVP(서열동정번호 : 26)과 TS-BP(서열동정번호 : 28)과 대조는 3개의 아미노산 변화를 나타냈다. 이들중 2개는 319번에서 발린을 알라닌으로 662번에서 이소로이신을 발린으로 보존적 변화를 나타냈다. 이들 2개의 아미노산 위치레서 플릇 구조의 조사는 이들 2개의 변화가 단백질 형상의 최소한 효과를 지닐 수 있는 것을 예시한다. 630번에서 3번째 변화는 중요하다 : TS FIVP에서 티로신으로부터 TS-BP에서 리신잔기. 이아미노산 변화가 단백질 폴링을 화해시키는 도중에 WT DF2(서열동정번호 : 22), DF2 HP(서열동정번호 : 24) 및 FECV(서열동정번호 : 32)에서 이 부위에 있는 컨센서스 아미노산은 리신이다. 이 결과는 TS BP에서 리신으로 역변화가 병원성으로 획복시키는 것과 연관되지 않는 다는 것을 제시한다.
단지 하나의 아미노산 변화(220번 트립토판에서 이소로이신)은 모두 형태Ⅱ인 다른 FIVP스트레인의 관점에서 WT TN 406 94-223의 서열중에서 관찰되었다. WT TN 406 은 형태 I 바이러스 전형적으로 고양이에서 질병을 야기시키느 하나이상의 노출이 필요하다. 예시된 TN 406서열은 뉴클레오타이드 302-671(서열동정번호 : 29) 및 아미노산 번호 102-223(서열동정번호 : 30)으로 이루어져 있다.
[실시예 13-도전연구]
FECV로부터 여러 가지 FIVP스트레인을 선택적으로 구별할 수 있을만큼 충분히 비-상동성인에스 유전자를 함유한 FIVP 및 FECV 스트레인을 좀더 동정하기 위하여, 아미노산 137-151 또는 150-180을 나타내는 합성펩타이드로 면역화된 토끼 또는 특정 고양이 코로나바이러스로 도전된 고양이로부터 혈청을 선별하였다. 이의 결과는 다음과 같다. FIVP 스트레인WT WSU 1146 또는 WT DF2로 면역화된 고양이로부터의 혈청은 웨스턴 블릇으로 검출됐을 때 FECV의 아미노산 94-223을 나타내는 융합단백질을 인지하지 않았다. 반대로, TS FIVP의 아미노산 94-223을 나타내는 융합단백질은 FECV에 감염된 고양이 혈청으로 웨스톤 블릇 탐지에서 검출되었다. 137-151번 위치에 WT WSU 1146 아미노산서열로 만든 합성 펩타이드에의해 면역화된 토끼롤부터의 혈청은 TS FIVP 만을 인지하였으며 그러나 FECV 94-223 융합단백질은 인지하지 못했다. 이러한 결과들은 94-223 융합단백질내의 137-151 아미노산과 같은 특정서열이 FECV로부터 FIVP를 구별하는데 유용할 수 있다. 하기 표 5에 도시된 바와샅이, TS FIVP 및 FECV 94-223 아미노산 융합단백질은 galk모노클로날 항체 HIV env 41 ASL[Beckman Instruments]에 의해 인지 되었다.
+/-는 웨스턴 블릇에서 고양이 혈청과의 반응성을 나타냄
*는 도전후 FIVP로 사멸한 고양이
nt는 시험되지 않았음을의미함
[실시예 14-비1상동성 서열의 항체인지]
아미노산 137-151 및 950-990번 위치(대조군)의 WT DF2/WT WUS 1146 서열로부터 맡든 합성펩타이드를 사용하여 토끼를 면역화시켰다. 하기 표 5에 도해된 바와 같이, 137-151 합성 펩타이드에 대한 항체는 WT DF2 및TS FIVP 94-223 아미노산을 나타내는 융합단백질을 인지하였으나, FECV 로부터 만든 유사한 융합단백질은 인지하지 않았다. 확인된 바에 따르면, 대조항체는 94-223 아미노산 융합단백질 어떠한 것도 인지하지 않았다.
모노클로날 galk 항체는 모든 융합단백질의 갈락토키나제 일부를 인지하였다.
웨스턴 블릇 결과에 대한 하기 도해에서, 0는 반응이 없음을 나타낸 것이며 4는 강력한 반응을 나타낸 것이다.
본 발명은 많은 변형 방법들은 본원 명세서에 포함되며 이들은 당업자에게 자명하다 할 것이다. 이러한 변형방법들은 본원에 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다.
[서열목록]
(1)일반정보 :
(ⅰ)출원인 : 스미스클라인 비참, 코프레이션
(ⅱ)발명의 명칭 : 재조합 고양이 코로나바이러스에스 단백질
(ⅲ)서열번호 : 54
(ⅳ)통신선 :
(a)주소 : 스미스클라인 비참 코포레이션
(b)가 : 스웨델랜드 로드
(c)시 : 킹 오브 프러시아
(d)주 : 펜실바니아
(e)국명 : 미합중국
(f)우편번호 : 19406-2799
(ⅴ)컴퓨터 해독형 :
(a)중간형 : 플로피 디스크
(b)컴퓨터 : ibm pc 호환중
(c)작동 시스템 : pc-dos/ms-dos
(d)소프트웨어 : patentin release #1.0 version #1.25
(ⅳ)현출원상황 :
(a)출원번호 :
(b)출원일 :
(c)분류 :
(ⅶ)선출원 상황 :
(a)출원번호 : us 07/698927
(b)출원일 : 1991.5.13.
(ⅶ)선출원상황 :
(a)출원 번호 : us 07/613, 066
(b)출원일 : 1990.11.14.
(ⅷ)대리인정보 :
(a)성명 : 윌리암 티 .킹
(b)등록번호 : 30.954
(c) 사건번호 : sbc 14532b
(ⅸ)통신안내 :
(a) 전화번호 : (215)270-5015
(b) fax번호 : (215)270-5090
(2)서열동정번호 : 1에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(a)길이 : 39개 염기쌍]
(b)유형 : 핵산
(c)가닥상태 : 이중
(d)형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형. dna(게놈)
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 1 :
(2)서열동정번호 : 2에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징;
(a)길이 : 35개 염기쌍
(b)유형 : 핵산
(c)가닥상태;단일
(d)형상 : 알려지지 않은
(ⅱ)분자형 : dna(게놈)
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 2 :
(2)서열동정번호 : 3에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(a)길이 : 35개 염기쌍
(b)유형 : 핵산
(c)가닥상태 : 단일
(d)형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : dna(게놈)
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 3 :
(2)서열동정번호 : 4에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(a)길이 : 36개 염기쌍
(b)유형 : 핵산
(c)가닥상태 : 단일
(d)형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : dna(게놈)
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 4 :
(2)서열동정번호 : 5에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(a)길이 : 39개 염기쌍
(b)유형 : 핵산
(c)가닥상태 : 단일
(d)형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 5 :
(2) 서열동정번호 : 6에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 39개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 6 :
(2) 서열동정번호 : 7에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 37개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 7 :
(2) 서열동정번호 : 8에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 37개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 8 :
(2) 서열동정번호 : 9에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 39개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 9 :
(2) 서열동정번호 : 10에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 36개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 10 :
(2) 서열동정번호 : 11에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 35개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 11 :
(2) 서열동정번호 : 12에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 36개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 12 :
(2) 서열동정번호 : 13에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 39개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 13 :
(2) 서열동정번호 : 14에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 39개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 14 :
(2) 서열동정번호 : 15에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 37개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 15 :
(2) 서열동정번호 : 16에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 37개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 16 :
(2) 서열동정번호 : 17에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 39개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 17 :
(2) 서열동정번호 : 18에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 38개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 단일
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : DNA(게놈)
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 18 :
(2) 서열동정번호 : 19에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 573개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..570
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 19 :
(2) 서열동정번호 : 20에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 190개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 20 :
(2) 서열동정번호 : 21에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 4365개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 21 :
(2)서열 동정번호 : 22에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(A) 길이 : 1454개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 22 :
(2)서열 동정번호 : 23에 대한 정보 :
(ⅰ)서열특징 :
(A) 길이 : 2246개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상탱 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..2244
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 23 :
(2) 서열동정번호 : 24에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 748개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 24 :
(2) 서열동정번호 : 25에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 4365개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..4362
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 25 :
(2) 서열동정번호 : 26에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 ; 1454개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 26 :
(2) 서열동정번호 : 27에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 2246개 아미노산
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..2244
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 27 :
(2) 서열동정번호 : 28에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 ; 748개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 28 :
(2) 서열동정번호 : 29에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 370개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 3..368
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 29 :
(2) 서열동정번호 : 30에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 122개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 30 :
(2) 서열동정번호 : 31에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 4365개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..4362
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 31 :
(2) 서열동정번호 : 32에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 1454개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(C) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 32 :
(2) 서열동정번호 : 33에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 2246개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 알려지지 않음
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..2244
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 33 :
(2) 서열동정번호 : 34에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 748개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 34 :
(2) 서열동정번호 : 35에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 27개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..27
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 35 :
(2) 서열동정번호 : 36에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 9개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 36 :
(2) 서열동정번호 : 37에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..24
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 37 :
(2) 서열동정번호 : 38에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 8개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 38 :
(2) 서열동정번호 : 39에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 18개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..18
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 39 :
(2) 서열동정번호 : 40에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 6개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 3..368
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 40 :
(2) 서열동정번호 : 41에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 150개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..150
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 41 :
(2) 서열동정번호 : 42에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 50개 아미노산
(B) 유형 아미노산
(D) 형상 직선형
(ⅱ)분자형 단백질
(xi)서열배열 서열동정번호 : 42 :
(2) 서열동정번호 : 43에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 18 개의 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : cDNA
(ⅷ)특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..18
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 43 :
(2) 서열동정번호 : 44에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 6개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ)분자형 : 단백질
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 44 :
(2) 서열동정번호 : 45에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 66개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A)성명/키 : CD
(B)위치 : 1..66
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 45 :
(2) 서열동정번호 : 46에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 22개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ) 분자형 : 단백질
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 46 :
(2) 서열동정번호 : 47에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 24개 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ) 분자형 : cDNA(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..24
(xi) 서열배열 : 서열동정번호 : 47 :
(2) 서열동정번호 : 48에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 8개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ)분자형 단백질
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 48 :
(2) 서열동정번호 : 49에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 18 개의 염기쌍
(B)유형 : 핵산
(C)가닥상태 : 이중상태
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..18
(xi)서열배열 서열동정번호 : 49 :
(2) 서열동정번호 : 50에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 6개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ)분자형 : 단백질
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 50 :
(2) 서열동정번호 : 51에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 알려지지 않음
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..24
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 51 :
(2) 서열동정번호 : 52에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 8개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ)분자형 : 단백질
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 52 :
(2) 서열동정번호 : 53에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 377 개의 염기쌍
(B) 유형 : 핵산
(C) 가닥상태 : 이중
(D) 형상 : 알려지지 않음
(ⅱ)분자형 : cDNA
(ⅸ) 특징 :
(A) 성명/키 : CDS
(B) 위치 : 1..375
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 53 :
(2) 서열동정번호 : 54에 대한 정보
(ⅰ) 서열특징 :
(A) 길이 : 125개 아미노산
(B) 유형 : 아미노산
(D) 형상 : 직선형
(ⅱ)분자형 : 단백질
(xi)서열배열 : 서열동정번호 : 54 :
Claims (17)
- (a)서열동정번호 : 20, (b)서열동정번호 : 22, (c)서열동정번호 : 24, (d)서열동정번호 : 26, (e)서열동정번호 : 28, (f)서열동정번호 : 30, (g)서열동정번호 : 32, (h)서열동정번호 : 54, 및 상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f)또는(h)에 위치적으로 상응하는 FECV S단백질의 아미노산서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 단FIVP 스트레인79-1146의 S단백질 전체 서열을 포함하지 않는 단백질.
- 제1항에 있어서, FIVP 또는 FECV S 단백질의 아미노산 1-748번, 94-223번, 97-222번 또는 121-180번을 포함한 단백질.
- (a)서열동정번호 : 36, (b)서열동정번호 : 38, (c)서열동정번호 : 40, (d)서열동정번호 : 42, (e)서열동정번호 : 44, (f)서열동정번호 : 46, (g)서열동정번호 : 48, (h)서열동정번호 : 50, 및(ⅰ) 서열동정번호52 및(j) 상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f)(g), (h) 또는(ⅰ)에 위치적으로 상응하는 FIVP S단백질의 아미노산서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고 단FIVP 스트레인79-1146의 S단백질 전체 서열을 포함하지 않으며 FIVP스트레인과 FECV를 구별할 수 있는 단백질.
- 제1항, 2항, 또는 3항에 있어서, 갈락토키나아제, β-갈락토시다제, 유비퀴틴, α 교배인자 및 인플루엔자 NS-1, 및 이들의 일부로 이루어진 그룹중에서 선택된 융합파트너에 융합되는 단백질
- 제4항에 있어서, 융합파트너가 갈락토키나제의 N-말단 52개 아미노산을 포함하는 단백질.
- (a)서열동정번호 : 19, (b)서열동정번호 : 21, (c)서열동정번호 : 23, (d)서열동정번호 : 25, (e)서열동정번호 : 27, (f)서열동정번호 : 29, (g)서열동정번호 : 31, (h)서열동정번호 : 53, (ⅰ)상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f)또는(h)에 위치적으로 상응하는 FIVP S 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및(j) 상기 서열동정번호(a)(b), (c), (d), (e), (f), (h) 또는(ⅰ)에 상응하는 FECV S 유전자의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 단 FIVP 스트레인 79-1146의 S 유전자 전체 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 DNA 분자.
- 제6항에 있어서, S 단백질 아미노산 1-748번, 94-223번, 97-222번 및 121-180번으로 이루어진 그룹중에서 선택된 펩타이드를 암호화하는 DNA분자.
- (a)서열동정번호 : 35, (b)서열동정번호 : 37, (c)서열동정번호 : 39, (d)서열동정번호 : 41, (e)서열동정번호 : 43, (f)서열동정번호 : 45, (g)서열동정번호 : 47, (h)서열동정번호 : 49, (ⅰ)서열동정번호 : 51 및(j)상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h)또는(ⅰ)에 위치적으로 상응하는 FIVP S유전자의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 단 FIVP 스트레인 79-1146의 S 유전자 전체 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않으며 FIVP 스트레인과 FECV를 구별할 수 있는 DNA 분자.
- (a)서열동정번호 : 19, (b)서열동정번호 : 21, (c)서열동정번호 : 23, (d)서열동정번호 : 25, (e)서열동정번호 : 27, (f)서열동정번호 : 29, (g)서열동정번호 : 31, (h)서열동정번호 : 53, (ⅰ)상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f), (g)또는(h)에 상응하는 FIVP S 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및(j)상기 서열동정번호(a), (b), (c), (d), (e), (f), (h)또는(ⅰ)에 위치적으로 상응하는 FECV S유전자의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편으로서 아미노산 10개 이상의 펩타이드를 암호화하고 FIVP 스트레인의 위치적으로 상응하는 단편과 FECV의 위치적으로 상응하는 단편사이에서 일치하는 95%이하의 염기쌍을 갖고 FIVP스트레인과 FECV를 구별할 수 있는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 DNA 분자.
- 제6항, 7항, 8항 또는 9항에 있어서, 갈락토키나제, β-갈락토시다제, 유비퀴틴, α교배인자 및 인플루엔자 NS-1, 및 이들의 일부로 이루어진 그룹중에서 선택된 융합파트너를 암호화한 뉴클레오타이드서열에 프레임내에서 융합돠는 DNA 분자.
- 제10항에 있어서, 융합파트너가 갈락토키나제의 N-말단 52개 아미노산을 포함하는 DNA분자.
- 서열동정번호 : 1 내지 18로 이루어진 그룹에서 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제6항 내지 11항중 어느 한 항에 따른 DNA 분자가 이의 발현을 숙주 세포에서 유도할 t수 있는 조절 뉴클레오타이드 서열과 작동적으로 연결되어 있는 재조합 발현 벡터.
- 숙주 세포를 제13항의 재조합 발현 벡터로 형질전환 시키고, 이 형질전환 된 숙주세포를 그 DNA분자에의해 암호화된 펩타이드 또는 단백질의 발현을 유도하는 조건하에서 배양하며, 발현된 펩타이드 또는 단백질을 회수함을 포함하여 고양이 코로나바이러스에의해 유발된 질병의 진단에 유용한 펩타이드 또는 단백질을 제조하는 방법.
- 제1항 내지 5항중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제56항 내지 62항중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하여 생물학적 샘플중의 고양이 코로나바이러스를 검출할 수 있는 진단제.
- 제15항에 있어서, 고양이 코로나 바이러스가 FIVP인 진단제.
- 제15항에 있어서, 고양이 코로나 바이러스가 FECV인 진단제.
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