BR122015016384B1 - polipeptídio recombinante ou isolado, molécula de ácido nucléico, kit de diagnóstico para detectar a infecção pelo vírus da hepatite e, composição de vacina, composição farmacêutica, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira transformada e uso do polipeptídeo recombinante ou isolado - Google Patents

Abstract

resumo “polipeptídio recombinante ou isolado, molécula de ácido nucléico, kit de diagnóstico para detectar a infecção pelo vírus da hepatite e, composição de vacina, composição farmacêutica, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira transformada e uso do polipeptídeo recombinante ou isolado” a presente invenção refere-se ao anticorpo monoclonal especificamente ligado ao(s) polipeptídio(s) compreendendo a sequência de aminoácidos como representado na seq.id.no:1, da orf2 do vírus da hepatite e ou suas variantes conservadas ou seus fragmentos ativos, ou outros anticorpos monoclonais contra a orf2 que pode ter reação cruzada com o referido anticorpo monoclonal da presente invenção, e sua sequência de nucleotídeos ou sua sequência degradadas; para o determinante antigênico na orf2 do vírus da hepatite e; para um método para classificação do polipeptídio isolado ou recombinado ou análogo do peptídeo, o qual tem a mesma propriedade de se ligar especificamente ao referido anticorpo monoclonal 8c11 e/ou 8h3 como o referido determinante antigênico 1) ou 3) da orf2 do vírus da hepatite e; para polipeptídio ou análogo de peptídeo classificado pelo método acima e sua sequência de nucleotídeo ou sua sequência degenerada; para um uso do referido polipeptídio ou análogo de polipeptídio na preparação de um medicamento para o diagnóstico e/ou precaução da infecção do vírus da hepatite e; para um kit de diagnóstico para a infecção do vírus da hepatite e e uma composição de vacina para profilaxia da infecção do vírus da hepatite e; para usar os referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas na preparação de um medicamento para diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento da infecção do vírus da hepatite e; para composição farmacêutica para profilaxia e/ou tratamento da infecção do vírus da hepatite e e um método para profilaxia e/ou tratamento da infecção do vírus da hepatite e; para um vetor de expressão recombinante compreendendo a referida molécula de nucleotídeo na presente invenção e uma célula hospedeira transformada com o referido vetor de expressão recombinante que é capaz de expressar o anticorpo monoclonal e suas variantes conservadas ou fragmentos ativos ou polipeptídios ou análogos de polipeptídio.

Description

"POLIPEPTÍDIO RECOMBINANTE OU ISOLADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, KIT DE DIAGNÓSTICO PARA DETECTAR A INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE E, COMPOSIÇÃO DE VACINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA E USO DO POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE OU ISOLADO" (Dividido do PI 0214188-4 depositado em 08/11/2002) Campo da invenção [0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal, especificamente ligado ao(s) polipeptidio(s) compreendendo a sequência de aminoácidos como representada na SEQ.ID.NO:l da ORF2 do virus da hepatite E ou suas variantes conservadas, ou seus fragmentos ativos, ou outros anticorpos monoclonais contra a ORF2 que podem ter reação cruzada com o referido anticorpo monoclonal da presente invenção, e sua sequência de nucleotideos ou sua sequência degradada; aos determinantes antigênicos na ORF2 do virus da hepatite E; a um método para classificação de um polipeptidio recombinante ou isolado ou um polipeptidio análogo, que têm a mesma propriedade de se ligar especificamente ao referido anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3 como o determinante antigênico (1) ou (3) da ORF2 do virus da hepatite E; ao uso do referido polipeptidio ou ao análogo do polipeptidio na fabricação de um medicamento para diagnóstico e/ou profilaxia da infecção do virus da hepatite E; a um kit para diagnóstico da infecção do virus da hepatite E, e a uma composição de vacina para profilaxia da infecção do virus da hepatite E; ao uso dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas na preparação de um medicamento para diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento da infecção do virus da hepatite E; a uma composição farmacêutica para profilaxia e/ou tratamento da infecção do virus da hepatite E; a um vetor de expressão recombinante compreendendo a molécula de nucleotideo da presente invenção e uma célula hospedeira transformada com o referido vetor de expressão recombinante e capaz de expressar o anticorpo monoclonal, suas variantes conservadas ou fragmentos ativos ou o polipeptidio ou os polipeptidios análogos da invenção.

Histórico da invenção [0002] O virus da hepatite E (HEV) foi primeiramente identificado como um patógeno da hepatite não-A, não-B transmitida entericamente em 1983 (Balayan et al., 1983., Intervirology 20:23). A hepatite E é principalmente endêmica nos países em desenvolvimento na Ásia, África e América Central. Nos países em desenvolvimento, os casos de hepatite E foram muito encontrados em imigrantes ou visitantes estrangeiros. Tanto os casos esporádicos quanto os pandêmicos foram relatados. Durante o período de 1950 a 1990, aconteceram vários princípios de hepatite E devido à ingestão de água poluída (Visvanathan, 1957, Indian J. Méd. Res. (Suppl.). 45:1-30; Wong et al., 1980 Lancet., 2:882-885; Myint et al. , 1985, Am. J. Trop. Med. Hyg., 34:1183-1189; Belabbes et al., 1985, J. Med. Virol., 16:257-263; Hau et al., 1999, am. J. Trop. Med. Hyg., 60:277-280). Muitas infecções por hepatite E foram auto-limitada e desenvolvidas apenas dentro de doenças crônicas; mas para a mulher grávida, a sequela foi severa com uma taxa de mortalidade acima de 17% (Tsega et al. , 1992, Clin. Infec. Dis., 14:961-965; Dilawari et al. , 1994, Indian J. Gastroenterol. , 13:44-48; Hussaini et al. , 1997, J. Viral Hepat., 4:51-54).

[0003] Em 1991, os pesquisadores obtiveram a sequência completa do genoma de HEV em um primeiro tempo, e foi descoberto que HEV é um virus RNA positivo não-envelopado de fita simples (Tam et al. , 1991, Virology, 185:120-131). A análise da sequência mostrou que o genoma foi de aproximadamente 7,2kb de comprimento com três regiões de abertura de leitura. A ORFl, que está localizada na extremidade 5', codifica uma proteína não estrutural do vírus, a ORF2, que está localizada na extremidade 3', codifica a maior proteína estrutural do vírus. Na extremidade 5' da ORF3, existe uma base sobreposta com a extremidade 3' da ORFl. Na extremidade 3' da ORF3, existem 339 bases sobrepostas com a ORF2. É de conhecimento que a ORF3 codifica uma outra proteína estrutural com função desconhecida (Tam et al., 1991, Virology, 185:120-131; Aye et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:3512; Aye et al. , 1993, Vírus Genes., 7:95-109; Huang et al., 1992, Virology, 191:550-558; Reyes et al. , 1993, Arch. Virol. Suppl., 7:15-25).

[0004] A ORF2 de HEV, inicia na base de número 5147, têm 1980 nucleotídeos, que codificam um polipeptídio com 660 aminoácidos, presumindo que seja a maior proteína estrutural constituinte do capsídio do vírus. Na N-terminal da proteína ORF2, existe uma sequência peptídeo sinal clássica seguida por uma região rica em arginina, que é uma região positiva altamente carregada e acredita-se estar envolvida na encapsidação do RNA genônico durante a construção do vírus. Durante o processo de translação, a ORF2 entra no retículo endoplásmico (ER) através do mecanismo da proteína que reconhece o peptídeo sinal (SRP), e é glicosilada e acumulada no ER, então, provavelmente, forma o capsômero do capsídio in suit. Três sítios N-glicosilados na 0RF2, Asn-137, Asn-310 e Asn-562 os uais são altamente conservativos entre as diferentes cepas de vírus, e Asm-310 que é o maior sítio glicosilado. As células COS de mamíferos transfectados com 0RF2 e as células Huh-7 e HepG2 de hepatocarcinoma humano pode, desse modo, expressar uma glicoproteína de 88 kD que pode ser encontrada tanto no citoplasma quanto na membrana. A mutação nestes sítios glicosilados não afeta a localização da P0RF2 na membrana celular. Entretanto, após a sequência do peptídeo sinal ter sido removida desta, a P0RF2 pode apenas ser encontrada no citoplasma. Isto implica no fato de que a troca de P0RF2 ao invés da glicosilação necessária para a localização da proteína na membrana celular. Um tipo de proteína MS em HBV, P0RF2 é possivelmente secretada para a membrana celular diretamente através do ER, não através do corpo de Golgi. Na superfície da célula transfectada, gpORF2 não é aleatoriamente distribuída, mas concentrada em algumas zonas, o que implica em um processo de combinação ativo das subunidades da proteína, a qual talvez agregue, dentro de formas ordenadas mais avançadas. A construção/maturação final do vírus necessita da encapsidação do RNA genômico, assim muitas ocorrem no citoplasma fora do ER ou no interior da parede da membrana celular. 0 acúmulo de gpORF2 na membrana pode implicar na construção do vírus. Ao mesmo tempo, a localização da proteína de capsídio, na membrana, também implica na possibilidade de secreção do vírus maturado nas células através da germinação.

[0005] Na patente U.S. No. 5,885,768, Reyes et al., relatou primeiramente que 4 macacos cinomolgos foram injetados i.m. nos dias 0 e 30 com a proteína recombinante trpE-C2 expressa em E. coli compreendendo a 0RF2 do exterminai 2/3 da cepa Burma HEV (aa225~660) em uma quantidade de 50 μρ^οεθ, onde a referida proteína é formulada com um adjuvante alume. Dois macacos como controle foram injetados apenas com o adjuvante. Na coleta de sangue quatro semanas mais tarde, nenhum anticorpo é detectado no Western Blotting. Em um terceiro período de imunização, dois macacos dentre eles foram imunizados com a administração de 80 μρ por animal, da proteína recombinante insolúvel sem adjuvante. Quatro semanas mais tarde, ambos os macacos foram positivos (WB) .

[0006] Então, os seis macacos foram agrupados em dois grupos, cada um incluindo três macacos: um imunizado três vezes, um imunizado duas vezes e um como controle. O primeiro grupo foi atacado com o HEV Burma, e o segundo grupos do HEV do México. Os resultados foram que (1) ALT foi normal em todos os períodos no grupo imunizado, mas este aumentou de 6 ~ 10 vezes mais do que antes da imunização no controle; (2) quando em uma amostra de biópsia de fígado foi detectado através do método de Fluorescência imunológica, o antígeno em todos os outros macacos exceto naqueles imunizados com três doses e infectados pela cepa Burma; (3) a excreção do vírus nas fezes foi descoberta em todos os outros macacos exceto naqueles imunizados com três doses e infectados com a cepa Burma. A amostra desta pesquisa foi pequena, mas isto implica que a proteína recombinante da ORF2 pode bloquear a ocorrência de índices bioquímicos do vírus da hepatite e proteger completamente alguns macacos da infecção quando os macacos foram atacados por um HEV selvagem.

[0007] O grupo Anderson na Austrália (Anderson et al., 1999, J. Virol. Methods. , 81:131-142; Li et al. , 1994; J. Clin. Microbio., 32:2060-2066; Li et al. , 1997, J. Méd. Virol., 52:289-300; Li et al., 2000, J. Med. Virol., 60:379386) usaram a ORF2 aa 394~660 (ORF2.1) expressa na E. coli.. O produto de expressão foi uma proteína de fusão com GST ou poli-His que podería formar um epítopo convalescente altamente dependente da conformação. Este epítopo podería detectar uma alta faixa de soro convalescente, mas este desaparece quando o fragmento foi estendido para o N-terminal ou truncado. O soro de 30 semanas obtido de camundongos após imunização dos mesmos com a proteína da ORF2.1 recombinante foi usado para bloquear o soro de pacientes convalescente com a VLP expressa em baculovírus com o antígeno de revestimento. A faixa de bloqueio alcançou de 81%~86%. Os dados diferentes mostraram que a ORF2.1 teve uma maior estrutura de epítopo do que o similar para VLP. O anticorpo para o epítopo pode existir por um longo período no soro de indivíduos infectados com HEV. É provavelmente um importante epítopo protetor, e os anticorpos para a ORF2.1 seriam de valor.

[0008] De modo a contornar muitos problemas durante o processo de preparação e aplicação do anticorpo monoclonal para HEV, com base na obtenção de séries de fragmentos de polipeptídios com excelente antigenicidade dentro da ORF2 do vírus da hepatite E (ver a patente Chinesa No. CN 00130634.0), os inventores prepararam um anticorpo monoclonal com o fragmento NE2 como antígeno pela tecnologia do hibridoma e obtiveram a linha de célula que pode secretar o anticorpo monoclonal especificamente ligado ao polipeptídio codificado pela 0RF2 do virus da hepatite E, e o anticorpo monoclonal produzido pela referida linha de célula.

Sumário da invenção [0009] A presente invenção em um aspecto refere-se a um anticorpo monoclonal especificamente ligado ao(s) polipeptidio(s) (a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:l) da ORF2 (HEV) do virus da hepatite E, ou variantes conservadas ou fragmentos ativos do mesmo onde um ou mais dos resíduos de aminoácidos conservados foram substituídos, adicionados ou deletados nas sequências de aminoácidos comparados àqueles dos referido anticorpo monoclonal da presente invenção e que retém a capacidade de especificamente se ligar ao HEV. A presente invenção também se refere a outros anticorpos monoclonais, dirigidos à ORF2 que podem reagir de forma cruzada com o referido anticorpo monoclonal.

[0010] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se à molécula de nucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos codificantes das regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo monoclonal da invenção, ou suas sequências degradadas.

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se aos determinantes antigênicos na ORF2 do vírus da hepatite E.

[0012] Em um outro aspecto da presente invenção, ela refere-se a um polipeptidio recombinante ou isolado, o qual compreende pelo menos um dos referidos determinantes antigênicos da ORF2 do vírus da hepatite E da invenção ou qualquer combinação dos mesmos, ou compreende fragmentos com sequências de alta homologia para pelo menos um dos referidos determinantes antigênicos da invenção.

[0013] Em um outro aspecto da presente invenção, ela refere-se a uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificante de um polipeptídio recombinante ou isolado ou polipeptídios análogos, ou suas sequências degeneradas.

[0014] Em um outro aspecto da presente invenção, ela se refere a um método para classificação do referido polipeptídio recombinante ou isolado ou o polipeptídio análogo, o qual têm a propriedade equivalente de se ligar especificamente ao anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3 da invenção para os determinantes antigênicos (1) ou (3) da ORF2 do vírus da hepatite E da invenção.

[0015] A presente invenção também refere-se a um polipeptídio recombinante ou isolado ou do polipeptídio análogo classificado pelo método acima.

[0016] A presente invenção também refere-se a uma molécula de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificante do referido polipeptídio ou polipeptídio análogo acima ou suas sequências degradadas.

[0017] A presente invenção também se refere ao uso do referido polipeptídio ou polipeptídio análogo na preparação de um medicamento para o diagnóstico e/ou profilaxia da infecção do vírus da hepatite E.

[0018] A presente invenção também se refere a um kit de diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite E, especialmente da detecção do anticorpo IgG ou IgM ou o anticorpo total contra o vírus da hepatite E, o qual compreende uma quantidade efetiva de diagnóstico de pelo menos um dos referidos determinantes antigênicos, polipeptídio ou polipeptídio análogo do vírus da hepatite E, e um agente de detecção apropriado para a detecção da referida interação do antigeno e anticorpo.

[0019] A presente invenção também se refere a uma composição de vacina para profilaxia da infecção do virus da hepatite E, que compreende uma quantidade imune efetiva de pelo menos um dos referidos polipeptidios ou polipeptidios análogos da invenção, ou qualquer combinação dos mesmos, e um adjuvante imunológico apropriado.

[0020] A presente invenção também se refere ao uso dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas na preparação de um medicamento para diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento da infecção do virus da hepatite E.

[0021] A presente invenção também se refere a um kit de diagnóstico para o diagnóstico da infecção do virus da hepatite E, especialmente para a detecção do antigeno do virus da hepatite E nas amostras, compreendendo pelo menos um dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservados da invenção, ou qualquer combinação dos mesmos, em uma quantidade efetiva para diagnóstico, e um agente de detecção apropriado para a detecção da interação do referido antigeno e do anticorpo.

[0022] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica para profilaxia e/ou para tratamento da infecção do virus da hepatite E, que compreende uma quantidade efetiva de tratamento de pelo menos um dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas da invenção, e um veiculo farmaceuticamente apropriado e/ou excipiente.

[0023] A presente invenção também se refere a um método para profilaxia e/ou tratamento da infecção do virus da hepatite E, o qual compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade efetiva para profilaxia e/ou tratamento de pelo menos um dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas da invenção.

[0024] A presente invenção também se refere a um vetor de expressão recombinante compreendendo a referida molécula de nucleotídeo da invenção e uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão recombinante, o qual é capaz de expressar o referido anticorpo monoclonal, suas variantes conservadas ou fragmento ativo, ou o polipeptídio ou polipeptídio análogo da invenção.

[0025] A presente invenção também provê um método para detectar o antígeno do vírus da hepatite E e/ou o anticorpo contra o vírus da hepatite E nas amostras.

Descrição detalhada da configuração preferida [0026] A menos que de outro modo indicado, todos os termos ou nomenclaturas aqui usadas têm o mesmo significado que àqueles convencionalmente usados na técnica. Os procedimentos da cultura de célula, genética molecular, química de ácido nucléico, e a imunologia aqui usada são técnicas de rotina comuns usadas na técnica.

[0027] Um anticorpo compreende a agregação de cadeias ligadas de polipeptídios através de pontes de bissulfeto. Duas cadeias de polipeptídios, denominadas de cadeia leve e cadeia pesada constitui toda a estrutura principal de um anticorpo (isótopos). Ambas as cadeias, pesada e leve podem ser adicionalmente divididas dentro de algumas sub-regiões das regiões variáveis e regiões constantes. Cada cadeia pesada tem uma região variável simples e três domínios constantes. Cada cadeia leve tem uma região variável simples diferente daquela da cadeia pesada e uma região constante simples diferente daquela da cadeia pesada. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves são responsáveis pela especificidade de ligação do anticorpo.

[0028] Um aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal capaz de especificamente se ligar ao polipeptídio codificante pela ORF2 do vírus da hepatite E como representado na SEQ.ID.NO:l. Em uma configuração, o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 8C11 contra o vírus da hepatite E produzido pela linha de célula de hibridroma CCTCC-C2200116, o qual pode capturar diretamente o vírus HEV, e têm efeito protetor de neutralizar, e têm significante efeito bloqueador no soro em ambas as fases aguda e convalescente do soro com infecção de HEV. O soro infectado com HEV pode bloquear a ligação de 8C11 ao antígeno de HEV. A ligação de 8C11 ao HEV ou ao análogo pode induzir a alteração da estrutura espacial de HEV ou o análogo, e um significante aumento da ligação de um outro anticorpo monoclonal 8H3 contra o HEV para o HEV ou análogo. A afinidade constante de 8C11 com o polipeptídio recombinante de HEV NE2 é de aproximadamente 2 x 10”8, e a afinidade constante deste fragmento Fab é de aproximadamente 6 x 10”7.

[0029] Em uma outra configuração da presente invenção, o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 13D8 contra o vírus da hepatite E produzido através da linha de célula de hibridroma CCTCC-C200114, o qual pode diretamente capturar o vírus HEV, e ter o efeito protetor de neutralizar, e ter significante efeito bloqueador, tanto na fase aguda do soro quanto na fase convalescente do soro na infecção de HEV. 0 soro infectado com HEV pode bloquear a ligação de 13D8 para o antigeno HEV. A ligação de 13D8 com o antigeno HEV pode ser bloqueada através do anticorpo monoclonal 8C11 e pode bloquear a ligação do anticorpo monoclonal 8C11 com o antigeno HEV. A ligação de 13D8 com HEV ou com o análogo não pode conduzir a um aumento significante da ligação de um outro anticorpo monoclonal 8H3 contra HEV para HEV ou um análogo. A afinidade constante de 13D8 com o polipeptidio HEV recombinante NE2 é de aproximadamente 2 x 10”8, e a afinidade constante de seu fragmento Fab é de aproximadamente 3xl0-7.

[0030] Em uma outra configuração da presente invenção, o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 8H3 contra o virus da hepatite E produzido pela linha de célula de hibridoma CCTCC-C200117, o qual pode capturar diretamente o virus HEV. A ação sinergética de 8H3 com o anticorpo monoclonal 8C11 pode significativamente aumentar o efeito protetor neutralizante, e têm um efeito bloqueador no soro mais significante, tanto na fase aguda quanto na fase convalescente do soro de uma infecção HEV do que com o anticorpo monoclonal 8C11 apenas. O soro infectado com HEV pode bloquear a ligação de 8H3 com o antigeno HEV. A ligação de 8C11 com HEV ou do análogo pode conduzir a um aumento significante da ligação do anticorpo monoclonal 8H3 com HEV ou com o análogo. A afinidade constante de 8H3 com o polipeptidio HEV recombinante NE2 é de aproximadamente 2 x 10”6, e a afinidade constante de seu fragmento Fab é de aproximadamente 6 x 10”11.

[0031] Em uma outra configuração da presente invenção, o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal 16D7 contra o vírus da hepatite E é produzido através da linha de célula de hibridoma CCTCC-C200115. 0 soro infectado com HEV pode bloquear a ligação de 16D7 com o antígeno HEV. A afinidade constante de 16D7 com o polipeptídio HEV recombinante NE2 é de aproximadamente 2 x 10”8.

[0032] Uma outra configuração da presente invenção refere-se ao referido anticorpo monoclonal, onde: 1) a sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal 8C11 é representada pela SEQ.ID.NO:12; a sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ.ID.NO:10; ou 2) a sequência do aminoácido da região variável da cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal 13D8 é representada pela SEQ.ID.NO:8; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ.ID.NO:6; ou 3) a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal 8H3 é representada pela SEQ.ID.NO:16; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ.ID.NO:14; ou 4) a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal 16D7 é representada pela SEQ.ID.NO:20; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve é representada pela SEQ.ID.NO:18.

[0033] O termo "região variável da cadeia pesada" significa um polipeptídio, que tem de 110 a 125 resíduos de aminoácidos de comprimento, e a sequência de aminoácidos da qual corresponde àquela da cadeia pesada do anticorpo monoclonal da invenção iniciando a partir do aminoácido da extremidade N-terminal. O termo "região variável da cadeia leve" significa um polipeptídio que tem de 95 a 115 resíduos de aminoácidos de comprimento, e a sequência de aminoácidos da qual corresponde àquela da cadeia leve do anticorpo monoclonal da invenção iniciando a partir do aminoácido da extremidade N-terminal.

[0034] A presente invenção também se refere a uma composição de ligação que especificamente se liga à proteína da ORF2 do vírus da hepatite E, compreendendo pelo menos uma das regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo monoclonal da invenção, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0035] O referido termo "composição de ligação" da invenção significa uma composição compreendendo duas cadeias de polipeptídios que: (1) quando eles efetivamente se ligam juntos, apresentarão a conformação com uma alta afinidade de ligação ao polipeptídio codificado pela ORF2 do vírus da hepatite E; (2) pode ser obtido a partir do hibridoma de célula produzindo o referido anticorpo monoclonal ou a partir de células hospedeiras geneticamente transformadas as quais expressam as cadeias de polipeptídios da região variável da cadeia leve e/ou da cadeia pesada do referido anticorpo monoclonal da invenção.

[0036] O termo "efetivamente ligado" significa que, quando ligadas juntas, as duas cadeias de polipeptídios podem ser localizadas relativamente, cada uma, através de várias maneiras, incluindo, mas não limitando a, ligação com um fragmento Fab do anticorpo natural ou Fv, ou ligado através de meios de engenharia genética à cadeia simples do anticorpo (scFv). As duas cadeias de polipeptídios correspondem, geralmente, as regiões variáveis da cadeia leve e da pesada do referido anticorpo monoclonal.

[0037] Os termos "Fab", "Fc", "F(ab)2" e "Fv" usados aqui, têm seus respectivos significados imunológicos (Klein, Immunology, John Wiley, New York, 1982; Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochesmistry, 4th Ed., Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986).

[0038] Na invenção, a referida região da cadeia pesada e/ou da cadeia leve pode ser preparada através de métodos convencionalmente usados na técnica, tal como, digestão com papaina. Os exemplos aqui apresentados descrevem o método para preparo do Fab do anticorpo monoclonal 8C11, 8H3, e 13D8.

[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se às moléculas de nucleotideos compreendendo uma sequência de nucleotideos codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do referido anticorpo monoclonal da invenção, ou suas sequências degradadas.

[0040] Em uma configuração da presente invenção, a referida sequência de nucleotideos codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 8C11 tal como representada na SEQ.ID.NO:12 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:11, ou codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 8C11 tal como representada na SEQ.ID.NO:10 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:9.

[0041] Em uma configuração da presente invenção, a referida sequência de nucleotideos codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 13D8 tal como representada na SEQ.ID.NO:8 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.N0:7, ou codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 13D8 tal como representada na SEQ.ID.N0:6 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.N0:5.

[0042] Em uma outra configuração da presente invenção, a referida sequência de nucleotideos codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 8H3 tal como representada na SEQ.ID.NO:16 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:15, ou codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 8H3 tal como representada na SEQ.ID.NO:14 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:13.

[0043] Em uma outra configuração da presente invenção, a referida sequência de nucleotideos codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 16D7 tal como representada na SEQ.ID.NO:20 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:19, ou codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 16D7 tal como representada na SEQ.ID.NO:18 e, preferivelmente, têm a sequência de nucleotideos da SEQ.ID.NO:17.

[0044] A invenção também se refere às variantes conservadas ou fragmentos ativos do referido anticorpo monoclonal, no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos conservados foram substituídos, adicionados ou deletados da sequência de aminoácidos do anticorpo monoclonal da invenção, o qual ainda retém a capacidade de especificamente se ligar ao vírus da hepatite E.

[0045] O termo "variantes conservadas" usado na invenção significa que as variantes retêm, substancialmente, as propriedades dos parentes, tal como as propriedades imunológicas básicas, propriedades estruturais, propriedades reguladoras ou propriedades bioquímicas. Geralmente, a sequência de aminoácidos das variantes conservadas dos polipeptídios está limitadamente diferente daquela do polipeptídio parente de modo que as variantes conservadas e o polipeptídio parente estão similarmente próximos como um todo e são idênticos em muitas das regiões. A diferença da sequência de aminoácidos entre as variantes conservadas e o polipeptídio parente pode ser a substituição, adição ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos ou qualquer combinação dos mesmos. Os resíduos de aminoácidos substituídos ou adicionados podem ou não podem ser codificados pelo código genético. As variantes conservadas do polipeptídio podem ser variantes produzidas espontaneamente ou não espontaneamente. As variantes conservadas dos polipeptídios produzidas não espontaneamente podem ser produzidas através de técnica de mutação induzida ou através de síntese direcionada.

[0046] De acordo com o conteúdo descritivo da invenção, um técnico no assunto podería observar que o fragmento do referido anticorpo monoclonal da invenção pode ser modificado para preservar substancialmente a propriedade de se ligar especificamente ao anticorpo monoclonal derivado do vírus da hepatite E.

[0047] Os inventores compreendem, adicionalmente, que outros anticorpos monoclonais contra a ORF2, podem ter reatividade cruzada com o referido anticorpo monoclonal da invenção. De acordo com a informação detalhada dos determinantes antigênicos aqui descritos, técnicos no assunto podem preparar hibridromas através de métidos conhecidos da técnica e podem obter anticorpos monoclonais com a sequência de aminoácidos diferente daquela do referido anticorpo monoclonal da invenção. Mas, tanto estes anticorpos monoclonais quanto o referido anticorpo monoclonal da invenção apontam para o mesmo determinante antigênico do referido virus da hepatite E, que é, ele tem atividade imunológica de reatividade cruzada. Então, a invenção também compreende o anticorpo monoclonal preparado com base nos determinantes antigênicos descritos e tendo reatividade cruzada com o referido anticorpo monoclonal da invenção.

[0048] Em um outro aspecto da presente invenção, é adicionalmente provido, um determinante antigênico selecionado a partir dos determinantes antigênicos de (1-4) dos polipeptidios codificados pela ORF2 de HEV, o qual: (1) se liga, especificamente, à região variável do anticorpo monoclonal 8C11 ou seus análogos; é exposto na superfície da partícula do vírus da hepatite E; depende da conformação, com sua formação correta e exposição suficiente sendo facilitada pela dimerização do fragmento polipeptídico da ORF2 do vírus da hepatite E; é parcialmente sobreposto ou é adjacente ao determinante antigênico especificamente reconhecido pelo anticorpo monoclonal 13D8; tem a chave dos resíduos de aminoácidos envolvidos na formação dos determinantes antigênicos que estão localizados aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 459 ~601 da ORF2 do vírus da hepatite E; ou (2) se liga, especificamente, à região variável do anticorpo monoclonal 13D8 ou seus análogos; é exposto na superfície da partícula do vírus da hepatite E; depende da conformação, com sua formação correta e exposição suficiente sendo facilitada pela dimerização do fragmento polipeptídico da 0RF2 do vírus da hepatite E; é parcialmente sobreposto ou é adjacente ao determinante antigênico especificamente reconhecido pelo anticorpo monoclonal 13D8; tem a chave dos resíduos de aminoácidos envolvidos na formação dos determinantes antigênicos que estão localizados aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 459 ~ 601 da ORF2 do vírus da hepatite E; ou (3) se liga, especificamente, à região variável do anticorpo monoclonal 8H3 ou seus análogos; é exposto na superfície da partícula do vírus da hepatite E; depende da conformação, com sua formação correta e exposição suficiente sendo facilitada pela dimerização do fragmento polipeptídico da ORF2 do vírus da hepatite E; têm sua exposição suficiente e estabilidade da estrutura espacial e desse modo melhora extraordinariamente sua capacidade de ligação com o Mab 8H3 na ligação do anticorpo monoclonal 8C11 com HEV; tem a chave dos resíduos de aminoácidos envolvidos na formação dos determinantes antigênicos que estão localizados aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 459 ~ 601 da ORF2 do vírus da hepatite E; ou (4) se liga, especificamente, à região variável do anticorpo monoclonal 16D7 ou seus análogos; é um determinante antigênico linear; está localizado aproximadamente entre os resíduos de aminoácidos 499 ~515 da ORF2 do vírus da hepatite E.

[0049] Em um outro aspecto da presente invenção, é provido adicionalmente, um polipeptidio recombinante ou isolado ou polipeptidios análogos, compreendendo pelo menos um dos referidos determinantes antigênicos da 0RF2 do virus da hepatite E da invenção ou qualquer combinação dos mesmos, ou um fragmento tendo alta homologia de sequência com pelo menos uma dos referidos determinantes antigênicos.

[0050] O termo "homologia de sequência" usado na invenção pretende mediar a homologia entre as sequências de nucleotideos ou sequências de aminoácidos. Usualmente, as sequências estão alinhadas juntas para a adequação máxima. O termo "homologia" tem o mesmo significado bem conhecido da técnica e pode ser calculado através da tecnologia descrita em (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, 1998; BIOCOMPUTING; INFORMATIOCS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W. ed., Academy Press, New York, 1993; COMPUTER ANALY SIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M.&Griffin, H.g., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALY SIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academy press, 1987; e SEQUENCE ANALY SIS PRIMER, Gribskov, M.&Devereux, J., eds. M. Stockton Press, New York, 1991).

[0051] Apesar de existir muitos métodos disponíveis para medir a homologia de dois polinucleotídios ou dois polipeptidios, o termo "homologia" é bem conhecido através de todas as técnicas relacionadas (relacionado ao SIAM J. Applied Math. Cartllo, H.,&Lipton, D., (1988) 48:1073). Os métodos conhecidos para medir a homologia ou similaridade de duas sequências incluem mas não se limitam àqueles publicadas no "Guide to Huge Computers", Marting J. Bishop, ed., Academy Press, San Diego, 1994 e SIAM J. Applied Math. Cartllo, H.&Lipton, D., (1988) 48:1073. Todos estes métodos são compilados em programas de computador, de acordo com algumas regras específicas. Dentre elas, os métodos preferidos incluem, mas não se limitam ao programa GCG (Devereux, J., etc., Nucleic Acids Research (1984)12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., etc., J. Molec.Biol. (1990) 215:403).

[0052] Por exemplo, uma sequência de polinucleotídio, que tenha pelo menos 95% "homologia" para a sequência de referência, significa que exceto por 5 nucleotídeos em cada 100 nucleotídeos do polinucleotídio, a outra sequência de nucleotídeos é idêntica àquela da sequência referência. Em outras palavras, para obter uma sequência de polinucleotídio tendo pelo menos 95% de homologia com a sequência, 5% de todos os nucleotídeos da sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por um outro tipo de nucleotídeos; ou alguns nucleotídeos não mais do que 5% de todos os nucleotídeos da sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência; ou qualquer combinação de, deleção, inserção e substituição pode ocorrer em até 5% de todos os nucleotídeos da sequência de referência. E estas mutações na sequência de referência podem ser localizadas nas extremidades 5' ou 3' terminais da sequência de referência, ou em qualquer lugar entre as duas extremidades terminais, ou pode ser dissipada individualmente ou pode formar um ou mais grupos adjacentes na sequência de referência.

[0053] Similarmente, uma sequência de polipeptídio, que tem pelo menos 95% de "homologia" com a sequência de referência significa que exceto pelos 5 resíduos de aminoácidos em cada 100 resíduos de aminoácidos do polipeptídio, a outra sequência de aminoácidos é idêntica àquela da sequência de referência. Em outras palavras, para obter uma sequência de polipeptidios tendo pelo menos 95% de homologia com a sequência de referência, até 5% de todos os resíduos de aminoácidos da sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por outro tipo de resíduos de aminoácidos; ou alguns resíduos de aminoácidos não mais do que 5% de todos os resíduos de aminoácidos da sequência de referência podem estar inseridos na sequência de referência; ou qualquer combinação de: deleção, inserção e substituição podem ocorrer em até 5% de todos os resíduos de aminoácidos da sequência de referência. E, estas mutações na sequência de referência podem estar localizadas nas extremidades 5' ou 3' terminais da sequência de referência, ou em qualquer lugar entre as duas extremidades terminais, ou pode ser dissipada individualmente ou pode formar um ou mais grupos adjacentes na sequência de referência.

[0054] Em um aspecto da presente invenção, é provido um polipeptídio recombinante ou isolado ou análogo do mesmo, compreendendo todos os referidos determinantes antigênicos de (1) e (3) da presente invenção, os quais podem formar partículas do tipo viral.

[0055] Em uma outra configuração da presente invenção, todos os referidos polipeptidios recombinantes ou isolados podem formar partículas do tipo viral, as quais são: (1) polipeptídio 208 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:22; ou (2) polipeptídio 229 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:21; ou (3) polipeptídio 243 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:23; ou (4) polipeptídio 251 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:24; ou (5) polipeptídio 262 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:25; ou (6) polipeptídio 292 tendo a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:26.

[0056] Em um outro aspecto da presente invenção, é ainda provida uma molécula de nucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo codificando os referidos polipeptídios ou seus análogos, ou sua sequência degradada.

[0057] Em uma configuração da presente invenção, a sequência de nucleotídeo da referida molécula de nucleotídeo codifica: (1) a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ. ID.NO: 22; ou (2) a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:21; ou (3) a sequência de aminoácido tal como representada na SEQ.ID.NO:23; ou (4) a sequência de aminoácidos tal como representada na SEQ.ID.NO:24; ou (5) a sequência de aminoácidos tal como representada na SEQ.ID.NO:25; ou (6) a sequência de aminoácidos tal como representada na SEQ.ID.NO:26.

[0058] Deve ser entendido pelos técnicos no assunto que, o referido polipeptídio, capaz de formar partículas do tipo viral (ou seja, polímeros do polipeptídio NE2 de HEV) pode compreender uma ou mais substituições conservativas, adições e/ou deleções de aminoácidos e ainda manter a propriedade de formar a partícula do tipo viral e a imunogenicidade. Em vias gerais, os resíduos de aminoácidos polares no referido polipeptídio podem ser substituídos por outro tipo de resíduos de aminoácidos polares, e resíduos de aminoácidos não-polares podem ser substituídos por outro tipo de resíduos de aminoácidos não-polares, sem alterar a capacidade do polipeptídio de formar polímeros. A substituição específica e a modificação dos aminoácidos serão discutidas nos Exemplos mencionados a seguir.

[0059] A presente invenção provê, ainda, um método para classificar os polipeptídios e seus análogos. Os referidos polipeptídios ou seus análogos tem as mesmas propriedades de se ligarem, especificamente, ao referido anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3 da invenção como ao referido determinante antigênico (1) ou (3) da ORF2 do vírus da hepatite E da invenção. O referido método compreende as etapas de: (1) contatar o referido anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3 com analítico por um tempo suficiente para ocorrência da imuno-reação sob condições apropriadas para a interação do antígeno com o anticorpo; (2) detectar a existência da reação analítico com o referido anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3; e (3) recuperar o analítico resultante capaz de reagir com o referido anticorpo monclonal.

[0060] Em uma configuração da presente invenção, os polipeptídios ou seus análogos, que podem se ligar especificamente ao anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3 da invenção, podem ser classificados a partir do banco de exposição de fago peptídio-7.

[0061] Em um outro aspecto da presente invenção, são adicionalmente providos alguns polipeptídios ou seus análogos classificados através do método acima mencionado. Até agora, os polipeptídios foram selecionados a partir de um banco de peptídios sintetizados usando os métodos precedentes, e os polipeptídios selecionados podem ter sequência de aminoácidos similares àquelas dos polipeptídios precedentes. Os técnicos nestas pesquisas de campo deveríam observar que os análogos dos polipeptídios podem ser selecionados a partir de bancos de compostos. De modo que, o análogos de polipeptídos pode pertencer a um tipo de composto não-peptídico, o qual tem propriedade similar ou parecida com a do determinante antigênico da 0RF2 de HEV para se ligar com os referidos anticorpos monoclonais.

[0062] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é provida uma molécula de nucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo codificando os referidos polipeptídios ou análogos de polipeptídios, ou suas sequências degradadas. Os técnicos destas pesquisas de campo deveríam observar que a sequência de polipeptídios ou sua sequência degradada pode ser deduzida a partir de uma sequência de aminoácidos do polipeptídio ou do polipeptídio análogo do polipeptídio ou dos análogos de polipeptídios e é obtida usando os métodos mencionados na invenção.

[0063] Em um outro aspecto da presente invenção, é ainda provido um kit de diagnóstico para diagnosticar a infecção pelo vírus da hepatite E em amostras biológicas, o qual compreende uma quantidade efetiva de diagnóstico de pelo menos um dos determinantes antigênicos de HEV, polipeptídios ou seus fragmentos com atividade de ligação de acordo com a presente invenção, ou polipeptídios e seus análogoso classificados pelo método da presente invenção, e um reagente de detecção apropriado para detectar a referida interação do antígeno com o anticorpo.

[0064] Em particular, a presente invenção provê um kit de diagnóstico para detecção do anticorpo IgG contra o vírus da hepatite E na amostra biológica, o qual compreende uma quantidade efetiva de diagnóstico de pelo menos um dos referidos determinantes antigênicos, ou seus fragmentos; e agentes de detecção correspondentes aos adotados no método de detecção.

[0065] Em uma configuração da presente invenção, os anticorpos IgG anti-HEV da amostra biológica são detectados através do método ELISA usando um kit de diagnóstico compreendendo ο NE2 da presente invenção.

[0066] A presente invenção também provê um kit de diagnóstico para detectar anticorpos IgM contra HEV, o qual compreende uma quantidade efetiva de diagnóstico com pelo menos um dos determinantes antigênicos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a presente invenção, e um reagente de detecção apropriado para o método relacionado.

[0067] Em uma configuração da presente invenção, os anticorpos IgM contra HEV são detectados através do método ELISA de captura da cadeia-μ (E2-IgM), onde o kit de diagnóstico usado compreende o determinante antigênico NE2 da presente invenção, marcado com a peroxidase de rábano silvestre.

[0068] Em um outro aspecto da presente invenção, é ainda provido um kit de diagnóstico para detectar os anticorpos totais contra HEV, o qual compreende uma quantidade efetiva de diagnóstico de pelo menos um dos determinantes antigênicos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a presente invenção, e um reagente de detecção apropriado aos métodos relacionados.

[0069] Em uma configuração da presente invenção, os anticorpos totais contra HEV são detectados através do método ELISA sanduíche com antígeno-duplo (E2-IgM) , onde o kit de diagnóstico usado compreende o determinante antigênico NE2 e o determinante antigênico HE2 marcado com a peroxidase de rábano silvestre, da presente invenção.

[0070] O termo "quantidade efetiva de diagnóstico" mencionado na presente invenção significa que o determinante antigênico ou os fragmentos, e os polipeptidios, ou polipeptidios análogos da presente invenção, se apresentam em uma quantidade efetiva suficiente para detecção de HEV em uma amostra biológica. De acordo com os métodos imunológicos conhecidos, os técnicos no assunto reconhecem que a quantidade do material acima mencionado seria variável dependendo dos diferentes métodos imunológicos em uso. Nos ensinamentos das referências publicadas, eles saberão como selecionar uma quantidade apropriada dos determinantes antigênicos ou fragmentos, e dos polipeptidios ou dos análogos de peptidios da presente invenção de modo a diagnosticar o HEV na amostra biológica. E eles também irão saber que o kit de diagnóstico, quando apropriado, podería incluir adicionalmente, transportadores absorventes apropriados, solução/reagente tampão, o reagente usado para produzir um sinal visível para o teste e o manual do usuário. A quantidade efetiva ótima de diagnóstico é de 1 ng-10.000 ng por dose, preferivelmente de 10ng-1.000 ng por dose, e mais preferivelmente de lOOng-l.OOO ng por dose.

[0071] Estes técnicos no assunto seriam competentes para construir um método imunológico apropriado, um reagente relevante, e um sistema de tampão adequado para proceder com o kit de diagnóstico de acordo com a interação específica do antígeno com o anticorpo, métodos de testes imunolóicos como comumente usados a partir da descrição da presente invenção.

[0072] De modo geral, os métodos imunológicos apropriados para procedimentos com o kit de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a: [0073] Um método para detecar os anticorpos totais contra HEV em uma amostra biológico compreendendo as etapas de: imobilizar pelo menos um dos polipeptidios contendo o determinante antigênico da presente invenção, preferivelmente ambos os determinantes antigênicos reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3, na superfície de um suporte de fase sólida; adicionar o analítico em um tampão apropriado; adicionar um polipeptídio carregando um marcador detectável e compreendendo o referido determinante antigênico, preferivelmente, ambos os determinantes antigênicos reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 8C11 e/ou 8H3; e detectar o transportador com o marcador detectável, determinando, desse modo, a presença ou a quantidade de anticorpos anti-HEV. Preferivelmente, o marcador detectável é a peroxidade de rábano silvestre ou a fosfatase alcalina.

[0074] Um método para detectar o anticorpo IgG contra HEV em uma amostra biológica compreendendo as etapas de: imobilizar pelo menos um dos polipeptidios compreendendo o determinante antigênico da presente invenção, preferivelmente, o polipeptídio compreendendo o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8C11 e/ou o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8H3, na superfície de um suporte de fase sólida; adicionar a amostra a ser detectada a qual está em um tampão apropriado; adicionar um segundo anticorpo carregando um marcador detectável contra o anticorpo IgG das espécies, a partir das quais as amostras a serem detectadas, são obtidas; e detectar o transportador com o marcador detectável pelo anticorpo secundário, determinando, desse modo, a presença ou a quantidade de anticorpos IgG anti-HEV na amostra. Preferivelmente, o marcador detectável é a peroxidade de rábano silvestre ou a fosfatase alcalina.

[0075] Um método para detectar o anticorpo IgM contra o HEV em uma amostra biológica compreendendo as etapas de: imobilizar pelo menos um dos polipeptidios compreendendo o determinante antigênico da presente invenção, preferivelmente, os polipeptidios compreendendo o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8C11 e/ou o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8H3, na superfície de um suporte de fase sólida; adicionar a amostra a ser detectada a qual está em um tampão apropriado; adicionar um segundo anticorpo carregando um marcador detectável contra o anticorpo IgM das espécies a partir das quais as amostras a serem detectadas foram obtidas; e detectar o transportador com o marcador detectável pelo anticorpo secundário, determinando, desse modo, a presença ou a quantidade de anticorpos IgM anti-HEV na amostra. Preferivelmente, o marcador detectável é a peroxidade de rábano silvestre ou a fosfatase alcalina.

[0076] Um método para detectar o anticorpo IgM contra HEV em uma amostra biológica compreendendo as etapas de: imobilizar um anticorpo secundário contra o anticorpo IgM, das espécies das quais a amostra a ser detectada é derivada, na superfície de um suporte de fase sólida; adicionar a amostra a ser detectada a qual está em um tampão apropriado; adicionar pelo menos um dos polipeptidios compreendendo o determinante antigênico da presente invenção, preferivelmente os polipeptídios compreendendo o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8C11 e/ou o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8H3, carregando um marcador detectável; adicionar um anticorpo secundário carregando um marcador detectável e reconhecido pelo referido polipeptídio; e detectar o transportador com o marcador detectável, determinando, desse modo, a presença ou a quantidade de anticorpos IgM anti-HEV na amostra. Preferivelmente, o marcador detectável é a peroxidade de rábano silvestre ou a fosfatase alcalina.

[0077] Dentro deste contexto, um método para selecionar um apropriado anticorpo secundário é conhecido pelos técnicos no assunto; em adição da peroxidase de rábono silvestre e a fosfatase alcalina, o marcador detectável para detectar a interação do antigeno com o anticorpo pode ser um radioisótopo, fluoresceina, biotina, estraptividina, β-galactosidase, etc.

[0078] Em um outro aspecto da presente invenção, é adicionalmente provido uma composição de vacina para profilaxia da infecção do virus da hepatite E em mamíferos, a qual compreende uma quantidade imune efetiva de pelo menos um dos polipeptídios ou análogos de polipeptídios definidos na presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos, e um adjuvante apropriado. Em uma outra configuração da presente invenção, a vacina mencionada compreende uma quantidade imune efetiva de, pelo menos, um dos polipeptídios ou dos polipeptídios análogos da presente invenção, a qual compreende determinantes antigênicos reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 8C11 e 8H3.

[0079] Em uma configuração da presente invenção, a composição de vacina para profilaxia da invenção pelo virus da hepatite E em mamíferos compreende uma quantidade imune efetiva dos polipeptídios da presente invenção, e é capaz de se ligar especificamente a pelo menos um dos anticorpos monoclonais da presente invenção. A vacina pode opcionalmente compreender veículos imunologicamente apropriados e/ou adjuvantes. Os técnicos no assunto reconheceríam se o adjuvante fosse usado e como selecionar um adjuvante comumente usado em imunologia. Os adjuvantes imunológicos disponíveis incluem, mas não se limitam a, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, etc.

[0080] Em uma configuração da presente invenção, o referido polipeptídio 239 com a propriedade de montagem de uma partícula do tipo viral, é usado para preparar a vacina com um adjuvante de alumínio ou sem qualquer adjuvante. E a imunização com esta vacina pode prevenir efetivamente um camundongo da infecção pelo HEV. O termo "quantidade imune efetiva" da presente invenção refere-se a uma quantidade de vacina suficiente para indução de resposta imune protetora efetiva em indivíduos vacinados. A quantidade imune efetiva de uma vacina pode ser variável dependendo das diferentes formas de vacinação, tipos de dosagens e dos indivíduos vacinados. Com o conhecimento geral da técnica, os técnicos no assunto saberão como determinar uma quantidade apropriada de uma vacina sem triagens indevidas. Preferivelmente, a quantidade imune efetiva é de 0,0001 mg-0,1 mg por dose, mais preferivelmente de 0,001mg-0,06 mg por dose, e adicionalmente mais preferivelmente de 0,1 mg-0,04 mg por dose.

[0081] Em um outro aspecto da presente invenção, é adicionalmente provido o uso de anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos ou variantes conservadas da presente invenção na preparação de um medicamento para diagnóstico, profilaxia e/ou tratamento da infecção pelo virus da hepatite E.

[0082] As partículas de HEV podem ser detectadas usando os anticorpos monoclonais 8C11, 13D8 ou 8H3, porque estes anticorpos monoclonais reconhecem os determinantes antigênicos localizados na superfície do HEV. Em uma configuração da presente invenção, é provido um método para detectar partículas HEV, compreendendo as etapas de: imobiliar pelo menos um dos anticorpos monoclonais acima mencionados na superfície de um suporte de fase sólida; contactá-lo com a amostra a ser detectada a qual pode conter HEV; adicionar um anticorpo contra HEV carregando um marcador detectável; e detectar o complexo do anticorpo monoclonal/HEV imobilizado na superfície do suporte. Em uma outra configuração da presente invenção, é provido um método para detectar a partícula de HEV, compreendendo as etapas de: imobilizar um anticorpo anti-HEV na superfície de um suporte de fase sólida; contactá-lo com a amostra a ser detectada a qual pode conter HEV; adicioná-lo ao referido anticorpo monoclonal carregando o marcador detectável; e detectar o complexo do anticorpo/HEV imobilizado na superfície do suporte. Em uma outra configuração da presente invenção, é provido um método para detectar a partícula de HEV, compreendendo as etapas de: misturar o referido anticorpo monoclonal com um marcador detectável (incluindo partícula coloidal dourada, partícula de emulsão, etc.) carregando o anticorpo policlonal anti-HEV ou seu anticorpo monoclonal carregando um marcador detectável; contactá-lo com a amostra a ser detectada a qual pode conter HEV; e detectar o sinal através da ligação do complexo do anticorpo/HEV ao anticorpo imobilizado anti-camundongo na resina imuno-cromatográfica durante a imuno-cromatografia.

[0083] Similarmente, devido aos anticorpos monoclonais 8C11, 13D8 e 8H3 reconhecerem os determinantes antigênicos localizados na superfície de HEV, estes anticorpos monoclonais e vários anticorpos derivados desenvolvidos com base em sua região de ligação com o antígeno (regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada do anticorpo) podem ser aplicados para profilaxia e/ou tratamento de imunização passiva da infecção pelo vírus da hepatite E.

[0084] Em um aspecto da presente invenção, em particular, é provido um kit de diagnóstico para diagnosticar a infecção por HEV, ou seja, detectar o antígeno de HEV, incluindo a quantidade efetiva de diagnóstico de pelo menos um dos anticorpos monoclonais, seus fragmentos ativos, e variantes conservadas da presente invenção, ou qualquer combinação dos mesmos, e um reagente de detecção apropriado para a interação do antígeno com o anticorpo.

[0085] Em uma configuração da presente invenção, o método ELISA sanduíche com anticorpo-duplo é usado para detectar o antígeno de HEV, onde, o kit de diagnóstico compreendendo o anticorpo monoclonal da presente invenção e o anticorpo monoclonal 8C11 marcado com a peroxidade de rábano silvestre é usado.

[0086] O termo "quantidade efetiva de diagnóstico" da presente invenção se refere a quantidade de anticorpo monoclonal da presente invenção suficiente para efetivamente detectar a presença de HEV na amostra biológica. De acordo com os métodos imunoquimicos conhecidos, os técnicos no assunto reconhecem que a quantidade de material acima mencionado seria variável dependendo dos diferentes métodos imunoquimicos específicos usados. De acordo com os ensinamentos das referências publicadas, eles saberíam como selecionar uma quantidade apropriada do anticorpo monoclonal da presente invenção de modo a diagnosticar HEV em uma amostra biológica. E eles também saberíam que quando apropriado, o kit de diagnóstico pode incluir transportadores apropriados, tampão solução/reagente, reagentes uados para detectar qualquer sinal produzido e um manual do usuário. Preferivelmente, a quantidade efetiva de diagnóstico é de lng-10.000 ng por dose, mais preferivelmente de lOng-l.OOOng por dose, e ainda mais preferivelmente 100 ng-l.OOOng por dose.

[0087] Em um outro aspecto da presente invenção, é adicionalmente provido um método para detectar a presença do antígeno HEV e/ou do anticorpo anti-HEV na amostra biológica, compreendendo as etapas de: a) prover um anticorpo primário sendo capaz de se ligar especificamente ao HEV e um anticorpo secundário, onde pelo menos um dos anticorpos primários e o anticorpo secundário é o anticorpo monoclonal ou os fragmentos disponíveis dos mesmos, de acordo com a reivindicação 1; b) prover um produtor de sinal capaz de se ligar ao anticorpo secundário, a intensidade do produtor de sinal estando apenas relacionadas a quantidade do anticorpo secundário; ou preferivelmente, um produtor de sinal diretamente ligado ao anticorpo secundário; c) ligar o anticorpo primário com um suporte, formando um complexo de ligação do anticorpo primário/suporte; d) contatar o complexo de ligação com uma amostra biológica a ser detectada, permitindo ao HEV presente, provavelmente, na amostra, se ligar ao complexo de ligação do anticorpo/suporte; e) contatar o anticorpo secundário que se liga efetivamente ao produtor de sinal com o complexo HEV/anticorpo primário/suporte, formando desse modo, um complexo produtor de sinal/anticorpo secundário/HEV/ anticorpo primário/suporte; e f) detectar o sinal produzido a partir do produtor de sinal.

[0088] Se desejado, no método de detecção acima, o anticorpo primário ou o anticorpo secundário pode ser um de ou qualquer combinação de uma pluralidade de anticorpos monoclonais ou fragmentos ativos de ligação dos mesmos de acordo com a reivindicação 1, respectivamente.

[0089] Em ainda um outro aspecto da presente invenção, é adicionalmente provida uma composição farmaceuticamente para tratamento da infecção por HEV, compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um dos anticorpos monoclonais da presente invenção, ou fragmentos ativos ou mutantes conservativos dos mesmos, e transportadores farmaceuticamente apropriados e/ou excipientes.

[0090] Em um outro aspectos da presente invenção, é adicionalmente provido um método para profilaxia e/ou tratamento da infecção pelo virus da hepatite E, compreendendo a administração aos indivíduos de uma quantidade profilaticamente efetiva ou de uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um dos anticorpos monoclonais precedentes da presente invenção, ou seus fragmentos ativos ou mutantes conservativos.

[0091] O termo "quantidade profilaticamente efetiva" pode ser substituído por um termo precedente "quantidade imunologicamente efetiva", o qual significa uma quantidade suficiente para induzir a prevenção imune para indivíduos vacinados. É bem conhecido que a "quantidade profilaticamente efetiva" pode variar de acordo com as vias de vacinação, probabilidade, indivíduos vacinados e os anticorpos monoclonais usados ou seus fragmentos ativos. De acordo com as referências publicadas, os ensinamentos e os correspondentes critérios clínicos da técnica, a "quantidade profilaticamente efetiva" pode ser determinada com testes limitados. A quantidade preferida profilaticamente/ imunologicamente efetiva é de 0,0001mg-0,lmg por dose, mais preferivelmente de 0,001mg-0,06mg por dose, e ainda mais preferivelmente de 0,01mg-0,04 mg por dose.

[0092] Similarmente, o termo "quantidade terapeuticamente efetiva" significa uma quantidade suficiente para induzir uma proteção efetiva para os indivíduos e para neutralizar HEV. E é bem conhecido que a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monoclonal pode variar dependendo de diferentes esquemas de tratamento, curso da doença, situações dos indivíduos e dos anticorpos monoclonais ou dos fragmentos ativos usados, De acordo com as referências publicadas, os ensinamentos e com os correspondentes critérios clínicos da técnica, um clínico pode determinar a "quantidade terapeuticamente efetiva' de um anticorpo monoclonal baseado em sua própria experiência. A quantidade terapeuticamente efetiva é de 0,001mg-20 mg por kg de peso, mais preferível é de 0,01mg-10mg por kg de peso e, ainda mais preferível é de -0,lmg-10mg por kg de peso.

[0093] Todos os anticorpos monoclonais e os fragmentos ativos dos mesmos, os determinantes antigênicos e os fragmentos ativos dos mesmos, os polipeptídios selecionados através do referido método da presente invenção e seus análogos podem ser expressos em uma célula hospedeira apropriada através de métodos de engenharia genética. Assim, a presente invenção também se refere a um vetor de expressão recombinante compreendendo a molécula de ácido nucleico codificante dos anticorpos monoclonais ou dos fragmentos ativos, os determinantes antigênicos ou seus fragmentos ativos, os polipeptídios selecionados através do referido método da presente invenção ou seus análogos. E a invenção refere-se as células hospedeiras transformadas com os referidos vetores recombinantes de expressão. Muitas células hospedeiras de expressão podem ser usadas na presente invenção, por exemplo, células procarióticas incluindo, mas não se limitando a, Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces; células eucarióticas incluindo, mas não se limitando a, Aspergillus, Saccharomycetes, e células de mamíferos, células de plantas e do gênero. A expressão de todos os produtos de interesse mencionados acima na presente invenção, não estão limitadas à quaisquer vetores de expressão específicos ou as células hospedeiras, enquanto elas podem ser usadas para expressão nos referidos anticorpos monoclonais, em seus mutantes conservativos ou nos fragmentos ativos, ou nos referidos determinantes antigênicos ou em seus fragmentos ativos, e nos polipeptidios selecionados através do método da presente invenção ou seus análogos.

[0094] A célula hibridoma desta invenção pode ser produzida através dos métodos conhecidos da técnica. Especificamente, ele compreende a fusão de uma linha de célula imortalizada como linfócito B que pode produzir o anticorpo desejado. O método para colher os linfócitos dos mamíferos imunizados através do antígeno especial é conhecido. Geralmente, quando de humanos, podem ser usados os linfócitos de sangue periférico; quando de outros mamíferos, podem ser usados os esplenócitos ou os linfócitos. Os mamíferos hospedeiros injetados repetidamente com um antígeno purificado produzirão células produtoras dos anticorpos desejados. Estas células são colhidas, e então fundidas com as células imortailizadas. O método para fusão celular também é um método conhecido da técnica. Geralmente, ele compreende as etapas de: misturar as células com os agentes de fusão tal como PEG; selecionar as células hibridoma através do método padrão, tal como seleção de HAT; analisar o meio de cultura do hibridoma através do imunoensaio padrão tal como ELISA para selecionar as células hibridoma que pode secretar os anticorpos monoclonais a partir do meio de cultura através dos métodos padrões para purificação da proteína. Para qualquer método mencionado acima, existe muitos documentos de referência (por exemplo, Kohler et al. , Hybridroma Techniques, Cold spring Harbor Laboratory, New York, 1980; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Amsterdam, 1985; etc).

[0095] A aplicação e a produção de fragmentos de anticorpos são também conhecidos da técnica, por exemplo, Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevir, Amsterdam, 1985) e Fv (Hochman et al., Biochemistry, 12:1130-1135, 1973; Sharon et al. , Biochemistry, 15:1591-1594, 1976; Ehrlich et al. , Patente U.S. 4,470,925). Além disso, anticorpos bi-especificos podem ser construídos com os compostos e composições da presente invenção através de métodos conhecidos, tal como fusão adicional das células de hibridoma (as quais resultarão em quadromas) (Ler, a patente U.S. 4,474,493) ou a recombinação química de partes de moléculas (Brennan et al., Science, 229:81-83, 1985).

[0096] Os anticorpos e os fragmentos especificamente secretados através das células de hibridoma na presente invenção também podem ser produzidos através do método de recombinação. As sequências codificantes dos anticorpos monoclonais na presente invenção, especialmente as sequências codificantes das regiões variáveis das cadeias pesadas e das cadeias leves, podem ser facilmente obtidos através de métodos conhecidos da técnica. O técnico no assunto pode facilmente determinar as regiões de aminoácidos importantes para a ligação específica do anticorpo monoclonal, por exemplo, as regiões determinantes complementares (CDR) CDRl, CDR2 e CDR3, nas regiões variáveis das cadeias pesadas e das cadeias leves dos genes do anticorpo, as correspondentes sequências de aminoácidos dos mesmos constituem as regiões de ligação específica dos anticorpos. Baseado nas sequências de aminoácidos dos polipeptídios com a mesma ou com a atividade de ligação similar específica do anticorpo monoclonal pode ser preparada através do método de recombinação. Por exemplo, a recombinação das sequências de DNA codificam regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo pode formar uma cadeia Fv simples (ScFv); substituição das partes correspondentes de um anticorpo humano com as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve ou CDRs irão resultar no anticorpo humanizado o qual é muito próximo ao anticorpo humano enquanto mantém a atividade de ligação especifica do anticorpo monoclonal original; e assim em diante.

[0097] Em uma configuração da presente invenção, um antigeno imuno-protetor, uma proteína recombinante NE2 da ORF2 do HEV, foi usada para imunizar camundongos para preparar anticorpos monoclonais, com quatro linhas de células de hibridoma obtidas dos anticorpos monoclonais secretados constantemente, os quais são denominados 13D8, 16D7, 8C11 e 8H3 respectivamente, todos secretados pelos subtipos IgGl como determinado pelo teste de subtipo. De acordo com o Tratado de Budapeste, os inventores depositaram todas estas quatro linhas de células de hibridoma no CCTCC (Universidade de Wuhan, província de Wuhan, China), e os números dos depósitos são CCTCC-C200114, CCTCC-C200115, CCTCC-C200116, CCTCC-C200117, respectivamente.

[0098] De acordo com os anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos preparados na presente invenção, um técnico no assunto pode conseguir as sequências de nucleotídios codificantes da mesma e conseguir suas variantes de acordo com a degradação do códon. De acordo com o conteúdo descritivo da presente invenção, um técnico no assunto pode conseguir vetores recombinantes de expressão contendo as sequências de nucleotídeos descritos acima, e as células hospedeiras transformadas com os vetores de expressão através de muitos métodos. A seleção de células hospedeiras e a tecnologia de transformação são bem conhecidas da técnica, enquanto podem ser usados para expressar os referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos na presente invenção.

[0099] O Western blotting das proteínas HE2 fervidas e não-fervidas mostrou que todos os anticorpos monoclonais 8C11, 8H3 e 13D8 reconhecem os determinantes antigênicos conformacionais, enquanto o 16D7 reconhece os determinantes antigênicos lineares. Os testes bloqueadores e os testes de inibição de ligação mostram que os anticorpos monoclonais 8C11 e 13D8 reconhecem o mesmo determinante antigênico, e que 8H3 e 16D7 identificam dois outros determinantes antigênicos respectivamente. O teste do PCR de captura de anticorpo mostra que os anticorpos monoclonais 8C11, 13D8 e 8H3 podería se ligar ao vírus da hepatite E natural, demonstrando que os determinantes antigênicos reconhecidos estão na superfície de HEV. Os testes de neutralização-proteção destes anticorpos monoclonais mostram que os anticorpos monoclonais 8C11 e 13D8 tem atividade neutralizante, e o determinante antigênico que eles reconhecem têm determinantes antigênicos neutralizantes, de modo que a vacina de polipeptídio contendo este determinante antigênico podería induzir anticorpos neutralizantes. Além disso, o determinante antigênico reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8H3 também está na superfície de HEV, de modo que estes anticorpos podem também ter atividade neutralizante, ou participar de uma regra na imunização anti-HEV dos indivíduos.

[0100] A presente invenção descreve também os determinantes antigênicos formados pelos polipeptidios da ORF2 de HEV, o qual tem a característica de se ligar especificamente a pelo menos um dos referidos anticorpos monoclonais 8C11, 8H3, 13D8 ou 16D7 na presente invenção. Estes determinantes dependem da estrutura espacial da superfície do HEV natural.

[0101] Além disso, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para profilaxia e/ou tratamento da infecção pelo vírus da hepatite E, a qual compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um dos referidos anticorpos monoclonais ou seus fragmentos ativos de ligação, e transportadores farmaceuticamente apropriados e/ou excipientes. De acordo com as condições específicas do indivíduo a ser tratado, um técnico no assunto sabe como selecionar a dose adequada e as vias de administração. A quantidade terapeuticamente efetiva preferível é de 0,001 mg-20 mg por quilograma, a dose especialmente preferida é de 0,01mg-10mg, e a dose adicionalmente mais preferida é de 0,1 mg-lOmg na presente invenção.

[0102] Os testes de Western blotting mostraram que o anticorpo monoclonal 16D7 é capaz de reagir, sensivelmente, com a proteína recombinante NE2 da ORF2 de HEV em várias condições existentes, capazes de detectar traços da quantidade da proteína de HEV no Western blotting. Assim, o anticorpo monoclonal 16D7 pode ser usado pra detectar a pureza e as condições atuais, durante a preparação da proteína recombinante de HEV, que é especialmente vantajosa para a preparação da proteína recombinante, tal como a vacina recombinante de HEV de alta pureza.

Breve descrição dos desenhos [0103] A figura 1 mostra a eletroforese SDS-PAGE dos produtos recombinantes purificados do antigeno NE2 na ORF2 de HEV. A coluna 1 são os marcadores de peso molecular; a coluna 2 é um lisado bacteriano; a coluna 3 é o sobrenadante de 2mmol/L do lavado de uréia; a coluna 4 é o sobrenadante de 4mmol/L do lavado de uréia; a coluna 5 é o sobrenadante de 8mmol/L do lavado de uréia; a coluna 6 é o sobrenadante de 4mmol/L do lavado de uréia dialisado pelo PBS; a coluna 7 é a proteína (não-fervida) recombinante purificada por HPLC; a coluna 8 é a proteína (fervida) purificada em HPLC;

[0104] A figura 2 mostra o perfil MALDI-TOF da proteína recombinante NE2;

[0105] A figura 3 mostra o Western blotting através dos anticorpos monoclonais diferentes da proteína NE2 fervida e não fervida recombinante. As colunas 1, 2 são resultados SDS-PAGE; As colunas de 3~20 são os resultados de Western blotting, com as colunas originais com a proteína NE2 não sendo fervidas enquanto que, as colunas iguais são correspondentes as proteínas NE2 fervidas. As colunas 3, 4 são do anticorpo monoclonal 1F6; as colunas 5, 6 são o anticorpo monoclonal 2C9; as colunas 7, 8 são anticorpos monoclonais 7E8; as colunas 9, 10 são o anticorpo monoclonal 8C11; as colunas 11, 12 são o anticorpo monoclonal 8H3; as colunas 13, 14 são o anticorpo monoclonal 13D8; as colunas 15, 16 são o anticorpo monoclonal 15B2; as colunas 17, 18 são o anticorpo monoclonal 16D7; as colunas 19, 20 são o anticorpo monoclonal como controle;

[0106] A figura 4 mostra o curso da ligação e da dissociação dos anticorpos monoclonais ou seu fragmento Fab com o pedaço NE2;

[0107] As figuras 5A e 5B mostram o efeito melhorado de 8H3 ou de seu fragmento Fab através do anticorpo monoclonal 8C11 e seu fragmento Fab. "A" é o efeito melhorado de 8H3 ou do fragmento Fab de 8H3 pelo anticorpo monoclonal 8C11; "B" é o efeito melhorado de 8H3 ou o fragmento Fab de 8H3 através do fragmento Fab 8C11;

[0108] A figura 6 mostra os resultados de captura RT-PCR através do anticorpo monoclonal de HEV no excremento. A coluna é o marcador de peso molecular; a coluna 2 é o controle sem o anticorpo monoclonal; a coluna 3 é o anticorpo monoclonal 1F6; a coluna 4 é o anticorpo monoclonal 7E8; a coluna 5 é o anticorpo monoclonal 8C11; a coluna 6 é o anticorpo monoclonal 15B2; a coluna 7 é o anticorpo monoclonal 8H3; a coluna 8 é o anticorpo monoclonal 16D7; a coluna 9 é o anticorpo monoclonal 2C9; a coluna 10 é o anticorpo monoclonal 13D8; a coluna 11 é o anticorpo monoclonal anti-HbsAg como controle; a coluna 12 é o anticorpo policlonal anti-NE2 de coelho;

[0109] A figura 7 mostra a melhora da atividade de captura para o HEV pelo anticorpo monoclonal 8H3 através do anticorpo monoclonal 8C11. Al~A4 é revestida pelo 8C11; A6~A12 é livre de revestimento; B1~B12 é revestido por 8H3; C1~C2 é revestido por 8H3; C4~C7 é revestido por 2C9; C9 é o controle negativo da extração do RNA; Cll é o controle negativo da segunda rodada de PCR; Al~A2 é o resultado da suspensão do excremento diretamente asicionada. A3~A4 é a suspensão do excremento incubada com 1:100 do anticorpo monoclonal 8C11; Α6 adição da suspensão de excremento diretamente; A7~A11 é o resultado da suspensão de excremento incubada com 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 e 1:1000.000 do anticorpo monoclonal 8C11; A12 é o resultado da suspensão de excremento incubada com 1;100 do anticorpo monoclonal 13D8; Bl e B2 adição de excremento diretamente; B3, B4 são o excremento incubado com 1:10 do anticorpo monoclonal 8C11; B5, B6 são o excremento incubado com 1:100 do anticorpo monoclonal 8C11; B7, B8 são o excremento incubado com 1:1000 do anticorpo monoclonal 8C11, B9, B10 são o excremento incubado com 1:10.000 do anticorpo monoclonal 8C11; Bll, B12 são o excremento incubado com 1:100 000 do anticorpo monoclonal 8C11; Cl, C2 são o excremento incubado com 1:100 do anticorpo monoclonal 13D8; C4, C5 adição do excremento diretamente; C6, C7 são o excremento incubado com 1:100 do anticorpo monoclonal 8C11;

[0110] A figura 8 mostra o efeito bloqueador em 8 tipos de anticorpo monoclonal anti-NE2 através do soro de um paciente com infecção aguda por HEV;

[0111] As figuras 9A, 9B e 9C mostram o efeito bloqueador em três soros com a infecção HEV na fase de recuperação por 8C11, 8H3 e seus fragmentos Fab;

[0112] A figura 10 mostra as propriedades de 20 aminoácidos.

[0113] As figuras 11A, 11B, 11C, 11D e 11E mostram o resultado do Western blotting de 601 séries de proteínas mutantes com diferentes anticorpos monoclonais. A, B, são resultados dos anticorpos monoclonais 16D7, 13D8, respectivamente: a coluna 1 é a proteína recombinante 600VE, a coluna 2 é a proteína recombinante 602LE, a coluna 3 é a proteína recombinante 599AE, a coluna 4 é a proteína recombinante 598VE, a coluna 5 é a proteína recombinante 597AE, a coluna 6 é a proteína recombinante 601LD, a coluna 7 é a proteína recombinante 601LK, a coluna 8 é a 601LH, a coluna 9 é a proteína recombinante 601LD. C, D são resultados dos anticorpos monoclonais 8C11, 8H3 respectivamente: a coluna 1 é a proteína recombinante NE2, a coluna 2 é a proteína recombinante 600VE, a coluna 3 é a proteína recombinante 602LE, a coluna 4 é a proteína recombinante 599E, a coluna 5 é a proteína recombinante 598VE, a coluna 6 é a proteína recombinante 597AE, a coluna 7 é a proteína recombinante 601LQ, a coluna 8 é a proteína recombinante 601LK, a coluna 9 é 601LH, a coluna 10 é a proteína recombinante 601LD. "E" é o resultado de SDS-PAGE da proteína mutante AA601, a coluna 1 é NE2, a coluna 2 é 601LP, a coluna 3 é 601LI, a coluna 4 é 601LG, a coluna 5 é 601LE, a coluna 6 é 601LD, a coluna 7 é 601LK, a coluna 8 é 601LN, a coluna 9 é 601LH;

[0114] As figuras 12A e 12B mostram a microscopia eletrônica de transmissão do polipeptídio recombinante 239;

[0115] A figura 13 mostra a microscopia de força atômica dos polipeptídios recombinantes 239;

[0116] A figura 14 mostra a dispersão dinâmica de luz resultante do polipeptídio recombinante 239;

[0117] A figura 15 mostra o Western blotting dos polipeptídos recombinantes 239, no soro do paciente com uma infecção HEV aguda. As colunas de 1~7 são o polipeptídio 239 não fervido, as colunas 8~14 são o polipeptídio 239 fervido. A coluna 1 e 8 são os resultados do SDS-PAGE, as colunas 2/9, colunas 3/10, colunas 4/11, colunas 5/12, colunas 6/13 e são cinco soros do paciente na fase aguda da infecção de HEV, as colunas 7/14 são o soro normal;

[0118] A figura 16 mostra o curso dinâmico de vários parâmetros de macacos com infecção por HEV;

[0119] A figura 17 mostra a distribuição da frequência OD dos reagentes de captura anti-HEV-IgM com NE2 como antigeno para o soro de 510 casos de infecção clinica de hepatite aguda;

[0120] A figura 18 mostra a relação entre os valores de E2-IgM e E2-IgG no soro de 200 casos da infecção aguda de hepatite clinica;

[0121] A figura 19 mostra a distribuição da frequência dos valores de OD de E2-IgM e GL-IgM para soro de 119 casos de não-HAV, não-HCV da infecção aguda de hepatite;

[0122] A figura 20 mostra a distribuição da frequência de valores OD para o soro normal e com hepatite aguda detectado pelo kit ELISA indireto com a IgG anti-HEV;

[0123] A figura 21 mostra o bloqueio do soro positivo E2-IgM pelo anticorpo monoclonal 8C11 e 8H3 anti-HEV;

[0124] A figura 22 mostra o bloqueio do E2-IgG pelo anticorpo monoclonal 8C11 e 8H3 anti-HEV ou seu fragmento Fab; e [0125] A figura 23 mostra a consistência dos resultados do soro detectado em dois sanduíches do anticorpo e o ELISA indireto para o soro de 400 doadores de sangue.

[0126] A presente invenção é ilustrada, adicionalmente, em detalhes, nos desenhos a seguir e exemplos. Os exemplos a seguir são dados apenas para descrever a presente invenção. As seleções de vetores, células hospedeiras, concentrações de reagentes, temperatura, e outras variantes são apenas ilustrativas e não deveríam ser interpretadas como limitativas do escopo de proteção da presente invenção. Exemplos; 1. Preparação dos anticorpos monoclonais da presente invenção.

Exemplo 1; Preparação do polipeptídio da 0RF2 de HEV para uso como antíteno. - Preparação dos fragmentos da 0RF2 de HEV para uso como modelo.

[0127] Usando um gene HEV de comprimento completo clonado a partir de um paciente infectado com HEV (de Xin Jiang Provine, China) como modelo (Aye, t.T., Uchida et. al. , Nucleic Acids Research, 20 (13), 3512 (1992); número de acesso no GeneBank D11092), dois primers, da ORF2 FP:5'atgcgccctcggcca-3' como primer "forward" (dianteiro) ORF2 RP: 5'aaataaactataactcccga-3' como primer reverso, a reação em cadeia por polimerase (PCR) é realizada em ciclo térmico de PCR (BIOMETRA T3) sob as seguintes condições: 94°C, por 5 minutos; então 25 ciclos de: 94°C por 50 segundos, 57°C por 50 segundos e 72°C por 2,5 minutos; finalizado por 72 °C por 10 minutos, e um fragmento de DNA específico da ORF2 de HEV de aproximadamente 2kb é aberto e será usado como o modelo para a preparação do polipeptídio da presente invenção. O referido produto de PCR acima é adicionalmente, ligado dentro do vetor comercial disponível pMDl8-T (TAKARA Co.), e então, o clone positivo contendo o gene da ORF2 são identificados através da digestão com BamHi/HindIII. OS 2 fragmentos de DNA da ORF2 de HEV, obtidos pelo método acima para uso como modelo para preparação do polipeptídio da presente invenção foram sequenciados na Shanghai BoYa Bioengineering Co. Usando o primer M13 ( + ) (-) . Um é uma sequência conservativa (Modelo 1, SEQ.ID.N0:2) e o outro é uma sequência mutante (Modelo 2, SEQ.ID.NO:3).

[0128] Através do alinhamento da sequência e da análise para a região de abertura de leitura (ORF), foi descoberto que a referida sequência mutante da ORF2 de HEV (SEQ.ID.NO:3) para uso como modelo para preparo do polipeptidio da presente invenção perdeu a base A quando comparada com a sequência conservativa (SEQ.ID.NO:2) e isto resulta em uma mutação por troca, de forma que os resíduos de aminoácidos 604-605 na ORF2 é mudado de His-Ser-Val para Por-Por-Arg, e a translação do polipeptidio é desse modo, interrompida através de um código "tag" de parada formado pela mutação.

[0129] Preparação do polinucleotídio codificante do polipeptidio NE2 da presente invenção e o vetor de expressão compreendendo o polinucleotídio.

[0130] Os 810bp ou o fragmento de DNA é obtido para ser a sequência de nucleotídio codificante do polipeptidio NE2 da presente invenção, correspondente a sequência de aminoácidos representada como SEQ.ID.NO:4, pelo uso do PCR na sequência acima obtida SEQ.ID.NO:3 como modelo, primers "forward" (dianteiro) HEFP:5'-ggatccatatgcagctgttctactctc gtc-3', na extremidade terminal 5' na qual o sítio BamHI, o sítio Ndel (CAT ATG) , e ATG como códon inicial no sistema E. coli são introduzidos, e HERP:5'-ctcgagaaataaacta taactcccga-3' como primer reverso, na extremidade terminal 5' na qual o sítio EcoRI é introduzido. O PCR foi realizado em ciclos térmicos (BIOMETRA T3) como a seguir: denaturado por aquecimento durante 5 minutos a 94°C, então amplificado por 30 ciclos: 50 segundos a 94 °C, 40 segundos a 57 °C e 40 segundos a 72°C, finalmente 10 minutos a 72°C.

[0131] O vetor de expressão pTO-T7 para expressão do polipeptidio da presente invenção foi construído de acordo com o método conhecido na técnica (LUO Wen-Xin, et al. , Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57), compreendendo as etapas particulares a seguir: clonagem do produto de PCR acima mencionado dentro de um vetor pMDl8-T comercialmente disponível (TAKARA Company), e obtenção de um subclone positivo inserido com o polipeptidio codificante do polipeptidio NE2 através da identificação com BamHI/HindIII; digestão adicional do subclone positivo com Ndel e EcoRI para obter a sequência de polinucleotídeo compreendendo o gene codificante do polipeptidio NE2, o qual é então ligado com Ndel/EcoRI- digerido com pTO-T7. Os clones positivos de pTO-T7-NE2, contendo a sequência do polinucleotídeo codificante do polipeptidio NE2 é verificado através da digestão com Ndel/EcoRI.

Expressão do polipeptidio NE2.

[0132] lul do plasmídeo pTO-T7-NE2 (0,15 mg/ml) foi usado para transformar 40ul de células competentes de E. coli ER2566 (da New England BioLabs company) preparado através do método do cloreto de cálcio. Então a mistura foi plaqueada com Kanamicina (para uma concentração final de 25 μρ/πιΐ, a mesma para o procedimento abaixo) contendo o meio LB sólido, e as placas foram incubadas a 37°C por 10~12 horas até clones individuais serem visíveis. Os clones individuais foram picados e adicionalmente incubados em 4 ml do meio de cultura LB em tubos, sob 220 rpm a 37°C por 10 horas, até o valor de OD55onm da cultura ser de aproximadamente 1,5. Então 1 ml do meio de cultura foi armazenado a 4°C para uso posterior, e 2 ul de 0,5 M de IPTG foi adicionado dentro dos 3 ml restantes da cultura (para uma concentração de 0,3 mM) . O meio de cultura contendo IPTG foi incubado a 37°C por 4 horas sob 220 rpm para indução da expressão do polipeptidio de interesse. l,5ml de meio de cultura induzido foram centrifugados a 12000g por 30 segundos. Os grãos foram re-suspendidos em 100 ul de tampão (lx) carregado com gel (50mM de Tris-Cl, pH6.8, lOOmM de DTT, 2% de SDS, 0,1% de Bromofenol Blue, 10% de Glicerol), e adicionalmente fervido por 10 minutos, então centrifugado a 12000g por 10 minutos. lOul do sobrenadante foi carregado em 12% de SDS-PAGE para análise da expressão do polipeptidio NE2. As cepas transformadas, com grande rendimento de expressão, foram escolhidas por ampla escala de expressão e armazenadas como grãos para o futuro.

[0133] 200 ul de cultura bacteriana armazenada foram adicionados em 500 ml de meio LB fresco em um frasco Erlenmeyer de 1L, e então agitado sob 190rpm a 37 °C por aproximadamente 11 horas até o valor de OD55onm alcançar 2.0. 300ul de 0,5M de IPTG foi adicionado para uma concentração final de 0,3 mM. Então a mistura foi adicionalmente agitada sob 190rpm a 37°C por 4 horas. Por último, os grãos bacterianos foram colhidos a partir do meio de cultura após centrifugação.

Purificação do polipeptidio NE2 expressos no corpo de inclusão de E. coli.

[0134] A cultura de E. coli contendo o polipeptidio NE2 recombinante foi centrifugada a 4.000 rpm por 15 minutos, e cada grânulo dos 500 ml da cultura foi re-suspenso em 15 ml do tampão litico (50 mM de Tris-Cl, lOmM de EDTA e 300 mM de NaCl, pH 7,2) . 0 sobrenadante celular de 200 ml da cultura foi sonicado em um frasco de 250 ml em banho de gelo (Uilbra-Cell VCX500, SONICS & MATERIALS Company) com potência de 70% e um grande aquecimento ultrasônico posicionado no centro do liquido, sonicado por 40 segundos dentro e 1 minuto fora por 20 segundos no total até não ter uma viscosidade óbvia e para verificar se existe um litro de uma substância preta produzida pela carbonização no grânulo celular obtidos por 12000rpm por 10 minutos a 4°C. O grânulo foi re-suspendido com uma solução de tampão I (200 mM de Tris-Cl, pH 8,5; 5mM de EDTA; lOOmM de NaCl) em volume da suspensão, e então suplementado com a solução de tampão I contendo 4% de Triton-X100 em volume igual, alcançando uma concentração final de Triton-Xl00 de 2%. A mistura foi agitada a 200rpm por 30 minutos a 37°C, então centrifugada a 10000 rpm por 10 minutos a 4°C. Os grãos foram re-suspensos em um volume igual do tampão I, e a mistura foi sonicada sob condições como acima (40 segundos dentro, 1 minuto fora; totalizando 3 minutos), então centrifugada (lOOOOrpm) por 10 minutos a 4°C. Os grânulos foram re-suspensos em volume de tampão I, e então um outro volume igual do tampão I contendo 4% de Triton-Xl00 foi adicionado. Após a mistura ter sido agitada (200rpm) por 30 minutos a 37 °C, ela foi centrifugada (lOOOOrpm) por 10 minutos a 4°C. O grânulo foi re-suspendido em volume igual do tampão I, agitado (200rpm) por 30 minutos a 37°C. Então a mistura foi centrifugada a lOOOOrpm por 10 minutos a 4°C. O grânulo foi re-suspendido em volume igual do tampão I o qual contêm 2M de uréia. Após agitação a 200 rpm por 30 minutos a 37°C, a mistura foi centrifugada a lOOOOrpm por 10 minutos a 4°C. Este sobrenadante foi marcado com 2M de NE2. O grânulo foi re-suspendido em volume igual do tampão I contendo 4M de uréia. Após agitação (200rpm) por 1 hora a 37 °C, a mistura foi colocada a 4°C durante a noite, e então foi centrifugada a 12000rpm por 10 minutos a 4°C. Este sobrenadante foi marcado com 4M de NE2, e o grânulo foi descartado. Re-naturação do polipeptidio recombinante NE2.

[0135] lOOml da amostra de 4M de NE2 foi carregada em 2 bolsas de diálise (36 DM, peso molecular retido: 8000 ~ lOOOODa, United Carbon Compound, U.S.A.) e dialisada sob agitação em um béquer de 1L, com 900 ml de lxPBS (20xPBS (1L) contendo 73.344g de Na2HP04-12H20, 4g de KH2PO4, 163.632g de NaCl, 4.024g de KC1 e pH 7,45) a 25°C durante a noite (10 horas), e então aparecerem os precipitados brancos nas bolsas de diálise. Refrescando o dialisado e o retorno para a diálise, e então o dialisado foi refrescado por 3 horas por 4 vezes. A principio, a concentração de uréia na amostra foi de 4 x 10_ÊM quando a diálise está acima. A amostra dialisada foi centrifugada a 25°C, 12000rpm por 10 minutos; o sobrenadante foi filtrado com uma membrana de filtro de 0,22μπι para uma purificação adicional.

Purificação do polipeptidio recombinante NE2 com filtração em gel por HPLC.

[0136] A amostra de NE2 re-naturizada foi purificada adicionalmente por HPLC como abaixo: Instrumento: Beckman System Gold Nouveau 125NMP/166NMP HPLC; Coluna: TSK GEL SW3000 21.5 mm x 60 cm;

Eluição: lxPBS Ph 7,45;

Razão de fluxo: 4ml/minuto;

Onda de detecção: UV a 280nm;

Amostra: 2ml de 4M de NE2 (8mg/ml), Colheita: colheita de picos automáticos através da janela; Tempo de colheita: 1 tubo/20 segundos;

Demora da colheita: 6 segundos.

[0137] Os resultados mostram que depois de tratada em água fervida por 10 minutos, a pureza de um único pico da proteína de interesse analisada pela SDS-PAGE com 12% de acrilamida é de até 90%.

[0138] A célula de E. coli transformada com o plasmídeo pTO-T7-E2 resulta em uma banda na posição de 29kD na análise de SDS-PAGE depois de ser induzida, a qual é de aproximadamente 40% de todas as proteínas da célula hospedeira (Figura 1, Coluna 2), e estava principalmente presente como corpos de inclusão. Tratado com 2mol/L, 4mol/L e 8mol/L de uréia no retorno, o corpo de inclusão de NE2 está presente como diferentes formas: em 2mol/L da proteína sobrenadante em uréia são principalmente 40kD (Figura 1, Coluna 3); em 4mol/L da proteína sobrenadante em uréia abundante de 29kD parece enquanto uma banda visível de 40kD ainda foi mostrada (Figura 1, Coluna 4); proteína em 8mol/L da proteína sobrenadante em uréia é principalmente uma banda de 29kD enquanto a banda de 40kD é sempre invisível (figura 1, coluna 5) ; as proteínas de 4mol/L uréia submetida a diálise pelo PBS são principalmente 40kD e 29kD em uma razão de 5:1 (Figurai, coluna 6); a proteína re-naturalizada sendo, adicionalmente, purificada através de filtragem em gel por HPLC (Figura 1, coluna 7), e após fervura por 10 minutos as bandas de 29kD aumentaram, significativamente, enquanto a banda de 40kD desapareceram e não mostrou outra banda contaminante (Figura 1, coluna 8) .

Análise por MALDI-TOF-MS do polipeptídio NE2.

[0139] As soluções matrizes de trabalho foram saturadas com ácido a-ciano-4-h idroxi-c inâmico (HCCA) em TFA acetonitrila -0,1% <1:2, v/v), e então misturadas com a amostra de NE2 em igual volume que foi purificado por HPLC e dessalinizada através de água pura. Então a mistura foi carregada em um espectrômetro de massa (Bruker Daltonics company, do tipo REFLEX III) para análise MS. A proteína ME2 mostrou nove picos óbvios com a massa/carga para os muitos picos intensivos que foram de 22899.18 m/z, comparável ao peso molecular teórico do monômero NE2 (23.097,02Da) com uma carga. Os outros oito picos foram múltiplos de 23,097.02 Da (figura 2), os quais podem ser multiineros diferentes de NE2. Nas condições experimentais, as moléculas de proteína usualmente carregam 1--2 cargas, e assim os nove picos sào deduzidos como sendo a proteína NE2 do monômero para dodecâmero (Tabela 1).

Tabela 1. Os principais picos da proteína recombinante NE2 em MALDI-TOF-MS.

Exemplo 2: Preparação das linhas de células hibridoma que secretam os anticorpos monoclonaís 8C11, 13D8, 8H3 e 16D7.

[0140] Para a imunização primária, cada camundongo fêmea Balb/C (de 6-8 semanas de idade) foi inoculado com 5 ug do antígeno NE2 recombinante emulsificado com o adjuvante de Freund completo (o volume total é de 50 ul). Quinze dias mais tarde, o camundongo foi imunizado intramuscularmente por um segundo período com a mesma quantidade do NE2 emulsificado no adjuvante de Freund incompleto. Trinta dias mais tarde, o camundongo foi então incentivado intravenosamente (via veia caudal) com 5 ug de antígenos sem o adjuvante. Os camundongos foram sacrificados 72 horas após a imunização incentivada. O sangue foi então colhido e o baço foi amputado para preparar a suspensão dos esplenócitos (suspenso em meio RPMI 1640). Os esplenócitos foram contados com um contador celular. Então os esplenócitos foram misturados em uma proporção de 6:1 com as células de mieloma do camundongo SP2/0 e centrifugados. As células misturadas foram fundidas por PEG (PEG 1500) e então misturadas com o volume igual do alimentador de células, e transferidas para uma placa de 96 poços (200 ul/poço). Em uma atmosfera de 5% de CO2, a placa foi incubada em um incubador (ESPEC BNA-31) a 37°C. 3 dias após, metade do meio de cultura foi substituído por meio HT (1.361 mg de hipoxantina e 0,388 mg de timidina, em meio RPMI 1640 (GIBCO Int.) para um volume final de 100 ml, dissolvido em aproximadamente 45-50°C e filtrado para esterilização). 7 dias mais tarde, em um placa de 96 poços revestida com NE2, foi realizado um ensaio ELISA do sobrenadante da cultura de célula de hibridoma como descrito abaixo. As células positivas no ensaio ELISA foram clonadas através de meios de diluião limitada.

ENSAIO ELISA

[0141] Ο NE2 purificado no HPLC é dissolvido em 0,05 mol/L de ácido carbônico coberto com tampão (20.02 g de Na2CÜ3 e 2,52 g de NaHC03, em ddíbO para um volume final de 1L, pH 9.5) para uma concentração final de 0,3 ug/ml. A placa de micro-titulação com 96 poços com polivinil foi tratada com a solução obtida a 37 °C por 2 horas e então a 4°C durante a noite. A placa de micro-titulação foi lavada com PBST (8.0 g de NaCl, 0,2 g de KH2P04, 2.9 g de Na2HP04-12H20, 0,2 g de KC1 e 0,5 ml de Tween-2 0, em ddH20 para uma concentração final de 1L, pH 7,4) para remover os antigenos não ligados. Então 200 ul de solução bloqueadora (2% de gultina, 0,2% de caseina e 2% de sacarose em 1 xPBS) foram adicionados por poço para bloqueio a 37 °C por 2 horas. Então a solução foi derramada, secos os poços e seladas as placas a vácuo, armazenada a 4°C.

[0142] Para o ensaio, lOOul do sobrenadante da cultura celular foram adicionados em cada poço, e um centro de controle positivo (adicionado lOOul, do soro anti-NE2 de múltiplos camundongos diluídos a 1:100) e um controle negativo (adicional 100 ul de meio HT) para cada placa. Após incubação a 37°C por 30 minutos, a placa foi lavada com PBST por 5 vezes e então decantada. HRP-GAM Ig (DAKO company) foi adicionado e incubado por outros 30 minutos a 37°C. A placa foi lavada com PBS-Tween-20 novamente por 5 vezes e decantada. 50 ul da solução substrato A (13,42g de Na2HP04-12H20, 4,2g de ácido cítrico-H20 e 0,3g de H202 em ddH20 para um final de 700ml) e 50 ul de solução reveladora B (0,2g de TMD e 2 0 ml de dimetilformamida, em ddH20 para um final de 700ml) foram adicionados à placa e revelado por 10 minutos a 37°C. 50 ul de solução de parada finalizou a reação. O valor de OD450 de cada poço foi lido em um leitor ELISA. Em geral, o valor OD450 é pelo menos duas vezes maior que o controle negativo pode ser considerado como positivo.

Preparação e purificação do anticorpo monoclonal contendo ascites .

[0143] Cada camundongo Balb/C com 10 semanas de idade foi inoculado intraperitonealmente com 0,5 ml de adjuvante de Freund incompleto. 2-7 dias mais tarde, as células hibridoma foram colhidas e centrifugadas. Então o sobrenadante é descartado e o soro livre do meio é adicionado as células para uma concentração final de 2 x 105-2xl06 células/ml e 0,5 ml foi usado para inocular cada camundongo. Os ascites foram colhidos de 7-10 dias depois quando o abdômen do camundongo inchou, e então foram centrifugado por 15 minutos a 3,00rpm. O liquido claro na parte mediana do tubo foi pipetado e filtrado com uma membrana de micropore de 0,45μπι para esterilização. O filtrado foi armazenado a -20°C.

[0144] Diluiu-se os ascites tratados com um volume igual de 0,02mol/l de PBS, pH7,4 (81 ml, 0,2mol/L de Na2HPC>4 e 19 ml, 0,2 mol/L de Na2HPC>4, em salina fisiológica para um volume final de 100 ml). (NH4)2S04 foi então adicionado gota a gota com agitação suave até 50% de saturação, e os ascites foram mantidos a 4°C durante a noite). A solução foi centrifugada (12,000rpm) a 4°C por 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. O grânulo foi dissolvido em 2 volumes de PBS. ((NH4)2S04 foi adicionado gota a gota novamente para a solução com agitação até 33% de saturação, e a solução foi mantida durante a noite a 4°C. A solução foi centrifugada (12,000 rpm) a 4°C por 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. O grânulo foi dissolvido em PBS (2 volumes de ascites foi usado) . (NH4)2S04 foi adicionado gota a gota com agitação suave até 50% de saturação, e mantido a 4°C durante a noite. A solução foi centrifugada (12,000rpm) a 4°C por 15 minutos, e o sobrenadante foi descartado. 0 grânulo foi então dissolvido era quantidades adequadas de PBS em uma bolsa de diálise e dialisado em 50100 volumes de 120 nmol/L de tampão Trls-HCl (20mmol/L de NaCl, pH7,8) por aproximadamente 12 horas a 4 eC sob agitação. Substituir o tampão por mais três vezes. O produto de interesse foi armazenado a -20“C em embalagens de alíquotas.

[0145] De acordo com o método descrito acima, 8 linhas de células hibridoma secretaram anticorpos monoclonai s ant i - HEV-ORF2 (1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3, 13D8, 15B2 e 16D7). Titraçao do sobrenadante da cultura da linha de célula de hibridoma.

[0146] Diluir o sobrenadante da cultura celular ou ascites induzidos, então fazer a titulação destes por ELISA indireta. Os resultados estão listados na Tabela 2.

Tabela 2. Titração dos sobrenadantes da cultura do anticorpo monoclonai secretado pelas células e os ascites. 2. Identificação e caracterização dos anticorpos monoclonais na presente invenção.

Exemplo 3. Identificação dos tipos e subtipos dos anticorpos monoclonais.

[0147] As placas de micro-titulação de ELISA sao revestidas com ο NE2 purificado de acordo com o Exemplo 2. 100 ul do sobrenadante de cada anticorpo monoclonai secretando a cultura celular foram adicionados às placas, então estas foram incubadas a 37“C por 30 minutos. Então as placas foram lavadas por 5 vezes com PBST usando um lavador de placas de microtitulação TECAN, com intervalos de 20 segundos, e então decantados. Diluições adequadas dos segundos anticorpos de HRP-GAM IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 (Serotec corapany) marcados com enzimas foram adicionadas e incubadas por outros 30 minutos a 37 eC, A placa foi lavada com PBS-Tween-20, novamente por 5 vezes e decantada. Uma gota para revelação da solução de substrato A (Η;Ό2) e da B (TMD) foram adicionadas em cada placa e desenvolvidas por 10 minutos a 37°C. Uma gota da solução de parada (H2S04) finalizou a reação. Em geral, o limite é o dobro da média negativa e os valores de OD450 acima do limite sâo positivos. Os resultados mostram que a cadeia leve de todos os anticorpos monoclonais ê k; do anticorpo monclonal 1F6 é IgG2b, 2C9 é IgG2a, os outros 8C11, 8H3, 12G8, 13D8, 15B2 e 16D7 são todos IgGl (Tabela 3).

Tabela 3. Subtipo do anticorpo monoclonai.

Exemplo 4: Western blotting da proteína recombinante de HEV dos anticorpos monoclonais.

[0148] A proteína NE2 recombinante purificada por filtragem em gel no HPLC foi fervida por 10 minutos, junto com a NE2 nâo-fervida que foi separada por SDS-PAGE 121, e foram transferidas para a membrana de nitrocelulose. Após bloqueio com 5% de espuma de leite por 1,5 horas em temperatura ambiente, a membrana foi cortada em tiras de 0,5 cm. Os anticorpos monoclonais foram adicionados respectivamente, reagindo à temperatura por 1 hora; então lavado três vezes usando TNT com intervalos de 5 minutos. A IgG anti-camundongo (H+L) de cabra, marcada com AP foi adicionada com o segundo anticorpo marcado com a enzima (Portos Company, diluído em 1:1000 com 5% com espuma de leite) e reagida a temperatura ambiente por 1 hora. Lavado três vezes com TNT com intervalos de 5 minutos, NBT/BCIP foi adicionado para desenvolver a cor (figura 3). Todos os anticorpos monoclonais podem reagir com NE2. Uma vez que NE2 é apto para formar o polímero e o dímero foi ainda observado em SDS-PAGE, a diferença de reação dos anticorpos monoclonais com o monômero e com o dímero de NE2 pode ser encontrado: o anticorpo monoclonal 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 e 13D8 reage melhor com o polímero NE2 do que com o polímero NE2; do contrário, o anticorpo monoclonal 15B2 e 16D7 reage comparativamente com o polímero NE2 e com o monômero. A proteína NE2 é desmontada no monômero após fervura, e a reatividade com o anticorpo monoclonal 15B2 e 16D7 não é influenciada, enquanto a reatividade com o anticorpo monoclonal 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 e 13D8 foi diminuída ou desapareceu.

[0149] Estes resultados indicam que o anticorpo monoclonal 15B2 e 16D7 reconhecem os epítopos lineares de NE2, e o anticorpo monoclonal 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 e 13D8 reconhecem os epítopos conformacionais de NE2 que são expostos mais no dímero ou no polímero do que no monômero da proteína NE2.

Exemplo 5. Medida da constante cinética de ligação do anticorpo monoclonal para o polipeptídio recombinante HEV- 0RF2 .

[0150] Conjugação do polipeptídio recombinante HEV-ORF2 para a amostra No. 1 no cadinho do biosensor.

[0151] O polipeptídio recombinante NE2 foi conjugado no cadinho do Biosensor IAsys tratado com CMD (Affinity System Company, Iasys Plus) de acordo com o manual do usuário: 200 ul de NHS (N-hidroxisuccinimida) e 200 ul de EDC (l-Etil-3(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida) foram misturados, então usados para ativar os grupos hidroxila do cadinho CMD (Caarbixtnetgtk Dextran), o qual foi lavado duas vezes com 40 ul de EDC/NHS, e então preenchido com a mistura acima por 7 minutos. Lavado com 50 ul de PBST (8.0 g de NaCl, 0,2g de KH2PO4, 2,9g de Na2HP04-12H20, 0,2 g de KC1 e 0,5 ml de Tween-20, em ddH20 para 1 litro, pH7,4) por três vezes, e equalizado por aproximadamente um minuto; então lavado por 3 vezes com 40 ul de lOmM de tampão NaAc (pH4,5) e equalizado por aproximadamente um minuto; então, tanto nos poços do cuvette 10 ul de NE2 (0,675 mg/ml, 95% de pureza) quanto 10 ul de BSA (10 mg/ml) como controle foram adicionados respectivamente para observação de ligação. Lavado por três vezes com 50 ul de PBST e equalizado por um minuto, então lavado por três vezes com 40 ul de lOmM de tampão de ácido acético (pH4,5) e equalizado por outro minuto, então lOul de NE2 (0,675mg/ml, 95% de pureza) foram adicionados para ligação por 7 minutos. O cadinho foi lavado três vezes com 50 ul de PBST e equalizado por um minuto, então os grupos carboxila livres são bloqueados com 1M de etanolamina, pH8,5: lavado com 40ul por três vezes e então bloqueado por 3 minutos. O cadinho foi lavado por três vezes com 50 ul de PBST, e equalizado por aproximadamente 1 minuto, e então lavado três vezes com 50 ml de 10 mM de HC1 para remover a molécula de proteína livre e a molécula de proteína com ligação não-específica, e equalizada por 2 minutos. Os cadinhos foram lavados por três vezes com 50 ul de PBST, e equalizados por 1 minuto. A quantidade de proteína conjugada é de aproximadamente 900arc segundos, aproximadamente 4,5ng de NE2/mm2.

Conjugação do polipeptídio recombinante HEV-ORF2 para a amostra do cadinho No.2 do biosensor.

[0152] O polipeptídio recombinante NE2 foi conjugado no cadinho do Biosensor IAsys tratado com CMD (Affinity System Company, Iasys Plus) de acordo com o manual do usuário: 200 ul de NHS e 200 ul de EDC foram usados para ativar os grupos hidroxila do cadinho CMD, o qual foi lavado duas vezes com 40 ul de EDC/NHS, e então preenchido com a mistura acima por 7 minutos. Lavado com 50 ul de PBST por três vezes, e equalizado por aproximadamente um minuto; então lavado por 3 vezes com 45 ul de lOmM de tampão de ácido acético (pH4,5) e equalizado por aproximadamente um minuto; então, tanto nos poços do cuvette 5 ul de NE2 (0,675 mg/ml, 95% de pureza) quanto 5 ul de BSA (10 mg/ml) como controle foram adicionados, respectivamente, para observação de ligação. Lavado por três vezes com 50 ul de PBST e equalizado por um minuto, então lavado por três vezes com 45 ul de lOmM de tampão de ácido acético (pH4,5) e equalizado por outro minuto, então 5ul de NE2 (0,675mg/ml, 95% de pureza) foram adicionados para observação da quantidade de ligação e o tempo de reação foi controlado não acima de 300arc segundos de acordo com a primeira quantidade de ação da proteína NE2. Os cadinhos foram lavados por três vezes com 40 ul de lOmM de tampão de ácido acético (pH4,5) e equalizado por um minuto, então lOul adicionais de NE2 (0,675 mg/ml, 95% de pureza) foram adicionados. Os cadinhos foram lavados por três vezes com 50ul de PBST e equalizados por um minuto, então os grupos carboxila livres são bloqueados com 1M de etanolamina, pH8,5: lavado com 40ul por três vezes e então bloqueado por 3 minutos. O cadinho foi lavado por três vezes com 50ul de PBST, e equalizado por aproximadamente 1 minuto, e então lavado três vezes com 50 ul de 10 mM de HC1 para remover a molécula de proteína livre e a molécula de proteína com ligação não-específica, e equalizada por 2 minutos. Os cadinhos foram lavados por três vezes com 50 ul de PBST, e equalizados por 1 minuto. A quantidade de proteína conjugada final é de aproximadamente 180arc segundos, aproximadamente 0,9ng de NE2/mm2.

Determinação da constante da cinética de ligação [0153] A constante cinética de ligação de cada anticorpo monoclonal foi determinada usando o cadinho No. 2 CMD do Biosensor Iasys. O anticorpo monoclonal é diluído com PBST em mais do que 5 diluições. O cadinho foi lavado com 45ul de PBST por 2 vezes e equalizado por aproximadamente um minuto. 5ul do anticorpo monoclonal diluído nas amostras de ascites purificadas foram adicionados para uma curva de ligação por aproximadamente 3~5 minutos. O cadinho foi lavado com 45ul de PBST por 2 vezes e equalizado por aproximadamente 1~3 minutos para a curva de desmontagem. O cadinho foi lavado com 50 ul de 50mM de HC1 por 3 vezes e equalizado por aproximadamente um minuto; então lavado por trêz vezes com 50 ul de PBST, e equalizado por aproximadamente um minuto. Colhida a curva de ligação do anticorpo monoclonal na proteína emparelhada NE2 no cadinho CMD durante 0-1 minuto, e analizado a constante cinética com o software FastFit . Os resultados estão mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Constantes cinéticas do anticorpos monoclonais 8C11, 8H3, 13D8 e 16D7._______________________________________ Preparação do fragmento Fab do anticorpo monoclonal.

[0154] O anticorpo monoclonal purificado 8C11 {1Omg/ml) é dialisado com 0,1mo1/L de Tris-HCl (pH8, 0} durante a noite. A papaína (da Sigma Co.} foi diluída com o mesmo tampão para 2mg/ml, contendo 2 mmo1/L de BDTA, 1 mmo1/L de DTT, e incubada a 37&c por 30 minutos para ser ativado. Então a papaína ativada é adicionada ao anticorpo monoclonal dialisado na razão por peso de 1:100, e incubada a 37“c por 1 hora. A reação foi terminada através de iodoacetamida {para uma concentração final de 2 0 mmo 1 / L} em um banho de gelo fotofóbico por uma hora. Então os anticorpos monoclonais clivados são dialisados por 20 mmo1 / L de PB (pH 7,4) durante a noite. O fragmento Fab é purificado por DEAE-HPLC com as condições de eluição de: eluir com 20 mmol/L de PB (pH 7,4) por 0 -10 minutos, renovando com 0,5mol/L de NaCl em 20 mmol/L de ΡΒΞ (pH 7,4} por 10 -15 minutos, então equalizado por 15 -20 minutos com 20 mmol/L de PB (pH 7,4). 10 -lOOmg dos anticorpos são carregados, a razão de fluxo é de 5 ml/minuto, e a detecção do comprimento de onda é em 28Qnm. O fragmento Fab purificado é condensado com PEG, e dialisado com 200 mmol/L de PBS (pH 7,4), e então esterilizado com 0,22μιη do filtro micropore e então aliquotado, para ser obtido um produto Fab puro do anticorpo monoclonal 8C11.

[0155] O fragmento Fab de 8H3, 13D8 podería ser obtido através do mesmo método.

Conjugação do polipeptídio recombinante HEV-ORF2 no fragmento CM5 tratado com CMD do biosensor (BIAcore tipo X, BIAcore Co. ) .

Análise da cinética da conjugação com fragmento CM5-NE2.

[0156] NE2 é conjugado usando amina no fragmento CM5 tratado com CMD de acordo com o manual do usuário da BIAcore. 200ul de NHS e 200ul de EDC são misturados para ativar os grupos carboxilas no fragmento CM5: fixando a temperatura de reação a 22 °C, e a razão de fluxo a 10 uL/minuto, 70uL da mistura é carregada para ativar a superfície por um tempo de contato de 7 minutos. A proteína NE2 (0,675 mg/ml, 95% de pureza) diluída em lOmM de acetato, pH 5,5 (em uma razão de 1:5) é carregada para revestimento com a quantidade controlada. A coleta dos dados da linha de base é feita em aproximadamente um minuto. Os grupos carboxilas não reagidos são então bloqueados por 75 μΐ de 1M etanolamina, pH8,5. A quantidade da proteína conjugada é de aproximadamente 84RU, o que é aproximadamente 0,042 ng/mm2.

[0157] Constantes cinéticas de ligação do anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e seu fragmento Fab determinado pelo biosensor BIAcore.

[0158] Cada um dos anticorpos monoclonais e seus fragmentos Fab são diluídos com PBS em mais do que 5 diluições, e então detectados por suas ligações com a proteína NE2 emparelhada no fragmento CM5, e analisada a constante cinética através do software "BIAevaluation".

[0159] Os resultados KD para cada ura dos fragmentos Fab estão mostrados na Tabela 5. As proporções de dissociação do fragmento Fab de 8C11, 13D8 são todas relativamente rápidas, similares às da associação; proporção de associação do fragmento Fab de 8H3 inicia significativamente aumentada, e a proporção de dissociação começa diminuída, a proporção de afinidade é aumentada em IO5. Os processos de associação e de dissociação do anticorpo monoclonal NE2 emparelhado no fragmento é mostrado na figura 4.

Tabela 5» Constantes cinéticas do anticorpo monoclonal 8C11, 8H3, 13D8, 16D7 e seus fragmentos Fab com NE2.

Exemplo 6: Teste de Bloqueio dos Biosensores [0160] Cada um dos anticorpos monoclonais foi diluído para uma concentração de ligação de saturação moderada baseado em sua análise de cinética de ligação, e associados um com outro para detectar a interação do 8H3 cora os anticorpos monoclonais 8C11, 13D8, 16D7 usando o cadinho CMD No. 1, e a interação de 8C11, 13D8, 16D7 com cada um usando o cadinho CMD No. 2. Pela primeira lavagem do cadinho com 45uL de PBST ou duas vezes e equilibrado por 1 minuto, 5 ul de uma amostra de ascites purificada diluída do anticorpo monoclonal Abl foi adicionada e deixada para ligação por 3 ~5 minutos; lavado o cadinho com 45 uL de PBST por duas vezes e equilibrado por 1 ~3 minutos (para o anticorpo monoclonal o qual pode dissociar tal como 8H3, o tempo de ligação foi estendido adequadamente para manter a reação em balanço como possível, e o procedimento de dissociação através da lavagem com PBST foi eliminada; 5uL adicionais da amostra de ascites purificada diluída do anticorpo monoclonal Ab2 foi adicionada e deixada para ligação por 3~5 minutos, então a curva de ligação foi observada. Após a lavagem do cadinho com 45 uL de PBST por duas vezes e equilibrada por 3~5 minutos, a curva de dissociação foi observada. 0 cadinho foi lavado com 50uL de 50 mM de HC1 por três vezes e equilibrado por 1 minuto; então lavado com 50 uL de PBST por 3 vezes e equilibrado por 1 minuto. Troca da ordem de Abl e de Ab2, e repetição dos processos acima. A quantidade de ligação do anticorpo monoclonal (R) foi o valor aumentado do sinal nos primeiros 3 minutos da adição do anticorpo monoclonal. A quantidade de ligação de cada anticorpo monoclonal como o primeiro anticorpo (Rl) e como o segundo anticorpo (R2) foram comparadas. Se R2 é maior que Rl (melhora a razão = (R2-Rl)/Rl, se ele é maior do que 20%, ele é melhorado), ele pode ser considerado como um outro anticorpo monoclonal adicional que melhora a atividade de ligação deste anticorpo monoclonal; ao contrário, se R2 é menor do que Rl, isto quer dizer que este anticorpo monoclonal é inibido pela adição de um outro anticorpo monoclonal (proporção de inibição = (Rl-R2)/Rl, se isto é maior do que 30%, será considerado como existindo inibição; de acordo com a proporção de inibição, existe uma inibição suave (30% ^ 40%) , inibição (40% - 60%), inibição evidente 160% - 80%) e inibição significativa (mais do que 80%), e foi considerada a inibição quando dois anticorpos monoclonais podem inibir um ao outro.

[0161] A proporção de inibição de 8C11 EM 13D8 é de 82%, e a proporção de 13D8 em 8C11 é de 531, o que sugere que os epitopo reconhecidos por estes dois anticorpos monoclonais sobrepõem um ao outro; enquanto 8C11 e 16D7, 13D8 e 16D7 não inibem um ao outro, o que mostra que existe um intervalo de espaço evidente entre os epítopos reconhecidos por 16D7 e que foram reconhecidos pelo 801 e 13D8; similarmente não existe inibição entre 8H3 e 13D8, 8H3 e 16D7, cada um deles mostrou que a região do epitopo reconhecida por 8H3 é diferente daquela dos 13D8 e 16D7 (Tabela 6) . Não é experado que 8C11 tiveram evidente melhora de 8H3 (proporção de melhora próxima a 501), e a curva de dissociação resultante mostrou previamente que a proporção da dissociação rápida do anticorpo monoelonal 8H3 começa devagar devido a influência de 8C11, o que indicou que a ligação de 8C11 com o antígeno resultante na conformação especial muda o antigeno de modo que conduz a uma exposição mais do que suficiente do epitopo no antigeno reconhecido por 8H3.

Tabela 6. Interação entre Mabs 8C11, 8H3, 13D8 e 16D7 Exemplo 7. Teste ELISA do efeito do bloqueio cruzado entre os Mabs .

[0162] A purificação de Mab 8C11: lOml de ascites de 8C11 foi precipitado três vezes com sulfato de amônio saturado, e dialisado contra pH 7,2, lOmM de tampão salina fosfato, então carregado em cromatografia DEAE-52 equilibrado no mesmo tampão e o pico através do fluxo foi colhido.

[0163] 8C11 Mab marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) .

[0164] Dissolver cada 1 mg de HRP e de NaIC>4 cada em água ultra-pura; então adicionar a solução de NaIC>4 gota a gota na solução HRP com agitação, a mistura completa da solução foi colocada no escuro a temperatura ambiente por 30 minutos; adição gotejada de 1 ul de etileno glicol em água ultra-pura dentro da solução de mistura acima com agitação, então deixada por 30 minutos no escuro a temperatura ambiente, de modo a que o processo de oxidação da enzima seja conseguida. Durante o processo de oxidação de HRP, o 8C11 purificado foi dialisado contra 50 mM de CB, pH ~9,6. Após o término da oxidação de HRP, HRP foi misturado com o 8C11 dialisado em uma proporção desejada e dialisado em 50 mM, pH 9,5 de CB por mais 6 horas; então parada, através da adição de uma solução de NaBH4 preparada a fresco com uma quantidade de 0,2 mg de NaBH4,· o resultante foi agitado completamente e mantido por 2 horas a 4°C seguido por sua diálise em 10 mM de PBS durante a noite.

[0165] Os MAbs de 8H3, 13D8 e 16D7 foram purificados e marcados com HRP de modo similar.

[0166] As microplacas de ELISA foram revestidas com 0,5 ug/ml da proteína NE2 purificada e bloqueada de acordo com o método similar como descrito acima no exemplo 2. Dividida em 20 poços dentro de 4 grupos, então adicionado em cada um quatro diferentes Mabs (diluídos 1:105 da titulação ELISA com 20% do soro bovino de recém-nascido) dentro de quatro poços de cada grupo respectivamente a lOOul por poço e 100 ul de 20% do soro bovino de recém-nascido em PBS dentro dos poços restantes como controle; após incubação por 30 minutos a 37 °C, descartado o líquido e adicionado 100 ul de quatro diferentes MAbs marcados com HRP (diluído a 1:103 titulação de ELISA com 2 0% de soro bovino de recém nascido em PBS) ; então incubado por 30 minutos a 37°C; lavado cinco vezes com PBST e corado a seco, adicionados 50 ul de cada um dos cromatógeno A e cromatógeno B, incubado por 15 minutos a 37°C, finalização da reação com 50 ul da solução de parada, e leitura de OD45o/620nm em um leitor de absorbância (PBST, cromatógeno A e cromatógeno B foram todos obtidos da Beijing Wantai Biomedical Company), finalmente, a proporção de bloqueio foi calculado (proporção de bloqueio = 1 - OD bloqueado/ controle OD). A proporção de bloqueio acima de 50% foi considerada como existência de bloqueio. Apenas quando o bloqueio foi incidente em cada um, foi considerado que existe bloqueio. Como descrito abaixo na tabela 7, o MAb de 8C11 e 13D8 pode bloquear um ao outro evidentemente, mas não existe efeito bloqueador entre cada um deles com o MAb de 8H3 e o MAb de 16D7; MAb de 8H3 e MAb de 16D7 não pode bloquear os outros três MAbs respectivamente. Isto sugere que o MAb de 8C11 e 13D8 pode reconhecer a mesma região determinante antigênica, enquanto o MAb de 8H3 e 16D7 reconhecem outras duas regiões determinantes antigênicas.

Tabela 7: 0 ELISA de bloqueio do MAbs de 8C11, 8H3, 13D8 e 16D7 .

Exemplo 8: Melhora do MAb de 8C11 e do fragmento Fab do mesmo na atividade de ligação do MAb de 8H3 e o fragmento Fab do mesmo detectado pelo biosensor BIAcore.

Emparelhamento dos fragmentos CM5-NE2 úteis para detecção.

[0167] O emparelhamento foi conduzido de acordo com o manual do fabricante: misturar 200 ul de NHS e 200 ul de EDC para ativar os grupos carboxila no fragmento CMS; carregado com lOOul da proteína NE2 diluída 1:5 em lOmM de tampão de acetato (pH 5,5) (0,675 mg/mL, 95% de pureza) e reagindo por 10 minutos; bloqueio do grupo carboxila não· reagido com 75 μI de 1M de etanolamina (pH 8,5). A quantidade final da proteína NE2 emparelhada foi de 3295RU, correspondendo a 1,65 ng/mrrh.

[0168] Interação do MAb de 8C11 com o MAb de 8H3 e ο 8H3 do anticorpo Fab.

[0169] O fragmento CM5-NE2 SENSOR para detecção foi usado, e a temperatura de reação foi mantida a 22eC, a razão de fluxo a ΙΟμύ/ιηίηηΙο, e o tampão- de reação foi de PBS. Após o balanço da reação, 10 μύ do anticorpo monoclonal 801 foi carregado, as curvas de ligação e de dissociação foram observadas, e então lavadas com 1 QpL de 50 mM de HC1. As curvas de ligação e de dissociação do anticorpo monoclonal 8H3 e 8H3 do anticorpo Fab foram detectados do mesmo modo. Então, 10 μΙ, do anticorpo monoclonal 8C11 foi carregado, após a associação e a dissociação, 10 μΐϋ do anticorpo monoclonal 8H3 foi carregado para detectar a ligação e a dissociação do anticorpo monoclonal 8H3 na presença do anticorpo monoclonal 8C11. Então lavado com 10 μΐϋ de 50 mM de HC1. Do mesmo modo, a associação e a dissociação do anticorpo 8H3 foram detectadas na presença do anticorpo monoclonal 8C11. Menos associação e mais dissociação do anticorpo monoclonal 8H3 e o 8H3 do Fab foram observadas durante os procedimentos de ligação separados. Na presença do anticorpo monoclonal 8C11, a quantidade de ligação começa maior e estável como mostrado na figura 5.

Interação do anticorpo Fab 9C11 com o MAb 8H3 e o anticorpo Fab 8H3.

[0170] O fragmento CM5-NE2 SENSOR para detecção foi usado, e a temperatura de reação mantida a 22°C, razão de fluxo a ΙΟμΙι/minuto, e o tampão de reação foi PBS. Após conseguir o balanço, ΙΟμΙι do anticorpo monoclonal 8CH3 foi carregado, as curvas de ligação e de dissociação foram observadas, e então lavados com ΙΟμΙι de 50mM de HC1. As curvas de ligação e de dissociação entre o anticorpo Fab 8H3 foram detectadas do mesmo modo. Então ΙΟμΙι do anticorpo monoclonal 8C11 do anticorpo Fab foi carregado, após a associação e a dissociação. ΙΟμΙι do anticorpo monoclonal 8H3 foi carregado para detectar a ligação e a dissociação do MAb de 8H3 na presença do anticorpo Fab 8C11. Então a lavagem com ΙΟμΙι de 50mM de HC1 foi conduzida. Do mesmo modo, a associação e a dissociação do anticorpo Fab 8H3 foi detectada na presença do anticorpo Fab 8C11. Menor associação e maior dissociação do anticorpo monoclonal 8H3 e anticorpo Fab 8H3 foram observadas durante os procedimentos separados de ligação. Na presença de Fab 8C11, a quantidade de ligação começa maior e estável como mostrado na figura 5.

Exemplo 9; Teste de ligação de mAb para as partículas virais HEV através do RT-PCR de captura do anticorpo.

[0171] Os tubos de Eppendorf comuns de l,5mL foram irradiados com UV por 30 minutos, e então adicionados com 500 uL de MAbs com diferentes diluições 1:1000 em tampão com revestimento de carbonato (20,02 g de Na2C03 e 2,52g de NaHC03, com a adição de ddH20 para 1L, pH9,5), então incubados durante a noite a 37°C; o tampão foi descartado, e adicionado 1,5 mL de tampão bloqueador (IX de PBS com 2% de albumina, pH 7,4) para bloqueio por 2 horas a 37°C; o tampão de bloqueio foi descartado e adicionado 500uL de suspensão do excremento positivo de HEV diluída a 10% em salina esterilizada para reagir a 37°C por 2 horas, então lavado com PBST por 6 vezes; e finalmente adicionado 250uL de ddH20 para cada um dos tubos de Eppendorf. Os RNAs extraídos usando o reagente Trizol (GIBCOL) de acordo com seu manual do usuário foram submetidos a transcrição reversa em um volume de reação de 20 μΐ a 42 °C por 40 minutos usando AMV transcriptase reversa com o primer específico A3 (4566-4586, 5'- ggctcaccggagtgtttcttc-3') como primer RT. Então a primeira corrida do RT-PCR foi conduzida em um volume final de 2 0 ul usando 2ul do modelo RT e os primers A3 e A5 (4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3') sob as seguintes condições de reação: pré-denaturação a 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94 °C por 4 0 segundos, anelamento e extensão a 68°C por 40 segundos; extensão a 72°C por 5 minutos. A segunda corrida do PCR foi conduzida em um volume final de 200ul usando 1 ul do produto de reação da primeira corrida como modelo e usando os primers B5 (4372-4392, 5'- gccgcagcaaaggcatccatg-3') e B3 (4554-4575, 5'- gtgtttcttccaaaaccctcgc-3') sob as seguintes condições de reação: pré-denaturação a 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94°C por 40 segundos, anelamento a 56°C por 40 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto e 2 0 segundos; extensão a 72°C por 5 minutos. Como resultado, os anticorpos monoclonais de 8C11, 8H3 e 13D8 foram capazes de se ligar ao virus (figura 6).

Exemplo 10: Melhora do efeito do MAb de 8C11 na capacidade de captura de MAb 8H3 do virus.

[0172] Uma suspensão do excremento positivo de HEV com baixa titulação do virus foi usada no ensaio de RT-PCR de imuno-captura. Para detectar o efeito de Mab 8C11 ou 13D8 (como controle) na capacidade de MAb 8H3 capturar HEV, várias concentrações de MAb 8C11 ou de 13D8 (como controle) foram previamente adicionadas à suspensão do excremento. Como descrito abaixo, na figura 7, o MAb 8C11 melhorou, especificamente, a capacidade de MAb 8H3 de se ligar ao virus marcado, enquanto MAb 13D8, que reconhece a região do epitopo similar de MAb 8C11 e também captura o virus, não teve o mesmo efeito. 3. Efeito de proteção neutralizante dos MAbs descritos na presente invenção.

Exemplo 11: Dose infecciosa da cepa XM de HEV para os macacos Rhesus.

[0173] Extração, transcrição reversa e PCR dos RNAs de HEV a partir do excremento: os RNAs de HEV foram extraídos de 200ul de várias diluições de suspensões de excremetnos usando o reagente Trizol (GIBCOL) de acordo com suas instruções de manipulação, e foram submetidos a transcrição reversa em um volume de reação de 20μ1 usando a transcriptase reversa AMV a 42°C por 40 minutos com o primer especifico A3 (4566-4586, 5'-ggctcaccggagtgtttcttc-3' ) como primer RT. O RT-PCR foi realizado em um volume final de 20ul usando 2ul do modelo RT e dos primers A3 e A5 (4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3') sob as seguintes condições de reação: pré-denaturação a 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94 °C por 40 segundos, anelamento e extensão a 68 °C por 4 0 segundos; extensão a 72 °C por 5 minutos. A segunda corrida do PCR foi conduzida em um volume final de 20ul usando 1 ul do produto de reação da primeira corrida como modelo e usando os primers B5 (4372-4392, 5'-gccgcagcaaaggcatccatg-3') e B3 (4554-4575, 5'-gtgtttcttccaaaaccctcgc-3') sob as seguintes condições de reação: pré-denaturação a 94 °C por 5 minutos; 35 ciclos de denaturação a 94°C por 40 segundos, anelamento a 56°C por 40 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto e 2 0 segundos; extensão a 72°C por 5 minutos. A titulação do PCR da espécie foi definida como a maior diluição na qual a espécie diluída podería ser detectada nas bandas positivas.

[0174] Infecção i.v. com 0,5 ml de títulos da solução diluída de PCR com 101 ~ 105 da cepa XM de HEV, todos os macacos Rhesus apareceram com excreção viral, na qual manifestaram infecção bem sucedida. Por enquanto, dois macacos Rhesus infectados com títulos de PCR de 10° não mostraram qualquer vírus detectável em seu excremento e nenhuma conversão positiva dos anticorpos e do ALT anormal, o que manifestou infecção mal sucedida. Portanto, os 50% das doses infecciosas dos macacos (MID50) da cepa XM de HEV foi uma quantidade de PCR de aproximadamente 101 detectável. Além disso, existe uma tendência de que a dose infecciosa diminua no período anterior do inicio da conversão positiva da excreção do vírus (tabela 8), Tabela 8: Marcadores detectáveis de HEV nos macacos rhesus infectados com diferentes doses. : H9 no dia 13, Η10 no dia 27, Hll no dia 63 morreu com disenteria, respectivamente.

Exemplo 12: Efeito de proteção da neutralização de MAbs 8C11 e 8H3.

[0175] Doze macacos foram divididos em quatro grupos (3 macacos por grupo). Grupo 1 (macaco KF25 ~ 27) foi usado como controle, grupo 2 (macacos KF16 ~ 18) foi neutralizado por MAb 8C11, grupo 3 (macacos KF19 ~21) foi neutralizado por MAb 8H3, grupo 4 (macacos KF22 -24) foi neutralizado pela combinação dos MAbs 8C11 e 8H3. As misturas de 2ml do excremento positivo da cepa XM de HEV (diluídas para títulos de PCR de 10'') e 2 ml da ascites do- anticorpo monoclonal 8C11 (aproximadamente, títulos de 1:105) , ou 2ml dos ascites de 8H3 (aproximadamente títulos de 1:104) , ou lml das ascistes de 8C11 com 1 ml dos ascites de 8H3 foram colocados a 4°C durante a noite (aproximadamente 14 horas), então incubados por 2 horas a temperatura ambiente. 0 grupo controle não foi incubado com os MAbs. 1 ml de cada mistura dos MAbs dos virus foi injetado i.v. em 3 macacos Rhesus, respectivamente. Para a detecção do RNA-HEV na excreção por RT-PCR, as amostras de excreção foram colhidas começando no dia da infecção, diariamente por 2 semanas e então duas vezes a cada semana. As amostras de soro foram tomadas semanalmente para medida do ALT e dos anticorpos anti-HEV.

[0176] O resultado foi mostrado na tabela 9. Todos os macacos no grupo controle mostraram ALT anormal e suas excreções virais apareceram cedo. Todos os macacos dos grupos neutralizados adiaram seus períodos de início da excreção viral acentuadamente, exceto por apenas um macaco no grupo 8C11+8H3 (KF22) que apareceu com ALT anormal. Um macaco (KF24) no grupo 8C11+8H3 foi completamente protegido sem excreção viral e anticorpos contra HEV durante o procedimento. Para um outro macaco (KF23) neste grupo, a excreção viral aconteceu no 40° dia após a infecção, permanecendo por mais de 2 semanas e então voltando para negativo; o anticorpo IgM anti-HEV foi indetectável durante o procedimento e o anticorpo IgG voltou a ser positivo até o dia 56. Estes resultados manifestaram que ambos os MAbs 8C11 e 8H3 tiveram determinados efeitos neutralizantes, e a neutralização da combinação de dois MAbs foi mais evidente.

Tabela 9: Teste de neutralização de MAbs. 4. Efeito de inter-bloqueio do soro infectado e dos MAbs da presente invenção.

Exemplo 13: Efeito bloqueador de HEV no soro de pacientes com MAbs.

[0177] A capacidade de bloqueio dos dois soros de pacientes cora HEV agudo e dois soros humanos normais contra NE 2 MAbs foi detectada. Sete MAbs de marcacos, foram enzimaticamente diluídos para uma cocnentração onde o valor de OD daqueles MAbs que reagiram com a microplaca de NE2 foi entre 1,0 e 2,0. Os micro-poços revestidos com NE2 foram divididos em dois grupos, um foi o grupo bloqueado e o outro foi o grupo controle. Os poços do grupo bloqueado foram adicionados com 100 ul de soro diluídos em séries triplicadas para ser detectado (1:10, 1:30, 1:90, 1:270 e 1:810), em duplicata para cada diluição. 12 poços controle foram adicionados com lOOul do diluente, 2 poços controles correspondentes para cada MAb. Após incubação por 30 minutos, a placa foi lavada 5 vezes e foram adicionados MAbs 1F6, 2C9, 8C11, 13D8 15Β2 e 16D7 diluídos, marcados enzimaticamente. Após incubação por outros 30 minutos, a placa foi lavada 5 vezes, corada a seco, adicionado cromatógeno e incubada por 10 minutos a 37 °C. A reação foi interrompida com 50 ul de tampão de finalização, e a absorbância de OD45o/650nm para cada poço foi medida. O epítopo NE2 reconhecido por MAb 8H3 podería ser melhorado por 8C11, então os micro-poços revestidos com NE2, usados no teste de bloqueio de soro contra MAb 8H3, foram primeiramente saturados por 8C11 (1:1000) por 30 minutos de modo a expor o epítopo 8H3 em NE2 completamente, seguido pelo teste de bloqueio no soro similar. A proporção do bloqueio no soro contra MAb foi igual (média de OD do controle - a média de OD do bloqueio) / média do OD do controle * 100%. O título de bloqueio no soro foi definido como a maior diluição na qual o proporção de bloqueio foi acima de 50%.

[0178] Como descrito na tabela 10, o soro dos pacientes agudos bloquearam, acentuadamente, a reação dos cinco MAbs que reconhecem os epítopos conformacionais, mas não bloquearam o MAb 15B2 que reconhecem o epítopo linear. Um dos soros dos pacientes agudos pode bloquear o epítopo linear MAb 16D7, e a proporção de bloqueio dos outros soros é sempre inferior a 50% com a tendência descendente junto com a diluição crescente (figura 8). O soro humano normal não teve efeito de bloqueio contra qualquer MAb. O efeito de bloqueio de um dos soros do paciente agudo com séries diferentes de diluições nos anticorpos monoclonais foi ilustrado na figura 8. Pode ser visto que em baixas diluições, a proporção de bloqueio contra 5 MAbs conformacionais é toda acima de 90%, e indica um efeito óbvio da dose, onde as proporções de bloqueio diminuem com o aumento da diluição.

Tabela 10» Efeito do bloqueio do soro humano contra NE2 MAbs. *: A titulação de bloqueio do soro foi definida como a maior diluição na qual a proporção de bloqueio foi acima de 50%, &: Ti.q foi a maior diluição no soro controle diluido no qual o valor OD foi acima de 1.0, detectado pelo ELISA indireto. Exemplo 14: Efeito do bloqueio do MAbs anti-NE2 contra o soro infectado por HEV.

Bloqueio..do...soro..convalescente...dos...pacientes..HEV...com diferentes MAbs anti-NE2.

[0179] Na microplaca revestida e bloqueada com NE2, adicionou-se lQQul de 8 MAbs anti-NE2 diluídos (1:1000), mistura de alíquotas iguais de MAb 801 e 8H3 e diluente como controle não bloqueado respectivamente; incubadas por 30 minutos a 37ec, e coradas a seco; então adicionou-se soro convalescente controle diluído de pacientes HEV e incubou-se por 30 minutos a 3?°C, foram lavadas por 5 vezes com ΡΒΞΤ e coradas a seco, então foram adicionados lQOul de IgG-HRP anti-humana diluída, seguido por incubação por 30 minutos a 37 "C, lavada cinco vezes novamente e corada a seco; adicionou-se cromatógeno para incubação por 10 minutos a 37 °Cf finalizou a reação com Sul de tampão de parada (2M de P/SO4) e o valor de absorbância OD^o/escnm foi medido. Seleção da diluição na qual o valor OD controle foi de 1.0 ~ 2.0 para calcular a proporção de bloqueio através da fórmula: proporção de bloqueio = (1 - OD bloqueado/ OD não bloqueado)* 100%. Se mais do que um poço não bloqueado teve o valor OD de 1.0 -2.0, a média da proporção de bloqueio pode ser estimada como a proporção de bloqueio do referido MAb contra o soro. Será considerado como positivo se a proporção de bloqueio for acima de 50%. Como descrito na tabela 11, a mistura de 8C11 e 8H3 (8C11+8H3) pode bloquear o soro de três pacientes acentuadamente, enquanto os MAbs 8C11 e 13D8 também podem bloquear os soros 514 e 454.

Tabela 11: Efeito do bloqueio dos MAbs anti-NE2 contra o soro convalescente dos pacientes com HEV. -, proporção de bloqueio foi menor que 50%.

Efeito do bloqueio de vários MAbs contra o soro de diferentes fases de infecções HEV nos macacos.

[0180] Para encontrar a diferença do efeito de bloqueio de diferentes MAbs no soro nas diferentes fases de três macacos infectados com HEV, o teste de bloqueio foi realizado de maneira similar. Como mostrado na tabela 12, os resultados foram similares àqueles do soro humano: MAb 8C11 e 13D8 podem bloquear de forma destacada o soro dos macacos em qualquer fase, o que indicou que o epitopo reconhecido através dos dois MAbs foi imuno-dominante; a proporção de bloqueio combinada de 8C11+8H3 foi substancialmente acima de 90%, maior do que a do 8C11 ou 13D8, o que manifestou que o epitopo reconhecido pelo 8H3 foi um outro imuno-dominante. Os anticorpos contra estes dois epitopos foram importantes entre os anticorpos anti-NE2 nas diferentes fases da infecção. Nenhum bloqueio efetivo foi observado usando 8H3 sozinho, o que pode ser explicado através das curvas de ligação dos MAbs de 8C11 ou 8H3 com ο NE2 determinado através de um biosensor. A afinidade de ligação do MAb 8H3 com NE2 foi fraca e fácil de dissociar. Quando se liga a NE2 ao mesmo tempo que 8C11, o epitopo reconhecido por 8H3 foi exposto completamente por NE2 pela alteração induzida da conformação através de 8C11 e desse modo pode se ligar ao correspondente anticorpo rápida e curta, assim o bloqueio combinado de 8C11 e 8H3 podería efetivamente bloquear os epitopos correspondentes.

[0181] Existirá provavelmente uma outra razão para o impedimento do efeito estérico ser produzido quando 8C11 e 8H3 se ligam ao NE2, assim a ligação dos anticorpos reconhecendo outros epitopos adjacentes aos dois epitopos com seus antígenos. Para encontrar o impacto dos referidos impedimentoss de efeitos estéricos nos bloqueadores dos MAbs 8C11 e 8H3, os fragmentos Fab destes dois MAbs foram cortados por digestão da papaína para reduzir destacavelmente o impedimento do efeito estérico, então um experimento similar de bloqueio é realizado. 0 resultado foi mostrado na figura 9. Os efeitos de bloqueio destes fragmentos Fab foram quase idênticos àqueles de todos os anticorpos, o que indicou que os efeitos de bloqueio de MAbs 801 e 8H3 no soro infectado por HEV foram epítopos-especificos. O evidente efeito de bloqueio de SCI 1 e 8H3 contra o soro infectado HEV indicou que estes dois epitopos foram os mais importantes epitopos imuno-dominantes dentro do domínio NE2 durante a infecção HEV e seus correspondentes anticorpos persistiram por um longo período como os principais anticorpos.

Tabela 12: Efeito do bloqueio de MAbs anti-NE2 contra o soro em diferentes fases de infecção nos macacos. - , proporção de bloqueio foi abaixo de 50%. 5. Isolamento e expressão dos genes da região variável das cadeias pesada e leve dos referidos anticorpos monoclonais na presente invenção.

Exemplo 15. Isolamento dos genes da região variável das cadeias pesadas e leve do anticorpo monoclonal 13D8.

[0182] 10' células de hibridoma do 13D8 de origem do camundongo foram cultivadas para semi-confluência, suspensas e então transferidas para dentro de um novo tubo de centrífuga de 4ml. As células foram colhidas através de agitação a 1.500rpm por 3 minutos. O grânulo foi re-suspenso em ΙΟΟμΙ de PBS estéril (pH 7,45) e transferido para dentro de um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. 800μ1 de Trizol (Roche, Alemanha) foram adicionados ao tubo. A solução foi perfeitamente misturada através de inversão suave e mantida por 10 minutos. O tubo foi vigorosamente agitado por 15 segundos após adição de 0,2 ml de clorofórmio, e mantido em repouso por 10 minutos, então centrifugada a 12000rpm por 15 minutos a 4°C. A fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml seguido pela adição de um volume igual de isopropanol. O tubo foi misturado através de muitas inversões aquosas e armazenado por 10 minutos, então centrifugado a 12000rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado. O grânulo foi lavado pela adição de 600ul de etanol a 75%. O tubo foi centrifugado a 12000rpm por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado. O grânulo foi seco sob vácuo a 60°C, então dissolvido em 70ul de H20 DEPC. A solução foi adicionada com lul do primer de transcrição reversa Oligo (dT) (i2-i8) (Promega) , Ιμΐ de dNTP (Shenggong, Shanghai), então incubado em banho-maria a 72°C por 10 minutos. O tubo foi imediatamente colocado no gelo por 5 minutos, adicionado com 20ul de tampão 5 X RT, 2μ1 de AMV (lOul/μΙ, Promega) e Ιμΐ de Renasin (40υ/μ1, Promega), então misturado. O cDNA foi sintetizado por transcrição reversa a 42 °C.

[0183] Os genes do anticorpo foram isolados pelo método da reação em cadeia por polimerase (PCR) com os kits Ig-Prime (Novagen) e um outro primer construído a jusante MKCRl (sintetizado peal Bioasia, Shanghai). O cDNA 13D8 sintetizado acima foi usado com modelo.

[0184] O gene da cadeia leve foi isolado com sete grupos de primers a montante de MuIgkVL5'-A a G para a cadeia Kappa e a jusante do primer MKCRl (5'-TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3' ) . A amplificação por PCR do gradiente foi realizada de 47° a 56°C com os pares de primers compostos pelos primer MKCRl e cada um dos sete primers a montante. Em cada um dos resultados, um fragmento de DNA de fita simples de aproximadamente 700bp foi amplificado com o par de primer de MuIgkVL5'-G3 (5' -ATG GT(C/T) CT(C/T) AT (A/C/G) TT (A/G) CTG CTG CTA TGG-3')/MKCRl sob a condição de PCR a seguir: 94 °C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94 °C por 40 segundos, 53°C por 1 minuto, 72°C por 50 segundos e um final de 72°C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado dentro do vetor pMD 18-T e então sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como a sequência da cadeia leve de 13D8 após o alinhamento por BLAST. A região variável foi representada na SEQ.ID.NO:5, e sua sequência de aminoácido deduzida foi a SEQ.ID.NO:6.

[0185] O gene da região variável da cadeia pesada foi isolado usando seis grupos de primers a montante de MuIgGVH5'-A a F para IgG e o primer a jusante MVhRÍS^CCC AAG CTT CCA GGG (A/G)CC A(A/G)(G/T) GGA TA(A/G) AC(A/G/C/T) G(A/G)T GG-3') . A amplificação por PCR do gradiente foi realizada a 47° a 56°C com os pares de primer composto do primer MVHR e cada um dos seis primers a montante. Como um resultado, um fragmento de DNA simples de aproximadamente 400bp foi amplificado com o par de primer de ΜυΙρ6νΗ5'-Ε2 (5'-CGA CAT GG(A/C/G) TTG G(C/G)T GTG GA(A/C) CTT GC(C/T) ATT CCT-3')/MuIgGVH3'-2 sob a condição a seguir: 94 °C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94 °C por 40 segundos, 53°C por 1 minuto, 72°C por 40 segundos e um final de 72°C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e então sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como a sequência da região variável da cadeia pesada 13D8 após o alinhamento de BLAST (SEQ.ID.NO:7) e sua sequência de aminoácido deduzida foi descrita na SEQ.ID.NO:8. Exemplo 16: Clonagem, expressão, purificação e determinação da atividade do anticorpo de cadeia simples 13D8.

[0186] As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de 13D8 foram ligadas a forma do fragmento de DNA do anticorpo de cadeia simples através de um pequeno peptideo ligador de (GGGGS)3. O fragmento de DNA da região variável da cadeia pesada de 13D8 foi amplificado com o par de primer de 13D8HF1(5'-gAA TTC gAT gTA CAA CTT Cag g-3')/13D8HR1(5'-gCT ACC ACC CCC TCC AgA TCC gCC ACC TCC TgA AgA TAC ggT gAC CgT ggT gCC-3' ) , e o fragmento de DNA da região variável da cadeia leve de 13D8 foi amplificado com o par de primer de 13D8KF1 (5'-A TCT ggA ggg ggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAc ATC Cag Atg ACT Cag-3')/13D8KR1(5'-gTC gAC CCG TTT GAT TTC CAG C-3'). Estes dois fragmentos foram respectivamente recuperados e montados em toda a extensão do fragmento do anticorpo de cadeia simples em um novo sistema de PCR com cada um dos dois fragmentos como primers e modelo para cada um deles. Os poucos fragmentos de extensão completa obtidos do anticorpo de cadeia simples foram usados como modelos para amplificações adicionais com o par de primer 13D8HF1/13D8KR1. O fragmento do anticorpo de cadeia simples recuperado foi clonado dentro do vetor pMD 18-T. O fragmento do anticorpo de cadeia simples, foi recuperado, pela digestão com EcoR I/Sal I do plasmídio resultante, então clonado dentro do vetor de expressão procariótico pT0-T7 digerido com as mesmas enzimas. A cepa ER256 de E. coli foi transformada com o plasmideo recombiante resultante pTO-T7-13D8, as colônias separadas foram cortadas e crescidas em 500 ml de meio LB (com lOOug/ml de Kan) . As incubações foram realizadas em um agitador durante a noite a 37°C. Quando o OD600 do meio de cultura bacteriana conseguiu aproximadamente 0,8, o IPTG foi adicionado para uma concentração final de 0,2 mmol/L para indução, e a incubação foi continuada a 30 °C por 6 horas antes da colheita da bactéria e as bactérias foram dilaceradas através de sonicação. Após centrifugadas a 15,000rpm por 10 minutos, o precipitado foi dissolvido no mesmo volume de 20mmol/L de Tris-HCl (pH 7,6) como o sobrenadante. O volume igual do sobrenadante e da solução precipitada foi realizado em SDS-PAGE. As concentrações do gel empilhado e do gel separado foram de 5% e de 12% respectivamente. Foi observado que a proteína expressa existiu, principalmente, na forma de corpo de inclusão não solúvel. O precipitado a partir da sonicação foi lavado duas vezes com 2% de Triton seguido por sua dissolução em 2M, 4M e 8M de uréia, respectivamente e 12% de SDS-PAGE para cada solução dissolvida foi realizado. O anticorpo de cadeia simples encontrou dissolução principalmente em 8M de uréia. O anticorpo de cadeia simples dissolvido em 8M de uréia foi renaturado através da diálise contra lx PBS gradualmente. O grânulo foi descartado através da centrifugação a 12000rpm por 10 minutos. A atividade da solução do anticorpo de cadeia simples obtido foi experimentada.

[0187] A atividade do anticorpo de cadeia simples 13D8, preliminarmente, purificado, foi detectada através da competição por ELISA. A placa de ELISA de 96-poços foi revestida com ο NE2 diluído e purificado em 1:40000 e bloqueada com BSA. 50ul da solução do anticorpo de cadeia simples acima e 50ul do anticorpo monoclonal 13D8 marcado com HRP em uma dilução de 1:500 foram adicionadas nos poços de amostras para ser detectado. 50 ul de lx da solução de PBS e 50ul do anticorpo monoclonal 13D8 marcado com HRP em uma dilução de 1:500 foram adicionados nos poços como controle negativo. 50ul do anticorpo monoclonal 13D8 não marcado e 50ul do anticorpo monoclonal 13D8 marcado com HRP em uma dilução de 1:500 foram adicionadas nos poços como controle positivo. Os ensaios foram realizados em triplicata. Após a mistura, a placa foi incubada a 37 °C por uma hora, então adicionado cromatógeno A e B. A cor foi desenvolvida a 37 °C por 15 minutos. A reação foi finalizada e a absorbância foi medida em um leitor de microplaca. Como resultado, o valor médio do controle negativo foi 2.955, e o valor médio do controle positivo foi de 0,731, o valor médio do poço da amostra a ser detectada foi de 0,624. Os resultados mostraram que o anticorpo da cadeia simples 13D8, preliminarmente purificado teve alta atividade.

Exemplo 17: Isolamento do gene da região variável da cadeia leve e do fragmento Fd da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 8C11.

[0188] O RNA total foi extraído a partir de lxlO7 das células de hibridoma semi-confluentes obtidas de camundongos do 8C11 através do mesmo método mencionado acima, e o cDNA foi sintetizado através da transcrição reversa. Similarmente, os genes da região variável do anticorpo foram isolados através do PCR com os kits Ig-Prime (Novagen) e dois outros primers construídos a jusante MFdRl e MFdR2 (Bioasia, Shanghai), e com o cDNA 8C11 sintetizados acima como modelo.

[0189] O gene da região variável da cadeia leve foi isolado com sete grupos de primers a montante do MuIgkVL5'-A a G para a cadeia Kappa e o primer 3' MulgkVL3'-1 (5'-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA-3') · A amplificação do PCR por gradiente foi realizada de 47° a 56°C com os pares de primers compostos de um primer a jusante e cada um dos sete primers a montante. Como resultado, um fragmento de DNA de fita simples de aproximadamente 400bp foi amplificado com o par de primer de MulgkVL5'-G3/MulgkVL3'-1 sob as seguintes condições: 94 °C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94 °C por 35 segundos, 53°C por 1 minuto, 72°C por 40 segundos e um final de 72 °C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como o gene da região variável da cadeia leve de 8C11 após o alinhamento por BLAST. A sequência foi representada na SEQ.ID.NO:9, e sua sequência de aminoácido deduzida foi descrita na SEQ.ID.NO:10.

[0190] O fragmento Fd do gene da cadeia pesada foi isolado usando seis grupos de primers a montante de MuIgGVH5'-A a F para IgG e o primer a jusante MFdRl (5'- ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3') e MFdR2 (5'- ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC-3' ) . A amplificação por PCR do gradiente foi realizada de 47 a 56°C com os pares de primers compostos do primer a jusante MFdRl/MFdR2 e cada um dos seis primers 5' . Como resultado, um fragmento de DNA simples de aproximadamente 700bp foi amplificado com o par de primer de MulgVH5'-D' (5'-CGA CAT GAG G(A/G)C CCC TGC TCA G(A/T)T T(C/T)T TGG (A/TC/G)(A/T)T CTT-3')/MFdR' sob as condições a seguir: 94°C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 50 segundos, 72°C por 50 segundos e um final de 72°C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como o fragmento Fb da cadeia pesada de 8C11 após o alinhamento por BLAST e a parte da sequência da região variável foi como representada na SEQ.ID.NO;ll e sua sequência de aminoácido deduzida foi como descrita na SEQ.ID.NO:12.

Exemplo 18: Clonagem, expressão, purificação e determinação da atividade do anticorpo de cadeia simples 8C11.

[0191] As regições variáveis das cadeias pesadas e leves de 8C11 foram ligadas à forma do fragmento de DNA do anticorpo de cadeia simples através de um pequeno peptideo ligador de (GGGGS)3. O fragmento de DNA da região variável da cadeia pesada de 8C11 foi amplificado com o par de primer de 8C11HF1 (5'-ggA TCC CAT ATg CAg gTT ACT CTg AAA gAg-3' ) /8C11HR1 (5' -gCT ACC ACC CCC TCC AgA TCC gCC ACC TCC TgA ggA gAC ggC gAC TgA-3' ) , e o fragmento de DNA da região variável da cadeia leve de 8C11 foi amplificado com o par de primer de 8C11KF1(5'-A TCT ggA ggg ggT ggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAC ATC CAg Atg ACT Cag-3')/8C11KR1(5'-gTC gAC CCgTTT gAT TTC CAg CTT gg-3' ) . Estes dois fragmentos foram revestidos e montados dentro da extensão completa do anticorpo de cadeia simples em um novo sistema de PCR com os mesmos fragmentos como primers e modelo para cada um deles. Os poucos fragmentos de extensão completa obtidos do anticorpo de cadeia simples foram ainda amplificados com o par de primer 8C11HF1/8C11KR1. O fragmento do anticorpo de cadeia simples foi recuperado e clonado dentro do vetor pMD 18-T. 0 fragmento do anticorpo da cadeia simples foi digerido a partir do plasmideo resultante com BamHI/Sal I e recuperado, então clonado dentro do vetor de expressão procariótico pT0-T7 digerido com as mesmas enzimas. A cepa de E. coli ER 2566 foi usada para expressar o anticorpo de cadeia simples com o processo similar mencionado acima. A proteína expressa foi encontrada na forma de corpos de inclusão insolúveis. 0 precipitado da sonicação foi purificado através dos mesmos processos descritos acima. 0 anticorpo de cadeia simples dissolveu principalmente em 8M uréia. 0 anticorpo de cadeia simples dissolvido em 8M uréia foi re-naturado por sua diálise contra lx PBS gradualmente. 0 grânulo foi descartado através de centrifugação a 12000 rpm por 10 minutos. A atividade do anticorpo de cadeia simples obtida foi detectada.

[0192] A competição por ELISA foi usada para detectar a atividade do anticorpo de cadeia simples 8C11 preliminarmente purificado. A placa de ELISA com 96-poços foi revestida com o NE2 purificado, diluído em 1:160000 e bloqueado com BSA. 50ul da solução do anticorpo de cadeia simples acima e 50 ul do anticorpo monoclonal 8C11 marcado com HRP em uma dilução de 1:1000 foram adicionados nos poços das amostras a serem detectadas. 50 ul de uma solução lx PBS e 50ul do anticorpo monoclonal 8C11 em uma diluição de 1 x PBS foram adicionados aos poços usados como controle negativo e 50 ul do anticorpo monoclonal 8C11 não marcado e 50ul do anticorpo monoclonal 8C11 marcado com HRP em uma dilução de 1:1000 foram adicionados aos poços usados como controle positivo. Os ensaios foram realizados em triplicata. Após mistura, a placa foi incubada a 37°C por uma hora, então adicionado cromatógeno A e B . A cor foi desenvolvida a 37 °C por 15 minutos. A reação foi finalizada e a absorbância foi medida em um leitor de microplaca. Como resultado, o valor médio do controle negativo foi de 1,852, e o valor médio do controle positivo foi de 0,541, o valor médio dos poços de amostras a serem detectadas foi de 0,162. Os resultados demonstraram que o anticorpo monoclonal 8C11 preliminarmente purificado teve alta atividade.

Exemplo 19; Isolamento do gene Fab do anticorpo monoclonal 8H3 (cadeia leve e fragmento Fd da cadeia pesada).

[0193] O RNA total foi extraído de 1 x 107 células de hibridoma semi-confluente originárias do 8H3 de camundongos através do mesmo método acima mencionado, e o cDNA resultante foi sintetizado através de transcrição reversa. Similarmente, o fragmento Fab do gene do anticorpo foi isolado por PCR com os kits Ig-Prime (Novagen) e três primers a jusante de MFdRl, MFdR2 e MKCRl (Bioasia, Shanghai) , e com o cDNA de 8H3 sintetizado acima como modelo.

[0194] O gene da cadeia leve foi isolado com sete grupos de primers a montante de MuIgkVL 5'-A a G para a cadeia Kappa e um primer a jusante MKCRl. Como resultado, o fragmento de DNA simples de aproximadamente 700 bp foi amplificado com o par de primers de MuIgkVL 5'-G2(5'- CGA CAT GGT (C/T)CT (C/T)AT (A/C/G)TC CTT GCT GTT CTG G-3')/MKCRl sob as seguintes condições: 94°C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por 40 segundos, 56°C por 35 segundos, 72°C por 50 segundos e um final à 72 °C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como 8H3 da sequência da cadeia leve após o alinhamento BLAST. A sequência da região variável foi como representada na SEQ.ID.N0:13 e sua sequência de aminoácido deduzida foi como descrita na SEQ.ID.NO:14.

[0195] O fragmento do gene da cadeia pesada foi isolado usando seis grupos de primers a montante de MuIgkVH 5'-A a F para IgG e o primer a jusante de MFdRl e MFdR2. Como resultado, um fragmento de DNA simples de aproximadamente 700bp foi amplificado com o par de primer de MuIgkVH 5'-C1(5'-CGA CAT GGC TGT C(C/T)T (A/G)G(C/G/T) GCT G(C/T)T C(C/T)T CTG-3')MFdRl sob as condições a seguir: 94°C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por 40 segundos, 50°C por 1 minuto, 72 °C por 50 segundos e um final à 72 °C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como o fragmento Fb da cadeia pesada de 8H3 de cadeia pesada após o alinhamento por BLAST e a parte da sequência da região variável foi como representada na SEQ.ID.NO:15 e sua sequência de aminoácido deduzida foi como descrita na SEQ.ID.NO:16.

Exemplo 20: Isolamento do gene Fab do anticorpo monoclonal 16D7 (cadeia leve e fragmento Fd da cadeia pesada).

[0196] O RNA total foi extraído de 1 x 107 células de hibridoma semi-confluente originárias do 16D7 de camundongos através do mesmo método acima mencionado, e o cDNA foi sintetizado através de transcrição reversa. Similarmente, o fragmento Fab do gene do anticorpo foi isolado por PCR com os kits Ig-Prime (Novagen) e dois primers a jusante de MFdRl e MFdR2 (Bioasia, Shanghai) , e com o cDNA de 16D7 sintetizado acima como modelo.

[0197] O gene da cadeia leve foi isolado com sete grupos de primers a montante de MuIgkVL 5'-A a G para a cadeia Kappa e o primer a jusante de MKCRl. Como resultado, o fragmento de DNA simples de aproximadamente 700 bp foi amplificado com o par de primers de MuIgkVL 5'-F4(5'- CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT-3')/MKCRl sob as condições a seguir: 94°C por 5 minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 35 segundos, 72°C por 50 segundos e um ciclo final à 72°C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado no vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como 16D7 da sequência da cadeia leve após o alinhamento BLAST e a parte da sequência da região variável como representada na SEQ.ID.NO:17, e sua sequência de aminoácido deduzida foi como descrita na SEQ.ID.NO:18.

[0198] A amplificação por PCR do gradiente foi realizada de 47° a 56°C com os pares de primers compostos pelos primers MFdRl/MFdR2 a jusante e cada um dos seis primers a montante. Como resultado, um fragmento de DNA simples de aproximadamente 700bp foi amplificado com o par de primer de MuIgVH5'-E2 (5'-CGA CATA GG(A/G) ATG GA(C/G) C(G/T) (G/T) (A/T/C/G)(A/G)T CTT T(A/C)T CT-3')/MFdRl sob a condição a seguir: 94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C por 40 segundos, 54 °C por 1 minuto, 72 °C por 50 segundos e um final à 72 °C por 15 minutos. O fragmento foi recuperado e clonado dentro do vetor pMD 18-T e sequenciado (Bioasia, Shanghai). A sequência foi identificada como o fragmento Fd da cadeia pesada de 16D7 após o alinhamento por BLAST e a parte da sequência da região variável foi tal como representada em SEQ.ID.NO:19 e sua sequência de aminoácido deduzida foi a SEQ.ID.NO:20.

Exemplo 21; Ensaio da expressão e da atividade do anticorpo quimérico humano-camundongo 8C11 nas células CHO.

[0199] As regiões variáveis das cadeias leve e pesada do gene do anticorpo 8C11 de camundongos foram respectivamente fundidas com as regiões constantes das cadeias leve e pesadas do gene do anticorpo humano. Após expressão nas células CHO, todo o anticorpo quimérico humano-camundongo foi montado e secretado no sobrenadante da cultura de célula. Os vetores de expressão usados aqui foram dois tipos de plasmideos do vetor de expressão de mamíferos pcDNA3.1-Hyg (higromicina como marcador seletivo) e pcDNA3.1-Neo (neomicina como marcador seletivo).

[0200] Quatro primers foram sintetizados. O gene da região constante da cadeia leve Kappa humana foi amplificado por PCR com hKCF (5' -CTT gAg ACT gTg gCT gCA CCA TC-3')/hKCR(5'-ggA TCC TCT AgA TTA ACA CTC TCC CCT gTT g-3') como par de primer e o plasmídeo pAG4622 como modelo, e clonado dentro do vetor pMDl8-T. O fragmento cortado e recuperado a partir do plasmídeo resultante com Xho I/Xba I foi clonado dentro do vetor pcDNA3.1-Neo digerido com as mesmas enzimas para produzir o plasmídeo pcDNA3.1-Ak. O gene da região constante da cadeia pesada da gamma 1 humana foi amplificado por PCR com hHCF (5' -CTC gAg gCA AgC TTC AAg ggC C-3' ) /hHCR (5' -ggA TCC TCT AgA TTA TTT ACC Cgg AgA CAg g-3') como par de primer e o plasmídeo pAH4604 como modelo, e clonado dentro do vetor pMDl8-T. O fragmento cortado e recuperado a partir do plasmídeo resultante com Xho I/Xba I foi clonado dentro do vetor pcDNA3.1-Hyg digerido com as mesmas enzimas para produzir o plasmídeo pcDNA3.1-AH.

[0201] A região variável da cadeia leve de 8C11 com o peptídeo sinal foi amplificada por PCR com 8CllhVkF(5'-gAA TTC ATG AGT GTG CCC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT ACA GAT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG-3')/8CllhVkR(5'-CTC gAg CCg TTT gAT TTC CAg CTT gg-3') como o par de primer e o vetor pMDl8-T contendo o gene da cadeia leve de 8C11 obtido a partir do exemplo 17 como modelo. Este fragmento de DNA foi clonado dentro do vetor pMDl8-T e adicionalmente cortado a partir do plasmideo resultante com EcoR/Xho I, então clonado dentro dos mesmos sitios do plasmideo pcDNA3.1-Ak para produzir o plasmideo pcDNA3.l-Ak8C expressando a cadeia leve quimérica humana-camundongo.

[0202] A região variável da cadeia pesada de 8C11 com o peptideo sinal foi amplificada por PCR com 8CllhVhF(5'-gAA TCC AgA TCT ATG GGC AGG CTT ACT TCT TCA TTC CTG CTA CTG ATT GTC CCT GCA TAT GTC CTG TCC CAG GTT ACT CTG AAA GAG TC-3')/8CllhVhR(5'-CTC gAg TGA GGA GAC GGC GAC TG-3')como o par de primer e o vetor pMDl8-T contendo o gene Fd da cadeia pesada de 8C11 obtido a partir do exemplo 17 como modelo. Este fragmento de DNA foi clonado dentro do vetor pMDl8-T e adicionalmente cortado a partir do plasmideo resultante com Bgl II/Xho I, então clonado dentro do plasmideo pcDNA3.1-AH digerido com o BamH I/Xhol para produzir o plasmideo pcDNA3.1-AH8C expressando a cadeia pesada do quimérico humano-camundongo.

[0203] Estes dois plasmideos pcDNA3.l-Ak8C e pcDNA3.1-AH8C foram co-transfectados dentro das células CHO de mamíferos através da transfecção mediada por liposomo. O liposomo foi o reagente Lipofectamina TM obtido da Invitrogen. As células transfectadas foram cultivadas em uma placa de 24-poços por 2 dias e então transferidas para uma placa de 6 poços com menos do que 100 células por poço. A higromicina e neomicina foram simultaneamente adicionadas ao meio de cultura para seleção. Duas semanas mais tarde, o sobrenadante da cultura e as células parciais foram colhidos. As células foram rompidas através de congelamentos e descongelamentos repetidos por 4 vezes, e o sobrenadante celular foi colhido através de centrifugação. O ELISA indireto foi usado para detectar a atividade do sobrenadante com as células CHO não-transfectadas através do mesmo tratamento como controle negativo.

[0204] A placa ELISA de 96-poços foi revestida com o antigeno NE2 e bloqueada com BSA. lOOul da amostra foi adicionado em triplicata, bem como o controle negativo. A placa foi incubada a 37 °C por uma hora. Após lavagem, cada poço foi adicionado com lOOul do anticorpo IgG anti-humano de cabra marcado com HRP em uma diluição de 1:5000. A placa foi incubada a 37°C por meia hora. Após lavagem, o cromatógeno A e o cromatógeno B foram adicionados e a cor foi desenvolvida a 37°C por 15 minutos. A reação foi finalizada e a absorbância foi medida através de um leitor de microplaca. Os resultados mostram que o valor médio do sobrenadante na cultura das células como controle negativo foi de 0,093, enquanto o valor médio do sobrenadante da cultura das células expressando o anticorpo humano-camundongo quimérico 8C11 foi de 2,346. O valor médio do sobrenadante das células rompidas como controle negativo foi de 0,132, enquanto que o valor médio do sobrenadante das células rompidas expressando o anticorpo humano-camundongo quimérico 8C11 foi de 3,534.

[0205] Os resultados acima demonstraram que o anticorpo humano-camundongo 8C11 quimérico expresso nas células CHO podem ser corretamente montados dentro das células e secretados nas células com alta atividade.

[0206] 6. Identificação de um polipeptidio recombinante HEV ORF2 tendo epitopo reconhecidos por um anticorpo monoclonal, e preparação dos polipeptidios ou polipeptidios análogos tendo a propriedade antigênica determinante (esp. tendo a propriedade de montagem em partículas do tipo viral) de acordo com a presente invenção.

Exemplo 22; Interação dos polipeptidios recombinantes do tipo NE2 HEV ORF2 e os anticorpos monoclonais.

[0207] Os polipeptidios HEV 0RF2 (listados na tabela 13) foram clonados dentro do vetor pTO-T7, expressos e purificados de acordo com os métodos do Exemplo 1. Os polipeptidios HEV ORF2 recombinantes expressos foram detectados pelo ELISA usando o anticorpo monoclonal marcado HRP de acordo com os métodos do exemplo 2.

[0208] 10μ1 (lmg/ml) de cada um dos polipeptidios purificados foram pontilhadas repetidamente e vagarosamente na membrana de nitrocelulose e seco ao ar. Após bloqueio com 5% de espuma de leite por 1,5 horas a temperatura ambiente, os anticorpos monoclonais (a célula sobrenadante secretada pelos linfócitos B monoclonais em uma diluição de 1:100 com 5% da espuma do leite) foram adicionados, e mantida por reação a temperatura ambiente por 1 hora. Então a membrana foi lavada três vezes (com 5 minutos de intervalos) usando TNT (lOmM com Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween-20). A IgG anti-camundongo de cabra marcado com HRP (produzido por JINGMEI Biological Company, diluído a 1:100 com 5% com espuma de leite) foi adicionado, e reagido com temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem 3 vezes (com 5 minutos de intervalo) com TNT, NBT/BCIP (C4oH3oNio06Ci2/C8H6BrClN04P. C7H9N) foi adicionado para desenvolver a cor. Para os pontos desenvolvidos foram classificados com um sistema de imagem de gel UVI e convertido nos valores de grau verde, os quais são divididos em cinco grades positivas como ++++, +++, ++, + +/- e a grade negativa como Os resultados foram listados na tabela 13, a qual mostrou que o polipeptidio 148C (459-603PPR) e 208N (394-601) reagiram com os anticorpos monoclonais 8C11, 8H3 e 13D8. Assim, a região do epitopo reconhecida pelos anticorpos monoclonais 8C11, 8H3 e 13D8 foram especulados por se localizar na região sobreposta aos 459-601 dos dois polipeptidios acima mencionados. Para localizar a região do epitopo reconhecidas pelo anticorpo monoclonal 16D7, outros polipeptidios 97C (AA564-AA660) , 161 (AA499-AA660) e 170P (AA345-AA515) foram testados paras as atividades com o anticorpo monoclonal 16D7. os resultados mostraram que 97C não foi reagido com 16D7, enquanto 161 e 170P foi reagida com 16D7. Este resultado indicou que a região do epitopo reconhecida pelo 16D7 pode se localizar na AA499-515 da ORF2 de HEV. Os polipeptidios, com excelente antigenicidade com os anticorpos monoclonais 8C11, 8H3 e 13D8, estavam principalmente presentes como dimero em SDS-PAGE, o que sugeriu que a formação de um dimero favorece a própria inclusão e/ou exposição completa dos epitopos para os três anticorpos monoclonais.

Tabela 13: Interações da 0RF2 HEV dó polipeptídio recombinante do tipo NE2 e anticorpos monoclonaís.

[0209] O símbolo * significa que -P-P-R foi adicionado à C-terminal da sequência de polipeptídio.

[0210] As interações dos polipeptídios e dos anticorpos monoclonaís podem ser classificadas de - a ++++ através do cálculo da razão de P/N, ou seja, a proporção do valor OD do poço da amostra para o valor de OD do poço com o controle negativo (se o valor de OD do poço do controle negativo for menor do que 0,05, então 0,05 é denominado como o valor de OD negativo). Assim, a classificação é definida como a seguir: -(ou seja, negativo) , P/N<3; +/-, 3<P/N<6; +, 6<P/N <10; ++, 10< P/N <30; +++, 30< P/N <50; ++++, P/N>50.

Exemplo 23: Expressão dos mutantes derivados a partir das mutações na região de dimerização dos polipeptidios NE2 e sua antigenicidade contra os anticorpos monoclonais.

[0211] Ο NE2 foi reconhecido mais fortemente em sua forma dimérica do que na forma de monômero através do anticopo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8. O dimero pode ser completamente dissociado dentro de monômero com tratamento de 8mol/L de uréia, e então a antigenicidade contra o anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8 foram significativamente reduzidos. Este fenômeno sugere que a própria inclusão e/ou a completa exposição do epitopo no NE2 reconhecido pelo anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8 foi correlacionado próximo com a homo-dimerização do polipeptidio NE2, e a referida homo-dimerização pode depender da interação hidrofóbica dos monômeros.

[0212] Os mutantes, derivados de NE2 através do truncamento do C-terminal para AA600, não foram capazes de dimerizar, e tiveram significativa redução de antigenicidade contra o anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8. Isto indicou que a região localizada próxima ao AA600 participa de uma regra critica na dimerização de NE2 e dos análogos dos mesmos. Para verificar esta teoria, uma série de mutações sítio-direcionadas foi introduzida na região AA600.

[0213] O polipeptídio ΝΕ2 submetido a mutação sítio-direcionada por PCR e técnicas de clonagem, e o sitio chave para dimerização foi identificado através da observação da presença da dimerização. Primeiramente, a Leu na AA601 foi substituída com Ile, Por, Glu, Gly, Asp, His, Lys, Gin, e Cys, respectivamente. Os métodos estão descritos em detalhes como a seguir: [0214] Para conseguir uma C-terminal mutada na AAA601, a reação em cadeia por polimerase (PCR) foi realização com NE2 como um modelo, 601LIFP (um primer do qual a Leu mudada para Ile) como primer a montante, e HERP como primer a jusante. E um PCR secundário foi realizado com NE2 como modelo, HEFP como primer a montante, e o fragmento C-terminal mudado recuperado como primer a jusante. O mutante NE2 de extensão completa amplificada foi denominado como 601LI, o qual foi então ligado dentro do vetor pMDl8-T, e então digerido com BamH I/Hind III, identificando um clone positivo pMD 18-T-601LI. Este clone foi digerido com Ndel e EcoRI para obter o gene 601LI de interesse, o qual foi então clonado dentro de pTO-T7 digerido com Ndel/EcoRI. O clone identificado como tendo a inserção correta foi pTO-T7-60lLI, e a proteína expressa foi 601LI.

[0215] Similarmente, outro mutante 601LP, 601LE, 601LG, 601LD, 601LH, 601LK, 601LQ e 601LC foram obtidos. As propriedades das proteínas mudadas estão mostradas na figura 10.

[0216] Através do SDS-PAGE, os polipeptídios 601LI, 601LP, 601LG, e 601LC foram descobertos como formadores de dímeros, mas os polipeptídios 601LE, 601LD, 601LH, 601LK e 601KQ estão presentes como monômeros (Tabela 14 e Figura 11). Os resultados mostram que, os polipeptídios dos quais AA601 foi um aminoácido não-polar podem formar dimeros e tem boa antigenicidade contra o anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8; e os polipeptídios dos quais AA601 foi o aminoácido polar falharam na dimerização e tiveram reduzida antigenicidade contra o anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8. Sete aminoácidos não-polares contínuos foram descobertos estando localizados na AA597-AA603 (incluindo AA601), os quais participam teoricamente de uma regra chave na dimerização do polipeptídio NE2. Para verificar esta teoria, os aminoácidos localizados em AA596-AA603 de NE2 foram substituídos com os aminoácidos não-polares, e individualmente, resultando nos mutantes 596SE, 597AE, 598VE, 599AE, 60OVE, 602AE e 603PE. Destes mutantes, 596SE, 600VE e 603PE poderíam formar dimeros, enquanto 597AE, 598VE, 599AE e 602AE estão presentes em monômeros (Tabela 14) . Os mutantes dimerizados mantêm forte antigenicidade contra o anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8, enquanto que os mutantes presentes nos monômeros tiveram obviamente reduzida antigenicidade. Exceto pela substituição de V por A em AA600, as substituições dos aminoácidos não-polares pelos aminoácidos polares na região AA600, todos inibiram a dimerização e desse modo reduziram a antigenicidade contra 8C11, 8H3 e 13D8. Em adição, a mutação para AA596(S) (fora da região AA597-AA602) não teve efeito na dimerização e na antigenicidade.

[0217] Estes resultados sugerem fortemente que a região não-polar AA597-AA603 de NE2 e os análogos dos mesmos participam de uma regra chave não apenas na dimerização, mas também na própria inclusão e/ou exposição de seus epítopos reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 8C11, 8H3 e 13D8. Tabela 14: Dimerizaçâo e antigenicidade contra os anticorpos monoclonais dos polipeptidios resultantes a partir da mutação sitio-direcionada na região de dimerizaçâo do NE2.

Exemplo 24: construção do clone do polipeptidio 239.

[0218] De acordo com a análise de MALDI -TOF-MS do polipeptidio PE2 descrito no Exemplo 1, este polipeptídio pode formar espontaneamente muitos tipos de homopolimeros na solução. Para algumas extensões, os procedimentos de polimerização do polipeptídio NE2 pode imitar a auto-construção do capsideo de HEV, e os dimeros podem apresentar as unidades estruturais básicas das partículas HEV.

[0219] Para expressar VLPs de HEV em E. coli, a N-terminal de NE2 de pTO-T7-NE2 foi extendida para AA368 através de meios de síntese da extensão de primers, resultando no clone pTO-t7-239. pTO-T7-239 podería expressar um polipeptídio recombinante com a sequência de aminoácido de SEQ.ID.NO:21.

[0220] O PCR foi realizado para conseguir a sequência do polinucleotideo codificando o polipeptidio 239 (AA368- AA603PPR) com o pTO-T7-NE2 como um modelo. Os primers foram como a seguir: [0221] 390FP: 5' -CAT ATG TCG GCG GGT GGT CAG CTG TTC TAC TCT CGC-3' [0222] 380FP: 5' -CAT ATG CTA GGC GGT CTA CCC ACA GAA TTG ATT TCG TCG GCG GGT GGT C-3' [0223] 368FP: 5' -CAT ATG ATA GCG CTT ACC CTG TTT AAC CTT GCT GAC ACC CTG CTA GGC GGT CTA CCC A-3' [0224] EHERP: 5' -GAA TTC ACC ACC ATG ATA GCG CTT ACC CTG TTT-3' [0225] A primeria reação em cadeia por polimerase (PCR) foi realizada com o pTO-T7-NE2 como modelo, junto com os dois primers a seguir: primer "forward" (dianteiro) 390FP, no qual o sitio de restrição Nde I foi introduzido para 5' ; e o primer reverso EHERP, no qual o sitio EcoR I foi introduzido para 5'. A condição de reação foi como a seguir: 94°C por 5 minutos, então 30 ciclos de: 94 °C por 50 segundos, 57 °C por 50 segundos, e 72 °C por 1 minuto; extensão a 72 °C por 10 minutos. Um fragmento de DNA especifico de aproximadamente 810bp foi obtido, ou seja, o DNA codificando o polipeptidio AA390-AA603PPR. Este produto de PCR foi adicionalmente ligado dentro do vetor pMDl8-T, e o clone positivo pMD 18-T-390F inserido com o gene de interesse foi então identificado através da digestão com BamH I/Hind III. Um PCR secundário foi realizado com o pMD 18-T-390F como modelo, junto com o primer "forward" (dianteiro) 380FP (do qual um sitio Ndel foi introduzido na 5') e com o primer reverso EHERP. O fragmento resultante foi de aproximadamente 840bp de comprimento, o qual codificou um polipeptidio localizado na AA380-AA660 da 0RF2 HEV. Similarmente, o produto de PCR foi ligado ao vetor pMD 18-T, e o clone positivo pMD 18-T-380F foi identificado pela digestão com BamH I/Hind III. 0 procedimento similar foi repetido. Assim, o gene 239 (AA368-603PPR) foi obtido pelo PCR com o primer "forward" (dianteiro) 368FP e o primer reverso EHERP. 0 gene 239 amplificado foi ligado ao vetor pMDl8-T, e o clone positivo pMD 18-T-239 foi então identificado pela digestão com BamH I/Hind III. 0 pMD 18-T-239 foi digerido com Ndel e EcoRI para obter o gene 239 de interesse, o qual foi então clonado dentro de NdeI/pT0-T7 digerido com EcoRI. 0 clone positivo pTO-T7-239 com a correta inserção foi identificado.

Exemplo 25; Expressão e purificação do polipeptidio 239.

[0226] E. coll ER2566 foi transformada com pTO-T7-239, e incubada em um tubo até o OD da cultura alcançar aproximadamente 1,0. Então a bactéria foi usada como uma semente para fermentação futura. IOOuL da bactéria foi adicionada dentro de 500 mL do meio de cultura LB. Após incubação a 37°C por aproximadamente 9 horas, 300uL de 0,5 de IPTG foi adicionado para induzir a expressão de 239. A mistura foi incubada por outras 4 horas. Foi descoberto que o polipeptidio 239 expresso estava presente como corpo de inclusão. Então o corpo de inclusão foi lavado como a seguir: [0227] O meio de cultura de E. coli foi centrifugado a 8,500 rpm por 10 minutos e o grânulo foi colhido. O grânulo obtido de l.OOOmL da cultura foi re-suspenso em 50 mL de tampão de lise, e as células foram sonicadas em instrumento de ultrason. A mistura sonicada foi centrifugada, e o grânulo foi então re-suspenso em 50 mL de 2% de Triton, o qual foi então agitado por 1 hora. A mistura foi centrifugada novamente, e o grânulo foi re-suspenso em 50 mL da solução de tampão I, a qual foi então sonicada por 5 minutos. A mistura foi centrifugada. Então o grânulo foi re-suspenso em 50 mL de 2% de Triton, e agitado por 1 hora. Após esta etapa, a mistura foi centrifugada, e o grânulo foi re-suspenso em 50 mL do tampão I. Após o que a mistura foi centrifugada. 0 grânulo foi re-suspenso em 30 ml do tampão I contendo 2M de uréia, sonicada por 1 hora e agitada por 30 minutos. A mistura foi centrifugada, e o sobrenadante foi colhido. O grânulo foi re-suspenso em 30 mL de tampão I contendo 4M de uréia, sonicada por 1 minuto e agitada por 30 minutos. Então a mistura foi centrifugada, e o sobrenadante foi colhido. O grânulo foi re-suspenso em 2 0mL do tampão I contendo 8M de uréia, sonicado por 1 minuto e agitado por 30 minutos. A mistura foi então centrifugada, e o sobrenadante foi colhido. Por último, o polipeptidio 239 foi descoberto por ser principalmente dissolvido no tampão I contendo 4M de uréia, o qual foi adicionalmente purificado por técnica de concentração isoelétrica.

[0228] Os sistemas usados no método acima foram como a seguir: A unidade de "pl8 IsoPrime Multi-chambered Electrofocusing" (da Amershan Pharmacia company); imobilizou as membranas em pH: pH5,10(T%:10%,C%:8%), pH5.20(T%:5%,C%:8%), pH5,25(T%:5%,C%:8%), pH5.30(T%:5%,C%:8): solução reserva: 4mol/L de uréia em H2O ultra-purifiçada; amostra: uma solução denaturada (300ml, 3,0mg/mL) contendo o polipeptidio recombinante dissolvido em 4mol/ml de uréia; Câmara de amostragem foi em pH5.25-pH5.30; Parâmetro de concentração elétrica: 200V por 2horas, 500V por 2horas, 800V por 2horas, 3000V por 60 horas. O polipeptídio purificado foi localizado entre o pH5.25 e pH5.30, com 300ml em volume e 2,5mg/ml em concentração. A pureza foi de 95% como mostrado no SDS-PAGE corado em prata. O polipeptídio assim obtido 293 foi adicionalmente purificado por HPLC HIC (cromatografia por interação hidrofóbica), descrito como a seguir: [0229] Instrumento: "Beckman System Gold Nouveaus 125NMP/166NMP HPLC; Coluna: TSK Fenil-5PW 21,5 mm x 15cm; tampão: 0,5mol/mL de sulfato de amônio, 4mol/L de uréia e 20mmol/L de tampão fosfato (pH 7,2); Tampão de eluição: 4mol/mL de uréia, 20mmol/mL de tampão fosfato (pH 7,2); Razão de fluxo: 4mL/minuto; Forma de eluição: 0,5-0 mol/mL de sulfato de amônia em graduação contínua por 120 minutos; Detecção do comprimento de onda: 280nm; Amostra: 360 ml do polipeptídio 239 purificado por foco isoelétricos em uma concentração de 2mg/ml; Coleta: após 105-120 minutos na cromatografia, 60 mL do polipeptídio 239 altamente purificado foi obtido com uma concentração de 4mg/mL, e a pureza foi maior do que 98% como mostrado no SDS-PAGE corado em prata.

[0230] Renaturação do polipeptídio 239 recombinante usando um dispositivo de fluxo tangencial: [0231] Instrumento: "Tangential Flow Device System" (PALL Company); cortes MW da membrana: 30kD; Pressão de corrida: 5psi; Razão de fluxo: 500mL/min; Razão de fluxo tangencial: 15mL/min; Amostra: 60mL do polipeptídio 239 com a concentração como 4mg/mL, altamente purificado por HPLC HIC; Tampão de renaturação: 1200mL de PBS (pH7.45); Pós tratamento da amostra renaturalizada: centrifugação a 12,000rpm a 4°C por 10 minutos, resultando em 60 mL do polipeptídio renaturalizado com a concentração como 3,9 mg/ml.

Exemplo 26; Caracterização das partículas do tipo vírus auto-montadas a partir do polipeptídio 239.

[0232] Tamanho de exclusão por HPLC: amostra 239 em 4M de Uréia/Tampão I foi dializada contra PBS, então carregado em Gel TSK SW3000 (21,5mmx60cm) coluna do instrumento "Beckman System Gold Nouveau 125NMP/166NMP" de HPLC. O resultado mostrou que o tempo de retenção do polipetídeo 239 foi de 22,3 minutos (volume de retenção: 89, OmL) , o qual é igual ao limite máximo de TSK GSW3000. Isto indicou que o peso molecular do polipeptídio 239 foi maior do que 500kD. O tempo de retenção de NE2 foi 35.6 minutos (volume de retenção:148.3mL), o qual indicou que o polipeptídio 239 forma partículas nas soluções (Figura 12A).

Observação de VLPs usando a microscopia de transmissão de elétrons (TEM).

[0233] O polipeptídio 239 renaturalizado foi adsorvido em grades revestidas com carbono, corado com 2% de ácido fosfotungístico (pH7,0), e examinado através do microscópio de elétron JEM-100CX II com aproximadamente χΙΟΟ,ΟΟΟ de aumento. A foto da figura 12B mostrou muitas partículas do tipo viral visíveis.

Observação dos VLPs usando microscopia de força atômica (AFM).

[0234] A análise foi realizada em um microscópio Nano IIIA de força atômica (Dl Company, USA), com uma sonda tendo lnm de poder de resolução. O polipeptídio 239 renaturalizado foi diluído em PBS (pH7,45) a 1:10, revestido na superfície de poliestireno, e então analizado pelo AFM com uma área de varredura de lmm2. A foto da figura 13 mostrou muitas partículas do tipo viral visíveis.

Análise dos VLPs usando Dispersão Dinâmica de Luz.

[0235] A análise foi realizada em um instrumento "DynaPor MS/S" - Dynamic Light Scattering" (contendo um controlador térmico), e o algoritmo empregado foi o algoritmo de regulação. O polipeptídio 239 foi centrifugado (20,000g) a 4°C por 15 minutos, e então analisado. O resultado mostrou que o raio dinâmico molecular hidratado do polipeptídio 239 foi de 24,16 nm (Figura 14).

Exemplo 27; A antigenicidade do polipeptídio 239 recombinante.

[0236] A antigenicidade do polipeptídio 239 recombinante contra o anticorpo monoclonal anti-HEV.

[0237] De acordo com os métodos do Exemplo 4, o polipeptídio 239 recombinado foi analizado por Western blotting com os anticorpos monoclonais. Os resultados foram similares àqueles do polipeptídio NE2, ou seja, os anticorpos monoclonais 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 e 13D8 foram mais fortemente interagidos com multímeros de 239 do que com os monômeros de NE2; ao contrário, os anticorpos monoclonais 15B2 e 16D7 interagiu igualmente com os multímeros de 239 e com os monômeros de NE2. Após fervido, ο NE2 todo dissociado dentro dos monômeros, e ainda teve antigenicidade não carregada contra os anticorpos monoclonais 15B2 e 16D7, mas teve antigenicidade significativamente reduzida contra os anticorpos monoclonais 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 e 13D8. Estes resultados sugeriram que os epítopos de 239 reconhecidos pelos anticorpos monoclonais 15G2 e 16D7 são epítopos lineares; enquanto os epítopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais 1F6, 2C9, 7E8, 8C11 e 13D8 são epítopos dependentes da conformação. Estes epítopos dependentes da conformação foram bem expostos nas formas de dímeros, mas não em monômeros.

Antigenicidade do polipeptídio 239 contra o soro na fase aguda e no soro convalescente de pacientes com HEV.

[0238] De acordo com os métodos do Exemplo 4, o polipeptídio 239 purificado foi analisado por Western blotting com 5 amostras do soro da fase aguda de pacientes com HEV, 5 amostras do soro convalescente e 2 amostras de soro humano normal. Os resultados (figura 15) mostrou que o polipeptídio 239 teve atividade óbvia com o soro da fase aguda, além disso, a atividade da forma de dímero é mais forte do que a forma de monômero; o dímero também mostrou alta atividade com as 3 amostras do soro convalescente dos pacientes com HEV; entretanto, ambas as formas do polipeptídio 239 não mostraram reação com o soro humano normal.

Exemplo 28; E. coli expressando o polipeptídio particulado da ORF2 de HEV.

[0239] Uma série de mutantes da extensão N-terminal de NE 2 foram clonados dentro do vetor pTO-T7 através da síntese da extensão do primer. Dentre eles, a proporção do monômero para o dímero, bem como a polimerização foram comparadas no SDS-PAGE. Em adição, de acordo com o método do exemplo 25, a formação da partícula foi determinada com o HPLC por exclusão de tamanho nos termos de seu tempo de redução.

[0240] Os resultados (Tabela 15) indicou que o polipeptídio 239 (AA368-603), resultou na extensão N-terminal do NE2 para AA368, pode se auto-montar dentro das partículas, enquanto os outros mutantes da extensão N-terminal, ou seja, 217 {ΑΑ3 90-603) , 227 (AA3S0-603) , bem como NE2, todos falharam na auto-montagem. De modo que a região AA368-380 está relacionada a auto-montagem das partículas. Extensões adicionais foram realizadas para produzir os polipeptídios 369, 370, 371, 372, 378, e 379. Dentre eles, descobriu-se que apenas 237C (AA37Ü-6Ü3) se auto-monta dentro das partículas. Para uma extensão adicional para AA345, o mutante ainda pode se auto-montar dentro das partículas.

Tabela 15: Polimerizaçâo dos mutantes de extensão N-terminal ______________^___________ de NE2 . __________^^ [0241] As mutações sítio direcionadas em Leu de AA368, AA370, AA372, AA375, e AA3 95, tiveram todos os efeitos colaterais na estabilidade das partículas (Tabela 16), o que indicou que a estrutura próxima a ΑΆ368 é importante na formação da partícula estável.

Tabela 16: Montagem da partícula do polipeptídio da 0RF2 de HEV resultante da mutação sítio direcionada na teu localizada na região AA368-395, [0242] Unia outra série de mutantes C-terminal dos polipeptidios particulados, ou seja, 292, 208, 209, 242P, 202P, 172P e 170P (Tabela 17), foram descobertos por se automontar dentro das partículas; e os polipeptidios, dos quais a C-terminal localizada a montante de AA603, não pode formar dimeros. Os resultados mostraram que a formação do dímero não pode estar relacionada com a montagem da partícula, e os dois mecanismos podem ser modulados através de diferentes domínios.

Tabela 17: Polimerízaçâo dos mutantes C-terminal dos polipeptidios particulados.

Exemplo 29: A antigenicidade contra os anticorpos monoclonais de E. coli expressando os polipeptidios da 0RF2 de HEV, os quais foram capazes de se auto-montar dentro das partículas do tipo viral.

Tabela 18: Antigenicidade dos polipeptidios particulados contra os anticorpos monoclonais (ELISA). 7. Seleção dos peptídeos imitadores do epitopo identificado pelo anticorpo monoclonal.

Exemplo 30; Seleção dos peptideos imitadores do epitopo identificado pelo anticorpo monoclonal.

[0243] O banco de exposição do fago dos 7-peptídeos (New England BioLabs company) é usado para classificar 7 peptideos os quais podem ser reconhecidos pelo anticorpo monoclonal 8C11, 8H3, 13D8 ou 16D7. O procedimento de classificação foi realizado como descrito no manual do usuário do banco de exposição de fagos. Resumidamente, o mAb (10(^g/mL, em 20mM de PB, pH 7,5), foi revestido em placas de microtitulação com 96 poços (150 μΕ/poço), e incubadas a 37°C durante a noite. Decantou-se a solução de revestimento. As placas foram lavadas com PBST uma vez, secas, então incubadas com o tampão de bloqueio (0,1M de NaHCCh, pH 8,6, 5mg/mL de BSA) por 2 horas a 37°C. Decantou-se a solução de bloqueio. As placas foram lavadas com PBST por 6 vezes, e secas. Separadamente, 2x1o11 fagos foram diluídos dentro do PBST (0,1% de Tween-20) para um volume final de ΙΟΟμΙϋ. A solução dos fagos diluídos foi então transferida para dentro de uma placa de microtitulação de 96 poços (ΙΟΟμΕ/poço), e deixada descançar por 1 hora a temperatura ambiente. A solução de fago foi decantada e firmemente agitada para remoção da solução residual. Os poços foram lavados com PBST (0,1% de Tween-20) por 10 minutos, e agitada para remover a solução residual. Os fagos ligados foram eluídos por incubação com 100μΕ de 0,2M de Glicina-HCl (pH 2,2, contendo lmg/mL de BSA) por 10 minutos a temperatura ambiente. A solução foi então pipetada em um tubo de microcentrífuga e neutralizada com lmol/L de Tris-HCl (pH 9,1) . ΙμΙι da solução foi tomada para titulação do fago. A solução restante foi adicionada a 20mL da cultura de ER2738 em um estágio anterior à fase de crescimento, e incubada a 37°C, com agitação por 4,5 horas. A cultura foi transferida para um tubo de centrifuga de 50mL e feito girar por 10 minutos a 10,000g. 80% do sobrenadante superior foi colhido e 1/6 do volume de PEG/NaCl (20% de PEG-8000, 2,5 M de NaCl), foram adicionados, mantidos a 4°C durante a noite. A mistura foi então agitada por 15 minutos (10,000g) a 4°C. O grânulo foi re-suspenso em lmL de PBS, e agitado a 4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi extraído e adicionado a 1/6 do volume da solução de PEG/NaCl, mantido a 4°C por 1 hora. A mistura foi então agitada (10,000rpm) a 4°C por 15 minutos. O sobrenadante foi decantado, e o grânulo foi suspenso em 200μΕ de PBS, e armazenado a 4°C. O procedimento acima foi repetido por um outro ciclo de classificação.

[0244] A célula ER2738, a qual foi cultivada durante a noite, foi diluída a 1:100 em um meio de cultura LB. A cultura diluída foi dispensada em tubos (lmL/tubo). 10 clones, que ficaram azuis na placa de cultura LB/IPTG/Xgal, após 3 rodadas de classificação, foram selecionadas e transferidas para um tubo contendo a cultura diluída acima, e cultivado por 4,5 horas a 37°C. As culturas foram transferidas para tubos de microcentrífugas de 1,5 mL. Os DNAs de fita simples foram extraídos de acordo com o manual de instrução para o kit mini M13 (da Shanghai Huashum Biotech Ltd.), e então sequenciado por Shanghai Boya Ltd, e a sequência que resultou 7 peptídeos inseridos foi listada na tabela 19.

Tabela 19: Sequência dos 7 peptídeos ligados com o anticorpo monoclonal.

Exemplo 311 Expressão do peptideo imitando o epitopo reconhecido pelo 8H3 e 8C11.

Separação e clonagem do gene HBc.

[0245] Os primers específicos BvCF e BvCR foram construídos [Tabela 20) . Com o piasmídeo pT-HBc construído pelo nosso grupo (GenBank No. AF233235) como um modelo, o PCR foi usado para amplificar a extensão completa do gene de HBc. O fragmento amplificado de aproximadamente 550bp foi clonado no piasmídeo pMD 18-T para obter um piasmídeo recombínante pT-Cl83 mostrando que foi o núcleo do gene de HBV de extensão completa, o qual teve 54 9bp de comprimento e codificou 183 aminoácidos.

Tabela 20. Primers para clonagem do gene HBV. Construção do plasmídio pCl4 9-mut [0246] Os resíduos de aminoácidos 79 e 80 na seção HBc MIR foram substituídos com o ligador através do método de mutação sitio direcionada para construir um plasmídeo mutante pCl4 9-mut para expressão de HBc.

[0247] Com o pT~Cl83 como modelo e Bv80F/Bvl49R e Bv78R/BvCF como pares de primer (tabela 20}, as sequências 3' terminal e 5'terminal de HBc foram amplificadas, e a produção de C80-149 e Cl-78 foi recuperado. Os dois fragmentos foram misturados em uma nova reação de PCR (Bvl 4 9R e BvCF como primers) para amplificar o gene HBc mutante de extensão completa (denominado Cl49-mut). O produto foi clonado dentro do vetor T para obter um plasmídeo recombinante pCl49-mut para expressão de HBc. O sítio de restrição BamHI com os ligadores em ambos os lados foi adicionado na sequência de pCl4 9-mut. A sequência de aminoácido de C14 9-mut é Cl-78+G4SG4T+GS+G4SG4+C81-149.

[0248] Construção dos peptídeos imitadores da expressão do plasmideos baseados no mutante plasmideo HBc.

[0249] De acordo com o resultado do sequenciamento dos 7 peptídeos, dois primers longos (8C11AFP e 8H3AFP da tabela 20) foram construídos para inserir o gene dos 7 peptídeos entre o ligador e o sítio BamHi. O primer 3' foi construído de acordo com a sequência próxima ao sítio EcoR I no pC14 9-mut (149MutRP na tabela 20). Os fragmentos de DNA compreendem as sequências de DNA do 7-peptídeo foram amplificados pelo PCR, e clonados dentro do vetor pMF-18T para obter plasmideos pT-8Cll e pT-8H3. Estes dois plasmideos e o vetor pC149-mut foram digeridos por BamH I e EcoR I. Os vetores e os fragmentos alvos foram recuperados, e o vetor e o fragmento foram ligados juntos para obter dois plasmideos recombinantes de expressão pC149-mut e pC149-mut-8H3. As sequências de aminoácidos das proteínas expressas foram representadas pelas SEQ.ID.NO;30 (C149-mut-8Cll) e SEQ.ID.NO:31 (C149-mut-8H3). Expressão do plasmideo contendo o peptídeo imitador.

[0250] As cepas de E. coli ER2566, as quais foram transformadas com o plasmideo recombinante pC1149-mut-8Cll ou pC149-mut-8H3, foram cultivadas em 2 ml de meio LB líquido (contendo Kan). As incubações foram conduzidas em um agitador a 37°C. Quando o OD600 do meio de cultura alcançou aproximadamente 0,6, foi adicionado IPTG para uma concentração final de 0,5 mmol/L, e a incubação foi continuada por 4 horas a 37°C. lmL da cultura celular foi transferida para um tubo de 1,5 mL, e girada a 12000rpm por 30 segundos, seca de cabeça para baixo. As células foram re-suspensas em 60 μΕ de H20, e então adicionados com 30μΕ de SDS-PAGE carregado com tampão (3x). A mistura foi banhada em água fervida por 10 minutos, e girada a 12000rpm por 10 minutos. ΙΟμΙϋ do sobrenadante foi usado para análise SDS-PAGE.

Teste da atividade imunológica do peptideo similar [0251] 3μ1 do sobrenadante lisado dos polipeptidios acima expressos foi pontilhado na membrana de nitrocelulose. 0,5% da solução de bloqueio contendo espuma do leite foi adicionada a 0,1 mL/ cm2 e agitada por 2 horas a temperatura ambiente. Então o anticorpo monoclonal 8C11 ou 8H3 diluído a 1:100 com 5% da espuma do leite foi adicionado a 0,1 mL/ cm2. A reação foi agitada a temperatura ambiente por 1 hora. Então a membrana foi lavada 3 vezes com TNT (cada vez por 10 minutos). A IgG anti-camundongo de cabra marcada com AP (diluído em 1:10000 com 0,5% de espuma de leite) foi adicionado a 0,lmL/cm2, e reagida a temperatura ambiente por 1 hora. Após ser lavada 3 vezes com TNT (cada por 10 minutos), o NBT/BCIP foi adicionado para desenvolvimento da cor. Finalmente, PBS foi adicionado para finalização da reação. O resultado mostrou que C149-mut-8Cll e C149-mut-8H3 reagiu obviamente com o correspondente anticorpo monoclonal.

[0252] 8. Kit de diagnóstico baseado no polipeptídio contendo o epítopo da presente invenção reconhecidos pelo MAb e a profilaxia da aplicação deste polipeptídio.

Exemplo 32: Método para o polipeptídio NE2 marcado com a peroxidase de rábano silvestre.

[0253] O procedimento a seguir foi baseado em 20 mg de NE2: dissolver 40 mg de HRP (Biozima R/Z>3) em 2 ml de tampão de acetato (0,2M, pH5,6); adicionar 2 ml de 0,06M da solução de NaIÜ4; a solução resultante foi mantida por 20 minutos a temperatura ambiente; adicinou-se 2 ml da solução de 0,16 M de etileno glicol-10% de NaCl, deixá-la permanecer por 20 minutos, a temperatura ambiente; diálise da solução contra 0,001M, pH 4,0 de tampão de acetato durante a noite; adicionar 0,8 ml de 2M, pH9,6 de tampão de aceto e 2 0mg do antigeno NE2, e deixar reagir por 2 horas a 4°C com agitação; adicionar 0,4 ml da solução de NaBH4 preparada a fresco (5mg/ml); deixá-la permanecer por 2 horas a 4°C com agitação; adicionar gota a gota 9,2 ml da solução de (NH4)2S04 saturada; agitá-la por 30 minutos a 4°C, então centrifugar a 3500rpm por 20 minutos a 4°C; descartar o sobrenadante, e dissolver o grânulo em 2 ml de 0,02 M, pH 7,4, do tampão fosfato, então dialisar a solução em 0,02M do tampão fosfato, pH 7,4 por 24 horas; adicionar 2 ml de glicerol, então misturar e armazená-la a -20°C.

Exemplo 33; kit de diagnóstico para detectar os anticorpos IgG anti-HEV e suas preparação e manipulação.

[0254] O procedimento de preparação do kit de diagnóstico contendo o polipeptidio NE2 recombinante desta invenção é como a seguir: preparar e purificar lmg/ml do polipeptidio NE2 recombinante como descrito no exemplo 1; dilui-lo com 20mM de tampão PBS, pH 7,4 a 1:500 e encobrir a placa de microtitulação com 96 poços, lOOuL/poço a 37 °C por 2 horas seguido por incubação a 4°C durante a noite; então lavar a placa uma vez com o tampão de lavagem PBS-Tween (8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH2P04, 2,9 g de Na2HP04-12H2) , 0,2g de KC1 e 0,5 ml de Tween-20, adicionar água deionizada para 1L, e ajustar o pH para 7,4), e secar de cabeça para baixo; adicionar 200ul de solução de bloqueio (2% de sacarose em PBS, 0,2% de Caseina, 2% de Gelatina) por poço, e incubar por 2 horas a 37 °C; corar o poço seco e selá-la a vácuo, então armazenar a placa a 4°C.

[0255] O procedimento do experimento deste kit é como a seguir: adicionar lOOul da amostra de diluição (20mM de PBS, pH 7,2) em cada poço, então adicionar lOul do soro, e incubar por 30 minutos a 37°C; lavar a microplaca cinco vezes (com 20 segundos de intervalo) com a solução de lavagem com PBS-Tween na máquina de lavagem TECAN; corar para secar e adicionar um segundo anticorpo marcado com HRP (IgG anti-humana de cabra) em diluição apropriada, então incubar por 30 minutos a 37°C, lavá-la cinco vezes (com 20 segundos de intervalo) novamente e corar para secar; adicionar ua gota de cromatógeno A e uma de cromatógeno B (cromatógeno A: 13,42g de Na2HP04-12H204, 4,2g de ácido cítrico e 0,3g de H2O2, adicionar água deionizada para 700ml; cromatógeno B: 0,2g de TMB, 20ml de DMF, adicionar água deionizada para 700ml), e incubar por 10 minutos a 72°C; terminar a reação com uma gota de solução de parada (2M de H2SO4) , e medir a absorbância para cada poço em 450nm (o comprimento de onda de referência é de 620nM) no leitor TECAN (Sunrise Remote/touch Screen). O valor de corte é considerado como o valor OD para o controle negativo maior que 0,16. Se o valor OD é maior do que o valor de corte, o resultado é considerado como positivo, enquanto que se o valor de OD é menor do que o valor de corte, o resultado é negativo.

Exemplo 34: Kit ELISA de captura da cadeia-μ (E2-IgM) para detectar os anticorpos IgG anti-HEV e sua preparação e manipulação.

[0256] O procedimento de preparação do referido kit é como a seguir: diluir NE2-HRP para 1:1000 como descrito no exemplo 32; adicionar lOOul da cadeia-μ anti-humana de cabra (DAKO) (1:1000, em 0,05M CB) para cada poço; incubar por 2 horas a 37°C, então durante a noite a 4°C; lavar a microplaca uma vez com o tampão de lavagem PBST (pH 7,4); bloquear cada poço com 200ul de tampão de bloqueio para incubação por 2 horas a 37 °C; corar o poço bloqueado para secar e selar em vácuo, então armazenar a 4°C.

[0257] O procedimento do experimento deste kit é como a seguir: adicionar lOOul da amostra diluiida (20mM de PBS, pH 7,2) para cada poço, e adicionar lOul do soro para ser testado, então incubar por 30 minutos a 37°C; lavar a microplaca cinco vezes com a solução de lavagem PBS; corar para secar e adicionar lOOul do NE2-HRP de trabalho (1:1000, preparado como no exemplo 32), então incubar por 30 minutos a 37 °C; lavá-la cinco vezes novamente com PBST e corar para secar; adicionar o cromatógeno, e incubar por 10 minutos a 37°C; finalizar a reação com uma gota da solução de finalização, e ler o valor de OD45o/6oonm· O valor de corte é considerado como o valor de OD para o controle negativo mais 0,26. Se o valor de OD é menor do que o valor de corte, a espécie é consericada como não-reativa, ou de outra forma, reativa.

Exemplo 35: Kit ELISA sanduíche pretendido para a detecção do antígeno HEV e sua preparação e manipulação.

[0258] O procedimento de preparação do referido kit é como a seguir: diluir o MAb 8C11 purificado da presente invenção para 50ng/ml com 20mM de PBS (pH 7,2), e adicionar lOOul da diluição em cada poço; incubar durante a noite a 37°C; então lavar a microplaca uma vez com PBST; bloquear cada poço com 200ul de soro bovino fetal a 20% (FBS) através da incubação por 2 horas a 37°C.

[0259] O procedimento do experimento deste kit é como a seguir: adicionar 50ul do soro ou 20% da suspensão da espécie preparada com FBS, então adicionar 50ul de 8C11-HRP diluído com 20% de FBS; misturar gentilmente e incubar por 60 minutos a 37°C; lavar a microplaca cinco vezes com PBST e corar para secar; adicionar cromatógeno A e cromatógeno B, 50ul de cada, e incubar por 15 minutos a 37°C; terminar a reação com 50ul da solução de finalização, e medir o valor de OD45o/6oonm para cada poço (PBST, cromatógeno A e cromatógeno B são obtidos da Beijing Wantai Biological Pharmac Enterprise Co., Ltd.). O valor de corte é considerado como o valor de OD para o controle negativo mais 0,12. Se o valor de OD é menor do que o valor de corte, a espécie é considerada não-reativa, caso contrário é reativa.

Exemplo 36: Exemplo para diagnóstico do soro com o kit ELISA E2-IgG e com o kit ELISA E2-IgM da presente invenção.

Detectar o E2-IgM e E2-IgG em cinco soro de pacientes com hepatite E e quatro soros negativos.

[0260] Cinco soro de pacientes com hepatite E e quatro soros negativos foram testados para o E2-IgG e E2-IgM. Todos os valores de OD dos cinco soros de pacientes com hepatite E foram acima de 1,0 e todos os valores OD negativos foram abaixo de 0,1.

[0261] A alteração dinâmica de diferentes anticorpos anti-HEV no soro de macacos Rhesus seguido pela infecção com HEV.

[0262] Como descrito na tabela 20, 86 macacos rhesus foram infectados através de uma suspensão de fezes positivas para HEV, e as fezes com excreção viral foi detectada em 98,4% dos macacos Rhesus infectados. A proporção de resposta para GL-IgG (os anticorpos IgG pode ser detectada pelo GENELABS DIAGNOSTICS HEV IgG ELISA) foi de 70,9%. A soro-conversão de GL-IgG ocorreu entre 3 e 14 semanas após a infecção (a média foi de 5 semanas), e foi de 0,5 ~ 5 semanas (a média foi de aproximadamente 3 semanas) logo após o inicio da hepatite em mais da metade dos animais. O GL-IgG persistiu de 1 semana a 69 semanas em diferentes macacos (menos do que 17 semanas em 75% dos macacos). GL-IgG não foi detectado através do experimento em 25 macacos, dos quais 11 macacos tivaram ALT anormal e os sintomas da hepatite aguda. A soro conversão de E2-IgM ocurrer em 85 macacos (proporção de resposta foi de 98.8%) entre 1 semana e 8 semanas após a infecção (a média foi de 4 semanas) , e ocorreu em 75% dos macacos dentro de 5 semanas após a contaminação. O tempo persistente foi geralmente de aproximadamente 8 semanas. O E2-IgM alterado para negativo entre 3 semanas e 4 semanas após o nivel de ALT no soro começou normal. Um macaco foi negativo sempre pra E2-IgM, e a excreção do virus nas fezes não foi detectada, exceto pelo fato de que ALT foi detectado anormal na quarta semana. Mas seus E2-IgG voltaram a ser positivos na terceira semana após a infecção e persistiram durante 20 semanas, enquanto GL-IgG não foi detectado através do experimento. A proporção da resposta para E2-IgG foi de 100%. A conversão do soro E2-IgG ocorreu dentro de 4,5 semanas após a infecção e sua soro-conversão não ocorreu em qualquer macaco dentro das 84 semanas.

Tabela 20: Proporção, tempo médio de início e tempo médio da persistência das respostas dos macacos para a infecção HEV» [0263] Tipicamente como na figura 16, a excreção do vírus começa na semana 0,5 após a infecção, seguida por viremia. Após E2-IgM e E2-IgG sere primeiramente detectados quase ao mesmo tempo na terceira semana, o nível ALT no soro rosa, seguido pela soro-conversão de GL-IgG. Então a viremia desaparecu rapidamente, e o nivel de ALT no soro retornou ao normal em seguida, e a excreção vira! foi negativa. Aproximadamente 3^4 semanas mais tarde, E2~IgM retornou para negativo. Enquanto o nível de GL-IgG declinou vagarosamente após ter alcançado seus respectivos valores de pico, o E2-IgG foi mantido níveis altos para uma maior duração do experimento, que foi após 70 semanas, e a proporção de resposta permaneceu em 100%, Detecção dos anticorpos IgM para HEV - em espécies clínicas -pacientes coro hepatite aguda, coro o kit ELISA E2-IgM desta presente invenção.

[0264] Testado com o kit ELISA E2-IgM, mais de 928 espécies de soros normais tiveram os valores OD abaixo de 0,15 com o OD médio de 0,012, exceto por apenas duas espécies que tiveram valores de OD maiores do que 0,2 (um é 0,203, e o outro é 0,333) . Os valores OD de 510 espécies de soros de pacientes clínicos com hepatite aguda variaram de 0,001 a 4, correspondendo, respectivamente, ao limite máximo e ao limite mínimo do leitor de microplaca. Para os valores OD distribuídos, próximos à curva exponencial, sua distribuição logarítmica foi analisada após a multiplicação por 1000 (Figura 17). Existem dois picos nos dois pontos de valores OD de 0,398~0,631. O pico da esquerda teve uma escala aproximada normal com a média logarítimica de 0,077, provavelmente representando os pacientes com IgM negativa; o pico da direita (000,398) contida em 131 espécies, 109 dos quais tiveram os valores OD maiores do que 1,0, provavelmente representando os pacientes HEV com IgM positiva. Se o corte para E2-IgM foi representado como 0,4, dos 200 espécies clínicos de soros com hepatite, as espécies positivas de E2-IgM tiveram valores OD maiores de E2-IgG, enquanto mias espécies negativas tiveram E2-IgG negativa e os valores OD de E2-IgG em outras espécies variaram de baixo a alto (Figura 18) .

[0265] Para comparar a distribuição dos valores OD, o kit E2-IgM e o kit GL-IgM (GENELABS DIAGNOSTICS HEV IgM ELISA) foram usados para testar 119 espécies de soro de pacientes não-A~C. A distribuição de valores OD para E2-IgM formou dois picos claros em dois lados do valor OD de 0,4 como descrito acima, enquanto que a distribuição dos valores OD para GL-IgM foi irregular (Figura 19) . Se o valor de corte foi representado como 0,4, a proporção de resposta para E2-IgM foi de 47,9% (57/119), enquanto a proporção de resposta para GL-IgM foi de 24,4% (29/119).

[0266] Em 29 espécies GL-IgM positivas, E2-IgM foi toda reativa. Entretanto, nenhum dos valores OD de E2-IgM de 30 espécies de soros, os quais mostrarm HAV-IgM positiva, HBc- IgM positiva ou HCV-IgG positiva, excedendo 0,2.

Detecção dos anticorpos IgG para HEV em espécies de pacientes clínicos com hepatite aguda e espécies de soro normais com o kit E2-IgG ELISA da presente invenção.

[0267] Como descrito no exemplo 33, 5060 espécies de soro normais e 200 espécies clínicos de soro a partir de pacientes com hepatite aguda foram testados com o kit E2-IgG ELISA, e os valores de OD foram analisados com a distribuição da frequência logarítimica (Figura 20) . Como espécies de soro normal foram descritos, existe um pico similar em torno de uma escala normal do vlaor OD de 0,025. Mas quando o valor OD caminha para aproximadamente 0,2, a linha extendida vagarosamente para o valor OD de 4,0. Com a análise da distribuição da frequência logarítimica, das espécies as quais os valoes OD foram menores do que 0,251, a media de log(OD) foi 1.333 (OD foi de 0,022) e o SD foi de 0,362. O corte de OD com 95% de especificidade foi de 0,111 (x=2,042), enquanto isso, o corte de OD com 99% de especificidade foi de 0,185 (x=2.266) . Os valores OD menores do que o corte de OD foi distribuído como uma escala normal aproximada, e as muitas espécies representadas por eles podem ser negativas para E2-IgG; as espécies, nas quais os valores OD foram maiores do que o valor de corte OD, podem ser positivas para E2-IgG com títulos diferentes. Com este valor de corte OD, a proporção de resposta das espécies foi de 22,2%.

[0268] Como 200 espécies de soro clínico de pacientes com hepatite aguda foram descritos, existem dois picos distintos em cada lado do valor de corte de OD. O pico da esquerda foi similar àquele das espécies do soro normal, e o pico da direita foi formado entre o valor 0D de 1,6~4,0 (pico em OD 2,5). Foi sugerido que existem dois grupos nos pacientes com hepatite aguda. Um foi similar ao de pessoas normais (aquelas onde o valor OD foi menor do que 0,2) e o outro teve maior valor OD de E2-IgG, mais do que as formas positivas de E2-IgM (Figura 21) . O último provavelmente representado nos pacientes HEV agudos.

Exemplo 37; Agente terapêutico compreendendo anti-HEV Mab da presente invenção, sua preparação e bloqueio do soro positivo para E2-IgM ou/e soro positivo para E2-IgG.

[0269] Na microplaca NE2 pré-revestida descrita como acima, adicionar lOOul da mistura de MAb 8C11 e MAb 8H3 (cada uma foi diluída em uma proporção de 1:1000) em um poço e adicionar lOOul de diluente em um outro poço ao mesmo tempo como controle; incubar a 37 °C por 2 horas, e então virar a placa de cabeça para baixo para secar o poço; adicionar lOOul de uma dupla série de diluições do soro, e incubar a 37°C por 30 minutos; lavar a placa cinco vezes com PEST, então adicionar lOOul de pré-diluído da diluição de trabgalho IgM-HRP anti-humana ou a diluição de trabalho IgG-HRP anti-humana (provido pela Beijing Wantai Biotech company) seguido pela incubação por 30 minutos a 37°C; lavar a solução cinco vezes novamente e secar de cabeça para baixo; adicionar cromatógeno e incubar por 10 minutos a 37°C; e então finalizar a reação com 50ul de 2M H2SO4, e determinar a absorbância de OD450/62o nm para cada poço. Selecionar a proporção de diluição na qual o valor OD do controle foi de 1,0 ~2,0 para calcular a proporção de bloqueio pela fórmula: Proporção de bloqueio = (OD bloqueado - OD controle)/ controle OD * 100%, [0270] E se os MAbs podem bloquear o soro com sucesso se a proporção de bloqueio for acima de 50%, [0271] Na microplaca pré-revestida descrita como acima, adicionar ΙΟΟμΙ da mistura de MAb 8C11 e MAb 8H3 (Diluído em uma proporção de 1:1000) para um poço, adicionar ΙΟΟμΙ da mistura do segmento Fab de MAb 8C11 e do segmento Fab de MAb 8H3 (diluído em uma proporção de 1:1000) em um outro poço e adicionar lOOul do diluente para um terceiro poço ao mesmo tempo como controle; incubar por 2 horas a 37°C, e secá-la de cabeça para aixo; adicionar lOOul do soro de uma série de diluições em uma proporção de 1:2, e incubar por 30 minutos a 37°C; lavar a placa cinco vezes com PEST e secá-la de cabeça para baixo, então adicionar ΙΟΟμΙ de IgM-HRP anti-humana ou IgG-HRP anti-humana diluída para uma concentração de trabalho seguida por incubação durante 30 minutos a 37°C; lavar cinco vezes e secar de cabeça para baixo; adicionar cromatógeno e incubar por 10 minutos a 37°C; finalizar a reação com 50ul de 2M de H2SO4, e determinar a absorbância de OD45o/620nm para cada poço.

[0272] Para verificar a especificidade de E2-IgM ELISA, dois MAbs que capturam diretamente HEV, 8C11 e 8H3, foram usados para bloquear E2-IgM em 10 espécies de soro positivo de E2-IgM. O resultado manifestou que os MAbs poderíam bloquear notavelmente a reação entre o soro e o antígeno E2 com uma proporção de bloqueio na faixa de 66,4%~94,8% (a média da proporção do bloqueio é de 86,6%(86,6%+7,9%)) (ver, figura 21) . Como para 10 espécies de soro positivo para E2-IgG, as reações entre o soro e o antígeno E2 foram todas bloqueadas com as proporções de bloqueio variando de 55% a 96%, a média da proporção de bloqueio de 75,7%.

[0273] Para estimular o impacto do impedimento do efeito estérico do anticorpo monoclonal no teste de bloqueio, o segmento Fab dos dois MAbs foram usados para bloquear duas espécies de soro simultaneamente. Como ilustrado na figura 22, o efeito do bloqueio do segmento Fab consistindo substancialmente com todo seu anticorpo, o qual indicou que o efeito bloqueador do MAbs contra o soro positivo foi por especificidade do epitopo.

Exemplo 38; Antigeno duplo sanduíche ELISA (DS-ELISA) [0274] A microplaca NE2 foi preparada como descrito acima no exemplo 33. O procedimento do experimento foi como a seguir: adicionar 50ul de NE2-HRP diluído para cada poço após adição de 50ul da espécie do soro; bater gentilmente na placa para homogeneizar os reagentes e incubar por 30 minutos a 37°C; lavar a placa seis vezes e secar de cabeça para baixo; então adicionar cromatógeno (substrato TMB, fornecido pela Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd.). Após incubar por 10 minutos a 37°C, finalizar a reação com 50ul de 2M de H2SO4; então medir a absorbância em cada poço a 450 nm com um comprimento de onda de referência em 620nm. Calcular o valor de corte pela adição de 0,12 para a média de absorbância do controle negativo. Se seu valor de absorbância for menor do que o valor de corte, a espécie é considerada não-reativa, fora isso, reativa.

[0275] As espécies de soro de 400 doadores de sangue voluntários foram testadas pelo DS-ELISA e E2-IgG ELISA e o resultado manifestou que os dois ELISA coincidiram com os outros perfeitamente. Como a proporção da amostra/corte das espécies positivas foi mencionada, o DS-ELISA foi maior do que o E2-IgG ELISA (ver, Figura 23).

[0276] Os anticorpos anti-HEV foram classificados no soro de vacas, carneiro, cabra e porcos colhidos da XinJiang e o soro de galinhas da SbangHai pelo DS-ELISA. Como descrito na tabela 21, os anticorpos anti-HEV podem ser detectados a partir daquelas espécies de animais sem exceção, e a porcentagem em porcos foi acima de 79,9%.

Tabela 21: Porcentagem positiva dos anticorpos anti-HEV em animais diferentes foi classificada pelo DS-ELISA.

Exemplo 39: Vacina compreendendo os determinantes antigênicos do peptideo 239, sua preparação e sua imunogenicidade.

[0277] Animal vacinado: 6 camundongos BALB/c e 6 camundongos Kunming brancos, com 4-6 semanas de idade.

[0278] Preparação da vacina: Uma quantidade desejada do adjuvante de alumínio original do Lanzhou Biological Product Institute da China, foi ajustado com IN NaOH até a ocorrência do precipitado. Após misturar completamente, lxPBS foi adicionado para dobrar o volume. Então a centri fugação foi realizada a 10,000rpm por 1 minuto, e o· sobrenadante foi descartado, 0 precipitado foi re-suspenso em lxPBS para o dobro do volume, e centrifugado a 10,000rpm por 1 minuto e o sobrenadante foi descartado. O referido processo foi repetido muitas vezes até o pH alcançar 7-7,4. Finalmente, o precipitada foi re-suspendido com volume igual de lxPBS, e a solução foi esterilizada e armazenada a 4°C, e usado como solução de estoque 9x. Os polipeptidios 239 purificados foram misturados com o adjuvante de alumínio* anterior para uma concentração final como 5μg/100μl, a 4°C, durante a noite. A vacina sem o adjuvante foi preparada apenas com o polipeptidio 239 com uma concentração de 5μρ/100μ1. A dose foi designada como 5μg/camundongo.

[0279] Programa de vacinação: Os animais foram agrupados em um grupo para a vacina com adjuvante e um grupo para a vacina sem adjuvante. Cada grupo tinha 3 camundongos BALB/c (Codificados Bl~B3, B4~B6) e o camundongo Kunming branco (Codificado Kl~K3, K4~K6), vacinado intramuscularmente de acordo com uma imunização determinada de 0, 10 dias. A presença dos anticorpos anti-HEV na coleta semanal do soro foi detectada com um kit ELISA pela placa revestida com o polipeptidio HEV-NE2.

[0280] Resultados (ver Tabela 22) : As vacinas, sem adjuvante e com adjuvante de alumínio 239, tiveram todas, excelente imunogenicidade. Especificamente, com apenas uma vacinação, da vacina sem adjuvante, fez um dos três camundongos induzir os anticorpos anti-HEV. Após duas vacinações, o título de anticorpo anti-HEV de vários camundongos pôde alcançar valores acima de 1:105.

Tabela 22: Imunogenicidade dos camundongos inoculados com a vacina do polipeptidio 239, Exemplo 40: Imuno-proteção do polipeptidio 239, Preparação da vacina contendo o polipeptidio 239 com o adjuvante de alumínio, [0281] Uma quantidade desejada do adjuvante de alumínio original da Lanzhou Biological Product Institute of China, foi ajustado com IN de NaOH até a ocorrência de precipitado. Após misturar completamente, IxPBS foi adicionado para alcançar o dobro do volume. Então o centri fugação foi realizada a 10,000rpm por 1 minuto, e o sobrenadante foi descartado, 0 precipitado foi re-suspenso com IxPBS para obter o dobro do volume, e centrifugado a 10,000rpm por 1 minuto e o sobrenadante foi descartado. O referido processo foi repetido muitas vezes até o pH alcançar de 7-7,4. Finalmente, o precipitado foi re-suspendído com volume igual de IxPBS, e a solução foi esterilizado e armazenada a 4 e C, e usado como uma solução estoque a 9x. O polipeptidio 239 produzido como acima mencionado e purificado por HPLC {a concentração da proteína é de l,0mg/ml) foi diluído com PBS, e o volume de 1/9 do adjuvante de alumínio foi adicionado para alcançar uma concentração final desejada do polipeptídio 239 (lOug/ml) , e misturado durante na oite a 4°C. A mistura foi dividida em 1,2 ml por ampola, e as ampolas foram armazenadas no escuro a 4°C. Antes do uso, as ampolas devem ser agitadas.

Esquema de Imunização [0282] Seis macacos Rhesus saudáveis com ALT normal e HEV negativo foram selecionados e dividos em dois grupos, 3 macacos por grupo. Os macacos do grupo da imunização foram vacinados três vezes através de injeção intradeltoidal com lOug do adjuvante de alumínio contendo a vacina do polipeptídio 239 no dia 0, dia 10 e no dia 58, respectivamente. O controle não foi imunizado.

Infecção com HEV

[0283] Aqueles macacos nos dois grupos foram infectados no 86° dia após a imunização (no 28° dia após a última imunização) com 0,25 ml de uma suspensão fecal a 20% da cepa de HEV XM por macaco (2*10Λ5 títulos de PCR por macaco). Coleta das espécies [0284] As amostras de soro foram tomadas antes e uma vez por semana por pelo menos 10 semanas após a infecção e então uma vez a cada duas semanas posteriormente. O ALT no soro foi determinado com o soro fresco no dia da coleta da amostra.

[0285] As espécies de fezes foram colhitas em outros dias por 10 dias e então duas vezes por semana por até o 86° dia. Se o RNA do vírus não foi continuamente detectado após o início da infecção, a excreção viral foi considerada como reversa.

Detecção dos marcadores de HEV

[0286] Anticorpos IgG anti-HEV - detecção da IgG anti- HEV nos soros dos macacos por dois métodos: Método 1 [0287] Foi realizado um ELISA E2-IgG, no qual o procedimento do experimento foi descrito no Exemplo 31. No método 2, o GL-IgG foi detectado com o Kit ELISA HEV-IgG da GENELABS DIAGNOSTICS. O polipeptídio recombinado da ORF2 de HEV e da ORF3 foi usado neste kit, o qual imita os epitopos do domínio C da ORF2 de HEV (AA604-AA660) e da ORF3 de HEV que não se sobrepõem com o epítopo principal de NE2.

[0288] Excreção viral: detecção do RNA de HEV nas fezes através do método como descrito no Exemplo 11.

[0289] Anticorpos IgM anti-HEV: detecção do IgM anti-HEV no soro dos macacos através do método descrito no exemplo 32. Resultados: [0290] Como descrito na tabela 22, em todos os três macacos controles, as excreções virais, E2-IgM, E2-IgG e GL-IgG foram detectadas uma semana após a infecção, o que manifestou que o HEV infectou aqueles macacos e replicou sucessivamente. Em dois dos três macacos imunizados, as excreções virais, E2-IgM e GL-IgG foram sempre indetectáveis, mas nos outros macacos, a excreção viral iniciou na terceira semana após a infecção e a E2-IgM e GL-IgG convergida na sétima semana após a infecção. Os macacos imunizados podería prevenir a infecção por HEV ou diminuir a severidade do sintoma, o que manifestou que o polipeptídio 239 teve uma imuno-proteção efetiva.

Tabela 22: Imuno-proteção do VLPs HEV recombinantes formados pelo polipeptídio 239.

Exemplo 41: Kit ELISA sanduíche antigenos duplos (DS-ELISA) para detecção dos anticorpos anti-HEV totais nas espécies biológicas, sua preparação e seu procedimento de ensaio.

[0291] O kit DS-ELISA consiste de micropoços pré-revestidos com o polipeptídeo NE2 recombinante, a solução de trabalho NE2-HRP diluída com a enzima diluente (20mM, pH7,2, PB, 5% de caseina e 10% de NBS) e alguns materiais ativos não biológicos (tais como 20x ΡΒΞΤ, cromatógeno A, cromatógeno B e solução de finalização etc.) obtido da Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd.

[0292] O procedimento de ensaio deste kit é como a seguir: adicionar 5Gul do ME2-HRP diluído para cada poço após adição de 50ul da espécie de soro; agitando gentilmente a placa para homogeneizar os reagentes com incubação por 60 minutos a 37 6C; lavar a placa seis vezes e secá-la de cabeça para baixo; então adicionar 50ul de cada, do cromatógeno A e do cromatógeno B; após incubação por 15 minutos a 37 °C, finalizar a reação com 50ul de 2M HjSO.;; então determinar a absorbância para cada poço a 450nm com um comprimento de onda de referência de 62Onm.

[0293] Os anticorpos anti-HEV foram classificados no soro de vacas, carneiro, cabra e porcos obtidos da XinJiang e o soro de galinhas da ShangHai através do DS-ELISA. Como descrito na tabela 23, as formas dos anticorpos anti-HEV poderíam ser detectadas de espécies de animais sem exceção, e a taxa positiva em porcos foi de até 79,91.

Tabela 23: Taxa positiva dos anticorpos anti-HEV em diferentes animais, classificada por DS-ELISA.

REIVINDICAÇÕES

Claims (15)

1. Polipeptidio recombinante ou isolado, caracterizado pelo fato de ser o: 1) polipeptidio 239 com a sequência de aminoácidos representado na SEQ.ID.NO:21; 2) polipeptidio 243 com a sequência de aminoácidos representado na SEQ.ID.NO:23; 3) polipeptidio 251 com a sequência de aminoácidos representado na SEQ.ID.NO:24; 4) polipeptidio 262 com a sequência de aminoácidos representado na SEQ.ID.NO:25; 5) polipeptidio 292 com a sequência de aminoácidos representado na SEQ.ID.NO:26.

2. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de nucleotideos codificando o polipeptidio, tal como definido na reivindicação 1.

3. Kit de diagnóstico para detectar a infecção pelo virus da hepatite E, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um polipeptideo recombinante ou isolado, conforme definido na reivindicação 1, e um agente de detecção apropriado para detectar a reação entre o referido polipeptideo e um anticorpo, sendo dito kit de diagnóstico utilizado para: 1) detectar o anticorpo IgG contra o virus da hepatite E em uma amostra; ou 2) detectar o anticorpo IgM contra o virus da hepatite E em um amostra; ou 3) detectar o anticorpo total contra o virus da hepatite E em um amostra.

4. Composição de vacina, caracterizado pelo fato de compreender o polipeptideo recombinante ou isolado, conforme definido na reivindicação 1, e um adjuvante imune apropriado, sendo que o polipeptideo recombinante ou isolado é o polipeptideo 239 consistindo da sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21.

5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o polipeptideo estar em uma quantidade de 0,0001 mg-0,1 mg por administração, ou 0,01 mg-0,04 mg.

6. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de ser utilizada para profilaxia da infecção do virus da hepatite E.

7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptideo recombinante ou isolado, conforme definido na reivindicação 1, e um veiculo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, sendo que o polipeptideo recombinante ou isolado é o polipeptideo 239 consistindo da sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de o polipeptideo estar em uma quantidade de 0,001 mg-20 mg por kilograma do peso do corpo ou 0,1 mg-10 mg por kilograma do peso do corpo.

9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de ser utilizada para profilaxia e/ou tratamento da infecção do virus da hepatite E.

10. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de ácido nucléico, conforme definida na reivindicação 2.

11. Célula hospedeira transformada, com o vetor de expressão recombinante, conforme definido na reivindicação 10, caracterizada pelo fato de ser uma célula procarionte, de Aspergillus ou de Saccharomyces capaz de expressar o polipeptídeo recombinante.

12. Polipeptídeo recombinante ou isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser utilizado no diagnóstico do vírus da hepatite E.

13. Polipeptídeo recombinante ou isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser utilizado na profilaxia e/ou tratamento da infecção do vírus da hepatite E, sendo que o polipeptídeo recombinante ou isolado é o polipeptídeo 239 consistindo da sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21.

14. Uso do polipeptídeo recombinante ou isolado, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser dirigido à preparação de um medicamento para diagnóstico do vírus da hepatite E.

15. Uso do polipeptídeo recombinante ou isolado, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser dirigido à preparação de um medicamento para profilaxia ou tratamento de uma infecção do vírus da hepatite E, sendo que o polipeptídeo recombinante ou isolado é o polipeptídeo 239 consistindo da sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO:21.