JP6016699B2

JP6016699B2 - 抗ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体、又は結合性を有するそのフラグメント、及びそれらの使用

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Publication number: JP6016699B2
Application number: JP2013078769A
Authority: JP
Inventors: ▲寧▼邵夏; ▲軍▼ ▲張▼; ▲穎▼ ▲顧▼; 少▲偉▼ 李; ▲勝▼祥 ▲葛▼; 志▲強▼ 何
Original assignee: ベイジンワンタイバイオロジカルファーマシーエンタープライズカンパニー，リミテッド; シャモンユニヴァーシティー
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2022-11-08
Also published as: US7786264B2; EP1452541A4; EP2322625A1; US9428554B2; US20060233822A1; CN100339395C; EP2322625B8; BR122015016384B1; AU2002349727B2; BRPI0214188B8; BRPI0214188B1; JP2005524386A; BR122015016384B8; JP2013226136A; JP2010213693A; BR0214188A; CN1610697A; US20100003281A1; KR101020256B1; EP1452541A1

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の配列番号：１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、又はその保存変異体若しくはその活性フラグメント、又は本発明の前記モノクローナル抗体と交差反応することができる、抗ＯＲＦ２モノクローナル抗体、及びそれらのヌクレオチド配列又は縮重配列に関する。また、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基に関する。また、本発明は、前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３に特異的に結合するという、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基１）又は３）と同一の性質を有する、単離された又は組み換えられたポリペプチド又はポリペプチドアナログをスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、上記の方法によりスクリーニングされたポリペプチド又はポリペプチドアナログ、及びそのヌクレオチド配列又は縮重配列に関する。また、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断及び／又は予防のための薬剤の製造における前記ポリペプチド又はポリペプチドアナログの使用に関する。また、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断のためのキット、及びＥ型肝炎ウイルス感染の予防のためのワクチン組成物に関する。また、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断、予防及び／又は治療のための薬剤の調製における、前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の使用に関する。また、本発明は、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための薬学的組成物、並びにＥ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための方法に関する。また、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む組換え発現ベクター、及び前記組換え発現ベクターで形質転換され、本発明のモノクローナル抗体、その保存変異体若しくは活性フラグメント、又は本発明のポリペプチド若しくはポリペプチドアナログを発現することができる宿主細胞に関する。

［発明の背景］
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、１９８３年に初めて経腸伝播性の非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体として同定された（Ｂａｌａｙａｎ等、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ２０：２３（１９８３））。Ｅ型肝炎は主にアジア、アフリカ及び中央アメリカの開発途上国における風土病である。先進国では、Ｅ型肝炎の症例は、たいてい海外からの移住者又は旅行者に見られた。散発的発症例及び汎発的発症例の双方が報告されている。１９５０年代から１９９０年代までの期間に、汚染された飲料水を原因とするＥ型肝炎の発生例がいくつかあった（Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ、ＩｎｄｉａｎＪ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）４５：１−３０（１９５７）；Ｗｏｎｇ等、Ｌａｎｃｅｔ．２：８８２−８８５（１９８０）；Ｍｙｉｎｔ等、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３４：１１８３−１１８９（１９８５）；Ｂｅｌａｂｂｅｓ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１６：２５７−２６３（１９８５）；Ｈａｕ等、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６０：２７７−２８０（１９９９））。たいていのＥ型肝炎感染は自己限定的であり、慢性疾患まで進行することは稀であったが、妊娠女性に関しては、続発症は重篤で、死亡率は１７％を超えている（Ｔｓｅｇａ等、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１４：９６１−９６５（１９９２）；Ｄｉｌａｗａｒｉ等、ＩｎｄｉａｎＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３：４４−４８（１９９４）；Ｈｕｓｓａｉｎｉ等、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．４：５１−５４（１９９７））。

１９９１年に、研究者は初めてＨＥＶの完全なゲノム配列を入手し、ＨＥＶがエンベロープを有さない１本鎖（＋）ＲＮＡウイルスであることを明らかになった（Ｔａｍ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：１２０−１３１（１９９１））。配列解析により、ゲノムは約７．２ｋｂの長さで３個のオープン・リーディグ・フレームを有することが示された。ＯＲＦ１は５’末端に位置し、ウイルスの非構造タンパク質をコードし、そしてＯＲＦ２は３’末端に位置し、ウイルスの主要構造タンパク質をコードする。ＯＲＦ３の５’末端は、１個の塩基でＯＲＦ１３’末端と重複する。ＯＲＦ３の３’末端では３３９個の塩基がＯＲＦ２と重複する。ＯＲＦ３は未知の機能を有する別の構造タンパク質をコードすることがわかっている（Ｔａｍ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：１２０−１３１（１９９１）；Ａｙｅ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：３５１２（１９９２）；Ａｙｅ等、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ７：９５−１０９（１９９３）；Ｈｕａｎｇ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９１：５５０−５５８（１９９２）；Ｒｅｙｅｓ等、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．７：１５−２５（１９９３））。

ＨＥＶＯＲＦ２は、５１４７番目の塩基から始まり、１９８０個のヌクレオチドを有する。このヌクレオチドは、ウイルスのカプシドを構成する主要構造タンパク質であると考えられている、６６０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードしている。ＯＲＦ２タンパク質のＮ末端には、アルギニンリッチ領域を伴った、よく知られたシグナルペプチド配列がある。そのアルギニンリッチ領域は強い正荷電を帯びた領域であり、ウイルス構築の際にゲノムＲＮＡがカプシドに包まれる過程に関与すると考えられている。ＯＲＦ２は、翻訳の過程で、シグナルペプチド認識タンパク質（ＳＲＰ）のメカニズムにより小胞体（ＥＲ）に進入し、そしてグリコシル化を受けてＥＲに蓄積した後、おそらくその場でカプシドのカプソメアを形成する。ＯＲＦ２の３個のＮ−グリコシル化部位である、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−３１０及びＡｓｎ−５６２は、異なるウイルス株間で高度に保存されている。Ａｓｎ−３１０は主要グリコシル化部位である。そのため、ＯＲＦ２をトランスフェクトされた哺乳動物細胞ＣＯＳ及びヒト肝癌細胞Ｈｕｈ−７及びＨｅｐＧ２は、細胞質及び細胞膜の双方で見出される８８ｋＤの糖タンパク質を発現することができる。これらのグリコシル化部位での変異は、細胞膜上へのＰＯＲＦ２の分布には影響しなかった。しかし、シグナルペプチド配列をそこから除去すると、ＰＯＲＦ２を細胞質にしか見出すことができなかった。これは、細胞膜上へのタンパク質の分布には、グリコシル化ではなく、ＰＯＲＦ２の移行が必要であることを示唆するものであった。ＰＯＲＦ２は、ＨＢＶにおけるＭＳタンパク質と同様に、おそらくゴルジ体を通過せずに直接ＥＲから細胞膜に分泌される。トランスフェクトされた細胞の表面では、ｇｐＯＲＦ２は無秩序に分布しているのではなく、ある区域で集積している。これは、タンパク質サブユニットが能動的に合体する過程を示唆するものであった。タンパク質サブユニットは、おそらく会合してより秩序ある形態に進展する。ウイルスの最終的な構築／成熟はゲノムＲＮＡがカプシドに包まれることを必要とするので、ＥＲの外側の細胞質、又は細胞膜の内壁で起こる可能性が高い。ｇｐＯＲＦ２の膜への蓄積はウイルスの構築を示唆する。同時に、カプシドタンパク質の膜への局在は、成熟ウイルスが出芽によって細胞から分泌される可能性も示している。

米国特許第５８８５７６８号明細書では、ライエス（Ｒｅｙｅｓ）等は最初に、ＨＥＶビルマ株ＯＲＦ２のＣ末端２／３（アミノ酸２２５〜６６０）を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた組換えタンパク質ｔｒｐＥ−Ｃ２を、４匹のカニクイザルに、５０μｇ／用量で０及び３０日に筋肉内注射したことを報告した。ここで、前記タンパク質は、ミョウバンアジュバントとともに投与された。２匹のサルは、対照としてアジュバントのみが注射された。４週後に採取した血液には、抗体が検出されなかった（ウェスタン・ブロッティング法による）。４匹のうちの２匹のサルには、１匹あたり８０μｇの不溶性組換えタンパク質をアジュバントなしで投与して、３回目の免疫を行った。４週後、双方のサルは陽性であった（ＷＢ）。次いで６匹のサルを、それぞれ３匹のサルからなる２群に分けた。各群の１匹は３回免疫されたもの、１匹は２回免疫されたもの、そして１匹は対照であった。第１の群にはビルマＨＥＶを、そして第２の群にはメキシコＨＥＶを投与した。結果は、次の（１）〜（３）である。（１）ＡＬＴは免疫群では終止正常であったが、対照では免疫前の６〜１０倍に増加した。（２）肝臓生検サンプルを免疫蛍光法で検査すると、３回免疫し、かつビルマ株を投与したサルを除いて、すべてのサルで抗原が検出された。（３）糞便中へのウイルス排泄は、３回免疫し、かつビルマ株を投与したサルを除いて、すべてのサルで見られた。この研究サンプルは小さいが、ＯＲＦ２由来の組換えタンパク質がウイルス性肝炎の生化学的指標の出現を遮断すること、及び野生型ＨＥＶに攻撃された場合、この組換えタンパク質によって感染を完全に免れるサルがいることを示唆するものであった。

オーストラリアのアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）のグループ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８１：１３１−１４２（１９９９）；Ｌｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３２：２０６０−２０６６（１９９４）；Ｌｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５２：２８９−３００（１９９７）；Ｌｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６０：３７９−３８６（２０００））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させたＯＲＦ２アミノ酸３９４〜６６０（ＯＲＦ２．１）を使用した。発現産物は、高度にコンフォーメーション依存的な回復期のエピトープを形成しうる、ＧＳＴ又はポリヒスチジンとの融合タンパク質であった。このエピトープは高い割合で回復期の血清を検出することができたが、フラグメントがＮ末端の方に伸長したり、切断されたりすると、エピトープは消失した。組換えＯＲＦ２．１タンパク質でマウスを免疫した後３０週の血清を用いて、バキュロウイルス内で発現したＶＬＰを有する回復期の患者の血清を被覆抗原として遮断した。遮断率は８１〜８６％に達した。別のデータでは、ＯＲＦ２．１がＶＬＰにかなり類似する主要なエピトープ構造を有することが示された。このエピトープに対する抗体は、ＨＥＶに感染した個体の血清中に長時間存在することができる。そのエピトープはおそらく重要な保護エピトープであり、ＯＲＦ２．１に対する抗体は有用であろう。

抗ＨＥＶモノクローナル抗体の調製及び適用の過程で生じる多くの問題を克服するために、発明者は、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２内の優れた抗原性を有する一連のポリペプチドフラグメントを得たこと（中国特許第ＣＮ００１３０６３４０号明細書参照）に基づき、ＮＥ２フラグメントを抗原として用いて、ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を調製した。そして、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌することのできる細胞株、及びその細胞株により産生されるモノクローナル抗体を得た。

［発明の概要］
本発明は、１つの態様においては、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ＯＲＦ２のポリペプチド（配列番号：１に示すアミノ酸配列）に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はその保存変異体若しくは活性フラグメントであって、アミノ酸配列内で、本発明の前記モノクローナル抗体のアミノ酸配列と比較して、１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基の置換、付加又は欠失がなされ、かつＨＥＶに特異的に結合する能力を保持している、保存変異体若しくは活性フラグメントに関する。本発明はまた、前記モノクローナル抗体と交差反応することができる、ＯＲＦ２を指向するモノクローナル抗体にも関する。

本発明は、別の１つの態様では、本発明のモノクローナル抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子に関する。

本発明は、別の１つの態様では、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基に関する。

本発明は、別の１つの態様では、本発明のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の前記抗原決定基の少なくとも１つ若しくはそのいずれかの組合せを含み、又は本発明の前記抗原決定基の少なくとも１つに対して高度な配列相同性を有するフラグメントを含む、単離された又は組み換えられたポリペプチドに関する。

本発明は、別の１つの態様では、単離された若しくは組み換えられたポリペプチド若しくはポリペプチドアナログをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子に関する。

本発明は、別の１つの態様では、本発明のモノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３を特異的に結合するという、本発明のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基１）又は３）と同等の性質を有する、前記単離された又は組み換えられたポリペプチド又はポリペプチドアナログをスクリーニングする方法に関する。

本発明はまた、上記の方法によりスクリーニングされた単離された又は組み換えられたポリペプチド又はポリペプチドアナログにも関する。

本発明はまた、上記のポリペプチド又はポリペプチドアナログをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子にも関する。

本発明はまた、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断及び／又は予防のための薬剤の調製における前記ポリペプチド又はポリペプチドアナログの使用にも関する。

本発明はまた、Ｅ型肝炎ウイルスの前記抗原決定基、ポリペプチド又はポリペプチドアナログの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ前記抗原・抗体相互作用の検出に適した検出試薬を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断のための、特にＥ型肝炎ウイルスに対するＩｇＧ抗体若しくはＩｇＭ抗体又はすべての抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出のための診断キットにも関する。

本発明はまた、本発明の前記ポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ少なくとも１つ、又はそのいずれかの組合せを免疫有効量だけ含み、かつ適当な免疫学的アジュバントを含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防のためのワクチン組成物にも関する。

本発明はまた、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断、予防及び／又は治療のための薬剤の調製における前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の使用にも関する。

本発明はまた、本発明の前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体、又はそのいずれかの組合せの少なくとも１つを診断に有効な量だけ含み、かつ前記抗原・抗体相互作用の検出に適した検出試薬を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断のための、特にサンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗原の検出のための診断キットにも関する。

本発明はまた、本発明の前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の少なくとも１つを治療有効量だけ含み、かつ薬学的に許容される溶剤及び／又は賦形剤を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための薬学的組成物にも関する。

本発明はまた、本発明の前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の少なくとも１つを予防有効量及び／又は治療有効量だけ対象に投与することを含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための方法にも関する。

本発明はまた、本発明の前記核酸分子を含む組換え発現ベクター、及びその組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、本発明の前記モノクローナル抗体、その保存変異体若しくは活性フラグメント、又はポリペプチド若しくはポリペプチドアナログを発現することができる宿主細胞にも関する。

本発明はまた、サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗原及び／又は抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法をも提供する。

ＨＥＶＯＲＦ２の抗原ＮＥ２の精製された組換え産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２は細菌ライゼートであり、レーン３は、尿素洗浄の上清２ミリモル／ｌであり、レーン４は尿素洗浄の上清４ミリモル／ｌであり、レーン５は尿素洗浄の上清８ミリモル／ｌであり、レーン６はＰＢＳで透析した尿素洗浄の上清４ミリモル／ｌであり、レーン７はＨＰＬＣにより精製された組換えタンパク質であり（煮沸していない）、レーン８はＨＰＬＣにより精製されたタンパク質である（煮沸した）。組換えタンパク質ＮＥ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプロファイルを示す。煮沸した、及び煮沸していない組換えタンパク質ＮＥ２の異なるモノクローナル抗体によるウェスタン・ブロッティングを示す。レーン１、２はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、レーン３から２０はウェスタン・ブロッティングの結果であり、奇数のレーンは煮沸していないＮＥ２タンパク質であり、一方偶数のレーンは対応する煮沸したＮＥ２タンパク質である。レーン３、４はモノクローナル抗体１Ｆ６であり、レーン５、６はモノクローナル抗体２Ｃ９であり、レーン７、８はモノクローナル抗体７Ｅ８であり、レーン９、１０はモノクローナル抗体８Ｃ１１であり、レーン１１、１２はモノクローナル抗体８Ｈ３であり、レーン１３、１４はモノクローナル抗体１３Ｄ８であり、レーン１５、１６はモノクローナル抗体１５Ｂ２であり、レーン１７、１８はモノクローナル抗体１６Ｄ７であり、そしてレーン１９、２０は対照としてのモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体又はそのＦａｂフラグメントのＮＥ２チップとの結合及び解離の経過を示す。モノクローナル抗体８Ｃ１１及びそのＦａｂフラグメントにより増強された８Ｈ３又はそのＦａｂフラグメントの効果を示す。Ａはモノクローナル抗体８Ｃ１１により増強された８Ｈ３又は８Ｈ３Ｆａｂフラグメントの効果であり、Ｂは８Ｃ１１Ｆａｂフラグメントにより増強された８Ｈ３又はその８Ｈ３Ｆａｂフラグメントの効果である。排泄物中のＨＥＶのモノクローナル抗体による捕捉ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はモノクローナル抗体不含の対照であり、レーン３はモノクローナル抗体１Ｆ６であり、レーン４はモノクローナル抗体７Ｅ８であり、レーン５はモノクローナル抗体８Ｃ１１であり、レーン６はモノクローナル抗体１５Ｂ２であり、レーン７はモノクローナル抗体８Ｈ３であり、レーン８はモノクローナル抗体１６Ｄ７であり、レーン９はモノクローナル抗体２Ｃ９であり、レーン１０はモノクローナル抗体１３Ｄ８であり、レーン１１は対照としての抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体であり、レーン１２はウサギ抗ＮＥ２ポリクローナル抗体である。モノクローナル抗体８Ｃ１１により増強されたモノクローナル抗体８Ｈ３のＨＥＶの捕捉活性を示す。Ａ１からＡ４は８Ｃ１１によりコーティングされており、Ａ６からＡ１２はコーティングされておらず、Ｂ１からＢ１２は８Ｈ３によりコーティングされており、Ｃ１からＣ２は８Ｈ３によりコーティングされており、Ｃ４からＣ７は２Ｃ９によりコーティングされており、Ｃ９はＲＮＡ抽出の陰性対照であり、Ｃ１１は第２ラウンドのＰＣＲの陰性対照であり、Ａ１からＡ２は直接添加した排泄物懸濁液の結果である。Ａ３からＡ４は１：１００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物懸濁液であり、Ａ６には排泄物懸濁液を直接添加し、Ａ７からＡ１１は１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００及び１：１０００００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物懸濁液の結果であり、Ａ１２は１：１００のモノクローナル抗体１３Ｄ８と共にインキュベートした排泄物懸濁液の結果であり、Ｂ１及びＢ２には排泄物を直接添加し、Ｂ３、Ｂ４は１：１０のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物であり、Ｂ５、Ｂ６は１：１００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物であり、Ｂ７、Ｂ８は１：１０００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物であり、Ｂ９、Ｂ１０は１：１００００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物であり、Ｂ１１、Ｂ１２は１：１０００００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物であり、Ｃ１、Ｃ２は１：１００のモノクローナル抗体１３Ｄ８と共にインキュベートした排泄物であり、Ｃ４、Ｃ５には排泄物を直接添加し、Ｃ６、Ｃ７は１：１００のモノクローナル抗体８Ｃ１１と共にインキュベートした排泄物である。急性ＨＥＶ感染の患者に由来する血清による８種類の抗ＮＥ２モノクローナル抗体に対する遮断効果を示す。８Ｃ１１、８Ｈ３及びそのＦａｂフラグメントによる回復相におけるＨＥＶ感染の３つの血清に対する遮断効果を示す。２０個のアミノ酸の特質を示す。異なるモノクローナル抗体による６０１シリーズの変異タンパク質のウェスタン・ブロッティングを示す。Ａ、Ｂは各々モノクローナル抗体１６Ｄ７、１３Ｄ８による結果である。レーン１は組換えタンパク質６００ＶＥであり、レーン２は組換えタンパク質６０２ＬＥであり、レーン３は組換えタンパク質５９９ＡＥであり、レーン４は組換えタンパク質５９８ＶＥであり、レーン５は組換えタンパク質５９７ＡＥであり、レーン６は組換えタンパク質６０１ＬＤであり、レーン７は組換えタンパク質６０１ＬＫであり、レーン８は組換えタンパク質６０１ＬＨであり、レーン９は組換えタンパク質６０１ＬＤである。Ｃ、Ｄは各々モノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３による結果である。レーン１は組換えタンパク質ＮＥ２であり、レーン２は組換えタンパク質６００ＶＥであり、レーン３は組換えタンパク質６０２ＬＥであり、レーン４は組換えタンパク質５９９ＡＥであり、レーン５は組換えタンパク質５９８ＶＥであり、レーン６は組換えタンパク質５９７ＡＥであり、レーン７は組換えタンパク質６０１ＬＱであり、レーン８は組換えタンパク質６０１ＬＫであり、レーン９は６０１ＬＨであり、レーン１０は組換えタンパク質６０１ＬＤである。Ｅはアミノ酸６０１変異タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、レーン１はＮＥ２であり、レーン２は６０１ＬＰであり、レーン３は６０１ＬＩであり、レーン４は６０１ＬＧであり、レーン５は６０１ＬＥであり、レーン６は６０１ＬＤであり、レーン７は６０１ＬＫであり、レーン８は６０１ＬＮであり、レーン９は６０１ＬＨである。組換えポリペプチド２３９の透過電子顕微鏡法を示す。組換えポリペプチド２３９の原子間力顕微鏡法を示す。組換えポリペプチド２３９の動的光散乱の結果を示す。急性ＨＥＶ感染の患者に由来する血清による組換えポリペプチド２３９のウェスタン・ブロッティングを示す。レーン１から７は煮沸していないポリペプチド２３９であり、レーン８から１４は煮沸したポリペプチド２３９である。レーン１及び８はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、レーン２／９、レーン３／１０、レーン４／１１、レーン５／１２、レーン６／１３はＨＥＶ感染の急性相の患者に由来する５つの血清であり、レーン７／１４は正常血清である。サルＨＥＶ感染の種々のパラメーターの動的経過。臨床急性肝炎感染の５１０症例の血清に関して抗原としてＮＥ２を用いる抗ＨＥＶ−ＩｇＭ捕捉試薬のＯＤ度数分布を示す。臨床急性肝炎感染の２００症例の血清におけるＥ２−ＩｇＭ及びＥ２−ＩｇＧＯＤ値間の関係を示す。非ＨＡＶ、非ＨＣＶ急性肝炎感染の１１９症例の血清に関するＥ２−ＩｇＭ及びＧＬ−ＩｇＭのＯＤ値度数分布を示す。抗ＨＥＶＩｇＧを用いる間接的ＥＬＩＳＡキットにより検出された正常及び急性肝炎に関するＯＤ値度数分布を示す。抗ＨＥＶモノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３によるＥ２−ＩｇＭ陽性血清の遮断を示す。抗ＨＥＶモノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３又はそのＦａｂフラグメントによるＥ２−ＩｇＧの遮断を示す。４００人の血液供給者の血清に関して２抗体サンドウィッチ及び間接的ＥＬＩＳＡで検出されたｓ／ｃｏの一貫性を示す。

特に断らない限り、本明細書で用いたすべての用語及び命名法はこの技術分野で慣用的に用いられるものと同一の意味を有する。本明細書で用いた細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の手法は、この技術分野で一般的に用いられる通常の技術である。

抗体は、ジスルフィド結合により連結されたポリペプチド鎖の集合体を含む。軽鎖及び重鎖と称される２つのポリペプチドは抗体のすべての主要な構造を構成する（アイソタイプ）。重鎖及び軽鎖の双方をさらに可変領域及び定常領域のいくつかの下位領域に分割することができる。各重鎖は、１個の可変領域及び３個の定常ドメインを有する。各軽鎖は、重鎖とは異なる１個の可変領域、及び重鎖とは異なる１個の定常領域を有する。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗体の結合特異性に寄与する。

本発明の１つの態様は、配列番号：１に示すＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体に関する。一実施形態では、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６により産生されたＥ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体８Ｃ１１であり、これはＨＥＶウイルスを直接捕捉することができ、そして中和保護効果を有し、そしてＨＥＶ感染の急性相及び回復相血清の双方で有意な血清遮断効果を有している。ＨＥＶ感染した血清はＨＥＶ抗原に対する８Ｃ１１の結合を遮断することができる。ＨＥＶ又はアナログに対する８Ｃ１１の結合により、ＨＥＶ又はアナログの空間的な構造の変化、及びＨＥＶ又はアナログに対する別のモノクローナル抗体８Ｈ３の結合の著しい増強を招きうる。８Ｃ１１のＨＥＶ組換えポリペプチドＮＥ２との親和定数は約２×１０−８であり、そしてそのＦａｂフラグメントの親和定数は約６×１０−７である。

本発明の別の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４により産生されたＥ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体１３Ｄ８であり、これはＨＥＶウイルスを直接捕捉することができ、そして中和保護効果を有し、そしてＨＥＶ感染の急性相及び回復相血清の双方で有意な血清遮断効果を有している。ＨＥＶ感染した血清はＨＥＶ抗原に対する１３Ｄ８の結合を遮断することができる。１３Ｄ８のＨＥＶ抗原との結合はモノクローナル抗体８Ｃ１１により遮断され、そしてモノクローナル抗体８Ｃ１１のＨＥＶ抗原との結合を遮断することができる。１３Ｄ８のＨＥＶ又はアナログとの結合により、ＨＥＶに対する別のモノクローナル抗体８Ｈ３のＨＥＶ又はアナログに対する結合の著しい増強を招くことはできない。１３Ｄ８のＨＥＶ組換えポリペプチドＮＥ２との親和定数は約２×１０−８であり、そしてそのＦａｂフラグメントの親和定数は約３×１０−７である。

本発明の別の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７により産生されたＥ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体８Ｈ３であり、これはＨＥＶウイルスを直接捕捉することができる。８Ｈ３のモノクローナル抗体８Ｃ１１との相乗作用は８Ｃ１１の中和保護効果を有意に増強することができ、そしてＨＥＶ感染の急性相及び回復相血清の双方で、モノクローナル抗体８Ｃ１１単独よりもさらに有意な血清遮断効果を有している。ＨＥＶ感染した血清は８Ｈ３のＨＥＶ抗原との結合を遮断することができる。ＨＥＶ又はアナログに対する８Ｃ１１の結合により、ＨＥＶ又はアナログに対するモノクローナル抗体８Ｈ３の結合の著しい増強を招きうる。８Ｈ３のＨＥＶ組換えポリペプチドＮＥ２との親和定数は約２×１０−６であり、そしてそのＦａｂフラグメントの親和定数は約６×１０−１１である。

本発明の別の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１５により産生されたＥ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体１６Ｄ７である。ＨＥＶ感染した血清は、１６Ｄ７のＨＥＶ抗原との結合を遮断することができる。１６Ｄ７のＨＥＶ組換えポリペプチドＮＥ２との親和定数は約２×１０−８である。

本発明の別の実施形態は前記モノクローナル抗体に関し、ここで
１）前記モノクローナル抗体８Ｃ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１２に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１０に示され、又は
２）前記モノクローナル抗体１３Ｄ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：８に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：６に示され、又は
３）前記モノクローナル抗体８Ｈ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１６に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１４に示され、又は
４）前記モノクローナル抗体１６Ｄ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２０に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１８に示される。

「重鎖可変領域」なる用語は、長さが１１０〜１２５アミノ酸残基のポリペプチド、及びＮ末端のアミノ酸から始まる、本発明のモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸に相当するアミノ酸配列を意味する。「軽鎖可変領域」なる用語は、長さが９５〜１１５アミノ酸残基のポリペプチド、及びＮ末端のアミノ酸から始まる、本発明のモノクローナル抗体の軽鎖に相当するアミノ酸配列を意味する。

本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくとも１つ、又はその組合せを含む、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２タンパク質に特異的に結合する結合組成物にも関する。

本発明の「結合組成物」なる前記用語は、（１）有効に結合した場合に、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドに対して高度な結合親和性のあるコンフォーメーションを提示し、（２）前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、又は本発明の前記モノクローナル抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域のポリペプチド鎖を発現する、遺伝的に形質転換された宿主細胞から得ることができる、２本のポリペプチド鎖を含む組成物を意味する。

「効果的に結合する」なる用語は、２つのポリペプチド鎖が互いに結合する場合、例えば（これに限られないが）、天然抗体フラグメントＦａｂやＦｖにおける結合のような結合をしたり、遺伝的に操作された１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）により結合したりする場合に、互いに様々な相対的な位置をとりうることを意味する。２つのポリペプチド鎖は、一般に前記モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖可変領域に相当する。

本明細書で用いるＦａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖなる用語は、各々の免疫学的な意味を有する（Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）；Ｗｅｉｒ編、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８６）のＰａｒｈａｍ、第１４章）。

本発明では、前記重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、この技術分野で従来から用いられている方法により調製することができる。本明細書添付の実施例は、モノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８のＦａｂを調製する方法を開示する。

本発明の別の態様は、本発明の前記モノクローナル抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子に関する。

本発明の実施形態では、前記ヌクレオチド配列は配列番号：１２に示す、モノクローナル抗体８Ｃ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、又は配列番号：１０に示す、モノクローナル抗体８Ｃ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：９のヌクレオチド配列を有する。

本発明の実施形態では、前記ヌクレオチド配列は配列番号：８に示す、モノクローナル抗体１３Ｄ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：７のヌクレオチド配列を有し、又は配列番号：６に示す、モノクローナル抗体１３Ｄ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：５のヌクレオチド配列を有する。

本発明の実施形態では、前記ヌクレオチド配列は配列番号：１６に示す、モノクローナル抗体８Ｈ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１５のヌクレオチド配列を有し、又は配列番号：１４に示す、モノクローナル抗体８Ｈ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１３のヌクレオチド配列を有する。

本発明の実施形態では、前記ヌクレオチド配列は配列番号：２０に示す、モノクローナル抗体１６Ｄ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１９のヌクレオチド配列を有し、又は配列番号：１８に示す、モノクローナル抗体１６Ｄ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１７のヌクレオチド配列を有する。

本発明はまた、前記モノクローナル抗体の保存変異体又は活性フラグメントにも関し、ここで１つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基は、本発明のモノクローナル抗体のアミノ酸配列において、置換、付加又は欠失されており、依然としてＥ型肝炎ウイルスに特異的に結合する能力を保持している。

本発明で用いる「保存変異体」なる用語は、実質的に親の性質、例えば基本的な免疫学的性質、構造的性質、制御性又は生化学的性質を保持していることを意味する。一般に、ポリペプチドの保存変異体のアミノ酸配列は親ポリペプチドとはわずかしか異ならず、保存変異体と親ポリペプチドは全体的に非常に類似し、多くの領域で同一である。保存変異体と親ポリペプチドとの間のアミノ酸配列の相違は１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、付加及び欠失又はそのいずれかの組合せでよい。置換又は付加されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされていても、されていなくてもよい。ポリペプチドの保存変異体は、自然発生的に又は非自然発生的に産生された変異体でよい。非自然発生的に産生されたポリペプチドの保存変異体は、変異誘発技術により、又は直接合成により産生することができる。

本発明の開示内容によれば、モノクローナル抗体誘導体のＥ型肝炎ウイルスへの特異的結合性を十分に維持して、本発明の前記モノクローナル抗体のフラグメントを修飾できることは当業者に理解されよう。

本発明者はさらに、本発明の前記モノクローナル抗体との交差反応性を有するＯＲＦ２に対するその他のモノクローナル抗体を想定する。本明細書に開示する抗原決定基の詳細な情報に従って、当業者はこの技術分野で公知の方法によりハイブリドーマを調製することができ、そして本発明の前記モノクローナル抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を得ることができる。しかし、このモノクローナル抗体及び本発明の前記モノクローナル抗体の双方は、前記Ｅ型肝炎ウイルスの同一の抗原決定基を標的とする。すなわち、これらは交差反応性という免疫学的活性を有する。従って、本発明はまた、開示した抗原決定基に基づいて調製され、本発明の前記モノクローナル抗体との交差反応性を有するモノクローナル抗体をも含む。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、ＨＥＶＯＲＦ２によりコードされるポリペプチドからなる次の抗原決定基１）〜４）から選択される抗原決定基を提供する。

１）モノクローナル抗体８Ｃ１１又はそのアナログの可変領域に特異的に結合し、Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体１３Ｄ８により特異的に認識される抗原決定基に部分的に重複し、又は隣接し、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、又は
２）モノクローナル抗体１３Ｄ８又はそのアナログの可変領域に特異的に結合し、
Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体１３Ｄ８により特異的に認識される抗原決定基に部分的に重複し、又は隣接し、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、前記抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、又は
３）モノクローナル抗体８Ｈ３又はそのアナログの可変領域に特異的に結合し、Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体８Ｃ１１のＨＥＶへの結合時に十分に露出し、また空間的構造の安定性を保持し、それによりモノクローナル抗体８Ｈ３に結合する能力が著しく増強され、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、又は
４）モノクローナル抗体１６Ｄ７又はそのアナログの可変領域に特異的に結合し、直線状の抗原決定基であり、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４９９〜５１５の間に位置する抗原決定基。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、本発明のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の前記抗原決定基の少なくとも１つ若しくはそのいずれかの組合せ、又は前記抗原決定基の少なくとも１つと高度な配列相同性を有するフラグメントを含む、単離された若しくは組み換えられたポリペプチド又はポリペプチドアナログを提供する。

本発明で用いる「配列相同性」なる用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の相同性を測定することを意図したものである。通常、対合が最大になるように配列を一緒に並べる。「相同性」なる用語はこの技術分野で公知の同一の意味を有し、開示された技術により算出することができる（ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９８）；ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＣＳＡＮＤＧＥＮＯＭＥＰＲＯＪＥＣＴＳ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｙｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）；ＣＯＭＰＵＴＥＲＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＳＥＱＵＥＮＣＥＤＡＴＡ、ＰＡＲＴＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．ｇ．編、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、（１９９４）；ＳＥＱＵＥＮＣＥＡＮＡＬＹＳＩＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｙｐｒｅｓｓ（１９８７）；並びにＳＥＱＥＮＣＥＡＮＡＬＹＳＩＳＰＲＩＭＥＲ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、ＭＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１））。２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドの相同性を測定するための多くの方法を利用できるが、「相同性」なる用語はすべての関連する当業者により公知である（ＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．Ｃａｒｔｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．４８：１０７３（１９８８）参照）。２つの配列の相同性又は類似性を測定するための一般的な方法には、例えば（これに限定されないが）、ＧｕｉｄｅｔｏＨｕｇｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ、ＭａｒｔｉｎＪ．Ｂｉｓｈｏｐ編、ＡｃａｄｅｍｙＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９４）並びにＳＩＡＭＪ．ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈ．Ｃａｒｔｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．４８：１０７３（１９８８）に公開されている方法がある。これらの方法をすべて、いくつかの特定の規則に従ってコンピュータープログラムにコンパイルする。その中で、好ましい方法には、例えば（これに限定されないが）、ＧＣＧプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））がある。

例えば、参照配列に少なくとも９５％の「相同性」を有するポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドの１００ヌクレオチド毎に５ヌクレオチドを除いて、その他のヌクレオチド配列が参照配列のヌクレオチド配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照配列に少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチド配列を得るために、参照配列の全ヌクレオチドの５％が欠失又はその他の種類のヌクレオチドで置換されていてよいか、又は参照配列の全ヌクレオチドの５％を超えないいくつかのヌクレオチドが参照配列に挿入されていてよいか、又は欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せが参照配列の全ヌクレオチドの５％までその中に生じていてよい。そして、参照配列におけるこれらの変異は、参照配列の５’若しくは３’末端、若しくは２つの末端の間のいずれかの場所に位置してよいか、又は別個に散らばってよいか、又は参照配列において１つ若しくはそれ以上の隣接する基を形成してよい。

同様に、参照配列に少なくとも９５％の「相同性」を有するポリペプチド配列は、ポリペプチドの１００アミノ酸毎に５アミノ酸残基を除いて、その他のアミノ酸配列が参照配列のアミノ酸配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照配列に少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド配列を得るために、参照配列の全アミノ酸残基の５％までが欠失又はその他の種類のアミノ酸残基で置換されていてよいか、又は参照配列の全アミノ酸残基の５％を超えないいくつかのアミノ酸残基が参照配列に挿入されていてよいか、又は欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せが参照配列の全アミノ酸残基の５％までその中に生じていてよい。そして、参照配列におけるこれらの変異は、参照配列の５’若しくは３’末端、若しくは２つの末端の間のいずれかの場所に位置してよいか、又は別個に散らばってよいか、又は参照配列において１つ若しくはそれ以上の隣接する基を形成してよい。

本発明の１つの態様では、本発明は、本発明の前記抗原決定基１）及び３）のすべてを含む、単離された若しくは組み換えられたポリペプチド又はそのアナログで、ウイルス様粒子を形成することができるものを提供する。

本発明の別の実施形態では、前記単離された若しくは組み換えられたポリペプチドすべてはウイルス様粒子を形成することができ、これは１）配列番号：２２に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２０８、又は２）配列番号：２１に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２３９、又は３）配列番号：２３に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２４３、又は４）配列番号：２４に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２５１、又は５）配列番号：２５に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２６２、又は６）配列番号：２６に示すようなアミノ酸配列を有するポリペプチド２９２である。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、前記ポリペプチド若しくはそのアナログをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子を提供する。

本発明の一実施形態では、前記ヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、１）配列番号：２２に示すアミノ酸配列、又は２）配列番号：２１に示すアミノ酸配列、又は３）配列番号：２３に示すアミノ酸配列、又は４）配列番号：２４に示すアミノ酸配列、又は５）配列番号：２５に示すアミノ酸配列、又は６）配列番号：２６に示すアミノ酸配列をコードする。

ウイルス様粒子を形成できる前記ポリペプチド（すなわちＨＥＶＮＥ２ポリペプチドの重合体）は１つ又はそれ以上の保存アミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を含むことができ、依然としてウイルス様粒子を形成する性質及び免疫原性を維持できることは当業者に理解されよう。一般に、ポリペプチドが重合体を形成する能力を変化させることなく、前記ポリペプチドの極性アミノ酸残基を別の種類の極性アミノ酸残基により置換することができ、そして非極性アミノ酸残基を別の種類の非極性アミノ酸残基により置換することができる。アミノ酸の具体的な置換及び修飾は、後述の実施例にて論じる。

本発明はさらにポリペプチド又はそのアナログをスクリーニングする方法を提供する。前記ポリペプチド又はそのアナログは、本発明のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の前記抗原決定基１）又は３）と同一の、本発明の前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３に特異的に結合する性質を有している。前記方法は、１）抗原・抗体の相互作用に適した条件下で免疫反応を生じるのに十分な時間、前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３を検体と接触させる工程と、２）前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３と反応する検体の存在を検出する工程と、３）前記モノクローナル抗体と反応できるその検体を回収する工程とを含む。

本発明の一実施形態では、本発明の前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／若しくは８Ｈ３と特異的に結合できるポリペプチド又はそのアナログは、７−ペプチドファージ・ディスプレイ・ライブラリーからスクリーニングすることができる。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、上記の方法によりスクリーニングされたいくつかのポリペプチド又はそのアナログを提供する。ここで、前述の方法を用いて合成されたペプチドライブラリーからはポリペプチドを選択することができ、選択されたポリペプチドは、前記ポリペプチドに類似のアミノ酸配列を有していてよい。当業者には、ポリペプチドアナログを化合物ライブラリーから選択できることが理解されよう。そのため、選択されたポリペプチドアナログは、前記モノクローナル抗体に結合するという、ＨＥＶＯＲＦ２抗原決定基と類似の又はそれによく似た性質を有する一種の非ペプチド化合物に属しうる。

本発明のさらに別の態様では、本発明はさらに、前記ポリペプチド若しくはそのポリペプチドアナログをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含むヌクレオチド分子を提供する。ポリペプチド又はそのポリペプチドアナログが本発明に記載の方法を用いて得られるとき、ポリヌクレオチド配列又はその縮重配列をポリペプチド又はそのアナログのアミノ酸配列から推定することができることは当業者に理解されよう。

本発明のさらに別の態様では、本発明はさらに、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断及び／又は予防のための薬剤の調製における前記ポリペプチド又はそのアナログの使用を提供する。

本発明のさらに別の態様では、本発明はさらに、前記ＨＥＶ抗原決定基、本発明の結合活性を有するポリペプチド若しくはそのフラグメント又は本発明の方法によりスクリーニングされたポリペプチド及びそのアナログの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ前記抗原・抗体相互作用の検出に適した検出試薬を含む、生物学的サンプルにおけるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のための診断用キットを提供する。

特に、本発明は、前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ適当な検出方法に対応する検出試薬を含む、生物学的サンプルにおけるＥ型肝炎ウイルスに対するＩｇＧ抗体の検出のための診断キットを提供する。

本発明の一実施形態では、本発明のＮＥ２を含む診断用キットを用いて、生物学的サンプルの抗ＨＥＶＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法により検出する。

本発明はまた、本発明の前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ関連する方法に適した検出試薬を含む、ＨＥＶに対するＩｇＭ抗体を検出するための診断キットも提供する。

本発明の一実施形態では、ＨＥＶに対するＩｇＭ抗体は、本発明の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗原決定基ＮＥ２を含む診断用キットを用いて、μ−鎖捕捉ＥＬＩＳＡ法（Ｅ２−ＩｇＭ）により検出される。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、本発明による前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ関連する方法に適した検出試薬を含む、ＨＥＶに対するすべての抗体を検出するための診断キットを提供する。

本発明の一実施形態では、ＨＥＶに対するすべての抗体は、抗原決定基ＮＥ２及び本発明の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗原決定基ＮＥ２を含む診断用キットを用いて、二重抗原サンドウィッチＥＬＩＳＡ法（Ｅ２−ＩｇＭ）により検出される。

本発明の「診断有効量」なる用語は、生物学的サンプル中のＨＥＶの検出に有効な量の抗原決定基又はそのフラグメント、及び本発明のポリペプチド又はポリペプチドアナログを意味することを意図したものである。公知の免疫化学的方法により、上記の材料の量はどの免疫化学的方法を用いるかによって変化することを当業者は認識している。公開された参照文献に従えば、適量の抗原決定基又はフラグメント、及び本発明のポリペプチド又はポリペプチドアナログを選択し、生物学的サンプル中のＨＥＶを診断する方法は当業者に公知である。診断用キットはさらに、適当な吸収性担体、バッファー試薬／溶液、試験のための可視シグナルを生成するために用いられる試薬及びユーザーマニュアルを適宜含むべきであることも当業者には公知である。最適な診断有効量は用量あたり１ｎｇ〜１００００ｎｇ、好ましくは用量あたり１０ｎｇ〜１０００ｎｇ、さらに好ましくは用量あたり１００ｎｇ〜１０００ｎｇである。

当業者は、抗原・抗体の特異的相互作用に基づく前述の診断キットに適した、適当な免疫学的方法、関連試薬、及びバッファー系、一般的に用いられる免疫化学的試験方法、並びに本発明で開示されたものを設計する能力がある。

一般的な方法では、上記の診断キットに適した免疫化学的方法には、例えば（これに限定されないが）、次のものがある。

本発明の抗原決定基、好ましくはモノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３により認識される双方の抗原決定基を含有する少なくとも１つのポリペプチドを固体支持体の表面に固定する工程と、適当なバッファー中で検体を添加する工程と、検出可能な標識を担持し、前記抗原決定基、好ましくはモノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３により認識される双方の抗原決定基を含むポリペプチドを添加する工程と、担持される検出可能な標識を検出し、それにより抗ＨＥＶ抗体の存在又は量を決定する工程とを含む、生物学的サンプルにおけるＨＥＶに対するすべての抗体を検出する方法。好ましくは、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼである。

本発明の抗原決定基を含む少なくとも１つのポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体８Ｃ１１により認識される抗原決定基、及び／又はモノクローナル抗体８Ｈ３により認識される抗原決定基を含むポリペプチドを固体支持体の表面に固定する工程と、適当なバッファー中にある、検出すべきサンプルを添加する工程と、検出すべきサンプルを導き出すＩｇＧ抗体に対する、検出可能な標識を担持する２次抗体を添加する工程と、２次抗体に担持される検出可能な標識を検出し、それによりサンプル中の抗ＨＥＶＩｇＧ抗体の存在又は量を決定する工程とを含む、生物学的サンプルにおけるＨＥＶに対するＩｇＧ抗体を検出する方法。好ましくは、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼである。

本発明の抗原決定基を含む少なくとも１つのポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体８Ｃ１１により認識される抗原決定基、及び／又はモノクローナル抗体８Ｈ３により認識される抗原決定基を含むポリペプチドを固体支持体の表面に固定する工程と、適当なバッファー中にある、検出すべきサンプルを添加する工程と、検出すべきサンプルを導き出すＩｇＭ抗体に対する、検出可能な標識を担持する２次抗体を添加する工程と、２次抗体に担持される検出可能な標識を検出し、それによりサンプル中の抗ＨＥＶＩｇＭ抗体の存在又は量を決定する工程とを含む、生物学的サンプルにおけるＨＥＶに対するＩｇＭ抗体を検出する方法。好ましくは、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼである。

検出すべきサンプルを導き出すＩｇＭ抗体に対する２次抗体を固体支持体の表面に固定する工程と、適当なバッファー中にある、検出すべきサンプルを添加する工程と、検出可能な標識を担持する、本発明の抗原決定基を含む少なくとも１つのポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体８Ｃ１１により認識される抗原決定基、及び／又はモノクローナル抗体８Ｈ３により認識される抗原決定基を含むポリペプチドを添加する工程と、検出可能な標識を担持し、前記ポリペプチドを認識する２次抗体を添加する工程と、並びに担持された検出可能な標識を検出し、それによりサンプル中の抗ＨＥＶＩｇＭ抗体の存在又は量を決定する工程とを含む、生物学的サンプルにおけるＨＥＶに対するＩｇＭ抗体を検出する方法。好ましくは、検出可能な標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼである。

その中で、適当な２次抗体を選択する方法は当業者に公知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼに加えて、抗原・抗体の相互作用を検出するための検出可能な標識は放射性同位元素、フルオレセイン、ビオチン、ストレプトアビジン、β−ガラクトシダーゼ等でよい。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、本発明によるポリペプチド若しくはポリペプチドアナログの少なくとも１つ、又はそのいずれかの組合せを免疫有効量だけ含み、かつ適当なアジュバントを含む、哺乳動物におけるＥ型肝炎ウイルス感染の予防のためのワクチン組成物を提供する。本発明の一実施形態では、記載したワクチンは、モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３により認識可能な抗原決定基を含む、本発明によるポリペプチド又はポリペプチドアナログの少なくとも１つを免疫有効量だけ含む。

本発明の一実施形態では、哺乳動物におけるＥ型肝炎ウイルス感染の予防のためのワクチン組成物は、免疫有効量の本発明のポリペプチドを含み、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体に特異的に結合できる。ワクチンは、場合によっては、免疫学的に許容される溶剤及び／又はアジュバントを含むことができる。アジュバントを用いるかどうか、及び免疫学で一般に用いられるアジュバントの選択の方法は当業者に理解されよう。

利用可能な免疫学的アジュバントには、例えば（これに限定されないが）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントがある。

本発明の一実施形態では、ウイルス様粒子を構築する性質を有する前記ポリペプチド２３９を用いて、アルミニウム・アジュバントを含むか又は何らアジュバントを含まないワクチンを調製する。そしてこのワクチンを用いる免疫は、マウスをＨＥＶによる感染から効果的に防御することができる。本発明の「免疫有効量」なる用語は、ワクチン接種された個体において有効な保護免疫応答を誘導するのに十分なワクチンの量を意味する。ワクチンの免疫有効量はワクチン接種様式、投与型及びワクチン接種された個体によって変化しうる。この技術分野の一般的な知識を用いて、当業者には、過度に試験することなく、ワクチンの適量を決定する方法がわかっている。免疫有効量は、好ましくは用量あたり０．０００１ｍｇ〜０．１ｍｇ、より好ましくは用量あたり０．００１ｍｇ〜０．０６ｍｇ、さらに好ましくは用量あたり０．１ｍｇ〜０．０４ｍｇである。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断、予防及び／又は治療のための薬剤の調製における本発明のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の使用を提供する。

モノクローナル抗体８Ｃ１１、１３Ｄ８又は８Ｈ３はＨＥＶの表面に位置する抗原決定基を認識するので、これらのモノクローナル抗体を用いてＨＥＶ粒子を検出することができる。本発明の一実施形態では、本発明は、固体支持体の表面に少なくとも１つの上記のモノクローナル抗体を固定する工程と、それを、ＨＥＶを含有している可能性のある検出すべきサンプルと接触させる工程と、検出可能な標識を担持するＨＥＶに対する抗体を添加する工程と、支持体の表面に固定されたモノクローナル抗体／ＨＥＶの複合体を検出する工程とを含む、ＨＥＶ粒子を検出する方法を提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、固体支持体の表面に抗ＨＥＶ抗体を固定する工程と、それを、ＨＥＶを含有している可能性のある検出すべきサンプルと接触させる工程と、検出可能な標識を担持する前記モノクローナル抗体を添加する工程と、支持体の表面に固定された抗体／ＨＥＶの複合体を検出する工程とを含む、ＨＥＶ粒子を検出する方法を提供する。本発明の別の実施形態では、本発明は、前記モノクローナル抗体を、抗ＨＥＶポリクローナル抗体を担持する検出可能な標識（金コロイド粒子、エマルジョン粒子等）、又は検出可能な標識を担持する前記モノクローナル抗体と混合する工程と、それを、ＨＥＶを含有して可能性のある検出すべきサンプルと接触させる工程と、免疫クロマトグラフィーの間に、免疫クロマトグラフィー樹脂に固定された抗マウス抗体への抗体／ＨＥＶ複合体の結合によるシグナルを検出する工程とを含む、ＨＥＶ粒子を検出する方法を提供する。

同様に、モノクローナル抗体８Ｃ１１、１３Ｄ８又は８Ｈ３はＨＥＶの表面に位置する抗原決定基を認識するので、その抗原結合領域（抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域）に基づいて開発した、これらのモノクローナル抗体及び種々の抗体誘導体を、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は受動免疫治療に適用することができる。

特に本発明の１つの態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体、その活性フラグメント及び保存変異体の少なくとも１つ、又はそのいずれかの組合せを診断有効量だけ含み、かつ抗原・抗体の相互作用に適した検出試薬を含む、ＨＥＶの感染を診断するための、すなわちＨＥＶ抗原を検出するための診断用キットを提供する。

本発明の一実施形態では、ＨＥＶ抗原の検出に二重抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡが用いられ、ここでは本発明のモノクローナル抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体８Ｃ１１を含む診断用キットが用いられる。

本発明の「診断有効量」なる用語は、生物学的サンプル中のＨＥＶの存在を効果的に検出するのに十分な、本発明のモノクローナル抗体の量を意味する。公知の免疫化学的方法により、上記の材料の量はどの特異的免疫化学的方法を用いるかによって変化することを当業者は認識している。公開された参照文献に従えば、生物学的サンプル中のＨＥＶを診断するのに適した量の本発明のモノクローナル抗体を選択する方法は当業者に公知である。そして、診断用キットは、適当な担体、バッファー試薬／溶液、生成されたいずれかのシグナルを検出するために用いられる試薬及びユーザーマニュアルを適宜含むことができることも当業者には公知である。診断有効量は、好ましくは用量あたり１ｎｇ〜１００００ｎｇ、より好ましくは用量あたり１０ｎｇ〜１０００ｎｇ、そしてさらに好ましくは用量あたり１００ｎｇ〜１０００ｎｇである。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、
ａ）ＨＥＶに特異的に結合できる１次抗体及び２次抗体であって、その少なくとも１つが本発明のモノクローナル抗体又はその利用可能なフラグメントである１次抗体及び２次抗体を提供する工程と、
ｂ）生成されたシグナルの強度が２次抗体の量にのみ関連する、２次抗体に結合できるシグナルプロデューサー、又は好ましくは、２次抗体に直接タグ化されたシグナルプロデューサーを提供する工程と、
ｃ）１次抗体を支持体と連結させ、１次抗体／支持体の結合複合体を形成する工程と、
ｄ）結合複合体を、検出すべき生物学的サンプルと接触させて、おそらくサンプル中に存在するであろうＨＥＶを抗体／支持体結合複合体に結合させる工程と、
ｅ）シグナルプロデューサーに効果的に結合する２次抗体を、ＨＥＶ／１次抗体／支持体複合体と接触させ、それによりシグナルプロデューサー／２次抗体／ＨＥＶ／１次抗体／支持体の複合体を形成する工程と、
ｆ）シグナルプロデューサーから生成されたシグナルを検出する工程とを含む、生物学的サンプル中のＨＥＶ抗原及び／又は抗ＨＥＶ抗体の存在を検出する方法を提供する。

上記の検出方法では、１次抗体又は２次抗体は、本発明の複数のモノクローナル抗体又はその結合活性フラグメントの１つ、又はいずれかの組合せでよい。

本発明のさらに別の態様では、本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の少なくとも１つを治療有効量だけ含み、かつ薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、ＨＥＶ感染の治療のための薬学的組成物を提供する。

本発明の別の態様では、本発明はさらに、上記の本発明のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の少なくとも１つを予防有効量又は治療有効量だけ対象に投与することを含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための方法を提供する。

「予防有効量」なる用語は上記の「免疫学的有効量」に置き換えることができ、ワクチン接種された個体の免疫防御を引き出すのに十分な量を意味する。「予防有効量」はワクチン接種の方法、機会、ワクチン接種された個体、及び用いたモノクローナル抗体又はその活性フラグメントによって変化しうることはよく知られている。この技術分野において公開されている参照文献、及び対応する臨床基準に従って、「予防有効量」を限られた試験で決定することができる。予防／免疫学的有効量は、好ましくは用量あたり０．０００１ｍｇ〜０．１ｍｇ、より好ましくは用量あたり０．００１ｍｇ〜０．０６ｍｇ、最も好ましくは用量あたり０．０１ｍｇ〜０．０４ｍｇである。

同様に、「治療有効量」なる用語は、対象の有効な保護を引き出し、ＨＥＶを中和するのに十分な量を意味する。そして、モノクローナル抗体の治療有効量は治療スキーム、疾病の経過、個体の状態、及び用いたモノクローナル抗体又は活性フラグメントによって変化しうることはよく知られている。この技術分野において公開されている参照文献、及び対応する臨床基準に従って、臨床医は彼らの自らの経験に基づいてモノクローナル抗体の「治療有効量」を決定することができる。治療有効量は、好ましくは体重あたり０．００１ｍｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは体重あたり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、最も好ましくは体重あたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。

遺伝子操作法により、すべてのモノクローナル抗体及びその活性フラグメント、抗原決定基及びその活性フラグメント、本発明の前記方法により選択されたポリペプチド及びそのアナログを適切な宿主細胞において発現させることができる。従って、本発明はまた、上記のモノクローナル抗体又は活性フラグメント、抗原決定基又はその活性フラグメント、本発明の前記方法により選択されたポリペプチド又はそのアナログをコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターにも関する。そして本発明は、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。多くの発現宿主細胞、例えば原核細胞（例えば（これに限定されないが）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、真核細胞（例えば（これに限定されないが）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、及び哺乳動物細胞、植物細胞等）を本発明において用いることができる。本発明における上記のすべての関係のある生成物の発現は、それらを前記モノクローナル抗体、その保存変異体若しくは活性フラグメント、又は前記抗原決定基若しくはその活性フラグメント、並びに本発明の方法により選択されたポリペプチド又はそのアナログを発現するために用いることができる限り、いずれかの特定の発現ベクター又は宿主細胞だけに限定されるものではない。

この技術分野で公知の技術により、本発明のハイブリドーマ細胞を生成することができる。具体的には、これは不死化細胞株を、所望の抗体を産生することができるＢリンパ球と融合することを含む。特別な抗原で免疫した哺乳動物からリンパ球を収集する方法は公知である。一般に、ヒトに関しては、末梢血リンパ球を用いることができ、その他の哺乳動物に関しては、脾細胞又はリンパ球を用いることができる。精製された抗原を繰り返し注射された宿主哺乳動物は、所望の抗体産生細胞を生成する。これらの細胞を収集し、そして次に不死化細胞と融合させる。細胞融合の方法もまたこの技術分野で公知である。一般に、この方法は、細胞を融合試薬、例えばＰＥＧと混合する工程と、標準的な方法、例えばＨＡＴ選択によりハイブリドーマ細胞を選択する工程と、標準的なイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡによりハイブリドーマの培養培地を分析して、所望のモノクローナル抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞を選択する工程と、タンパク質精製のための標準的な方法により、培養培地からモノクローナル抗体を精製する工程とを含む。上記のいずれかの方法に関して多くの参照文献（例えばＫｏｈｌｅｒ等、ＨｙｂｒｉｄｒｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８０）、Ｔｉｊｓｓｅｎ、ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）等）がある。

抗体フラグメント、例えばＦａｂ（Ｔｉｊｓｓｅｎ、ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５））及びＦｖ（Ｈｏｃｈｍａｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２：１１３０−１１３５（１９７３）、Ｓｈａｒｏｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５：１５９１−１５９４（１９７６）、Ｅｈｒｌｉｃｈ等、米国特許第４４７０９２５号明細書）の適用及び生成もまたこの技術分野で公知である。さらに、公知の方法、例えばハイブリドーマ細胞のさらなる融合（これはクアドローマに至る）（Ｒｅａｄｉｎｇ、米国特許第４４７４４９３号明細書）又は半分子の化学的組換え（Ｂｒｅｎｎａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１−８３（１９８５））により、本発明の化合物及び組成物を用いて二重特異性抗体を構築することができる。

本発明のハイブリドーマ細胞により特異的に分泌される抗体及びフラグメントを組換えの方法により生成することもできる。本発明のモノクローナル抗体のコード化配列、特に重鎖及び軽鎖の可変領域のコード化配列をこの技術分野で公知の方法により容易に入手することができる。当業者は、モノクローナル抗体の特異的結合に重要なアミノ酸領域、例えば抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖の可変領域の抗原決定基相補性領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、抗体の特異的結合領域を構成する、対応するそのアミノ酸配列を容易に決定することができる。これらのアミノ酸配列に基づいて、モノクローナル抗体に対して同一の又は類似の特異的結合活性を有するポリペプチドを組換え法により調製することができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列の組換えにより１本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）を形成することができる。また、ヒト抗体の対応する部分を重鎖及び軽鎖可変領域又はＣＤＲと置換することにより、元のモノクローナル抗体の特異的結合活性を保持した、ヒト抗体により近いヒト化抗体が提供される。

本発明の一実施形態では、免疫保護抗原である、ＨＥＶＯＲＦ２に由来する組換えタンパク質ＮＥ２を用いてマウスを免疫し、４つのハイブリドーマ細胞株を得てモノクローナル抗体を調製した。４つのハイブリドーマ細胞株は、モノクローナル抗体を安定的に分泌し、各々１３Ｄ８、１６Ｄ７、８Ｃ１１及び８Ｈ３と名づけられた。これらのハイブリドーマ細胞が分泌する抗体はすべて、サブタイプ試験により、ＩｇＧ１サブタイプに属するものと確定した。ブダペスト条約に従って、発明者はこれらの４つのハイブリドーマ細胞株をすべてＣＣＴＣＣ（ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｗｕｈａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ、中国）に寄託していて、寄託番号は各々ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１５、ＣＣＴＣＣ−２００１１６、ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７である。

本発明で調製したモノクローナル抗体又はその活性フラグメントによれば、当業者はそれと同一のものをコードするヌクレオチド配列、及びコドン縮重によるその変異体を得ることができる。本発明の開示した内容に従って、当業者は上記のヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクター、及び多くの方法により発現ベクターで形質転換された宿主細胞を得ることができる。本発明の前記モノクローナル抗体又はその活性フラグメントを発現するために使用できる限り、宿主細胞の選択及び形質転換技術はこの技術分野では公知であった。

煮沸した及び煮沸していないＮＥ２タンパク質のウェスタン・ブロッティングにより、モノクローナル抗体、８Ｃ１１、８Ｈ３、及び１３Ｄ８はすべて、立体状の抗原決定基を認識するが、１６Ｄ７は直線状の抗原決定基を認識することが示された。遮断試験及び結合抑制試験により、モノクローナル抗体８Ｃ１１及び１３Ｄ８が同一の抗原決定基を認識し、８Ｈ３及び１６Ｄ７が各々それ以外の互いに異なる抗原決定基を認識することが示された。抗体捕捉ＰＣＲ試験により、モノクローナル抗体８Ｃ１１、１３Ｄ８及び８Ｈ３が天然のＥ型肝炎ウイルスに結合できることが示され、また認識された抗原決定基がＨＥＶの表面にあることが実証された。これらのモノクローナル抗体の中和保護試験により、８Ｃ１１及び１３Ｄ８が中和活性を有すること、及びこれらが認識する抗原決定基が中和活性を有する抗原決定基であり、この抗原決定基を含有するポリペプチドワクチンが中和活性を有する抗体を誘導することができることが示された。さらに、モノクローナル抗体８Ｈ３により認識される抗原決定基もまたＨＥＶ表面にあったため、その抗体もまた中和活性を有し、又は個体の抗ＨＥＶ免疫において役割を果たすであろう。

本発明はまた、少なくとも１つの本発明の前記モノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８又は１６Ｄ７に特異的結合する性質を有したＨＥＶＯＲＦ２のポリペプチドにより形成される抗原決定基をも開示する。これらの決定基は天然ＨＥＶの表面の空間的構造に依存する。

従って、本発明は、前記モノクローナル抗体又はその結合活性フラグメントの少なくとも１つを治療有効量だけ含み、かつ薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための薬学的組成物を提供する。治療すべき対象の特定の症状に応じて、当業者には適切な用量及び投与経路を選択する方法がわかっている。本発明では、治療有効量は、好ましくはキログラムあたり０．００１ｍｇ〜２０ｍｇ、特に好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。

ウェスタン・ブロッティング試験により、モノクローナル抗体１６Ｄ７が種々の存在条件の下でＨＥＶＯＲＦ２の組換えタンパク質ＮＥ２と敏感に反応でき、ウェスタン・ブロッティングにおける微量のＨＥＶタンパク質を検出できることが示された。従って、モノクローナル抗体１６Ｄ７は、ＨＥＶ組換えタンパク質の調製中の純度及び現状を知るために用いることができる。このことは、高純度の組換えタンパク質（例えばＨＥＶ組換えワクチン）を調製するのに特に好都合である。

本発明を、以下の図面及び実施例を用いてさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図したものである。ベクター、宿主細胞、試薬濃度、温度及びその他の変数は説明するためのものにすぎず、決して本発明の保護範囲を限定するものと理解されるべきではない。

（実施例）１．本発明のモノクローナル抗体の調製
実施例１：抗原として使用するためのＨＥＶＯＲＦ２ポリペプチドの調製
鋳型として使用するためのＨＥＶＯＲＦ２フラグメントの調製

鋳型としてＨＥＶ感染した患者（ＸｉｎＪｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｅ、中国から）からクローン化した全長ＨＥＶ遺伝子（Ａｙｅ，Ｔ．Ｔ．、Ｕｃｈｉｄａ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０（１３）３５１２（１９９２）；ジェンバンク受け入れ番号Ｄ１１０９２）、２つのプライマー、順行プライマーとしてＯＲＦ２ＦＰ：５’−ａｔｇｃｇｃｃｃｔｃｇｇｃｃａ−３’、及び逆行プライマーとしてＯＲＦ２ＲＰ：５’−ａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’を使用して、ＰＣＲサーマルサイクラー（ＢＩＯＭＥＴＲＡＴ３）中、以下の条件：９４℃で５分、次いで９４℃で５０秒、５７℃で５０秒及び７２℃で２．５分の２５サイクル、終わりに７２℃で１０分、の下でポリメラーゼ連鎖反応物（ＰＣＲ）を実施し、そして約２ｋｂのＨＥＶＯＲＦ２の特異的なＤＮＡフラグメントが得られ、そして本発明のポリペプチドの調製のための鋳型として使用する。上記のＰＣＲ産物をさらに市販により入手可能なベクターｐＭＤ１８−Ｔ（ＴＡＫＡＲＡＣｏ．）に連結し、そして次にＯＲＦ２遺伝子と共に挿入された陽性クローンをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化により同定する。本発明のポリペプチドを調製するための鋳型として用いるために上記の方法により得られたＨＥＶＯＲＦ２の２つのＤＮＡフラグメントを、ＳｈａｎｇｈａｉＢｏＹａＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏ．のＭ１３（＋）／（−）プライマーを用いてシークエンシングした。一方は保存配列（鋳型１、配列番号：２）であり、他方は変異配列（鋳型２、配列番号：３）である。

配列アラインメント及びオープン・リーディグ・フレーム（ＯＲＦ）に関する分析により、本発明のポリペプチドを調製するための鋳型として用いるためにＨＥＶＯＲＦ２の前記変異配列（配列番号：３）は、保存配列（配列番号：２）と比較した場合、塩基Ａを欠き、そしてこれはシフト変異に至り、そのためにＯＲＦ２のアミノ酸残基６０４−６０５がＨｉｓ−Ｓｅｒ−ＶａｌからＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇに変異し、そしてそれによりポリペプチドの翻訳が変異により形成された停止コードにより停止する。

本発明のポリペプチドＮＥ２をコードするポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む発現ベクターの調製

鋳型として上記で得られた配列番号：３の配列、その５’末端にＢａｍＨＩ部位、ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系の出発コドンとしてＡＴＧを導入した順行プライマー、ＨＥＦＰ：５’−ｇｇａｔｃｃａｔａｔｇｃａｇｃｔｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｃｇｔｃ−３’、並びにその５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入した逆行プライマー、ＨＥＲＰ：５’−ｃｔｃｇａｇａａａｔａａａｃｔａｔａａｃｔｃｃｃｇａ−３’を用いてＰＣＲにより、本発明のポリペプチドＮＥ２をコードするヌクレオチド配列である８１０ｂｐほどのＤＮＡフラグメントが得られ、対応するアミノ酸配列を配列番号：４として列挙する。ＰＣＲは以下のようにサーモサイクラー（ＢｉｏｍｅｔｒａＴ３）で実施する。９４℃で５分間の熱変性、次いで９４℃で５０秒、５７℃で４０秒、及び７２℃で４０秒を３０サイクル、最後に７２℃で１０分。

本発明のポリペプチドを発現するための発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７をこの技術分野で公知の方法に従って構築し（ＬＵＯＷｅｎ−Ｘｉｎ等、ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：５３−５７（２０００））、その方法は以下の特定の工程：上記のＰＣＲ産物を市販により入手可能なｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴＡＫＡＲＡｃｏｍｐａｎｙ）にクローニングする工程と、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで同定することによりポリペプチドＮＥ２をコードするポリペプチドと共に挿入された陽性サブクローンを得る工程と、さらに陽性サブクローンをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、ポリペプチドＮＥ２をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を得て、これを次にＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴＯ−Ｔ７とライゲートする工程と、を含む。ポリペプチドＮＥ２をコードするポリヌクレオチド配列を含有する陽性クローンｐＴＯ−Ｔ７−ＮＥ２をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化することにより確認する。

ポリペプチドＮＥ２の発現

プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＮＥ２（０．１５ｍｇ／ｍｌ）１μｌを用いて、塩化カルシウム法により調製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）のコンピテント細胞４０μｌを形質転換した。次いで混合物をカナマイシン（最終濃度２５μｇ／ｍｌにし、以下に関しても同様）含有固体ＬＢ培地に蒔き、そしてプレートを３７℃で１０から１２時間、個々のクローンが可視化するまでインキュベートした。個々のクローンを取り、そしてさらにチューブ内のＬＢ培養培地４ｍｌに播種し３７℃で１０時間、培養物のＯＤ５５０ｎｍ値が約１．５になるまで２２０ｒｐｍ下に置いた。次いで後で使用するために、培養培地１ｍｌを４時間保存し、そして０．５ＭＩＰＴＧ２μｌを培養物の残りの３ｍｌに加えた（最終濃度０．３ｍＭにする）。目的のポリペプチドの発現を誘導するために、ＩＰＴＧを含有する培養培地を２２０ｒｐｍ下で、３７℃で４時間インキュベートした。誘導した培養培地１．５ｍｌを１２０００ｇで３０秒間遠心した。ペレットを１×ゲル負荷バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ６．８、１００ｍＭＤＴＴ、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノール・ブルー、１０％のグリセロール）１００μｌに再懸濁し、そしてさらに１０分間煮沸し、次いで１２０００ｇで１０分間遠心した。ポリペプチドＮＥ２の発現を分析するために上清１０μｌを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。大量発現させるために発現収量が最も高い形質転換株を選択し、将来播種するために保存した。

１ｌのエルレンマイヤーフラスコ中、新鮮ＬＢ培地５００ｍｌに、保存した細菌培養物２００μｌを加え、そして次に１９０ｒｐｍで３７℃で約１１時間、ＯＤ５５０ｎｍ値が２．０になるまで振盪した。０．５ＭＩＰＴＧ３００μｌを最終濃度０．３ｍＭになるまで加えた。混合物をさらに１９０ｒｐｍで３７℃で４時間振盪した。最後に、遠心した後、細菌ペレットを培養培地から収集した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）封入体において発現されたポリペプチドＮＥ２の精製

組換えポリペプチドＮＥ２を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を４０００ｒｐｍで１５分間遠心し、そして５００ｍｌ培養物からの各ペレットを溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ及び３００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）１５ｍｌに再懸濁した。培養物２００ｍｌの細胞上清を２５０ｍｌフラスコ中氷浴中で、液体の中央に配置された大型の超音波ヘッドを用いて７０％出力で、４０秒間オンにし、そして１分間オフにするソニケーションで全体で２０分間、明らかな粘性がなく、そして１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分で得られた細胞ペレットにおける炭化により生成される散在する黒色物質が存在する程度までソニケート（Ｕｉｌｂｒａ−ＣｅｌｌＶＣＸ５００、ＳＯＮＩＣＳ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ）した。ペレットをバッファーＩ溶液（２００ｍＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ８．５；５ｍＭＥＤＴＡ；１００ｍＭＮａＣｌ）に、懸濁液の１／２の容量で再懸濁し、そして次に等量の４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有バッファーＩ溶液を補充し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の最終濃度を２％にする。混合物を２００ｒｐｍで、３７℃で３０分間振盪し、次いで１００００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。ペレットを等量のバッファーＩに再懸濁し、そして混合物を上記の条件下（４０秒間オンにし、そして１分間オフにする。全体で３分間）でソニケートし、次いで４℃で１０分間遠心（１００００ｒｐｍ）した。ペレットを１／２の容量のバッファーＩに再懸濁し、そして次にさらに等量の４％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有バッファーＩ溶液を加えた。混合物を３７℃で３０分間振盪（２００ｒｐｍ）した後、４℃で１０分間遠心（１００００ｒｐｍ）した。ペレットを等量のバッファーＩに再懸濁し、３７℃で３０分間振盪（２００ｒｐｍ）した。次に混合物を１００００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。ペレットを２Ｍ尿素を含有する等量のバッファーＩに再懸濁した。２００ｒｐｍで、３７℃で３０分間振盪した後、混合物を１００００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。この上清をＮＥ２２Ｍと印を付けた。ペレットを４Ｍ尿素を含有する等量のバッファーＩに再懸濁した。３７℃で１時間振盪（２００ｒｐｍ）した後、混合物を４℃で一晩放置し、そして次に１２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。この上清をＮＥ２４Ｍと印を付け、そしてペレットを捨てた。

組換えポリペプチドＮＥ２の再生

サンプルＮＥ２４Ｍ１００ｍｌを２個の透析バッグ（３６ＤＭ、保持分子量：８０００から１００００Ｄａ、ＵｎｉｔｅｄＣａｒｂｏｎＣｏｍｐｏｕｎｄ、米国）に負荷し、そして１ｌビーカー中１×ＰＢＳ（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ７３．３４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、ＮａＣｌ１６３．６３２ｇ、ＫＣｌ４．０２４ｇ（ｐＨ７．４５）含有２０×ＰＢＳ（１Ｌ））９００ｍｌと共に２５℃で一晩（１０時間）攪拌しながら透析し、そして次に白色の沈殿物が透析バッグ中に現れた。透析液を交換し、そして透析を続け、そして次に３時間毎に４回透析液を交換した。原則的に、サンプル中の尿素濃度は、透析が終了した時点で４×１０−６Ｍになる。透析したサンプルを１２０００ｒｐｍで２５℃で１０分間遠心し、さらに精製するために上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。

ゲル濾過ＨＰＬＣを用いる組換えポリペプチドＮＥ２の精製

再生したＮＥ２サンプルをＨＰＬＣにより以下のようにさらに精製した。
装置：ＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄＮｏｕｖｅａｕ１２５ＮＭＰ／１６６ＮＭＰＨＰＬＣ、カラム：ＴＳＫＧＥＬＳＷ３０００２１．５ｍｍ×６０ｃｍ
溶出：１×ＰＢＳｐＨ７．４５
流速：４ｍｌ／分
検出波長：２８０ｎｍのＵＶ
サンプル：４ＭＮＥ２（８ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ
収集：ウィンドウモードの自動ピーク収集
収集時間：１チューブ／２０秒
収集遅延：６秒

その結果により、沸騰水中で１０分間処理した後、１２％のアクリルアミドを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した目的のタンパク質の単独のピークの純度が９０％までになることが示される。

ｐＴＯ−Ｔ７−Ｅ２プラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、誘導された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で２９ｋＤａの位置にバンドを生じ、これは宿主細胞の全タンパク質の約４０％であり（図１、レーン２）、そして主に封入体として存在した。今度は、尿素２モル／ｌ、４モル／ｌ及び８モル／ｌで治療した場合は、ＮＥ２封入体は異なった形態として存在し、尿素２モル／ｌの上清ではタンパク質は主に４０ｋＤ（図１、レーン３）であり、尿素４モル／ｌの上清では豊富な２９ｋＤタンパク質が現れるが、４０ｋＤ可視バンドは依然認められる（図１、レーン４）、尿素８モル／ｌの上清のタンパク質は主に２９ｋＤバンドであるが、４０ｋＤバンドはほとんど見えない（図１、レーン５）、ＰＢＳにより透析を行った尿素４モル／ｌのタンパク質は主に５：１の比率の４０ｋＤ及び２９ｋＤであり（図１、レーン６）、再生タンパク質をゲル濾過ＨＰＬＣによりさらに精製し（図１、レーン７）、そして１０分間煮沸した後、２９ｋＤのバンドは有意に増加し、一方４０ｋＤのバンドは消失し、そしてその他の夾雑バンドが認められない（図１、レーン８）。

ＮＥ２ポリペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析

作業中のマトリックス溶液をアセトニトリル−０．１％のＴＦＡ（１：２、容量／容量）中のα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＨＣＣＡ）で飽和させ、そして次にＨＰＬＣで精製した、等量のＮＥ２サンプルと混合し、そして純水で脱塩した。次いで、ＭＳ分析のために混合物を質量分析器（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ社、ＲＥＦＬＥＸＩＩＩ型）に負荷した。ＮＥ２タンパク質は９個の明らかなピークを示し、最も強いピークの質量／電荷は２２８９９．１８ｍ／ｚであり、これは１電荷数のＮＥ２単量体（２３０９７．０２Ｄａ）の理論的分子量に匹敵した。その他の８個のピークは複数の２３０９７．０２Ｄａ（図２）であり、これはＮＥ２の異なる多量体であろう。実験条件では、タンパク質分子は通常１から２の電荷数を有し、そして従って、９個のピークが単量体から１２量体のＮＥ２タンパク質であると推定される（表１）。

実施例２：モノクローナル抗体８Ｃ１１、１３Ｄ８、８Ｈ３及び１６Ｄ７を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製

マウスの免疫及びその脾細胞と骨髄腫細胞との融合

１次免疫用に各Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス（６から８週齢）に、フロイント完全アジュバントで乳化した組換え抗原ＮＥ２５μｇ（全量５０μｌ）を接種した。１５日後、同量の、フロイント不完全アジュバントで乳化したＮＥ２でマウスを筋肉内で２回目の免疫を行なった。３０日後に、次いでアジュバント不含の抗原５μｇでマウスに静脈内（尾静脈を介する）にブースター投与した。ブースター免疫の７２時間後にマウスを剖検した。次いで血液を収集し、そして脾臓を切除して脾細胞の懸濁液を調製した（ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁）。脾細胞をセルカウンターで計数した。次いで脾細胞をＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞と６：１の比率で混合し、そして遠心した。混合した細胞をＰＥＧ（ＰＥＧ１５００）により融合させ、そして次に等量のフィーダー細胞と混合し、そして９６ウェルプレートに移した（２００μｌ／ウェル）。５％のＣＯ２雰囲気下、プレートをインキュベーター（ＥＳＰＥＣＢＮＡ−３１）中３７℃でインキュベートした。３日後、培養物の半分をＨＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯＩｎｔ．）中ヒポキサンチン１．３６１ｍｇ及びチミジン０．３８８ｍｇ）で、最終容量を１００ｍｌにし、約４５から５０℃で溶解し、そして滅菌濾過した）で置換した。７日後、ＮＥ２でコーディングした９６ウェルプレートで以下に記載するハイブリドーマ細胞培養物の上清に関してＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡアッセイで陽性の細胞を限界希釈法によりクローン化した。

ＥＬＩＳＡアッセイ

ＨＰＬＣ精製したＮＥ２を０．０５モル／ｌカルボン酸コーティングバッファー（ｄｄＨ２Ｏ中Ｎａ２ＣＯ３２０．０２ｇ及びＮａＨＣＯ３２．５２ｇ、最終１ｌ、ｐＨ９．５）に溶解し、最終濃度０．３μｇ／ｍｌにする。９６ウェルポリビニルマイクロタイタープレートを得られた溶液で３７℃で２時間、そして次に４℃で一晩処理した。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ（ｄｄＨ２Ｏ中ＮａＣｌ８．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ２．９ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ及びＴｗｅｅｎ−２００．５ｍｌ、最終１ｌ、ｐＨ７．４）で洗浄して非結合性抗原を除去した。次いで遮断溶液（１×ＰＢＳ中２％のグルチン、０．２％のカゼイン及び２％のスクロース）をウェルあたり２００μｌ加えて３７℃で２時間遮断した。次いで溶液を捨て、ウェルを乾燥し、そして真空下プレートを密閉し、４℃で保存した。

アッセイ用に細胞培養液の上清１００μｌを各ウェルに加え、そして各プレートに関して陽性対照を１つ（１：１００希釈したマウス多重抗ＮＥ２血清１００μｌを加える）及び陰性対照を１つ（ＨＴ培地１００μｌを加える）設定する。３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、そして次に捨てた。ＨＲＰ−ＧＡＭＩｇ（ＤＡＫＯ社）を加え、そしてさらに３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０でさらに５回洗浄し、そして捨てた。基質溶液Ａ（ｄｄＨ２Ｏ中Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ１３．４２ｇ、クエン酸・Ｈ２Ｏ４．２ｇ及びＨ２Ｏ２０．３ｇ、最終７００ｍｌ）５０μｌ及び顕色溶液Ｂ（ｄｄＨ２Ｏ中ＴＭＤ０．２ｇ及びジメチルホルムアミド２０ｍｌ、最終７００ｍｌ）をプレートに加え、そして３７℃で１０分間顕色させた。停止溶液５０μｌで反応を終止させる。各ウェルのＯＤ４５０値をＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。一般に、陰性対照よりも少なくとも２倍高いＯＤ４５０値を陽性と考えることができる。

腹水含有モノクローナル抗体の調製及び精製

各１０週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスに不完全フロイントアジュバント０．５ｍｌを腹腔内に接種した。２から７日後、ハイブリドーマ細胞を収集し、そして遠心した。次いで上清を捨て、そして血清不含培地を細胞に加えて最終濃度２×１０５−２×１０６セル／ｍｌにし、そして０．５ｍｌを用いて各マウスに接種した。７から１０日後、マウスの腹部が膨張したとき、腹水を収集し、そして次に３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。チューブの中央部分の透明な液体をピペットで採取し、そして０．４５μｍマイクロポア膜で濾過して滅菌濾過した。濾液を−２０℃で保存した。

処理した腹水を等量のＰＢＳ０．０２ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．４）（生理食塩水中０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４８１ｍｌ及び０．２モル／ｌＮａＨ２ＰＯ４１９ｍｌ、最終１００ｍｌ）で希釈する。次いで穏やかに攪拌しながら５０％飽和になるまで（ＮＨ４）２ＳＯ４を滴加し、そして腹水を４℃で一晩放置した。溶液を４℃で１５分間遠心（１２０００ｒｐｍ）し、そして上清を捨てた。ペレットを２容量のＰＢＳに溶解した。再度攪拌しながら３３％飽和になるまで（ＮＨ４）２ＳＯ４を溶液に滴加し、そして溶液を一晩４℃を維持した。溶液を４℃で１５分間遠心（１２０００ｒｐｍ）し、そして上清を捨てた。ペレットをＰＢＳ（用いた腹水の２倍容量）に溶解した。穏やかに攪拌しながら５０％飽和になるまで（ＮＨ４）２ＳＯ４を滴加し、そして一晩４℃を維持した。溶液を４℃で１５分間遠心（１２０００ｒｐｍ）し、そして上清を捨てた。次いでペレットを透析バッグ中適量のＰＢＳに溶解し、そして攪拌しながら４℃で約１２時間、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１２０ミリモル／ｌ（ＮａＣｌ２０ミリモル／ｌ、ｐＨ７．８）５０から１００容量で透析した。バッファーを３回以上交換する。目的の産物を等分割包装して−２０℃で保存した。

上記の方法に従って、抗ＨＥＶ−ＯＲＦ２モノクローナル抗体を分泌する８個のハイブリドーマ細胞株を同定した（１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８、１５Ｂ２及び１６Ｄ７）。

ハイブリドーマ細胞株の培養上清の力価測定

細胞培養上清又は誘導された腹水を希釈し、次いでその力価を間接的ＥＬＩＳＡにより測定する。結果を表２に列挙する。

２．本発明のモノクローナル抗体の同定及び特徴付け

実施例３：モノクローナル抗体のタイプ及びサブタイプの同定

ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを実施例２に従って精製されたＮＥ２でコーティングする。各々のモノクローナル抗体の分泌細胞培養物の上清１００μｌをプレートに加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。次いでＴＥＣＡＮマイクロタイタープレート洗浄機を用いてＰＢＳＴで、２０秒間隔で５回プレートを洗浄し、次いで捨てた。酵素で標識したＨＲＰ−ＧＡＭＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）の２次抗体の適当な希釈物を加え、そしてさらに３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で再度５回洗浄し、そして捨てた。顕色用基質溶液Ａ（Ｈ２Ｏ２）及びＢ（ＴＭＤ）各々の１滴をプレートに加え、そして３７℃で１０分間発色させた。停止溶液（Ｈ２ＳＯ４）１滴で反応を終止させる。各ウェルのＯＤ４５０値をＥＬＩＳＡリーダーで読む。一般に、閾値は陰性平均の２倍であり、そして閾値以上のＯＤ４５０値を陽性とする。その結果により、全モノクローナル抗体の軽鎖はκであり、モノクローナル抗体１Ｆ６はＩｇＧ２ｂであり、２Ｃ９はＩｇＧ２ａであり、その他の８Ｃ１１、８Ｈ３、１２Ｇ８、１３Ｄ８、１５Ｂ２及び１６Ｄ７はすべてＩｇＧ１であることが示された（表３）。

実施例４：モノクローナル抗体によるＨＥＶ組換えタンパク質のウェスタン・ブロッティング

ＨＰＬＣゲル濾過により精製した組換えタンパク質ＮＥ２を１０分間煮沸し、煮沸していないＮＥ２と一緒に１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。５％の脱脂粉乳で室温で１．５時間遮断した後、膜を０．５ｃｍ幅のスロットに切断した。モノクローナル抗体を各々に加え、室温で１時間反応させ、次いでＴＮＴを用いて５分間隔で３回洗浄した。酵素標識した２次抗体としてＡＰ標識したヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）ＩｇＧを加え（Ｐｒｏｔｏｓ社、５％の脱脂粉乳と１：１０００で希釈）、そして室温で１時間反応させる。ＴＮＴで５分間隔で３回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて発色させた（図３）。全モノクローナル抗体をＮＥ２と十分反応させることができる。ＮＥ２は重合体を形成する傾向があり、そして二量体が依然ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察されたので、モノクローナル抗体と、ＮＥ２の単量体又は二量体の反応性の差異を見出すことができる。モノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８はＮＥ２二量体よりもＮＥ２重合体とよりよく反応し、対照的にモノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７はＮＥ２重合体及び単量体と同等に反応する。ＮＥ２タンパク質は煮沸後単量体に分解され、そしてモノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７との反応性は影響を受けないが、モノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８との反応性は減少又は消失した。

これらの結果により、モノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７はＮＥ２の直線状エピトープを認識し、そしてモノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８は、ＮＥ２タンパク質の単量体よりも二量体又は重合体により露出されるＮＥ２の立体的エピトープを認識することが示される。

実施例５：ＨＥＶ−ＯＲＦ２組換えポリペプチドに対するモノクローナル抗体の結合速度定数の測定法

バイオセンサーのサンプルキュベット１＃に対するＨＥＶ−ＯＲＦ２組換えポリペプチドの結合

ユーザーマニュアルに従って、組換えポリペプチドＮＥ２をＣＭＤ処理したＩＡｓｙｓバイオセンサー（ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｙｓｔｅｍｃｏｍｐａｎｙ、ＩａｓｙｓＰｌｕｓ）のキュベットに結合させた。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）２００μｌ及びＥＤＣ（１−エチル３（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）２００μｌを混合し、次いでこれを用いてＣＭＤ（ＣａａｒｂｉｘｔｎｅｔｇｔｋＤｅｔｒａｎ）キュベットのヒドロキシル基を活性化し、これをＥＤＣ／ＮＨＳ４０μｌで２回洗浄し、そして次に上記の混合物で７分間充填した。ＰＢＳＴ（ｄｄＨ２Ｏ中ＮａＣｌ８．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ２．９ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ及びＴｗｅｅｎ−２００．５ｍｌで１ｌにする、ｐＨ７．４）５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いで１０ｍＭＮａＡｃバッファー（ｐＨ４．５）４０μｌで３回洗浄し、約１分間均一化し、次いでキュベットのいずれかのウェルにＮＥ２（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）１０μｌ及び対照としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを各々加え、結合を観察する。ＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いで１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）４０μｌで３回洗浄し、そしてさらに約１分間均一化し、次いでＮＥ２（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）１０μｌを加えて７分間結合させる。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いで結合していないカルボキシル基を１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５で遮断する。４０μｌで３回洗浄し、そして次に３分間遮断する。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、そして次に１０ｍＭＨＣｌ５０μｌで３回洗浄して遊離の及び非特異的な豊富なタンパク質分子を除去し、そして２分間均一化した。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化した。結合タンパク質の量は約９００ａｒｃｓｅｃ、約４．５ｎｇＮＥ２／ｍｍ２である。

バイオセンサーのサンプルキュベット２＃に対するＨＥＶ−ＯＲＦ２組換えポリペプチドの結合

ユーザーマニュアルに従って、組換えポリペプチドＮＥ２をＣＭＤ処理したＩＡｓｙｓバイオセンサー（ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｙｓｔｅｍｃｏｍｐａｎｙ、ＩａｓｙｓＰｌｕｓ）のキュベットに結合させた。ＮＨＳ２００μｌ及びＥＤＣ２００μｌを用いてＣＭＤキュベットのヒドロキシル基を活性化し、これをＥＤＣ／ＮＨＳ４０μｌで２回洗浄し、そして次に混合物で７分間充填した。ＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いで１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）４５μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いでキュベットのいずれかのウェルにＮＥ２（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）５μｌ及び対照としてＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）５μｌを各々加え、結合を観察する。ＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして１分間均一化し、次いで１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）４５μｌで３回洗浄し、そしてさらに１分間均一化し、次いでＮＥ２（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）５μｌを加えて結合量を観察し、そしてＮＥ２タンパク質の最初の添加量に準じて反応時間を３００ａｒｃｓｅｃを超えないように調節した。キュベットを１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）４０μｌで３回洗浄し、そして１分間均一化し、次いでさらにＮＥ２（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）１０μｌを加えた。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして１分間均一化し、次に結合していないカルボキシル基を１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５で遮断する。４０μｌで３回洗浄し、そして次に３分間遮断する。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、そして次に１０ｍＭＨＣｌ５０μｌで３回洗浄して遊離及び非特異的な豊富なタンパク質分子を除去し、そして２分間均一化した。キュベットをＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして１分間均一化した。最終的に結合タンパク質の量は約１８０ａｒｃｓｅｃ、約０．９ｎｇＮＥ２／ｍｍ２である。

結合速度定数の決定

各モノクローナル抗体の結合速度定数をＩＡｓｙｓバイオセンサーにより２＃ＣＭＤキュベットを用いて決定した。モノクローナル抗体をＰＢＳＴで５希釈以上に希釈する。キュベットをＰＢＳＴ４５μｌで２回洗浄し、そして約１分間均一化した。希釈したモノクローナル抗体精製腹水サンプル５μｌを結合キュベットに約３から５分間加える。キュベットをＰＢＳＴ４５μｌで２回洗浄し、そして分解曲線用に約１から３分間均一化した。キュベットを５０ｍＭＨＣｌ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化し、次いでＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして約１分間均一化した。ＣＭＤキュベットに結合しているＮＥ２タンパク質に結合しているモノクローナル抗体の結合曲線を０から１分間収集し、そしてＦＡＳＴｆｉｔソフトウェアで速度定数を分析する。結果を表４に示す。

モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントの調製

精製したモノクローナル抗体８Ｃ１１（１０ｍｇ／ｍｌ）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ０．１ｍｏｌ／ｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析する。パパイン（ＳｉｇｍａＣｏ．）をＥＤＴＡ２ミリモル／ｌ、ＤＴＴ１ミリモル／ｌを含有する同一のバッファーで２ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして３７℃で３０分間インキュベートして活性化した。次いで活性化したパパインを透析したモノクローナル抗体に重量比１：１００で加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。遮光した氷浴中ヨードアセタミド（最終濃度２０ミリモル／ｌ）で１時間反応を終止させた。次いで切断したモノクローナル抗体をＰＢ２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．４）で一晩透析する。ＰＢ２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．４）で０から１０分溶出し、ＰＢＳ２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．４）中ＮａＣｌ０．５モル／ｌで１０から１５分更新し、次いでＰＢ２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．４）で１５から２０分間均一化する溶出条件でＤＥＡＥ−ＨＰＬＣによりＦａｂフラグメントを精製する。抗体１０から１００ｍｇを負荷し、流速は５ｍｌ／分であり、そして検出波長は２８０ｎｍである。精製したＦａｂフラグメントをＰＥＧで濃縮し、そしてＰＢ２０ミリモル／ｌＳ（ｐＨ７．４）で透析し、そして次に０．２２μｍマイクロポアフィルターで滅菌し、そして次に等分してモノクローナル抗体８Ｃ１１の純粋なＦａｂ産物が得られる。

８Ｈ３、１３Ｄ８のＦａｂフラグメントを同一の手段により得ることができる。

バイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅｔｙｐｅＸ、ＢＩＡｃｏｒｅＣｏ．）のＣＭＤ処理したチップＣＭ５におけるＨＥＶ−ＯＲＦ２組換えポリペプチドの結合

ＣＭ５−ＮＥ２チップとの結合の動態分析

ＢＩＡコアユーザーマニュアルに従って、アミンを用いてＮＥ２をＣＭＤ処理したチップＣＭ５に結合させる。ＮＨＳ２００μｌ及びＥＤＣ２００μｌを混合し、ＣＭ５チップのカルボキシル基を活性化する。反応温度２２℃、及び流速１０μｌ／分に設定し、混合物７０μｌを負荷して接触時間７分間で表面を活性化する。１０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．５）で希釈したＮＥ２タンパク質（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）（１：５の比率）を負荷し、量を調節してコーティングする。約１分間のベースラインデータを集める。次いで未反応カルボキシル基を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）７５μｌで遮断する。結合したタンパク質の量は約８４ＲＵであり、すなわち約０．０４２ｎｇ／ｍｍ２である。

ＢＩＡコアバイオセンサーにより決定したモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及びそのＦａｂフラグメントの結合速度定数

各モノクローナル抗体及びそのＦａｂフラグメントをＰＢＳで５希釈以上に希釈し、そして次にその結合をＣＭ５チップに連結したＮＥ２タンパク質で検出し、そしてＢＩＡ評価ソフトウェアにより速度定数を分析する。

各Ｆａｂフラグメントに関するＫＤ結果を表５に示す。８Ｃ１１、１３Ｄ８Ｆａｂフラグメントの解離速度は会合と同様、すべて比較的速く、８Ｈ３Ｆａｂフラグメントの会合速度は有意に上昇し、そして解離速度は低下し、親和速度は１０５上昇する。チップに連結されたＮＥ２に対するモノクローナル抗体の会合及び解離過程を図４に示す。

実施例６：バイオセンサーの遮断試験

各々のモノクローナル抗体を希釈して、結合速度分析に基づいて飽和結合濃度を抑え、そして１＃ＣＭＤキュベットを用いて８Ｈ３とモノクローナル抗体８Ｃ１１、１３Ｄ８、１６Ｄ７との相互作用、２＃ＣＭＤキュベットを用いて８Ｃ１１、１３Ｄ８、１６Ｄ７の互いの相互作用を検出するために、互いに組にした。最初にＰＢＳＴ４５μｌで２回洗浄し、そして１分間平衡化することにより、希釈し、精製した、モノクローナル抗体Ａｂ１の腹水サンプル５μｌを加え、３から５分間結合させ、ＰＢＳＴ４５μｌで２回キュベットを洗浄し、そして１から３分間平衡化し（解離できるモノクローナル抗体、例えば８Ｈ３に関して、結合時間を適当に延長して、できるだけ反応のバランスを保ち、ＰＢＳＴ洗浄による解離の手順を排除した）、さらに希釈し、精製した、モノクローナル抗体Ａｂ２の腹水サンプル５μｌを加え、３から５分間結合させ、次いで結合曲線を観察した。洗浄後、キュベットをＰＢＳＴ４５μｌで２回洗浄し、そして３から５分間平衡化した後、解離曲線を観察した。キュベットを５０ｍＭＨＣｌ５０μｌで３回洗浄し、そして１分間平衡化し、次いでＰＢＳＴ５０μｌで３回洗浄し、そして１分間平衡化した。Ａｂ１及びＡｂ２の順序を換え、そして上記の過程を繰り返す。モノクローナル抗体結合量（Ｒ）はモノクローナル抗体の添加から最初の３分で増加したシグナルの値であった。１次抗体としての各モノクローナル抗体の結合量（Ｒ１）及び２次抗体としてのその結合量（Ｒ２）を比較した。Ｒ２がＲ１よりも大きい場合（増強率＝（Ｒ２−Ｒ１）／Ｒ１、これが２０％以上である場合、これは増強である）、これは添加した別のモノクローナル抗体がこのモノクローナル抗体の結合活性を増強すると見なすことができ、対照的に、Ｒ２がＲ１よりも小さい場合、このモノクローナル抗体は添加した別のモノクローナル抗体により抑制されると言える（抑制率＝（Ｒ１−Ｒ２）／Ｒ１、これが３０％以上である場合、これは抑制が存在すると見なされ、抑制率に従って、穏やかな抑制（３０％から４０％）、抑制（４０％から６０％）、明白な抑制（６０％から８０％）及び顕著な抑制（８０％以上）があり、そして２つのモノクローナル抗体が互いに抑制できる場合、抑制であると考えられた）。

１３Ｄ８に及ぼす８Ｃ１１の抑制率は８２％であり、そして８Ｃ１１に及ぼす１３Ｄ８の率は５３％であり、これはこれらの２つのモノクローナル抗体により認識されるエピトープが互いに重複していることを示唆しているが、一方８Ｃ１１及び１６Ｄ７、１３Ｄ８及び１６Ｄ７は互いに抑制せず、これは１６Ｄ７により認識されるエピトープと８Ｃ１１及び１３Ｄ８により認識されるエピトープとの間に明白な空間的間隔があることを示しており、同様に８Ｈ３及び１３Ｄ８、８Ｈ３及び１６Ｄ７の間に互いに抑制がなく、これは８Ｈ３により認識されるエピトープ領域が１３Ｄ８及び１６Ｄ７によるエピトープ領域と異なることを示している（表６）。８Ｃ１１が明らかに８Ｈ３を増強すること（増強率はほぼ５０％）は予想外であり、そして得られた解離曲線はモノクローナル抗体８Ｈ３の以前の急速な解離速度が８Ｃ１１の影響により遅くなることを示し、これは８Ｃ１１と抗原との結合が抗原の空間的コンフォーメーション変化を招き、そのために８Ｈ３により認識される抗原のエピトープがさらに十分に露出されるようになることを示した。

実施例７：モノクローナル抗体間の交差遮断効果のＥＬＩＳＡ試験

モノクローナル抗体８Ｃ１１の精製：８Ｃ１１腹水１０ｍｌを飽和硫酸アンモニウムで３回沈殿させ、そして１０ｍＭリン酸バッファー生理食塩水（ｐＨ７．２）で透析し、次いで同一バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−５２クロマトグラフィーに負荷し、そして流出ピークを収集した。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いるモノクローナル抗体８Ｃ１１の標識

ＨＲＰ及びＮａＩＯ４各１ｍｇを超純水に溶解し、次いでＮａＩＯ４溶液をＨＲＰ溶液に振盪しながら滴加し、十分に混合した溶液を室温で３０分間暗所に置き、超純水中エチレングリコール１μｌを上記の混合物溶液に振盪しながら滴加し、次いで室温で３０分間暗所に置き、それまでに酵素酸化の過程が達成された。ＨＲＰ酸化の過程で、精製された８Ｃ１１を５０ｍＭＣＢ（ｐＨ〜９．６）に対して透析した。ＨＲＰ酸化が終了した後、ＨＲＰを透析した８Ｃ１１と任意の比率で混合し、そして５０ｍＭＣＢ（ｐＨ９．５）で６時間以上透析し、次いで新たに調製したＮａＢＨ４溶液をＮａＢＨ４０．２ｍｇの量で添加することにより停止させ、得られたものを十分に振盪し、そして４℃で２時間放置し、続いて１０ｍＭＰＢＳで一晩透析した。

モノクローナル抗体８Ｈ３、１３Ｄ８及び１６Ｄ７を精製し、そして類似の方法でＨＲＰを用いて標識した。

ＥＬＩＳＡマイクロプレートを０．０５μｇ／ｍｌ精製ＮＥ２タンパク質でコーティングし、そして実施例２で上記の方法と類似の方法に従って遮断した。２０ウェルを４群に分け、次いで４つの異なるモノクローナル抗体（２０％のウシ新生仔血清で１：１０５ＥＬＩＳＡ力価に希釈）を各群の４つのウェルに各々ウェルあたり１００μｌ、及び対照として残りのウェルにＰＢＳ中２０％のウシ新生仔血清１００μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、液体を捨て、そして４つの異なるＨＲＰ標識モノクローナル抗体（ＰＢＳ中２０％のウシ新生仔血清で１：１０３ＥＬＩＳＡ力価に希釈）を加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、そしてブロッティング乾燥し、クロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢ各々５０μｌを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、停止溶液５０μｌで反応を停止させ、そして吸光度リーダーでＯＤ４５０／６２０ｎｍを読み（ＰＢＳＴ、クロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢはすべてＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社より購入した）、最後に遮断率を算出した（遮断率＝１−遮断したＯＤ／対照ＯＤ）。５０％を超える遮断率を遮断が存在すると見なした。互いに遮断した場合のみ、遮断が存在したと考えた。表７に後記するように、モノクローナル抗体８Ｃ１１及び１３Ｄ８が互いに明らかに遮断することができるが、その各々と、モノクローナル抗体８Ｈ３及びモノクローナル抗体１６Ｄ７との間に遮断効果はなく、モノクローナル抗体８Ｈ３及びモノクローナル抗体１６Ｄ７は残りの３つのモノクローナル抗体各々を遮断することができない。これはモノクローナル抗体８Ｃ１１及び１３Ｄ８が同一の抗原決定領域を認識することができるが、モノクローナル抗体８Ｈ３及び１６Ｄ７はその他の２つの抗原決定領域を認識することを示唆した。

実施例８：ＢＩＡコアバイオセンサーにより検出されるモノクローナル抗体８Ｈ３及びそのＦａｂフラグメントの結合活性に及ぼすモノクローナル抗体８Ｃ１１及びそのＦａｂフラグメントの増強

検出に有用なＣＭ５−ＮＥ２チップの連結

製造マニュアルに従って連結をおこなった：ＮＨＳ２００μｌ及びＥＤＣ２００μｌを混合し、ＣＭ５チップのカルボキシル基を活性化する。１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）で１：５に希釈したＮＥ２タンパク質（０．６７５ｍｇ／ｍｌ、純度９５％）１００μｌを負荷し、そして１０分間反応させ、未反応カルボキシル基を１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）７５μｌで遮断する。連結したタンパク質の最終量は３２９５ＲＵであり、１．６５ｎｇ／ｍｍ２に相当する。

モノクローナル抗体８Ｃ１１のモノクローナル抗体８Ｈ３及び８Ｈ３Ｆａｂ抗体との相互作用

検出用のＣＭ５−ＮＥ２センサーチップを使用し、そして反応温度を２２℃、流速１０μｌ／分に設定し、そして反応バッファーはＰＢＳであった。平衡に達した後、モノクローナル抗体８Ｃ１１１０μｌを負荷し、結合及び解離曲線を観察し、そして次に５０ｍＭＨＣｌ１０μｌで洗浄した。モノクローナル抗体８Ｈ３及び８Ｈ３Ｆａｂ抗体の結合及び解離曲線を同一の方法で検出した。次いでモノクローナル抗体８Ｃ１１１０μｌを負荷し、会合及び解離の後、モノクローナル抗体８Ｈ３１０μｌを負荷して、モノクローナル抗体８Ｃ１１の存在下でのモノクローナル抗体８Ｈ３の結合及び解離を検出した。次いで５０ｍＭＨＣｌ１０μｌで洗浄した。同一の方法でモノクローナル抗体８Ｃ１１の存在下での８Ｈ３Ｆａｂ抗体の会合及び解離を検出した。別個の結合手順の間にモノクローナル抗体８Ｈ３及び８Ｈ３Ｆａｂの会合の減少及び解離の増加が観察された。モノクローナル抗体８Ｃ１１の存在下での結合量は図５で示すように高くなり、そして安定した。

８Ｃ１１Ｆａｂ抗体のモノクローナル抗体８Ｈ３及び８Ｈ３Ｆａｂ抗体との相互作用

検出用のＣＭ５−ＮＥ２センサーチップを使用し、そして反応温度を２２℃、流速１０μｌ／分に設定し、そして反応バッファーはＰＢＳであった。平衡に達した後、モノクローナル抗体８ＣＨ３１０μｌを負荷し、結合及び解離曲線を観察し、そして次に５０ｍＭＨＣｌ１０μｌで洗浄した。８Ｈ３Ｆａｂ抗体間の結合及び解離曲線を同一の方法で検出した。次いでモノクローナル抗体８Ｃ１１Ｆａｂ抗体１０μｌを負荷し、会合及び解離の後、モノクローナル抗体８Ｈ３１０μｌを負荷して、８Ｃ１１Ｆａｂ抗体の存在下でのモノクローナル抗体８Ｈ３の結合及び解離を検出した。次いで５０ｍＭＨＣｌ１０μｌでの洗浄を行なった。同一の方法で８Ｃ１１Ｆａｂ抗体の存在下での８Ｈ３Ｆａｂ抗体の会合及び解離を検出した。別個の結合手順の間にモノクローナル抗体８Ｈ３及び８Ｈ３Ｆａｂ抗体の会合の減少及び解離の増加が観察された。８Ｃ１１Ｆａｂの存在下での結合量は図５で示すように高くなり、そして安定した。

実施例９：抗体捕捉ＲＴ−ＰＣＲによるＨＥＶウイルス粒子に対するモノクローナル抗体の結合を試験する

一般的な１．５ｍｌエッペンドルフチューブにＵＶを３０分間照射し、次いで炭酸コーティングバッファー（Ｎａ２ＣＯ３２０．０２ｇ及びＮａＨＣＯ３２．５２ｇ、ｄｄＨ２Ｏを加えて１ｌにする、ｐＨ９．５）で１：１０００希釈した異なるモノクローナル抗体５００μｌを加え、３７℃で一晩インキュベートし、バッファーを捨て、そして遮断バッファー（２％のアルブミン含有１ＸＰＢＳ、ｐＨ７．４）１．５ｍｌを加えて３７℃で２時間遮断し、遮断バッファーを捨て、そして滅菌生理食塩水で希釈した１０％のＨＥＶ陽性排泄物懸濁液５００μｌを加えて３７℃で２時間反応させ、次いでＰＢＳＴで６回洗浄し、そして最後にｄｄＨ２Ｏ２５０μｌを各エッペンドルフのチューブに加えた。そのユーザーマニュアルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＬ）を用いて抽出したＲＮＡを反応容量２０μｌで４２℃で４０分間、ＡＭＶ逆転写酵素を用いて、ＲＴプライマーとして特異的プライマーＡ３（４５６６−４５８６、５’−ｇｇｃｔｃａｃｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ−３’）を用いる逆転写に供した。次いで、最終容量２０μｌでＲＴ鋳型２μｌ及びＡ３及びＡ５プライマー（４３４１−４３６２、５’−ｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇ−３’）を用いて以下の反応条件下でＲＴ−ＰＣＲの最初のラウンドを実施した。予備変性を９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の変性、６８℃で４０秒間のアニーリング及び伸長を３５サイクル、７２℃で５分間の伸長。鋳型として第１ラウンドの反応産物１μｌを用い、そしてプライマーＢ５（４３７２−４３９２、５’−ｇｃｃｇｃａｇｃａａａｇｇｃａｔｃｃａｔｇ−３’）及びＢ３（４５５４−４５７５、５’−ｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃｃａａａａｃｃｃｔｃｇｃ−３’）を用いて、以下の反応条件下でＰＣＲの第２ラウンドを最終容量２０μｌで実施した。予備変性を９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の変性、５６℃で４０秒間のアニーリング及び７２℃で１分２０秒間の伸長を３５サイクル、７２℃で５分間の伸長。結果として、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８のモノクローナル抗体はウイルスに結合することができた（図６）。

実施例１０：モノクローナル抗体８Ｈ３のウイルス捕捉能力に及ぼすモノクローナル抗体８Ｃ１１の増強効果

ウイルス力価の低いＨＥＶ陽性排泄物懸濁液を免疫捕捉ＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用した。モノクローナル抗体８Ｈ３のＨＥＶ捕捉能力に及ぼすモノクローナル抗体８Ｃ１１又は１３Ｄ８（対照として）の影響を検出するために、種々の濃度のモノクローナル抗体８Ｃ１１又は１３Ｄ８（対照として）を予め排泄物懸濁液に添加した。図７に後記するように、モノクローナル抗体８Ｃ１１は特異的にモノクローナル抗体８Ｈ３のウイルス結合能力を著しく増強し、一方、モノクローナル抗体８Ｃ１１の類似のエピトープ領域を認識し、これもまたウイルスを補足するモノクローナル抗体１３Ｄ８にはかかる効果はなかった。

３．本発明に記載するモノクローナル抗体の中和保護効果

実施例１１：アカゲザルに対するＨＥＶＸＭ株の感染用量

排泄物由来のＨＥＶＲＮＡの抽出、逆転写及びＰＣＲ：Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＬ）を用いて、その操作指示書に従ってＨＥＶＲＮＡを種々の希釈の排泄物懸濁液２００μｌから抽出し、そしてＡＭＶ逆転写酵素を用いて４２℃で４０分間、ＲＴプライマーとして特異的プライマーＡ３（４５６６−４５８６、５’−ｇｇｃｔｃａｃｃｇｇａｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃ−３’）を用いて反応容量２０μｌで逆転写に供した。ＲＴ鋳型２μｌ及びＡ３及びＡ５プライマー（４３４１−４３６２、５’−ｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｃｇｔｃｔｔｃｔｃｇ−３’）を用いて以下の反応条件下で最終容量２０μｌでＲＴ−ＰＣＲを実施した。予備変性を９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の変性、６８℃で４０秒間のアニーリング及び伸長を３５サイクル、７２℃で５分間の伸長。鋳型として第１ラウンドの反応産物１μｌを用い、そしてプライマーＢ５（４３７２−４３９２、５’−ｇｃｃｇｃａｇｃａａａｇｇｃａｔｃｃａｔｇ−３’）及びＢ３（４５５４−４５７５、５’−ｇｔｇｔｔｔｃｔｔｃｃａａａａｃｃｃｔｃｇｃ−３’）を用いて、以下の反応条件下でＰＣＲの第２ラウンドを最終容量２０μｌで実施した。予備変性を９４℃で５分間、９４℃で４０秒間の変性、５６℃で４０秒間のアニーリング及び７２℃で１分２０秒間の伸長を３５サイクル、７２℃で５分間の伸長。標本のＰＣＲ力価は、希釈した標本が陽性バンドに検出されうる希釈溶液のうち、希釈倍率が最も高いものの希釈倍率と定義した。

ＰＣＲ力価が１０１〜１０５の希釈ＨＥＶＸＭ株溶液０．５ｍｌを静脈内注射してウイルスを投与したところ、すべてのアカゲザルにウイルス排泄が認められた。これは感染が成功した証拠である。一方、１００ＰＣＲ力価でウイルスを投与した２匹のアカゲザルは、その排泄物に検出可能なウイルス、抗体の陽転及び異常ＡＬＴが認められなかった。これは感染が成功しなかった証拠である。従って、ＨＥＶＸＭ株の５０％サル感染用量（ＭＩＤ５０）は大体、１０１ＰＣＲ検出可能量であった。さらに感染用量が低いほど、ウイルス排泄における陽転の発現時期が遅れる傾向があった（表８）。

実施例１２：モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の中和保護効果

１２匹のサルを４群に分けた（群あたりサル３匹）。第１群（サルＫＦ２５から２７）を対照として用い、第２群（サルＫＦ１６から１８）をモノクローナル抗体８Ｃ１１で中和し、第３群（サルＫＦ１９から２１）をモノクローナル抗体８Ｈ３で中和し、第４群（サルＫＦ２２から２４）をモノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の組合せで中和した。希釈したＨＥＶＸＭ株陽性排泄物（１０３ＰＣＲ力価に希釈）２ｍｌ及びモノクローナル抗体８Ｃ１１腹水（約１：１０５力価）２ｍｌ、又は８Ｈ３腹水（約１：１０４力価）２ｍｌ、又は８Ｈ３腹水１ｍｌと一緒にした８Ｃ１１腹水１ｍｌの混合物を４℃で一晩（約１４時間）放置し、次いで室温で２時間インキュベートした。対照群はモノクローナル抗体と共にインキュベートしなかった。ウイルス−モノクローナル抗体の各混合物１ｍｌを３匹のアカゲザルに各々静脈内注射した。ＲＴ−ＰＣＲにより排泄物中のＨＥＶ−ＲＮＡの検出のために、ウイルス投与の日から始めて、２週間毎日、そして次に週２回排泄物標本を収集した。血清サンプルを毎週採取し、ＡＬＴ及び抗ＨＥＶ抗体を測定した。

結果を表９に示した。対照群の３匹すべてのサルはＡＬＴ異常を示し、そしてそのウイルス排泄が早期に認められた。８Ｃ１１＋８Ｈ３群の１匹のサル（ＫＦ２２）においてのみＡＬＴ異常が認められた以外は、中和群のすべてのサルはウイルス排泄の発現時期を著しく延期させた。８Ｃ１１＋８Ｈ３群の１匹のサル（ＫＦ２４）は手順の間中ウイルス排泄及びＨＥＶに対する抗体がなく完全に保護された。この群の別のサル（ＫＦ２３）に関しては、注射後４０日にウイルス排泄を生じ、２週に満たない期間続き、そして次に陰性に転じ、抗ＨＥＶＩｇＭ抗体は期間中検出されず、そしてＩｇＧ抗体は５６日までに陽性に転じた。これらの結果により、モノクローナル抗体８Ｃ１１及びモノクローナル抗体８Ｈ３の双方が一定の中和効果を有し、また、２つのモノクローナル抗体を組み合わせると明らかに中和効果が増強されることが証明された。

４．感染血清及び本発明のモノクローナル抗体のインター・ブロッキング効果

実施例１３：モノクローナル抗体に及ぼすＨＥＶ患者の血清の遮断効果

２人の急性ＨＥＶ患者の血清及び２人の正常ヒト血清のＮＥ２モノクローナル抗体に対する遮断能力を検出した。７つの酵素標識したモノクローナル抗体を、ＮＥ２マイクロプレートと反応するこれらのモノクローナル抗体のＯＤ値が１．０と２．０の間である濃度まで希釈した。ＮＥ２で予めコーティグしたマイクロウェルを２群に分け、一方は遮断群、及び他方は対象群にした。遮断群のウェルに３倍連続希釈した検出すべき血清（１：１０、１：３０、１：９０、１：２７０及び１：８１０）１００μｌを、各希釈に関して２検体ずつで加えた。１２個の対照ウェルには希釈液１００μｌを加え、２個の対照ウェルは各モノクローナル抗体に相当した。３０分間インキュベートした後、プレートを５回洗浄し、そして希釈した酵素標識モノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、８Ｃ１１、１３Ｄ８、１５Ｂ２及び１６Ｄ７を添加した。さらに３０分間インキュベートした後、プレートを５回洗浄し、ブロッティング乾燥し、クロマトゲンを添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。停止バッファー５０μｌで反応を停止させ、そして各ウェルに関して吸光度ＯＤ４５０／６２０ｎｍを測定した。モノクローナル抗体８Ｈ３により認識されるＮＥ２エピトープを８Ｃ１１によって増強させることができ、従ってモノクローナル抗体８Ｈ３に対する血清遮断試験で使用した、ＮＥ２で予備コーティングしたマイクロウェルを最初に８Ｃ１１（１：１０００）で３０分間飽和し、８Ｈ３をＮＥ２のエピトープに完全に暴露させ、続いて類似の血清遮断試験を行なった。モノクローナル抗体に対する血清の遮断率＝（平均対照ＯＤ−平均遮断ＯＤ）／平均対照ＯＤ＊１００％。血清の遮断力価は、遮断率が５０％を超える希釈溶液のうち、希釈倍率が最も高いものの希釈倍率と定義した。

表１０に記載するように、急性の患者の血清は、立体状エピトープを認識する５つのモノクローナル抗体の反応を著しく遮断したが、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体１５Ｂ２を遮断しなかった。１人の急性患者の血清は直線状エピトープモノクローナル抗体１６Ｄ７を遮断できた、そしてその他の血清の遮断率はいつも５０％以下で、希釈倍率の上昇に連れて下降する傾向があった（図８）。正常ヒト血清はいずれのモノクローナル抗体に対しても遮断効果がなかった。希釈倍率を連続的に変化させて希釈した１人の急性患者の血清の、異なるモノクローナル抗体に及ぼす遮断効果は図８で説明した。低希釈倍率では、５つの立体的モノクローナル抗体に対する遮断率がすべて９０％を超えることが認められ、そしてこれは遮断率が希釈倍率の増加と共に低下する明白な用量効果を示した。

実施例１４：ＨＥＶ感染血清に対する抗ＮＥ２モノクローナル抗体の遮断効果

ＨＥＶ患者の回復期血清を異なる抗ＮＥ２モノクローナル抗体で遮断する。

ＮＥ２コーティング及び遮断したマイクロプレートに、８つの希釈した抗ＮＥ２モノクローナル抗体（１：１０００）１００μｌ、モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の等量混合物並びに遮断していない対照として希釈液を各々加え、３７℃で３０分間インキュベートし、そしてブロッティング乾燥し、次いでＨＥＶ患者由来の対照希釈した回復期血清を加え、そして３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄し、そしてブロッティング乾燥し、次いで希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ１００μｌを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートし、再度５回洗浄し、そしてブロッティング乾燥し、クロマトゲンを加え、３７℃で１分間インキュベートし、停止バッファー（２ＭＨ２ＳＯ４）５０μｌで反応を停止させ、そしてＯＤ４５０／６２０ｎｍの吸光度を測定した。対処ＯＤ値が１．０から２．０になる希釈を選択し、式：遮断率＝（１−遮断ＯＤ）／非遮断ＯＤ＊１００％により遮断率を算出する。１つ以上の非遮断ウェルが１．０から２．０のＯＤ値を有した場合、平均遮断率を血清に対する前記モノクローナル抗体の遮断率と見なすことができる。遮断率が５０％を超える場合、これは陽性と考えられる。表１１に記載するように、８Ｃ１１及び８Ｈ３の混合物（８Ｃ１１＋８Ｈ３）が３人の患者の血清を著しく遮断でき、一方モノクローナル抗体８Ｃ１１及び１３Ｄ８もまた血清５１４及び４５４を遮断することができた。

異なる相のＨＥＶ感染サル由来の血清に対する種々モノクローナル抗体の遮断効果

３匹のＨＥＶ感染サルの異なる相での血清に及ぼす、異なるモノクローナル抗体の遮断効果の差異を見出すために、類似の方法で遮断試験を実施した。表１２に示すように、結果はヒト血清によるものに類似した。モノクローナル抗体８Ｃ１１及び１３Ｄ８はいずれの相でもサル血清を顕著に遮断することができ、これは２つのモノクローナル抗体により認識されるエピトープが免疫優性であることを示し、８Ｃ１１＋８Ｈ３の組合せ遮断率は実質的に９０％を超え、８Ｃ１１又は１３Ｄ８の遮断率よりも高く、これにより８Ｈ３により認識されるエピトープが別の免疫優性エピトープであることが証明された。これらの２つのエピトープに対する抗体は、異なる感染相の抗ＮＥ２抗体の中でも重要であった。８Ｈ３単独を用いて有効な遮断は観察されず、これをバイオセンサーにより決定されたモノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３のＮＥ２との結合曲線により説明することができた。モノクローナル抗体８Ｈ３のＮＥ２との結合親和性は弱く、そして解離し易かった。８Ｃ１１と同時にＮＥ２に結合する場合、８Ｈ３により認識されるエピトープは、８Ｃ１１により誘導されたコンフォーメーション変化によりＮＥ２に完全に露出され、そしてそれにより対応する抗体とより早くそしてより堅固に結合することができ、従って８Ｃ１１及び８Ｈ３の組合せ遮断が対応するエピトープを効率よく遮断することができた。

８Ｃ１１及び８Ｈ３がＮＥ２に同時に結合したとき、従って２つのエピトープに隣接する別のエピトープを認識する抗体がその抗原と結合する場合に、立体障害効果を生じるおそらく別の理由があった。モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の遮断効果に及ぼすかかる立体障害効果の影響力を見出すために、これらの２つのモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントをパパイン消化により切除し、立体障害効果を著しく低減させ、次いで類似の遮断実験を実施する。結果を図９に示す。これらのＦａｂフラグメントの遮断効果は抗体全体の遮断効果とほとんど同等であり、これによりＨＥＶ感染血清に及ぼすモノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の遮断効果がエピトープ特異的であることが示された。ＨＥＶ感染血清に対する８Ｃ１１及び８Ｈ３の明白な遮断効果により、これらの２つのエピトープがＨＥＶ感染中のＮＥ２ドメイン内の最も重要な免疫優性エピトープであり、そしてその対応する抗体が主要な抗体として長時間持続されることが示された。

５．本発明の前記モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子の単離及び発現

実施例１５：モノクローナル抗体１３Ｄ８の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子の単離

１３Ｄ８マウス起源の１０７個のハイブリドーマ細胞を半集密的になるまで培養し、懸濁し、そして次に新たな４ｍｌ遠心チューブに移した。１５００ｒｐｍで３分間回転させることにより細胞を収集した。ペレットを滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４５）１００μｌに再懸濁し、そして新たな１．５ｍｌ遠心チューブに移した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）８００μｌをチューブに加えた。穏やかに逆さまにすることにより溶液を完全に混合し、そして１０分間放置した。クロロホルム０．２ｍｌを添加した後、チューブを１５秒間激しく振盪し、そして１０分間放置し、次いで１２０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心した。上部の水相を新たな１．５ｍｌ遠心チューブに移し、続いて等量のイソプロパノールを加えた。チューブを数回逆さまにすることにより混合し、そして１０分間放置し、次いで１２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心した。上清を捨てた。７５％のエタノール６００μｌを加えることによりペレットを洗浄した。チューブを１２０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心した。上清を捨てた。ペレットを６０℃で５分間真空下で乾燥させ、次いでＤＥＰＣＨ２Ｏ７０μｌに溶解した。溶液に逆転写プライマーＯｌｉｇｏ（ｄＴ）（１２−１８）（Ｐｒｏｇｅｇａ）１μｌ、ｄＮＴＰ（Ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）１μｌを加え、次いで湯浴中７２℃で１０分間インキュベートした。チューブを即座に氷上に５分間置き、５ｘＲＴバッファー２０μｌ、ＡＭＶ（１０ｕ／μｌ、Ｐｏｒｍｅｇａ）２μｌ及びＲｎａｓｉｎ（４０ｕ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）１μｌを加え、次いで混合した。４２℃での逆転写によりｃＤＮＡを合成した。

Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び別の設計された下流プライマーＭＫＣＲ１（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉにより合成）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により抗体遺伝子を単離した。上記で合成した１３Ｄ８ｃＤＮＡを鋳型として使用した。

カッパ鎖のＭｕＩｇｋＶＬ５’−ＡからＧの上流プライマーの７個のセット及び下流プライマーＭＫＣＲ１（５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’）を用いて軽鎖遺伝子を単離した。ＭＫＣＲ１及び７個の上流プライマーの各々から成るプライマー対を用いて４７から５６℃でグラジエントＰＣＲ増幅を実施した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下のＰＣＲ条件下でＭｕＩｇｋＶＬ５’−Ｇ３（５’−ＡＴＧＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ−３’）／ＭＫＣＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５３℃で１分間、７２℃で５０秒間の３５サイクル及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そして次にシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に配列を１３Ｄ８軽鎖配列と同定した。可変領域を配列番号：５に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：６に示した。

ＩｇＧのＭｕＩｇＧＶＨ５’−ＡからＦの上流プライマーの６個のセット及び下流プライマーＭＶＨＲ（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡ（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧＡＴＡ（Ａ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）Ｇ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧ−３’）を用いて重鎖の可変領域を単離した。プライマーＭＶＨＲ及び６個の上流プライマーの各々から成るプライマー対を用いて４７から５６℃でグラジエントＰＣＲ増幅を実施した。結果的に、単一のＤＮＡフラグメント約４００ｂｐを以下の条件下でＭｕＩｇＧＶＨ５’−Ｃ２（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ）ＴＴＧＧ（Ｃ／Ｇ）ＴＧＴＧＧＡ（Ａ／Ｃ）ＣＴＴＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＡＴＴＣＣＴ−３’）／ＭｕＩｇＧＶＨ３’−２のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５３℃で１分間、７２℃で４０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そして次にシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に配列を１３Ｄ８重鎖の可変領域配列と同定し（配列番号：７）、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：８に示した。

実施例１６：１３Ｄ８１本鎖抗体のクローニング、発現、精製及び活性決定

（ＧＧＧＧＳ）３の短いペプチドリンカーにより１３Ｄ８重鎖及び軽鎖の可変領域を連結させて１本鎖抗体のＤＮＡフラグメントを形成した。１３Ｄ８重鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを１３Ｄ８ＨＦ１（５’−ｇＡＡＴＴＣｇＡＴｇＴＡＣＡＡＣＴＴＣＡｇｇ−３’）／１３Ｄ８ＨＲ１（５’−ｇＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡｇＡＴＣＣｇＣＣＡＣＣＴＣＣＴｇＡＡｇＡＴＡＣｇｇＴｇＡＣＣｇＴｇｇＴｇＣＣ−３’）のプライマー対を用いて増幅し、そして１３Ｄ８軽鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを１３Ｄ８ＫＦ１（５’−ＡＴＣＴｇｇＡｇｇｇｇｇＴｇｇＴＡｇＣｇｇＴｇｇＡｇｇＣｇｇｇＡｇＴｇＡＣＡＴＣＣＡｇＡＴｇＡＣＴＣＡｇ−３’）／１３Ｄ８ＫＲ１（５’−ｇＴＣｇＡＣＣＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣ−３’）のプライマー対を用いて増幅した。これらの２個のフラグメントを各々回収し、そしてお互いのプライマー及び鋳型としてかかる２個のフラグメントを用いて新たなＰＣＲ系で１本鎖抗体の全長フラグメントを構築した。少しの得られた１本鎖抗体の全長フラグメントを鋳型として使用してプライマー対１３Ｄ８ＨＦ１／１３Ｄ８ＫＲ１を用いてさらに増幅した。回収した１本鎖抗体フラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化した。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩを用いる消化により１本鎖抗体フラグメントを得られたプラスミドから回収し、次いで同一の酵素で消化した原核細胞性発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７にクローン化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６株を得られた組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−１３Ｄ８で形質転換し、別個のコロニーを取り、そしてＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌＫａｎ含有）５００ｍｌ中で成長させた。シェーカー中３７℃で一晩インキュベーションを実施した。細菌培養培地のＯＤ６００が約０．８に達したときに、ＩＰＴＧを最終濃度０．２ミリモル／ｌになるまで添加して誘導し、そして３０℃で６時間インキュベーションを続けた後、細菌を収集し、そして細菌をソニケーションにより破壊した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、沈殿物を上清と同一容量の２０ミリモル／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に溶解した。等量の上清及び沈殿物溶液でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。濃縮用ゲル及び分離用ゲルの濃度は各々５％及び１２％であった。発現されたタンパク質は主に不溶性封入体の形態で存在することが観察された。ソニケーションからの沈殿物を２％のＴｒｉｔｏｎで２回洗浄し、続いて２Ｍ、４Ｍ及び８Ｍ尿素に各々溶解し、そして溶解した溶液の各々に関して１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。１本鎖抗体は主に８Ｍ尿素に溶解しているのが見出された。１ｘＰＢＳに対して徐々に透析することにより８Ｍ尿素に溶解した１本鎖抗体を復元した。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心することによりペレットを捨てた。得られた１本鎖抗体溶液の活性を検定した。

予め精製した１３Ｄ８１本鎖抗体の活性を競合ＥＬＩＳＡにより検出した。１：４００００希釈し、そしてＢＳＡで遮断した精製ＮＥ２で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。上記の１本鎖抗体溶液５０μｌ及び１：５００希釈したＨＲＰ標識１３Ｄ８モノクローナル抗体５０μｌを検出すべきサンプルウェルに加えた。陰性対照として１ｘＰＢＳ溶液５０μｌ及び１：５００希釈したＨＲＰ標識１３Ｄ８モノクローナル抗体５０μｌをウェルに加えた。陽性対照として未標識１３Ｄ８モノクローナル抗体５０μｌ及び１：５００希釈したＨＲＰ標識１３Ｄ８モノクローナル抗体５０μｌをウェルに加えた。３検体ずつでアッセイを実施した。混合した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いでクロマトゲンＡ及びＢを加えた。３７℃で１５分間発色させた。反応を停止させ、そしてマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。結果的に、陰性対照の平均値は２．９５５であり、そして陽性対照の平均値は０．７３１であり、検出すべきサンプルウェルの平均値は０．６２４であった。その結果により、予め精製した１３Ｄ８１本鎖抗体は高い活性を有することが示された。

実施例１７：モノクローナル抗体８Ｃ１１の軽鎖の可変領域遺伝子及び重鎖のＦｄフラグメントの単離

上記の方法と同一の方法により半集密的なマウス起源の８Ｃ１１のハイブリドーマ細胞１×１０７個から全ＲＮＡを抽出し、そして逆転写によりｃＤＮＡを合成した。同様に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）並びに２つの別の設計された下流プライマーＭＦｄＲ１及びＭＦｄＲ２（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を用いて、そして鋳型として上記で合成した８Ｃ１１ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子を単離した。

カッパ鎖のＭｕＩｇｋＶＬ５’−ＡからＧの上流プライマーの７個のセット及び３’プライマーＭｕｌｇｋＶＬ３’−１（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ−３’）を用いて軽鎖可変領域遺伝子を単離した。１個の下流プライマー及び７個の上流プライマーの各々から成るプライマー対を用いて４７から５６℃でグラジエントＰＣＲ増幅を実施した。結果的に、約４００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇｋＶＬ５’−Ｇ３／ＭｕｌｇｋＶＬ３’−１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で３５秒間、５３℃で１分間、７２℃で４０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に、配列を８Ｃ１１軽鎖可変領域遺伝子と同定した。配列を配列番号：９に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：１０に示した。

ＩｇＧのＭｕＩｇＧＶＨ５’−ＡからＦの上流プライマーの６個のセット及び下流プライマーＭＦｄＲ１（５’−ＡＣＴＡＧＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ−３’）及びＭＦｄＲ２（５’−ＡＣＴＡＧＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＴＣＴＡＧＧＣＴＣ−３’）を用いて重鎖のＦｄフラグメント遺伝子を単離した。下流プライマーＭＦｄＲ１／ＭＦｄＲ２及び６個の５’プライマーの各々から成るプライマー対を用いて４７から５６℃でグラジエントＰＣＲ増幅を実施した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇＶＨ５’−Ｄ１（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧ（Ａ／Ｇ）ＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧ（Ａ／Ｔ）ＴＴ（Ｃ／Ｔ）ＴＴＧＧ（Ａ／ＴＣ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＴＣＴＴ−３’）／ＭＦｄＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５７℃で５０秒間、７２℃で５０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に、配列を８Ｃ１１重鎖のＦｄフラグメントと同定し、そして可変領域配列の一部を配列番号：１１に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：１２に示した。

実施例１８：８Ｃ１１１本鎖抗体のクローニング、発現、精製及び活性の決定

（ＧＧＧＧＳ）３の短いペプチドリンカーにより８Ｃ１１重鎖及び軽鎖の可変領域を連結させて１本鎖抗体のＤＮＡフラグメントを形成した。８Ｃ１１重鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを８ｃ１１ＨＦ１（５’−ｇｇＡＴＣＣＣＡＴＡＴｇＣＡｇｇＴＴＡＣＴＣＴｇＡＡＡｇＡｇ−３’）／８ｃ１１ＨＲ１（５’−ｇＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡｇＡＴＣＣｇＣＣＡＣＣＴＣＣＴｇＡｇｇＡｇＡＣｇｇＣｇＡＣＴｇＡ−３’）のプライマー対を用いて増幅し、そして８ｃ１１ＫＦ１（５’−ＡＴＣＴｇｇＡｇｇｇｇｇＴｇｇＴＡｇＣｇｇＴｇｇＡｇｇＣｇｇｇＡｇＴｇＡＣＡＴＣＣＡｇＡＴｇＡＣＴＣａｇ−３’）／８ｃ１１ＫＲ１（５’−ｇＴＣｇＡＣＣＣｇＴＴＴｇＡＴＴＴＣＣＡｇＣＴＴｇｇ−３’）のプライマー対を用いて８Ｃ１１軽鎖の可変領域のＤＮＡフラグメントを増幅した。これらの２個のフラグメントを各々回収し、そしてお互いのプライマー及び鋳型と同一のフラグメントを用いて新たなＰＣＲ系で１本鎖抗体の全長フラグメントを構築した。少しの得られた１本鎖抗体の全長フラグメントをプライマー対８Ｃ１１ＨＦ１／８Ｃ１１ＫＲ１を用いてさらに増幅した。１本鎖抗体フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化した。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩを用いて得られたプラスミドから１本鎖抗体フラグメントを消化し、そして回収し、次いで同一酵素で消化した原核細胞性発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７にクローン化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６株を用いて上記の方法と類似の方法で１本鎖抗体を発現させた。発現されたタンパク質は不溶性封入体の形態で見出された。ソニケーションからの沈殿物を上記の方法と同一の方法により精製した。１本鎖抗体は主に８Ｍ尿素に溶解しているのが見出された。１ｘＰＢＳに対して徐々に透析することにより８Ｍ尿素に溶解した１本鎖抗体を復元した。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心することによりペレットを捨てた。得られた１本鎖抗体溶液の活性を検出した。

競合ＥＬＩＳＡを用いて予め精製した８Ｃ１１１本鎖抗体の活性を検出した。１：１６００００希釈し、そしてＢＳＡで遮断した精製ＮＥ２で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。上記の１本鎖抗体溶液５０μｌ及び１：１０００希釈したＨＲＰ標識８Ｃ１１モノクローナル抗体５０μｌを検出すべきサンプルウェルに加えた。１ｘＰＢＳ溶液５０μｌ及び１：１０００希釈したＨＲＰ標識８Ｃ１１モノクローナル抗体５０μｌを陰性対照として用いられるウェルに加え、そして未標識８Ｃ１１モノクローナル抗体５０μｌ及び１：１０００希釈したＨＲＰ標識８Ｃ１１モノクローナル抗体５０μｌを陽性対照として用いられるウェルに加えた。３検体ずつでアッセイを実施した。混合した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いでクロマトゲンＡ及びＢを加えた。３７℃で１５分間発色させた。反応を停止させ、そしてマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。結果的に、陰性対照の平均値は１．８５２であり、そして陽性対照の平均値は０．５４１であり、検出すべきサンプルウェルの平均値は０．１６２であった。その結果により、予め精製した８Ｃ１１１本鎖抗体は高い活性を有することが実証された。

実施例１９：モノクローナル抗体８Ｈ３Ｆａｂ遺伝子（軽鎖及び重鎖のＦｄフラグメント）の単離

上記の方法と同一の方法により半集密的なマウス起源の８Ｈ３のハイブリドーマ細胞１×１０７個から全ＲＮＡを抽出し、そして逆転写によりｃＤＮＡを合成した。同様に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）並びに３個の下流プライマーＭＦｄＲ１、ＭＦｄＲ２及びＭＫＣＲ１（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を用いて、そして鋳型として上記で合成した８Ｈ３ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより抗体のＦａｂフラグメント遺伝子を単離した。

カッパ鎖のＭｕＩｇｋＶＬ５’−ＡからＧの上流プライマーの７個のセット及び下流プライマーＭＫＣＲ１を用いて軽鎖遺伝子を単離した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇｋＶＬ５’−Ｇ２（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＧＴ（Ｃ／Ｔ）ＣＴ（Ｃ／Ｔ）ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ）ＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ−３’）／ＭＫＣＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５６℃で３５秒間、７２℃で５０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に、配列を８Ｈ３軽鎖配列と同定した。可変領域の配列を配列番号：１３に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：１４に示した。

ＩｇＧのＭｕＩｇＧＶＨ５’−ＡからＦの上流プライマーの６個のセット及び下流プライマーＭＦｄＲ１及びＭＦｄＲ２を用いて重鎖のＦｄフラグメント遺伝子を単離した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇＶＨ５’−Ｃ１（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣ（Ｃ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＣＴＧ−３’）／ＭＦｄＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５０℃で１分間、７２℃で５０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に、配列を８Ｈ３重鎖のＦｄフラグメントと同定し、そして可変領域の一部を配列番号：１５に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：１６に示した。

実施例２０：モノクローナル抗体１６Ｄ７Ｆａｂ遺伝子（軽鎖及び重鎖のＦｄフラグメント）の単離

上記の方法と同一の方法により半集密的なマウス起源の１６Ｄ７のハイブリドーマ細胞１×１０７個から全ＲＮＡを抽出し、そして逆転写によりｃＤＮＡを合成した。同様に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）並びに２個の下流プライマーＭＦｄＲ１及びＭＦｄＲ２（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を用いて、そして鋳型として上記で合成した１６Ｄ７ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより抗体のＦａｂフラグメント遺伝子を単離した。

カッパ鎖のＭｕＩｇｋＶＬ５’−ＡからＧの上流プライマーの７個のセット及び下流プライマーＭＫＣＲ１を用いて軽鎖遺伝子を単離した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇｋＶＬ５’−Ｆ４（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ−３’）／ＭＫＣＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５７℃で３５秒間、７２℃で５０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に配列を１６Ｄ７軽鎖配列と同定し、そして可変領域配列の一部を配列番号：１７に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：１８に示した。

下流プライマーＭＦｄＲ１／ＭＦｄＲ２及び６個の上流プライマーの各々から成るプライマー対を用いて４７から５６℃でグラジエントＰＣＲ増幅を実施した。結果的に、約７００ｂｐの単一のＤＮＡフラグメントを以下の条件下でＭｕｌｇＶＨ５’−Ｅ２（５’−ＣＧＡＣＡＴＧＧ（Ａ／Ｇ）ＡＴＧＧＡ（Ｃ／Ｇ）Ｃ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＴＣＴＴＴ（Ａ／Ｃ）ＴＣＴ−３’）／ＭＦｄＲ１のプライマー対を用いて増幅した。９４℃で５分間、続いて９４℃で４０秒間、５４℃で１分間、７２℃で５０秒間の３５サイクル、及び最後に７２℃で１５分間。フラグメントを回収し、そしてｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてシークエンシングした（Ｂｉｏａｓｉａ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）。ＢＬＡＳＴアラインメントの後に、配列を１６Ｄ７重鎖のＦｄフラグメントと同定し、そして可変領域配列の一部を配列番号：１９に示し、そしてその推定アミノ酸配列を配列番号：２０に示した。

実施例２１：ＣＨＯ細胞における８Ｃ１１ヒト−マウスキメラ抗体の発現及び活性アッセイ

８Ｃ１１マウス抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域遺伝子を各々ヒト抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域遺伝子と融合させた。ＣＨＯ細胞で発現させた後、全ヒト−マウスキメラ抗体を構築し、そして細胞培養の上清に分泌させることができる。ここで用いた発現ベクターは２つの型の哺乳動物発現ベクターのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇ（選択マーカーとしてヒグロマイシン）及びｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｅｏ（選択マーカーとしてネオマイシン）であった。

４つのプライマーを合成した。プライマー対としてｈＫＣＦ（５’−ＣＴＣｇＡｇＡＣＴｇＴｇｇＣＴｇＣＡＣＣＡＴＣ−３’）／ｈＫＣＲ（５’−ｇｇＡＴＣＣＴＣＴＡｇＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴｇＴＴｇ−３’）及び鋳型としてプラスミドｐＡＧ４６２２を用いてＰＣＲによりヒト・カッパ軽鎖の定常領域遺伝子を増幅し、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化した。得られたプラスミドからＸｈｏＩ／ＸｂａＩを用いて切断し、そして回収したフラグメントを、同一酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｅｏベクターにクローン化してプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋを作製した。プライマー対としてｈＨＣＦ（５’−ＣＴＣｇＡｇｇＣＡＡｇＣＴＴＣＡＡｇｇｇＣＣ−３’）／ｈＨＣＲ（５’−ｇｇＡＴＣＣＴＣＴＡｇＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣｇｇＡｇＡＣＡｇｇ−３’）及び鋳型としてプラスミドｐＡＨ４６０４を用いてＰＣＲによりヒト・ガンマ１重鎖の定常領域遺伝子を増幅し、ｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化した。得られたプラスミドからＸｈｏＩ／ＸｂａＩを用いて切断し、そして回収したフラグメントを、同一酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｇベクターにクローン化してプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨを作製した。

プライマー対として８Ｃ１１ｈＶｋＦ（５’−ｇＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧ−３’）／８Ｃ１１ｈＶｋＲ（５’−ＣＴＣｇＡｇＣＣｇＴＴＴｇＡＴＴＴＣＣＡｇＣＴＴｇｇ−３’）及び鋳型として実施例１７から得られた８Ｃ１１軽鎖遺伝子を含有するｐＭＤ１８−Ｔベクターを用いてＰＣＲにより、シグナルペプチドを有する８Ｃ１１軽鎖の可変領域を増幅した。このＤＮＡフラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてさらに得られたプラスミドからＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを用いて切断し、次いでプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋの同一部位にクローン化してヒト−マウスキメラ軽鎖を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ８Ｃを作製した。

プライマー対として８Ｃ１１ｈＶｈＦ（５’−ｇＡＡＴＴＣＡｇＡＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＴＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣ−３’）／８Ｃ１１ｈＶｈＲ（５’−ＣＴＣｇＡｇＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＧ−３’）及び鋳型として実施例１７から得られた８Ｃ１１重鎖Ｆｄ遺伝子を含有するｐＭＤ１８−Ｔベクターを用いてＰＣＲにより、シグナルペプチドを有する８Ｃ１１重鎖の可変領域を増幅した。このＤＮＡフラグメントをｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローン化し、そしてさらに得られたプラスミドからＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩを用いて切断し、次いでＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨにクローン化してヒト−マウスキメラ重鎖を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ８Ｃを作製した。

これらの２つのプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ａｋ８Ｃ及びｐｃＤＮＡ３．１−ＡＨ８Ｃをリポソーム媒介トランスフェクションにより哺乳動物ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。リポソームはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬であった。トランスフェクトされた細胞を２４ウェルプレートで２日間培養し、そして次に６ウェルプレートにウェルあたり１００セル未満で移した。選択のためにヒグロマイシン及びネオマイシンを同時に培養培地に添加した。２週後、培養上清及び一部の細胞を収集した。凍結及び解凍を４回繰り返すことにより細胞を破壊し、そして遠心により細胞上清を収集した。間接ＥＬＩＳＡを用いて陰性対照と同一の処置によりトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞での上清の活性を検出した。

９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを抗原ＮＥ２でコーティングし、そしてＢＳＡで遮断した。サンプル１００μｌを３検体ずつ、及び陰性対照に加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、各ウェルに１：５０００希釈のＨＲＰ標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体１００μｌを添加した。プレートを３７℃で半時間インキュベートした。洗浄後、クロマトゲンＡ及びＢを添加し、そして３７℃で１５分間発色させた。反応を停止させて、マイクロプレートリーダーにより吸光度を測定した。その結果により、陰性対照としての細胞の培養上清の平均値は０．０９３であり、一方８Ｃ１１ヒト−マウスキメラ抗体を発現する細胞の培養上清の平均値は２．３４６であることが示された。陰性対照として破壊された細胞の上清の平均値は０．１３２であり、一方８Ｃ１１ヒト−マウスキメラ抗体を発現する破壊された細胞の上清の平均値は３．５３４であった。

上記の結果により、ＣＨＯ細胞により発現される８Ｃ１１ヒト−マウスキメラ抗体が細胞内で正確に構築され、高い活性を伴って細胞から分泌されうることが実証された。

６．モノクローナル抗体により認識されるエピトープを有する組換えポリペプチドＨＥＶＯＲＦ２の同定、及び本発明による抗原決定基性質を有する（特にウイルス様粒子を構築する性質を有する）ポリペプチド又はポリペプチドアナログの調製

実施例２２：ＮＥ２様組換えポリペプチドＨＥＶ−ＯＲＦ２及びモノクローナル抗体の相互作用

ＨＥＶ−ＯＲＦ２ポリペプチド（表１３に列挙）をｐＴＯ−Ｔ７ベクターにクローン化し、そして実施例１の方法に従って発現及び精製した。実施例２の方法に従って、ＨＲＰ標識モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより、発現された組換えＨＥＶ−ＯＲＦ２ポリペプチドを検出した。

精製されたポリペプチドの各々１０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を繰り返し、そしてゆっくりとニトロセルロース膜にドットし、そして空気乾燥した。５％の脱脂粉乳で室温で１．５時間遮断した後、モノクローナル抗体（モノクローナルＢリンパ球により分泌された細胞上清を５％の脱脂粉乳で１：１００希釈）を加え、そして室温で１時間反応を続けさせた。次いでＴＮＴ（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて膜を３回（５分間隔）洗浄した。ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（ＪＩＮＧＭＥＩＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社により製造、５％の脱脂粉乳で１：１０００希釈）を加え、そして室温で１時間反応させた。３回（５分間隔）洗浄した後、ＴＮＴ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｃ４０Ｈ３０Ｎ１０Ｏ６Ｃｌ２／Ｃ８Ｈ６ＢｒＣｌＮＯ４Ｐ．Ｃ７Ｈ９Ｎ）を加えて発色させた。発色したドットをＵＶＩゲル撮像系でスキャンし、そして灰色度の値に変換し、これを＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、＋／−の５つの陽性段階及び−の陰性段階に分ける。結果を表１３に列挙し、これによりポリペプチド１４８Ｃ（４５９−６０３ＰＰＲ）及び２０８Ｎ（３９４−６０１）がモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８と反応することが示された。従ってモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８により認識されるエピトープ領域は上記の２つのポリペプチドの重複領域４５９−６０１に位置すると推測された。モノクローナル抗体１６Ｄ７により認識されるエピトープ領域の位置決定を行なうために、その他のポリペプチド９７Ｃ（アミノ酸５６４〜アミノ酸６６０）、１６１（アミノ酸４９９〜アミノ酸６６０）及び１７０Ｐ（アミノ酸３４５〜アミノ酸５１５）をモノクローナル抗体１６Ｄ７との活性に関して試験した。その結果により、９７Ｃは１６Ｄ７と反応しないが、一方１６１及び１７０Ｐは１６Ｄ７と反応することが示された。この結果により、１６Ｄ７により認識されるエピトープ領域はＨＥＶ−ＯＲＦ２のアミノ酸４９９〜５１５に位置することが示された。モノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８と優れた抗原性を有するポリペプチドはＳＤＳ−ＰＡＧＥでたいてい二量体として存在し、これは二量体の形成が３つのモノクローナル抗体に関して適切なフォールディング及び／又は完全なエピトープの露出で有利に働くことを示唆した。

Ｐ／Ｎ比、すなわち陰性対照ウェルのＯＤ値に対するサンプルウェルのＯＤ値の比率（陰性対照ウェルのＯＤ値が０．０５未満である場合、次いで０．０５を陰性ＯＤ値に指定する）を算出することにより、ポリペプチド及びモノクローナル抗体の相互作用を−から＋＋＋＋までの階級に分けることができる。そしてランクを以下のように定義する。−（すなわち陰性）、Ｐ／Ｎ＜３；＋／−、３＜Ｐ／Ｎ＜６；＋、６＜Ｐ／Ｎ＜１０；＋＋、１０＜Ｐ／Ｎ＜３０；＋＋＋、３０＜Ｐ／Ｎ＜５０；＋＋＋＋、Ｐ／Ｎ＞５０。

実施例２３：ＮＥ２ポリペプチドの二量化領域における変異から誘導された変異体の発現及びモノクローナル抗体に対するその抗原性

ＮＥ２は単量体形態よりも二量体形態でより強力にモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８により認識された。二量体は尿素８モル／ｌ処置で完全に単量体に解離し、そして次にモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対する抗原性が著しく低減した。この現象によりモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８により認識されるＮＥ２のエピトープの適切なフォールディング及び／又は完全な露出がＮＥ２ポリペプチドのホモ二量化によく相関し、そしてかかるホモ二量化は単量体の疎水性相互作用に依存しうることが示唆された。

Ｃ末端をアミノ酸６００に切断することによりＮＥ２から誘導された変異体を二量化することができ、そしてモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対する抗原性は有意に低減されていた。これはアミノ酸６００近くに位置する領域がＮＥ２及びそのアナログの二量化に重要な役割を果たすことを示した。この推定を確認するために、一連の部位特異的変異がアミノ酸６００領域に導入した。

ＰＣＲ及びクローニング技術によりＮＥ２ポリペプチドに部位特異的変異を行い、そして二量化に重要な部位を二量化の存在を観察することにより同定した。最後に、アミノ酸６０１のＬｅｕをＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ及びＣｙｓの各々で置換した。方法を以下に詳細に記載する。

アミノ酸６０１変異したＣ末端を得るために、鋳型としてＮＥ２、上流プライマーとして６０１ＬＩＦＰ（ＬｅｕをＩｌｅに変異させたプライマー）、及び下流プライマーとしてＨＥＲＰを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。そして鋳型としてＮＥ２、上流プライマーとしてＨＥＦＰ、及び下流プライマーとして回収した変異したＣ末端フラグメント用いて２次ＰＣＲを実施した。増幅した全長ＮＥ２変異体を６０１ＬＩと称し、次いでこれをベクターｐＭＤ１８−Ｔに連結し、そして次にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、陽性クローンｐＭＤ１８−Ｔ−６０１ＬＩを同定した。このクローンをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化して目的の６０１ＬＩ遺伝子が得られ、これを次にＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴＯ−Ｔ７にクローン化した。正確に挿入されたと同定されたクローンはｐＴＯ−Ｔ７−６０１ＬＩであり、そして発現されたタンパク質は６０１ＬＩであった。

同様に、その他の変異体６０１ＬＰ、６０１ＬＥ、６０１ＬＧ、６０１ＬＤ、６０１ＬＨ、６０１ＬＫ、６０１ＬＱ及び６０１ＬＣが得られた。変異したタンパク質の特質を図１０に示した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ポリペプチド６０１ＬＩ、６０１ＬＰ、６０１ＬＧ及び６０１ＬＣは二量体を形成することが見出されたが、ポリペプチド６０１ＬＥ、６０１ＬＤ、６０１ＬＨ、６０１ＬＫ及び６０１ＫＱは単量体として存在した（表１４及び図１１）。その結果により、アミノ酸６０１が無極性アミノ酸であったポリペプチドは二量体を形成でき、そしてモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対して良好な抗原性を有し、そしてアミノ酸６０１が極性アミノ酸であったポリペプチドは二量化できず、そしてモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対する抗原性が低減したことが示された。７個の連続した無極性アミノ酸はアミノ酸５９７〜アミノ酸６０３（アミノ酸６０１を含む）に位置することが見出され、これはＮＥ２ポリペプチドの二量化に重要な役割を果たすことが推測された。この推測を確認するために、ＮＥ２のアミノ酸５９６〜アミノ酸６０３に位置するアミノ酸を無極性アミノ酸Ｅと個々に置換し、変異体５９６ＳＥ、５９７ＡＥ、５９８ＶＥ、５９９ＡＥ、６００ＶＥ、６０２ＡＥ及び６０３ＰＥが得られた。これらの変異体の中で５９６ＳＥ、６００ＶＥ及び６０３ＰＥは二量体を形成することができたが、５９７ＡＥ、５９８ＶＥ、５９９ＡＥ及び６０２ＡＥは単量体で存在した（表１４）。二量化された変異体はモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対して強力な抗原性を維持し、一方単量体で存在する変異体は明らかに抗原性が低減されている。アミノ酸６００のＶのＡでの置換を除いて、アミノ酸５９７〜アミノ酸６０２領域における無極性アミノ酸の極性アミノ酸による置換体は二量化を抑制し、そして従って８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対する抗原性を低減した。加えて、アミノ酸５９６（Ｓ）（アミノ酸５９７〜アミノ酸６０２領域の外側）に対する変異は二量化及び抗原性の影響がなかった。

これらの結果により、ＮＥ２及びそのアナログの無極性領域アミノ酸５９７〜アミノ酸６０３が２量化のみならず、適切なフォールディング及び／又はモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８により認識されるそのエピトープの露出においても重要な役割を果たすことが強く示唆された。

実施例２４：ポリペプチド２３９のクローン構築

実施例１で記載したポリペプチドＮＥ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により、このポリペプチドは溶液中で数種のホモ重合体を自然発生的に形成することができる。ポリペプチドＮＥ２の重合の手順はＨＥＶカプシドの自己組織化をある程度擬似し、そして二量体がＨＥＶ粒子の基本的構造単位を提示しうる。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＨＥＶのＶＬＰを発現するために、プライマー伸長合成によりｐＴＯ−Ｔ７−ＮＥ２のＮＥ２のＮ末端をアミノ酸３６８まで伸長させ、クローンｐＴＯ−Ｔ７−２３９が得られる。ｐＴＯ−Ｔ７−２３９は配列番号：２１のアミノ酸配列の組換えポリペプチドを発現することができる。

鋳型としてｐＴＯ−Ｔ７−ＮＥ２を用いてＰＣＲを実施して、ポリペプチド２３９（アミノ酸３６８〜アミノ酸６０３ＰＰＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を得た。プライマーは以下のとおりであった。３９０ＦＰ：５’−ＣＡＴＡＴＧＴＣＧＧＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＣＴＣＧＣ−３’３８０ＦＰ：５’−ＣＡＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＧＧＧＴＧＧＴＣ−３’３６８ＦＰ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＧＧＣＧＧＴＣＴＡＣＣＣＡ−３’ＥＨＥＲＰ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＴ−３’

鋳型としてｐＴＯ−Ｔ７−ＮＥ２及び以下の２つのプライマー：順行プライマー３９０ＦＰ（ＮｄｅＩ制限部位が５’に導入されている）及び逆行プライマーＥＨＥＲＰ（ＥｃｏＲＩ部位が５’に導入されている）を用いて１次ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。反応条件は以下のとおりであった。９４℃で５分間、次いで９４℃で５０秒間、５７℃で５０秒間及び７２℃で１分間の３０サイクル、７２℃で１０分間の伸長。約８１０ｂｐの特異的ＤＮＡフラグメント、すなわちアミノ酸３９０〜アミノ酸６０３ＰＰＲポリペプチドをコードするＤＮＡが得られた。このＰＣＲ産物をさらにベクターｐＭＤ１８−Ｔに連結させ、そして次にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの消化により目的の遺伝子が挿入された陽性クローンｐＭＤ１８−Ｔ−３９０Ｆを同定した。鋳型としてｐＭＤ１８−Ｔ−３９０Ｆを、順行プライマー３８０ＦＰ（ＮｄｅＩ部位を５’に導入した）及び逆行プライマーＥＨＥＲＰと一緒に用いて２次ＰＣＲを実施した。得られたフラグメントは約８４０ｂｐの長さであり、これはＨＥＶ−ＯＲＦ２のアミノ酸３８０〜アミノ酸６６０に位置するポリペプチドをコードした。同様にＰＣＲ産物をベクターｐＭＤ１８−Ｔに連結させ、そして次にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの消化により陽性クローンｐＭＤ１８−Ｔ−３８０Ｆを同定した。類似の手順を繰り返した。それにより、順行プライマー３６８ＦＰ及び逆行プライマーＥＨＥＲＰを用いるＰＣＲにより遺伝子２３９（アミノ酸３６８〜６０３ＰＰＲ）が得られた。増幅した遺伝子２３９をベクターｐＭＤ１８−Ｔに連結させ、そして次に陽性クローンｐＭＤ１８−Ｔ−２３９をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの消化により同定した。ｐＭＤ１８−Ｔ−２３９をＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、目的の遺伝子２３９が得られ、これを次いでＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＴＯ−Ｔ７にクローン化した。正確に挿入された陽性クローンｐＴＯ−Ｔ７−２３９を同定した。

実施例２５：ポリペプチド２３９の発現及び精製

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６をｐＴＯ−Ｔ７−２３９で形質転換し、そして培養物のＯＤが約１．０に達するまでチューブをインキュベートした。次いでさらに発酵させるための種として細菌を使用した。細菌１００μｌをＬＢ培養培地５００ｍｌに加えた。３７℃で９時間インキュベートした後、０．５ＭＩＰＴＧ３００μｌを加え、２３９の発現を誘導した。混合物をさらに４時間インキュベートした。発現されたポリペプチド２３９は封入体として存在することが見出された。次いで封入体を以下のとおり洗浄した。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養培地を８５００ｒｐｍで１０分間遠心し、そしてペレットを収集した。培養物１０００ｍｌから得られたペレットを溶解バッファー５０ｍｌに再懸濁し、そして細胞を超音波装置でソニケートした。ソニケートした混合物を遠心し、そして次にペレットを２％のＴｒｉｔｏｎ５０ｍｌに再懸濁し、これを次に１時間振盪した。混合物を再度遠心し、そしてペレットをバッファーＩ溶液５０ｍｌに再懸濁し、これを次に５分間ソニケートした。混合物を遠心した。次いでペレットを２％のＴｒｉｔｏｎ５０ｍｌに再懸濁し、そして１時間振盪した。その後、混合物を遠心し、そしてペレットをバッファーＩ溶液５０ｍｌに再懸濁した。その後混合物を遠心した。ペレットを２Ｍ尿素含有バッファーＩ溶液３０ｍｌに再懸濁し、１分間ソニケートし、そして３０分間攪拌した。混合物を遠心し、そして上清を収集した。ペレットを４Ｍ尿素含有バッファーＩ溶液３０ｍｌに再懸濁し、１分間ソニケートし、そして３０分間攪拌した。次いで混合物を遠心し、そして上清を収集した。ペレットを８Ｍ尿素含有バッファーＩ溶液２０ｍｌに再懸濁し、１分間ソニケートし、そして３０分間攪拌した。次いで混合物を遠心し、そして上清を収集した。最後にポリペプチド２３９が４Ｍ尿素含有バッファーＩ溶液に主に溶解していることが見出され、等電点電気泳動技術によりこれをさらに精製した。

上記の方法で用いた系は以下のとおりであった。ｐＩ８ＩｓｏＰｒｉｍｅマルチチャンバー等電点電気泳動ユニット（ＡｍｅｒｓｈａｎＰｈａｒｍａｃｉａｃｏｍｐａｎｙ）；固定したｐＨ膜：ｐＨ５．１０（Ｔ％：１０％、Ｃ％：８％）、ｐＨ５．２０（Ｔ％：５％、Ｃ％：８％）、ｐＨ５．２５（Ｔ％：５％、Ｃ％：８％）、ｐＨ５．３０（Ｔ％：５％、Ｃ％：８％）、ｐＨ５．３５（Ｔ％：５％、Ｃ％：８％）、ｐＨ５．４０（Ｔ％：１０％、Ｃ％：８％）；貯蔵溶液：超純水Ｈ２Ｏ中尿素４モル／ｌ；サンプル：尿素４モル／ｌに溶解した組換えポリペプチドを含有する変性溶液（３００ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ）；サンプルチャンバーをｐＨ５．２５からｐＨ５．３０にする。等電点電気泳動パラメーター：２００Ｖ２時間、５００Ｖ２時間、８００Ｖ２時間、３０００Ｖ６０時間。精製されたポリペプチドはｐＨ５．２５とｐＨ５．３０との間にあり、容量３００ｍｌで、そして２．５ｍｇ／ｍｌの濃度であった。銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで示されたように純度は９５％であった。このように得られたポリペプチド２３９を以下に記載するようにＨＰＬＣＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によりさらに精製した。

装置：ＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄＮｏｕｖｅａｕ１２５ＮＭＰ／１６６ＮＭＰＨＰＬＣ；カラム：ＴＳＫＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ２１．５ｍｍ×１５ｃｍ；バッファー：０．５モル／ｍｌ硫酸アンモニウム、尿素４モル／ｍｌ及びリン酸バッファー２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．２）；溶出バッファー：尿素４モル／ｍｌ、リン酸バッファー２０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．２）；流速：４ｍｌ／分；溶出様式：硫酸アンモニウム０．５〜０モル／ｍｌの連続グラジエントで１２０分間；検出波長：２８０ｎｍ；サンプル：２ｍｇ／ｍｌの濃度で等電点電気泳動により精製したポリペプチド２３９３６０ｍｌ；収集：クロマトグラフィーで１０５から１２０分後、高度に精製されたポリペプチド２３９６０ｍｌが４ｍｇ／ｍｌの濃度で得られ、そして純度は銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるように９８％以上であった。

接線流装置を用いる組換えポリペプチド２３９の再生

装置：ＴａｎｇｅｎｔｉａｌＦｌｏｗＤｅｖｉｃｅ系（ＰＡＬＬ社）；膜のカットオフ分子量：３０ｋＤ；作業時圧力：５ｐｓｉ；流速：５００ｍｌ／分；接線流速：１５ｍｌ／分；サンプル：４ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＨＰＬＣＨＩＣにより高度に精製されたポリペプチド２３９６０ｍｌ；再生バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４５）１２００ｍｌ；再生したサンプルの処理後：４℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで遠心し、３．９ｍｇ／ｍｌの濃度の再生されたポリペプチド６０ｍｌが得られた。

実施例２６：ポリペプチド２３９から自己組織化されたウイルス様粒子の特徴付け

サイズ排除ＨＰＬＣ：４Ｍ尿素／バッファーＩ中サンプル２３９をＰＢＳに対して透析し、次いでＢｅｃｋｍａｎＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄＮｏｕｖｅａｕ１２５ＮＭＰ／１６６ＮＭＰＨＰＬＣ装置のＴＳＫＧＥＬＳＷ３０００（２１．５ｍｍ×６０ｃｍ）カラムに負荷した。その結果により、ポリペプチド２３９の保持時間は２２．３分（保持容量：８９．０ｍｌ）であり、これはＴＳＫＧＳＷ３０００の上限に等しいことが示された。これは、ポリペプチド２３９の分子量が５００ｋＤ以上であることを示した。ＮＥ２の保持時間は３５．６分（保持容量：１４８．３ｍｌ）であり、これは溶液中でポリペプチド２３９が粒子を形成することを示した（図１２Ａ）。

透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いるＶＬＰの観察

再生されたポリペプチド２３９を炭素コーティングしたグリッドに吸収させ、２％のリンタングステン酸（ｐＨ７．０）で染色し、そしてＪＥＭ−１００ＣＸＩＩ電子顕微鏡により約×１０００００の倍率で試験した。図１２Ｂの写真により多くの可視性のウイルス様粒子が示された。

原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いるＶＬＰの観察

ＮａｎｏＩＩＩＡ原子間力顕微鏡（ＤＩ社、米国）で解像度１ｎｍを有するプローブを用いて分析を実施した。再生されたポリペプチド２３９をＰＢＳ（ｐＨ７．４５）で１：１０に希釈し、ポリスチレンの表面にコーディングし、そして次にＡＦＭによりスキャン面積１ｍｍ２で分析した。図１３の写真により多くの可視性ウイルス様粒子が示された。

動的光散乱を用いるＶＬＰの分析

ＤｙｎａＰｒｏＭＳ／Ｘ動的光散乱装置（熱調節装置を含む）で分析を実施し、用いたアルゴリズムは制御アルゴリズムであった。ポリペプチド２３９を４℃で１５分間遠心（２００００ｇ）し、そして次に分析した。その結果により、ポリペプチド２３９の水和分子の動的半径は２４．１６ｎｍであることが示された（図１４）。

実施例２７：組換えポリペプチド２３９の抗原性

抗ＨＥＶモノクローナル抗体に対する組換えポリペプチド２３９の抗原性

実施例４の方法に従って、精製したポリペプチド２３９をモノクローナル抗体と共にウェスタンブロットした。その結果はポリペプチドＮＥ２の結果に類似した、すなわちモノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８はＮＥ２の単量体とよりもポリペプチド２３９の多量体とより強力に相互作用し、対照的にモノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７は２３９の多量体及びＮＥ２の単量体と同等に相互作用した。煮沸後、ＮＥ２はすべて単量体に解離し、そしてモノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７に対する抗原性は依然変化しないが、モノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８に対する抗原性は有意に低下した。これらの結果により、モノクローナル抗体１５Ｂ２及び１６Ｄ７により認識される２３９のエピトープは直線状エピトープであり、一方モノクローナル抗体１Ｆ６、２Ｃ９、７Ｅ８、８Ｃ１１、８Ｈ３及び１３Ｄ８により認識されるエピトープは立体構造依存性エピトープであることが示唆された。これらの立体構造依存性エピトープは二量体形態によく露出されるが、単量体にはよく露出されない。

ＨＥＶ患者の急性相血清及び回復期血清に対するポリペプチド２３９の抗原性

実施例４の方法に従って、精製したポリペプチド２３９をＨＥＶ患者の急性相血清の５個のサンプル、回復期血清の５個のサンプル及び正常ヒト血清の２個のサンプルでウェスタンブロットした。結果（図１５）により、ポリペプチド２３９が急性相血清で明らかな活性を有し、さらに二量体形態の活性は単量体形態の活性よりも強力であることが示され、二量体はまたＨＥＶ患者の回復期血清の３個のサンプルで高い活性を示したが、ポリペプチド２３９の双方の形態は正常ヒト血清に対する反応性を示さない。

実施例２８：ＨＥＶ−ＯＲＦ２の特定のポリペプチドを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）

ＮＥ２の一連のＮ末端伸長変異をプライマー伸長合成によりｐＴＯ−Ｔ７ベクターにクローン化した。これらのうち、単量体と二量体の比率及び重合をＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較した。加えて、実施例２５の方法に従って、その保持時間に関してサイズ排除ＨＰＬＣで粒子形成を決定した。

その結果（表１５）により、ＮＥ２のアミノ酸３６８までのＮ末端伸長の結果であるポリペプチド２３９（アミノ酸３６８〜６０３）は粒子に自己組織化できるが、一方その他のＮ末端伸長変異体、すなわち２１７（アミノ酸３９０〜６０３）、２２７（アミノ酸３８０〜６０３）及びＮＥ２はすべて自己組織化できないことが示された。それでアミノ酸３６８〜３８０領域は粒子の自己組織化に関連する。さらに伸長させてポリペプチド３６９、３７０、３７１、３７２、３７８及び３７９を生成した。そのうち、２３７Ｃ（アミノ酸３７０〜６０３）のみが粒子に自己組織化することが見出された。さらにアミノ酸３４５に伸長するために、変異体は依然粒子に自己組織化することができる。

アミノ酸３６８、アミノ酸３７０、アミノ酸３７２、アミノ酸３７５及びアミノ酸３９５のＬｅｕの部位特異的変異体はすべて粒子の安定性に関して逆効果を有し（表１６）、これはアミノ酸３６８近くの構造が安定な粒子の形成に重要であることを示した。

特定のポリペプチドの別の一連のＣ末端変異体、すなわち２９２、２０８、２０９、２４２Ｐ、２０２Ｐ、１７２Ｐ及び１７０Ｐ（表１７）は粒子に自己組織化することが見出され、そしてそのＣ末端がアミノ酸６０３の上流に位置したポリペプチドは二量体を形成できない。その結果により、二量体の形成は粒子の構築に関連せず、そして２つのメカニズムが異なるドメインにより変調されうることが示された。

実施例２９：ウイルス様粒子に自己組織化できたＨＥＶ−ＯＲＦ２ポリペプチドを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のモノクローナル抗体に対する抗原性

７．モノクローナル抗体により同定されるエピトープを擬似するペプチドの選択

実施例３０：モノクローナル抗体により同定されるエピトープを擬似するペプチドの選択

７−ペプチドファージ・ディスプレイ・ライブラリー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）を用いてモノクローナル抗体８Ｃ１１、８Ｈ３、１３Ｄ８又は１６Ｄ７により認識されうる７−ペプチドをスクリーニングする。ファージ・ディスプレイ・ライブラリーのユーザーマニュアルに記載されるようにスクリーニング手順を実施した。簡単には９６ウェルマイクロタイタープレート（１５０μＬ／ウェル）をモノクローナル抗体（２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．５）中１００μｇ／ｍｌ）でコーティングし、そして３７℃で一晩インキュベートした。コーティング溶液を捨てる。プレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、乾燥し、次いで遮断バッファー（０．１ＭＮａＨＣＯ３ｐＨ８．６、ＢＳＡ５ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。遮断バッファーを捨てる。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、そして乾燥した。別個に、２×１０１１ファージをＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）に最終容量１００μｌまで希釈した。次いで希釈したファージ溶液を、コーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（１００μＬ／ウェル）に移し、そして室温で１時間放置した。ファージ溶液を捨て、そしてしっかりとはたいて残留溶液を除去する。ウェルをＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で１０回洗浄し、そしてはたいて残留溶液を除去した。０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．ＢＳＡ２、１ｍｇ／ｍｌ含有）１００μｌと共に室温で１０分間インキュベートすることにより結合したファージを溶出した。次いで溶液をマイクロ遠心チューブに配管し、そして１モル／ｌＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和した。１μｌ溶液を取り、ファージの力価測定を行なう。残りの溶液を成長相の初期段階でＥＲ２７３８２００ｍｌに加え、そして振盪しながら３７℃で４．５時間インキュベートした。培養物を５０ｍｌ遠心チューブに移し、そして１００００ｇで１０分間回転させた。上部上清の８０％を収集し、１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ−８０００、２．５ＭＮａＣｌ）を加え、４℃で一晩放置した。次いで混合物を４℃で１５分間回転させた（１００００ｇ）。ペレットをＰＢＳ１ｍｌで再懸濁し、そして４℃で５分間回転させた。上清を取り出し、そして１／６容量のＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加え、４℃で１時間放置した。次いで混合物を４℃で１５分間回転させた（１００００ｇ）。上清を捨て、そしてペレットをＰＢＳ２００μｌに懸濁し、そして４℃で保存した。スクリーニングの別のサイクルのために上記の手順を繰り返す。

一晩培養したＥＲ２７３８宿主をＬＢ培養培地で１：１００希釈した。希釈した培養物をチューブ（１ｍｌ／チューブ）に分配する。３ラウンドのスクリーニングの後、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌ培養プレート上の青色プラークである１０個のクローンを選択し、そして上記の希釈した培養物を含有するチューブに移し、そして３７℃で４．５時間培養した。培養物を１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移す。Ｍ１３ミニキット（ＳｈａｎｇｈａｉＨｕａｓｈｕｎＢｉｏｔｅｃｈＬｔｄ）の取扱説明書に従って、１本鎖ＤＮＡを抽出し、そして次にＳｈａｎｇｈａｉＢｏｙａＬｔｄによりシークエンシングし、そして７−ペプチド挿入の結果である配列を表１９に列挙した。

実施例３１：８Ｈ３及び８Ｃ１１により認識されるエピトープを擬似するペプチドの発現

ＨＢｃ遺伝子の分離及びクローニング

特異的プライマーＢｖＣＦ及びＢｖＣＲを設計した（表２０）。我々のチームで構築したプラスミドｐＴ−ＨＢｃ（ジェンバンク番号ＡＦ２３３２３５）を鋳型として用いて、ＰＣＲを用いてＨＢｃの全長遺伝子を増幅した。約５５０ｂｐの増幅したフラグメントをプラスミドｐＭＤ１８−Ｔにクローン化して組換えプラスミドｐＴ−Ｃ１８３が得られた。プラスミドｐＴ−Ｃ１８３の目的のフラグメントのシークエンシング結果により、これが５４９ｂｐの長さであり、そして１８３個のアミノ酸をコードする全長ＨＢＶコア遺伝子であることが示された。

プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔの構築

部位特異的変異法によりＨＢｃＭＩＲセクションのアミノ酸残基７９及び８０をリンカーと置換して、ＨＢｃ発現のための変異プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔを構築した。

鋳型としてｐＴ−Ｃ１８３及びプライマー対としてＢｖ８０Ｆ／Ｂｖ１４９Ｒ及びＢｖ７８Ｒ／ＢｖＣＦ（表２０）を用いて、ＨＢｃの３’末端及び５’末端配列を増幅し、そして産物Ｃ８０−１４９及びＣ１−７８を回収した。２個のフラグメントを新たなＰＣＲ反応（プライマーとしてＢｖ１４９Ｒ及びＢｖＣＦ）で混合し、変異体全長ＨＢｃ遺伝子（Ｃ１４９−ｍｕｔと称する）を増幅した。産物をＴベクターにクローン化して組換えプラスミドｐＴ−Ｃ１４９−ｍｕｔが得られた。ｐＣ１４３及びｐＣ−１４９に関して記載したように、Ｃ１４９−ｍｕｔフラグメントを発現ベクターｐＴＯ−Ｔ７にサブクローン化してＨＢｃ発現のための変異プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔが得られた。両側でリンカーを伴うＢａｍＨＩ制限部位をｐＣ１４９−ｍｕｔの配列に付加した。ｐＣ１４９−ｍｕｔのアミノ酸配列はＣ１−７８＋Ｇ４ＳＧ４Ｔ＋ＧＳ＋Ｇ４ＳＧ４＋Ｃ８１−１４９である。

変異ＨＢｃプラスミドに基づく擬似ペプチド発現プラスミドの構築

７−ペプチドのシークエンシング結果に従って、２個の長いプライマー（表２０の８Ｃ１１ＡＦＰ及び８Ｈ３ＡＦＰ）を設計して、リンカーとＢａｍＨＩ部位の間に７−ペプチド遺伝子を挿入した。ｐＣ１４９−ｍｕｔのＥｃｏＲＩ部位の近くの配列（表２０の１４９ＭｕｔＲＰ）に従って３’プライマーを設計した。７−ペプチドＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅し、そしてｐＭＤ−１８Ｔベクターにクローン化してプラスミドｐＴ−８Ｃ１１及びｐＴ−８Ｈ３が得られた。これらの２個のプラスミド及びｐＣ１４９−ｍｕｔベクターをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。ベクター及び標的フラグメントを回収し、そしてベクター及び標的フラグメントを一緒に連結させて２個の組換え発現プラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔ−８Ｃ１１及びｐＣ１４９−ｍｕｔ−８Ｈ３が得られた。発現されたタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：３０（Ｃ１４９−ｍｕｔ−８Ｃ１１）及び配列番号：３１（Ｃ１４９−ｍｕｔ−８Ｈ３）に示した。

擬似ペプチドを含有するプラスミドの発現

組換えプラスミドｐＣ１４９−ｍｕｔ−８Ｃ１１又はｐＣ１４９−ｍｕｔ−８Ｈ３で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６株をＬＢ液体培地（Ｋａｎ含有）２ｍｌ中で培養した。攪拌器中３７℃でインキュベーションを行った。培養培地のＯＤ６００が約０．６に達したときに、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ミリモル／ｌで加え、そして３７℃で４時間インキュベーションを続けた。細胞培養物１ｍｌを１．５ｍｌチューブに移し、そして１２０００ｒｐｍで３０秒間回転させ、そして上下逆にして乾燥させた。細胞をＨ２Ｏ６０μｌに再懸濁し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷バッファー（３ｘ）３０μｌを加えた。混合物を１０分間沸騰浴し、そして１２０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用した。

擬似ペプチドの免疫学的活性の試験

上記の発現されたポリペプチドのライゼート上清３μｌをニトロセルロース膜にドットした。０．５％の脱脂粉乳含有遮断溶液を０．１ｍｌ／ｃｍ２で加え、そして室温で２時間振盪した。５％の脱脂粉乳で１：１００に希釈したモノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３を０．１ｍｌ／ｃｍ２で加えた。反応物を室温で１時間振盪した。次いで膜をＴＮＴで３回洗浄した（各々１０分間）。ＡＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５％の脱脂粉乳で１：１００００希釈した）を０．１ｍｌ／ｃｍ２で加え、室温で１時間反応させた。ＴＮＴで３回洗浄した（各々１０分間）後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて発色させた。最後に、ＰＢＳを加えて反応を停止させた。その結果により、Ｃ１４９−ｍｕｔ−８Ｃ１１及びＣ１４９−ｍｕｔ−８Ｈ３が対応するモノクローナル抗体と明確に反応したことが示された。

８．モノクローナル抗体により認識される本発明のエピトープを含有するポリペプチドに基づく診断用キット及びこのポリペプチドの予防的適用

実施例３２：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でポリペプチドＮＥ２を標識する方法

以下の手順はＮＥ２２０ｍｇに基づいた：酢酸バッファー（０．２Ｍ、ｐＨ５．６）２ｍｌ中ＨＲＰ（ＢｉｏｚｙｍｅＲ／Ｚ＞３）４０ｍｇを溶解し、０．０６ＭＮａＩＯ４溶液２ｍｌを加え、得られた溶液を室温で２０分間維持し、０．１６Ｍエチレングリコール−ＮａＣｌ１０％の溶液２ｍｌを加え、室温で２０分間放置し、溶液を０．００１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）に対して一晩透析し、２Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）０．８ｍｌ及びＮＥ２抗原２０ｍｇを加え、そして攪拌しながら４℃で２時間反応させ、新たに調製したＮａＢＨ４溶液（５ｍｇ／ｍｌ）０．４ｍｌを加え、攪拌しながら４℃で２時間放置し、飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液９．２ｍｌを滴加し、４℃で３０分間攪拌し、次いで３５００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心し、上清を捨て、そしてペレットを０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）２ｍｌに溶解し、次いで０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）に対して２４時間透析し、次いでグリセロール２ｍｌを加え、次いで混合し、そして−２０℃で保存する。

実施例３３：抗ＨＥＶＩｇＧ抗体を検出するための診断用キット並びにその調製物及び操作

本発明の組換えポリペプチドＮＥ２を含有する診断用キットの調製手順は以下のとおりである。実施例１に記載するように組換えポリペプチドＮＥ２１ｍｇ／ｍｌを調製及び精製し、２０ｍＭＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で１：５００に希釈し、そして９６ウェルマイクロタイタープレートを１００μｌ／ウェルで３７℃で２時間コーティングし、続いて４℃で一晩インキュベートし、次いでプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄バッファー（ＮａＣｌ８．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ２．９ｇ、ＫＣｌ０．２ｇ及びＴｗｅｅｎ−２００．５ｍｌ、脱イオン水に加えて１ｌにし、そしてｐＨ７．４に調整する）で１回洗浄し、そして上下を逆にして乾燥させ、遮断溶液（ＰＢＳ中２％のスクロース、０．２％のカゼイン、２％のゼラチン）をウェルあたり２００μｌ加え、そして３７℃で２時間インキュベートし、ウェルをブロット乾燥し、そして真空下でそれを密閉して、次に４℃でそれを保存する。

このキットのアッセイ手順は以下のとおりである。サンプル希釈物（２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２））１００μｌを各ウェルに加え、次いで血清１０μｌを加え、そして３７℃で３０分間インキュベートし、ＴＥＣＡＮ洗浄器でＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄溶液を用いてマイクロプレートを５回（２０秒間隔）洗浄し、ブロット乾燥し、ＨＲＰ標識した２次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を適当な希釈で加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、再度５回（２０秒間隔）洗浄し、そしてブロット乾燥し、クロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢ（クロマトゲンＡ：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ１３．４２ｇ、クエン酸４．２ｇ及びＨ２Ｏ２０．３ｇ、７００ｍｌまで脱イオン水を加える、クロマトゲンＢ：ＴＭＢ０．２ｇ、ＤＭＦ２０ｍｌ、７００ｍｌまで脱イオン水を加える）を１滴加え、そして３７℃で１０分間インキュベートし、停止溶液（２ＭＨ２ＳＯ４）１滴で反応を終止させ、そしてＴＥＣＡＮリーダー（ＳｕｎｒｉｓｅＲｅｍｏｔｅ／ＴｏｕｃｈＳｃｒｅｅｎ）で各ウェルの吸光度を４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で測定する。カットオフ値は陰性対照のＯＤ値プラス０．１６と考えられる。ＯＤ値がカットオフ値よりも大きい場合、その結果は陽性と見なされ、一方ＯＤ値がカットオフ値よりも小さい場合、その結果は陰性である。

実施例３４：抗ＨＥＶＩｇＭ抗体を検出するためのμ鎖捕捉ＥＬＩＳＡキット（Ｅ２−ＩｇＭ）並びにその調製物及び操作

前記キットの調製手順は以下のとおりである。実施例３２に記載するようにＮＥ２−ＨＲＰを１：１０００に希釈し、ヤギ抗ヒトμ鎖（ＤＡＫＯ）（０．０５ＭＣＢで１：１０００）を各ウェルに１００μｌ加え、３７℃で２時間、次いで４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳＴ洗浄バッファー（ｐＨ７．４）でマイクロプレートを１回洗浄し、遮断バッファー２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートすることにより各ウェルを遮断し、遮断したウェルをブロット乾燥し、そして真空下でそれを密閉し、次いで４℃でそれを保存する。

このキットのアッセイ手順は以下のとおりである。サンプル希釈物（２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２））１００μｌを各ウェルに加え、そして試験すべき血清１０μｌを加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ洗浄溶液で５回マイクロプレートを洗浄し、ブロット乾燥し、そして作業中のＮＥ２−ＨＲＰ（１：１０００、実施例３２のように調製）１００μｌを加え、次いで３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで再度５回洗浄し、そしてブロット乾燥し、クロマトゲンを加え、そして３７℃で１０分間インキュベートし、停止溶液１滴で反応を停止させ、そしてＯＤ４５０／６２０ｎｍ値を読む。カットオフ値は陰性対照のＯＤ値プラス０．２６と考えられる。ＯＤ値がカットオフ値よりも小さい場合、標本は非反応性であると考えられ、そうでない場合は反応性である。

実施例３５：ＨＥＶ抗原の検出を意図したサンドウィッチＥＬＩＳＡキット並びにその調製及び操作

前記キットの調製手順は以下のとおりである。精製した本発明のモノクローナル抗体８Ｃ１１を２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、そしてその希釈物を各ウェルに１００μｌ加え、３７℃で一晩インキュベートし、次いでマイクロプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）２００μｌと共に３７℃で２時間インキュベートすることにより各ウェルを遮断する。

このキットのアッセイ手順は以下のとおりである。血清又はＦＢＳで調製した便標本の２０％の懸濁液５０μｌを加え、次いで２０％のＦＢＳで希釈した８Ｃ１１−ＨＲＰ５０μｌを加え、それを穏やかに混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートし、マイクロプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、そしてブロット乾燥し、クロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢを各５０μｌ加え、そして３７℃で１５分間インキュベートし、停止溶液５０μｌで反応を終止させ、そして各ウェルに関してＯＤ４５０／６２０ｎｍ値を測定する（ＰＢＳＴ、クロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢはＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈａｒｍａｃｙｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅＣｏ．，Ｌｔｄより購入）。カットオフ値は陰性対照のＯＤ値プラス０．１２と考えられる。ＯＤ値がカットオフ値よりも小さい場合、標本は非反応性であると考えられ、そうでない場合は反応性である。

実施例３６：本発明のＥ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡキット及びＥ２−ＩｇＭＥＬＩＳＡキットを用いて血清を診断するための実施例

５人のＥ型肝炎の患者の血清及び４０人の陰性血清におけるＥ２−ＩｇＭ及びＥ２−ＩｇＧの検出

５人のＥ型肝炎の患者の血清及び４０人の陰性血清をＥ２−ＩｇＭ及びＥ２−ＩｇＧに関して試験した。５人のＥ型肝炎の患者の血清は１．０を超え、そして陰性ＯＤ値はすべて０．１以下であった。

ＨＥＶでの感染後のアカゲザル血清における異なる抗ＨＥＶ抗体の動態変化

表２０に記載するように、８６匹のアカゲザルをＨＥＶ陽性糞便の懸濁液によりウイルスを投与し、そして糞便中ウイルス排泄が感染したアカゲザルの９８．４％で検出された。ＧＬ−ＩｇＧに関する応答率（ＧＥＮＥＬＡＢＳＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳＨＥＶＩｇＧＥＬＩＳＡによりＩｇＧ抗体を検出することができる）は７０．９％であった。ＧＬ−ＩｇＧセロコンバージョンが感染後３週と１４週の間（平均は５週）で起こり、半分以上の動物で肝炎の発病よりも０．５から５週（平均は約３週）遅かった。異なるサルでＧＬ−ＩｇＧが１週から６９週を超えるときまで持続した（７５％のサルで１７週よりも短い）。ＧＬ−ＩｇＧは２５匹のサルで実験期間中検出されず、そのうち１１匹のサルは明らかにＡＬＴ異常及び急性肝炎の徴候があった。Ｅ２−ＩｇＭセロコンバージョンが感染後１週と８週の間（平均は４週）で８５匹のサルに起こり（応答率９８．８％）、そして７５％のサルでウイルス投与後５週以内に起こった。持続時間は大体約８週であった。血清ＡＬＴレベルが正常になった後、３週と４週の間でＥ２−ＩｇＭが陰性に変化した。１匹のサルはＥ２−ＩｇＭに関していつも陰性であり、そして第４週でＡＬＴの異常が検出された以外、糞便中ウイルス排泄は検出されなかった。しかしそのＥ２−ＩｇＧは感染後第３週で陽性に転じ、そして２０週持続したが、一方ＧＬ−ＩｇＧは実験期間中検出されなかった。Ｅ２−ＩｇＧに関する応答率は１００％であった。Ｅ２−ＩｇＧセロコンバージョンは感染後４．５週以内に起こり、そしてそのセロコンバージョンは８４週以内にいずれのサルにおいても起こらなかった。

典型的には図１６のように、ウイルス排泄は感染後０．５週でウイルス排泄が始まり、続いてウイルス血症になる。３週に同時にＥ２−ＩｇＭ及びＥ２−ＩｇＧが最初に検出された後、血清ＡＬＴレベルが上昇し、続いてＧＬ−ＩｇＧのセロコンバージョンが起こる。次いでウイルス血症が急速に消滅し、そして血清ＡＬＴレベルが連続して正常に転じ、そしてウイルス排泄は陰性であった。約３から４週後、Ｅ２−ＩｇＭは陰性に転じた。ＧＬ−ＩｇＧレベルはその各ピーク値に到達した後、ゆっくりと低下するが、Ｅ２−ＩｇＧは実験期間中高レベルを持続した、すなわち７０週後、応答率は１００％を維持する。

本発明のＥ２−ＩｇＭＥＬＩＳＡキットを用いる急性肝炎患者の臨床標本におけるＨＥＶに対するＩｇＭ抗体の検出

Ｅ２−ＩｇＭＥＬＩＳＡキットで試験すると、９２８個の正常血清標本のほとんどが０．１５以下のＯＤ値を有し、平均ＯＤが０．０１２であるが、２つの標本のみが例外で０．２以上のＯＤ値を有した（一方は０．２０３であり、他方は０．３３３である）。臨床で急性肝炎の患者に由来する５１０個の血清標本のＯＤ値は０．００１から４にわたり、各々マイクロプレートリーダーの上限及び下限に相当する。ほぼ指数関数的に分布するＯＤ値に関しては、１０００倍した後その対数的分布を分析した（図１７）。ＯＤ値０．３９８から０．６３１の両側で２つのピークがあった。左のピークはほぼ正常な集団で対数平均は０．０７７であり、おそらくＩｇＭ陰性肝炎患者を示しており、右のピーク（ＯＤ＞０．３９８）は１３１個の標本を含み、そのうちの１０９個は１．０以上のＯＤ値を有し、これはおそらくＩｇＭ陽性ＨＥＶ患者を示している。Ｅ２−ＩｇＭに関するカットオフを０．４に設定した場合、２００人の臨床で肝炎の血清標本のうち、Ｅ２−ＩｇＭの陽性標本はより高いＥ２−ＩｇＧのＯＤ値を有したが、一方たいていの陰性標本はＥ２−ＩｇＧ陰性であり、そしてその他の標本のＥ２−ＩｇＧのＯＤ値は低から高にわたった（図１８）。

ＯＤ値の分布を比較するために、Ｅ２−ＩｇＭキット及びＧＬ−ＩｇＭキット（ＧＥＮＥＬＡＢＳＤＩＡＧＮＯＳＴＣＳＨＥＶＩｇＭＥＬＩＳＡ）を用いて非Ａ〜Ｃ型肝炎患者の１１９個の血清標本を試験した。上記のようにＥ２−ＩｇＭに関するＯＤ値の分布はＯＤ値０．４の両側の２つの明確なピークを形成したが、一方ＧＬ−ＩｇＭに関するＯＤ値の分布は不規則であった（図１９）。カットオフ値を０．４に設定した場合、Ｅ２−ＩｇＭに関する応答率は４７．９％（５７／１１９）であったが、一方ＧＬ−ＩｇＭに関する応答率は２４．４％（２９／１１９）であった。

２９個のＧＬ−ＩｇＭ陽性標本では、Ｅ２−ＩｇＭはすべて反応性であった。しかしながら、陽性ＨＡＶ−ＩｇＭ、陽性ＨＢｃ−ＩｇＭ又は陽性ＨＣＶ−ＩｇＧを示す３０個の血清標本のうち、Ｅ２−ＩｇＭのＯＤ値が０．２を超えるものはなかった。

本発明のＥ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡキットを用いる急性肝炎患者の臨床標本及び正常血清標本におけるＨＥＶに対するＩｇＧ抗体の検出

実施例３３に記載するように、Ｅ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡキットを用いて５０６０個の正常血清標本及び２００個の急性肝炎患者に由来する臨床血清標本を試験し、そして対数の頻度分布を用いてＯＤ値を分析した（図２０）。正常血清標本について記載すると、ＯＤ値０．０２５あたりで正常集団に類似するピークがあった。しかしＯＤ値が０．２を超えると、ラインはＯＤ値４．０まで傾斜して伸びた。対数の頻度分布分析を用いて、ＯＤ値が０．２５１未満の標本のうち、Ｌｏｇ（ＯＤ）の平均は１．３３３（ＯＤは０．０２２であった）であり、そしてＳＤは０．３６２であった。９５％の特異性を有するカットオフＯＤは０．１１１（ｘ＝２．０４２）であり、一方９９％の特異性を有するカットオフＯＤは０．１８５（ｘ＝２．２６６）であった。カットオフＯＤ未満のＯＤ値はほぼ正常集団として分布され、そしてそれにより示されたたいていの標本はＥ２−ＩｇＧに関して陰性であり、ＯＤ値がカットオフＯＤよりも高い標本はＥ２−ＩｇＧに関して異なる力価を伴う陽性の可能性がある。このカットオフＯＤを用いて、標本の応答率は２２．２％であった。

急性肝炎患者の２００個の臨床血清標本について記載されるように、いずれかの側のカットオフＯＤで２個の明確なピークがあった。左のピークは正常血清標本のピークに類似し、そして右のピークは１．６から４．０のＯＤ値の間で形成された（ＯＤ２．５でのピーク）。急性肝炎患者で２つの群があることが示唆された。一方は正常なヒトに類似し（そのＯＤ値は０．２未満であった）、そして他方はより高いＥ２−ＩｇＧのＯＤ値を有し、そのほとんどがＥ２−ＩｇＭ陽性であった（図２１）。後者はおそらく急性ＨＥＶ患者を示した。

実施例３７：本発明の抗ＨＥＶモノクローナル抗体を含む治療薬、その調製及びＥ２−ＩｇＭ陽性血清及び／又はＥ２−ＩｇＧ陽性血清の遮断

上記の予めコーティングしたＮＥ２マイクロプレートで、モノクローナル抗体８Ｃ１１及びモノクローナル抗体８Ｈ３（各々１：１０００の率で希釈した）の混合物１００μｌを１つのウェルに加え、そして対照として希釈剤１００μｌを別のウェルに同時に加え、３７℃で２時間インキュベートし、そして次に上下を逆にしてウェルを乾燥し、二重に連続して希釈した血清１００μｌを加え、そして３７℃で３０分間インキュベートし、プレートをＰＥＳＴで５回洗浄し、次いで予め希釈した抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰの作業中の希釈物又は抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰの作業中の希釈物（ＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉＢｉｏｔｅｃｈ社により提供された）１００μｌを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートし、それを再度５回洗浄し、そして上下を逆にしてウェルを乾燥し、クロマトゲンを加え、そして３７℃で１０分間インキュベートし、そして次に２ＭＨ２ＳＯ４５０μｌで反応を停止させ、そして各ウェルに関して吸光度ＯＤ４５０／６２０ｎｍを決定する。対照ＯＤ値が１．０から２．０である希釈率を選択し、式：遮断率＝（対照ＯＤ−遮断ＯＤ）／対照ＯＤ＊１００％により遮断率を算出し、そして遮断率が５０％を超えた場合、モノクローナル抗体は血清をうまく遮断することができる。

上記の予めコーティングしたＮＥ２マイクロプレートで、モノクローナル抗体８Ｃ１１及びモノクローナル抗体８Ｈ３（１：１０００の率で希釈した）の混合物１００μｌを１つのウェルに加え、モノクローナル抗体８Ｃ１１のＦａｂセグメント及びモノクローナル抗体８Ｈ３のＦａｂセグメントの混合物（１：１０００の率で希釈した）１００μｌを別のウェルに加え、そして対照として希釈剤１００μｌを第３のウェルに同時に加え、３７℃で２時間インキュベートし、そして次に上下を逆にして乾燥し、１：２の率で連続希釈した血清１００μｌを加え、そして３７℃で３０分間インキュベートし、プレートをＰＥＳＴで５回洗浄し、そして上下を逆にして乾燥し、次いで作業濃度に希釈した抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ又は抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ１００μｌを加え、続いて３７℃で３０分間インキュベートし、それを５回洗浄し、そして上下を逆にして乾燥し、クロマトゲンを加え、そして３７℃で１０分間インキュベートし、２ＭＨ２ＳＯ４５０μｌで反応を停止させ、そして各ウェルに関して吸光度ＯＤ４５０／６２０ｎｍを決定する。

Ｅ２−ＩｇＭＥＬＩＳＡの特異性を確認するために、ＨＥＶを直接的に捕捉する２つのモノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３を用いて１０個のＥ２−ＩｇＭ陽性血清標本中のＥ２−ＩｇＭを遮断した。その結果は、モノクローナル抗体が血清とＥ２抗原との間の反応を著しく遮断でき、遮断率は６６．４％〜９４．８％の範囲であることが明らかになった（平均遮断率は８６．６％（８６．６％±７．９％）である）（図２１参照）。１０個のＥ２−ＩｇＧ陽性血清標本に関して、血清とＥ２抗原との間の反応が５５％から９６％にわたる遮断率ですべて遮断され、平均遮断率は７５．７％である。

遮断試験におけるモノクローナル抗体の立体障害の影響力を推測するために、２つのモノクローナル抗体のＦａｂセグメントを用いて２個の血清標本を同時に遮断した。図２２に説明するように、Ｆａｂセグメントの遮断効果は、実質的にはその全抗体と一致し、これにより陽性血清に対するモノクローナル抗体の遮断効果がエピトープ特異性であることが示された。

実施例３８：二重抗原サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ＤＳ―ＥＬＩＳＡ）

実施例３３に上記のようにＮＥ２マイクロプレートを調製した。アッセイ手順は以下のとおりであった。血清標本５０μｌを加えた後、希釈したＮＥ２−ＨＲＰをウェルあたり５０μｌ加え、プレートを穏やかにはたいて試薬を均一化し、そして３７℃で３０分間インキュベートし、６回洗浄し、そして上下を逆にして乾燥し、次いでクロマトゲン（ＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈａｒｍａｃｙｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅＣｏ．，Ｌｔｄにより供給されたＴＭＢ基質）を加える。３７℃で１０分間インキュベートした後、２ＭＨ２ＳＯ４５０μｌで反応を停止させ、ついで各ウェルに関して４５０ｎｍで、参照波長６２０ｎｍで吸光度の値を測定する。陰性対照の平均吸光度に０．１２を加えることによりカットオフ値を算出する。その吸光度がカットオフ値未満である場合は標本には反応性がないとみなし、それ以外の場合は反応性があるとみなす。

４００人のボランティア血液ドナーの血清標本をＤＳ−ＥＬＩＳＡ及びＥ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡにより試験し、そしてその結果により、２つのＥＬＩＳＡが互いに完全に一致することが明らかなった。陽性標本のサンプル／カットオフの比率に言及するように、ＤＳ−ＥＬＩＳＡはＥ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡよりも高かった（図２３参照）。

新疆から収集した雌ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタの血清並びに上海からのメンドリの血清において抗ＨＥＶ抗体をＤＳ−ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。表２１に記載するように、例外なくこれらの種の動物から抗ＨＥＶ抗体を検出することができ、そしてブタにおける陽性率は７９．９％までであった。

実施例３９：ペプチド２３９の抗原決定基を含むワクチン、その調製及びその免疫原性

ワクチン接種した動物：６匹のＢａｌｂ／ｃマウス及び６匹の昆明白色マウス、４から６週齢

ワクチンの調製：ＬａｎｚｈｏｕＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎａの望ましい量の元来のアルミニウム・アジュバントを、沈殿が生じるまで１ＮＮａＯＨで調整した。完全に混合した後、１ｘＰＢＳを２倍容量まで加えた。次いで１００００ｒｐｍで１分間遠心を実施し、そして上清を捨てた。沈殿を１ｘＰＢＳで２倍容量に再懸濁し、そして１００００ｒｐｍで１分間遠心し、そして上清を捨てた。ｐＨが７から７．４に達するまでかかる過程を数回繰り返した。最後に、沈殿を等量の１ｘＰＢＳに再懸濁し、そして溶液を滅菌して４℃で保存し、そして９ｘ保存溶液として使用した。精製したポリペプチド２３９を上記のアルミニウム・アジュバントと混合し、最終濃度を５μｇ／１００μｌにして４℃で一晩置いた。アジュバント不含のワクチンをポリペプチド２３９のみを用いて、５μｇ／１００μｌの濃度で調製した。用量を５μｇ／マウスに設計した。

ワクチン接種プログラム：動物をアジュバントワクチン及び非アジュバントワクチンの群に分けた。各群は３匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｂ１〜Ｂ３、Ｂ４〜Ｂ６と符号を付けた）及び昆明白色マウス（Ｋ１〜Ｋ３、Ｋ４〜Ｋ６と符号を付けた）を有し、０、１０日の免疫スケジュールに従って筋肉内にワクチン接種した。ＥＬＩＳＡキットを用いてＨＥＶ−ＮＥ２ポリペプチドコーティングプレートにより毎週収集した血清中の抗ＨＥＶ抗体の存在を検出した。

結果（表２２参照）：非アジュバント及びアルミニウム・アジュバント２３９ワクチンはすべて優れた免疫原性を有した。特に非アジュバントワクチンの１つのワクチン接種のみが３匹のうち１匹のマウスに抗ＨＥＶ抗体を誘導した。２つのワクチン接種の後、数匹のマウスの抗ＨＥＶ抗体力価は１：１０５を超えることができる。

実施例４０：ポリペプチド２３９の免疫保護

ポリペプチド２３９をアルミニウム・アジュバントと共に含有するワクチンの調製

ＬａｎｚｈｏｕＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎａの望ましい量の元来のアルミニウム・アジュバントを、沈殿が生じるまで１ＮＮａＯＨで調整した。完全に混合した後、１ｘＰＢＳを２倍容量に達するまで加えた。次いで１００００ｒｐｍで１分間遠心を実施し、そして上清を捨てた。沈殿を１ｘＰＢＳで２倍容量に再懸濁し、そして１００００ｒｐｍで１分間遠心し、そして上清を捨てた。ｐＨが７から７．４に達するまでかかる過程を数回繰り返した。最後に、沈殿を等量の１ｘＰＢＳに再懸濁し、そして溶液を滅菌して４℃で保存し、そして９ｘ保存溶液として使用した。上記のように産生し、そしてＨＰＬＣで精製したポリペプチド２３９（タンパク質の濃度は１．０ｍｇ／ｍｌである）をＰＢＳで希釈し、そして１／９容量のアルミニウム・アジュバントを加えてポリペプチド２３９を望ましい最終濃度にし（１０μｇ／ｍｌ）、そして４℃で一晩混合した。混合物をアンプルあたり１．２ｍｌに分け、そしてアンプルを暗所で４℃で保存した。使用前にアンプルを混合しなければならない。

免疫スケジュール

ＡＬＴが正常でそしてＨＥＶが陰性である６匹の健常アカゲザルを選択し、そして群あたり３匹の２群に分けた。免疫群のサルにはアルミニウム・アジュバント含有ポリペプチド２３９ワクチン１０μｇを用いて三角筋内注射により０日、１０日及び５８日の各々で３回ワクチン接種した。対照は免疫しなかった。

ＨＥＶでのウイルス投与

２群のこれらのサルを最初の免疫後８６日目（最後の免疫後２８日目）にサルあたりＨＥＶＸＭ株の２０％の糞便懸濁液０．２５ｍｌでウイルスを投与した（サルあたり２＊１０＾５ＰＣＲ力価）。

標本の収集

感染前及び感染後少なくとも１０週間、週１回、そして次にその後隔週に１回血清サンプルを採取した。サンプル収集の日に新鮮血清で血清ＡＬＴを決定した。

１０日間、隔日に、そして次に週２回、８６日まで便標本を収集した。開始後ウイルスＲＮＡが連続的に検出されなかった場合、ウイルス排泄は逆転したと考えられた。

ＨＥＶマーカーの検出

抗ＨＥＶＩｇＧ抗体：サル血清の抗ＨＥＶＩｇＧを２つの方法で検出する。

方法１はＥ２−ＩｇＧＥＬＩＳＡであり、このアッセイ手順は実施例３１に記載した。方法２では、ＧＬ−ＩｇＧをＧＥＮＥＬＡＢＳＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳＨＥＶＩｇＧＥＬＩＳＡキットで検出した。ＨＥＶＯＲＦ２（アミノ酸６０４〜アミノ酸６６０）及びＮＥ２の主要なエピトープと重複しないＨＥＶＯＲＦ３のＣドメインのエピトープを擬似したＨＥＶＯＲＦ２及びＯＲＦ３の組換えポリペプチドをこのキットで使用した。

ウイルス排泄：実施例１１に記載したような方法により糞便中のＨＥＶＲＮＡを検出する。

抗ＨＥＶＩｇＭ抗体：実施例３２に記載したような方法によりサルの血清の抗ＨＥＶＩｇＭを検出する。

結果：
表２２に記載するように、３匹の対照サルすべての中で、ウイルス投与後１週間でウイルス排泄、Ｅ２−ＩｇＭ、Ｅ２−ＩｇＧ及びＧＬ−ＩｇＧが検出され、これによりＨＥＶがこれらのサルに感染し、そして複製に成功したことが明らかになった。３匹の免疫したサルのうちの２匹では、ウイルス排泄、Ｅ２−ＩｇＭ及びＧＬ−ＩｇＧはいつも検出されなかったが、その他のサルではウイルス排泄がウイルス投与後３週で始まり、そしてＥ２−ＩｇＭ及びＧＬ−ＩｇＧはウイルス投与後７週で逆転した。免疫したサルはＨＥＶの感染を免れるか又は症状が明確に軽減されることができ、これによりポリペプチド２３９が有効な免疫保護性を有していることが明らかになった。

実施例４１：生物学的標本中の全抗ＨＥＶ抗体を検出するための二重抗原サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ＤＳ−ＥＬＩＳＡ）キット、その調製及びそのアッセイ手順

ＤＳ−ＥＬＩＳＡキットは組換えポリペプチドＮＥ２で予めコーティングしたマイクロウェル、酵素希釈剤（２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．２）、５‰のカゼイン及び１０％のＮＢＳ）で希釈した作業用ＮＥ２−ＨＲＰ溶液及びいくつかの非生物学的活性材料（例えば２０×ＰＢＳＴ、クロマトゲンＡ、クロマトゲンＢ及び停止溶液等）から成り、ＢｅｉｊｉｎｇＷａｎｔａｉｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｈａｒｍａｃｙｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅＣｏ．，Ｌｔｄから購入した。

このキットのアッセイ手順は以下のとおりである。血清標本５０μｌを加えた後、希釈したＮＥ２−ＨＲＰ５０μｌを各ウェルに加え、プレートを穏やかにはたいて試薬を均一化し、そして３７℃で６０分間インキュベートし、６回洗浄し、そして上下逆にして乾燥し、次いでクロマトゲンＡ及びクロマトゲンＢを各々５０μｌ加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、２ＭＨ２ＳＯ４５０μｌで反応を停止させ、次いで各ウェルに関して４５０ｎｍで、参照波長６２０ｎｍで吸光度を決定する。

新疆から収集した雌ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタの血清及び上海からのメンドリの血清でＤＳ−ＥＬＩＳＡにより抗ＨＥＶ抗体をスクリーニングした。表２３に記載するように、例外なくこれらの動物種から抗ＨＥＶ抗体を検出でき、そしてブタでは陽性率は７９．９％までであった。

本発明の好適な実施形態は以下の通りである。
［１］
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ＯＲＦ２によりコードされる、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、その保存変異体若しくは活性フラグメントであって、本モノクローナル抗体に比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が保存的に置換、付加又は欠失され、かつ依然としてＨＥＶに特異的に結合する能力を保持している、保存変異体若しくは活性フラグメント、又は、前記モノクローナル抗体と交差反応することができる、ＯＲＦ２を指向する他のモノクローナル抗体であって、
前記モノクローナル抗体が
１）ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６により分泌される抗Ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体８Ｃ１１、
２）ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４により分泌される抗Ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体１３Ｄ８、
３）ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７により分泌される抗Ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体８Ｈ３、及び、
４）ハイブリドーマ細胞株ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１５により分泌される抗Ｅ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体１６Ｄ７
からなる群より選択される、
モノクローナル抗体、保存変異体若しくは活性フラグメント又は他のモノクローナル抗体。
［２］
１）モノクローナル抗体８Ｃ１１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が各々配列番号：１２及び配列番号：１０に示される配列であること、
２）モノクローナル抗体１３Ｄ８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が各々配列番号：８及び配列番号：６に示される配列であること、
３）モノクローナル抗体８Ｈ３の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が各々配列番号：１６及び配列番号：１４に示される配列であること、又は、
４）モノクローナル抗体１６Ｄ７の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が各々配列番号：２０及び配列番号：１８に示される配列であることを特徴とする、［１］に記載のモノクローナル抗体。
［３］
［２］に記載のモノクローナル抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含む核酸分子であって、
前記ヌクレオチド配列が
１）配列番号：１２に示される、モノクローナル抗体８Ｃ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１１に示される配列であり、及び／又は、配列番号：１０に示される、モノクローナル抗体８Ｃ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：９に示される配列であり、
２）配列番号：８に示される、モノクローナル抗体１３Ｄ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：７に示される配列であり、及び／又は、配列番号：６に示される、モノクローナル抗体１３Ｄ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：５に示される配列であり、
３）配列番号：１６に示される、モノクローナル抗体８Ｈ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１５に示される配列であり、及び／又は、配列番号：１４に示される、モノクローナル抗体８Ｈ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１３に示される配列であり、又は、
４）配列番号：２０に示される、モノクローナル抗体１６Ｄ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１９に示される配列であり、及び／又は、配列番号：１８に示される、モノクローナル抗体１６Ｄ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号：１７に示される配列である、核酸分子。
［４］
ＨＥＶＯＲＦ２によりコードされるポリペプチド上の抗原決定基であって、次の抗原決定基１）〜４）からなる群より選択される抗原決定基。
１）モノクローナル抗体８Ｃ１１又はそのアナログの可変領域に特異的に結合する抗原決定基であって、Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体１３Ｄ８により特異的に認識される抗原決定基に部分的に重複し、又は隣接し、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、
２）モノクローナル抗体１３Ｄ８又はそのアナログの可変領域に特異的に結合する抗
原決定基であって、Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体１３Ｄ８により特異的に認識される抗原決定基に部分的に重複し、又は隣接し、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、前記抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、
３）モノクローナル抗体８Ｈ３又はそのアナログの可変領域に特異的に結合する抗原
決定基であって、Ｅ型肝炎ウイルス粒子の表面に露出し、コンフォーメーション依存的であり、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のポリペプチドフラグメントの二量化によりその正確な形成及び十分な露出が促進され、モノクローナル抗体８Ｃ１１のＨＥＶへの結合時に十分に露出し、また空間的構造の安定性を保持し、それによりモノクローナル抗体８Ｈ３に結合する能力が著しく増強され、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ酸残基４５９〜６０１の間に位置する、抗原決定基の形成に関与する重要なアミノ酸残基を有する抗原決定基、又は、
４）モノクローナル抗体１６Ｄ７又はそのアナログの可変領域に特異的に結合する抗
原決定基であって、直線状の抗原決定基であり、ほぼＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２のアミノ
酸残基４９９〜５１５の間に位置する抗原決定基。
［５］
［４］に記載のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基の少なくとも１つ又はその組合せを含む、ウイルス様粒子を形成できる単離された若しくは組み換えられたポリペプチド又はそのフラグメント、
［４］に記載のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基の少なくとも１つと高度な配列相同性を有するフラグメント、又は、
その保存変異体若しくは活性フラグメントであって、本モノクローナル抗体のアミノ酸残基に比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が保存的に置換、付加又は欠失され、依然としてウイルス様粒子を形成する能力が保持されている、保存変異体若しくは活性フラグメント。
［６］
さらに［４］に記載の前記抗原決定基１）及び３）を含む、［５］に記載の単離された若しくは組み換えられたポリペプチド又はそのフラグメント。
［７］
１）配列番号：２２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２０８、
２）配列番号：２１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２３９、
３）配列番号：２３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２４３、
４）配列番号：２４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２５１、
５）配列番号：２５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２６２、又は
６）配列番号：２６に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド２９２である、［５］に記載の単離された若しくは組み換えられたポリペプチド又はそのフラグメント。
［８］
［７］に記載のポリペプチド又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含む核酸分子であって、好ましくは、前記ヌクレオチド配列が
１）配列番号：２２に示すアミノ酸配列、
２）配列番号：２１に示すアミノ酸配列、
３）配列番号：２３に示すアミノ酸配列、
４）配列番号：２４に示すアミノ酸配列、
５）配列番号：２５に示すアミノ酸配列、又は
６）配列番号：２６に示すアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
［９］
［４］に記載のＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２の抗原決定基１）又は３）に特異的に結合する、［１］に記載のモノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３の性質に相当する性質を有するポリペプチド又はそのアナログをスクリーニングする方法であって、
１）抗原・抗体の特異的結合に適した条件下で十分な時間、前記モノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３を被験物質と接触させる工程と、
２）［１］に記載のモノクローナル抗体８Ｃ１１及び／又は８Ｈ３と反応する被験物質の存在を検出する工程と、
３）前記モノクローナル抗体と反応できる前記物質を回収する工程とを備える方法。
［１０］
［９］に記載の前記方法によりスクリーニングされるポリペプチド又はそのアナログ。
［１１］
［１０］に記載のポリペプチド又はそのアナログをコードするヌクレオチド配列又はその縮重配列を含む核酸分子。
［１２］
Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断及び／又は予防のための薬剤の調製における［１０］に記載のポリペプチド又はそのアナログの使用。
［１３］
［１］、［４］、［７］又は［１０］に記載の前記モノクローナル抗体、抗原決定基、ポリペプチド又はそのアナログの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ前記抗原・抗体反応に適した検出試薬を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染を検出するための診断キットであって、好ましくは、
１）サンプル中の抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＧ抗体の検出に有用であって、［４］及び／又は［７］に記載の前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ対応する検出方法に適した検出試薬を含む前記診断キット、
２）サンプル中の抗Ｅ型肝炎ウイルスＩｇＭ抗体の検出に有用であって、［４］及び／又は［７］に記載の前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ対応する検出方法に適した検出試薬を含む前記診断キット、又は、
３）サンプル中のすべての抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体の検出に有用であって、［４］及び／又は［７］に記載の前記抗原決定基又はそのフラグメントの少なくとも１つを診断有効量だけ含み、かつ対応する検出方法に適した検出試薬を含む前記診断キット。
［１４］
［４］、［７］又は［１０］に記載のポリペプチド若しくはそのアナログの少なくとも１つ、又はそのいずれかの組合せを免疫有効量だけ含み、かつ適当な免疫アジュバントを含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防のためのワクチン組成物であって、免疫有効量が好ましくは投与あたり０．０００１ｍｇ〜０．１ｍｇであり、より好ましくは０．００１ｍｇ〜０．０６ｍｇであり、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜０．０４ｍｇである、ワクチン組成物。
［１５］
前記活性フラグメントが配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：８、配列番号：６、配列番号：１６及び配列番号：１４からなる群より選択される配列に示される可変領域の少なくとも１つを含み、［４］に記載の抗原決定基の少なくとも１つに特異的に結合する、［１］に記載のモノクローナル抗体の活性フラグメント。
［１６］
［１］、［２］又は［５］に記載のモノクローナル抗体のいずれか１つの保存変異体又は活性フラグメントであって、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が保存的に置換、付加又は欠失され、依然としてＨＥＶに特異的に結合する能力を保持している、保存変異体又は活性フラグメント。
［１７］
Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断、予防及び／又は治療のための薬剤の調製における［１］に記載のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の使用。
［１８］
［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体の少なくとも１つ又はそのいずれかの組合せを診断有効量だけ含み、かつ前記抗原・抗体間の反応に適した検出試薬を含む、サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗原を検出するために用いられるＥ型肝炎ウイルス感染の診断のための診断用キットであって、免疫有効量が好ましくは用量あたり１ｎｇ〜１００００ｎｇであり、より好ましくは用量あたり１０ｎｇ〜１０００ｎｇであり、さらに好ましくは用量あたり１００ｎｇ〜１０００ｎｇである、診断用キット。
［１９］
［１］に記載のモノクローナル抗体又はその活性フラグメント若しくは保存変異体のも１つを治療有効量だけ含み、かつ薬学的に許容される溶剤及び／又は賦形剤を含む、Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための薬学的組成物であって、治療有効量が好ましくは体重キログラムあたり０．００１ｍｇ〜２０ｍｇであり、より好ましくは体重キログラムあたり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇであり、さらに好ましくは体重キログラムあたり０．１ｍｇ〜１０ｍｇである、薬学的組成物。
［２０］
［３］又は［１１］に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
［２１］
［１］に記載のモノクローナル抗体及びその保存変異体若しくは活性フラグメント又は［１０］に記載のポリペプチド若しくはそのアナログを発現できる、［２０］に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［２２］
ａ）Ｅ型肝炎ウイルスに特異的に結合する１次及び２次抗体を提供する工程であって、前記１次又は２次抗体の少なくとも１つが本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントである工程と、
ｂ）２次抗体と有効に結合するシグナル産生物質を提供する工程であって、産生されるシグナル強度が２次抗体の量にのみ依存し、好ましくは２次抗体がシグナル産生物質で直接標識されている工程と、
ｃ）１次抗体をキャリアーと結合させて１次抗体−キャリアー複合体を形成する工程と、
ｄ）被験物質を１次抗体−キャリアー複合体と接触させて、サンプル中に存在するＥ型肝炎ウイルスを抗体−キャリアー複合体に結合させる工程と、
ｅ）シグナル産生物質に有効に結合する２次抗体をウイルス−１次抗体−キャリアー複合体と接触させて、シグナル産生物質−２次抗体−ウイルス−１次抗体−キャリアーの複合体を形成する工程と、
ｆ）シグナル産生物質により産生されるシグナルを検出する工程であって、前記１次抗体又は２次抗体が本発明の１つ又はそれ以上のモノクローナル抗体若しくはその結合活性フラグメント又はそのいずれかの組合せであってもよい工程と
を備える、サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗原及び／又は抗Ｅ型肝炎ウイルス抗体を検出する方法。

Claims

サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗原を検出する方法であって、
ａ）Ｅ型肝炎ウイルスに特異的に結合する１次及び２次抗体を提供する工程であって、前記１次又は２次抗体の少なくとも１つがモノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３であるか、或いはモノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３の抗原結合活性を保持したモノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３のフラグメントである工程、
ｂ）２次抗体と有効に結合するシグナル産生物質を提供する工程であって、産生されるシグナル強度が２次抗体の量にのみ依存するか、２次抗体がシグナル産生物質で直接標識されている工程、
ｃ）１次抗体をキャリアーと結合させて１次抗体−キャリアー複合体を形成する工程、
ｄ）被験物質を１次抗体−キャリアー複合体と接触させて、サンプル中に存在するＥ型肝炎ウイルスを抗体−キャリアー複合体に結合させる工程、
ｅ）シグナル産生物質に有効に結合する２次抗体をウイルス−１次抗体−キャリアー複合体と接触させて、シグナル産生物質−２次抗体−ウイルス−１次抗体−キャリアーの複合体を形成する工程、及び
ｆ）シグナル産生物質により産生されるシグナルを検出する工程
を備え、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、方法。
前記１次又は２次抗体はそれぞれ、モノクローナル抗体８Ｃ１１又は８Ｈ３の１つ以上である、請求項１に記載の方法。
抗原結合活性を保持したフラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ又はＳｃＦｖである、請求項１に記載の方法。
Ｅ型肝炎ウイルス感染の予防及び／又は治療のための薬剤の調製における、モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の少なくとも一つ、又は抗原結合活性を保持したそれらのフラグメントの使用であって、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、使用。
モノクローナル抗体８Ｃ１１及び８Ｈ３の少なくとも一つ、又は抗原結合活性を保持したそれらのフラグメントの、Ｅ型肝炎ウイルス感染の診断のための薬剤の調製における使用であって、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、使用。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体又はそのフラグメントであって、重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲの配列は、
ａ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｃ１１の、配列番号１２及び配列番号１０に示すアミノ酸配列、
ｂ）それぞれ、モノクローナル抗体１３Ｄ８の、配列番号８及び配列番号６に示すアミノ酸配列、又は
ｃ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｈ３の、配列番号１６及び配列番号１４に示すアミノ酸配列、
のＣＤＲであり、
前記抗体又はそのフラグメントはＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされるポリペプチド配列の天然のコンフォメーションに結合するが、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされる変性したポリペプチド配列に減少した結合を有するか結合せず、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体１３Ｄ８がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４で寄託されたハイブリドーマ細胞株１３Ｄ８由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、抗体又はそのフラグメント。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又はそのフラグメントであって、重鎖及び軽鎖の可変領域の配列は、
ａ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｃ１１の、配列番号１２及び配列番号１０に示すアミノ酸配列、
ｂ）それぞれ、モノクローナル抗体１３Ｄ８の、配列番号８及び配列番号６に示すアミノ酸配列、又は
ｃ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｈ３の、配列番号１６及び配列番号１４に示すアミノ酸配列、
であり、
前記抗体又はそのフラグメントはＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされるポリペプチド配列の天然のコンフォメーションに結合するが、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされる変性したポリペプチド配列に減少した結合を有するか結合せず、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体１３Ｄ８がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４で寄託されたハイブリドーマ細胞株１３Ｄ８由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、抗体又はそのフラグメント。
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト化抗体であって、重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲの配列は、
ａ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｃ１１の、配列番号１２及び配列番号１０に示すアミノ酸配列、
ｂ）それぞれ、モノクローナル抗体１３Ｄ８の、配列番号８及び配列番号６に示すアミノ酸配列、又は
ｃ）それぞれ、モノクローナル抗体８Ｈ３の、配列番号１６及び配列番号１４に示すアミノ酸配列、
のＣＤＲであり、
前記抗体はＥ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされるポリペプチド配列の天然のコンフォメーションに結合するが、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされる変性したポリペプチド配列に減少した結合を有するか結合せず、
モノクローナル抗体８Ｃ１１がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１６で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｃ１１由来であり、モノクローナル抗体１３Ｄ８がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１４で寄託されたハイブリドーマ細胞株１３Ｄ８由来であり、モノクローナル抗体８Ｈ３がＣＣＴＣＣに寄託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００１１７で寄託されたハイブリドーマ細胞株８Ｈ３由来である、抗体。
請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントであって、Ｅ型肝炎ウイルスＯＲＦ２によってコードされるポリペプチド配列が配列番号１である、抗体又はそのフラグメント。
請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体はモノクローナル抗体８Ｃ１１、モノクローナル抗体１３Ｄ８又はモノクローナル抗体８Ｈ３である、抗体又はそのフラグメント。
請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントであって、前記フラグメントはＦａｂフラグメント又は一本鎖抗体である、抗体又はそのフラグメント。
請求項６に記載の抗体又はそのフラグメントであって、前記抗体はヒト化抗体である、抗体又はそのフラグメント。
Ｅ型肝炎ウイルス感染を検出するための診断キットであって、診断有効量の請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを含む、キット。
前記抗体又はそのフラグメントの診断有効量が１００ｎｇ〜１０００ｎｇである、請求項１３に記載のキット。