JP2003093078A - 組換えネココロナウイルスｓ蛋白 - Google Patents

組換えネココロナウイルスｓ蛋白

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）は高致死性疾患
であり，その診断的，治療的なワクチンを提供する。 【解決手段】 ネココロナウイルスＳ遺伝子の特定のア
ミノ酸配列を含む単離ペプチドまたは蛋白を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、一般には、ネコ感染性腹膜炎ウイルス疾患の
診断および予防的治療に有用なポリペプチドに関する。
より詳しくは、本発明は新規組換えネココロナウイルス
Ｓ蛋白および融合蛋白に関する。
【０００２】発明の背景 ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、野生および家畜ネコの
双方における高致死性疾患であり、すべての年齢のネコ
が罹患しうるが若年動物に優先して発生する。ＦＩＰの
症状は、貧血、好中球増加、免疫グロブリンおよび／ま
たはフィブリノーゲンの濃度の増加、尿素およびクレア
チニンの高値により示される腎障害、および播種性血管
内凝固症候群を含むかもしれない。有効なＦＩＰＶワク
チンを開発するこれまでの試みは、大部分が成功してい
ない。伝統的な不活性化全ウイルスワクチンの投与は、
実際上、ネコにＦＩＰを発症させる傾向があり、攻撃後
より急性で急襲性の疾患を発生させる。ＦＩＰＶの非ビ
ルレント株をワクチン接種されたネコは、非免疫ネコよ
り容易に感染し、亜致死用量のビルレントＦＩＰＶで免
疫した動物は、攻撃から一貫していない防御を示した
［ペダーセン（Pedersen）およびブラック（black)、A
m. J. Vet. Res., 44:229-234(1983)］。
【０００３】また、他の抗原的に関連したコロナウイル
スでネコを免疫することも成功していない。ほとんどの
実験では、ＴＧＥＶ、ＣＣＶおよびヒトコロナウイルス
２２９Ｅの投与は、ネコを感作も防御もしない［ウッズ
（Woods）およびペダーセン（Pedersen）、Vet. Microb
iol., 4:11-16；トマ（Toma）ら、Rec. Med. Vet.,155:
788-803(1979)；バーロク（Barlough）ら、Can. J. Com
p. Med., 49:303-307(1985)；バーロク（Barlough）
ら、Lab. Anim. Sci., 34:592-597(1984)；ストッダー
ト（Stoddart）ら、Res. Vet. Sci., 45:383-388(198
8)］。 最近、鼻内投与の場合に有効でありＦＩＰＶ攻撃に際し
て安全である温度感受性ＦＩＰＶ（ＴＳ−ＦＩＰＶ）ワ
クチンが開発された［クリスチャンソン（Christianso
n）ら、Arch. Virol., 109:185-196(1989)］。皮下投与
の場合にはこのワクチンの有効性は限定されるが、同種
および異種株に対して有効であるようである。鼻内投与
では他の経路に比べて投与量を定量化できないため、一
般に鼻内投与は好ましくない。ＦＩＰＶおよび血清学的
に関連する感染に対して動物を診断、治療およびワクチ
ン接種するのに使用するために有効な診断的、治療的お
よび予防的組成物が依然として必要とされている。
【０００４】発明の概要 １つの態様においては、本発明は、ネココロナウイルス
Ｓ遺伝子の蛋白およびペプチド断片を提供する。これら
のペプチドは、組換え的または合成的に発現されてもよ
く、診断的、治療的またはワクチン的成分として有用で
ある。１つの具体例においては、該ネココロナウイルス
Ｓ由来ペプチドは、種々のＦＩＰＶ株のＳゲノムのアミ
ノ酸番号１〜約１４５４、ＦＥＣＶのＳゲノムの１〜約
１４５４の範囲、またはその中のより小さいペプチド断
片である。好ましい具体例においては、該ネココロナウ
イルスＳ由来ペプチドは、ＦＩＰＶ株のＳ遺伝子のアミ
ノ酸番号１〜約７４８またはＦＥＣＶのＳゲノムの１〜
約７４８の範囲である［配列番号３２］。特に、ＦＩＰ
ＶまたはＦＥＣＶのＳゲノムのアミノ酸番号約９４〜約
２２３の範囲のペプチドが望ましい。特に好ましい具体
例においては、ネココロナウイルスＳ由来ペプチドは、
ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶのＳゲノムのアミノ酸番号９７
〜２２２の範囲であることが判明している。さらにもう
１つの具体例においては、ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶのゲ
ノムのアミノ酸番号約１２１〜約１８０の範囲のペプチ
ドを開示する。
【０００５】本発明のペプチド断片は、診断的アッセ
イ、例えば酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ELISA）ま
たはウエスタン・ブロットに使用した場合、ＦＩＰＶお
よびＦＥＣＶ、またはＦＩＰＶの異なる株を識別する能
力を有する。また、これらのペプチドは、抗体の存在に
ついてネコ血清をスクリーニングするため、またはＦＩ
ＰＶおよびＦＥＣＶ、またはＦＩＰＶの異なる株を認識
する能力を有する抗体を生成させるために抗原として使
用してもよい。もう１つの態様においては、本発明は、
上記ペプチドをコードする、または上記ペプチドコード
化配列に隣接（flank）するヌクレオチド番号１〜約４
３６５および１〜約２２４６の範囲のＦＩＰＶおよびＦ
ＥＣＶからのヌクレオチド配列を提供する。ＰＣＲプラ
イマーまたはハイブリダイゼーション・プローブとして
診断的アッセイに使用する場合、これらのヌクレオチド
配列は、ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶのＳゲノムを識別する
能力を有する。
【０００６】本発明のもう１つの態様においては、新規
の組換えＦＩＰＶまたはＦＥＣＶのＳ融合蛋白が提供さ
れる。本発明のネココロナウイルスＳ由来ペプチドは、
Ｓペプチドの組換え発現に所望の利点を付与する選択さ
れた蛋白と融合されてもよい。例えば、融合相手は、所
望の宿主細胞系において高発現される、または高度の分
泌で特徴づけられる蛋白であってもよい。また、融合相
手は、シグナル配列または選択宿主細胞系におけるＳ由
来ペプチドの安定性を増加させる配列であってもよい。
この態様の１つの具体例においては、ネココロナウイル
スのＳ遺伝子由来のペプチドを、ガラクトキナーゼ（Ga
lK）のＮ末端の５２個のアミノ酸と融合させる。もう１
つの態様においては、本発明は、所望により検出可能な
標識と結合した、本発明のＦＩＰＶ Ｓ由来ペプチドま
たは融合蛋白よりなる診断試薬組成物を提供する。標準
的なアッセイ形態を用いてネコにおけるＦＩＰＶまたは
ＦＥＣＶの存在をアッセイするのに、かかる診断試薬を
使用してもよい。
【０００７】同様の態様においては、本発明は、本発明
のＦＩＰＶ Ｓ由来ペプチドまたは融合蛋白をコードす
るまたはこれに隣接（flanking）するヌクレオチド配列
よりなり、該ＤＮＡ配列は所望により検出可能な標識と
結合している診断試薬組成物を提供する。かかる診断試
薬は、ハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲ技
術において、ネコにおけるＦＩＰＶまたはＦＥＣＶの存
在をアッセイするのに使用してもよい。さらに本発明の
もう１つの態様においては、Ｓ由来ペプチドおよび／ま
たはＳ由来融合蛋白は、ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶによる
感染に対して動物を防御するためにワクチン中の有効成
分として使用してもよい。ワクチン組成物は、１以上の
ビルレントなネココロナウイルスに対する免疫を刺激す
る能力を有する本発明の有効量のＦＩＰＶまたはＦＥＣ
Ｖ Ｓ由来ペプチドまたは融合蛋白および内的投与に適
する担体を含む。さらにまた、これらのペプチドおよび
蛋白に対する免疫応答の特徴は、ワクチンに含まれてい
るはずのＦＩＰＶまたはＦＥＣＶ配列の他の領域を示唆
する。
【０００８】さらに別の態様においては、本発明は、治
療的有効量の本発明のＦＩＰＶまたはＦＥＣＶ Ｓ由来
のペプチドまたは融合蛋白および医薬上有効な担体より
なるＦＩＰＶまたはＦＥＣＶ感染の治療のための医薬組
成物を提供する。さらにもう１つの態様においては、本
発明は、非感染であるかまたはＦＥＣＶまたは天然ＦＩ
ＰＶにさらされているネコを識別するために獣医により
使用されてもよい診断用キットを提供する。また、該キ
ットにより、これらの疾患に対してワクチン接種されて
いるネコを識別できる。また、かかるキットにより、異
なる株のＦＩＰＶを識別でき、あるいはＦＩＰＶ感染の
進行段階にあるネコを識別できる。該キットは、Ｓ遺伝
子ヌクレオチド配列から選択された本発明のＰＣＲプラ
イマー；選択されたＦＩＰＶ Ｓ由来ペプチドまたは融
合蛋白；関連のまたは同種のウイルスのプライマー、ペ
プチドおよび融合蛋白、および下記のような「共通」配
列からの領域をコードするプライマー、ペプチドおよび
融合蛋白よりなるものであってもよい。
【０００９】さらに別の態様においては、本発明は、本
発明のＰＣＲ Ｓ由来プライマーおよび／またはＳ由来
ペプチドおよび融合蛋白を使用して、すでに暴露されて
いる、および非処理（naive）のネコを識別する、なら
びにＦＩＰＶによる暴露を他の関連コロナウイルスによ
る暴露から識別する方法を提供する。本発明のもう１つ
の診断方法では、ネコ血清中のウイルスに対する抗体を
検出するために、ELISAにおいてＳ遺伝子由来ペプチド
を使用してもよい。本発明のもう１つの態様は、有効な
ワクチン量の本発明のＳ由来ペプチドまたはＳ由来融合
蛋白を投与することにより、ＦＩＰＶによる感染に対し
て動物にワクチン接種する方法を包含する。さらに別の
態様においては、本発明は、本発明の医薬組成物を動物
に投与することにより、ＦＩＰＶ感染を治療する方法を
提供する。
【００１０】さらに本発明のもう１つの態様は、ＦＩＰ
ＶまたはＦＥＣＶまたは関連コロナウイルスエピトープ
に指向された抗体であり、この抗体はこれらのウイルス
間を識別する能力を有する。これらの抗体は、本発明の
ペプチドまたは融合蛋白を抗原として使用することによ
り生成される。また、かかる抗体は、診断的または治療
的試薬として使用されてもよく、所望により検出可能な
標識または毒素または他の治療的化合物に結合されてい
てもよい。本発明の他の態様および利点は、以下の本発
明の具体例の詳細な記載中でさらに記載する。
【００１１】発明の詳細な記載 本発明は、ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶの診断的、ワクチン
的および治療的組成物に有用な新規組成物ならびにＦＩ
Ｐの診断、予防および治療においてこれらの組成物を使
用する方法を提供する。ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶ Ｓ遺
伝子またはその部分を使用して、本発明で有用なペプチ
ドを構築することが現在好ましい。しかし、他のコロナ
ウイルスからのＳ遺伝子が、本発明で開示するのと同様
に有用であるかもしれない。公表されているＦＩＰＶ
ＷＴ ＷＳＵ１１４６株からのＳ遺伝子配列を、実施例
１に詳記するとおり、コンピューター分析により分析
し、その結果から、ウイルス株を識別しうる抗原性領域
を予想した。本発明者らは、種々の株のＦＩＰＶおよび
その姉妹ウイルス、ＦＥＣＶの間の相違がペプロマー配
列のアミノ末端半分内に位置していると予想した。アミ
ノ酸配列の異なるＳ蛋白の別個の部分を用い、血清学的
に同様のウイルス間を識別する試薬を生成させるために
ポリペプチドを使用することができるであろう。
【００１２】下記の実施例は、公表されているＦＩＰＶ
株ＷＴ ＷＳＵ１１４６［デグルート（DeGroot）ら、J.
Gen. Virol., 68: 2639-2646 (1987)］およびＷＴ Ｄ
Ｆ２、ＴＳ−ＦＩＰＶ、ＷＴ ＴＮ４０６、ＷＴ ＵＣＤ
−１およびＷＴ ＵＣＤ−２株からの新しく同定された
配列およびワクチン株ＷＴ ＦＩＰＶ ＤＦ２高継代（hi
gh passage）(ＤＦ２−ＨＰ）およびＴＳ ＦＩＰＶ Ｄ
Ｆ２戻し継代（back passage）(ＤＦ２−ＢＰ）に特に
言及している。ＷＴ ＦＩＰＶ ＤＦ２−ＨＰは、組織培
養における９９回の連続継代によりＷＴ ＤＦ２から得
た。ついで紫外線にさらすことによりＤＦ２−ＨＰに突
然変異を誘発させて、ＴＳ ＦＩＰＶウイルスを得た。
ＴＳ ＦＩＰＶウイルスの安定性を決定するために、つ
いでそれをネコおよび組織培養において５回継代してＴ
Ｓ−ＢＰ ＦＩＰＶ株を得た。ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全
なヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を特に開示する。
推定の共通配列のＤＮＡおよびアミノ酸配列もまた、本
発明のヌクレオチドおよびペプチド配列の提供に有用で
ある。本発明は、実施例で使用するＦＩＰＶ株に特に限
定されるものではない。本発明の教示によれば、他のビ
ルレントまたは非ビルレントなネコのまたは他のコロナ
ウイルス株から同じ分析をして同様の結果が得られるか
もしれない。
【００１３】未公表のまたは新しく同定されたＦＩＰＶ
またはＦＩＰＶ関連ウイルス株からの本明細書中に記載
するＳ由来ペプチドおよびＤＮＡ配列のアミノ酸および
ヌクレオチドの番号は、公表されているＷＴ ＷＳＵ１
１４６Ｓ遺伝子の番号づけと一致する。しかし、図３〜
８に記載のウイルス配列において示すとおり、また図２
６−２９の共通配列の形成により、また実施例１２で詳
記するとおり、他のウイルスにおける配列は、同定され
ている相同ＷＴ ＷＳＵ１１４６ペプチドより幾分長い
か短い。また、これらの未だ公知でないウイルス配列に
おける相同ＷＴＷＳＵ１１４６配列領域の実際のアミノ
酸の番号づけは相違する。図２６−２９の共通配列は、
人工的な配列であり、これは、ＦＩＰＶ配列ＷＴ ＷＳ
Ｕ１１４６、ＷＴ ＤＦ２、ＤＦ−２ＨＰ、ＴＳ、ＴＳ
−ＢＰ、ＷＴ ＴＮ−４０６およびＦＥＣＶの内の各々
の位置で最も普通に使用されるアミノ酸を包含する。
【００１４】ＤＮＡおよび蛋白の配列からのＦＩＰＶ株
とＦＥＣＶを識別するための候補として適当な領域が同
定され、これはＦＩＰＶ株、共通配列およびＦＥＣＶ各
々のＳ遺伝子の可変Ｎ末端半分に存在する。Ｓ遺伝子の
カルボキシ側半分からのＤＮＡおよび蛋白配列もまた、
可能なワクチン成分として同定されている。これらの領
域のすべては、常法によりクローニングおよび発現され
てもよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー
の位置を移動させて、全Ｓ遺伝子および／または該遺伝
子の別個の部分に及ぶ配列を増幅することができる。本
発明の実施においては、ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子内の特異的
部位におけるｃＤＮＡ合成のプライマーとするためにオ
リゴヌクレオチド配列を設計した。実施例２に詳記する
とおり、ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子のＤＮＡ配列に特異的なオ
リゴヌクレオチドプライマーを設計した。下記表IIは、
ヌクレオチド配列および隠されたＳ遺伝子アミノ酸配列
の部分により、５'および３'のＦＩＰＶ Ｓオリゴヌク
レオチドプライマー［それぞれ配列番号１〜９および１
０〜１８］を特に示す。Ｓ遺伝子のアミノ酸配列領域に
及ぶヌクレオチド配列を提供することに加え、表IIにお
いて特に示すプライマー［配列番号１〜１８］はまた、
選択された発現ベクターにネココロナウイルスＳ遺伝子
断片を特異的配向で導入して本発明の融合蛋白を生成さ
せるための配列を含有する。
【００１５】ネココロナウイルスＲＮＡからの断片、例
えば下記表IIのプライマー［配列番号１〜１８］をＰＣ
Ｒ増幅するための下記の最適化条件だけでなく、これら
の同一のプライマーをも、ＰＣＲ技術を用いる診断方法
において試薬として使用して、ＦＩＰＶまたはＦＩＰＶ
様ウイルスの存在を確認してもよい。これらのプライマ
ーは、ホスホラミダイト法により合成し、使用前にゲル
精製した。ついで該プライマーをポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）分析の技術［例えば、アーンハイム（Arnhei
m）ら、Chem.&Eng.News，３６−４７頁（１９９０年１
０月１日）を参照せよ。これは出典明示により本明細書
の一部とする］において使用した。ＰＣＲ技術は、遺伝
子工学の当業者に公知であり、実施例３に詳記する。Ｆ
ＩＰＶおよびＦＥＣＶペプロマー遺伝子の別個の領域を
表す付加的断片の生成にＰＣＲ技術を使用してもよい。
このように、この技術により、ネココロナウイルスの重
要な株の間での相同性または異種性の領域を表すＦＩＰ
ＶおよびＦＥＣＶ配列の単離、同定および増幅が可能と
なる。かかるＤＮＡ配列またはその断片は、感染動物の
診断および治療の双方において有用である。
【００１６】通常のアッセイ法により特異的ウイルスの
存在を検出し互いを識別する、例えば、あるネココロナ
ウイルスを他のものから、あるいはある種のコロナウイ
ルスを他のものから識別する診断的アッセイに有用な試
薬が、異種遺伝子配列の同定により提供される。また、
関連ネココロナウイルスのＰＣＲ分析から、異なる疾患
誘発特性を有するウイルス株間での相同性または非相同
性の領域についての情報が得られる。ネココロナウイル
スおよび他の関連ウイルス、例えばブタ伝染性胃腸炎ウ
イルス（ＴＧＥＶ）［ジャコブズ（Jacobs）ら、Virus
Res., 8: 363-371 (1987)］、イヌＣＣＶおよびヒト２
２９ＥのＰＣＲマッピングにより得られた情報は、他の
深く関連するコロナウイルスまたは１以上のＦＩＰＶ株
に対するワクチンの製剤化に有用である。例えば、典型
的なワクチンは、有効量の上記の相同的な増幅された配
列（これはおそらく、１種以上のコロナウイルスに有効
である）を含有していてもよい。
【００１７】簡単に言えば、ＰＣＲは、注目している２
本鎖核酸の反対の鎖に相補的である２個のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用する。それらの鎖は、ＤＮＡポ
リメラーゼにより伸張する場合、該オリゴヌクレオチド
を分離する領域に沿って合成がおこるように配向してい
る。熱変性、該プライマーのそれらの相補的配列に対す
るアニーリングおよびアニール化プライマーの温度安定
性ＤＮＡポリメラーゼによる伸張の反復的サイクルによ
り、標的遺伝子配列の何百万ものコピーが生成する。該
反応の鋳型は、ＦＩＰＶ感染細胞から単離された全ＲＮ
Ａである。ＰＣＲにより生成したＤＮＡ断片を、このＲ
ＮＡから合成したｃＤＮＡから増幅した。初期の実験で
は、該ＲＮＡを、ＦＩＰＶまたはＦＩＰＶ関連ウイルス
の以下の株から精製し調製した：ＷＴ ＦＩＰＶ ＤＦ
２、ＷＴ ＦＩＰＶ ＷＳＵ １１４６、ＴＳ ＦＩＰＶ
ＤＦ２、ＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−２、ＷＴ ＦＩＰＶ Ｔ
Ｎ４０６、ＦＥＣＶおよびＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−１。
該ＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製は以下の実施例３に詳記
する。ＦＩＰＶまたはＦＩＰＶ関連配列の他の株もま
た、同様にＰＣＲの鋳型を与える。
【００１８】ＰＣＲにより増幅されるＳ遺伝子の特異的
領域により、ネココロナウイルスおよび他の関連ウイル
スの識別が可能となる。オリゴヌクレオチドプライマー
を混合および対合させることにより、Ｓのわずか１０５
個のアミノ酸または１４５４個ものアミノ酸（完全な
Ｓ）を表す領域の合成が可能となる。かかるプライマー
を下記表IIに示す。以下の実施例４で記載するとおり、
アミノ酸番号９４〜２２３に及ぶようにＰＣＲプライマ
ーを設計し、ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子の以下の増幅された断
片（この中には該範囲の領域より短いペプチドがある）
を生成させる。現在好ましいペプチドは、ＦＩＰＶ Ｓ
ゲノム、共通配列およびＦＥＣＶゲノムのアミノ酸番号
約９４〜約２２３の範囲のものである。特に、ＦＩＰＶ
ゲノム、共通配列およびＦＥＣＶゲノムのアミノ酸番号
約９７〜約２２２のものがより好ましい。
【００１９】本発明のＦＩＰＶ株およびＦＥＣＶの特異
的に増幅された配列は、以下に挙げる領域を包含する。
ＷＴ ＤＦ２から、アミノ酸番号１−１０５、１−２２
３、１−３６２、１−５５５、１−７４８、１−１０４
０、１−１２０３、１−１４５２、９４−２２３、９４
−３６２、９４−５５５、９４−７４８、９４−１０４
０、９４−１２０３、９４−１４５２、２１３−３６
２、２１３−５５５、２１３−７４８、２１３−１０４
０、２１３−１２０３、２１３−１４５２、３５２−５
５５、３５２−７４８、５４４−７４８、５４４−９０
５、５４４−１０４０、５５４−１２０３、５５４−１
４５２、７３７−９０５、７３７−１０４０、７３７−
１２０３、７３７−１４５２、８９４−１０４０、８９
４−１２０３、８９４−１４５２，１０２９−１２０
３、１０２９−１４５２および１１９２−１４５２の範
囲の増幅領域。
【００２０】ＴＳ ＤＦ２から、アミノ酸番号１−１０
５、１−２２３、１−３６２、１−５５５、１−７４
８、１−１０４０、１−１２０３、９４−２２３、９４
−３６２、９４−５５５、９４−７４８、９４−１０４
０、９４−１２０３、９４−１４５２、２１３−３６
２、２１３−５５５、２１３−７４８、２１３−１０４
０、２１３−１２０３、２１３−１４５２、３５２−７
４８、５４４−７４８、５４４−９０５、５４４−１０
４０、５４４−１２０３、５４４−１４５２、７３７−
９０５、７３７−１０４０、７３７−１２０３、７３７
−１４５２、８９４−１０４０、８９４−１２０３、８
９４−１４５２，１０２９−１２０３、１０２９−１４
５２および１１９２−１４５２の範囲の増幅領域。
【００２１】ＦＥＣＶから、アミノ酸番号１−１０５、
１−２２３、１−３６２、９４−２２３、９４−３６
２、９４−５５５、９４−７４８、９４−１０４０、２
１３−３６２、２１３−７４８、３５２−５５５、３５
２−７４８、５４４−７４８、５４４−９０５、５４４
−１０４０、５４４−１２０３、５４４−１４５２、７
３７−９０５、７３７−１０４０、７３７−１２０３、
７３７−１４５２、８９４−１０４０、８９４−１２０
３、８９４−１４５２，１０２９−１２０３、１０２９
−１４５２および１１９２−１４５２の範囲の増幅領
域。
【００２２】ＷＴ ＷＳＵ １１４６から、アミノ酸番号
１−１０５、１−２２３、１−３６２、１−５５５、９
４−２２３、９４−３６２、９４−５５５、９４−７４
８、２１３−３６２、２１３−７４８、３５２−５５
５、３５２−７４８、５４４−７４８、５４４−９０
５、５４４−１０４０、５４４−１２０３、７３７−９
０５、７３７−１０４０、７３７−１２０３、８９４−
１０４０、８９４−１２０３、８９４−１４５２、１０
２９−１２０３、１０２９−１４５２および１１９２−
１４５２の範囲の増幅領域。
【００２３】ＷＴ ＵＣＤ−１から、アミノ酸番号９４
−２２３、９４−３６２、９４−５５５、９４−７４
８、５４４−７４８、７３７−９０５、７３７−１０４
０、７３７−１２０３、８９４−１０４０、８９４−１
２０３、１０２９−１２０３、１０２９−１４５２およ
び１１９２−１４５２の範囲の増幅領域。
【００２４】ＷＴ ＴＮ４０６から、アミノ酸番号９４
−２２３の範囲の増幅領域。ＷＴ ＵＣＤ−４から、ア
ミノ酸番号９４−２２３の範囲の増幅領域。これらの断
片の多くをクローニングし、ｇａｌＫ融合蛋白として発
現させた。それらを以下の実施例５の表IVに示す。
【００２５】同様にして、異なる株の間での相同性また
は異種性の領域を示すＰＣＲ ＤＮＡ断片を単離した。
例えば、ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶのＳゲノムのアミノ酸
番号７３７−１４５２に隣接（flankng）するＤＮＡプ
ライマーは、推定の大きさが２１６８ｂｐの断片を与え
る。ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ配列のアミノ酸番号１０２
９−１４５２に隣接（flanking）するＤＮＡプライマー
は、推定の大きさが１２９０ｂｐの断片を与える。ＤＦ
２、ＴＳおよびＦＥＣＶウイルス鋳型のそれぞれから、
これらの断片を増幅した。ＤＦ２、ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳ
−ＢＰ、ＴＳおよびＦＥＣＶから、アミノ酸番号１−７
４８の範囲のＤＮＡ断片を増幅した。また、ＷＴ ＴＮ
４０６についてのアミノ酸番号９４−２２３について、
ＤＮＡ断片を増幅した。
【００２６】プライマー化事象が適切であるにもかかわ
らず増幅させなかった特異的断片は、ＦＥＣＶについて
のアミノ酸番号１−５５５および３５２−５５５の範囲
の断片を包含する。これは、ＷＳＵ １１４６に基づく
プライマーとの異種性が疑われる領域を示す。これらの
ポリペプチドまたはそのより短い断片は、ＦＥＣＶをＦ
ＩＰＶ株から識別するのに有用である。Ｓ遺伝子配列
の、またそれによりコードされるアミノ酸配列の相同性
領域を大ざっぱに同定した後で、該配列を比較してそれ
らの相同率を求めた。一般に、核酸およびアミノ酸の相
同性が９５％未満であることは、非病原性ＦＥＣＶとビ
ルレントなＦＩＰＶとの識別が可能な診断として、該ウ
イルスのある領域が有用でありうることを示すかもしれ
ない。以下の表Ｉは、表示のＦＩＰＶ株のＳ遺伝子領域
とＦＥＣＶとの相同性を示す。これは、ＦＥＣＶおよび
ＦＩＰウイルスが、診断的および治療的用途に有用な識
別配列を得るのに十分に相違することを示す。
【００２７】表Ｉに示されている相同性はパーセント単
位であり、誤対合／非対合の塩基対またはアミノ酸の数
は括弧内に示されている。ＡＡ（Ｉ）は、完全な対合の
アミノ酸の相同性を表す。ＡＡ（Ｓ）は、エム・オー・
デイホフ（M. O. Dayhoff）「シークエンス・アンド・ア
トラス・オブ・プロテイン・ストラクチャー（Sequence
and Atlas of Protein Structure）」［ナショナル・バ
イオメディカル・リサーチ・ファンデーション（Nation
al Biomedical Research Foundation）、シルバー・スプ
リング（Silver Spring）、メリーランド（１９６
８）］の規則に基づく類似対合（similarity match）の
アミノ酸の相同性を表す。
【００２８】 表Ｉ 株１ 株２ 核酸 ＡＡ(Ｉ) ＡＡ(Ｓ) WSU FECV 92.9(159) 93.0(52) 93.0(52) DF2 FECV 93.1(154) 93.3(50) 93.3(50) DF2-HP FECV 93.0(158) 93.3(50) 93.3(50) TS FECV 92.9(160) 92.9(53) 92.9(53) TS-BP FECV 93.1(156) 93.3(50) 93.3(50) TN406 FECV 90.0(37) 86.1(17) 86.1(17)
【００２９】６個のＦＩＰコロナウイルス（ＷＴ ＤＦ
２、ＷＴ ＷＳＵ １１４６、ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳ、ＴＳ
−ＢＰおよびＷＴ ＴＮ４０６）のＦＥＣＶに対する、
また共通配列（図２６−２９）に対するヌクレオチドお
よびアミノ酸配列の比較から、全体のＦＥＣＶは、ＦＩ
ＰＶ株に対してわずか約９３.０％の相同性を共有する
にすぎないことがわかる。Ｓ遺伝子の最初の７４８個の
アミノ酸において、ＦＥＣＶと表示のＦＩＰＶ株とでは
５０個より多いアミノ酸が相違する。これらの変化の幾
つかは、ＦＩＰＶ配列の相同性領域と相違するＦＥＣＶ
配列の領域においてかたまって起こる。このようなかた
まりの領域は、ウイルスの識別のための部位を表し、Ｆ
ＩＰＶとＦＥＣＶとを識別する能力を有する診断試薬と
して、または治療剤またはワクチン剤として望ましい。
ＦＩＰＶ株の対応する領域または共通領域、すなわち、
ＦＥＣＶまたはＦＩＰＶの他の株に対するかたまりのア
ミノ酸の相違を示す領域を同様にして使用してもよい。
【００３０】ＦＥＣＶのＳ遺伝子のヌクレオチド配列
は、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプラ
イマーのための所望の配列、例えば塩基対１−１０８０
の間の配列を与える。対応するアミノ酸配列は、ＥＬＩ
ＳＡまたはウエスタン・アッセイにおいて、または血清
のスクリーニングまたは抗体の発生のための抗原として
有用なペプチドを与える（例えば、アミノ酸１−３６０
の間の配列）。かかるプローブ、プライマー、抗原およ
び抗体は、ＦＥＣＶに感染したネコの組織または血清サ
ンプルと陽性に反応するが、ＦＩＰＶ株に感染したネコ
とは陰性に反応するであろう。
【００３１】特に、ＦＥＣＶの以下の領域は、ペプチド
断片およびかかる目的のためのＤＮＡ配列の生成に特に
適切であるようである。また、ＦＩＰＶ株の対応する領
域および共通配列も同じ目的に有用である。これらのＦ
ＥＣＶ領域を以下に示す：アミノ酸残基１８−２６［配
列番号３６］、４６−５３［配列番号３８］、７３−７
８［配列番号４０］、１２４−１７４［配列番号４
２］、１４５−１５０［配列番号４４］、１３８−１５
９［配列番号４６］、１４３−１５０［配列番号４
８］、２００−２０５［配列番号５０］および５２９−
５３６［配列番号５２］および対応するヌクレオチド断
片５２−７８［配列番号３５］、１３６−１５９［配列
番号３７］、２１４−２３１［配列番号３９］、３７０
−５１９［配列番号４１］、４３３−４５０［配列番号
４３］、４１２−４７７［配列番号４５］、４２７−４
５０［配列番号４７］、５９８−６１５［配列番号４
９］および１５８５−１６０８［配列番号５１］。
【００３２】これらの領域の中のより小さなペプチド断
片またはこれらの領域を含有するより大きな断片を、生
物学的および血清学的アッセイに使用してもよい（例え
ば、長さが少なくとも１０個のアミノ酸）。最も通常の
獣医が行うアッセイのためには、好ましくは、１５個の
アミノ酸のペプチド中の少なくとも７個または８個の異
なるアミノ酸の配列が必要である［ポスツマス（Posthu
mus）ら、J. Virol. 68: 2639-2646 (1987)参照］。勿
論、遺伝子技術で、小さいペプチド中の単一のアミノ酸
変化を検出できる。また、ＰＣＲプライマーまたはハイ
ブリダイゼーションプローブとして、これらの領域中の
より小さなまたはより大きなＤＮＡ断片を用いてもよ
い。通常のＰＣＲ技術によれば、望ましくは、ＰＣＲプ
ライマー配列は、長さが１５から３０塩基であり、その
間に少なくとも１００塩基から１５００塩基もの介在配
列を有する。しかし、ＰＣＲ技術の修飾に基づき、より
大きなまたはより小さな配列長が有用でありうる可能性
がある。
【００３３】一般に、満足な識別を得るために、これら
の１以上の配列からなるプローブは、現在の技術に基づ
けば、長さが１５から５０塩基で構成される。しかし、
担体に結合しているのであれば、より短い領域を用いて
もよい。適切な担体は、卵アルブミン、キーホール・リ
ンペット・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、セファ
ロース・ビーズおよびポリデキストリン・ビーズを包含
する。ＰＣＲ増幅技術そのものを診断的手段として使用
してもよい。法廷目的のために使用されるものと同様の
方法を用いて、ＦＩＰＶに感染していると思われるネコ
からの組織または血液サンプルを、選択されたＦＩＰＶ
特異的プライマーセット（例えば、上記および表IIに開
示のＤＮＡ配列）によるＰＣＲ増幅に付すであろう。Ｄ
ＮＡの増幅は、ＦＩＰＶの存在と相互関連しているであ
ろう。ＦＩＰＶがサンプル中に存在しなければ、増幅さ
れない結果となる。同様に、特異的なＳプライマーのセ
ットの選択により、ＦＩＰＶにおいてもその個々の株の
識別が可能となるであろう。上記のとおり、ＦＩＰＶ株
に対し異種性の他の領域に対するＦＥＣＶプライマーを
使用するＦＥＣＶの診断で同様の結果が得られるかもし
れない。
【００３４】診断試薬として使用する場合、本発明のプ
ライマー、プローブおよびペプチドに、所望により、当
業者に公知の検出可能な標識または標識系を結合させて
もよい。診断的アッセイは、通常使用されるアッセイ、
例えばサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタン
・ブロット、サザーン・ブロットなどのいずれでもよ
い。ＣＣＶおよびＴＧＥＶをＦＩＰＶから識別するため
に、ＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプロー
ブあるいはペプチド診断試薬を同様に設計することがで
きるであろう。例えば、感染の疑いのある動物からのサ
ンプル組織または生物学的流体からの核酸を、ウイルス
遺伝子配列の領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ
増幅することにより、特異的ウイルスの存在を確認また
は除外してもよい。このように、感染動物について適切
な処理を選択することができる。
【００３５】本発明によるネココロナウイルスのＳ遺伝
子のヌクレオチドおよびペプチド断片は、常法、例えば
メリフィールド合成［メリフィールド（Merrifield）、
J.A.C.S., 85: 2149-2154 (1963)］により容易に合成さ
れるかもしれない。あるいは、組換え法により製造して
もよい。クローニング法は常法であり、ティー・マニア
ティス（T. Maniatis）ら、モレキュラー・クローニン
グ（Molecular Cloning）（ア・ラボラトリー・マニュ
アル（A Laboratory Manual））、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab
oratory）(１９８２)に記載されているとおりである。
ＰＣＲ中に生成した断片により決定されたＳ遺伝子配列
の部分を表す本発明の選択されたＰＣＲ由来断片を、選
択された発現ベクター中にクローニングする。Ｓ遺伝子
蛋白の生産方法に使用するベクターは、本発明の新規Ｓ
遺伝子断片ＤＮＡ配列、および選択された宿主細胞にお
けるＳ由来ペプチドの複製および発現を指令する能力を
有する、ＤＮＡコード配列と作動的に結合した選択され
た調節配列よりなる。
【００３６】上記Ｓ遺伝子ヌクレオチド配列、蛋白およ
びペプチド断片もまた、融合蛋白の形態で望ましく生成
される。かかる融合蛋白は、ペプチド断片そのものにつ
いて上記したのと同様にして合成的に生産してもよい。
しかし、本発明の融合蛋白の生産を促進するためには組
換え法が好ましい。ＰＣＲ反応で使用される選択された
プライマーセットを設計して制限エンドヌクレアーゼ開
裂部位配列を含有するＰＣＲ増幅断片を生成させ、選択
された発現ベクター中に特異的配向でネココロナウイル
スＳ遺伝子断片を導入し、本発明の融合蛋白を生産させ
てもよい。該ベクターは、Ｓ遺伝子断片がフレームで
（in frame）融合して融合蛋白を生産する所望の蛋白ま
たはその断片を含有していてもよい。
【００３７】多数の考慮に基づいて、選択されたＳ遺伝
子配列との融合蛋白を生成させるために蛋白またはペプ
チドを選択してもよい。例えば、Ｓ由来断片の融合相手
を選択してもよい。なぜなら、それは選択された宿主細
胞系で高発現され、それに融合するＳ由来配列に高い発
現レベルを付与しうるからである。以下の実施例５で詳
記するとおり、選択されたＳ遺伝子配列を、細菌におけ
るガラクトース代謝の最初の段階を触媒する細菌性酵素
であるガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）の５２個のアミノ
酸にフレームで融合することにより、本発明の選択され
た融合蛋白を生産する。この酵素の配列を巧みに処理し
て外来遺伝子の挿入および融合蛋白の構築を可能とし
た。ＧａｌＫはイー・コリ（E. coli）発現系で高発現
される。
【００３８】同様に、融合相手は、好ましいシグナル配
列、すなわち選択された宿主細胞系における増加した分
泌で特徴づけられる配列またはＳ由来ペプチドの安定性
を増加させる配列であってもよい。ガラクトキナーゼの
代わりに選択してもよい幾つかの他の典型的な融合相手
は、ユビキチンおよび酵母発現系のα交配因子、および
ベータ−ガラクトシダーゼおよび細菌系についてのイン
フルエンザＮＳ−１蛋白を包含するが、これらに限定さ
れる訳ではない。当業者は、選択された発現系について
の適切な融合相手を容易に選択することができる。本発
明は、いずれかの個々の融合相手の使用に限定されるも
のではない。
【００３９】本発明のベクターは、細菌、哺乳動物、真
菌または昆虫の細胞において、または選択されたウイル
スにおいて、Ｓ遺伝子ペプチドまたは融合蛋白を発現さ
せるように設計されてもよい。適切なベクターは、公知
の刊行物または供給者を頼って当業者に公知である。以
下の実施例の融合蛋白の構築に使用するベクターは、細
菌性ｐＢＲ３２２由来発現ベクター、ｐＯＴＳＫＦ３３
である（図１および実施例５参照）。プラスミドｐＯＴ
ＳＫＦ３３はｐＢＲ３２２の誘導体であり[ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ(Bethesda Research Laborat
ories)]、バクテリオファージ・ラムダからの調節シグ
ナルを担持している。ファージ調節情報を選択したの
は、その高い効率および被調節能による。該系は、制御
され得るプロモーター（λＰＬ）、いずれかの遺伝子挿
入配列を越える能率的な転写を保証する抗終結機構、ベ
クターの高い安定性、抗菌選択性、および調節配列の下
流のいずれかの遺伝子の挿入のための可変性部位を与え
る。ｐＯＴＳＫＦ３３の唯一の制限部位へのクローニン
グ（ＸｍａＩおよびＳｔｕＩを使用）によりガラクトキ
ナーゼ／ＦＩＰＶ Ｓペプロマー融合遺伝子が構築する
ように、Ｓ遺伝子配列ＰＣＲ断片を改変(engineer)し
た。かかる融合遺伝子の１つを図２に例示する。
【００４０】ついで、得られたＤＮＡ分子またはネココ
ロナウイルスＳ由来ペプチドまたは融合遺伝子をコード
する配列を含有するベクターを宿主細胞に導入し、異種
蛋白の発現を誘導した。本発明のＳ由来ペプチドまたは
融合蛋白の発現に使用するのに適切な細胞または細胞系
は現在のところ、細菌細胞が好ましい。例えば、バイオ
テクノロジーの分野における宿主細胞として、イー・コ
リ（E. coli.）の種々の菌株（例、ＨＢ１０１、ＭＣ１
０６１）がよく知られている。また、ビー・ズブチリス
（B. subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他
の桿菌などの種々の菌株をこの方法に使用してもよい。
【００４１】また、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ
・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ−１細胞
も、本発明の蛋白、ペプチドおよび融合蛋白の発現に使
用し得ると考えられる。他の適切な哺乳動物宿主細胞の
選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよ
び生産物生産および精製の方法は、当該分野で公知であ
る［例えば、ゲシング（Gething）およびサムブルック
（Sambrook）、Nature,293: 620-625 (1981)またはカウ
フマン(Kaufman)ら、Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1
759 (1985)またはハウリー（Howley）ら、米国特許第
４,４１９,４４６号を参照せよ］。
【００４２】また同様に、当業者に公知の多数の酵母の
菌株または他の真菌細胞が、本発明の蛋白、ペプチドお
よび融合蛋白の発現のための宿主として入手可能であ
る。酵母調節配列を用いて酵母発現ベクターを構築し
て、酵母細胞における蛋白、ペプチドまたは融合蛋白を
コードするＤＮＡを発現させ、分泌される細胞外活性阻
害剤をそれらが生成するようにする［例えば、公開ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ８６／０６６３９および欧州特許出願ＥＰ１
２３,２８９に記載されている方法を参照せよ］。昆虫
細胞もまた、組換え蛋白の発現に使用される公知の宿主
細胞であり、これをこの場合の宿主細胞として使用して
もよい。追加的発現系は、公知のウイルス発現系（例、
ワクチニア、鶏痘、豚痘）を包含してもよい。さらに、
発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択に依存すると理
解される。種々の適切な発現系が当業者に公知である。
【００４３】形質転換された宿主細胞を、適当な時間、
当業者に公知の適切な培養条件下で培養した後、該細胞
を溶菌してもよい。また、組換え蛋白を細胞外に分泌さ
せ、これを培養液から得ることも、用いる構築物に依存
して可能かもしれない。ついで、ＦＩＰＶ、ＦＥＣＶま
たは共通配列からのペプチド抗原性部位に対する、また
融合蛋白の場合には融合相手（例、イー・コリ（E. col
i.）ガラクトキナーゼ）に対する抗体、好ましくはＭＡ
ｂｓにより識別されるＳ由来ペプチドまたは融合蛋白の
存在について、細胞溶菌液または培養液をスクリーニン
グする。
【００４４】ワクチン成分、治療組成物または診断試薬
として、Ｓ由来ペプチドまたは融合ポリペプチドを含有
する粗細胞溶菌液を直接使用することができる。あるい
は、粗溶菌液または培養液から通常手段によりＳ由来ペ
プチドまたは融合蛋白を精製することができる。例え
ば、細菌溶菌液からアフィニティー・クロマトグラフィ
ーにより、ガラクトキナーゼ／ＦＩＰＶ Ｓ融合ポリペ
プチドを精製することができる。簡単に言えば、ガラク
トキナーゼに対するモノクローナル抗体でカラムを調製
する。選択されたＭＡｂｓは、該酵素の最初の５２個の
アミノ酸内のエピトープを認識する。融合蛋白を含有す
る細菌溶菌液をカラムを通して移動させながらアフィニ
ティー・マトリックス上に吸着させて、抗原−抗体複合
体を形成させる。カラムの洗浄後、酸、塩基またはカオ
トロピック剤で処理することにより、結合したｇａｌＫ
／Ｓペプロマー（ＦＩＰＶ、ＦＥＣＶまたは共通）融合
蛋白を溶出させる。ついで精製されたＳ由来ペプチドま
たは融合蛋白を、ワクチン成分または診断試薬として使
用するのがより望ましい。
【００４５】このように、ＰＣＲ増幅Ｓ遺伝子配列また
は宿主細胞におけるＳ遺伝子／融合相手ＤＮＡ配列、例
えば細菌細胞中で生産されたｇａｌＬ／ＦＩＰＶまたは
ＦＥＣＶ Ｓ断片の発現により、診断的アッセイにおい
て、または治療的およびワクチン組成物の成分として使
用し得る組換え蛋白が得られる。一例として、本発明に
より製造される精製された組換え融合蛋白、５８−３
（配列番号１９および２０、それぞれ核酸およびアミノ
酸配列）は、ＴＳ ＦＩＰＶのアミノ酸番号９７から２
２３に対応するネココロナウイルスＳ遺伝子部分を含有
する。同様に、ＦＥＣＶアミノ酸配列または本明細書中
に開示する他のＦＩＰ株のアミノ酸配列と融合蛋白を形
成させてもよい。
【００４６】このように本発明の組換え蛋白をワクチン
成分に含ませてもよい。かかるワクチン組成物は、免疫
原性量の１以上の選択されたＳ由来ペプチド、蛋白、例
えばＦＥＣＶの完全Ｓ遺伝子配列によりコードされてい
るもの、または本発明の方法で製造される融合蛋白、お
よびＦＩＰＶ感染の予防的治療用ワクチン組成物として
非経口投与に適切な担体を含有してもよい。ワクチン組
成物に使用される組換え蛋白は、１以上のＦＩＰＶ株に
対する防御免疫反応を誘導するＳ遺伝子配列を含有する
ことが好ましい。さらに、追加的抗原（例、他のコロナ
ウイルスまたは他の一般の病原体）を含むワクチン組成
物中に、本発明のＳ由来ペプチド、蛋白または融合蛋白
を用いることが望ましい。例えば、本明細書中の一部と
する１９８９年１０月３０日出願の共有の同時継続米国
特許出願第０７／４２８,７９６号［ＳＫＢ１４３９
３］に詳記されている温度感受性ＦＩＰＶワクチンにお
ける追加的抗原として、本発明のＳ由来ペプチド、蛋白
または融合蛋白を使用してもよい。あるいは、他のネコ
ワクチン組成物（例、ネコ白血病用ワクチン）に本発明
のペプチド、蛋白および融合蛋白を含ませてもよい。
【００４７】適切なｐＨ等張性、安定性および他の慣用
的性質を備えた医薬上許容されるワクチンは当技術分野
の範囲内である。かくして、最も好ましくは、かかるワ
クチンは、例えばアルミニウム水性懸濁物および水酸化
マグネシウムのごときアジュバントおよび／または担体
を含むものとする。該ワクチン組成物は、ＦＩＰに関連
する治療上の症状に対し、ワクチン処理していない動物
に用いてもよい。本発明によるワクチンを、例えば経
口、鼻腔、皮下、腹腔内または筋肉を通じて投与でき
る。好ましくは、皮下注射および鼻腔内滴下法とする。
【００４８】本発明のＳ−由来ペプチド、蛋白または融
合蛋白の量を、動物の体重、性別、身体的状態および容
態を考慮して選択する。はっきりとした副反応を起こす
ことのない免疫防衛反応を誘導するための所要量は、免
疫原として用いる組換え蛋白および付加的なアジュバン
トの存在に依存する。一般的に、個々の投与はｍＬあた
り０.１ないし１０００マイクログラムの蛋白、およ
び、好ましくは、本発明の組換え蛋白またはペプチドの
免疫原量の滅菌溶液ｍＬあたり０.１ないし１００マイ
クログラムであることが期待される。所望により、繰り
返し追加抗原注射の次に最初の投与を行ってもよい。好
ましくは、該ワクチン組成物は、ｍＬあたり少なくとも
１種ないし１０種の融合蛋白からなるものとする。本発
明のもう１つのワクチン物質は、図４−１０から図２５
に示したアンチ−センスＲＮＡ配列である。本配列は、
当業者により、化学合成あるいは組換えのいずれかによ
り容易に調製できる。適当な供給のもとで、感染動物へ
の投与に関するかかるアンチ−センスＲＮＡ配列はウイ
ルスＲＮＡに結合でき、それゆえ、細胞内でのウイルス
複製を妨げる。
【００４９】本発明は、本発明により調製されるＳ−由
来ペプチド、蛋白または融合蛋白からなる医薬組成物お
よび医薬上効果的な担体をも提供する。内服用の適当な
医薬上効果的な担体は当業者に知られている。担体の一
例として滅菌生理食塩水があげられる。該医薬組成物
は、いかなる適切な経路によっても適用されうるが、好
ましくは、鼻腔内滴下によるものとする。
【００５０】Ｓ−由来蛋白、融合蛋白あるいはペプチド
断片のみならず、上記のごとく調製したＰＣＲプライマ
ーもまた、血清認識の標的となる、組換えにより調製し
た蛋白免疫原に依存する診断分析において用いることが
できる。例えば、本発明は、所望により、前もって抗原
に暴露されたならびに無処理のネコの同定だけでなく、
ＦＩＰＶに対する暴露を他の関連するコロナウイルスと
区別するのに有用な診断試薬としてのガラクトキナーゼ
のＮ−末端の５２個のアミノ酸のごときペプチドと融合
したネコのコロナウイルスのＳ遺伝子から誘導されたペ
プチドの使用法を提供する。ＦＥＣＶおよびＦＩＰＶに
対し異なった反応性を示す他のｇａｌＫ／ＦＩＰＶ Ｓ
ペプチドまたは融合ペプチドは、ネコにおけるＦＩＰＶ
に対する暴露を検出するためのＥＬＩＳＡに基づく検索
分析におけるＦＩＰＶ−特異的試薬としても有用となり
うる。同様に、ＦＥＣＶに感染したネコ血清により、あ
るいはＦＩＰＶ陽性のネコ血清によってのみ認識される
エピトープを含むＳ−由来ペプチドあるいは融合蛋白
を、コロナウイルス感染の識別あるいは区別に用いるこ
とができる。
【００５１】１の分析形態として、精製ＦＩＰＶまたは
ＦＥＣＶ Ｓ蛋白、ペプチドあるいはｇａｌＫ／Ｓのご
とき融合ポリペプチドの、ネコの体液あるいは細胞に対
する親和反応性をウェスタン・ブロットにより分析でき
る。好ましくは、該分析を血清に用いるものとするが、
他の適当な体液あるいは例えばマクロファージまたは白
血球のごとき細胞に適用してもよい。ウェスタン・ブロ
ット法において、調製用ゲルにより分離された精製蛋白
をニトロセルロース上に移し、細断する。次いで、断片
を未感染または感染したネコの血清でプローブする。ヤ
ギ抗−ネコＩｇＧ標識アルカリホスファターゼとインキ
ュベートし、つぎに酵素基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴとインキ
ュベートすることにより該蛋白へのネコ血清の結合を検
出する。断片を水で洗浄することにより発色を停止す
る。
【００５２】本発明により調製され、実施例５から実施
例７に詳細に記載した精製組換え融合蛋白（配列番号：
２０）により、ネコ血清試料のウェスタン・ブロット検
索を行う。該組換え蛋白のネコ科コロナウイルスＳ遺伝
子部分はＴＳ ＦＩＰＶから得られ、ＴＳ ＦＩＰＶお
よび公表されたＷＳＵ １１４６株の９７番目ないし２
２３番目のアミノ酸に対応する。ネコ血清のバッテリー
でスクリーニングする場合、病気あるいはＤＦ２または
ＷＳＵ １１４６ ＦＩＰＶで死亡した猫の血清のみが
５８−３ポリペプチド（配列番号：２０）と反応する。
健康なネコはこのペプチドと反応せず、非ビルレントＦ
ＥＣＶコロナウイルス株に攻撃されたネコも反応しな
い。本発明の他のペプチドを、同様にＦＩＰＶおよびＦ
ＥＣＶ、あるいは異なった株のＦＩＰＶをを識別するの
に用いてもよい。
【００５３】融合蛋白５８−３（配列番号：２０）をＦ
ＩＰＶ疾病検出のためのＥＬＩＳＡに基づく分析に用い
てもよい。ＦＥＣＶおよびＦＩＰＶ血清に対し異なった
反応性を示す他のＳ−誘導体化ペプチドまた、融合蛋白
もネコにおけるＦＩＰＶ暴露を検出するためのＥＬＩＳ
Ａに基づく分析に有用である。典型的なＥＬＩＳＡ法の
手順は、９６穴ウェル皿への抗原（例えばｇａｌＫ／Ｓ
融合蛋白）の付着を含む。ついで、試験される血清を加
える。血清が抗原に対する抗体を有する場合、盲検とな
る。反応特異性をプレートに吸着した抗原により決定す
る。５８−３ｇａｌＫ／Ｓ融合蛋白（配列番号：２０）
で、病気またはＦＩＰＶで死亡したネコの血清のみが、
プレートに結合する。ウイルス感染した子猫あるいは感
染していないネコの血清は結合しない。
【００５４】同様に、ＦＥＣＶ感染したネコの血清ある
いはＦＩＰＶ陽性のネコの血清によってのみ認識される
エピトープを含むＳ−由来蛋白、ペプチドあるいは融合
蛋白をコロナウイルス感染の識別に用いることができ
る。１次抗体の結合後、試験される血清を持つ動物のグ
ロブリンに対する酵素標識抗体を添加する。ウェルに結
合した抗体が結合した酵素が、基質を可視形態に変換す
る。測定される色の濃さは試料物質中の抗体量に比例し
ている。この方法で、前もってＦＩＰＶ感染させたネコ
を識別でき、処理でき、ウイルス感染していないネコが
ワクチン注射により保護される。本発明はまた、例え
ば、ＦＩＰＶのごとき他のコロナウイルスとは反応しな
い、上で同定したＦＥＣＶのアミノ酸残基領域あるい
は、かかる領域を含む融合蛋白に対する抗体の開発を包
含する。１の具体例において、該抗体は、後の図３から
図２５で同定されるＤＮＡ配列の全部または一部により
コードされるＦＥＣＶ抗原部位を同定あるいは結合でき
る。かかる抗体を診断検索試験に、あるいは治療薬とし
て用いてもよい。
【００５５】上で同定される領域のペプチドあるいは本
発明の分析に有用なＦＩＰＶおよびＦＥＣＶとの識別可
能な他の領域に対する抗体は、ポリクローナルであって
よい。しかしながら、モノクローナル抗体を、本発明の
分析ならびに可能な治療および予防試薬として用いるこ
とは、標的特異性向上に関して望ましい。そのうえ、合
成的に設計されたモノクローナル抗体は既知の遺伝子工
学的技術であり［ダブリュ・ディ−・ヒューズ（W.D.Hu
se）らサイエンス（Science）、２４６：１２７５−１
２８１（１９８９）］、本明細書記載の方法に使用され
る。簡単のため、用語ＭＡＢ（ｓ）を本明細書全体を通
じて使用する。しかしながら、あるポリクローナル抗
体、特に、高い抗体価のポリクローナル抗体および組換
え抗体が使用される。
【００５６】ＭＡｂはよく知られたコーラー（Kohler）
およびミルスタイン（Milstein）法ならびにその変法に
より生成でき、先に同定された１つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基領域、あるいは他のＦＥＣＶ−コードされた
ペプチド、もしくはそれ自身および後述する実施例１２
で同定されるようなＦＩＰＶとの相違を有するエピトー
プに向けられる。例えば、ＦＩＰＶのそれとは異なる抗
原領域をコードするＦＥＣＶ配列のかかる一部は、ＭＡ
ｂを生成させる慣用的方法において抗原として存在して
もよい。ＦＥＣＶのみを認識し、ＦＩＰＶまたは他のい
かなるコロナウイルスをも認識しない抗体を分泌する細
胞系が、次いでこの用途のために同定されうる。当業者
は、本明細書中、抗原として同定されるアミノ酸残基領
域断片を用いて、およびこれらの情報を用いて、いかな
る数のＭＡｂをも生成させることができる。
【００５７】診断目的で、抗体（のみならず治療プロー
ブも）は、個々の標識に関連していてもよく、そこで１
種以上の抗体が診断法に用いられ、望ましくは、標識は
相互作用し、検出可能な信号を生じるものとする。最も
望ましくは、標識が、例えば比色法のように視覚的に検
出できるものとする。本発明の診療分析に有用な抗体に
付着させる検出可能な標識は、診断分析の当業者により
簡単に選択されるものでもある。好ましくは、視覚的に
検出できる標識は、信号の迅速性およびその読み取り簡
便性により医療への応用において有用であるものとす
る。比色検出については、種々の酵素系が、適切に作用
する技術分野において記述されている。比色酵素系は、
例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
あるいはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を包含する。
他の適当な酵素系は当業者に知られており、グルコース
−６−りん酸デヒドロゲナーゼに共役したヘキソキナー
ゼを包含する。生体蛍光または化学蛍光もまた、それぞ
れルシフェラーゼおよび基質ＮＡＤＨならびにＦＭＮに
関連したＮＡＤオキシドレダクターゼ、あるいはルミノ
ールおよび基質ペルオキシドに関連したペルオキシダー
ゼを用いて検出できる。用いることのできる他の慣用的
な標識系は蛍光化合物、放射性化合物または元素あるい
は免疫電極を包含する。これらのおよび他の適当な標識
系ならびにそれらを抗体あるいはペプチドと組み合わせ
た方法が当業者に知られている。
【００５８】ＦＥＣＶ結合能力がなく、あるいは別法と
して、ＦＩＰＶの非ビルレント株でなくビルレント株上
のエピトープに特異的な、ＦＩＰＶ上のエピトープ特異
的抗体を、標的試薬として治療的に用い、感染細胞に対
するウイルス毒性あるいは感染細胞毒性要因を供給して
もよい。診断的利用についての標識に関連してというよ
りはむしろ、治療的要因は、ウイルス複製機構をこわ
し、あるいはウイルス感染細胞を破壊する能力のある要
因またはリガンドに結合した抗体を用いる。毒性リガン
ドの同一性は本発明を限定するものではない。好ましく
は、本明細書中で同定する配列によりコードされるペプ
チドに対する抗体が、感染細胞内に入り、細胞中にリガ
ンドを供給する能力に関して検索されることが期待され
るものとする。
【００５９】本明細書記載の分析方法、ＰＣＲプライマ
ー、Ｓ−誘導体化蛋白、ペプチドおよび融合蛋白ならび
に抗体を、獣医は治療キットのアッセンブリー中で有効
に利用できる。該キットは、無処理のＦＩＰＶに暴露さ
れた動物およびワクチン投与された動物のみならず暴露
されていない動物、ならびにＦＩＰＶ感染動物およびＦ
ＥＣＶのごとき血清学的に関連のあるウイルスに感染し
た動物を識別するのに有用であろう。かかる診断キット
は、上記分析を行うのに必要な構成物品を含む。かくし
て、該キットが、本発明の少なくとも１つの融合蛋白あ
るいは少なくとも１つのＳ遺伝子蛋白またはＰＣＲプラ
イマー・ペアー、ＦＩＰＶ Ｓ断片上の１次エピトープ
に向いたＭＡｂ（そこではＭＡｂは標識されている）、
所望の付加的な検出可能な標識系の組成物、血清試料を
入れておくバイアル、蛋白試料およびそれに類する試料
ならびに１番目の酵素に近接していて、可視生成物を生
成する２番目の酵素に結合した２次ＭＡｂを含んでいて
もよい。かかる診断キットの他の構成物品を含んでいて
もよい。
【００６０】別法として、キットが、選択されたＦＩＰ
Ｖ Ｓ ペプチドまたは融合蛋白、固体表面に結合し、
１番目の酵素に関連する選択されたＦＩＰＶ Ｓ ペプ
チド断片、２番目の酵素に関連した異なるＭＡｂならび
に血清およびＭＡｂを添加すると２番目の酵素の反応物
を生じ、結果的に色の変化を引き起こす１番目の酵素の
充分量の基質を含んでいてもよい。他の知られた分析形
態は本発明による診断キットの付加的な構成物品を含む
ことを示すであろう。以下の実施例は説明のためだけの
ものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】実施例１−可能性のある抗原部位の予測 ジェイムソン（Jameson）およびウォルフ（Wolf）、カ
ビオス（Cabios）、４：１８１−１８６（１９８８）に
より開発されたコンピューター・プログラムを用い、公
表されているＦＩＰＶ ＷＳＵ １１４６株（所望なら
ワシントン州立大学から入手可能）のアミノ酸配列上の
可能性のある抗原部位の予測を行った。本プログラム
は、もともと抗原部位を正確に予測するのに重要な５つ
の主要因子の影響を組み立てるように設計されている。
ホップ（Hopp)およびウッズ(Woods)、プロシーディング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad,Sci,USA）、７８：３
８２４−３８２８（１９８１）にしたがい、親水性値を
決定した。潜在的表面確率は、主としてジャニン(Jani
n)、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol）、１２５：３５７−３８６（１９７８）
の方法により決定したが、より最近、エミニ（Emini）
らジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）５５：
８３６−８３９（１９８５）の方法によった。
【００６２】蛋白骨格の柔軟性は、カープラス（Karplu
s）およびシュルツ（Schulz）ナトゥーアウィッセンシ
ャフテン（Naturwissenschaften）７２：２１２−２１
３（１９８５）記載の方法で決定したが、蛋白２次構造
の予測は２つの方法で行った。全体の確率を含めるため
のニシカワ（Nishikawa）、バイオキム・バイオフィズ
・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、７４８：２８５−
２９９により改変されたチョウ（Chou）およびファスマ
ン（Fasman）、アドバンシズ・イン・エンザイモロジー
（Adv.Enzymol.）４７：１４５−１４７（１９７８）の
方法を蛋白２次構造の予測に用いた。そのうえ、ガーニ
ア（Garnier）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（J.Mol.Biol）、１２０：９７−１２０
（１９７８）の方法をチョウ−ファスマンの方法を支持
するために用いた。蛋白２次構造の予測の最も高度な正
確さは、２つの異なるサブルーチンが一致する点で達成
される［ジェイムソン（Jameson）およびウォルフ（Wol
f）、前記］。
【００６３】これらの因子のそれぞれをいっせいに計算
し、概略値、すなわち抗原指数を得る。Ｓ遺伝子のアミ
ノ酸配列に沿って、直線的な方法で、プログラムの出力
をプロットした。ＦＩＰＶ Ｓ 蛋白の分析は、ＶＭＳ
操作系の下でクラスターが作動するＶａｘ ８８００シ
リーズ（デジタル・イクイップメント・コーポレーショ
ン（Digital Equipment Corp.））にて行った。これら
のプログラムはウィスコンシン大学コンピューターグル
ープ（ＧＣＧ）のパッケージ・エンバイアランメントの
一部として利用できる［デベルー（Devereux）、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ（Nucleic.Acid.Researc
h）、１２：３８７−３９５（１，９８４）］。ＷＴ
ＷＳＵ １１４６およびＴＧＥを用いる蛋白配列に関す
る本分析は、ＦＩＰＶ Ｓ蛋白がＣ末端（遺伝子の２／
３）において保存されている一方で、Ｎ末端（遺伝子の
１／３）における変化が頻発していることを示した。コ
ンピューター分析により予測されたように、Ｓ遺伝子の
カルボキシ末端の変化はほとんどなかった。
【００６４】実施例２−オリゴヌクレオチドの設計 ４５００塩基対（１４５２個のアミノ酸）のＷＳＵ １
１４６ Ｓ遺伝子を約３００ないし５００塩基対の断片
に切断するために、オリゴヌクレオチドを設計した。前
記コンピューター分析により決定された１つまたはそれ
以上の抗原ピークを含むように、これらの各断片を選択
した。プライマーは長さ３０ないし４０塩基対で、その
上流（５'）プライマー中にＸｍａＩ制限部位およびそ
の下流（３'）プライマー中にＳｔｕＩ制限部位を含
む。［下記の表１参照、配列番号：１ないし１８］。こ
れらの制限部位はプライマー中に含まれており、発現ベ
クター中への方向性のあるフレーム内でのクローニング
ができる。そのうえ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを安
定化し、効率良く増幅できるように、５つの付加的なＦ
ＩＰＶ適合塩基対が各制限部位の上流に付け加えた。オ
リゴヌクレオチドは、付加的なハイブリッドの安定性を
もたらす相対的に高いＣ−Ｇ含量（約５０％またはそれ
以上）を有するように設計した。プライマー配列を、公
表されたＷＳＵ １１４６配列に対してコンピューター
で比較し、それらが特異的位置のみで始まり、たのプラ
イマーと「プライマー２量体」構造を形成せず、増幅の
間、コロナウイルスのＲＮＡ／ＤＮＡとの適切なハイブ
リダイゼーションを阻害しうる内部２次構造をもたない
ことを確認した。
【００６５】表IIは、５'から３'（配列番号：１ないし
１８）へのＰＣＲ方により増幅されたＦＩＰＶ Ｓオリ
ゴヌクレオチドプライマーを示す。上記のごとく設計さ
れたこれらのプライマーを、ホスホラミダイト法による
アプライド・バイオシステム（Applied Biosystem）３
８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置で合成し、使用前にゲルで精製
した。６番目ないし１１番目のヌクレオチドにおいて、
配列番号：１ないし９のプライマーはＸｍａ制限部位を
含み、配列番号：１０ないし１８のプライマーはＳｔｕ
Ｉ制限部位を含む。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマー
および結果生じる本発明の融合蛋白はＧａｌＫとの融合
後、停止コドンを含んでいてもよい。しかしながら、オ
リゴヌクレオチドの効果的な結合は、発現に左右され
ず、それゆえプライマー中の停止コドンの存在に影響さ
れないＰＣＲによるプライミングに必要である。
【００６６】プライマーレベルで、停止コドンの問題を
なくすために、ヌクレオチドを変化させることができ、
かかる変化を下記の表II中アステリスクで示す。例え
ば、２番目、３番目、５番目、６番目および９番目のプ
ライマー（それぞれ配列番号：２，３，５および９）
は、各配列中、アステリスク下のヌクレオチドを欠失さ
せることにより、変化させることができる。４番目およ
び８番目のプライマー（それぞれ配列番号：４および
８）は、アステリスクで示したヌクレオチドの前に、そ
れぞれ、ＴまたはＡを付加することにより、変化させる
ことができる。そのうえ、ＰＣＲの結果としておよび／
または細菌中での遺伝子発現の結果として、ＤＮＡ配列
を付加、欠失あるいは変更できる。それゆえ、配列中の
エラーを検出するためにすべてのクローン配列を確認し
なければならない。いかなる配列エラーも、慣用的な手
法を用いる当業者により、クローンの発現においてヌク
レオチドレベルで修正できる。ＰＣＲのデータに関する
かぎり、表IIのプライマー（配列番号：１ないし１８）
を用いて得られた。以下に記述の融合蛋白を発現させる
際にも、これらの同じプライマーを使用した。しかしな
がら、効果的な発現データを得るために、生じたクロー
ンのいくつかを修正した。
【００６７】
【表１】
【表２】
【００６８】実施例３−ＰＣＲ用のＲＮＡおよびｃＤＮ
Ａの調製 本発明に有用なＰＣＲ増幅された断片の生成の鋳型とし
て用いるＲＮＡを、以下のコロナウイルス株から得た：
ＷＴ ＷＳＵ １１４６およびワシントン州立大学から
のＦＥＣＶ（ＷＳＵ １６８３）、カリフォルニア−デ
イビス（Davis）大学エヌ・ペダーセン（N.Pedersen）
からのＷＴ ＵＣＤ−１、ＷＴ ＵＣＤ−２ およびＷ
Ｔ ＵＣＤ−４、テネシー州のジェイ・ブラック（J.Bl
ack）博士からのＷＴ ＴＮ４０６ならびにリンカーン
州のスミスクライン・ビーチャム・アニマル・ヘルスか
らのＷＴ ＤＦ２およびＴＳ ＤＦ２である。ＷＴ Ｕ
ＣＤ−１、ＷＴ ＷＳＵ １１４６およびＷＳＵ １６
８３はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American TypeCulture C
ollection）から入手できる。他の株はそれぞれの供給
者に希望することにより入手できる。
【００６９】以下のようにしてウイルスを培養した。ロ
ーラーびんに入れた集密的ノーデンラボラトリーズ（No
rden Laboratories）ネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞を、以
下の手順を用いてＷＴ ＤＦ２、ＷＴ ＷＳＵ １１４
６ またはＦＥＣＶ １６８３のいずれかで感染させ
た。ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰウイルスは、もともとネコ肝
臓外植片から単離されたものである。特異的病原体のな
い（ＳＰＦ）ネコの組織摩砕物で数回継代した後、感染
１次脾臓細胞とともに培養することによりウイルスをノ
ーデンラボラトリーズネコ腎臓（ＮＬＦＫ）細胞に感染
させた。ＴＳ ＤＦ−２ウイルス変異株は、３９℃でＮ
ＫＬＦ細胞上で６０回継代し、ついで、３１℃で３９回
継代したＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰウイルスから誘導され
た。９９回目の継代の際、ウイルスを集め、５分間紫外
線照射し、ついで、クリスチャンソン（Christianson）
ら、アチーブス・ウイロロジー（Arch.Virol）、１０
９：１８５−１９６（１９８９）記載の方法で使用に先
立ちプラーク精製した。 増殖培地を除去し、ウイルス
（ＭＯＩ＝０.１）を、２％ＦＢＳを添加した５０ｍｌ
のＢＭＥ中に吸着した。ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶの感染
のみ、無血清培地中で行った。ウイルスを２時間吸着
し、ついで、２５０ｍｌの増殖培地を添加した。細胞変
性効果（ＣＰＥ）について培養をモニターし、感染後２
４ないし３６時間で典型的に収穫した。
【００７０】総てのインキュベーションを３１℃で行っ
た以外は、ＴＳ ＦＩＰＶ株での感染については同様の
手順に従った。ＷＴ ＴＮ４０６、ＷＴ ＵＣＤ−１お
よびＷＴ ＵＣＤ−２をネコ胎児全細胞（ＦＣＷＦ）の
入ったＴ１５０フラスコ中で増殖させた。細胞を１：２
に分け、２％ＦＢＳを添加した５０ｍｌのＢＭＥ中の約
１０５個のＴＣＩＤ５０のウイルスに接種した。再びＣ
ＰＥについて培養をモニターし、感染後４８ないし７２
時間後典型的に収穫した。チャーグウィン（Chirgwi
n）、バイオケミストリー（Biochemistry）、１８：５
２９４（１９７９）の方法によりグアニジンイソチオシ
アネート抽出により全細胞質ＲＮＡを調製した。指示さ
れた所で、オリゴｄＴセルロースに吸着させ、ついで、
オリゴｄＴセルロースからバッチ溶出させることにより
ポリＡ＋ｍＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡをこの全ＲＮＡ
から標準的方法により合成した。
【００７１】実施例４：ＰＣＲ増幅 以下の条件で、実施例３のＦＩＰＶのｃＤＮＡについ
て、ＰＣＲ増幅を行った：最終反応体積２０μｌの１×
ＰＣＲバッファー（１０×ＰＣＲバッファー：１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ ＫＣｌ，１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，０.０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中、以
下の成分をＲＮＡａｓｅのないシリコン塗布した５００
μｌ微小遠心チューブに入れた：１.０ｍＭ ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ
ｓ），２０ユニットのＲＮＡｓｉｎ（プロメガ・コーポ
レーション（Promega Corp））、１００ピコモルのラン
ダム・ヘキサマー・オリゴヌクレオチド（ファルマシア
（Pharmacia）、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.５）中１００ピ
コモル／μｌ溶液）、２００ユニットの逆転写酵素（モ
ロニー（Ｍｏｌｏｎｙ）ＭｕＬＶ，バテスダ・リサーチ
・ラブス（Bathesda Research Labs））および１.０μ
ｇの上記のごとく単離した個々のＲＮＡである。
【００７２】ピペッティング・エラーおよびコンタミネ
ーションを避けるため、すべての溶液を、ジエチルピロ
カーボネート（ＤＥＰＣ）処理した水で調製され、最後
に添加するＲＮＡを除くすべての反応成分からなるマス
ター混合液から分取した。混合物をプログラム可能な過
熱筒（パーキン−エルマー セトス（Perkin-Elmer Cet
us））中で、２１℃で１０分、ついで４２℃で１時間そ
して９５℃で５分間、最後にＰＣＲ増幅まで４℃に保っ
た。ｃＤＮＡの増幅は、本質的にはサイキ（Saiki）
ら、サイエンス（Science）、２３０：１３５０−１３
５４（１９８５）の方法により、タック・ポリメラーゼ
を用いて行った。簡単に述べると、上記２０μｌのｃＤ
ＮＡ反応混合物に８.０μｌの１０×ＰＣＲバッファ
ー、前もって水でマイクロリットル当たり３０ピコモル
に希釈した１.０μＬ）の上流および下流の各プライマ
ーならびに５.０ユニットのタック・ポリメラーゼ（パ
ーキン−エルマー セトス）を添加する。ジエチルピロ
カーボネート（ＤＥＰＣ）処理した水を用いて、最終体
積を１００μＬとし、１００μＬの鉱物油を重層した。
上記のようにしてコンタミネーション防止のためマスタ
ー混合液を調製した。
【００７３】パーキン エルマー セトス過熱筒中で、
９５℃で１分間変性させることにより１サイクル反応を
行い、３７℃で２分間アニーリング、ついで７２℃で４
０分間伸長した。このはじめのサイクルは、最初のよじ
れたＤＮＡ合成の可能性を増大させた。ついで、標準的
なＰＣＲの輪郭を、４０サイクルについて９５℃で１分
間変性、３７℃で２分間アニーリング、７２℃で３分間
伸長することにより行った。最後の伸長の輪郭を９５℃
で１分間変性、３７℃で２分間アニーリング、７２℃で
１５分間伸長、そして分析まで４℃に保った。完結した
ＰＣＲ反応の小容量分取試料（５μｌ）を、アガロース
ゲル電気泳動により分析し、予想されるＤＮＡ断片の増
幅を確認した。ｇａｌ／ＫＦＩＰＶＳ クローン ５８
−３についてのみ、二重鎖ｃＤＮＡを、ＴＳ ＦＩＰＶ
に感染したＮＬＦＫ細胞から単離した２ｍｇのポリＡ＋
ｍＲＮＡを用いて合成した。ベーリンガー・マンハイム
（Boehringer Mannheim）のｃＤＮＡ合成キットを、製
造者の指示に従い用いた。ｃＤＮＡをフェノール／クロ
ロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈澱し、１.
４％アルカリ性アガロースゲル上にサイズ順に並べた。
ｃＤＮＡ収率をベーリンガーの指示に従い測定した。
【００７４】ついで、ＰＣＲ反応において、１００ｎｇ
のｃＤＮＡおよび１００ｎｇの各プライマーを、上記濃
度（表ＩＩ参照）の標準反応混合物中の全４種のｄＮＴ
Ｐ，ＭｇＣｌ２および５ユニットのタック・ポリメラー
ゼに添加した。該混合物に１００μｌの鉱物油を重層
し、パーキン エルマー セトス過熱筒中で、３０サイ
クルインキュベートした。それぞれの完結したサイクル
での試料の加熱は９４℃で１分間、ついで３７℃で２分
間、そして７２℃で３分間で終了した。１.２％アガロ
ースゲル上で５.０μｌの混合物を一晩電気泳動してＰ
ＣＲ増幅産物を分析した。エチジウムブロミド染色およ
び紫外線蛍光にてバンドを可視化した。ポラロイド（登
録商標）５５型フィルムを用いた写真は、試料の泳動距
離に関して計数化されうる陰性およびゲル上を移動した
マーカーに対する比較を提供した。ついで、ＩＢＭ Ａ
Ｔ上で作動するマイクロジェニー（Microgenie）（ベッ
クマン（Beckman））ソフトウェアを用いてバンドの実
際のサイズを計算した。ＷＴＵＣＤ−１およびＦＥＣＶ
からＷＴ ＷＳＵ １１４６またはＷＴ ＤＦ２を識別
する反応を下の表IIIに示す。
【００７５】 表III ＰＣＲにより区別されるＳ領域（アミノ酸） ウイルス １−５５５ ３５２−５５５ ８９４−１４５２ ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣ WT WSU 1146またはDF2 ＋ ＋ ＋ WT UCD-1 ０ ＋ ０ FECV ０ ＋ ＋ ￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣
【００７６】表IIIに示す結果は、１番目のアミノ酸か
ら始まる５'プライマーは、ＷＴ ＷＳＵ １１４６お
よびＷＴ ＤＦ２を除くいかなる鋳型からも十分にＤＮ
Ａ合成を開始する能力がないことを示している。しかし
ながら、３５２番目から始まるプライマーは、すべての
株の鋳型と反応した。５５５番目から始まる３'プライ
マーは示したすべての株について、有効に開始した。そ
れぞれ８９４番目および１４５２番目における５'およ
び３'プライマーは、ＷＴ ＷＳＵ １１４６、ＷＴ
ＤＦ２およびＦＥＣＶの鋳型からはＤＮＡ合成を開始し
たが、ＷＴ ＵＣＤ−１の鋳型からはＤＮＡ合成を開始
しなかった。この方法で、ネコ・コロナウイルスの異な
る株を識別できる。ＰＣＲ増幅の結果は、ＷＴ ＤＦ
２、ＴＳおよびＦＥＣＶ株それぞれについてアミノ酸範
囲７３７番目ないし１４５２番目の増幅を示した。予想
されるサイズ（２１６８塩基対）の断片が各ウイルスか
ら得られた。２番目あるいはより小さい領域（アミノ酸
範囲１０２９番目ないし１４５２番目）は、株間の類似
性の付加的な証拠を提供した。予想されるサイズ（１２
９０塩基対）の断片を、ＷＴＤＦ２、ＴＳおよびＦＥＣ
Ｖウイルスの鋳型から再び得た。
【００７７】株間の相違を、アミノ末端の範囲内の部位
の増幅により示すことができた。結果はＷＴ ＤＦ２お
よびＴＳに関するアミノ酸範囲１番目ないし７４８番目
の増幅を示した。予想されるサイズ（２２６１塩基対）
の断片を得た。ＦＥＣＶウイルスの同一領域を繰り返し
増幅する試みは何の断片も生じなかった。そのうえ、ア
ミノ酸範囲１番目ないし２２３番目のＰＣＲは、ＷＴ
ＤＦ２およびＴＳ株については正当な断片（６８５塩基
対）が得られるが、ＦＥＣＶウイルスについては余分な
断片が得られることを示した。各ウイルス株についてＰ
ＣＲにより得られる他のＳ遺伝子配列を下の表IVに示
す。
【００７８】実施例５−ＦＩＰＶ Ｓ領域のクローニン
グ ＰＣＲで生じたＦＩＰＶのペプロマー断片のクローニン
グ用に、大腸菌由来のベクターｐＯＴＳＫＦ３３を選択
した。クローニング操作は、上に引用したティー・マニ
アティスらの方法によった。図１に図式的に示した細菌
の発現ベクターｐＯＴＳＫＦ３３をスミスクライン・ビ
ーチャム・ライブラリーで維持し、社を通じて一般に利
用できる。本プラスミドはｐＢＲ３２２［バテスダ・リ
サーチ・ラボラトリー］の誘導体で、ラムダバクテリオ
ファージの調節シグナルを有している。本系は、調節さ
れたプロモーター（λＰＬ）およびいかなる挿入遺伝子
をも越えて有効に転写することを保証するアンチターミ
ネーション機構、高いベクター安定性ならびに調節配列
下流のいかなり遺伝子挿入に関しても柔軟な部位を提供
する。ｐＯＴＳＫＦ３３ベクターも酵素ガラクトキナー
ゼの５２個のアミノ酸に関するコーディング配列をλＰ
Ｌプロモーターのごく近傍に有している。本酵素配列を
操作し、外来遺伝子を挿入し、融合蛋白を生成するよう
にした。
【００７９】３つのリーディング・フレームのいずれに
おいても融合用の制限酵素切断部位、各フェーズに関す
る停止コドン、３つのリーディング・フレームのいずれ
においても融合用のクローニング部位を含むリンカーを
ガラクトキナーゼの初めの５２個のアミノ酸について誘
導した。ＰＬプロモーターからの転写は、ｃＩ＋リプレ
ッサー蛋白を発現する細菌中のプラスミドを維持するこ
とにより、強力に調節される。外来蛋白の発現誘導はリ
プレッサーを除去することにより達成される。本研究に
使用した細菌株において、リプレッサー蛋白は温度感受
性である。許容温度３２℃では、リプレッサーは、通常
はＰＬ調節配列からの転写を阻害するように機能する。
増殖温度（４２℃）に上昇すると、リプレッサーの破壊
が起こり、融合ポリペプチドの発現が誘導される。
【００８０】いくつかの場合、融合蛋白が全細菌蛋白の
２０％以上をしめる。ｇａｌＫに対するモノクローナル
抗体によりこれらの融合蛋白を検出できる。ｇａｌＫ／
ＦＩＰＶ Ｓ融合蛋白５８−３（配列番号：２０）のク
ローニング法を以下に説明する。重層した鉱物油をＰＣ
Ｒ反応混合物から除去し、最終体積３００μｌ中で１０
０μｌのＤＮＡフラクションをＸｍａＩおよびＳｔｕＩ
で３７℃、１８時間切断する。切断したＤＮＡをまず、
フェノールで、ついでフェノール／クロロホルム（１：
１）で抽出し、−２０℃でエタノール沈澱した。Ｘｍａ
Ｉ／ＳｔｕＩにより切断したＤＮＡを、ＸｍａＩ／Ｓｔ
ｕＩにより切断し、ホスファターゼ処理したｐＯＴＳＫ
Ｆ３３ベクターを含むライゲーション混合物中で、１５
℃、２４時間インキュベートした。
【００８１】大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質転換し、挿入
部分を持つクローンを少量のＤＮＡの制限酵素切断によ
同定した。ついで、確認されたクローンからの少量のＤ
ＮＡを熱誘導性大腸菌ＡＲ５８株［スミスクライン・ビ
ーチャムラボラトリー］の形質転換に用いた。ＡＲ５８
中の確認されたクローンを発現分析のための誘導培養調
製に用いた。当業者に知られているように、ＨＢ１０１
細胞は、通常はラムダｃＩ８５７＋でない。結果とし
て、本菌の増殖培養中、ＰＬプロモーターが、うまく調
節しないことになる。大腸菌ＡＲ１２０株中で付加的な
形質転換が行われる。なぜならＡＲ１２０株は、完全に
ラムダｃＩ＋であるからである。ｐＯＴＳＫＦ３３のＸ
ｍａＩ−ＳｔｕＩ部位中にクローンされたＰＣＲで増幅
した断片を有するプラスミドを図２で説明する。ｇａｌ
Ｋ／ＦＩＰＶ Ｓ融合蛋白（配列番号：２０）を含むク
ローンの残りの部分を以下の手順で単離した。２μｌの
選択したＰＣＲ増幅した反応混合物（約５００−１００
０ｎｇＤＮＡ）を、３０μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐ
Ｈ７.５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ ＢＭＥお
よび１０μｇ／ｍｌＢＳＡ中、３７℃で、ＸｍａＩおよ
びＳｔｕＩにより切断した。反応液の半分を１％低融点
アガロース（シーケム（Seakem））に負荷し、ＴＢＥ中
で泳動した。ＤＮＡ断片を単離し、先に引用のティー・
マニアティスらの方法により溶出した。
【００８２】簡単に説明すると、ＤＮＡ断片をエチジウ
ムブロミド染色により可視化し、薬さじでゲルから切り
出し、エッペンドルフ・チューブに移した。ゲル断片を
５分間６５℃でインキュベートし、ボルテックスで撹拌
し、５倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８.０，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを添加した。試料をさらに２分間６５℃で
インキュベートし、ついでフェノールで１回、フェノー
ル：クロロホルムで１回抽出した。１/１０倍容の３Ｍ
ＮａＯＡｃおよび２.５倍容の９５％エタノールで−
２０℃で沈澱させた。ペレット化したＤＮＡを懸濁し、
ＸｍａＩおよびＳｔｕＩで切断し、ホスファターゼ処理
したｐＯＴＳＫＦ３３プラスミドベクターに対し、１５
℃で一晩ライゲートした。大腸菌ＡＲ１２０株細胞［ス
ミスクライン・ビーチャム・ラボラトリー］をライゲー
ション混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換
株を選択した。少量のＤＮＡのＢａｍＨＩおよびＰｓｔ
Ｉ切断により、挿入部分の存在についてクローンを検索
した。挿入部分のあるクローンからの少量のＤＮＡを、
ついで、ＡＲ５８細胞の形質転換に用いた。ＡＲ５８中
の確認されたクローンを、ウェスタン・ブロット分析用
の誘導溶解物を調製するのに用いた。
【００８３】図３はＰＣＲ発現したクローンＡＲ５８−
３（配列番号：１９および２０、それぞれ核酸およびア
ミノ酸配列）を示す。二重鎖プラスミドを鋳型として、
配列決定を行った。その構造はつぎの配列からなる：１
番目ないし１６８番目の核酸は、ｐＯＴＳＫＦ３３の１
８８０番目ないし２０４７番目の核酸に由来し、ｇａｌ
Ｋの５２個のアミノ酸をコードしている。ＡＲ５８−３
の１６９番目ないし１８１番目の核酸は外来の５個のア
ミノ酸をコードしている。該クローンの１８２番目ない
し５７３番目の核酸は、ＦＩＰＶ ＴＳの３５６番目な
いし７３４番目の核酸に由来し、公表されたＷＳＵ １
１４６株の９７番目ないし２２２番目のアミノ酸に対応
する１２８個のアミノ酸からなるＳ遺伝子領域をコード
している。蛋白は全体として１８８個のアミノ酸からな
り、平均アミノ酸分子量１２０を用いると分子量は約２
２，５００ｋＤである。
【００８４】予想される蛋白サイズは、クーマシー染色
ゲルおよびウェスタン・ブロットの両方に見られるバン
ドとよく一致し、機能的なＸｍａＩおよびＳｔｕＩ制限
部位を有している。１個の付加的なアミノ酸は、ＦＩＰ
Ｖ蛋白の末端においてＳｔｕＩ制限部位をｐＯＴＳＫＦ
３３中へ移すことになる。ＷＳＵ １１４６公表株と比
較した場合、３つの塩基対の相違が明らかである。１つ
目の相違は図３中の３１２番目（公表配列の４８０番
目）の塩基に存在する。ＷＳＵ １１４６は「Ｃ」を示
し、一方ＡＲ５８−３は「Ｔ」である。アミノ酸の変化
は起こっていない。２つ目の相違は図３中の３４９番目
（公表配列の５１７番目）の塩基に存在する。ＷＳＵ
１１４６では「Ａ」で、ＡＲ５８−３では「Ｇ」であ
る。スレオニンからアラニンへの１つのアミノ酸の変化
が起こっている。３つ目の相違は図３中の３９９番目
（公表配列の５６７番目）の塩基に存在する。公表株で
は「Ｔ」であり、ＡＲ５８−３では「Ｃ」である。アミ
ノ酸の変化は起こっていない。そのうえ、２つのアミノ
酸（チロシン イソロイシン）の挿入が、ＡＲ５８−３
では図３に示した８４番目および８５番目のアミノ酸で
起こっている。これらのアミノ酸は、公表されたＷＴ
ＷＳＵ １１４６の配列中、相同的位置には出現しな
い。
【００８５】実施例６−誘導溶解物のウェスタン・ブロ
ット ｇａｌＫ／ＦＩＰＶ Ｓ融合遺伝子を含む細菌クローン
をウェスタン分析により発現に関して検索する。ｐＯＴ
ＳＫＦ３３にＳ配列を持つＡＲ５８クローンにおける融
合蛋白発現溶解物を、つぎのようにして調製した。３ｍ
ｌのＬＢ＋５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐ）
に、滅菌楊枝を用い、マスター・プレートから細菌コロ
ニーを接種し、３２度℃で１８時間増殖させた。１ｍｌ
の一晩培養物を、２５０ｍｌエルレンマイヤーフラスコ
中の５０ｍｌの新鮮ＬＢ＋ａｍｐに接種した。エアー・
シェーカーを用い、３２℃でＡ６５０＝０.５ないし０.
６になるまで培養した。この時点で１ｍｌのＴ０試料を
取っておき、６５℃に前もって加熱しておいた１／３容
のＬＢを添加することにより誘導を行った。フラスコを
すぐに振とうウォーターバスに移し、４２℃で４時間イ
ンキュベートした。Ａ ６５０値を再び測定し、１.３ｍ
ｌのＴ４試料を取った。
【００８６】細胞をペレット化し、試料バッファー
（０.１Ｍ ＤＴＴ，２％ ＳＤＳ，８０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ６.８，１０％グルセロール、０.０２％ブロモ
フェノルブルー）中に懸濁し、２０℃で保存した。電気
泳動の前に、１００℃、５分間煮沸により試料を変性さ
せた。試料をボルテックスで撹拌し、１５ないし２０μ
ｌを、レムリ（Laemmli）、ネイチャー（Nature）、２
２７、６８０−６８５（１９７０）記載の方法により１
５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷した。ミリ
ブロット（Milliblot）装置を用いて２５０ｍＡで３０
ないし４５分間、あるいはトランスブロット（Transblo
t)装置(バイオラッド(Biorad)）を用いてトリス／グリ
シンバッファー中で４℃、２５０ｍＡで２時間、蛋白を
０.２μｍｌシュライヒャー（Schleicher）＋シュエル
（Schuell）ＢＡＳ／ＮＣニトロセルロースに移した。
【００８７】２％乾燥乳、１％ゼラチン、ＴＢＳ（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７.５，５００ｍＭ ＮａＣｌ）
中にフィルターを室温で１時間固定し、ＴＴＢＳ（ＴＢ
Ｓ＋０.０５％ツイン−２０）で濯ぎ、ウサギ・ポリク
ロナールｇａｌＫ抗体またはマウアウ腹水中gａｌＫモ
ノクローナル抗体ＨＩＶ ｅｎｖ ４１ ＡＳ１［ベッ
クマン・インストゥルメンツ（Beckman Instruments)]
をＴＴＢＳで１：１０００に希釈したものとともに、１
％ゼラチン添加し、室温で１時間インキュベートした。
ＴＴＢＳ中でフィルターを１０分間×３回洗浄し、ＴＴ
ＢＳおよび１％ゼラチン中のＩ１２５蛋白Ａ（１μＣｉ
／１０ｍｌ）（アマシャム（Amersham))で標識した。フ
ィルターを上記のごとく洗浄し、風乾し、−７０℃で種
々の時間ＸＡＲフィルムに露出した。
【００８８】表IVに、数個のＦＩＰＶ Ｓ／ｐＯＴＳＫ
Ｆ３３ ＡＲ５８クローンの発現結果を示す。細菌溶解
物を調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電泳泳
動し、ニトロセルロースに移し、上記のごとくポリクロ
ーナルおよびモノクローナルｇａｌＫ抗体の両方を用い
たウェスタン・ブロットにより分析した。ＰＣＲ増幅の
間ＲＮＡが抽出されたウイルス、ｐＯＴＳＫＦ３３中に
クローン化されたＳアミノ酸領域およびｇａｌＫ／Ｓ融
合蛋白の予想サイズもまた示されている。
【００８９】
【表３】
【００９０】表IVの結果は、誘導されたＳ／ｐＯＴＳＫ
Ｆ３３ ＡＲ５８クローンの溶解物は、ポリクローナル
およびモノクローナルｇａｌＫ抗血清によって検出する
と予期されたサイズの融合蛋白を発現することを示す。
融合蛋白を表すバンドは、ｐＯＴＳＫＦ３３単独の非誘
導溶解物または制御溶解物では検出されなかった。発現
のレベルは「＋＋＋」または「＋＋」として表IVに定量
化する。記号「＋＋＋」は、クローン５８−３によって
得られた発現のレベルに匹敵する発現を示す。この高レ
ベルまで発現された融合蛋白は、クーマシー染色ポリア
クリルアミドゲル上で容易に可視化され、合計５〜１０
％の細胞蛋白を表し得る。記号「＋＋」は、５８−３
（配列番号：２０）によって産生されたもの未満の発現
レベルを表す。一般に、これらのクローンからの融合蛋
白はクーマシーブルーで染色した溶解物では容易に可視
化されず、合計１〜２％の合計細胞蛋白を表し得る。
【００９１】実施例７−ＧａｌＫ／ＦＩＰＶ Ｓ融合蛋
白を発現する細菌の大培養の誘導 融合プラスミドを含有するＡＲ５８株イー・コリ（E. c
oli)の一昼夜定常培養をＬブロス＋１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンの５００ｍｌ用接種物として用いた。該培養
をＯＤ６５０が０.５〜０.６に達するまで３２℃でイン
キュベートした。６５℃まで予備加熱したＬブロスの１
／３培養容量を添加し、さらに増殖の４時間の間、４２
℃にシフトした。細菌を遠心（３５００、１０℃、１５
分間）で収集し、１００ｍｌの水に再懸濁した。リゾチ
ームおよびＥＤＴＡ（各々１％および２００ｍＭ、各１
００ｍｌ）を細胞ペレットに添加し、培養を１時間氷上
でインキュベートした。次いで、培養を氷上で６分間５
０ｍｌ分中で超音波処理して（ブランソン（Branson)超
音波処理機）細菌を完全に破壊した。超音波処理に続
き、チメロサル（thimerosal)を４℃にて４〜１８時間
で添加して０.０１〜０.２％の終濃度として溶解物を不
活化した。不活化物質の一部を用いて、アンピリシンと
共にまたはそれなくしてＬＢプレートを接種した。培養
のいずれも２４時間のインキュベーションの後に目で見
える増殖を示さなかった。
【００９２】実施例８−細菌からのＧａｌＫ／ＦＩＰＶ
Ｓ融合蛋白の可溶化 発現の誘導に続き、精製ｇａｌＫ／ＦＩＰＶ Ｓ融合蛋
白の細菌溶解物からの単離のために以下の精製プロトコ
ルを行った。１０ｍｌの不活化抽出物を２７０００×ｇ
で３０分間遠心した（ＪＡ２０）。上澄みを捨て、緩衝
液Ａ＋０.２％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％
トリトンＸ−１００の１０ｍｌ中で渦を起こすことによ
ってペレットを再懸濁した。緩衝液Ａは５０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＤ
ＴＴ、および５％グリセロールを含有する。抽出物を２
７０００×ｇで３０分間遠心し、得られた上澄みを捨て
た。トリトンＸ−１００（１％）および０.５Ｍ ＫＣ
ｌを含有する緩衝液Ａ １０ｍｌ中で１０分間渦を起こ
すことによってペレットを再懸濁した。遠心（２７００
０×ｇ、３０分間）に続き、８Ｍ尿素を含有する緩衝液
Ａの２ｍｌ中で１０分間渦を起こすことによってペレッ
トを再懸濁した。溶液を再度２７０００×ｇで３０分間
遠心し、ペレットを捨てた。溶液が２０ｍｌの容量に達
するまで（最終尿素濃度、０.８Ｍ）、上澄みのｐＨを
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の段階的添加によって
ｐＨ７.４に調整した。
【００９３】実施例９−抗ガラクトキナーゼモノクロー
ナル抗体の精製 抗−ガラクトキナーゼｍＡｂを含有する腹水を、ｇａｌ
Ｋの最初の５２アミノ酸、例えば、ＨＩＶ ｅｎｖ ４１
Ａｓ１［ベックマン・インスツルメンツ（Beckman Ins
truments)]に対してマウスで産生させた。ビシンコニニ
ック（bicinchoninic)酸溶液および硫酸銅溶液よりなる
ＢＣＡ蛋白アッセイキット［ピエルス・ケミカル・カン
パニー（Pierce Chemical Co.)］を製造業者の指示に従
って使用して該流体中の蛋白濃度を測定した。該アッセ
イにおける銅２＋イオンは蛋白存在下で銅１＋に変換さ
れる。次いで、銅＋１イオンをＢＣＡ分子にキレート結
合させて、呈色の変化を生じた。蛋白濃度が高くなれば
なるほど、色は深くなる。蛋白濃度は５６２ｎｍにおけ
る吸光度測定から決定する。
【００９４】合計９０ｍｇの蛋白を滅菌リン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７.４、に添加した。該物質
を、硫酸アンモニウムを添加して最終濃度２４％としつ
つ、氷上で撹拌した。氷上での２時間後、沈殿を３００
０×ｇ、４℃での３０分間の遠心によって収集した。上
澄みを捨て、ペレットを、穏やかに渦を起こしながらＰ
ＢＳに再懸濁した。再度、ゆっくりと氷上で撹拌しつ
つ、飽和硫酸アンモニウムを添加して４０％とした。１
時間後、沈殿を前記したごとく遠心によって収集した。
上澄みを捨て、ペレットを渦を起こすことによりＰＢＳ
に再懸濁した。ｍＡｂ混合物をスペクトレイパー（Spec
trapor)膜チュービング(分子量カットオフ１２−１４０
００)[フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Sc
ientific)］に添加し、４回交換するＰＢＳ４リット
ル、ｐＨ７.４、に対して透析した。透析後の物は合計
１９.５ｍｇの蛋白を含有していた。
【００９５】実施例１０−ＧａｌＫ／ＦＩＰＶ Ｓ融合
蛋白のアフィニティー精製 イミュノピュア（Immunopure)ＴＭＡｇ／Ａｂ固定化キ
ット［ピエルス・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemi
cal Co.)]を用い、抗−ガラクトキナーゼｍＡｂをカラ
ムマトリックスに結合させた。抗−ガラクトキナーゼＡ
ｂ１０ｍｇを製造業者によって記載されているごとくに
アミノリンク（Aminolink)ＴＭ（アガロース）上に固定
化した。カラムを４℃で貯蔵した。融合蛋白を含有する
カラムおよびプレ−カラム溶液双方を室温までもって行
った。該カラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７.４、１６ｍｌで平衡化した。プレ−カラム溶液を
該カラムに各々５ｍｌ４回分にて適用した。合計プレ−
カラム溶出物を３回該カラムに再度添加した。次いで、
該カラムを０.８Ｍ尿素６ｍｌで洗浄し、続いて１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.４（１６ｍｌ）で洗浄した。結
合した融合蛋白を０.１ＭグリシンｐＨ２.８の５ｍｌの
添加によって溶出させた。５つの１ｍｌ画分を収集し、
１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９.５、の５０μｌで中和し
た。画分を４℃で必要になるまで貯蔵した。該カラムを
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.４で再平衡化
した。
【００９６】ガラクトキナーゼＥＬＩＳＡアフィニティ
ーカラム溶出画分を１０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９.６中
で１：１００に希釈し、１００μｌ分を９６ウェルプレ
ート（ヌンク・イミュノ・プレート（Nunc Immuno plat
e)）の各ウェルに添加した。該プレートを４℃で一晩イ
ンキュベートし、次いで室温までもって行き、０.０５
％ツイーン−２０（ＰＢＳ−Tween）を含有するＰＢＳ
（ｐＨ７.４）で１回洗浄した。３７℃にて３０分間、
ブロッキング剤（ＰＢＳ＋１％ポリビニルアルコール、
ＰＶＡ）を２００μｌ分にて各ウェルに添加した。該プ
レートをＰＢＳ−Tweenで１回洗浄し、次いで、ＰＢＳ
＋１％ＰＶＡ中のマウス抗−ガラクトキナーゼｍＡｂの
１００μｌ（１：１０００）を各ウェルに添加した。３
７℃での１時間後、プレートをＰＢＳ−Tweenで１回洗
浄した。ヤギ抗−マウスＩｇＧペルオキシダーゼ標識複
合体（キルケガード・アンド・ペリー（Kirkegaard and
Perry))をＰＢＳ＋１％ＰＶＡにて１：１０００に希釈
し、１００μｌ分を各ウェルに添加した。該プレートを
３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−Tw
eenで１回洗浄した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質系
（キルケガード・アンド・ペリー（Kirkegaard and Per
ry))の１００μｌ分を各ウェルに添加し、室温での１０
分間のインキュベーションの後に、色素産生反応の強度
をモレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices) V
ｍａｘ プレート・リーダーにて４０５ｎｍで測定し
た。
【００９７】実施例１１−ネコ血清を用いるウェスタン
分析 融合蛋白のアフィニティーカラム溶出画分をレムリィ(L
aemmli)試料緩衝液で変性し、分取用１０％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル上の電気泳動に付した。電気泳動
に続き、トウビン（Towbin)ら［プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl,Acad.Sci.)USA、７６：４３５０−４３５
４］の手法に従って蛋白をニトロセルロースに移した。
５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌお
よび５％脱脂粉乳を含有するブロッキング溶液（緩衝液
Ａ）中で、該ニトロセルロースを室温にて一晩インキュ
ベートした。ブロッキングに続き、該ニトロセルロース
を５ｍｍ片にスライスし、個々のインキュベーションチ
ャンバーに入れた。
【００９８】５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、０.２％トリトンＸ−１００および５％脱
脂粉乳の３ｍｌ（緩衝液Ｂ）中で１：３０に希釈した独
特のネコ血清と共に、各片を室温にて１時間インキュベ
ートした。次いで、該片を緩衝液Ａで１５分間、続いて
１回の緩衝液Ｂ洗液で洗浄した。緩衝液Ａ中で１：１０
００に希釈したヤギ抗−ネコＩｇＧホスファターゼ標識
複合体（キルケガード・アンド・ペリー（Kirkegaard a
nd Perry))を、室温にて１時間、各チャンバーに添加し
た。次いで、ニトロセルロース片を順次緩衝液Ｂ、緩衝
液Ａで洗浄し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭトリス、ｐＨ７.
４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％脱脂粉乳）で２回洗浄
した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴホスファターゼ基質系［キルケ
ガード・アンド・ペリー（Kirkegaard and Perry)］を
各片に添加し；基質をデカンテーションし、室温で３０
分後に水で洗浄することによって反応を停止させた。
【００９９】ウェスタンブロットを行って、ＷＴ ＤＦ
２ ＦＩＰＶまたはＷＴ ＷＳＵ１１４６いずれかで攻
撃したネコからの血清に対する精製した融合蛋白の結合
親和性を測定した。ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶで攻撃した
ネコについては、以下のことを行った：３週間後第２Ｔ
Ｓ−ＦＩＰＶワクチン接種血清および４種間後ＷＴＤＦ
２ ＦＩＰＶ攻撃血清、共に非症状ネコ＃ＩＲ０３から
のもの；３週間後第２ＴＳ−ＦＩＰＶワクチン接種血清
および４週間後ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶ攻撃血清、共に
症状ネコ＃ＪＩ１からのもの；非ワクチン接種攻撃前血
清および４週間後ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶ攻撃血清、共
に非症状ネコ＃Ｇ２６からのもの；非ワクチン接種攻撃
前血清および４週間後ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶ攻撃血
清、共に症状ネコ＃ＩＲＶ５からのもの；（ｍＡｂ）抗
−ガラクトキナーゼモノクローナル抗体；Ｓペプチド複
合体オバルブミン−グルタルアルデヒド−１３７−１５
１アミノ酸断片で免疫したウサギからの（Ｊ７３６）血
清；およびＳペプチド複合体オバルブミン−グルタルア
ルデヒド−１５０−１８０アミノ酸断片で免疫したウサ
ギからの（Ｊ７３９）血清。症状ネコからの後ＦＩＰＶ
攻撃血清のみが、組換え５８−３（配列番号：１９およ
び２０）によって発現された２２ｋＤ ＦＩＰＶ ｇａ
ｌＫ／Ｓ融合蛋白を認識した。抗−ガラクトキナーゼｍ
Ａｂおよびウサギ血清は陽性蛋白として供した。
【０１００】ＷＴ ＷＳＵ１１４６で攻撃したネコにつ
いては、以下のことを行った：３週間後第２ＴＳ−ＦＩ
ＰＶワクチン接種血清、および４週間後ＷＴ ＷＳＵ１
１４６ＦＩＰＶ攻撃血清、共に非症状ネコ＃ＥＵ６から
のもの；３週間後第２ＴＳ−ＦＩＰＶワクチン接種血清
および４週間後ＷＴ ＷＳＵ１１４６ＦＩＰＶ攻撃血
清、共に症状ネコ＃ＦＷ３からのもの；非ワクチン接種
攻撃前血清、および４週間後ＷＴ ＷＳＵ１１４６ＦＩ
ＰＶ攻撃血清、共に非症状ネコ＃ＦＶ２からのもの；非
ワクチン接種攻撃前血清および４週間後ＷＴ ＷＳＵ１
１４６ＦＩＰＶ攻撃血清、共に症状ネコ＃ＰＢ２からの
もの；（ｍＡｂ）抗−ガラクトキナーゼモノクローナル
抗体；Ｓペプチド複合体オバルブミン−グルタルアルデ
ヒド−１３７ａａ−１５１ａａで免疫したウサギからの
（Ｊ７３６）血清；Ｓペプチド複合体オバルブミン−グ
ルタルアルデヒド−１５０ａａ−１８０ａａで免疫した
ウサギからの（Ｊ７３９）血清；および第２複合体ヤギ
−抵−ネコＩｇＧ−ホスファターゼ抗体のみを摂取した
対照。症状ネコからの後ＦＩＰＶ攻撃血清のみが組換え
５８−３（配列番号：１９および２０）によって発現さ
れた２２ｋＤ ｇａｌＫ／Ｓ融合蛋白を認識した。抗−
ガラクトキナーゼｍＡｂおよびウサギ血清は陽性対照と
して供した。
【０１０１】実施例１２−他の株の部分配列 本発明において、完全なＳ遺伝子ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰ
Ｖ（各々配列番号：２１および２２）、ＤＦ２−ＨＰの
Ｓ遺伝子の断片（配列番号：２３および２４）、完全な
Ｓ遺伝子ＴＳ（各々配列番号：２５および２６）、ＴＳ
−ＢＰのＳ遺伝子の断片（各々配列番号：２７および２
８）、ＷＴ ＴＮ４０６のＳ遺伝子の断片（各々配列番
号：２９および３０）、ＵＣＤ−２のＳ遺伝子の断片
（各々配列番号：５３および５４）およびＦＥＣＶの完
全なＳ遺伝子（各々配列番号：３１および３２）の以下
のＤＮＡおよびアミノ酸配列が、ＷＴ ＷＳＵ１１４６
について実施例１で記載したのと実質的に同様の手法に
よって得られた。図４−１０はＷＴ ＦＩＰＶ ＤＦ２
ウイルスの完全なＳ遺伝子（配列番号：２１および２
２）およびＦＩＰＶ ＨＰウイルスのＳ遺伝子の断片
（配列番号：２３および２４）を提供する。太線印刷部
分は、ＤＦ２−ＨＰの配列がＷＴ ＤＦ２と異なる箇所
を示す。ＤＦ２−ＨＰにおけるＷＴ ＤＦ２からのヌク
レオチド変化は、星印でＷＴ ＤＦ２配列の上方に示
し、アミノ酸の差異は星印でＷＴＤＦ２配列の下方に示
す。
【０１０２】図１１−１７はＴＳ ＦＩＰＶの完全なＳ
遺伝子（配列番号：２５および２６）およびアミノ酸１
−７４８からのＴＳ−ＢＰのＳ遺伝子の断片（配列番
号：２７および２８）の配列を示し、各々はＡＲ５８−
３ Ｓ由来ペプチドに相同な配列（配列番号：２０）を
包含する。ＴＳからのＴＳ−ＢＰ配列におけるヌクレオ
チド差異は星印と共にＴＳ配列の上方に太線にて示し、
アミノ酸の差異はＴＳ配列の下方に同様に示す。図３
（配列番号：２０）に示すごとく、ＡＲ５８−３と、Ｔ
Ｓ ＦＩＰＶ（配列番号：２５および２６）、ＷＴ Ｄ
Ｆ２ ＦＩＰＶ（配列番号：２１および２２）の配列と
の間の相同性のある領域は後記図４−１０および５で下
線を施すことによって示す。図１８はアミノ酸１０２−
２２３からのＷＴ ＴＮ４０６ ＦＩＰＶの配列（配列
番号：２９および３０）を提供する。図１９−２４はア
ミノ酸１−１１５２からのＦＥＣＶウイルスのＳ遺伝子
の配列（配列番号：３１および３２）を提供する。
【０１０３】図２５はアミノ酸１−１２５からのＵＣＤ
−２ウイルスのＳ遺伝子の配列（配列番号：５３および
５４）を示す。ＦＩＰＶ、株ＷＴ ＷＳＵ１１４６、Ｗ
Ｔ ＤＦ２、ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳ、ＴＳ−ＢＰ、ＷＴ
ＴＮ４０６、ＦＥＣＶ、ＵＣＤ−２および、Ｓ遺伝子の
ヌクレオチド１−２２４６（アミノ酸１−７４８をコー
ド）から伸びるコンセンサス配列間のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列の差異は以下の通りであり、コンセンサ
ス配列は参照として図２６−２９に示す（配列番号：３
３および３４）。コンセンサス配列はアミノ酸７４８
（塩基対２２４６）を超える遺伝子のその部分について
は得られなかった。従って、遺伝子がこの地点を超えて
配列決定されている株については、公開されているＷＴ
ＷＳＵ１１４６配列を参照されたい。
【０１０４】ＷＴ ＷＳＵ１１４６は、以下のヌクレオ
チド変化によってコンセンサス配列（配列番号：３３）
と異なる：８４９におけるＣ；２０２９におけるＡ；１
３４６におけるＧおよび欠失：３５１−３５６。ＷＴ
ＷＳＵ１１４６は以下のアミノ酸変化を含有する：４４
９におけるＧｌｙおよび６７７におけるＡｓｎならびに
欠失：１１９および１２０。ＷＴ ＤＦ２（配列番号：
２１）は、以下のヌクレオチド変化によってコンセンサ
ス配列（配列番号：３３）と異なる：２１６における
Ａ、２１８におけるＡ、８４９におけるＣ、１３４６に
おけるＧ、１３７０におけるＣ、１５９７におけるＣ、
１７５１におけるＣ、２０２９におけるＡ。ＷＴ ＤＦ
２（配列番号：２２）は、以下のアミノ酸変化を含有す
る：７３におけるＧｌｎ；４４９におけるＧｌｙ、４５
９におけるＡｌａ；５３３におけるＨｉｓ；５８４にお
けるＰｒｏ、および６７７におけるＡｓｎ。
【０１０５】加えて、ＷＴ ＤＦ２（配列番号：２１）
は、以下のヌクレオチド変化（対応するＷＴ ＷＳＵ１
１４６番号を括弧に入れて続ける）によって公開された
ＷＴＷＳＵ１１４６配列と異なる：２５４１におけるＣ
（２６０１におけるＴ）；４１２１におけるＣ（４１８
５におけるＡ）；４２１０におけるＣ（４２７３におけ
るＴ）；４３３０におけるＴ（４３９４におけるＡ）。
ＷＴ ＤＦ２（配列番号：２２）は以下のアミノ酸差異
によって公開されたＷＴ ＷＳＵ１１４６配列と異な
る：１３７４におけるＴｈｒ（１３７２におけるＡｓ
ｎ）および１４４４におけるＴｙｒ（１４４２における
Ａｓｎ）。ＤＦ２−ＨＰ（配列番号：２３）は、以下の
ヌクレオチド変化によってコンセンサス配列(配列番
号：３３)と異なる：４００におけるＧ；１０８３にお
けるＣ；８４９におけるＴ；１３４６におけるＧ；１７
９１におけるＣおよび２０２９におけるＧ。ＤＦ２−Ｈ
Ｐ(配列番号：２４)は以下のアミノ酸変化を含有する：
１３４におけるＧｌｕ；４４９におけるＧｌｙおよび６
７７におけるＡｓｐ。ＴＳ（配列番号：２５）は、以下
のヌクレオチド変化によってコンセンサス配列（配列番
号：３３）と異なる：９０におけるＴ；８４９における
Ｔ；９５６におけるＴ；１３４６におけるＡ；１８８９
におけるＣ；１９８４におけるＡ；および２０２９にお
けるＧ。ＴＳ（配列番号：２６）は、以下のアミノ酸変
化を含有する：３１９におけるＶａｌ；６３０における
Ｔｈｒ；６６２におけるＩｌｅ；４４９におけるＡｓ
ｐ；および６７７におけるＡｓｐ。
【０１０６】加えて、ＴＳ［配列番号：２５］は、以下
のヌクレオチド変化によって公開されたＷＴ ＷＳＵ１
１４６配列と異なる：２３０９におけるＴ（２３７２に
おけるＣ）；２５４１におけるＣ（２６０４における
Ｔ）；４０２４におけるＡ（４０８７におけるＧ）およ
び４０７４におけるＧ（４１３７におけるＡ）。ＴＳ
［配列番号：２６］は以下のアミノ酸変化によってＷＴ
ＷＳＵ１１４６のアミノ酸配列と異なる：７７０にお
けるＩｌｅ（７６８におけるＴｈｒ）および１３４２に
おけるＴｈｒ（１３４０におけるＡｌａ）。ＴＳ−ＢＰ
（配列番号：２７）は、以下のヌクレオチド変化によっ
てコンセンサス配列（配列番号：３３）と異なる：８４
９におけるＴ；１３４６におけるＡ；２０２９における
Ｇ。ＴＳ−ＢＰ（配列番号：２８）は以下のアミノ酸イ
ンサートを含有する：４４９におけるＡｓｐおよび６７
７におけるＡｓｐ。ＷＴ ＴＮ４０６（配列番号：２
９）は以下のヌクレオチド変化によってコンセンサス配
列（配列番号：３３）と異なる：６５９におけるＴ。Ｗ
Ｔ ＴＮ４０６(配列番号：３０）は２２０位において
Ｉｌｅへのアミノ酸変化を含有する。
【０１０７】ＦＥＣＶ（配列番号：３３）は、以下のヌ
クレオチド変化によってコンセンサス配列（配列番号：
３３）と異なる：３６におけるＣ、４８におけるＴ、５
３におけるＣ、６０におけるＧ、６１におけるＴ、６６
におけるＣ、７２におけるＴ、７５におけるＴ、７７に
おけるＧ、９９におけるＡ、１２０におけるＴ、１２６
におけるＣ、１３０におけるＴ、１４１におけるＴ、１
５８におけるＴ、２３０におけるＡ、２３２における
Ｇ、２６６におけるＡ、２７６におけるＴ、３１２にお
けるＴ、３１３におけるＣ、３２７におけるＴ、３３６
におけるＡ、３４６におけるＡ、３４８におけるＣ、３
５１におけるＣ、３６０におけるＡ、３７０における
Ｇ、３９３におけるＡ、４００におけるＧ、４１２にお
けるＴ、４２０におけるＴ、４３３におけるＡ、４３９
におけるＧ、４４５におけるＡ、４４７におけるＣ、４
４８におけるＡ、４４９におけるＣ、４５０における
Ｃ、４５７におけるＡ、４５８におけるＧ、４６９にお
けるＧ、４７６におけるＴ、４８７におけるＡ、４８８
におけるＧ、５２１におけるＧ、５２５におけるＴ、５
４６におけるＧ、５６４におけるＡ、５７６における
Ｇ、５９８におけるＡ、６００におけるＴ、６０２にお
けるＧ、６１４におけるＡ、６１８におけるＣ、６８９
におけるＣ、７４２におけるＴ、７５９におけるＴ、７
６５におけるＧ、７７５におけるＴ、７８９における
Ｃ、７９２におけるＣ、７９５におけるＴ、８０１にお
けるＣ、８１０におけるＡ、８１３におけるＴ、８１４
におけるＧ、８１５におけるＴ、８１６におけるＧ、８
１９におけるＡ、８４９におけるＣ、８５８における
Ｔ、８７３におけるＣ、８９４におけるＡ、９０６にお
けるＣ、９１３におけるＣ、９１８におけるＡ、９１９
におけるＧ、９２４におけるＣ、９３０におけるＡ、９
８４におけるＧ、９９３におけるＴ、９９６における
Ｇ、１００１におけるＧ、１００８におけるＡ、１０２
６におけるＡ、１０４６におけるＴ、１０５６における
Ｃ、１０８９におけるＧ、１０９５におけるＧ、１０９
６におけるＴ、１１０７におけるＧ、１１２６における
Ｇ、１１３９におけるＡ、１１６０におけるＴ、１１８
２におけるＴ、１２００におけるＴ、１２０９における
Ｇ、１２４５におけるＧ、１２６６におけるＴ、１３４
６におけるＡ、１３６０におけるＣ、１３７６における
Ａ、１４１３におけるＣ、１４１９におけるＧ、１４５
５におけるＧ、１４９１におけるＧ、１５４８における
Ｇ、１５５１におけるＴ、１５５５におけるＣ、１５５
７におけるＴ、１５６０におけるＧ、１５８６における
Ｔ、１５９４におけるＧ、１５９７におけるＣ、１５９
９におけるＴ、１６０６におけるＡ、１６３７における
Ｇ、１６４１におけるＣ、１６６２におけるＡ、１６６
５におけるＡ、１６６９におけるＴ、１６８０における
Ｔ、１７０１におけるＴ、１７０４におけるＣ、１７０
７におけるＡ、１７３４におけるＧ、１７３７における
Ｔ、１７５５におけるＴ、１７５７におけるＴ、１７６
１におけるＴ、１７６４におけるＧ、１７９７における
Ａ、１８１５におけるＴ、１８１８におけるＣ、１８３
３におけるＧ、１８７８におけるＡ、１９１７における
Ｃ、１９２３におけるＣ、１９４１におけるＣ、１９６
５におけるＡ、２０１３におけるＴ、２０８５における
Ｇ、２０２９におけるＡ、２０７９におけるＧ、２０８
２におけるＴ、２１２０におけるＡ、２０４２における
Ｃ、２２０７におけるＣ、インサート：コンセンサス配
列のヌクレオチド１３５および１３６間のＣＡＡ；コン
センサス配列のヌクレオチド２２３および２２４の間の
ＣＣＡ；および１３８−１４０；２１６−２１８位にお
ける欠失。
【０１０８】ＦＥＣＶ（配列番号：３２）は、以下のア
ミノ酸変化によってコンセンサス配列（配列番号：３
３）と異なる：１８におけるＳｅｒ、２１におけるＳｅ
ｒ、２４におけるＡｓｎ、２６におけるＡｒｇ、４６に
おけるＧｌｎ、４７におけるＳｅｒ、５３におけるＩｌ
ｅ、７３におけるＴｈｒ、７７におけるＴｙｒ、７８に
おけるＧｌｕ、８９におけるＡｓｐ、１１６におけるＩ
ｌｅ、１２４におけるＧｌｙ、１３４におけるＧｌｕ、
１３８におけるＬｅｕ、１４５におけるＡｓｎ、１４７
におけるＡｓｐ、１４９におけるＡｓｎ、１５０におけ
るＴｈｒ、１５７におけるＡｓｐ、１５９におけるＩｌ
ｅ、１６３におけるＡｓｎ、１７４におけるＡｒｇ、１
８８におけるＧｌｕ、２００におけるＡｓｎ、２０１に
おけるＴｒｐ、２０５におけるＡｓｎ、２３０における
Ｖａｌ、２５３におけるＰｈｅ、２５９におけるＴｙ
ｒ、２７２におけるＶａｌ、３０７におけるＶａｌ、３
３４におけるＳｅｒ、３７６におけるＶａｌ、３８０に
おけるＡｓｎ、３８８におけるＰｈｅ、４４９における
Ａｓｐ、４５９におけるＡｓｐ、４８５におけるＬｙ
ｓ、５１９におけるＬｅｕ、５２９におけるＩｌｅ、５
３２におけるＡｌａ、５３３におけるＨｉｓ、５３６に
おけるＩｌｅ、５４６におけるＡｒｇ、５８６における
Ｉｌｅ、５９８におけるＧｌｕ、６０５におけるＡｓ
ｐ、６７７におけるＡｓｎ、６９３におけるＧｌｕ、お
よび７０７におけるＧｌｎ、
【０１０９】加えて、ＷＴ ＷＳＵ１１４６は以下の変
化によってＦＥＣＶのヌクレオチド配列と異なる（該Ｗ
Ｔ ＷＳＵ１１４６ヌクレオチドおよびヌクレオチド番
号は括弧に入れたＦＥＣＶヌクレオチドおよびヌクレオ
チド番号の前に表す）：２２７１におけるＴ（２２０８
におけるＣ）；２３７２におけるＣ（２３０９における
Ａ）；２３７６におけるＴ（２３１３におけるＣ）；２
３８５におけるＧ（２３２２におけるＡ）；２４２１に
おけるＣ（２３５８におけるＴ）；２４２６におけるＧ
（２３６３におけるＡ）；２４７９におけるＧ（２４１
６におけるＡ）；２４９６におけるＴ（２４３３におけ
るＣ）；２５５０におけるＣ（２４８７におけるＴ）；
２５７９におけるＡ（２５１６におけるＣ）；２５９８
におけるＴ（２５３５におけるＣ）；２６０４における
Ｔ（２５４１におけるＣ）；２６１９におけるＴ（２５
５６におけるＣ）；２６２８におけるＧ（２５６５にお
けるＴ）；２６４０におけるＴ（２５７７における
Ｃ）；２６７６におけるＴ（２６１３におけるＣ）；２
７１８におけるＧ（２６５５におけるＴ）；２７３９に
おけるＡ（２６７６におけるＧ）；２７９６におけるＴ
（２７３３におけるＣ）；２７９９におけるＣ（２７３
６におけるＴ）；２８０２におけるＧ（２７３９におけ
るＴ）；２８５９におけるＴ（２７９６におけるＣ）；
２８８２におけるＧ（２８１９におけるＡ）；２８９９
におけるＣ（２８３６におけるＴ）；２９０８における
Ｃ（２８４５におけるＴ）；２９１６におけるＴ（２８
５３におけるＣ）；２９２２におけるＡ（２８５９にお
けるＧ）；２９５０におけるＧ（２８８７における
Ｃ）；２９６７におけるＴ（２９０４におけるＣ）；２
９８２におけるＡ（２９１９におけるＧ）；２９９１に
おけるＡ（２９２８におけるＴ）
【０１１０】；３０３３におけるＴ（２９７０における
Ａ）；３０４２におけるＣ（２９７９におけるＴ）；３
０５１におけるＡ（２９８８におけるＣ）；３０５７に
おけるＧ（２９９４におけるＡ）；３０９０におけるＴ
（３０２７におけるＧ）；３０９１におけるＣ（３０２
８におけるＴ）；３０９６におけるＡ（３０３３におけ
るＴ）；３１１０におけるＣ（３０４７におけるＡ）；
３１３８におけるＡ（３０７５におけるＴ）；３１５７
におけるＴ（３０９４におけるＣ）；３１８３における
Ｇ（３１２０におけるＴ）；３２０７におけるＡ（３１
４４におけるＴ）；３２１０におけるＧ（３１４７にお
けるＡ）；３２６１におけるＡ（３１９８における
Ｇ）；３３１２におけるＴ（３２４９におけるＡ）；３
３１８におけるＴ（３２５５におけるＣ）；３３４９に
おけるＣ（３２８６におけるＡ）；３３６０におけるＣ
（３２９７におけるＡ）；３３７５におけるＧ（３３１
２におけるＡ）；３４２３におけるＴ（３３６０におけ
るＣ）；３４２９におけるＴ（３３６６におけるＡ）；
３４６８におけるＴ（３４０５におけるＣ）；３５４０
におけるＴ（３４７７におけるＡ）；３５９１における
Ａ（３５２８におけるＧ）；３６２１におけるＡ（３５
５８におけるＧ）；３６４５におけるＧ（３５８２にお
けるＡ）；３６４８におけるＴ（３５８５における
Ｃ）；３６５１におけるＧ（３５８８におけるＡ）；３
６６３におけるＣ（３６００におけるＴ）；３６８７に
おけるＴ（３６２４におけるＣ）；３６９９におけるＡ
（３６３６におけるＴ）；３７４１におけるＡ（３６７
８におけるＧ）；３７５３におけるＡ（３６９０におけ
るＧ）；３７７８におけるＴ（３７１５におけるＣ）；
３８１３におけるＣ（３７５０におけるＴ）；３８３４
におけるＧ（３７７１におけるＡ）；３８５５における
Ｔ（３７９２におけるＣ）；３８７９におけるＣ（３８
１６におけるＴ）；３９０５におけるＴ（３８４２にお
けるＣ）；３９３６における
【０１１１】Ａ（３８７３におけるＧ）；３９４２にお
けるＴ（３８７９におけるＣ）；３９６０におけるＣ
（３８９７におけるＴ）；３９６３におけるＧ（３９０
０におけるＡ）；３９７５におけるＴ（３９１２におけ
るＣ）；４００８におけるＴ（３９４５におけるＣ）；
４０１４におけるＡ（３５９１におけるＧ）；４０２６
におけるＣ（３９６３におけるＴ）；４０６８における
Ｔ（４００５におけるＧ）；４０８３におけるＣ（４０
２０におけるＴ）；４１２８におけるＧ（４０６５にお
けるＡ）；４１４９におけるＴ（４０８６における
Ｃ）；４１５２におけるＣ（４０８９におけるＴ）；４
１５５におけるＴ（４０９２におけるＣ）；４１５８に
おけるＡ（４０９５におけるＴ）；４１８２におけるＴ
（４１１９におけるＣ）；４１９１におけるＴ（４１２
８におけるＣ）；４１９４におけるＴ（４１３１におけ
るＣ）；４２６６におけるＧ（４２０３におけるＡ）；
４２７２におけるＴ（４２０９におけるＣ）；４２８２
におけるＧ（４２１９におけるＡ）；４３００における
Ｃ（４２３７におけるＴ）；４３１６におけるＴ（４２
５３におけるＧ）；４３２０におけるＣ（４２５７にお
けるＴ）；４３４７におけるＴ（４２８４における
Ｃ）；および４３７１におけるＡ（４３０８における
Ｇ）。
【０１１２】ＦＥＣＶは以下の変化（ＷＳＵ１１４６ア
ミノ酸は括弧中で表す）によってＷＴＷＳＵ１１４６の
アミノ酸配列と異なる：７７０におけるＬｙｓ（７６８
におけるＴｈｒ）；７８８におけるＡｓｎ（７８６にお
けるＳｅｒ）；８０６におけるＩｌｅ（８０４における
Ｖａｌ）；８３９におけるＴｈｒ（８３７におけるＡｓ
ｎ）；８５５におけるＩｌｅ（８５３におけるＭｅ
ｔ）；９４０におけるＡｓｎ（９３８におけるＳｅ
ｒ）；９６３におけるＡｒｇ（９６１におけるＧｌ
ｙ）；１０１６におけるＡｓｐ（１０１４におけるＡｌ
ａ）；１０９６におけるＬｙｓ（１０９４におけるＧｌ
ｎ）；１２３９におけるＰｒｏ（１２３７におけるＳｅ
ｒ）；１２８１におけるＡｌａ（１２７９におけるＶａ
ｌ）；１３３５におけるＬｅｕ（１３３３におけるＰｈ
ｅ）；１４０７におけるＩｌｅ（１４０５におけるＶａ
ｌ）；１４１８におけるＣｙｓ（１４１６におけるＰｈ
ｅ）；および１４３６におけるＭｅｔ（１４３４におけ
るＩｌｅ）。
【０１１３】ＵＣＤ−２（配列番号：５４）は以下のア
ミノ酸変化によってコンセンサス配列のアミノ酸配列と
異なる：＃２１におけるＴｙｒ、＃２２におけるＩｌ
ｅ。ＵＣＤ−核酸配列とコンセンサス配列との間にヌク
レオチドの差異はない。以下の一般的結論がこの情報か
ら帰結される。ＦＥＣＶおよびＷＴ ＤＦ２由来ウイル
スのすべては、ＷＴ ＷＳＵ１１４６Ｓ遺伝子に存在し
ない＃１１９および１２０位における２のアミノ酸イン
サート(Ｔｙｒ Ｉｌｅ)を含有する。しかしながら、一
般に、ＷＴ ＷＳＵ１１４６およびＷＴ ＤＦ２由来株
の間の相同性はかなり高い(＞９９.０％）。ＷＴ ＤＦ
２配列と比較してＤＦ２−ＨＰ Ｓ遺伝子の最初の７４
８アミノ酸に６つの変化が存在する。主要な変化は保存
的であるが、いくつか(＃４５９、＃５３３)は蛋白のコ
ンフォメーションを乱す恐れがある。ＤＦ２ ＨＰとＤ
Ｆ２との間の総じてのアミノ酸相同性は＞９９.０％残
る。
【０１１４】Ｓ遺伝子の最初の半分において、ＤＦ２
ＨＰの突然変異誘発はＴＳ ＦＩＰＶで観察される５つ
のアミノ酸変化を起こし得たであろう。再度、主要な変
化は天然で保存的である。しかしながら、＃５５３およ
び＃６３０位におけるアミノ酸置換は蛋白プロット構造
で変化を引き起し得る。総じて、２つのウイルスの同様
性は９９.０％を超える。ＴＳ ＦＩＰＶ（配列番号：
２６）およびＴＳ−ＢＰ（配列番号：２８）の１−７４
８アミノ酸配列は高度に相同性がある（＞９９.０
％）。しかしながら、ＴＳ ＦＩＰＶ（配列番号：２
６）とＴＳ ＢＰ（配列番号：２８）との比較は３つの
アミノ酸変化を示す。これらのうち２つは、＃３１９に
おけるバリンからアラニンおよび＃６６２におけるイソ
ロイシンからバリンへの保存的変化を表した。これらの
２つのアミノ酸位のプロット構造の調査により、これら
の２つの変化は蛋白のコンフォメーションへ影響は最小
であろうことが予測される。＃６３０における第３の変
化は重要である：ＴＳ ＦＩＰＶにおけるチロシンから
ＴＳ
【０１１５】ＢＰにおけるリシン残基。このアミノ酸変
化は蛋白の折り畳みを乱し得るが、ＷＴ ＤＦ２（配列
番号：２２）、ＤＦ２ ＨＰ（配列番号：２４）および
ＦＥＣＶ（配列番号：３２）におけるこの部分における
共通のアミノ酸はリシンである。この結果は、ＴＳ Ｂ
Ｐにおけるリシンへの復帰変化はビルレンスへの復帰と
関連するものではないことを示唆する。すべてタイプII
である他のＦＩＰＶ株に関し、ＷＴ ＴＮ４０６ ９４
−２２３アミノ酸領域の配列において、ただ１つのアミ
ノ酸変化（＃２２０、トリプトファンからイソロイシ
ン）が観察された。ＷＴ ＴＮ４０６はタイプＩのウイ
ルスであり、典型的には、ネコにおいて病気を引き起こ
すには１を超える暴露が必要である。示したＴＮ４０６
配列はヌクレオチド３０２−６７１［配列番号：２９］
およびアミノ酸番号１０２−２２３［配列番号：３０］
よりなる。
【０１１６】実施例１３−攻撃実験 種々のＦＩＰＶ株をＦＥＣＶから選択的に区別できるの
に十分な非相同性のＳ遺伝子配列を含有するＦＩＰＶお
よびＦＥＣＶ株をさらに同定するために、アミノ酸１３
７−１５１または１５０−１８０を表す合成ペプチドで
免疫したウサギまたは特異的ネコ・コロナウイルスで攻
撃したネコいずれかから血清をスクリーニングした。結
果は以下の通りである。ＦＩＰＶ株ＷＴ ＷＳＵ１１４
６またはＷＴ ＤＦ２で免疫したネコからの血清は、ウ
ェスタンブロットでプローブした場合、ＦＥＣＶのアミ
ノ酸９４−２２３を表す融合蛋白を認識しなかった。対
照的に、ＴＳ ＦＩＰＶのアミノ酸９４−２２３を表す
融合蛋白は、ＦＥＣＶで感染したネコからの血清によっ
て認識されなかったが、ＷＴ ＷＳＵ１１４６−感染ま
たはＷＴ ＤＦ２−感染ネコ血清からの血清でのウェス
タンブロットプローデで検出された。１３７−１５１位
におけるＷＴ ＷＳＵ１１４６アミノ酸配列に対し合成
ペプチドで免疫したウサギからの血清はＴＳ ＦＩＰＶ
のみを認識したが、ＦＥＣＶ９４−２２３融合蛋白を認
識しなかった。これらの結果は、９４−２２３融合蛋白
内の１３７−１５１アミノ酸のごとき特異的配列がＦＩ
ＰＶをＦＥＣＶから区別するのに有用であり得ることを
示唆する。以下の表Ｖで示すように、ＴＳ ＦＩＰＶお
よびＦＥＣＶ９４−２２３アミノ酸融合蛋白は、共に、
ｇａｌＫモノクローナル抗体ＨＩＶ ｅｎｖ ４１ ＡＳ
１［ベックマン・インスツルメンツ（Beckman Instrume
nts)］によって認識された。
【０１１７】 表Ｖ 攻撃ウイルス型 血清型 ＴＳ ＦＩＰＶ ＴＳ ＦＩＰＶ ＡＲ ５８−３ ＡＲ ５８−３９９ ９３−２２３ａａ ９４−２２３ ａａ ＷＳＵ１１４６ ポスト−シャル＊ ＋ − (Post-Chall) ＷＴ ＤＦ２ ポスト−シャル ＋ − ＦＥＣＶ ポスト−シャル − ＋ ウサギ ＷＴ ＦＩＰＶ ＋＋ − ａａ 137-151 ＷＴ ＦＩＰＶ ＋＋ ＮＴ ａａ 150-180 マウス 抗−ＧａｌＫ Ｍａｂ ＋＋ ＋＋ ＋／−はネコ血清でのウェスタンブロットにおける反応
性を示す。＊攻撃後にＦＩＰＶから死んだ症状ネコＮＴ
テストせず
【０１１８】実施例１４−非相同配列の抗体認識 アミノ酸位置＃１３７−１５１および＃９５０−９９０
（対照）におけるＷＴＤＦ２／ＷＴ ＷＳＵ１１４６配
列からつくった合成ペプチドを用いてウサギを免疫し
た。以下の表IVに示すごとく、１３７−１５１合成ペプ
チドに向けられた抗体は、ＷＴ ＤＦ２およびＴＳ Ｆ
ＩＰＶ９４−２２３アミノ酸を表す融合蛋白を認識した
が、ＦＥＣＶからつくられたアナログ融合蛋白を認識し
なかった。予期されたごとく、対照抗体はテストしたい
ずれの９４−２２３ａ.ａ.融合蛋白も認識しなかった。
モノクローナルｇａｌ−Ｋ抗体はすべての融合蛋白のガ
ラクトキナーゼ部分を認識した。ウェスタンブロット結
果の以下の表示において、「０」は無反応を、「４」は
強い反応を示す。
【０１１９】 表ＶＩ 血清 ＴＳ ＦＩＰＶ ＴＮ４０６ ＦＥＣＶ ９４−２２３ ９４−２２３ ９４−２２３ ウサギα１３７−１５１ａａ ２ ２ ０ ウサギα９５０−９９０ａａ ０ ０ ０ マウス抗−ｇａｌＫ ４ ２ ４ 本発明の多数の修飾および変形がこれまでの明細書に含
まれ、当業者に自明と考えれる。かかる修飾および改変
は添付する請求の範囲の範囲に含まれると信ずる。
【０１２０】 配列リスト （１）一般的情報： （i）出願人：スミスクライン・ビーチャム、コーポレイション （ii）発明の名称：組換えネコ・コロナウイルスＳ蛋白 （iii）配列の数：５４ （iv）通信宛先： （Ａ）宛名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション （Ｂ）ストリート：７０９スウェードランド・ロード （Ｃ）シティ：キング・オブ・プロシア （Ｄ）州：ペンシルベニア （Ｅ）国：米国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−２７９９ （v）コンピューター解読可能形態： （Ａ）媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク （Ｂ）コンピューター：Ｉ
ＢＭ ＰＣコンパティブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソストウェア：PatentIn Release ＃１.０、Version ＃１.２５ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）優先権基礎出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ ０７／６９８９２７ （Ｂ）出願日：１９９１年５月１３日 （vii）優先権基礎出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ ０７／６１３０６６ （Ｂ）出願日：１９９０年１１月１４日 （viii）代理人情報： （Ａ）氏名：キング，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：３０９５４ （Ｃ）参照／書類番号：ＳＢＣ １４５３２Ｂ （ix）電信番号情報： （Ａ）電話：（２１５） ２７０−５０１５ （Ｂ）テレックス：（２１５） ２７０−５０９０ （２）配列番号１についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１： GTGCCCCCGG GTATGATTGT GCTCGTAACT TGCCTCTTG 39 （２）配列番号２についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：２： AAATACCCGG GCACTGGTAA TGCACGTGGT AAACC 35 （２）配列番号３についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：３： GTATTCCCGG GCACGCTCAA GCACTGCTAC CTGGG 35 （２）配列番号４についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：４： CAGATCCCGG GGTACAATCT GGTATGGGTG CTACAG 36 （２）配列番号５についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：５： GCTTACCCGG GGTGGTTATG GTCAACCCAT AGCCTCGAC 39 （２）配列番号６についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：６： TGTGACCCGG GCGCCATGTG ATGTAAGCGC ACAAGCGGC 39 （２）配列番号７についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：７： GCAATCCCGG GGGGTGCCAG ACTTGAAAAC ATGGAGG 37 （２）配列番号８についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：８： CATTACCCGG GGGTGCACTT GGTGGTGGCG CCGTGGC 37 （２）配列番号９についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：９： TAGGTCCCGG GCTCAGTCTC AGAGATTCGG ATTCTGTGG 39 （２）配列番号１０についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１０： ATAATAGGCC TGGTTTACCA CGTGCATTAC CAGTGC 36 （２）配列番号１１についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１１： GTATTAGGCC TCCCAGGTAG CAGTGCTTGA GCGTG 35 （２）配列番号１２についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１２： AAATAAGGCC TCTGTAGCAC CCATACCAGA TTGTAC 36 （２）配列番号１３についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１３： TTAGTAGGCC TGTCGAGGCT ATGGGTTGAC CATAACCAC 39 （２）配列番号１４についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１４： TAACAAGGCC TGCCGCTTGT GCGCTTACAT CACATGGCG 39 （２）配列番号１５についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１５： ATCAAAGGCC TCCTCCATGT TTTCAAGTCT GGCACCC 37 （２）配列番号１６についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１６： GTATAAGGCC TGCCACGGCG CCACCACCAA GTGCACC 37 （２）配列番号１７についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１７： CATTAAGGCC TCCACAGAAT CCGAATCTCT GAGACTGAG 39 （２）配列番号１８についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列記載：配列番号：１８： TAAATAGGCC TTTAGTGGAC ATGCACTTTT TCAATTGG 38 （２）配列番号１９についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：５７３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴 （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..５７０ （xi）配列記載：配列番号：１９： ATG GAT CCC GAA TTC CAA GAA AAA ACA CAA TCT CTG TTT GCC AAC GCA 48 Met Asp Pro Glu Phe Gln Glu Lys Thr Gln Ser Leu Phe Ala Asn Ala 1 5 10 15 TTT GGC TAC CCT GCC ACT CAC ACC ATT CAG GGC CCT GGC CGC GTG AAT 96 Phe Gly Tyr Pro Ala Thr His Thr Ile Gln Gly Pro Gly Arg Val Asn 20 25 30 TTG ATT GGT GAA CAC ACC GAC TAC AAC GAC GGT TTC GTT CTG CCC TGC １44 Leu Ile Gly Glu His Thr Asp Tyr Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Cys 35 40 45 GCG ATT GAT TAT CAA ACC GTG ATC CCT AAT ACC CGG GGC ACT GGT AAT 192 Ala Ile Asp Tyr Gln Thr Val Ile Pro Asn Thr Arg Gly Thr Gly Asn 50 55 60 GCA CGT GGT AAA CCA TTA TTA TTT CAT GTG CAT GGT GAG CCT GTT AGT 240 Ala Arg Gly Lys Pro Leu Leu Phe His Val His Gly Glu Pro Val Ser 65 70 75 80 GTT ATT ATA TAT ATA TCG GCT TAT AGG GAT GAT GTG CAA CAA AGG CCC 288 Val Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln Gln Arg Pro 85 90 95 CTT TTA AAA CAT GGG TTA GTG TGT ATA ACT AAA AAT CGC CAT ATT AAC 336 Leu Leu Lys His Gly Leu Val Cys Ile Thr Lys Asn Arg His Ile Asn 100 105 110 TAT GAA CAA TTC GCC TCC AAC CAG TGG AAT TCC ACA TGT ACG GGT GCT 384 Tyr Glu Gln Phe Ala Ser Asn Gln Trp Asn Ser Thr Cys Thr Gly Ala 115 120 125 GAC AGA AAA ATT CCC TTC TCT GTC ATA CCC ACG GAC AAT GGA ACA AAA 432 Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp Asn Gly Thr Lys 130 135 140 ATC TAT GGT CTT GAG TGG AAT GAT GAC TTT GTT ACA GCT TAT ATT AGT 480 Ile Tyr Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Phe Val Thr Ala Tyr Ile Ser 145 150 155 160 GGT CGT TCT TAT CAC TTG AAC ATC AAT ACT AAT TGG TTT AAC AAT GTC 528 Gly Arg Ser Tyr His Leu Asn Ile Asn Thr Asn Trp Phe Asn Asn Val 165 170 175 ACA CTT TTG TAT TCA CGC AGC AGC ACT GCT ACC TGG GAG GCC 570 Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Thr Ala Thr Trp Glu Ala 180 185 190 TAG 573 （２）配列番号２０についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：１９０塩基対 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：２０： Met Asp Pro Glu Phe Gln Glu Lys Thr Gln Ser Leu Phe Ala Asn Ala 1 5 10 15 Phe Gly Tyr Pro Ala Thr His Thr Ile Gln Gly Pro Gly Arg Val Asn 20 25 30 Leu Ile Gly Glu His Thr Asp Tyr Asn Asp Gly Phe Val Leu Pro Cys 35 40 45 Ala Ile Asp Tyr Gln Thr Val Ile Pro Asn Thr Arg Gly Thr Gly Asn 50 55 60 Ala Arg Gly Lys Pro Leu Leu Phe His Val His Gly Glu Pro Val Ser 65 70 75 80 Val Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln Gln Arg Pro 85 90 95 Leu Leu Lys His Gly Leu Val Cys Ile Thr Lys Asn Arg His Ile Asn 100 105 110 Tyr Glu Gln Phe Ala Ser Asn Gln Trp Asn Ser Thr Cys Thr Gly Ala 115 120 125 Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp Asn Gly Thr Lys 130 135 140 Ile Tyr Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Phe Val Thr Ala Tyr Ile Ser 145 150 155 160 Gly Arg Ser Tyr His Leu Asn Ile Asn Thr Asn Trp Phe Asn Asn Val 165 170 175 Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Thr Ala Thr Trp Glu Ala 180 185 190 （２）配列番号２１についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：４３６５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..４３６２ （xi）配列記載：配列番号：２１： ATG ATT GTG CTC GTA ACT TGC CTC TTG TTG TTA TGT TCA TAC CAC ACA 48 Met Ile Val Leu Val Thr Cys Leu Leu Leu Leu Cys Ser Tyr His Thr 1 5 10 15 GTT TTG AGT ACA ACA AAT AAT GAA TGC ATA CAA GTT AAC GTA ACA CAA 96 Val Leu Ser Thr Thr Asn Asn Glu Cys Ile Gln Val Asn Val Thr Gln 20 25 30 TTG GCT GGC AAT GAA AAC CTT ATC AGA GAT TTT CTG TTT AGT AAC TTT 144 Leu Ala Gly Asn Glu Asn Leu Ile Arg Asp Phe Leu Phe Ser Asn Phe 35 40 45 AAA GAA GAA GGA AGT GTA GTT GTT GGT GGT TAT TAC CCT ACA GAG GTG 192 Lys Glu Glu Gly Ser Val Val Val Gly Gly Tyr Tyr Pro Thr Glu Val 50 55 60 TGG TAC AAC TGC TCT AGA ACA GCA CAA ACT ACT GCC TTT CAG TAT TTT 240 Trp Tyr Asn Cys Ser Arg Thr Ala Gln Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Phe 65 70 75 80 AAT AAT ATA CAT GCC TTT TAT TTT GTT ATG GAA GCC ATG GAA AAT AGC 288 Asn Asn Ile His Ala Phe Tyr Phe Val Met Glu Ala Met Glu Asn Ser 85 90 95 ACT GGT AAT GCA CGT GGT AAA CCA TTA TTA TTT CAT GTG CAT GGT GAG 336 Thr Gly Asn Ala Arg Gly Lys Pro Leu Leu Phe His Val His Gly Glu 100 105 110 CCT GTT AGT GTT ATT ATA TAT ATA TCG GCT TAT AGG GAT GAT GTG CAA 384 Pro Val Ser Val Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln 115 120 125 CAA AGG CCC CTT TTA AAA CAT GGG TTA GTG TGC ATA ACT AAA AAT CGC 432 Gln Arg Pro Leu Leu Lys His Gly Leu Val Cys Ile Thr Lys Asn Arg 130 135 140 CAT ATT AAC TAT GAA CAA TTC ACC TCC AAC CAG TGG AAT TCC ACA TGT 480 His Ile Asn Tyr Glu Gln Phe Thr Ser Asn Gln Trp Asn Ser Thr Cys 145 150 155 160 ACG GGT GCT GAC AGA AAA ATT CCT TTC TCT GTC ATA CCC ACG GAC AAT 528 Thr Gly Ala Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp Asn 165 170 175 GGA ACA AAA ATC TAT GGT CTT GAG TGG AAT GAT GAC TTT GTT ACA GCT 576 Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Phe Val Thr Ala 180 185 190 TAT ATT AGT GGT CGT TCT TAT CAC TTG AAC ATC AAT ACT AAT TGG TTT 624 Tyr Ile Ser Gly Arg Ser Tyr His Leu Asn Ile Asn Thr Asn Trp Phe 195 200 205 AAC AAT GTC ACA CTT TTG TAT TCA CGC TCA AGC ACT GCT ACC TGG GAA 672 Asn Asn Val Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Thr Ala Thr Trp Glu 210 215 220 TAC AGT GCT GCA TAT GCT TAC CAA GGT GTT TCT AAC TTC ACT TAT TAC 720 Tyr Ser Ala Ala Tyr Ala Tyr Gln Gly Val Ser Asn Phe Thr Tyr Tyr 225 230 235 240 AAG TTA AAT AAC ACC AAT GGT CTA AAA ACC TAT GAA TTA TGT GAA GAT 768 Lys Leu Asn Asn Thr Asn Gly Leu Lys Thr Tyr Glu Leu Cys Glu Asp 245 250 255 TAT GAA CAT TGC ACT GGC TAT GCT ACC AAT GTA TTT GCT CCG ACA TCA 816 Tyr Glu His Cys Thr Gly Tyr Ala Thr Asn Val Phe Ala Pro Thr Ser 260 265 270 GGT GGT TAC ATA CCT GAT GGA TTT AGT TTT AAC AAT TGG TTC TTG CTT 864 Gly Gly Tyr Ile Pro Asp Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp Phe Leu Leu 275 280 285 ACA AAT AGT TCC ACT TTT GTT AGT GGC AGG TTT GTA ACA AAT CAA CCA 912 Thr Asn Ser Ser Thr Phe Val Ser Gly Arg Phe Val Thr Asn Gln Pro 290 295 300 TTA TTG ATT AAT TGC TTG TGG CCA GTG CCC AGT TTT GGT GTA GCA GCA 960 Leu Leu Ile Asn Cys Leu Trp Pro Val Pro Ser Phe Gly Val Ala Ala 305 310 315 320 CAA GAA TTT TGT TTT GAA GGT GCA CAG TTT AGC CAA TGT AAT GGT GTG 1008 Gln Glu Phe Cys Phe Glu Gly Ala Gln Phe Ser Gln Cys Asn Gly Val 325 330 335 TCT TTA AAT AAC ACA GTG GAT GTT ATT AGA TTC AAC CTT AAT TTC ACT 1056 Ser Leu Asn Asn Thr Val Asp Val Ile Arg Phe Asn Leu Asn Phe Thr 340 345 350 GCA GAT GTA CAA TCT GGT ATG GGT GCT ACA GTA TTT TCA CTG AAT ACA 1104 Ala Asp Val Gln Ser Gly Met Gly Ala Thr Val Phe Ser Leu Asn Thr 355 360 365 ACA GGT GGT GTC ATT CTT GAA ATT TCA TGT TAT AGT GAC ACA GTG AGT 1152 Thr Gly Gly Val Ile Leu Glu Ile Ser Cys Tyr Ser Asp Thr Val Ser 370 375 380 GAG TCT AGT TCT TAC AGT TAT GGT GAA ATC CCG TTC GGC ATA ACT GAC 1200 Glu Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Glu Ile Pro Phe Gly Ile Thr Asp 385 390 395 400 GGA CCA CGA TAC TGT TAT GTA CTT TAC AAT GGC ACA GCT CTT AAA TAT 1248 Gly Pro Arg Tyr Cys Tyr Val Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Leu Lys Tyr 405 410 415 TTA GGA ACA TTA CCA CCC AGT GTA AAG GAA ATT GCT ATT AGT AAG TGG 1296 Leu Gly Thr Leu Pro Pro Ser Val Lys Glu Ile Ala Ile Ser Lys Trp 420 425 430 GGC CAT TTT TAT ATT AAT GGT TAC AAT TTC TTT AGC ACA TTT CCT ATT 1344 Gly His Phe Tyr Ile Asn Gly Tyr Asn Phe Phe Ser Thr Phe Pro Ile 435 440 445 GGT TGT ATA TCT TTT AAT TTA ACC ACT GGT GCT AGT GGA GCT TTT TGG 1392 Gly Cys Ile Ser Phe Asn Leu Thr Thr Gly Ala Ser Gly Ala Phe Trp 450 455 460 ACA ATT GCT TAC ACA TCG TAT ACT GAA GCA TTA GTA CAA GTT GAA AAC 1440 Thr Ile Ala Tyr Thr Ser Tyr Thr Glu Ala Leu Val Gln Val Glu Asn 465 470 475 480 ACA GCT ATT AAA AAT GTG ACG TAT TGT AAC AGT CAC ATT AAT AAC ATT 1488 Thr Ala Ile Lys Asn Val Thr Tyr Cys Asn Ser His Ile Asn Asn Ile 485 490 495 AAA TGT TCT CAA CTT ACT GCT AAT TTG AAT AAT GGA TTT TAT CCT GTT 1536 Lys Cys Ser Gln Leu Thr Ala Asn Leu Asn Asn Gly Phe Tyr Pro Val 500 505 510 GCT TCA AGT GAA GTA GGT TTC GTT AAT AAG AGT GTT GTG TTA TTA CCT 1584 Ala Ser Ser Glu Val Gly Phe Val Asn Lys Ser Val Val Leu Leu Pro 515 520 525 AGC TTT TTC ACA CAC ACC GCT GTC AAT ATA ACC ATT GAT CTT GGT ATG 1632 Ser Phe Phe Thr His Thr Ala Val Asn Ile Thr Ile Asp Leu Gly Met 530 535 540 AAG CTT AGT GGT TAT GGT CAA CCC ATA GCC TCG ACA CTA AGT AAC ATC 1680 Lys Leu Ser Gly Tyr Gly Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu Ser Asn Ile 545 550 555 560 ACA CTA CCA ATG CAG GAT AAC AAT ACT GAT GTG TAC TGT ATT CGT TCT 1728 Thr Leu Pro Met Gln Asp Asn Asn Thr Asp Val Tyr Cys Ile Arg Ser 565 570 575 AAC CAA TTC TCA GTT TAT GTT CCT TCC ACT TGC AAA AGT TCT TTA TGG 1776 Asn Gln Phe Ser Val Tyr Val Pro Ser Thr Cys Lys Ser Ser Leu Trp 580 585 590 GAC AAT ATT TTT AAT CAA GAC TGC ACG GAT GTT TTA GAG GCT ACA GCT 1824 Asp Asn Ile Phe Asn Gln Asp Cys Thr Asp Val Leu Glu Ala Thr Ala 595 600 605 GTT ATA AAA ACT GGT ACT TGT CCT TTC TCA TTT GAT AAA TTG AAC AAT 1872 Val Ile Lys Thr Gly Thr Cys Pro Phe Ser Phe Asp Lys Leu Asn Asn 610 615 620 TAC TTG ACT TTT AAC AAG TTC TGT TTG TCG TTG AGT CCT GTT GGT GCT 1920 Tyr Leu Thr Phe Asn Lys Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Val Gly Ala 625 630 635 640 AAT TGC AAG TTT GAT GTT GCT GCA CGT ACA AGA ACC AAT GAG CAG GTT 1968 Asn Cys Lys Phe Asp Val Ala Ala Arg Thr Arg Thr Asn Glu Gln Val 645 650 655 GTT AGA AGT CTA TAT GTA ATA TAT GAA GAA GGA GAC AAC ATA GTG GGT 2016 Val Arg Ser Leu Tyr Val Ile Tyr Glu Glu Gly Asp Asn Ile Val Gly 660 665 670 GTA CCG TCT GAT AAT AGC GGT CTG CAC GAT TTG TCT GTG CTA CAC CTA 2064 Val Pro Ser Asp Asn Ser Gly Leu His Asp Leu Ser Val Leu His Leu 675 680 685 GAC TCC TGT ACA GAT TAC AAT ATA TAT GGT AGA ACT GGT GTT GGT ATT 2112 Asp Ser Cys Thr Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Thr Gly Val Gly Ile 690 695 700 ATT AGA CGA ACT AAC AGT ACG CTA CTT AGT GGC TTA TAT TAC ACA TCA 2160 Ile Arg Arg Thr Asn Ser Thr Leu Leu Ser Gly Leu Tyr Tyr Thr Ser 705 710 715 720 CTA TCA GGT GAT TTG TTA GGC TTT AAA AAT GTT AGT GAT GGT GTC ATT 2208 Leu Ser Gly Asp Leu Leu Gly Phe Lys Asn Val Ser Asp Gly Val Ile 725 730 735 TAT TCT GTG ACG CCA TGT GAT GTA AGC GCA CAA GCG GCT GTT ATT GAT 2256 Tyr Ser Val Thr Pro Cys Asp Val Ser Ala Gln Ala Ala Val Ile Asp 740 745 750 GGT GCC ATA GTT GGA GCT ATG ACT TCC ATT AAC AGT GAA CTG TTA GGT 2304 Gly Ala Ile Val Gly Ala Met Thr Ser Ile Asn Ser Glu Leu Leu Gly 755 760 765 CTA ACA CAT TGG ACA ACG ACA CCT AAT TTT TAT TAC TAC TCT ATA TAT 2352 Leu Thr His Trp Thr Thr Thr Pro Asn Phe Tyr Tyr Tyr Ser Ile Tyr 770 775 780 AAT TAC ACA AGT GAG AGG ACT CGT GGC ACT GCA ATT GAC AGT AAC GAT 2400 Asn Tyr Thr Ser Glu Arg Thr Arg Gly Thr Ala Ile Asp Ser Asn Asp 785 790 795 800 GTT GAT TGT GAA CCT GTC ATA ACC TAT TCT AAT ATA GGT GTT TGT AAA 2448 Val Asp Cys Glu Pro Val Ile Thr Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys 805 810 815 AAT GGT GCT TTG GTT TTT ATT AAC GTC ACA CAT TCT GAC GGA GAC GTG 2496 Asn Gly Ala Leu Val Phe Ile Asn Val Thr His Ser Asp Gly Asp Val 820 825 830 CAA CCA ATT AGC ACT GGT AAT GTC ACG ATA CCT ACA AAT TTT ACC ATA 2544 Gln Pro Ile Ser Thr Gly Asn Val Thr Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 835 840 845 TCT GTG CAA GTT GAA TAC ATG CAG GTT TAC ACT ACA CCA GTA TCA ATA 2592 Ser Val Gln Val Glu Tyr Met Gln Val Tyr Thr Thr Pro Val Ser Ile 850 855 860 GAT TGT GCA AGA TAC GTT TGT AAT GGT AAC CCT AGA TGT AAC AAA TTG 2640 Asp Cys Ala Arg 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ACC TTC ACC AGC 48 Leu Cys Ile Thr Lys Asn Arg Asn Ile Asp Tyr Asn Thr Phe Thr Ser 1 5 10 15 AAC CAG TGG GAT TCC ATA 66 Asn Gln Trp Asp Ser Ile 20 （２）配列番号４６についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：２２アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：４６： Leu Cys Ile Thr Lys Asn Arg Asn Ile Asp Tyr Asn Thr Phe Thr Ser 1 5 10 15 Asn Gln Trp Asp Ser Ile 20 （２）配列番号４７についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..２４ （xi）配列記載：配列番号：４７： AAT CGC AAT ATT GAC TAT AAC ACC 24 Asn Arg Asn Ile Asp Tyr Asn Thr 1 5 （２）配列番号４８についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：４８： Asn Arg Asn Ile Asp Tyr Asn Thr 1 5 （２）配列番号４９についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..１８ （xi）配列記載：配列番号：４９： AAT TGG AAC ATC AAT AAT 18 Asn Trp Asn Ile Asn Asn 1 5 （２）配列番号５０についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：５０： Asn Trp Asn Ile Asn Asn 1 5 （２）配列番号５１についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：未知 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..２４ （xi）配列記載：配列番号：５１： ATC TTT TTC GCA CAT ACC GCT ATC 24 Ile Phe Phe Ala His Thr Ala Ile 1 5 （２）配列番号５２についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：５２： Ile Phe Phe Ala His Thr Ala Ile 1 5 （２）配列番号５３についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：３７７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖性：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：未知 （ii）分子タイプ：ｃＤＮＡ （ix）特徴： （Ａ）名称／キイ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１..３７５ （xi）配列記載：配列番号：５３： AAT GCT CGT GGT AAA CCA TTA TTA TTT CAT GTG CAT GGT GAG CCT GTT 48 Asn Ala Arg Gly Lys Pro Leu Leu Phe His Val His Gly Glu Pro Val 1 5 10 15 AGT GTT ATT ATA TAT ATA TCG GCT TAT AGG GAT GAT GTG CAA CAA AGG 96 Ser Val Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln Gln Arg 20 25 30 CCC CTT TTA AAA CAT GGG TTA GTG TGC ATA ACT AAA AAT CGC CAT ATT 144 Pro Leu Leu Lys His Gly Leu Val Cys Ile Thr Lys Asn Arg His Ile 35 40 45 AAC TAT GAA CAA TTC ACC TCC AAC CAG TGG AAT TCC ACA TGT ACG GGT 192 Asn Tyr Glu Gln Phe Thr Ser Asn Gln Trp Asn Ser Thr Cys Thr Gly 50 55 60 GCT GAC AGA AAA ATT CCT TTC TCT GTC ATA CCC ACG GAC AAT GGA ACA 240 Ala Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp Asn Gly Thr 65 70 75 80 AAA ATC TAT GGT CTT GAG TGG AAT GAT GAC TTT GTT ACA GCT TAT ATT 288 Lys Ile Tyr Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Phe Val Thr Ala Tyr Ile 85 90 95 AGT GGT CGT TCT TAT CAC TTG AAC ATC AAT ACT AAT TGG TTT AAC AAT 336 Ser Gly Arg Ser Tyr His Leu Asn Ile Asn Thr Asn Trp Phe Asn Asn 100 105 110 GTC ACA CTT TTG TAT TCA CGC TCA AGC ACT GCT ACC TGG GA 377 Val Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Thr Ala Thr Trp 115 120 125 （２）配列番号５４についての情報： （i）配列特徴： （Ａ）長さ：１２５アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：リニアー （ii）分子タイプ：蛋白 （xi）配列記載：配列番号：５４： Asn Ala Arg Gly Lys Pro Leu Leu Phe His Val His Gly Glu Pro Val 1 5 10 15 Ser Val Ile Ile Tyr Ile Ser Ala Tyr Arg Asp Asp Val Gln Gln Arg 20 25 30 Pro Leu Leu Lys His Gly Leu Val Cys Ile Thr Lys Asn Arg His Ile 35 40 45 Asn Tyr Glu Gln Phe Thr Ser Asn Gln Trp Asn Ser Thr Cys Thr Gly 50 55 60 Ala Asp Arg Lys Ile Pro Phe Ser Val Ile Pro Thr Asp Asn Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ile Tyr Gly Leu Glu Trp Asn Asp Asp Phe Val Thr Ala Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Arg Ser Tyr His Leu Asn Ile Asn Thr Asn Trp Phe Asn Asn 100 105 110 Val Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Ser Ser Thr Ala Thr Trp 115 120 125
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＯＴＳＫＦ３３細菌発現ベクターの図であ
る。
【図２】 ｐＯＴＳＫＦ３３のＸｍａＩ−ＳｔｕＩ部位
中にクローニングされたＰＣＲ増幅断片を含有するプラ
スミドを例示する。
【図３】 ＰＣＲ発現クローンＡＲ５８−３のヌクレオ
チド［配列番号１９］およびアミノ酸配列［配列番号２
０］を例示する。
【図４】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。
【図５】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図４の続きである。
【図６】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図５の続きである。
【図７】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図６の続きである。
【図８】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図７の続きである。
【図９】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示す
る。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変化
および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの配
列（ＤＦ２ ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図８の続きである。
【図１０】 ＤＦ２ ＦＩＰＶのＳ遺伝子ヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号２１および２２］を例示
する。また、ＤＦ２−ＨＰの配列の上のヌクレオチド変
化および下のアミノ酸相違を除き、ＤＦ２ ＦＩＰＶの
配列（ＤＦ２ＦＩＰＶが配列決定されている範囲で）と
同一であるＤＦ２−ＨＰの配列の断片［配列番号２３お
よび２４］の一部を例示する。図９の続きである。
【図１１】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。
【図１２】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１１の続きである。
【図１３】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１２の続きである。
【図１４】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１３の続きである。
【図１５】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１４の続きである。
【図１６】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１５の続きである。
【図１７】 配列がＴＳ ＦＩＰＶの配列［配列番号２
５および２６］と異なる位置を示すことにより、Ｓ遺伝
子ＴＳ−ＢＰヌクレオチド配列［配列番号２７］および
アミノ酸配列［配列番号２８］の断片の一部を例示す
る。図１６の続きである。
【図１８】 ＴＮ４０６のＳ遺伝子ヌクレオチドおよび
アミノ酸配列の断片［配列番号２９および３０］を例示
する。
【図１９】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。
【図２０】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。図１９の続きである。
【図２１】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。図２０の続きである。
【図２２】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。図２１の続きである。
【図２３】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。図２２の続きである。
【図２４】 ＦＥＣＶ Ｓ遺伝子の完全なヌクレオチド
およびアミノ酸配列［配列番号３１および３２］の一部
を例示する。図２３の続きである。
【図２５】 ＵＣＤ−２ Ｓ遺伝子のヌクレオチドおよ
びアミノ酸配列の断片を例示する。
【図２６】 共通部分的Ｓ遺伝子配列のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号３３および３４］の一部を
例示する。図２５の続きである。
【図２７】 共通部分的Ｓ遺伝子配列のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号３３および３４］の一部を
例示する。図２６の続きである。
【図２８】 共通部分的Ｓ遺伝子配列のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号３３および３４］の一部を
例示する。図２７の続きである。
【図２９】 共通部分的Ｓ遺伝子配列のヌクレオチドお
よびアミノ酸配列［配列番号３３および３４］の一部を
例示する。図２８の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アルバート・ポール・リード アメリカ合衆国ペンシルベニア州19341、 エクストン、ベーカー・サークル117番 (72)発明者 シャロン・アール・クレプファー アメリカ合衆国ペンシルベニア州19018、 クリフトン・ハイツ、エヌ・グレンウッ ド・アベニュー136番 (72)発明者 ナンシー・イー・フェイファー アメリカ合衆国ネブラスカ州68434、スウ ォード、ボックス20、ルート１番 (72)発明者 ブライアン・ティー・スーター アメリカ合衆国ネブラスカ州68516、リン カーン、サウス・フォーティーセカンド・ ストリート6211番 (72)発明者 エイレン・ブイ・ジョーンズ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19151、 グリーンヒル・ファームズ、アンダバー・ ロード1217番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG31 CA02 CA19 CC24 DA01 4C084 AA02 BA23 NA14 ZB33 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA86 EA20 FA74

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号３２のアミノ酸配列を含む単離
    ペプチドまたは蛋白。
  2. 【請求項２】 配列番号３２のアミノ酸残基番号１８−
    ２６、４６−５３、７３−７８、９４−２２３、１２４
    −１７４、１２１−１８０、１３７−１５１、１４５−
    １５０、１３８−１５９、１４３−１５０、２００−２
    ０５、５２９−５３６、１−３６０および１−７４８か
    らなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチ
    ドまたは蛋白。
  3. 【請求項３】 選択された融合相手に融合した請求項１
    または２記載のペプチドまたは蛋白。
  4. 【請求項４】 選択された融合相手がガラクトキナー
    ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、α交配因子お
    よびインフルエンザＮＳ−１からなる群より選択される
    か、またはその一部である、請求項３記載のペプチドま
    たは蛋白。
  5. 【請求項５】 請求項１ないし４に記載のいずれかのペ
    プチドまたは蛋白をコードするヌクレオチド配列のみか
    らなる単離ＤＮＡ分子。
  6. 【請求項６】 選択された宿主細胞中でＤＮＡ分子によ
    りコードされるペプチドまたは蛋白の発現を方向付ける
    ことのできる調節配列と機能的に関連している請求項５
    記載の単離ＤＮＡ分子。
  7. 【請求項７】 ネココロナウイルスにより引き起こされ
    る疾患の診断、治療または予防に有用な組換え蛋白の製
    法であって、その組換え蛋白の発現に資する条件下で、
    形質転換した選択された宿主細胞を請求項６のＤＮＡ分
    子と共に培養し、その発現した組換え蛋白を集めること
    を特徴とする方法。
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