CN113072626A - 一种猫冠状病毒s重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种猫冠状病毒s重组蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。本公开还提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；(b)将S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞；(c)将质粒和原核表达载体连接，得到重组质粒。(d)将重组质粒转化至BL21进行原核表达，得到猫冠状病毒S重组蛋白。本发明人首次发现了位于FCoV S2蛋白中的蛋白片段具有良好的反应原性和免疫原性，可作为后续研究和开发FCoV疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。

Description

一种猫冠状病毒S重组蛋白及其制备方法
技术领域
本公开涉及基因重组的技术领域，尤其涉及一种猫冠状病毒S重组蛋白及其制备方法。
背景技术
猫传染性腹膜炎是由猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)引起的慢性致死性疾病，以腹膜炎、大量腹水积聚或各脏器出现肉芽肿病变为主要特征，不同年龄的猫均可感染，但老龄猫和2岁以内的猫发病率较高，纯种猫发病率高于一般品种的家猫，传染率非常高。FCoV为不分节段、单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovi-rale)，冠状病毒科(Coronaviridae)，α冠状病毒(Alphacoronavirus)。FCoV有11个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，以及7种非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a、7b，和复制酶1a和1b。冠状病毒S蛋白全长为12-24nm，呈穹顶状，排列方式类似于王冠样，是病毒表面最大的结构蛋白。S蛋白是机体识别病原的主要靶蛋白，它能够介导病毒与宿主细胞的识别以及侵入过程的膜融合。研究表明，S蛋白在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用，是基因工程疫苗和诊断技术等方面研究中是最重要的一个靶蛋白。S蛋白包括S1和S2功能域。其中，S1功能域含有受体结合区域RBD以及大量抗原表位区域，然而S1功能域变异性较高，不利于作为靶蛋白区域；而S2功能域是S蛋白中较为保守的部分，介导病毒和细胞膜的融合，且含有丰富的抗原表位。
本发明人通过生物信息学软件预测分析FCoV S蛋白。根据亲水性、表面极性、抗原性以及二级结构特征等，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性，可作为后续研究冠状病毒的新蛋白材料。
发明内容
本公开提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白，可作为后续研究FCoV及开发FCoV药物的基础。
本公开还提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；
(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；
(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S；
(d)将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应体系为：扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfu PCR SuperMix12.5μL、上下游引物各1μL、模板1μL，补充灭菌ddH2O至终体积25μL。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述载体为pMD18-T载体。
根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DH5α；所述双酶切的位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。
根据本公开的至少一个实施方式，所述的制备方法还包括步骤(e)将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清，得到纯化的FCoV-S重组蛋白。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白在制备FCoV疫苗中的应用。
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒S重组蛋白在制备FCoV检测试剂盒中的应用。
采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
通过生物信息学软件的分析方法，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性，且该蛋白片段在FCoV毒株之间具有保守性，由此得到了本公开的猫冠状病毒S重组蛋白，可作为后续研究和开发FCoV疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。
附图说明
附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
图1是本公开FCoV S蛋白的信号肽切割位点预测结果。
图2是本公开FCoV S蛋白的穿膜螺旋预测结果。
图3是本公开FCoV S蛋白的N-糖基化位点预测结果。
图4是本公开FCoV S蛋白的DNASTAR分析结果。
图5是本公开FCoV S蛋白的PCR扩增结果；其中，M:GL2000Maker，1：阴性对照；2：目的片段。
图6是本公开FCoV S蛋白的SDS-PAGE结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：未诱导；2：诱导1h；3：诱导2h；4：诱导3h；5：诱导4h；6：诱导5h。
图7是本公开FCoV S蛋白的SDS-PAGE结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：未诱导；2：诱导全菌；3：诱导后超声上清；4：诱导后超声沉淀；5：纯化FCoV S蛋白。
图8是本公开FCoV S蛋白的纯化结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：本公开S重组蛋白(阳性猫血清为一抗)。
图9是本公开FCoV S蛋白免疫小鼠的结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
本公开提供了一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；
所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示；PCR扩增反应体系为：扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfu PCRSuperMix12.5μL、上下游引物各1μL、模板1μL，补充灭菌ddH2O至终体积25μL；PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至pMD18-T载体上，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；所述双酶切的位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。
(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S。
(d)将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白。
(e)将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清，得到纯化的FCoV-S重组蛋白。
本公开生物信息学分析FCoV S蛋白结构域：
在DNAstar分析软件上输入FCoV S蛋白的氨基酸序列，对S蛋白进行了二级结构的初步预测。通过预测结果得到了3个紧密螺旋区域。
如图1所示，信号肽切割位点及穿膜螺旋预测结果表明，FCoV S蛋白的信号肽切割位点位于N-端14位氨基酸残基丝氨酸(Ser)和15位氨基酸残基苏氨酸(Thr)之间，即1-14aa为蛋白的信号肽。如图2所示，穿膜结构的预测结果表明，FCoV S蛋白的穿膜结构位于1406-1427aa之间，1-1405aa位于膜外。如图3所示，N-糖基化位点预测结果显示，S蛋白共有24个糖基化位点，其中3个糖基化的可能性很高。
通过DNASTAR-protein软件对FCoV S蛋白的可及性进行预测，如图4所示，分析结果显示，在FCoV S蛋白中，存在着60个氨基酸残基暴露比较连续的片段；亲水性预测结果表明，FCoV S蛋白中有4个明显的亲水性区域；β-转角(β-turn)的预测工作采用DNASTAR生物学分析软件，分析结果表明FCoV S蛋白共形成97个β转角。
参考亲水性、可及性等预测分析结果，本公开选择FCoV S蛋白中1127-1400aa为目的片段，该段片段位于S2功能域，含有丰富的抗原表位，易于体外原核表达，且在FCoV毒株中具有保守性。
实施例猫冠状病毒S重组蛋白的基因克隆及表达载体的构建
(1)引物设计与合成
参照GenBank中发表的FCoV S蛋白基因序列，设计合成一对特异性引物：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。在下游引物中设计双酶切位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化和测序。
(2)利用上述引物进行PCR
以猫冠状病毒S蛋白基因为模板，扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfuPCR SuperMix 12.5μL、上下游引物各1μL、质粒模板1μL，补充灭菌ddH2O至终体积25μL。反应条件：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。反应结束，取10μL PCR产物进行核酸电泳鉴定，产物经电泳分离，凝胶切割纯化，克隆至pMD18-T载体上，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；涂布卡那霉素抗性平板过夜，挑取孤立的白色菌落，提取质粒双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序。
(3)表达载体的构建及表达
将鉴定正确的阳性克隆质粒用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切反应，酶切下的目的基因片段与表达载体pET-28a的线性化片段连接。取10μL连接反应液转化BL21(DE3)感受态细胞。挑取单个转化菌落接种于5mL含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，培养后提取质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定，酶切结果如图5所示，得到了822bp的目的片段；鉴定结果表明，已成功构建重组原核表达载体。
将阳性重组质粒转化入BL21感受态细胞中，分别接种含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，37℃振摇培养过夜。然后取此过夜培养的菌液按1％分别接种于含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8时，加入0.5mmol/L IPTG 37℃振摇4～8h，每个时段时各取1mL菌液，4℃，4000×g离心10min收集菌体，裂解细胞，进行SDS-PAGE电泳，得到分子量为32KDa的目的蛋白片段。摸索最佳诱导时间，分别继续诱导培养至1h、2h、3h、4h、5h、6h，各取1mL菌液进行鉴定，结果如图6所示，结果表明重组蛋白在第4h诱导表达量最高且纯化后的蛋白纯度高。
(4)重组融合蛋白的纯化
先将上述菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清。将纯化的重组融合蛋白进行SDS-PAGE电泳后，电泳结果如图7所示，电转移到硝酸纤维素膜，进行Western blot鉴定，如图8所示，结果表明本公开的猫冠状病毒S重组蛋白能够与猫血清反应，具有生物反应原性。将纯化并经鉴定的重组蛋白质用PBS透析后分装后进行蛋白浓度测定。将本公开的猫冠状病毒S重组蛋白免疫小鼠3次，同时设置对照组，进行ELISA测定，如图9所示，结果表明：本公开的猫冠状病毒S重组蛋白具有良好的免疫原性。
本发明人通过生物信息学软件预测分析FCoV S蛋白。根据亲水性、表面极性、抗原性以及二级结构特征等，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性，且该蛋白片段在FCoV毒株之间具有保守性，由此得到了本公开的猫冠状病毒S重组蛋白，可作为后续研究和开发FCoV疫苗及相关诊断检测试剂盒的基础。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种猫冠状病毒S重组蛋白及其制备方法
<130> P210589
<141> 2021-04-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gln Gly Glu Ala Leu Ser Gln Leu Thr Ser Gln
20 25 30
Leu Gln Lys Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Ala Glu Ile Tyr
35 40 45
Asn Arg Leu Glu Lys Ala Glu Ala Asp Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile
50 55 60
Thr Gly Arg Leu Ala Ala Leu Asn Ala Tyr Val Ser Gln Thr Leu Thr
65 70 75 80
Gln Tyr Ala Glu Val Lys Ala Ser Arg Gln Leu Ala Met Glu Lys Val
85 90 95
Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Asp Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Asn
100 105 110
Gly Thr His Leu Phe Ser Leu Val Asn Ser Ala Pro Asp Gly Leu Leu
115 120 125
Phe Phe His Thr Val Leu Leu Pro Thr Glu Trp Glu Lys Val Thr Ala
130 135 140
Trp Ser Gly Ile Cys Val Asn His Thr Tyr Ala Tyr Val Leu Lys Asp
145 150 155 160
Phe Asp His Ser Ile Phe Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Met Val Thr Pro
165 170 175
Arg Asn Met Phe Gln Pro Arg Lys Pro Gln Met Ser Asp Phe Val Gln
180 185 190
Ile Thr Ser Cys Glu Val Thr Phe Leu Asn Thr Thr Tyr Thr Met Phe
195 200 205
Gln Asn Ile Val Val Asp Tyr Ile Asp Ile Asn Lys Thr Ile Ala Asp
210 215 220
Met Leu Glu Gln Tyr Tyr Ser Asn Tyr Thr Thr Pro Glu Leu Asp Leu
225 230 235 240
Gln Leu Glu Ile Phe Asn Gln Thr Lys Leu Asn Phe Thr Ala Glu Ile
245 250 255
Asp Gln Leu Glu Gln Arg Ala Asp Asn Leu Thr Thr Ile Ala His Glu
260 265 270
Leu Gln Gln Tyr Ile Asp Asn Leu Asn Lys Thr Leu Val Asp Leu Glu
275 280 285
Trp Leu Asn Arg Ile Glu Thr
290 295
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatgcagg gtgaagcact g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagttag gtttcaatgc g 21

Claims (10)

1.一种猫冠状病毒S重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种猫冠状病毒S重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；
(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；
(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S；
(d)将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应体系为：扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfu PCR SuperMix12.5μL、上下游引物各1μL、模板1μL，补充灭菌ddH2O至终体积25μL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述载体为pMD18-T载体。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DH5α；所述双酶切的位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括步骤(e)将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清，得到纯化的FCoV-S重组蛋白。
9.一种如权利要求1所述的猫冠状病毒S重组蛋白在制备FCoV疫苗中的应用。
10.一种如权利要求1所述的猫冠状病毒S重组蛋白在制备FCoV检测试剂盒中的应用。
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