JPH08504954A - Ｂ型およびｃ型肝炎同時診断用診断キットおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＢ型およびＣ型肝炎の同時診断用診断キットおよび前記診断キットを用いた診断方法に関するもので、さらに詳細には、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス抗原を共に含むＢ型およびＣ型肝炎同時診断用キットおよび前記キットを用いる診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型およびＣ型肝炎同時診断用診断キットおよび方法発明の分野 本発明は、Ｂ型およびＣ型肝炎の同時診断のための診断キット、および前記診 断キットを用いた診断方法に関するものであり、さらに詳細には、Ｂ型およびＣ 型肝炎ウイルスの抗原を共に含むＢ型およびＣ型肝炎の同時診断用診断キット、 および前記キットを用いた診断方法に関するものである。発明の背景 一般的に、ウイルス性肝炎はＡ型、Ｂ型、デルタ型およびＥ型肝炎ウイルス、 サイトメガロ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ）ウイルスおよびエップスタイン・バー（ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスを含む多様な肝炎ウイルスによって誘発さ れるものと知られている。 それらの中Ｂ型肝炎ウイルス（“ＨＢＶ”）は、ヘパドナビリデ（Ｈｅｐａｄ ｎａｖｉｒｉｄａｅ）の一種で肝癌を始め多様な肝疾患を引き起こすと知られて いる。ＨＢＶは、外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）蛋白をコードするＳ遺伝子、コア蛋 白をコードするＣ遺伝子、ＤＮＡポリメラーゼをコードするＰ遺伝子および未確 認のＸ蛋白をコードするＸ遺伝子とからなる４個のオープンリーディ ングフレイム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を含む二重螺線構造の ３．２Ｋｂ ＤＮＡを有している（Ｇａｎｅｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒ ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．，５０，６５１−６９３（１９８７）参照）。 ＨＢＶ表面抗原、コア抗原およびｅ抗原を含むＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ感染後に 血清内に形成された抗体を検出することによってＢ型肝炎を診断することに使用 されてきた。特に、抗コア性抗体は、ＨＢＶ感染直後に形成され、ＨＢＶによっ て感染された全ての患者の血清中に検出できるので、初期のＢ型肝炎を検出する ことにはコア抗原が有用であり、抗表面抗原抗体はＢ型肝炎の回復段階で発見さ れるので、表面抗原はＢ型肝炎が治療されたのか否かを決定することに使用され る。 またＣ型肝炎ウイルス（“ＨＣＶ”）は、輸血によって発生する肝炎の７０乃 至８０％を占め（Ａｌｔｅr，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃeｔ，２，８３ ８−８４１（１９７５）；およびＤｉｅｎｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ ．，６，６７−８１（１９８６）参照）、 かかる輸血後肝炎は、しばしば肝硬変または肝細胞癌へと進展する。前記ウイル スは、一本のＲＮＡプラス鎖からなるＲＮＡウイ ルス中の一つであり、前記鎖の一つのオープンリーディングフレイム（ＯＲＦ） から多蛋白前駆体（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）を生産する （Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３５９−３６ ２（１９８９）；およびＣｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８８，２４５１−２４５５（１９９１）参照） 。 Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子構造は、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ） またはペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）の遺伝子構造と類似し（Ｍｉｌ ｌｅｒ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ，８７，２０５７−２０６１（１９９０）；およびＭｕｒａｉｓｏ，Ｋ．， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１ ７２ ，５１１−５１６（１９９１）参照）、前記の類縁関係を基にして、Ｃ型肝 炎ウイルスの多蛋白（ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｎ−末端からＣ−末端まで 、コア−外皮１（Ｅ１）−外皮２／非構造１蛋白（Ｅ２／ＮＳ１）−非構造２蛋 白（ＮＳ２）−非構造３蛋白（ＮＳ３）−非構造４蛋白（ＮＳ４）−非構造５蛋 白（ＮＳ５）のように構成されたものと推定される（Ｃ ｈｏｏ，Ｑ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ，８８，２４５１−２４５５（１９９１）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，Ａ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，１１０５−１１１３（１９９１）；お よびＫａｔｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６５２４−６５２８（１９９０）参照）。 Ｃ型肝炎ウイルスの感染の可否は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａ ｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を用いて血液試料から直接Ｃ型 肝炎ウイルスのＲＮＡを検出することによって診断することができ（Ｈｏｓｏｄ ａ，Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１５，７７７−７８１（１９ ９２）；Ａｂｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１５，６９０− ６９５（１９９２）；およびＡｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎ ｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１５，６４４−６４９（１９９１）参照） ；この方法によれば、ウイルスのＲＮＡを初期に、即ち、感染後１−２週内に検 出することができるが、大量の試料を分析せねばならないので高い費用と長い時 間が所要される。他の診断の方法は、例えば、Ｃ１００−３蛋白を用いる酵素免 疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって血清試料に存在するＣ型肝炎ウイルスに対 する抗体を検出するものである（Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８８，２４５１−２４５５（１９９１ ））；およびＫｕｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，３６２− ３８４（１９８９）参照）。 しかし、コントレラスらは、ＥＬＩＳＡを用いた前記診断方法が、しばしばＣ 型肝炎以外の肝疾患、例えば、胆汁性肝硬変（ｂｉｌｉａｒｙ ｃｉｒｒｈｏｓ ｉｓ）、自己免疫病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、特発性肝硬変 （ｃｒｙｐｔｏｇｅｎｉｃ ｈｅｐａｔｏｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）等を患っている 患者の血清に対して偽陽性を示すということを明かにした（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２，５０５（１９８９）；Ｃａｓｈ Ｊ ．Ｄ．，ｅｔ，ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２，５０５（１９８９）参照）。テイル マン（Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ）らは、慢性関節リウマチ患者の６０％以上が、オル トダイアグノスチックシステムス社（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙ ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）の第１世代診断試薬および診断方法によって診断する際 、ＨＣＶ陽性反応を示すと報告した （Ｌａｎｃｅｔ，３３５，１３４６（１９９０）参照）。前記の結果は、ＥＬＩ ＳＡを使用する診断方法が偽陽性の結果をもたらすことがあり、したがって、確 認検査が必要であることを暗示する。 なお、米国のキロン社（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ．）と前記オルトダイアグノスチ ックシステムス社は、ＥＬＩＳＡを使用して得た診断結果を確認するために、組 換え免疫ブロット分析（ＲＩＢＡ）を用いることによって改善された診断方法を 開発した。前記改善された診断方法は、二つのＨＣＶ−特異的抗原等、即ち、Ｓ ＯＤ−５−１−１およびＳＯＤ−Ｃ１００−３をニトロセルロースのフィルター にブロッチング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）し、前記抗原をＣ型肝炎患者から得た血清 と反応させ、抗原−抗体複合体をペルオキシダーゼで標識された抗ヒトＩｇＧ抗 体と反応させ、各抗原バンドの色濃度を基にして血清中の抗ＨＣＶ抗体の存在可 否を決定することからなる。ボーダート（Ｂａｕｄａｒｔ）らは、パラプロテイ ン血症患者等から取った１８４個の血清試料中で、ＥＬＩＳＡ方法によって２８ 個の試料がＨＣＶ陽性として診断された反面、陽性血清試料等を前記ＲＩＢＡ方 法を使用して確認した際、唯一つの試料のみ陽性として診断され、３個の試料に ついては診断を保留したことを報告した （Ｌａｎｃｅｔ，３３６，６３（１９９０）参照）。 また、米国のオルトダイアグノスチックシステムス社は、既存の第１世代診断 試薬にコア抗原Ｃ２２−３および非構造３抗原Ｃ３３Ｃを添加することによって 製造した、抗ＨＣＶ抗体に対して改善された感度を有する第２世代ＲＩＢＡ診断 試薬（ＲＩＢＡII）を報告した。バラリ（Ｖａｌｌａｒｉ）らは、Ｃ１００−３ 蛋白のみを用いる方法に比べて、前記Ｃ２２−３、Ｃ３３ＣおよびＣ１００−３ 蛋白を含む診断試薬を用いたドット免疫ブロット分析法を使用して、抗ＨＣＶ抗 体をより早期に、かつ高い感度で検出できると報告した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ ．，３０（３），５５２（１９９２）参照）。 大部分の場合、高い費用と多量の試料を使っていくつかの診断キットを用いて Ｂ型とＣ型肝炎を別々に診断してきたが、既存の方法は特異性や正確性において 満足すべき結果をもたらしていない。 本発明者等は、既存のＥＬＩＳＡ方法やＲＩＢＡ方法より高い感度と特異性を 有するＢ型およびＣ型肝炎同時診断用診断キット、および／または該診断方法を 開発するために努力してきた。発明の概要 したがって、本発明の主要目的は、Ｂ型およびＣ型肝炎を同時に診断するため の診断キットを提供することである。 本発明の他の目的は、前記診断キットを用いてＢ型およびＣ型肝炎を同時に診 断するための診断方法を提供することである。 本発明の態様によって、Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅ ｉｎ）、非構造３蛋白（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ） 、非構造４蛋白（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ４ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非構 造５蛋白および外皮蛋白（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一つ以上のエ ピトープを含む一つ以上のＨＣＶ抗原蛋白、およびＢ型肝炎ウイルスのコア蛋白 および表面抗原蛋白の一つ以上のエピトープを含む一つ以上のＨＢＶ抗原蛋白を 含む診断キットが提供される。 本発明の他の態様によって、本発明の診断キットを用いてＢ型およびＣ型肝炎 を同時に診断するための診断方法が提供される。図面の簡単な説明 本発明の目的および特徴は添付された図面と共に記述した好ましい態様の説明 を参照することによって容易に 理解できる。添付された図面において、 図１は、ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４蛋白をコードするヌクレオチド配列、および そこにコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示し、 図２は、ＫＨＣＶ ８９７蛋白をコードするヌクレオチド配列、およびそこに コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示し、 図３は、ＫＨＣＶ ＮＳ４蛋白をコードするヌクレオチド配列、およびそこに コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を示し、 図４は、ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨＣＶ Ｅ２Ｅをコー ドするそれぞれのヌクレオチド配列、およびそこにコードされたポリペプチドの アミノ酸配列を示し、 図５は、ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白をコードするヌクレオチド配列、およ びそこにコードされたアミノ酸配列を示し、 図６は、ＨＢＶコア遺伝子のヌクレオチド配列、およびそこにコードされたポ リペプチドのアミノ酸配列を示し、 図７は、ＨＢＶ表面抗原をコードするヌクレオチド配列、およびそこにコード されたポリペプチドのアミノ酸 配列を示し、 図８は、ユビキチン遺伝子と融合されたＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４蛋白およびＫ ＨＣＶ８９７蛋白をコードするヌクレオチド配列の発現用ベクターを示し、 図９Ａは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）細胞内でＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４蛋白 とＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ発現させ た後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した結果を示 し、 図９Ｂは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図９Ａのゲルをウェスタンブロッチン グ分析した結果を示し、 図１０は、ユビキチン遺伝子と融合されたＫＨＣＶＮＳ４Ｅ蛋白をコードする ヌクレオチド配列の発現用ベクターを作製する過程を示し、 図１１Ａは、大腸菌細胞内でＫＨＣＶ ＵＢＮＳ４Ｅ蛋白をコードするヌクレ オチド配列を発現させた後ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、 図１１Ｂは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図１１Ａのゲルをウェスタンブロッ チング分析した結果を示し、 図１２は、ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨＣＶ Ｅ２Ｅをコ ードするＤＮＡ蛋白とユビキチン遺伝子を結合させ、結合されたＤＮＡ（ＵＢ Ｅ１Ｅ ２ ＤＮＡ）の発現用ベクターを作製する過程を示し、 図１３Ａは、大腸菌細胞内でＵＢ Ｅ１Ｅ２ ＤＮＡを発現させた後ＳＤＳ− ＰＡＧＥした結果を示し、 図１３Ｂは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図１３Ａのゲルをウェスタンブロッ チング分析した結果を示し、 図１４は、ユビキチン、ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ蛋白およびＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２蛋 白を含むＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白をコードする組換えＤＮＡの発現用ベクターを 作製する過程を示し、 図１５Ａは、大腸菌細胞内でＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白をコードする組換えＤＮ Ａを発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） した結果を示し、 図１５Ｂは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図１５Ａのゲルをウェスタンブロッ チング分析した結果を示し、 図１６は、ユビキチン遺伝子と融合されたＫＨＣＶＮＳ５−１．２蛋白をコー ドするヌクレオチド配列の発現用ベクターを作製する過程を示し、 図１７Ａは、大腸菌細胞内でＫＨＣＶ ＵＢＮＳ５−１．２蛋白をコードする 組換えＤＮＡを発現させた後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）した結果を示し、 図１７Ｂは、Ｃ型肝炎患者の血清を用いて図１７Ａのゲルをウェスタンブロッ チング分析した結果を示し、 図１８は、ＨＢＶ ＣＯＲＥ遺伝子とユビキチン遺伝子の融合遺伝子（ＵＢ ＨＢＶ ＣＯＲＥ ＤＮＡ）の発現用ベクターを作製する過程を示し、 図１９Ａは、大腸菌細胞内でＵＢ ＨＢＶ ＣＯＲＥ ＤＮＡを発現させた後 ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、 図１９Ｂは、Ｂ型肝炎患者の血清を用いて図１９Ａのゲルをウェスタンブロッ チング分析した結果を示し、 図２０は、酵母細胞内でＨＢＶ表面抗原をコードするＤＮＡ断片の発現用ベク ターを作製する過程を示し、 図２１は、酵母細胞内でＨＢＶ表面抗原をコードするＤＮＡ断片を発現させた 後ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示し、 図２２は、本発明の診断キットを使用した免疫測定法によって血清試料を診断 した結果を示す。発明の詳細な説明 本願に引用された参考文献はすべて本願の参考文献として引用されたものであ る。 本願に使用された下記用語は次のような意味を有する： 用語“Ｃ型肝炎ウイルス”は、非Ａ非Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の原因となるウ イルスをいう。用語ＨＣＶと用語Ｃ型肝炎は本願で交換的に使用する。 用語“韓国型Ｃ型肝炎ウイルス”または“ＫＨＣＶ”は、韓国人Ｃ型肝炎患者 から分離された新型ＨＣＶとして、そのｃＤＮＡは８４２、８４９および８５３ 番アミノ酸がそれぞれフェニルアラニン、ロイシンおよびトレオニン、あるいは ロイシン、フェニルアラニンおよびアラニンのアミノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。 用語“エピトープ”は、免疫学的に能力のある宿主で免疫反応を起こし得、お よび／または相補的抗体へ特異的に結合できるポリペプチドの抗原決定基をいう 。本発明のエピトープは、一般的に少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは７個 または８個のアミノ酸からなる。 本願に使用された他の用語は当該分野で正常的、かつ通常的な意味を有する。 以後、ＨＣＶ ｃＤＮＡのヌクレオチド番号またはＨＣＶ蛋白のアミノ酸番号 は、韓国特許公開第９３−６８３号に開示された全体ＫＨＣＶヌクレオチド配列 またはアミノ酸配列を基にする。 以下、本発明をさらに詳細に説明する。 １．ＨＣＶ抗原蛋白内のエピトープの決定 ＨＣＶ、例えば、ＫＨＣＶ（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１、特許手続上の微生物の寄託 の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に１９９１年５月１４日付 受託番号ＡＴＣＣ ７５００８として寄託；韓国特許出願公開第９３−６８３号 参照）のｃＤＮＡ等のヌクレオチド配列に対する情報を用いて、ＫＨＣＶ ８９ ７蛋白、外皮１および外皮２蛋白、または非構造５蛋白をコードするｃＤＮＡ断 片の５′−末端と３′−末端に該当するポリメラーゼ連鎖反応用プライマーを合 成する。 前記プライマーおよび、鋳型として、ＫＨＣＶ８９７遺伝子（ブダペスト条約 に従ってＡＴＣＣに１９９１年６月２７日付受託番号ＡＴＣＣ ６８６４０とし て寄託）、ＫＨＣＶ外皮遺伝子（ＡＴＣＣに１９９１年１２月１１日付受託番号 ＡＴＣＣ ６８８７８、６９８６６および７４１１７として寄託）およびＫＨＣ Ｖ ＮＳ５遺伝子（韓国特許出願公開第９３−６８３号参照）を用いてポリメラ ーゼ連鎖反応を行うことによって、ＫＨＣＶ８９７遺伝子、ＫＨＣＶ外皮１およ び２遺伝子、およびＫＨＣＶ ＮＳ５遺伝子のｃＤＮＡ断片を得る。各ｃＤＮＡ 断片をベクターに挿入し、発現ベクターにより大腸菌のような適当な宿主を形質 転換させる。形質転換された宿主細胞を使って産生したポリペプチドをポリアク リルアミドゲル上で電気泳動した後、Ｃ型肝炎患者の血清を使用してウェスタン ブロッチング分析を行うことによって、どのポリペプチドがＫＨＣＶ抗原のエピ トープとして抗ＫＨＣＶ抗体と特異的に反応するかを確認する。確認されたエピ トープのＫＨＣＶ ｃＤＮＡ全配列での位置も加えて調査する。 その結果、ＫＨＣＶ８９７蛋白のエピトープは、ＫＨＣＶ ｃＤＮＡの４３４ ８番目乃至４７１３番目のヌクレオチドに該当する３６６塩基対から発現された ＫＨＣＶ８９７蛋白のカルボキシ末端に存在することが明らかになった（ＫＨＣ Ｖ８９７蛋白のエピトープのアミノ酸配列、およびヌクレオチド配列は図２に示 している）。 外皮蛋白の場合、エピトープはＫＨＣＶ ｃＤＮＡの１２０１番目乃至１５０ ９番目のヌクレオチドに該当する３０９塩基対から発現されたＫＨＣＶ外皮１蛋 白のカルボキシ末端部（Ｅ１Ｇ蛋白）；ＫＨＣＶ ｃＤＮＡの１５１０番目乃至 １７４９番目のヌクレオチドに該当する２４０塩基対から発現されたＫＨＣＶ外 皮２蛋白のアミノ末端領域（Ｅ２Ａ蛋白）；およびＫＨＣＶ ｃＤＮ Ａの２２８１番目乃至２５２９番目のヌクレオチドに該当する２４９塩基対から 発現されたＫＨＣＶ外皮２蛋白のカルボキシ末端領域（Ｅ２Ｅ蛋白）に存在する ということが明らかになった（ＫＨＣＶ Ｅ１Ｇ、ＫＨＣＶ Ｅ２ＡおよびＫＨ ＣＶ Ｅ２Ｅ蛋白のアミノ酸配列およびそれらをコードするヌクレオチド配列は 図４に示している）。 なお、ＮＳ５蛋白のエピトープは、ＫＨＣＶ４０３ｃＤＮＡ断片を含む６６４ ９番目乃至７２８４番目のヌクレオチドに該当する１，２００塩基対でコードさ れたＮＳ５蛋白のアミノ末端に存在し、ＫＨＣＶ４０３よりさらに高い感度でＫ ＨＣＶ患者の血清と特異的に反応する。 ２．一つ以上のＨＣＶエピトープを含む組換え蛋白 ＨＣＶまたはＨＢＶ抗原のエピトープは効果的、かつ経済的である診断試薬の 開発において非常に重要である。特に、一つまたはそれ以上のエピトープを含む 融合蛋白が経済性、効能および正確性においてさらに好ましく、一つ以上のエピ トープを含む融合蛋白が最も好ましい。 一つ以上のＨＣＶエピトープを含むＨＣＶ組換え蛋白としては、好ましくは、 ＫＨＣＶコア蛋白およびＮＳ３蛋白のエピトープを含む組換えＫＨＣＶ ＣＯＲ Ｅ ５ １８融合蛋白、およびＫＨＣＶ Ｅ１，Ｅ２およびＮＳ４蛋白等のエピトープを 含む組換えＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２融合蛋白が含められる。 組換え蛋白等は、前記融合蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む多様な発 現ベクターシステムを用いることにより産生することができ；ベクターは、前記 融合蛋白および蛋白の発現率を増加させることができる他の特定蛋白、好ましく はユビキチンを含む組換え融合蛋白を直接産生することができる。ＫＨＣＶ融合 蛋白のみでなく、ユビキチンを含む組換え融合蛋白も、ＫＨＣＶ蛋白の必需的な 特性、例えば、ＨＣＶの抗原性を維持する限り、本発明の目的のために使用でき る。 前記発現システムは、ユビキチンがプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）の攻撃 から目的蛋白を保護または安定させることができるので、目的蛋白が不安定であ り宿主細胞内でプロテアーゼによって容易に分解される場合に効果的に使用でき る。尚かつ、ユビキチンと融合された目的組換え蛋白の発現は、抗ユビキチン抗 体を使用して確認することができ、前記蛋白はユビキチンの特性を用いて容易に 精製することができる。 ３．ＨＢＶ抗原蛋白 例えば、韓国特許公告第９０−５９５９号に記載され たＨＢＶのｃＤＮＡのヌクレオチド配列に対する情報を用いて、それぞれ一つ以 上のエピトープを含むＨＢＶコア抗原および表面抗原を産生する。ＨＢＶコア抗 原および表面抗原（Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ）のアミノ酸配列は図６および図７ にそれぞれ例示されている。多いタイプのＨＢＶが存在すると知られているので 、ＨＢＶコア抗原および表面抗原のアミノ酸配列は各タイプのＨＢＶにおいて少 しづつ異なるとみられ、これらも本発明に使用することができる。 ＨＢＶ抗原蛋白は、多様な発現ベクターシステムを用いて、ＨＢＶ抗原蛋白中 一つをコードするＤＮＡ断片を発現させ産生することができる。ＨＢＶ抗原蛋白 をコードするＤＮＡ断片は、例えばＨＢＶコア抗原および表面抗原をそれぞれコ ードするｃＤＮＡ断片の５′−末端および３′−末端に該当する合成プライマー を使用したＰＣＲを用いて産生することができる。 ＨＢＶ抗原蛋白を、前記２項で記述したように、ＨＢＶ抗原蛋白、および蛋白 の安定性を増加させるか精製過程を容易にさせる他の特定蛋白、好ましくは、ユ ビキチンを含む組換え蛋白の形態として産生することができる。 ４．宿主微生物での抗原蛋白の発現 ＨＣＶまたはＨＢＶエピトープを含む目的ＨＣＶまた はＨＢＶ蛋白を得るためには、ＨＣＶまたはＨＢＶエピトープをコードするＨＣ ＶまたはＨＢＶ ｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターをもって適当な宿主細胞を形 質転換させ、形質転換された細胞を発現を許す条件下で培養する。 適当な宿主は、当該分野でよく知られている多数の要素を考慮して選択できる 。このような要素は、例えば、選択されたベクターとの適合性、組換えプラスミ ドによってコードされた蛋白の毒性、目的蛋白の回収容易性、蛋白の特性、生物 学的安定性および費用を含む。前記要素の均衡は必ず考慮すべきであり、特定組 換えＤＮＡ分子の発現において全ての宿主が同等に効果的でないことは勿論であ る。 本発明に使用できる適当な宿主は大腸菌などの細菌およびサッカロマイセス・ セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母を 含むが、それらに限定されない。 宿主細胞で産生されたポリペプチドは、通常の方法、例えば、細胞破壊、遠心 分離、透析、塩析、クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動および電気溶出を 組合わせて使用することによって分離精製できる。 本発明のポリペプチドはまた、適当な方法、例えば、 排他的な固相合成法（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｓ）、部分固相法、断片縮合法または通常の液相合成法によって化学的 に合成できる。メリフィルド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によって開示された固相 合成法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）参照）が 好ましい。 一方、蛋白において、生物学的および免疫学的な活性を実質的に変化させない アミノ酸置換が起こることは広く知られている（例えば、ニューラツの文献（Ｎ ｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７９）参照）。このような機能的に同等 なアミノ酸置換は、産生された蛋白が同一な抗原的特性を維持する限り本発明の 範囲に含まれる。 本願では、ヌクレオチドおよびアミノ酸を示すための標準１文字または３文字 略字を使用する。前記略字の意味は通常の生化学教材に示されている（例えば、 文献（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ ．９６，７９８（１９８４）参照）。 ５．Ｂ型およびＣ型肝炎同時診断用の診断キットおよび 方法 本発明の診断キットは、好ましくは、ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ蛋白、ＫＨＣＶ Ｅ １Ｇ蛋白、ＫＨＣＶ Ｅ２Ａ蛋白、ＫＨＣＶ Ｅ２Ｅ蛋白、ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ ＥＰＩ蛋白、ＫＨＣＶ ５１８蛋白およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白を含み 、一つまたはそれ以上のＨＣＶエピトープを含有する少なくとも一つのＨＣＶ抗 原蛋白、およびＨＢＶコア蛋白または表面抗原蛋白の一つまたはそれ以上のエピ トープを含有する少なくとも一つのＨＢＶ抗原蛋白を含む。 さらに好ましくは、本発明の診断キットは、エピトープが他の蛋白、好ましく はユビキチンと融合された組換え蛋白の形態のＨＣＶまたはＨＢＶ抗原蛋白を含 む。 最も好ましくは、本発明の診断キットは、ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４蛋白、ＫＨ ＣＶ ＵＢ８９７蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢＮＳ４Ｅ蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢＮＳ４Ｅ １Ｅ２蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢＮＳ５−１，２蛋白、ＨＢＶ ＣＯＲＥ蛋白および ＨＢＶ Ｓ２ Ｓ Ａｇ蛋白を含む。故に、前記キットは、既存の他の診断キッ トを使用して感知できなかったＨＣＶ外皮蛋白およびＮＳ５蛋白に特異的な抗体 を検出する能力があるため、ＨＣＶを検出するにおいてさらに正確な診断結果を 示すことができる。 また、本発明のキットに含まれたＨＢＶ ＣＯＲＥ蛋白およびＨＢＶ Ｓ２表面 抗原は、Ｃ型肝炎と同時にＢ型肝炎の診断を可能にする。 本発明の診断キットに含まれる各抗原蛋白の量は任意的に調節することができ 、各蛋白を同モル量で使用することが好ましい。 ユビキチンと融合された抗原蛋白を使用する場合、ユビキチンは対照蛋白とし てキット内に含まれる。 また、本発明の診断キットは、キットと共に使用される診断方法によって、緩 衝液、陽性対照群として人間免疫グロブリン、支持物質、または他の必要試薬を 含めることができる。 Ｂ型およびＣ型肝炎の診断は、本発明の診断キットと共に当該分野に知られて いる任意の方法を使用して行うことができ、好ましくは免疫ブロット分析法を使 用する。 本発明はまた、免疫ブロット分析法を用いて本発明の診断キットを使用する診 断方法に関するものである。本発明の診断方法は肝炎患者の血清中の抗ＨＢＶお よび抗ＨＣＶ抗体を検出するにおいて、既存のいずれの診断方法よりもっと特異 的かつ正確であり、したがって、Ｃ型肝炎の診断方法および確認試験用として、 またＨＢＶおよびＨＣＶを同時に診断するための診断方法として使用 することができる。 抗原蛋白を使用する診断方法は下記段階を含めることができる： 第一に、一つまたはそれ以上のＨＢＶ抗原蛋白および一つまたはそれ以上のＨ ＣＶ抗原蛋白をそれぞれ固体支持体、例えば、ニトロセルロースのフィルターま たはマイクロリットルのウェル（ｗｅｌｌ）に加え、前記抗原蛋白を支持体の表 面に吸着させ； 第２に、希釈剤で希釈された診断用試料を抗原−被覆された固体支持体に添加 するが、ここで、抗ＨＢＶ抗体または抗ＨＣＶ抗体が血清内に存在する場合には 、抗原−抗体複合体が生成することになり； 第３に、酵素、例えば、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはアルカ リ性燐酸化酵素と結合された抗ヒトＩｇＧを支持物に添加して酵素が第２段階で 形成された複合体の抗体に結合するようにし； 最終に、前記支持物に酵素の基質、例えば、ペルオキシダーゼの場合は、Ｏ− フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）および過酸化水素を添加して呈色反応を させるが、もし血清試料が抗ＨＢＶ抗体または抗ＨＣＶ抗体を含むと、酵素と基 質の反応結果として特定色が現れる。 色濃度は濃度測定機やミクロウェルリーダーで測定し、 その結果を基にして抗ＨＣＶ抗体または抗ＨＢＶ抗体の存在を判定する。 第１段階で使用された固体支持物としては、ニトロセルロース濾過膜、ビニル 膜およびイモビロンＰ^R（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ^R）、好ましくはニトロセルロ ース濾過膜が使われる。ＨＢＶ抗原蛋白などは混合物として、または別々に固体 支持物に吸着させ、ＨＣＶ抗原蛋白などの場合も同じようにする。 本発明の診断キットを使用する際、好ましい診断方法は下記の工程から成る。 （Ａ）精製されたヒトイムノグロブリン、ＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ１４蛋白 、ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ５−１．２、ＨＢＶ ＣＯＲＥ、ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇおよびユビキチンがそれぞれ吸着されたニトロセルロースフィルター を遮断溶液（blocking solution）で処理し； （Ｂ）遮断されたフィルターを支持膜に並べて付着し、膜を切断して、同一面 積の各フィルターが含まれる８個の蛋白バンドを形成しているストリップを製造 し； （Ｃ）ストリップを推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）血清試料と反応させ； （Ｄ）（Ｃ）で得たストリップを西洋ワサビペルオキ シダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼで標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と反応 させ； （Ｅ）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼに対する 基質を添加し； （Ｆ）（Ｅ）で得たストリップの上に呈色反応を起させた後、各バンドの色濃 度を測定する。 一つ以上のエピトープを含有する本発明の組換え蛋白を使用する本発明の診断 試薬は、ただ一つのエピトープを有する既存の抗原を使用する場合よりさらに敏 感で、かつ正確な診断を可能にする。また、一つ以上のＨＢＶまたはＨＣＶエピ トープを含有する一つ以上の組換え蛋白を含む本発明の診断キットは卓越な診断 結果を示す。 下記実施例は、本発明の範囲を制限するものでなく、本発明を詳細に説明する ためのものであり、実施例に使用された実験方法は、別に言及しない限り下記の 参照実施例による。 別に指摘しない限り、固体混合物中固体、液体中液体および液体中固体につい て下記に示した％はそれぞれｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／ｖｏｌの 基準である。 参照例１：制限エンドヌクレアーゼを使用したＤＮＡの切断 滅菌された１．５ｍｌエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に制限エンド ヌクレアーゼと反応緩衝溶液を５０μｌ乃至１００μｌの反応容量になるように 入れ、３７℃で１乃至２時間反応させた。反応が完了した後、制限エンドヌクレ アーゼを不活性化するために反応混合物を６５℃で１５分間熱処理した（または 耐熱性エンドヌクレアーゼの場合はフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ た）。 本参照実施例で使用された制限酵素および反応緩衝溶液はＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｊｏｌｌａ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入し た。 制限エンドヌクレアーゼの反応のための１０倍反応緩衝溶液の組成は次のよう である： １０倍ＮＥＢ反応緩衝溶液１：１００ｍＭビストリスプロパン−ＨＣ１、１０ ０ｍＭ ＭｇＣ１₂、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ），ｐＨ７．０ １０倍ＮＥＢ反応緩衝溶液２：１００ｍＭトリス−ＨＣ１、１００ｍＭ Ｍｇ Ｃ１₂、５００ｍＭ ＮａＣ１、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０ １０倍ＮＥＢ 反応緩衝溶液３：１００ｍＭトリス−ＨＣ１、１００ｍＭ ＭｇＣ１₂、１００ ０ｍＭ ＮａＣ１、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０ １０倍ＮＥＢ反応緩衝溶液４：２００ｍＭトリス−酢酸塩、１００ｍＭ 酢酸 マグネシウム、５００ｍＭ酢酸カルシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０ 参照例２：フェノール抽出およびエタノール沈澱 ＤＮＡと酵素との反応が完了した後、酵素を不活性化するかＤＮＡを回収する ために反応混合物をフェノールで抽出するが、この抽出には１０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液であらかじめ平衡され たフェノールを使用した。 フェノールによる抽出は、同容量の試料とフェノールを強く振って混合し、１ ５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、水性層を新しい試験管に移す工程を ３回繰返した。 次に、水性層を同容量のクロロホルム溶液（クロロホルム：イソブタノール＝ ２４：１）で抽出し、水性層をさらに分離した後；ここに０．１容量の３Ｍ酢酸 ナトリウムおよび２．５容量の無水エタノールを加え；これを−７０℃で３０分 間または−２０℃で１２時間以上静置した後、１５，０００ｒｐｍおよび４℃で ２０分間遠心分離して核酸を回収した。 参照例３：連結反応 ＮＥＢから購入したＴ４ ＤＮＡリガーゼおよび１０ 倍連結反応緩衝溶液（０．５Ｍトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＭｇＣ １₂、０．２Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ、０．５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミ ン（ＢＳＡ））を使用してＤＮＡの連結反応を行った。反応容量は通常的に２０ μｌであり、ＤＮＡの接着末端の連結のためには１０単位、平滑末端を有するＤ ＮＡの連結のためには１００単位のＴ４リガーゼを使用した。 前記反応は１６℃で５時間行うか４℃で１４時間以上行い；反応が終了した後 、反応混合物を６５℃で１５分間加熱してＴ４ ＤＮＡリガーゼを不活性化させ た。 参照例４：大腸菌の形質転換 大腸菌菌株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）、Ｅ ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）またはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０５（ＡＴＣＣ ４７０１６））の形質転換は当該分野で公知の方法、例えば 、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８２））、またはコヘン（Ｃｏ ｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６９，２１１０ （１９７２））による方法を使用して行うことが できる。 参照例５：オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは自動化された固相ホスホアミジト法（ｓｏｌｉｄ ｐｈ ａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いてＤＮＡ 合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ｍｏｄｅｌ Ｎｏ ．３８０Ｂ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で合成した。 合成されたオリゴヌクレオチドを変性ポリアクリルアミドゲル（２Ｍ尿素、１ ２％アクリルアミドおよびビス（２９：１）、５０ｍＭトリス、５０ｍＭホウ酸 、１ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ₂）、電気泳動、およびアセトニトリル：水（５０： ５０）を溶出剤として使用するＣ₁₈ ＳＥＰ−ＰＡＫ（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ． ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）カラムクロマトグラフィーによって精製し、２６０ｎｍにおけ るＯ．Ｄ．を計測して量を測定した。 参照例６：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） １０ｎｇ乃至１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０μｌの１０倍濃度Ｔａｑポリメラ ーゼ反応緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、 １５ｍＭ ＭｇＣ１₂、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）、１０μｌのｄＮＴＰの 混合溶液（各々１０ｍＭのｄＧＴＰ、ｄ ＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、２μｇの各々のプライマー（一般的に、二つ のプライマーが反応に使用され、三つのプライマーが使用された場合、中間に位 置したプライマーは０．０２μｇの量で使用した）および０．５μｌのＡｍｐｌ ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｕ． Ｓ．Ａ．）の混合物に蒸留水を加え総容量を１００μｌにし；反応混合物の蒸発 を防止するためにここに５０μｌの鉱油を添加した。 ＰＣＲは温度サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｕ．Ｓ． Ａ．）を用いて行い、温度サイクルは９５℃で１分→５５℃で１分→７２℃で２ 分間のサイクルを２５回以上繰返し、最終的に７２℃で１０分間反応させるよう にプログラムされた。 反応が終了した後、混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させるこ とによってＰＣＲ産物を回収し、沈澱物を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶かした。 参照例７：ＨＲＰ−結合された抗ヒトＩｇＧ抗体の産生 ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｒｉｚｏｎａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＨＦ−１００１）を、ヒトＩ ｇＧ−付 着されたセファロースＣＬ−４Ｂ親和性カラムおよび蛋白−Ｇカラム（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるクロマトグラフィーによって精製 して９０％以上の純度を有する抗体を得た。収得した抗体を過ヨウ素酸ナトリウ ム法（ｓｏｄｉｕｍ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎａｋａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｃｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４（１９７ ４））によって西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて次のように標識した： ５mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．８１４．３９３）を１．２mlの蒸留水に溶 かした溶液に、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて調製し た０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液０．３mlを添加し、混合物を室温で２０分 間反応させた。反応溶液を１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で１６時間透析した。 このペルオキシダーゼ溶液１．５mlを、精製抗体が１０mg／mlの濃度で含まれ る２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．５）１mlと混合し、混合物を室温で２ 時間反応させた。その後、ここに、ホウ水素化ナトリウムの蒸留水溶液（４mg／ ml）１００μｌを添加して還元反応に よって未反応シッフ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ′ｓ ｂａｓｅ）を除去した。この溶液 をリン酸塩緩衝食塩水で一晩の間透析した後、セファデックス（ｓｅｐｈａｄｅ ｘ）Ｇ−２００カラムを通過させ未反応抗体またはペルオキシダーゼを除去した 。 実施例１．ＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４およびＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白の産生 ＜段階１＞ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４およびＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４およびＫＨＣＶ ８９７ ＤＮＡ（それぞれＫＨＣＶ −ＬＢＣＩの３４３番目乃至７２６番目のヌクレオチドの領域および３９１６番 目乃至４７１３番目のヌクレオチドの領域から成った）を増幅させ、これらをｔ ｒｐプロモータの調節下にユビキチン遺伝子を含有する大腸菌発現ベクターにク ローニングするために、下記プライマー等を合成した： プライマーＰＣＯＲＥＵＢＩ： ５′−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＡＣ ＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣ−３′（ユビキチン遺伝子の３′−末端領域と重複す る５′−末端の２５個のヌクレオチドおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ １の３４３番目乃至３６０番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ１４： ５′−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＴＧＧＡＴＧ ＡＣ−３′（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の７２６番目ヌクレオチドの後で翻訳を終止さ せる終止コドンおよびＳａｌ Ｉの認識部位を含む）； プライマーＰＫ８９７ＳＡＬ： ５′−ＧＡＣＴＧＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＴＡＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡ ＴＣＡＣ−３′（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の４７１３番目ヌクレオチドの後で翻訳を 終止させる３′−末端の２個の終止コドン（ＴＡＡＴＡＣ）およびＳａｌ Ｉの 認識部位を含む）； プライマーＰＫ８９７ＵＢＩ： ５′−ＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＧＡ ＡＴＴＣＡＴＡＣＣＣＧ−３′（ユビキチン遺伝子の３′−末端領域と重複する 、５′−末端領域の２５個のヌクレオチドおよびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の３９１６ 番目のヌクレオチドから翻訳を始めるように設計した他のヌクレオチドを含む） 。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管ＡにはプライマーＰＣＯＲＥＵＢＩ ２μｇ、 およびプライマーＰＳＡＬＣＯＲＥ１４ ２μｇを、試験管ＢにはプライマーＰ Ｋ８９７ＳＡＬ ２μｇおよびプライマーＰＫ８９７ＵＢＩ ２μｇを各々入れ 、５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５００８）、１０μｌ の１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ ，２ｍＭ ｄＡＴＰ，２ｍＭ ＴＴＰ，２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａ ｑポリメラーゼを加えた後、蒸留水を加え総容量を１００μｌに調節した。 蒸発を防止するために鉱油５０μｌを反応混合物に加え、参照例６と同様な温 度サイクルを２５回繰返すことによってＰＣＲを行った。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、試験管Ａでは約３８４ｂｐのＤＮＡ、試験管Ｂでは約８９７ｂｐ のＤＮＡが増幅したことを確認した。ＤＮＡ断片は前記（１−２）と同様なポリ アクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、それぞれ断片Ｋ３８４およびＫ８ ９７と命名した。 ＜段階２＞ユビキチン遺伝子の作製 （２−１）プライマーの作製 オズケイナクら（Ｏｚｋａｙｎａｋ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．Ｊ．，６，１ ４２９−１４３９（１９８７））によるユビキチン遺伝子に対する情報に基づき 、次のような３種のオリゴヌクレオチドを設計し、ＤＮＡ合成機を用いて合成し た。 ＵＢＩ１：５′−ＣＣＣＣＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＧＴＣＡＡＡＡＣＴ ＣＴＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＣＣＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴ ＴＣＣＧＡＣＡＣＴＡＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡ−３′ ＵＢＩ２：５′−ＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴ ＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡ ＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＧＴＣＴＣ−３′ ＵＢＩ３：５′−ＡＣＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧ ＡＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＡＣＡＡ ＧＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡ− ３′ ＵＢＩ１は５′−末端のＮｄｅＩの認識部位（５′−ＣＡＴＡＴＧ−３′）お よびＵＢＩ２と重複する約２０個のヌクレオチドを持つように設計し、ＵＢＩ３ はその 内にコードされたアミノ酸配列にいかなる変化もなくＳａｃIIの認識部位（５′ −ＣＣＧＣＧＧ−３′）を持つように設計した。 （２−２）ユビキチン遺伝子の作製 ２μｇのＵＢＩ１、０.０２μｇのＵＢＩ２および２μｇのＵＢＩ３の混合物 に１０μｌの１０倍ＰＣＲ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰの混合物および ２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留水で総容量を１００μｌになるよ うにした。ＰＣＲは参照例６と同様に実施した。反応産生物を５％ポリアクリル アミドゲル電気泳動させて、約２４０ｂｐのＤＮＡを分離し、これを断片Ｕｂと 命名し、分離した断片を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。 ＜段階３＞発現ベクターの作製 （３−１）ポリメラーゼ連鎖反応 二つの試験管を準備して次のようにプライマーを入れた： 試験管Ａ：２μｇのプライマーＵＢＩ１および２μｇのプライマーＰＳＡＬＣ ＯＲＥ１４；および 試験管Ｂ：２μｇのプライマーＵＢＩ１および２μｇのプライマーＰＫ８９７ ＳＡＬ。 鋳型として、試験管Ａには、５０ｎｇの断片Ｋ３８４ および５０ｎｇの断片ＵＢ、試験管Ｂには、５０ｎｇの断片Ｋ８９７および５０ ｎｇの断片ＵＢをそれぞれ加えた後、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１ ０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留 水で総容量を１００μｌに調節した。それぞれの反応混合物に蒸発を防止するた めに鉱油５０μｌを添加し、参照例６と同様な温度サイクルを２５回繰返すこと によってＰＣＲを行った。 （３−２）制限エンドヌクレアーゼを用いた断片およびベクターＤＮＡの完全切 断 前記（３−１）で得た各々のＰＣＲ産生物をＮＥＢ緩衝液３中でＮｄｅＩおよ びＳａｌＩを用いて完全に切断した。 試験管ＡおよびＢから得た断片をそれぞれ断片ＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４お よびＫＨＣＶ ＵＢ８９７と命名した。 ２μｇのｐｔｒｐ３２２Ｈ−ＨＧＨ（韓国特許公告第９１−４５７号参照）を ＮＥＢ緩衝液３中でＰｓｔＩおよびＳａｌＩで完全に切断し、２μｇのプラスミ ドをＮＥＢ緩衝液４中でＰｓｔＩおよびＮｄｅＩで完全に切断した。産物を０． ７％アガロースゲルで分離して約１．５ｋｂおよび約０．８６ｋｂ断片を単離し 、これらをそ れぞれ断片ＰＬおよびＰＴと命名した。 （３−３）連結 前記段階（３−２）から得た断片を用いて次のように連結反応を実施した： 連結反応試験管Ａには１００ｎｇのＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４を、連結反応 試験管Ｂには１００ｎｇのＫＨＣＶ ＵＢ８９７をそれぞれ加えた。それぞれの 試験管に１００ｎgのＰＬ、１００ｎｇのＰＴ、２μｌの１０倍連結反応緩衝液 および１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、蒸留水で総容量を２０μｌに調 節した。１６℃で１２時間前記反応を行った。連結されたベクターを各々単離し 、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ ３３６９４）を各々のベクターで形質 転換させた。断片ＵＢＣＯＲＥ１４を含むベクターを単離してｐｔｒｐＨ−ＵＢ −ＣＯＲＥ１４と、断片ＫＨＣＶ ＵＢ８９７を含むベクターを単離してｐｔｒ ｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７と各々命名した； ＜段階４＞ＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ１４およびＫＨＣＶ ＵＢ８９７ ＤＮＡ の発現 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を前記＜段階３＞で 作製した各プラスミドで形質転換した。それらの中、特許手続上の微生物の寄託 の国際 的承認に関するブダペスト条約によって、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７で 形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０はＡＴＣＣに１９９１年６月２７日付受 託番号ＡＴＣＣ ６９６４０で寄託し、ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４で形質 転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０はＡＴＣＣに１９９１年７月１日付受託番号 ＡＴＣＣ ６８６４２で寄託した。 プラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４およびｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＫＨＣ Ｖ８９７で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細 胞を５０μｇ／mlのアンピシリンを含む液状ＬＢ培地（６％バクト−トリプトン 、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ）で３７℃で１２時間振盪培養した。５ml の培養液を１ｌのＭ９培地（４０ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、２２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、８ ．５ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ ＮＨ₄Ｃｌ、１％グルコース、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．４％カザアミノ酸、１０μｌ／ml Ｖｉｔ．Ｂ１、４０μｇ／mlアンピシリン）に移し、３７℃で３乃至４時間振盪 培養した。６５０ｎｍでのＯ．Ｄ．値が０．５に至ると、インドールアクリル酸 （ＩＡＡ）を最終濃度が１．４ｍＭとなるように培養液に添加した。５時間後、 生成した培養液を３，０００ｒｐｍで２５分 間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を得た。 ＜段階５＞発現された蛋白、およびそのＣ型肝炎患者から得た血清との反応性確 認 前記＜段階４＞で得た各細胞沈降物を緩衝液に懸濁した後、レムリ（Ｌａｅｍ ｍｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））を用いて１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥすることによってＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ１４およびＫＨＣ Ｖ ＵＢ８９７蛋白の発現を確認した。その結果は図９Ａに示している。 図９Ａで、Ｍ列は標準分子大きさのマーカーとして上から７２、４３、２９お よび１８キロダルトンを示し；１列はＫＨＣＶ遺伝子を含まないプラスミドを有 する大腸菌の産物を示し；２列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４で形質転換し た大腸菌の産物として約２３ｋｄの蛋白が産生したことを示し；５列はｐｔｒｐ Ｈ−ＵＢ−ＫＨＣＶ８９７で形質転換された大腸菌の産物として約４０ｋｄの蛋 白が産生したことを示し；３、４および６列は他のＫＨＣＶ蛋白を示す。 ゲル上で分離された蛋白をトウビンの方法（Ｔｏｗｂｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．，７６，４７５０（１９７９））によって ニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，孔サ イズ０．２２μｍ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ）へ移した。このフィルターを０．２％ツ イーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢＳ（１０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７．０，０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ）に入れ、室温で２時間振盪して蛋白に対するＩｇＧの非特異的 結合を遮断した。０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン２０を含有する２００ 倍容量のＰＢＳをもって韓国人ＨＣＶ患者から得た精製ＩｇＧを希釈して調製し たＩｇＧ溶液に、前記フィルターを入れ、室温で１時間軽く振りながら蛋白とＩ ｇＧを反応させた。その後、フィルターを０．２％ツイーン２０を含有するＰＢ Ｓで５分づつ４回洗浄した。０．５％ゼラチンと０．０５％ツイーン２０を含有 する２００倍容量のＰＢＳをもって西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された山 羊抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を希釈して 調製した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に、前記フィルターを入れ、室温で１時間振盪し た。フィルターを０．２％ツイーン２０を含有するＰＢＳで５分づつ４回洗浄し た後、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。 このフィルターに４００μｇ／mlの４−クロロ−１−ナフトールおよび０．０ ３％過酸化水素を含む５０ｍＭトリス緩衝液を加え呈色反応を起こした。前記ウ ェスタ ンブロッチングの結果は図９Ｂに示している。図９Ｂで、各列は図９Ａと同一な 試料を示す。 前記結果は、組換え大腸菌で生産された蛋白がＫＨＣＶ抗体と特異的に結合す ることを確証する。 ＜段階６＞ＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４およびＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白の精製 ＜段階６−Ａ＞ＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４蛋白の精製 （６−Ａ−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階４＞で得た大腸菌細胞沈降物４ｇを４℃で２０mlの緩衝液１（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、 １ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／mlペプスタチンＡ）に懸濁さ せた。懸濁液に４mgのリゾチームを添加し、生成された溶液を氷の上で３０分間 攪拌した後、超音波処理機（ＨＥＡＴ ＳＹＳＴＥＭＳ ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＩＮＣ．，Ｗ２２５，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して８０％の出力および５０％の 効率（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）で氷浴に２０分間超音波処理して細胞を破壊し大 腸菌細胞のホモジネートを得た。 （６−Ａ−２）：尿素処理 （６−Ａ−１）で得たホモジネートを遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２ １，Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０） で１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して不溶性沈降物を除去し上澄液を得 た。 上澄液に最終濃度が８Ｍになるように９Ｍ尿素を加え産生物を室温で１２時間 攪拌した。 （６−Ａ−３）酸処理 （６−Ａ−２）で得た溶液に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を最終濃度が １０ｍＭになるように添加した後室温で１時間攪拌しながら１Ｍ酢酸を加え溶液 のｐＨを５．０に調節した。遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１，Ｒｏｔ ｏｒ ＪＡ １４）を用いて１１，０００ｒｐｍで遠心分離して沈降物を除去し 上澄液を得た。 （６−Ａ−４）：ＣＭ−イオン交換クロマトグラフィー （６−Ａ−３）で得たＫＨＣＶ ＵＢ−ＣＯＲＥ１４蛋白を含む溶液を、緩衝 液２（８Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、およ び１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．０）によって平衡化された２５mlのＣＭ−セファロ ース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を充填したカラム（２．５cm× １０cm）に１ml／分の流速で通過させた。カラム内に遊離形態で残っている物質 を前記緩衝液を用いて完全に洗浄した後、０乃至０．５Ｍの塩化ナトリウム濃度 勾配を有する５００mlの前記緩衝液２を３ml／分の流速で添加して、結合さ れた蛋白を溶出させた。溶出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した 結果、ＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４蛋白は約０．３Ｍで溶出した。ＫＨＣＶ Ｕ ＢＣＯＲＥ１４を含む分画を収集して次の段階で使用した。 （６−Ａ−５）：Ｓ−２００ゲル浸透クロマトグラフィー （６−Ａ−４）で収集された分画をＹＭ５限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｓ ．Ａ．）で容量が１０mlになるように濃縮した。濃縮物を、６Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有するＰＢＳ溶液で平衡化 したＳ−２００セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラム（２．５cm×１００ cm、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に０．５ml／分の流速で通過させ、蛋 白を分子量別に分離した。蛋白分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳 動させ、ＫＨＣＶＵＢＣＯＲＥ１４蛋白を含む分画を収集した。 （６−Ａ−６）：Ｍｏｎｏ−Ｓ クロマトグラフィー （６−Ａ−５）で得たＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ１４蛋白を含む分画を同容量の 緩衝液３（６Ｍ尿素、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび １０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ７．０）で希釈した後、緩衝液Ａで平衡化されたＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（ＨＲ ５／ ５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通過させた。カラムを前記緩衝液Ａ で洗浄した後、６Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール 、１０ｍＭ燐酸塩および０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂを０．８ml／分 の流速で、始めの５分間は３５％、次の５５分間は７０％、そして、最後の１０ 分間は１００％の量で次第に加え、結合された蛋白を溶出させた。ＫＨＣＶ Ｕ Ｂ−ＣＯＲＥ１４蛋白は緩衝液Ｂの量が６０％に至る際、即ち、塩化ナトリウム の濃度が０．２５Ｍになるとき溶出された。 分画を４℃でＰＢＳ溶液で透析して少なくとも９０％の純度を有するＫＨＣＶ ＵＢＣＯＲＥ−１４蛋白４mgを得た。 ＜段階６−Ｂ＞ＫＨＣＶ ＵＢ ８９７蛋白の精製 （６−Ｂ−１）：細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階４＞で得た大腸菌細胞沈降物３ｇを＜段階６−Ａ＞の（６−Ａ−１）と 同様に処理して細胞破壊し、それから不溶性沈降物を得た。 （６−Ｂ−２）：トリトンＸ−１００とトリス緩衝液を用いた不溶性沈降物の洗 浄 （６−Ｂ−１）で得た沈降物を１％トリトンＸ−１００を含む緩衝液４（５０ ｍＭトリス、ｐＨ８．５、５ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール）５０mlに懸濁させた。懸濁液 を室温で３０分間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ １４）を用いて１１，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して上澄液を除 去し不溶性沈降物を得た。次いで、沈降物を５０mlの緩衝液４にさらに懸濁させ た。懸濁液を攪拌し、さらに遠心分離して、上澄液を除去し不溶性沈降物を得た 。 前記の単純な洗浄過程を経て、少なくとも６０％の純度を有するＫＨＣＶ Ｕ Ｂ８９７蛋白を得た。 （６−Ｂ−３）：８Ｍ尿素を用いた不溶性沈降物の溶解 （６−Ｂ−２）で得たＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を含む不溶性沈降物を８Ｍ尿 素を含む５０mlの緩衝液５（２０ｍＭ燐酸塩、ｐＨ６．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭβ−メルカプトエタノール）に懸濁させた。懸濁液を室温で１時間攪拌し 遠心分離して不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。 （６−Ｂ−４）：Ｓ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー （６−Ｂ−４）で得た上澄液を、４Ｍ尿素を含有する緩衝液５で平衡化された Ｓ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＦＦ，２．５cm×７cm，Ｕ．Ｓ ．Ａ．） に通過させ０乃至０．２Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配を有する６００ml緩衝液で 溶出させた。蛋白分画を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）させ高純度で精製された ＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を含有する分画を収集した。 （６−Ｂ−５）：尿素除去およびＦＰＬＣ−ＭｏｎｏＱイオン交換クロマトグラ フイー （６−Ｂ−４）で収集されたＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を含有する蛋白分画を 緩衝液６（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭβ−メルカ プトエタノール）を使って透析して尿素を除去し、前記緩衝液で平衡化されたＦ ＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑイオン交換樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＨＲ ５／ ５）に負荷した後、０乃至０．４Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配を有する４０mlの 緩衝液で溶出させた。高度に精製されたＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を含有する分 画を収集して少なくとも９０％の純度を有するＫＨＣＶ ＵＢ８９７蛋白を得た 。 実施例２：ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ４Ｅ蛋白の産生 ＜段階１＞ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの作製 ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ＤＮＡ（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５５４ ７番目のヌクレオチドの領域か らなる）を作製し、これをｔｒｐプロモーターの調節下でユビキチン遺伝子を含 む発現ベクターにクローニングするために、次のようなプライマーを合成した： プライマーＰＮＳ４ＥＴ２：５′−ＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣ ＡＴＣＣＣＣＧＡＴＡＧＧＧＡＡＧＴＴ−３′（ＳａｃII認識部位およびＫＨＣ Ｖ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５４４２番目のヌクレオチドを含む）；および プライマーＰＮＳ４ＥＳＡＬ：５′−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡ ＡＣＣＣＧＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＧＴＴＴ−３′（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５５４ ７番目ヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびＳａｌＩ認識部位 を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＮＳ４ＥＴ２ ２μｇおよびプライマーＰＮＳ４ＥＳＡ Ｌ ２μｇを入れた。該管に５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝溶液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄ ＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留水を加えて総容量を１ ００μｌに調節した。 蒸発を防止するために反応混合物に鉱油５０μｌを入れ、参照例６と同様な温 度サイクルを２５回繰返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動さ せた。その結果、約１３０ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを 前記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製して断片ＮＳ４Ｅと 命名した。 ＜段階２＞発現ベクターの作製 ２μｇのプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＣＯＲＥ１４（ＡＴＣＣ ６８６４２ ：大韓民国特許出願公開第９３−６８３号参照）をＮＥＢ緩衝溶液３中でＳａｃ IIおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。生成された混合物を７％アガロース ゲルで電気泳動して約２．７ｋｂの断片を分離し、これを断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ −Ｔ２／Ｌと命名した。 一方、前記＜段階１＞の（１−３）で得た断片ＮＳ４Ｅ ２μｇを参照例１の ようにＮＥＢ緩衝溶液３中でＳａｃIIおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。 連結反応管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。該管に５０ｎｇの前 記断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２ ／Ｌ、２μｌの１０倍連結反応緩衝溶液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入 れて、蒸留水を加え総容量を２０μｌに調節した。連結反応は１６℃で１２時間 実施した。 連結反応混合物でＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を形質 転換させ断片ＮＳ４Ｅを含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ含有組換え 大腸菌細胞を得た（図１０参照）。 ＜段階３＞ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ蛋白の産生 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を前記＜段階２＞で得た プラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅで形質転換させた。 形質転換された大腸菌細胞を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する液状ル リア培地（６％バクトートリプトン、０．５％酵母抽出物、１％ ＮａＣｌ）に ３７℃で１２時間振盪培養した。３mlの前記培養液を３００mlのＭ９培地（４０ ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄、２２ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、８．５ｍＭ ＮａＣｌ、１８．７ｍ Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、１％グルコース、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭ ＣａＣ ｌ₂、０．４％カザアミノ酸、１０μｇ／ml Ｖｉｔ．Ｂ１、４０μｇ／mlアン ピシリン）に移して３７℃で４時間振盪培養した。培養液の６５０ｎｍでのＯ． Ｄ． 値が０．３に至ると、最終濃度が５０μｇ／mlになるように培養液にインドール アクリル酸（ＩＡＡ）を添加した。５時間後、生成された培養液を１１，０００ ｒｐｍで２５分間遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。 ＜段階４＞発現されたＵＢ ＮＳ４Ｅ蛋白、およびそのＣ型肝炎患者から得た血 清との反応性の確認 前記＜段階３＞で得た細胞沈降物をレムリの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕ ｒｅ ，２２７，６８０（１９７０））を用いて１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ゲル をクーマシブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂ ｌｕｅ）Ｒ２５０で染色して組換え蛋白の発現を確認した（図１１Ａ参照）。図 １１Ａで、第１列は標準分子大きさ標識を示し、第２列乃至１３列はプラスミド ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅで形質転換された大腸菌の産物を示し、第１４列は いかなるＫＨＣＶＤＮＡ断片も含まないプラスミドを有する大腸菌の産物を示す 。 ゲル上で分離された蛋白をトウビンの方法（Ｔｏｗｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．，７６，４７５０（１９７ ９））によってニトロセルロースフィルター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，孔の 大きさ０．２２μｍ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ. Ａ．）へ移した。前記フィルターを０．５％ツイーン２０を含有するＰＢＳ（１ ０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に入れて、室温で２時間 軽く振盪して蛋白に対するＩｇＧの非特異的結合を遮断した。０．５％ゼラチン と０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳを用いて韓国型Ｃ型肝炎患者から精 製されたＩｇＧを最終濃度１６μｇ／mlになるように希釈して調製したＩｇＧ溶 液に前記フィルターを入れ、室温で１時間軽く振盪して蛋白とＩｇＧを反応させ た。次いで、フィルターを０．２％ツイーン２０を含むＰＢＳで５分ずつ４回洗 浄した。０．５％ゼラチンおよび０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳを用いて 西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された山羊抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔ ｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，ＣＡ，Ｕ．Ｓ． Ａ．）を５００倍希釈して調製した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に前記フィルターを入 れて室温で１時間振盪した。フィルターを０．２％ツイーン２０を含むＰＢＳで ５分ずつ４回洗浄した後、５０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐＨ７．０）で２回洗浄し た。このフィルターに４００μｇ／mlの４−クロロ−１−ナフトールおよび０． ０３％過酸化水素を含む５０ｍＭトリス緩衝液を加え呈色反応を起こさせた。前 記ウエスタンブロッチ ングの結果は図１１Ｂに示してあり、ここで第１列乃至４列はプラスミドｐｔｒ ｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅで形質転換された大腸菌の産物を示し、第５列はいかなる ＫＨＣＶ ＤＮＡ断片も含んでいないプラスミドを有する大腸菌の産物を示し、 第６列は標準分子大きさのマーカーを示す。 ＜段階５＞ＵＢ ＮＳ４Ｅ蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および不溶性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を４０mlの緩衝液７（２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、 １ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇ／mlペプスタチンＡ）に懸濁さ せた。この懸濁液に最終濃度が０．２ｍｇ／mlになるようにリゾチームを添加し 、生成溶液を３０分間氷の上に放置した。産物を超音波処理機（ＨＥＡＴ ＳＹ ＳＴＥＭＳ ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＳ ＩＮＣ．，Ｗ２２５，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を 用いて８０％出力および５０％効率で氷浴に１５分間超音波処理して細胞を破壊 し大腸菌細胞のホモジネートを得た。 前記で得た細胞ホモジネートを遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１，Ｒ ｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を用いて１５，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して不 溶性沈 降物を除去し溶解された蛋白を得た。 （５−２）ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー （５−１）で得た蛋白溶液に１Ｍ ＨＣ１を加えて溶液がｐＨ９．０になるよ うに調節した。結果物を緩衝液８（２０ｍＭトリス、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤ ＴＡおよび１ｍＭ β−メルカプトエタノール）で平衡化されたＤＥＡＥ−セフ ァロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２．５cm×３cm）に２ml／分の流速で通 過させ、同一緩衝液を加えカラム内に残っている遊離蛋白を溶出した。その次に ０乃至０．４Ｍ ＮａＣ１の濃度勾配を有する３００mlの緩衝液８を８ml／分の 流速で加えて、結合された蛋白を溶出させ、溶出物を４mlの分画として収集した 。蛋白分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＵＢＮＳ４Ｅ蛋白を含む分画を収集し た。 （５−３）Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー （５−２）で収集された蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ． Ｓ．Ａ．）を用いて５ml容量に濃縮した後、ＰＢＳで平衡化されたＳ−２００樹 脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２．５cm×９０cm）に１ml／分の流速で通過さ せた。溶出した蛋白を３ml分画として収集し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして高い 純度のＵＢＮ Ｓ４Ｅ蛋白を含有する分画を収集した。 （５−４）ＦＰＬＣ−フェニル−スペーロースクロマトグラフィー （５−３）で収集された蛋白分画に、２．０Ｍの最終濃度になるようにＮａＣ １を加えた。これを、２．０Ｍ ＮａＣ１を含有するＰＢＳで平衡化されたＦＰ ＬＣ−フェニル−スペーロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＨＲ５／５，０． ５cm×５cm）に０．７ml／分の流速で通過させ、同一緩衝液を加えカラムに残っ ている遊離蛋白を溶出した。その後、２．０Ｍ乃至０Ｍ 塩化ナトリウムの線形 濃度勾配を有する４０mlのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０）を加え結合 された蛋白を溶出し、溶出物を１．４ml分画として収集した。 蛋白分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして少なくとも９５％の純度のＵＢＮＳ４ Ｅ蛋白を含む分画を収集し、精製された蛋白の抗原性をウェスタンブロッチング 分析法によって確認した。 実施例３．ＫＨＣＶ ＵＢＥ１Ｅ２蛋白の産生 ＜段階１＞ＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの作製 ＨＣＶ外皮蛋白のエピトープを含有するＫＨＣＶ Ｅ１Ｅ２遺伝子を増幅し、 これをｔｒｐプロモーターの調 節下でユビキチン遺伝子を含む発現ベクターへクローニングするために下記プラ イマーを合成した： プライマーＰＥ２ＥＴ２：５′−ＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＴＣ ＧＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣ−３′（ＳａｃII認識部位およびＫＨＣＶ −ＬＢＣ１の２２８１番目乃至２２９８番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＥ２ＥＧＥ１Ｇ：５′−ＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧ ＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＴＴＣ−３′（Ｅ２Ｅ ＤＮＡの３ ′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２５０９番目乃至２５２９番目のヌクレオ チド領域およびＥＩＧ遺伝子の５′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１２０１ 番目乃至１２２１番目のヌクレオチド領域を含む）；および プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ：５′−ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ ＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＴＧＴＡＴＣ−３′（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４９番目 のヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびＸｈｏＩ認識部位を含 む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＥ２ＥＧＥ１Ｇ ２μｇおよびプライマーＰＥ２ＡＸＨ Ｏ ２μｇを入れた。この試験 管に鋳型として５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ１ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５００８ ）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍ Ｍ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭｄＣＴＰ）、２．５ 単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、ここに蒸留水を加え総容量を１００μｌに調 節した。 反応混合物に蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を加え参照例６と同一な温 度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約５５０ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前 記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＧＥ１ＧＥ２ Ａと命名した。 （１−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管にプライマーＰＥ２ＥＴ２ ２μｇおよびプライマーＰＥ２ＡＸＨＯ ２μｇを入れた。試験管に鋳型として５０ｎｇのプラスミドｐＹＬＢＣ−Ａ／Ｇ −ＵＢＥ２Ｃ（ＡＴＣＣ ７４１１７、韓国特許出願公開第９３−６８３号参照 ）および５０ｎｇの断片ＧＥ１ＧＥ２Ａ、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液 、１０μｌの ２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを入れ、ここに蒸留水を加 え総容量１００μｌに調節した。 反応混合物の蒸発を防止するために鉱油５０μｌを添加し参照例６と同一な温 度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−５）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−４）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前 記と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片Ｅ１Ｅ２と命 名した。 ＜段階２＞発現ベクターの作製 前記（１−５）で得たＤＮＡ断片２μｇを、参照例１と同様にＮＥＢ緩衝液３ 中でＳａｃIIおよびＸｈｏＩを用いて完全に切断した。 試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れ、更に実施例２の＜段階２＞ で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０倍連結反応緩 衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を加えて総容量が２０μ ｌになるように調節した。連結反応は １６℃で１２時間行った。 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）を連結反応混合物で形質 転換させ断片Ｅ１Ｅ２を含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２を含有する 組換え大腸菌細胞を得た（図１２参照）。 ＜段階３＞ＫＨＣＶ ＵＢＥ１Ｅ２蛋白の発現 前記＜段階２＞で作製されたプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｅ１Ｅ２で形質転 換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を実施例２の ＜段階３＞と同様な方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集し た。 ＜段階４＞発現されたＵＢＥ１Ｅ２蛋白、およびそのＣ型肝炎患者の血清との反 応性確認 発現されたＵＢＥ１Ｅ２蛋白およびそのＣ型肝炎患者から採取した血清との反 応性は前記＜段階３＞の細胞沈降物を用いて実施例２の＜段階４＞と同様な方法 で確認し、その結果を図１３に示す。（ここで、ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果で あり、Ｂはウェスタンブロッチングの結果である）。 図１３ＡおよびＢで、第１列および４列はいかなるＫＨＣＶ ＤＮＡ断片も含 まないプラスミドを有する大腸菌の産物を示し、第２列および５列はｐｔｒｐＨ −ＵＢ −Ｅ１Ｅ２で形質転換された大腸菌の産物を示し、第３列は標準分子大きさマー カーとしてゲルの上から４３、２９、１８および１４キロダルトンを示す。 ＜段階５＞ＵＢＥ１Ｅ２蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た大腸菌細胞沈降物３ｇを実施例２の＜段階５＞の（５− １）と同様に処理して細胞を破壊しそれから不溶性沈降物を得た。 （５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た沈降物を１％トリトンＸ−１００を含む４０mlの緩衝液 ８に懸濁させた。懸濁液を室温で３０分間攪拌して遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を使用して１５，０００ｒｐｍで２５ 分間遠心分離することによって溶解された蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （５−３）４Ｍ尿素および０．５％トリトンＸ−１００を用いた洗浄 前記（５−２）の不溶性沈降物を８Ｍ尿素および０．５％トリトンＸ−１００ を含む１００mlの緩衝液９（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ および１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に懸濁させた。懸濁液を室温で２ 時間攪拌し遠心分離して、溶解した蛋 白を除去し不溶性沈降物を得た。 （５−４）１％のＳＤＳを用いた沈降物の溶解 （５−３）の不溶性沈降物を１％のＳＤＳを含む１０mlのＰＢＳ（１０mlリン 酸塩、ｐＨ７．０）１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁させた。懸濁液を室温で１２ 時間攪拌し遠心分離して、不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。 （５−５）Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラフィー （５−４）で得た２０mlの上澄液をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｕ． Ｓ．Ａ．）を使用して４mlの容量に濃縮した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２０）を使用して１５，０００ｒｐｍで２５分 間遠心分離して不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。上澄液を、０．１％ＳＤＳ を含有するＰＢＳで平衡化されたＳ−２００樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，２．５cm×９０cm）に４０ml／時の流速で通過させた。溶出した蛋白を ３ml分画として収集し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして、９０％以上の純度を有す るＵＢＥ１Ｅ２蛋白を含む分画を収得した。 実施例４．ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の生産 ＜段階１＞ＮＳ４Ｅ１Ｅ２遺伝子の増幅 （１−１）プライマーの作製 ＨＣＶ外皮蛋白のエピトープをコードする遺伝子およ びＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ＤＮＡを増幅させ、これをｔｒｐプロモーターの調節下 でユビキチン遺伝子を含有する発現ベクター内にクローン化するために、下記プ ライマー等を合成した。 プライマーＰＮＳ４ＥＴ２：５′−ＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＣ ＡＴＣＣＣＣＧＡＴＡＧＧＧＡＡＧＴＴ−３’（ＳａｃIIの認識部位およびＫＨ ＣＶ−ＬＢＣ１の５４２２番目乃至５４４２番目のヌクレオチドを含む）； プライマーＰＮＳ４ＥＧＥ２Ｃ３：５′−ＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＣＧＧＧＴＴ ＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＣＧＧＧＧＡＧＡＧＣＧＴＴＧ Ｔ−３′（ＮＳ４Ｅ ＤＮＡの３′−末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の５５３０ 番目乃至５５４７番目のヌクレオチドの領域、１個のプロリンコドン、６個のグ リシンコドン、およびＥ２Ｅ遺伝子の５′末端領域のＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の２２ ８１番目乃至２２９８番目のヌクレオチドの領域を前記順序のように含む）；お よび プライマーＰＥ２ＡＸＨＯ：５′−ＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＣ ＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＴＧＴＡＴＣ−３′（ＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の１７４９番目 のヌクレオチドの後で翻訳を終了させる終了コドンおよびＸｈ ｏＩの認識部位を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ４ＥＧＥ２Ｃ３および２μｇのプライマー ＰＥ２ＡＸＨＯを入れた。この試験管に、鋳型として５０ｎｇのｐｔｒｐＨ−Ｕ Ｂ−Ｅ１Ｅ２（実施例３の＜段階２＞）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液 、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、蒸留 水を加えて総容量を１００μｌにした。 蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を前記反応混合物に加え参照例６と同一 な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを行った。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約８００ｂｐのＤＮＡが増幅したことを確認した。ＤＮＡを前記 と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し断片ＧＥＮＶＥＰＩ− IIIと命名した。 （１−４）第２ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ４ＥＴ２および２μｇのプライマーＰＥ２ ＡＸＨＯを入れた。この試験管 に、鋳型として実施例２の＜段階２＞で得た５０ｎｇのプラスミドｐｔｒｐＨ− ＵＢ−ＮＳ４Ｅ、前記（１−３）で得た５０ｎｇの断片ＧＥＮＶＥＰＩ−III、 １０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単 位のＴａｑポリメラーゼを入れ、蒸留水を加えて総容量を１００μｌにした。 前記反応混合物の蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を添加し、参照例６と 同一な温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを行った。 （１−５）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−４）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約９２０ｂｐのＤＮＡが増幅したことを確認した。ＤＮＡを前記 と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ と命名した。 ＜段階２＞発現ベクターの作製 ＜段階１＞の（１−５）で得た２μｇのＤＮＡ断片を参照例１のようにＮＥＢ 緩衝液３中でＳａｃIIおよびＸｈｏＩを用いて完全に切断した。 試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れ、更 に実施例２の＜段階２＞で得た断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ ５０ｎｇ、２ μｌの１０倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水 を加えて総容量を２０μｌに調整した。連結反応は１６℃で１２時間行った。 上記連結反応混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３ ９）を形質転換させて断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２を含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ− ＮＳ４Ｅ１Ｅ２を含有する組換え大腸菌細胞を得た（図１４参照)。 ＜段階３＞断片ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ ＤＮＡの発現 前記＜段階２＞で作製したプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２を含 むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）形質転換体を実施例２の ＜段階３＞のような方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集し た。 ＜段階４＞発現したＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白、およびそのＣ型肝炎患者から採取 した血清との反応性確認 大腸菌内でＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の生産およびＣ型肝炎患者から採取した血 清とそれとの反応性は実施例２の＜段階４＞のような方法で＜段階３＞の細胞沈 降物を用いることによって確認し、その結果は図１５に示して おり、ここでＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブロッチング の結果である。 図１５ＡおよびＢで第１列および第４列はいかなるＫＨＣＶ ＤＮＡ断片も含 まないプラスミドを有する大腸菌の産物を示し、第２列および第５列はｐｔｒｐ Ｈ−ＵＢ−ＮＳ４Ｅ１Ｅ２で形質転換した大腸菌の産物を示し、第３列は標準分 子大きさマーカーとしてゲルの上から９２、７０、４３、２９および１８キロダ ルトンを示す。 ＜段階５＞ＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階３＞で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を実施例２の＜段階５＞のように処 理して、細胞を破壊し、それから不溶性沈降物を得た。 （５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た不溶性沈降物を実施例３の＜段階５＞（５−２）のよう に処理して、溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （５−３）４Ｍ尿素を用いた洗浄 前記（５−２）の不溶性沈降物を４Ｍ尿素を含む３０mlの緩衝液２に懸濁させ た。この懸濁液を室温で２時間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１ 、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２１）を用いて１５，０００ｒｐｍで遠 心分離することによって溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （５−４）６Ｍ塩化グアニジンを用いた洗浄 前記（５−３）の不溶性沈降物を６Ｍ塩化グアニジン（guanidine chloride） を含む３０mlの緩衝液２に懸濁させた。懸濁液を室温で２時間攪拌し遠心分離機 （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２１）を用いて１５，００ ０ｒｐｍで遠心分離することによって、溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得 た。 （５−５）１％ＳＤＳを用いた沈降物の溶解 前記（５−４）の不溶性沈降物を１％ＳＤＳを含有する１０mlのＰＢＳ（１０ ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁させた。懸濁液を室 温で１２時間攪拌し遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ Ｊ Ａ ２１）を用いて１５，０００ｒｐｍで遠心分離することによって、不溶性沈 降物を除去し上澄液を得た。 （５−６）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−５）で得た１０mlの上澄液をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、 Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して４ml容量に濃縮した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１、Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２１）を用いて１５，００ ０ｒｐｍで２５分間遠心分離して、不溶性沈降物を除去し上澄液を得た。上澄液 を、０．１％ＳＤＳを含むＰＢＳで平衡化されたＳ−３００樹脂カラム（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，２．５cm×９０cm）に４０ml／時の流速で通過させゲル 濾過クロマトグラフィーを行った。溶出した蛋白を２mlの分画として収集し、１ ５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして９０％以上の純度を有するＵＢＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白を 含む分画を収集した後、精製した蛋白の抗原的特異性をウェスタンブロッチング 分析法を用いて確認した。 実施例５．ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白の産生 ＜段階１＞ＮＳ５−１．２ＤＮＡの増幅 （１−１）プライマーの製造 ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２ ＤＮＡ（ＫＨＣＶ ＬＢＣ１の６６４９番目乃至 ７８２４番目のヌクレオチドの領域からなる）を増幅し、これをｔｒｐプロモー ターの調節下でユビキチン遺伝子を含む発現ベクター内にクローン化するために 、下記のプライマー等を合成した： プライマーＰＮＳ５Ｔ２：５′−ＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＣＧＧ ＧＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣ−３′ （ＳａｃIIの認識部位およびＫＨＣＶ−ＬＢＣ１の６６ ４９番目乃至６６６９番目のヌクレオチドを含む）；および プライマーＰＮＳ５１．２ＳＡＬ：５′−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡ ＣＧＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴ−３′ （ＫＨＣＶ ＬＢＣ１の７８２４番目のヌクレオチドの後で翻訳を終止させる終 止コドンおよびＳａｌＩ認識部位を含む） （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＮＳ５Ｔ２および２μｇのプライマーＰＮＳ５ １．２ＳＡＬを入れた。この試験管に、鋳型として５０ｎｇのＫＨＣＶ−ＬＢＣ １ ＤＮＡ（ＡＴＣＣ ７５００８）、１０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、 １０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭ ＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位のＴａｑポリメラーゼを加え、これに 蒸留水を加えて総容量を１００μｌに調節した。 反応混合物に蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を加え参照例６のような温 度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約１．２ｋｂＤＮＡが増幅されたことを確認した。ＤＮＡを前記 と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し断片ＮＳ５−１．２と 命名した。 ＜段階２＞発現ベクターの作製 ＜段階１＞の（１−３）で得た２μｇのＤＮＡ断片を参照例１のようにＮＥＢ 緩衝液３中でＳａｃIIおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。 試験管に前記で得たＤＮＡ断片１００ｎｇを入れた。この試験管に実施例２の ＜段階２＞で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μｌの１０倍 連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を加えて総容 量を２０μｌに調整した。連結反応は１６℃で１２時間行った。 上記連結反応混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３ ９）を形質転換させて断片ＮＳ５−１．２を含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ− ＮＳ５−１．２を含有する組換え大腸菌細胞を得た（図１６参照)。 ＜段階３＞断片ＮＳ５−１．２ ＤＮＡの発現 前記＜段階２＞で製造されたプラスミドｐｔｒｐＨ− ＵＢ−ＮＳ５−１．２を用いて変質転換させたＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴ ＣＣ ３７３３９）細胞を実施例２の＜段階３＞のような方法で培養した後、遠 心分離して大腸菌細胞沈降物を収集した。 ＜段階４＞発現したＫＨＣＶ ＵＢＮＳ５−１．２蛋白およびそのＣ型肝炎患者 から採取した血清との反応性確認 大腸菌内でＵＢＮＳ５−１．２蛋白の生産およびそのＣ型肝炎患者から採取し た血清との反応性は実施例２の＜段階４＞のような方法で＜段階３＞の細胞沈降 物を使用して確認し、その結果を図１７に示す。ここでＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの 結果であり、Ｂはウェスタンブロッチングの結果である。 図１７ＡおよびＢで、第１列はいかなるＫＨＣＶ ＤＮＡ断片も含有しないプ ラスミドを有する大腸菌の産物を示し、第２列および第３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ −ＮＳ５−１．２で形質転換した大腸菌の産物を示す。 ＜段階５＞ＵＢＮＳ５−１．２蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 ＜段階３＞で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を実施例２の＜段階５＞の（５−１ ）のように処理して、細胞を破壊し、それから不溶性沈降物を得た。 （５−２）不溶性沈降物の洗浄 前記（５−１）で得た不溶性沈降物を実施例３の＜段階５＞（５−２）のよう に処理して、溶解した蛋白を除去し不溶性沈降物を得た。 （５−３）不溶性沈降物の溶解 前記（５−２）の不溶性沈降物を８Ｍ尿素を含む１００mlの緩衝液３（５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタ ノール）に懸濁させた。この懸濁液を室温で１時間攪拌し遠心分離して不溶性沈 降物を除去し上澄液を得た。 （５−４）ＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロマトグラフィー 前記（５−３）で得た上澄液を、前記緩衝液３で平衡化されたＤＥＡＥ−セフ ァロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，２．５cm×３cm）に２ml／分の流速で通 過させ、同一緩衝液を加えカラムに残っている遊離蛋白を溶出させた。その後、 ０乃至０．３Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を有する３００mlの緩衝液３を８ml／分の 流速で加えて、結合した蛋白を溶出し、溶出物を４ml分画として収集した。蛋白 分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＵＢＮＳ５−１．２蛋白を含む分画を収集し た。 （５−５）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−４）で収集した蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ ．Ｓ．Ａ．）を用いて３mlの容量に濃縮した後、８Ｍ尿素を含有する緩衝液３で 平衡化されたＳ−３００樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１．２cm×１２０cm ）に１０ml／時の流速で通過させた。溶出した蛋白を０．５ml分画等として集め 、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして高純度のＵＢＮＳ５−１．２蛋白を含有する分画 を収集した。 （５−６）ＦＰＬＣ−フェニル−スペロース（superose）クロマトグラフィー 前記（５−５）で収集した蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ ．Ｓ．Ａ．）を通過させ４mlの容量に濃縮した。濃縮物を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒ ｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ．Ｗ．ｃｕｔ ｏ ｆｆ ６，０００−８，０００）を使用してＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７ ．０，１５ｍＭ ＮａＣｌ）で透析して尿素を除去した。この溶液に１．５Ｍの 最終濃度となるように塩化ナトリウムを添加した後、同一緩衝液で平衡化された ＦＰＬＣ−フェニル−スペロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＨＲ ５／５， ０．５cm×５cm）に０．７ml／分の流速で通過させ、同一緩衝液を加えカラムに 残っている遊離蛋白を溶出した。 その後、１．５乃至０Ｍの塩化ナトリウム線形濃度勾配を有したＰＢＳを加え結 合された蛋白を溶出し、溶出物を０．７mlずつの分画として収集した。蛋白分画 を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥして９５％以上の純度を有するＵＢＮＳ５−１．２蛋 白を含む分画を収集し、精製した蛋白の抗原的特異性はウェスタンブロッチング 分析法によって確認した。 実施例６：ＨＢＶＣＯＲＥ蛋白の産生 ＜段階１＞ＨＢＶＣＯＲＥ遺伝子の増幅 （１−１）プライマーの作製 ＨＢＶＣＯＲＥ ＤＮＡ（韓国型Ｂ型肝炎ｃＤＮＡ（ｐＨＢＶａｄｒ）の一部 分、韓国特許出願公告第９０−５９５９号参照）を増幅し、これをｔｒｐプロモ ーターの調節下にユビキチン遺伝子を含む発現ベクター内にクローン化するため に、下記プライマー等を合成した： プライマーＰＣＯＲＥＴ２：５′−ＴＧＡＧＡＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＧ ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＡＴＡＡＡ−３′ （ＳａｃIIの認識部位およびＨＢＶＣＯＲＥ ＤＮＡの１番目乃至２１番目のヌ クレオチドを含む）。 プライマーＰＣＯＲＥＳＡＬ：５′−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣ ＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡ ＧＡＴＴＧ−３′ （ＨＢＶＣＯＲＥ ＤＮＡの３′−末端で翻訳を終止させる終止コドンとＳａｌ Ｉの認識部位を含む）。 （１−２）ポリメラーゼ連鎖反応 試験管に２μｇのプライマーＰＣＯＲＥＴ２および２μｇのプライマーＰＣＯ ＲＥＳＡＬを入れた。この試験管に、鋳型として５０ｎｇのｐＨＢＶａｄｒ、１ ０μｌの１０倍ポリメラーゼ緩衝液、１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（２ｍＭ ｄ ＧＴＰ、２ｍＭ ｄＡＴＰ、２ｍＭＴＴＰ、２ｍＭ ｄＣＴＰ）、２．５単位の Ｔａｑポリメラーゼを入れ、蒸留水を加えて総容量を１００μｌに調節した。 反応混合物に、蒸発を防止するために５０μｌの鉱油を添加し、参照例６のよ うな温度サイクルを２５回繰り返すことによってＰＣＲを実施した。 （１−３）ＰＣＲ産物の分離および精製 前記（１−２）で得たＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し た。その結果、約５５０ｂｐのＤＮＡが増幅したことを確認した。ＤＮＡを前記 と同一なポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、断片ＨＢＶＣＯＲＥ と命名した。 ＜段階２＞発現ベクターの作製 前記＜段階１＞の（１−３）で得た２μｇのＤＮＡ断片を参照例１のようにＮ ＥＢ緩衝液３中でＳａｃIIおよびＳａｌＩを用いて完全に切断した。 連結反応試験管に前記で得た１００ｎｇのＤＮＡ断片を入れた。この試験管に 実施例２の＜段階２＞で得た５０ｎｇの断片ｐｔｒｐＨ−ＵＢ−Ｔ２／Ｌ、２μ ｌの１０倍連結反応緩衝液、１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ、蒸留水を 加えて総容量を２０μｌに調整した。連結反応は１６℃で１２時間実施した。 連結されたベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３ ９）を形質転換して、断片ＨＢＶＣＯＲＥを含むプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ− ＨＢＶＣＯＲＥを有する組換え大腸菌形質転換体を得た（図１８参照）。 ＜段階３＞ＨＢＶＣＯＲＥ ＤＮＡの発現 前記＜段階２＞で作製したプラスミドｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＨＢＶＣＯＲＥで形 質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ３７３３９）細胞を実施例２ の＜段階３＞のような方法で培養した後、遠心分離して大腸菌細胞沈降物を収集 した。 ＜段階４＞発現したＨＢＶＣＯＲＥ蛋白、およびＢ型肝炎患者から採取した血清 とその反応性確認 ＵＢ ＨＢＶＣＯＲＥ蛋白の発現および前記蛋白とＢ型肝炎患者から採取した 血清との反応性を、前記＜段階３＞の細胞沈降物を使用して実施例２の＜段階４ ＞のような方法で確認した。その結果を図１９に示しており、ここでＡはＳＤＳ −ＰＡＧＥの結果であり、Ｂはウェスタンブロッチングの結果である。 図１９で、１列はいかなるＨＢＶ ＤＮＡ断片も含まないプラスミドを有する 大腸菌の産物を示し、２列および３列はｐｔｒｐＨ−ＵＢ−ＨＢＶＣＯＲＥで形 質転換した大腸菌の産物を示す。 ＜段階５＞ＵＢ ＨＢＶＣＯＲＥ蛋白の精製 （５−１）細胞破壊および溶解性蛋白の除去 前記＜段階３＞で得た３ｇの大腸菌細胞沈降物を実施例２の＜段階５＞の（５ −１）のように処理して、細胞を破壊し、それから不溶性沈降物を得た。 （５−２）６Ｍ尿素を用いた処理およびＤＥＡＥ−セファロースイオン交換クロ マトグラフィー 前記（５−１）で得た不溶性沈降物に最終濃度が６Ｍになるように尿素を添加 し、この懸濁液に最終容量が２８０mlになるように１Ｍ ＮａＯＨを添加してｐ Ｈ９．０に調整した。 上記産生物を、６Ｍ尿素を含む緩衝液８で平衡化させ たＤＥＡＥ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１．２５cm×５cm）に ３ml／分の流速で通過させ、同一緩衝液を加えてカラム内に残っている遊離蛋白 を溶出した。その後、０乃至０．５Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配を有する１００mlの 緩衝液８を３ml／分の流速で加えて結合した蛋白を溶出し溶出物を３mlずつの分 画として収集した。蛋白分画を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥしてＵＢ ＨＢＶＣＯＲ Ｅ蛋白を含む分画を収集した。 （５−３）Ｓ−３００ゲル濾過クロマトグラフィー 前記（５−２）で得た蛋白分画をＹＭ１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕ．Ｓ ．Ａ．）を用いて５mlの容量に濃縮した後、緩衝液８で平衡化させたＳ−３００ 樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，２．５cm×９０cm）に１ml／分の流 速で通過させた。溶出した蛋白を３mlずつの分画で収集し、１５％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥして高純度のＵＢ ＨＢＶＣＯＲＥ蛋白を含む分画を収集した。 （５−４）透析による尿素の除去 前記（５−３）で収集した蛋白分画を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ，Ｎｏ ．１，Ｍ．Ｗ．ｃｕｔｏｆｆ：６，０００−８，０００）を使用して緩衝液１０ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカ プトエタノール）に対して４℃で透析 して尿素を除去した後、遠心分離して９５％以上の純度を有するＵＢ ＨＢＶ ＣＯＲＥ蛋白を含む溶解性上澄液を得た。 実施例７：ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ蛋白の産生 ＜段階１＞発現ベクターの作製 ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ ＤＮＡを含有する１０μｇのベクターｐＬＢＣ−ＰＳ ＡＧ１４（韓国特許公告第９０−５９５９号参照）を１０単位の制限酵素Ｂａｍ ＨＩで３７℃で１時間処理した後、１％アガロースゲル電気泳動してＡＤＨ２プ ロモーター−前表面抗原（pre-surface antigen）−表面抗原−ＧＡＰＤＨタミ ネーターをコードするＤＮＡ配列を含むＢａｍＨＩカセットを得た。カセットを ２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた後、ＢａｍＨＩで切断したｐＹＬＢＣ中にク ローン化し、細菌のアルカリ性ホスファターゼで処理した。ヒネンの方法（Ｈｉ ｎｎｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，１ ９２９−１９３３（１９７８））によってサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｘ４００−５Ｂ（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を形質転換し、 それから組換え発現ベクターｐＹＰＳＡＧ１００を分離した（図２０参 照）。 ＜段階２＞ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ蛋白の産生 前記＜段階１＞で得たベクターｐＹＰＳＡＧ１００でサッカロミセス・セレビ ジエＸ４００−５Ｂ（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ ｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を形質転換し、形質転換した酵母細胞を３mlのロイシン欠乏 （deficient）培地（培地１ｌ当たり６．７ｇのアミノ酸のない酵母窒素基質、 １８２ｇのソルビトール、２％のグルコース、０．２５ｇのＬｅｕ−補充物）で ３０℃で２４時間培養した。 遠心分離機（ＤＹＮＡＣ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて培養液を３，０００ｒｐｍ で５分間遠心分離して上澄液を除去した。沈降物を５mlの培養培地（２％グルコ ース、１％酵母抽出物、２％バクトペプトン（Bacto peptone））で８時間振盪 した。培養液を３，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去し沈降物を得、こ れを５mlのＹＥＰＥ培地（５％エタノール、１％酵母抽出物、２％バクトペプト ン）で３０℃で４時間培養して、Ｂ型肝炎ウイルスの前表面抗原（pre-surface antigen）および表面抗原の発現を誘導した。 ＜段階３＞Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ蛋白の精製 前記＜段階２＞で得た１ｌの培養液を遠心分離機（Ｂ ｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ ＪＡ ４．２，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて３５００ｒ ｐｍで１０分間遠心分離して酵母細胞沈降物を収集した。細胞沈降物を５０mlの 緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ ％トリトンＸ−１００，１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）に溶解し同容 量の直径０．４５ｍｍのガラスビーズを懸濁液に添加した。生成された懸濁液を それぞれ５分ずつ３回強く振盪した後、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏ ｒ ＪＳ−１３，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分 離して上澄液を得た。 上澄液を、乾燥セファロースＣＬ−４Ｂ １ｇ当り８ｍｇの単クローン性抗体 を含有するＨＢＶ表面抗原に対する単クローン性抗体（ＣＨII５−６０、ラッキ ー中央研究所）と結合されたセファロースＣＬ−４Ｂ親和性カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に通過させた。緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７ ．５，１Ｍ ＮａＣｌ）を溶出させることによってカラムを十分に洗浄して活性 化した。表面抗原を含有する上澄液を１ml／時の流速で添加し、溶出剤のＡ₂₈₀ が０に至るまで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液でカラムを継続洗浄 した。緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７． ５）をカラムに加えて非特異性蛋白を除去し溶出物のＡ₂₈₀を１になるように調 整した。 Ａ₂₈₀が１に到達した後、緩衝液（３Ｍ ＮＨ₄ＳＣＮ，５０ｍＭトリス、ｐＨ ７．５）を加えて結合した表面抗原蛋白を溶出させＡ₂₈₀のピークで溶出された ２０ｍｌを収集して、これを４ｌの緩衝液（５０ｍＭトリス，ｐＨ７．５）に対 して４℃で２４時間透析した。 産生物をＹＭ３０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に通過させ１ｍ ｌ容量に濃縮した。５０ｍｌ／時の流速で緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７．０）を加えながらセファロースＣＬ−４Ｂカラム（１．５×９０cm，Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を通過させ、結合した蛋白を溶出し 溶出物を２ｍｌの分画として収集した。オスチームII（ＯｓｚｙｍｅII、Ａｂｏ ｔｔ Ｃｏ．）を使用して、各試験管を試験し反応性を示す分画を収集した。得 られた溶液に最終濃度が１．２ｇ／cm³になるようにＣｓＣｌ₂溶液を加えた。懸 濁液を遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｏｒ ４１Ｔｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を 用いて３５，０００ｒｐｍで２４時間遠心分離して沈降物を得た。 レムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））を用いて沈降物 をＳＤＳ−ＰＡＧＥして蛋白を 含む分画を収集した（図２１参照）。 実施例８：イムノブロッチング分析キットの作製 ５種のＨＣＶ抗原蛋白（ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４，ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ，ＫＨ ＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２，ＫＨＣＶ８９７およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２）、２ 種のＨＢＶ抗原蛋白（ＨＢＶ ＣＯＲＥおよびＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ ）、ユビキチンおよび人間免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）をブロッチング緩衝液 （１００ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）で下記濃度になるように希釈した ： ｈＩｇＧ：５μｇ／ｍｌ ＆ ０．１μｇ／ｍｌ； ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４：１０μｇ／ｍｌ； ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ：２０μｇ／ｍｌ； ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２：１０μｇ／ｍｌ； ＫＨＣＶ ８９７：１０μｇ／ｍｌ； ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２：２０μｇ／ｍｌ； ＨＢＶ ＣＯＲＥ：１０μｇ／ｍｌ； ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ：１０μｇ／ｍｌ ；および ＵＢ：５μｇ／ｍｌ。 抗原蛋白を含有する各希釈液を、スロットブロッチング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂ．，Ｄｏｔ ＳＦブロ ッチング装置、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７０−６５４２，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用してブ ロッチング緩衝液にあらかじめ浸漬したニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌ ｉｅｓｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，ＢＡ ８３，孔の大きさ０．２２μm， Ｕ．Ｓ．Ａ．）のスロット（０．７×０．７ｍｍ）に下記順序および量に従って 添加した後、同一緩衝液で一度洗浄した。 スロット１：ｈＩｇＧ ５μｇ／ｍｌ，２５０μｌ； スロット２：ＫＨＣＶ ＣＯＲＥ１４ １０μｇ／ｍｌ，２５０μｌ； スロット３：ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ ２０μｇ／ｍｌ，１２５μｌ；および ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２ １０μｇ／ｍｌ，１２５μｌ； スロット４：ＫＨＣＶ ８９７ １０μｇ／ｍｌ，２５０μｌ； スロット５：ＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２ ２０μｇ／ｍｌ，２５０μｌ； スロット６：ＨＢＶ ＣＯＲＥ １０μｇ／ｍｌ，２５０μｌ； スロット７：ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ １０μｇ／ｍｌ，２５０μｌ ； スロット８：ＵＢ ５μｇ／ｍｌ，２５０μｌ；および スロット９：ｈＩｇＧ ０．１μｇ／ｍｌ，２５０μｌ。 ニトロセルロースフィルターに８乃至１０Ｈｇの真空圧力を１０乃至２０分間 加えて前記蛋白溶液を濾過することによって抗原蛋白をニトロセルロースフィル ターにブロッチングし、各スロットに２５０μｌのブロッチング緩衝液を加えて もう一度濾過することによって濾過膜を一度洗浄した。 ニトロセルロースフィルターをピンセットで取り除き６０℃で１０分間乾燥し た。乾燥したニトロセルロースフィルターを０．１％ゼラチンを含有するリン酸 塩緩衝食塩水に入れ室温で３０分間軽く振って、空いているブロッチング部位に 蛋白が非特異的に結合することを防止した。処理されたフィルターを前記のよう な条件で乾燥させた後、適当な方法で番号を付けるか番号で標識された支持体に 結合させた。フィルターをそれぞれ一つの抗原蛋白を含有する全ての種類のスロ ットを含むストリップに切った。 実施例９：イムノブロッチングキットを用いた診断 前記実施例８で作製した各ストリップを試験管（１３ ×１００ｍｍ）に入れ、これに、５μｇ／ｍｌのＵＢを含有するＰＢＳ（０．２ ５％ゼラチン、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２％チ メロサル（Thimerosal））で５０倍希釈された血清試料をストリップが充分に浸 されるまで添加した。試験管（glass tube）をパラ−フィルム（para-film）で 密封し室温で２時間軽く振ってストリップ上の抗原と血清試料中の抗体を反応さ せた。 吸入装置を用いて血清を試験管（glass tube）から除去した。各試験管に４ｍ ｌの洗浄液（０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳ）を加え約４分間振盪 した後洗浄液を除去することによってストリップを１度洗浄した。 ２０ｍｌの洗浄液を含む反応皿に１０個のストリップを置いて洗浄液で３度洗 浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された山羊抗ヒトＩｇＧ抗体（ｇｏ ａｔ ａｎｔｉ−ｈＩｇＧ（γ）ＨＲＰ）を、１０μｇ／ｍｌのＵＢを含む酵素 −標識された抗体希釈剤（１０％牛胎血清、１％のフィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、 ０．０５％のツイーン２０、０．０２％チメロサルを含むＰＢＳ）５乃至７μｇ ／ｍｌをもって希釈された溶液２０ｍｌを反応皿に加えた。 産物を室温で４０分間軽く振って反応させ各２０ｍｌ の前記洗浄緩衝液で４回洗浄した後、各２０ｍｌの反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒ ｉｓ，ｐＨ７．５）で２回洗浄した。４００μｇ／ｍｌの４−クロロ−１−ナフ トールおよび０．０３％の過酸化水素を含む２０ｍｌの反応緩衝液をそこに加え 、軽く振盪しながら室温で２０分間反応させた。 反応緩衝液を除去した後、濾過膜を蒸留水で２度洗浄し、吸収紙に移した後室 温で２０分間乾燥させた。ストリップに可視的なカラーバンドが現れた。 この結果は表１に示しており、ここで試料番号１乃至１８はオルト診断キット （Ortho Diagnostic kit）によって陽性と診断された結果を示し、試料番号１９ 乃至２１はＢ型肝炎患者から採取した血清を用いて得た結果を示す。 実施例１０．試験結果の判定 各抗原蛋白の色濃度を二つの対照群の色濃度と比較することによって、前記試 験結果を次のように判定した。 １）始め、バンド１および９でｈＩｇＧが着色しているかとバンド８でユビキ チンに色がないかを検査した。 ２）色濃度を基にして、各バンドの反応性を次のように分類した： 各バンドでの色濃度 反応性 ０ − バンド９でのｈＩｇＧの色濃度＞ ＋／− バンド９でのｈＩｇＧの色濃度と類似 １＋ バンド１と９でのｈＩｇＧ等の色濃度の間 ２＋ バンド１でのｈＩｇＧの色濃度＜ ３＋ ３）前記２）の分類によって、試験試料を次のように判定した。 反応性 結果 １＋以上 ：陽性 −または＋／− ：陰性 １＋以上であるが、バンド８で ：保留 ＵＢの濃度が１＋以上である場合 ４）Ｂ型肝炎の場合、ＨＢＶＣＯＲＥとＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇバン ドとが＋であるかＨＢＶ Ｐｒ ｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇバンドのみ＋であれば、患者がＢ型肝炎から回復中のことと 判定し、ＨＢＶＣＯＲＥバンドのみ＋であれば、患者が急性Ｂ型肝炎を患ってい ることと判定した。 前記基準による判定結果は表Ｉに示されている。オルト第一世代診断キットに よって陽性と診断された１８個の血清試料中で、株式会社ラッキーのＥＬＩＳＡ 方法（韓国特許公開第９３−６８３号）によって、ただ５個試料のみ陽性として 診断され１個の試料は中間として診断され、本発明の診断キットを用いて５個の 試料が陽性として診断された。 株式会社ラッキーのＥＬＩＳＡ方法によって中間と診断された４番試料は本発 明の診断キットを用いるとき陰性と診断された。 この結果は、本発明の診断キットがオルト診断キットより実質的に少なく偽陽 性結果を示し、誤診の可能性を減らすため、ＥＬＩＳＡ方法によって陽性と診断 された血清試料を確認するのに有用であることを示す。 一方、肝炎患者の血清試料１７８個を本発明の診断キットおよびＰＣＲを用い て試験して、１３６個の試料が陽性と診断された。この試験結果を下記表IIに示 した。 また、前記試験結果を確認するため前記血清試料をＲＩＢＡII（オルトダイア グノスチックシステムズ社、米国）を用いて診断した。 その結果を本発明の診断キットを用いて得た結果と比較して下記表IIIに示す 。 表IIIに示したように、ＰＣＲで陽性と診断された１２３個の試料全てが本発 明の診断キットによって同一に診断された反面、ＲＩＢＡII（オルトダイアグノ スチック システムズ社）によれば１０個の試料が中間と診断された。 この結果は、本発明の診断方法が実質的に誤診の可能性を減らし２種の肝炎、 即ち、Ｂ型およびＣ型肝炎を同時に診断できることを示す。 また本発明の診断キットは多いエピトープ、即ち、ＫＨＣＶ外皮蛋白、ＫＨＣ Ｖ Ｅ１Ｅ２蛋白およびＫＨＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白を含むので、ＨＣＶ感染 に対してさらに正確な診断が可能である。 本発明を前記実施態様に対して記述したが、本発明と関連した当該分野の専門 家等は本発明を多様に変化および変更でき、これらも、下記添付した請求の範囲 で規定した本発明の範囲に属することは勿論である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キム チュン ヒュング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―１ ラッキー ドーミトリー 219 (72)発明者 ソー ホング セオブ 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―４ ラッキー ドーミトリー 301 (72)発明者 ヤング ジャエ ヨウング 大韓民国 305―340 ダエジェオン ユセ オング―ク ドリオング―ドン 386―４ ラッキー アパートメント Ｂ―304 (72)発明者 キム イン ソオ 大韓民国 305―345 ダエジェオン ユセ オング―ク シンスング―ドン 153 ラ ッキー ハナ アパートメント 102―402 (72)発明者 チョイ ドング セオブ 大韓民国 305―345 ダエジェオン ユセ オング―ク シンスング―ドン 153 ラ ッキー ハナ アパートメント 107―707

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非構造３蛋 白（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非構造４蛋白（ｎ ｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ４ ｐｒｏｔｅｉｎ）および.外皮蛋白（ｅｎｖ ｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のエピトープを一つ以上含むＨＣＶ抗原蛋白一つ 以上、およびＢ型肝炎ウイルスのコア蛋白および表面抗原蛋白のエピトープを一 つ以上含むＨＢＶ抗原蛋白一つ以上を含むＢ型およびＣ型肝炎同時診断用診断キ ット。 ２． 下記アミノ酸配列を有するＫＨＣＶ ＣＯＲＥ １４蛋白、ＫＨＣＶ ８ ９７蛋白、ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ蛋白、ＫＨＣＶ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白およびＫＨ ＣＶ ＮＳ５−１．２蛋白からなる群から選択された一つ以上のＣ型肝炎ウイル ス抗原蛋白およびＢ型肝炎ウイルスＣＯＲＥ蛋白および／またはＰｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇ蛋白を含む請求項１に記載の診断キット： ３． ＨＣＶ抗原蛋白またはＨＢＶ抗原蛋白が、１つのポリペプチド分子内で１ または複数のエピトープが他の蛋白と融合された組換え蛋白である請求項１に記 載の診断キット。 ４． 前記他の蛋白がユビキチンである請求項３に記載の診断キット。 ５． ＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ １４蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ４Ｅ蛋白、 ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ４Ｅ１Ｅ２蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢ ８９７蛋白および Ｋ ＨＣＶ ＵＢ ＮＳ５−１．２のＨＣＶ抗原組換え蛋白；ＨＢＶ コア蛋白およ びＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ ＡｇのＨＢＶ抗原組換え蛋白；ネガティブコント ロール蛋白としてユビキチン；およびポジティブコントロール蛋白としてヒトイ ムノグロブリンを含む請求項４に記載の診断キット。 ６． 請求項１乃至５中いずれかの診断キットを使用してＢ型およびＣ型肝炎を 同時に診断する診断方法。 ７． （Ａ）精製されたヒトイムノグロブリン、ＫＨＣＶ ＵＢ ＣＯＲＥ１４ 蛋白、ＫＨＣＶ ＵＢ ＮＳ５−１．２、ＨＢＶ ＣＯＲＥ、ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２ Ｓ Ａｇおよびユビキチンがそれぞれ吸着したフィルターを遮断溶液（ｂ ｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ） で処理し； （Ｂ）遮断されたたフィルターを支持膜に並行に並べて付着し、膜を切断して ８個の蛋白バンドを形成するように各フィルターの同一な領域を含むストリップ を製造し； （Ｃ）該ストリップを推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）血清試料と反応させ； （Ｄ）（Ｃ）で得たストリップを西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ 性ホスファダーゼで標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させ； （Ｅ）西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファダーゼのための 基質を加え；および （Ｆ）（Ｅ）で得たストリップ上に呈色反応を起こした後、各バンドの色濃度 を測定する段階 を含む、Ｂ型およびＣ型肝炎の同時診断方法。