CN113203854B

CN113203854B - 用于检测猫冠状病毒抗体的间接elisa试剂盒

Info

Publication number: CN113203854B
Application number: CN202110449806.9A
Authority: CN
Inventors: 林炜明; 董波; 章高强; 陈雪菲; 张晓东; 李成钰; 魏兰
Original assignee: Longyan University
Current assignee: Longyan University
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113203854A

Abstract

本公开提供了一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒中含有包被抗原S重组蛋白；所述S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本公开还提供了上述试剂盒在猫冠状病毒抗体检测中的应用。本发明人依据间接ELISA的原理，研制了猫冠状病毒抗体的ELISA检测试剂盒，首先，通过筛选抗原性强且保守的猫冠状病毒S2蛋白，扩增和克隆基因；然后构建原核表达载体，原核表达融合蛋白：接着通过Western blotting进行免疫原性分析，将该S重组蛋白进行纯化作为包被抗原，最终获得了灵敏度较高、特异性强、稳定性好的间接ELISA试剂盒。

Description

用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒

技术领域

本公开涉及抗体检测的技术领域，尤其涉及一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)为不分节段、单股正链RNA病毒，基因组大小约30kb，属于尼多病毒目(Nidovi-rale)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒(Alphacoronavirus)。FCoV有11个开放阅读框(ORF)，编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)，以及7种非结构蛋白：辅助蛋白3a、3b、3c、7a、7b，和复制酶1a和1b。冠状病毒S蛋白全长为12-24nm，呈穹顶状，排列方式类似于皇冠样，是病毒表面最大的结构蛋白。S蛋白在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中都发挥重要生物学作用，是基因工程疫苗和诊断技术等方面研究中是最重要的蛋白。其中，S1功能域含有受体结合区域RBD以及大量抗原表位区域，然而S1功能域变异性较高，不利于作为靶蛋白区域；而S2功能域是S蛋白中较为保守的部分，介导病毒和细胞膜的融合，且含有丰富的抗原表位。

本发明人前期通过生物信息学软件预测分析FCoV S蛋白。根据亲水性、表面极性、抗原性以及二级结构特征等，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性。有鉴于此，本发明人研究和设计出了一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

发明内容

本公开提供了一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，通过本公开首次发现的特异性抗原S重组蛋白，可以有效检测猫感染冠状病毒产生的抗体，也可以用于猫接种疫苗后免疫效果的评价。

根据本公开的一个方面，一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，所述试剂盒中含有包被抗原S重组蛋白；所述S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本公开的至少一个实施方式，所述S重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；

(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；

(c)将上述测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S；

(d)将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白；

(e)将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清，得到纯化的FCoV-S重组蛋白。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应体系为：扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfu PCR SuperMix12.5μL、上下游引物各1μL、模板1μL，补充灭菌ddH₂O至终体积25μL。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(a)中，所述PCR扩增：PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述载体为pMD18-T载体。

根据本公开的至少一个实施方式，所述步骤(b)中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DH5α；所述双酶切的位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。

根据本公开的至少一个实施方式，所述试剂盒还任选包括ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液的一种或几种。

根据本公开的至少一个实施方式，所述包被抗原的最佳包被浓度为4μg/ml。

根据本公开的至少一个实施方式，所述酶标抗体工作液为HRP标记的羊抗猫二抗。

根据本公开的一个方面，上述试剂盒在猫冠状病毒抗体检测中的应用，所述试剂盒检测猫冠状病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将纯化的S重组蛋白按照4μg/ml浓度溶于包被液中，加入ELISA板中，4℃包被过夜，PBST洗涤3遍；将阳性对照血清及阴性对照血清按1：400稀释后，分别加入ELISA板；剩下的孔用于检测待检样品，1：400稀释，37℃反应1h；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的羊抗猫二抗，室温反应1h；PBST洗涤3遍后，进行显示5min，之后加入终止液终止显示，读取OD450吸光值，OD450大于1的孔判为阳性。

采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：

本发明人依据间接ELISA的原理，研制了用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，首先，通过筛选抗原性强且保守的猫冠状病毒S2蛋白，扩增和克隆基因；然后构建原核表达载体，原核表达融合蛋白：接着通过Western blotting进行免疫原性分析，将该S重组蛋白进行纯化作为包被抗原，最终获得了灵敏度较高、特异性强、稳定性好的间接ELISA试剂盒。

附图说明

附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。

图1是本公开FCoV S蛋白的PCR扩增结果；其中，M:GL2000Maker，1：阴性对照；2：目的片段。

图2是本公开FCoV S蛋白的SDS-PAGE结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：未诱导；2：诱导1h；3：诱导2h；4：诱导3h；5：诱导4h；6：诱导5h。

图3是本公开FCoV S蛋白的SDS-PAGE结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：未诱导；2：诱导全菌；3：诱导后超声上清；4：诱导后超声沉淀；5：纯化FCoV S蛋白。

图4是本公开FCoV S蛋白的纯化结果；其中，M:蛋白预染Maker，1：本公开S重组蛋白(FCoV阳性猫血清为一抗)。

图5是本公开FCoV S蛋白免疫小鼠的结果。

图6是本公开敏感性试验。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。

实施例1猫冠状病毒S重组蛋白的克隆测序分析、表达和纯化

(1)引物设计与合成

参照GenBank中发表的FCoV S蛋白基因序列，设计合成一对特异性引物：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。在下游引物中设计双酶切位点分别为NdeⅠ和XhoⅠ。引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化和测序。

(2)利用上述引物进行PCR

以猫冠状病毒S蛋白基因为模板，扩增体系为25μL，其中2×TransStart FastPfuPCR SuperMix 12.5μL、上下游引物各1μL、质粒模板1μL，补充灭菌ddH₂O至终体积25μL。反应条件：94℃预变性2min后进入循环，94℃变性20s；55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸5min。反应结束，取10μL PCR产物进行核酸电泳鉴定，产物经电泳分离，凝胶切割纯化，克隆至pMD18-T载体上，并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；涂布卡那霉素抗性平板过夜，挑取孤立的白色菌落，提取质粒双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司测序。

(3)表达载体的构建及表达

将鉴定正确的阳性克隆质粒用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切反应，酶切下的目的基因片段与表达载体pET-28a的线性化片段连接。取10μL连接反应液转化BL21(DE3)感受态细胞。挑取单个转化菌落接种于5mL含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，培养后提取质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定，酶切结果如图1所示，得到了822bp的目的片段；鉴定结果表明，已成功构建重组原核表达载体。

将阳性重组质粒转化入BL21感受态细胞中，分别接种含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，37℃振摇培养过夜。然后取此过夜培养的菌液按1％分别接种于含有卡那霉素的LB(100μg/mL)液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8时，加入0.5mmol/L IPTG 37℃振摇4～8h，每个时段时各取1mL菌液，4℃，4000×g离心10min收集菌体，裂解细胞，进行SDS-PAGE电泳，得到分子量为32KDa的目的蛋白片段。摸索最佳诱导时间，分别继续诱导培养至1h、2h、3h、4h、5h、6h，各取1mL菌液进行鉴定，结果如图2所示，结果表明重组蛋白在第4h诱导表达量最高且纯化后的蛋白纯度高。

实施例2S重组蛋白的反应原性和免疫原性鉴定

先将上述菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清。将纯化的重组融合蛋白进行SDS-PAGE电泳后，电泳结果如图3所示，电转移到硝酸纤维素膜，进行Western blot鉴定，如图4所示，结果表明本公开的猫冠状病毒S重组蛋白能够与猫血清反应，具有生物反应原性。将纯化并经鉴定的重组蛋白质用PBS透析后分装后进行蛋白浓度测定。将本公开的猫冠状病毒S重组蛋白免疫小鼠3次，同时设置对照组，进行ELISA测定，如图5所示，结果表明：本公开的猫冠状病毒S重组蛋白具有良好的免疫原性。

实施例3用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒的研制

1、抗原最佳包被浓度和最佳二抗浓度的确定

(1)将纯化的蛋白按照适当浓度溶于包被液中，横排从左到右开始浓度开始进行倍比稀释(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml)。将抗原按照每孔50μl加入ELISA板中进行4℃过夜包被。

(2)将包被结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min，用5％的脱脂乳按100μl/孔，于37℃条件下封闭2h。

(3)将封闭结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min，用1:200的浓度按照50μl/孔的阳性血清(一抗)于37℃条件下孵育1h。

(4)将孵育一抗结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min，纵排将羊抗猫二抗，原液浓度为1mg/ml，分别进行倍比稀释(1：2500、1：5000、1：10000、1：20000、1：40000、1：80000)，各加50μL按照50μl/孔的二抗于37℃条件下孵育1h。

(5)将孵育二抗结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min。

(6)加入TMB单组份显色液，每孔100μl，显色5min。

(7)加终止液100μl，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，取三个复孔平均值表示OD值，选择阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，作为理想的条件，并适当参考P/N值筛选出最佳结果。本发明采用经临床和PCR检测确诊感染猫传染性腹膜炎的猫血清为阳性血清，采用健康、无特定病原体感染的幼猫血清为阴性血清。

结果如表1所示，由此可见，当S重组蛋白浓度为4μg/ml和二抗稀释度为1：20000时，阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，P/N值为8.25，所以抗原最佳包被浓度为4μg/ml，最佳二抗稀释度为1：20000。

表1抗原最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定

2、最佳一抗稀释度的确定

以4μg/ml的S重组蛋白4℃过夜包被，二抗为1：20000的浓度，通过棋盘法摸索血清稀释度为1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200时的最佳一抗浓度，实验结果如表2所示，结果表明一抗稀释度为1:400时，阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，P/N值达到9.92；所以最佳一抗稀释度为1:400。

表2最佳一抗稀释度的确定

3、最佳封闭剂的确定

4μg/ml的S重组蛋白以4℃过夜包被，封闭剂设为0.2％明胶、0.4％明胶、2.5％脱脂乳、5％脱脂乳、2.5％BSA、5％BSA，于37℃条件下封闭2h，一抗稀释度为1：400，二抗稀释度1:20000。一抗、二抗孵育时间温度都为37度1h。实验结果如表3所示，结果表明，5％脱脂奶封闭时，阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，P/N值达到6.37，所以最佳封闭剂为5％脱脂奶。

表3最佳封闭剂的确定

4、最佳一抗孵育时间及温度的确定

4μg/ml的S蛋白以4℃过夜包被，以5％脱脂奶37℃条件下封闭2h，一抗稀释度为1：400，二抗稀释度1:20000，一抗孵育时间及温度设为37度0.5h、37度1h、37度1.5h、37度2h、室温0.5h、室温1h、室温1.5h、室温2h。二抗孵育条件为37度1h，显色5min。实验结果如表4所示，结果表明，一抗孵育条件为37度1h时，阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，P/N值达到5.90；所以一抗最佳的孵育条件为37度1h。

表4最佳一抗孵育时间及温度的确定

5、最佳二抗孵育时间及温度的确定

4μg/ml的S蛋白以4℃过夜包被，以5％脱脂奶37℃条件下封闭2h，一抗稀释度为1：400，二抗稀释度为1:20000，一抗孵育时间及温度条件为37度1h。二抗时间及温度设为37度0.5h、37度1h、37度1.5h、37度2h、室温0.5h、室温1h、室温1.5h、室温2h，显色5min。实验结果如表5所示，结果表明，二抗孵育条件为37度1h时，阳性血清OD值大于1.0且更接近于1.0，阴性血清OD值小于0.2，P/N值达到7.18；所以二抗最佳的孵育条件为37度1h。

表5最佳二抗孵育时间及温度的确定

6、间接ELISA操作流程

(1)将纯化的蛋白按照4μg/ml浓度溶于包被液中，将抗原按照每孔50μl加入ELISA板中进行4℃过夜包被。

(2)将包被结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用磷酸盐吐温缓冲液PBST(200μl)洗3次，每次5min，用5％的脱脂乳，100μl/孔，于37℃条件下封闭2h。

(3)将封闭结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min，用1:400的浓度按照50μl/孔的血清(一抗)于37℃条件下孵育1h。

(4)将孵育一抗结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST(200μl)洗3次，每次5min，将羊抗猫二抗，原液浓度为1mg/ml，进行倍比稀释1：20000，各加50μL按照50μl/孔的二抗于室温条件下孵育1h。

(6)加入TMB显色液单组份显色液，每孔100μl，显色5min。

(7)加终止液2M硫酸100μl，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，进行特异性、敏感性与重复性实验。

特异性试验：

按照上述所建立的间接ELISA方法，分别检测已知的猫细小病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒(FHV)感染的血清，每份血清做3个平行重复，设立阳性对照和阴性对照。采用感染猫冠状病毒(FCoV)的猫血清为阳性对照，采用健康、无特定病原体感染的幼猫血清为阴性对照。用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该间接ELISA方法的特异性。结果如表6所示，FPV、FCV、FHV感染的血清的OD值均小于0.2，判定为阴性。表明该重组蛋白抗原与FPV、FCV、FHV感染猫血清中产生的抗体没有交叉反应，说明ELISA方法具有良好的特异性，可以用于FCoV感染猫的血清中特异性抗体的检测。

表6本公开特异性试验

血清类型	阳性对照	阴性对照	FPV感染	FCV感染	FHV感染
						<![CDATA[OD<sub>450nm</sub>]]>	1.38	0.16	0.17	0.15	0.13
结果判定	+	-	-	-	-

敏感性试验：

按照上述所建立的间接ELISA方法，将FCoV阳性血清分别按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800进行稀释，用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该间接ELISA方法的敏感性。结果如图6所示，结果显示血清稀释到1：12800时阳性血清的OD值小于0.2，转变为阴性，表明该间接ELISA有较好的灵敏性。

板内板间重复性试验：

按照上述所建立的间接ELISA方法进行重复性试验，用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，对已知的5份血清进行重复性试验，结果如表7所示，经统计分析得到该ELISA方法的板内板间重复试验的变异系数均小于6％，表明该方法具有良好的重复性。

表7本公开板内板间重复性试验

本发明人前期通过生物信息学软件预测分析FCoV S蛋白。根据亲水性、表面极性、抗原性以及二级结构特征等，对S蛋白可能存在的抗原表位区域进行预测分析，本发明人惊奇地发现位于S2功能域的一蛋白片段具备良好的反应原性和免疫原性。本发明人以此为前提，研究和设计出了一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，通过本公开试剂盒可以有效检测猫冠状病毒抗体，并且具有良好的特异性，敏感性及可重复性，便于猫冠状病毒或者接种猫冠状病毒疫苗后的大规模检测。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。

本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。

序列表

<110> 龙岩学院

<120> 用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒

<130> P210590

<141> 2021-04-25

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Ala Gly Ser His Met Gly Gly Gly Ala Leu Ser Gly Leu Thr Ser Gly

20 25 30

Leu Gly Leu Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ser Ser Ile Ala Gly Ile Thr

35 40 45

Ala Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Ala Ala Leu Ile

50 55 60

Thr Gly Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Val Ser Gly Thr Leu Thr

65 70 75 80

Gly Thr Ala Gly Val Leu Ala Ser Ala Gly Leu Ala Met Gly Leu Val

85 90 95

Ala Gly Cys Val Leu Ser Gly Ser Ala Ala Thr Gly Pro Cys Gly Ala

100 105 110

Gly Thr His Leu Pro Ser Leu Val Ala Ser Ala Pro Ala Gly Leu Leu

115 120 125

Pro Pro His Thr Val Leu Leu Pro Thr Gly Thr Gly Leu Val Thr Ala

130 135 140

Thr Ser Gly Ile Cys Val Ala His Thr Thr Ala Thr Val Leu Leu Ala

145 150 155 160

Pro Ala His Ser Ile Pro Ser Thr Ala Ala Thr Thr Met Val Thr Pro

165 170 175

Ala Ala Met Pro Gly Pro Ala Leu Pro Gly Met Ser Ala Pro Val Gly

180 185 190

Ile Thr Ser Cys Gly Val Thr Pro Leu Ala Thr Thr Thr Thr Met Pro

195 200 205

Gly Ala Ile Val Val Ala Thr Ile Ala Ile Ala Leu Thr Ile Ala Ala

210 215 220

Met Leu Gly Gly Thr Thr Ser Ala Thr Thr Thr Pro Gly Leu Ala Leu

225 230 235 240

Gly Leu Gly Ile Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ala Pro Thr Ala Gly Ile

245 250 255

Ala Gly Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala Leu Thr Thr Ile Ala His Gly

260 265 270

Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Thr Leu Val Ala Leu Gly

275 280 285

Thr Leu Ala Ala Ile Gly Thr

290 295

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgcagg gtgaagcact g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgagttag gtttcaatgc g 21

Claims

1.一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有包被抗原S重组蛋白；所述S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述S重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（a）以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增，克隆出S重组蛋白片段；

（b）将所述S重组蛋白片段进行电泳分离，回收纯化后连接至载体上，并转化至感受态细胞，得到第一重组质粒；双酶切电泳检测，将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序；

（c）将上述步骤（b）测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET-28a连接，得到重组质粒pET28a-FCoV-S；

（d）将所述重组质粒pET28a-FCoV-S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达，得到FCoV-S重组蛋白，即猫冠状病毒S重组蛋白；

（e）将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀，进行包涵体变性，变性后的上清液通过His-Trap柱亲和层析，收集过柱后的液体，经过复性缓冲液梯度透析，最后收集上清，得到纯化的FCoV-S重组蛋白。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤（a）中，所述PCR扩增：上游引物序列如SEQ ID NO:2所示；下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤（a）中，所述PCR扩增：PCR扩增反应体系为：扩增体系为25 μL，其中2×TransStart FastPfu PCR SuperMix12.5 μL、上下游引物各 1μL、模板 1 μL，补充灭菌 ddH₂O 至终体积 25 μL。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤（a）中，所述PCR扩增：PCR扩增反应条件为：94℃预变性 2 min 后进入循环，94℃变性20s；55℃退火 20 s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃终延伸5 min。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤（b）中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DH5α；所述双酶切的位点分别为Nde Ⅰ和Xho Ⅰ。

7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的最佳包被浓度为4μg/ml。

9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标酶标抗体工作液为HRP标记的羊抗猫二抗。