CN105445463A - 一种戊肝IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戊肝IgG抗体检测试剂盒,所述试剂盒包括以下组分:包被HEV基因重组抗原的固相材料;用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体;浓缩洗液;增强液;分析缓冲液;样本稀释液;阴阳性对照。此外,本发明还提供该试剂盒的制备方法,包括如下步骤:第一步,制备包被HEV基因重组抗原的固相材料;第二步,用信号生成物质标记鼠抗人IgG单克隆抗体。另外,本发明还公开该试剂盒在检测戊肝IgG抗体中的应用。该检测试剂盒克服了大分子(如:酶)标记抗体的缺点,具有灵敏度高、稳定性好、成本低廉等优点,从而显著改善了戊型肝炎病毒IgG抗体检测的特异性、灵敏度和稳定性,同时大幅降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种戊型肝炎病毒(HEV)IgG抗体试剂盒及其检测方法,特别是涉及一种基于间接标记的非竞争免疫分析原理,定性检测人血清样本中戊型肝炎病毒IgG抗体的方法及其相应的检测试剂盒。
背景技术
戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus,HEV)引起,经粪、口途径传播的急性肠胃道传染病,主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家和地区。戊肝和甲肝在我国及其他发展中国家均十分常见,10年前,在我国的上海和新疆两地分别发生了甲肝和戊肝的暴发流行,发病人数均超过10万。两者在临床症状、传播途径以及转归方面极为相似,但是戊肝发病以青壮年为主,病情较重,病死率较高,特别是孕妇的病死率可高达10%~40%。戊肝较甲肝患者发病年龄大,病程长,黄疸程度深,与其他肝炎病毒的重叠或混合感染率高。我国是病毒性肝炎高发区,据统计,在急性病毒性肝炎中,戊型肝炎发病率为3.4%~20.5%,平均为8.6%,对人民健康与劳动生产力的危害甚大。除了人类可感染HEV外,近年来还发现猪感染HEV。1997年首次在美国报道,凡大于3周龄的猪100%都可检测到抗-HEV、HEVRNA等血清标记物。现已明确全球都存在猪HEV感染,其存在的意义尚不明确,可能与人类感染有关。
HEV成球形,直径27~34nm,基因组是单股正链RNA,长约7.5kB,由5′非编码区、编码区和3′非编码区组成。编码区包括3个开放读码框架(ORF)。ORF1位于基因组的5′端,长5,079bp,为非结构区基因,编码病毒复制所需要的RNA聚合酶、蛋白酶和解旋酶等;ORF2及ORF3位于基因组的3′端,ORF2长1,980bp,编码病毒的结构蛋白;ORF3长369bp,含有可被中和抗体所识别的抗原表位。随着戊型肝炎病毒分子克隆技术的成功建立,以重组蛋白作为抗原来检测HEV抗体的技术正在逐步完善,同时HEV的生物学性状也在进一步了解中。
目前,国内外尚未有以镧系元素标记的间接法测定戊型肝炎病毒IgG抗体的技术用于检测人血清IgG抗体的报道。
本试剂盒采用时间分辨免疫荧光分析法(Time-resolvedImmunofluorometricAssay,TRIFMA),应用镧系元素作为示踪剂,标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异性荧光的干扰,极大的提高了灵敏度,具有特异性强、稳定性好、精密性高、重复性好等优点。虽然时间分辨免疫荧光分析法相对传统的RIA(RadioImmunoassay,放射免疫分析)或ELISA(Enzyme-linkedImmunoabsorbentassay,酶联免疫分析)检测灵敏度有很大的提高,与CLIA(ChemiluminescenceImmunoassay,化学发光免疫)相比也有一定的优势,但也存在一些缺点,如对环境洁净程度要求较高,因为空气中灰尘可能会导致本底偏高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于稀土元素标记的间接法测定戊型肝炎病毒IgG抗体的方法及其相应的检测试剂盒。该检测试剂盒克服了大分子(如:酶)标记抗体的缺点,具有灵敏度高、稳定性好、成本低廉等优点,从而显著改善了戊型肝炎病毒IgG抗体检测的特异性、灵敏度和稳定性,同时大幅降低了成本。
为解决上述技术问题,本发明提供一种戊肝IgG抗体检测试剂盒,所述试剂盒包括以下组分:
包被反应板:包被HEV基因重组抗原的固相材料;
标记物:用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体;
浓缩洗液:含Tween-20、防腐剂的Tris缓冲液;
增强液:含有邻苯二甲酸氢钾、冰醋酸、曲拉通、螯合剂组分,将信号生成物质解离到溶液中,便于检测荧光信号;
分析缓冲液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂,用于稀释标记物;
样本稀释液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂,用于标本的稀释;
阴性对照:含磷酸盐、小牛血清,用于验证临床标本的无反应性;
阳性对照:含磷酸盐、小牛血清和HEV-IgG抗体,用于验证临床标本的有反应性。
作为本发明优选的技术方案,所述HEV基因重组抗原的包被浓度为150-400ng/mL。
所述信号生成物质,包括:酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质;其中,酶,包括:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶;荧光物质,包括:异硫氰酸荧光素FITC、荧光素;稀土离子,包括:Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+及其螯合物配基;化学发光物质,包括:丫啶酯及其衍生物;电化学发光物质,包括:多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+。
作为本发明优选的技术方案,所述标记物为铕标记物20×,是保存于Tris缓冲液中的Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体,临用前1:20稀释使用。
所述HEV基因重组抗原包括通过基因工程技术制备的戊型肝炎病毒基因重组抗原,或通过合成方法制备的戊型肝炎病毒基因重组抗原;所述固相材料包括:微孔反应板、试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒、或其它不同大小、形状的塑料制品。
此外,本发明还提供一种上述试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
第一步,制备包被HEV基因重组抗原的固相材料;
第二步,用信号生成物质标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
第一步具体步骤包括:
(1)将HEV基因重组抗原溶解于包被缓冲液后,浸泡固相材料,静置20~30小时;其中,包被缓冲液是0.1MpH8.0(±0.2)的PBS,包被体积为100μL/孔缓冲液,其中,该缓冲液中含有:0.01%SDS;
(2)用含表面活性剂的缓冲液洗涤步骤(1)制备的HEV基因重组抗原包被的固相材料后,加入含酪蛋白的缓冲液(即封闭液),室温静置18~24小时,其中酪蛋白的缓冲液包含了0.05mol/LpH7.8±0.2,含0.5%酪蛋白钠盐、10%蔗糖、0.05%NaN3的TSA缓冲液;
(3)弃去缓冲液,干燥固相材料,从而完成HEV基因重组抗原包被固相材料的制备。
在第二步中,将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质,通过过碘酸钠法与酶结合在一起;或将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与带有反应官能团的荧光物质或化学发光物质混合,使它们结合在一起。在双功能官能团存在下,将抗小分子物质抗体或其他能与小分子结合的物质与酶、荧光物质或化学发光物质混合,使它们结合在一起。标记的方法包括:
(1)基于有机化学原理的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法;
如直接使用连接有反应活性官能团的小分子物质与TP抗原反应;或通过活化方式(如活化羰基为羧基)在小分子物质或TP抗原引入反应活性官能团,再与TP抗原或小分子物质反应;
(2)基于酶化学和基因重组技术的小分子物质与蛋白质或多肽之间的连结方法。如通过酶化学和基因重组技术直接在重组TP抗原上引入小分子物质,完成重组TP抗原的标记。
作为本发明优选的技术方案,第二步具体为:
(1)将鼠抗人IgG单克隆抗体用超纯水调整至1.0~4.0mg/mL,温度为20~25℃范围内,透析过夜;
(2)室温条件下,按照标铕比例1:2~1:4(铕:蛋白),用纯化水完全溶解Eu-DTTA,滴加到透析后的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液中,搅拌混匀5-10分钟,然后室温避光静置24小时±2小时;
(3)待标记物反应时间完成后,采用层析柱分离,分管收集流出液,流出液即为铕标记原液。
此外,本发明还提供该试剂盒在检测戊肝IgG抗体中的应用,包括如下步骤:
第一步,在所述包被HEV基因重组抗原的固相材料中先加入样本稀释液,然后将样品或阴阳性对照按顺序加入相应微孔,再于室温下振荡反应;
第二步:在微孔内加入用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体后,室温振荡;
第三步,在每个微孔内加入增强液,室温振荡;
第四步,用时间分辨荧光检测仪进行荧光强度测定。
上述应用的原理是:利用固相材料表面的HEV基因重组抗原及小分子物质标记的二抗(鼠抗人IgG单克隆抗体)与样本中的抗人HEVIgG抗体发生免疫反应,形成夹心复合物:固相HEV抗原—抗-HEVIgG—铕标记物(Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体)复合物,然后加入Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(以下简称铕标记物)通过免疫反应形成固相HEV抗原—抗-HEVIgG—铕标记物复合物,然后,利用信号报告分子与小分子物质的结合反应,使形成的复合物带有可检测的信号生成物质,用于检测样本中抗人HEVIgG抗体的含量。
临床上戊肝IgG抗体常与IgM抗体联合检测,提高戊型肝炎的检出率,也广泛应用于流行病学调查。基于上述因素,基于稀土元素标记的间接法测定抗HEVIgG抗体的检测试剂盒测定抗HEVIgG抗体可以有效改善戊型肝炎病毒IgG抗体检测的灵敏度和特异性。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
3.1灵敏度
目前市场上流通的戊型肝炎病毒IgG抗体检测试剂盒,大多灵敏度较低,本试剂盒用时间分辨技术测量荧光,同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异性荧光的干扰,极大地提高了灵敏度。
本试剂盒采用包被原料(HEV抗原)是以基因工程重组技术表达的HEVORF2基因编码的结构蛋白片断,充分融合了目前广泛流行的戊型肝炎病毒I~Ⅳ型四种基因型优势抗原表位,因而对不同基因型戊型肝炎病毒均能检出,进一步提高了检测灵敏度。
3.2特异性
由于本试剂盒采用的包被抗原为含优势抗原表位的蛋白片段,相比全抗原包被,非特异性结合减少,从而提高了检测的特异性。
3.3成本低廉
试剂盒成本的主要构成往往是昂贵的抗原抗体,酶联免疫试剂盒由于技术平台自身的原因,为提高检出率,往往生物原料使用浓度较大,因而试剂成本也随之增加。本试剂盒采用时间分辨免疫荧光分析,合理建立工艺参数,有效控制试剂成本,无论包被抗原,还是标记抗体,用量均只有酶联免疫方法的十分之一左右,大大节省了试剂盒成本。此外,与现有的时间分辨免疫荧光分析法试剂盒相比,本试剂盒的制作成本也明显更低,将这种成本低廉优势淋漓尽致地发挥出来,其成本优势超过了其他现有的时间分辨免疫荧光分析法试剂盒。
3.4其他
3.4.1节省时间
本试剂盒采用两步法(30分钟+30分钟模式),最快90分钟内可出结果,在同类试剂盒中属于领先水平。
3.4.2操作方便
本试剂盒不需要在室温中反应,不像酶联免疫试剂需要37℃孵育,操作方便。
附图说明
图1:试剂盒生产工艺流程图,备注:虚线框内的工序在十万级洁净区完成。星号标注,关键工艺。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
在试剂盒生产工艺中,包被反应板、铕标记物20×、阴性对照、阳性对照、样本稀释液、分析缓冲液、浓缩洗液、增强液、说明书等组分是必须组分,Tip头和
如图1所示,本发明提供一种基于稀土元素标记的间接法测定抗HEVIgG抗体的检测试剂盒,包括:
包被反应板:包被HEV基因重组抗原的固相材料;
铕标记物20×:用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体,保存于Tris缓冲液中的Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体,临用前1:20稀释使用;
浓缩洗液:Tris缓冲液,含Tween-20、防腐剂等,25倍稀释后使用,可以洗掉一些未特异性结合的抗原抗体或其他组分;
增强液:含有邻苯二甲酸氢钾、冰醋酸、曲拉通、螯合剂等组分,将信号生成物质解离到溶液中,便于检测荧光信号;
分析缓冲液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂等,用于稀释铕标记物20×;
样本稀释液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂等,用于标本的稀释;
阴性对照:含磷酸盐、小牛血清等,可以验证临床标本的无反应性;
阳性对照:含磷酸盐、小牛血清和HEV-IgG抗体等,可以验证临床标本的有反应性;
说明书:一份,包含了试剂盒预期用途、使用方法和注意事项等内容;
封片纸:三张,在试剂盒检测时防止灰尘污染微孔;
Tip头:吸取铕标记工作液和增强液等组分;
自封袋:用于包被板开封后保存。
本发明试剂盒的检测原理是:利用固相材料表面的HEV基因重组抗原及小分子物质标记的二抗(鼠抗人IgG单克隆抗体)与样本中的抗人HEVIgG抗体发生免疫反应,形成夹心复合物:固相HEV抗原—抗-HEVIgG—铕标记物(Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体)复合物然后加入Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(以下简称铕标记物)通过免疫反应形成固相HEV抗原—抗-HEVIgG—铕标记物复合物,然后,利用信号报告分子与小分子物质的结合反应,使形成的复合物带有可检测的信号生成物质,用于检测样本中抗人HEVIgG抗体的含量。
实施例1HEV-基因重组抗原包被板的制备
HEV-基因重组抗原的来源:购自上海必吉生物技术有限公司。
步骤如下:
(1)在包被微孔反应板板架上喷印条形码,并在板条右边凸起处划好红色标识线;
(2)将HEV基因重组抗原溶解于包被缓冲液后,浸泡固相材料,静置20~30小时;其中,包被缓冲液是0.05-0.1MpH8.0(±0.2)的PBS,包被体积为100μL/孔缓冲液,其中,该缓冲液中含有:0.005-0.05%SDS;包被工作液是添加了HEV基因重组抗原(150-400ng/mL)和0.05%-0.5%(体积比)抗原保护剂(β-巯基乙醇)的包被缓冲液;然后以100μl/孔加入微孔,室温静置20-30小时,并注意要防止水分蒸发;
(3)在达到包被孵育时间后,用含表面活性剂的缓冲液洗涤两次(洗液400μl/孔)注入封闭液200μl/孔,室温静置18-24小时;其中,封闭液是包含了0.1-0.5%酪蛋白钠盐、10-20%蔗糖、1-3%海藻糖、0.05%NaN3等组分的TSA缓冲液(0.05mol/LpH7.8±0.2)。
(4)吸干封闭液并甩干;
(5)将甩干的反应板放入真空干燥机,真空度小于50帕,抽干3.5小时,停机;
(6)将干燥后反应板装入铝箔袋并热封,做好标识,放置2-8℃保存。
实施例2铕标记物的制备
鼠抗人IgG单克隆抗体来源:购自北京协顺生物技术开发中心
(1)将鼠抗人IgG单克隆抗体用超纯水调整至2.5mg/mL,温度为20~25℃范围内,用一定体积(1~5L)的透析溶液1透析过夜;其中透析溶液1是0.1mol/L、pH8.1±0.2的碳酸氢钠缓冲液。
透析时间为24h±2h,换液两次,时间间隔大于3小时;之后在温度为20~25℃范围内,换用透析溶液2;其中透析缓冲液2是0.1mol/L、pH9.4±0.2的CBS缓冲液。透析24h±2h,换液两次,时间间隔大于3小时,遇下班则换液后过夜透析。
(2)室温条件下,按照标铕比例1:3(铕:蛋白),用纯化水完全溶解Eu-DTTA,滴加到透析后的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液中。滴加时应慢慢晃动原料,充分混匀,搅拌混匀5-10分钟,然后室温(20~25℃)避光静置24小时±2小时。
(3)待标记物反应时间完成后,采用层析柱分离,分离标记前用0.05mol/LpH7.8±0.2的Tris-HCl-NaCl溶液冲洗,平衡过夜。用已备好分离标记的层析柱,取出标记物用加样枪上样,上样时应沿管壁慢速加样。将上好样的层析柱底端出口连接核酸电脑检测仪进口处,检测操作采集端口开始,根据电脑显示由基线上升及出峰情况趋势则开始分管收集流出液,流出液即为铕标记原液。将铕标记物原液用铕标记保存液【pH7.8±0.2的Tris-HCl-NaCl,含0.3%BSA和0.1%NaN3】(见图1中的铕标记保存液)稀释到1-4.5μg/mL,即可得到铕标记物半成品。
实施例3戊肝IgG抗体检测应用
(1)试剂的准备
将40mL浓缩洗液【含0.2-1.0%吐温20的Tris-HCl-NaCl(pH8.3±0.2)溶液,临用时40倍稀释】和960mL去离子水或蒸馏水在干净的洗液瓶中混合,作为工作洗涤液备用。
将试剂盒内阴阳性对照、样本稀释液、分析缓冲液、所需数量的微孔反应条和待测样品平衡至18~28℃),将液体试剂振荡混匀。
配制铕标记物工作液:对每一条12孔板,取75μL铕标记物(20×),加1.5mL分析缓冲液【pH7.8±0.2的酪蛋白缓冲液,含0.878%的NaCl、0.5%酪蛋白钠盐、0.606%的Tris、0.5%的盐酸、0.00074%的EDTA-Na2、0.2%TritonX-100、3%山羊血清、0.005%鸡冠花红和0.05%NaN3】后,充分混匀(1:20稀释)。第二步振荡反应前30分钟内配制。
(2)编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设抗-HEVIgG阴性对照【pH7.4±0.2的磷酸缓冲液,含0.232%Na2HPO4、0.016%KH2PO4、0.64%NaCl、0.016%KCl和20%小牛血清】和阳性对照【pH7.4±0.2的磷酸缓冲液,含0.232%Na2HPO4、0.016%KH2PO4、0.64%NaCl、0.016%KCl、10-20%小牛血清和抗HEV阳性血】各2孔。
(3)第一步振荡反应:每孔先加入样本稀释液【pH6.0±0.2的酪蛋白缓冲液配方如下:1.756%的NaCl、0.1-0.5%酪蛋白钠盐、0.05-0.5%的鱼皮明胶、0.2-0.5%的Brij-35、0.01-0.02%的EDTA-Na2、0.005%溴甲酚紫和0.05%NaN3】100μL,然后吸取10μL的样品或阴阳性对照按顺序加入相应微孔,18~28℃慢档振荡30分钟。
(4)用工作洗涤液【浓缩洗液用纯化水40倍稀释所得】洗板5次,将板条在洁净的吸水纸上拍干。
(5)第二步振荡反应:在每个微孔内加入100μL铕标记物工作液后,18~28℃慢档振荡30分钟。
(6)用工作洗涤液【浓缩洗液用纯化水40倍稀释所得】洗板5次,将板条在洁净的吸水纸上拍干。
(7)在每个微孔内加入100μL的增强液【1.0%(体积/体积)冰乙酸和2.0%(质量/体积)邻苯二甲酸氢钾缓冲液,含有0.1-0.5%(质量/体积)β-萘基甲酰三氟丙酮(β-NTA),1-5%(质量/体积)三正辛基氧膦(TOPO),0.05-0.2%(体积/体积)TritonX-100】,室温慢档振荡5分钟。
(8)荧光强度测定:用时间分辨荧光检测仪,选择相应程序测荧光强度。下面表1为申请人生产的HEV-IgG三批试剂盒测国家参考品的实验数据。
表1中国药品生物制品检定所HEV-IgG国家参考品,批次:0805。
注:上述表1按公式Cutoff值(临界值)=0.2PCx+5000,计算Cutoff,按S/CO=荧光值/Cutoff计算各参考品S/CO,包括国家质控血清盘阴性参考品N1N30和阳性参考品P1P10各点的S/CO,阴、阳性参考品检出率均符合国家质控血清盘要求。
检测试剂:公司HEV-IgG试剂盒,批号:20130920、20131120和20131220
阴阳性参考品符合率及精密度参考品符合率均符合国家参考品质量标准,即阴性符合率≥29/30,阳性符合率≥9/10,重复性CV(%)≤15%。
以现有国家食品药品监督管理局注册证的、北京万泰生物药业股份有限公司生产的“戊型肝炎病毒IgG抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)”[注册证号:国食药监械(准)字2011第3400940号]作为参比试剂,与考核试剂同步检测HEV-IgG样本1125份。以参比试剂为相对标准,相对灵敏度(阳性符合率)为99.15%,相对特异性(阴性符合率)为98.13%,相对总符合率为98.67%。
综上所述,我们可以看到:
(1)以稀土元素标记的间接法试剂盒检测戊型肝炎病毒IgG抗体具有很高的戊型肝炎病毒IgG抗体的检测灵敏度。
(2)以稀土元素标记的间接法试剂盒检测戊型肝炎病毒IgG抗体,具有良好的特异性。
Claims (9)
1.一种戊肝IgG抗体检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括以下组分:
包被反应板:包被HEV基因重组抗原的固相材料;
标记物:用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体;
浓缩洗液:含Tween-20、防腐剂的Tris缓冲液;
增强液:含有邻苯二甲酸氢钾、冰醋酸、曲拉通、螯合剂组分,将信号生成物质解离到溶液中,便于检测荧光信号;
分析缓冲液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂,用于稀释标记物;
样本稀释液:含NaCl、酪蛋白钠盐、防腐剂,用于标本的稀释;
阴性对照:含磷酸盐、小牛血清,用于验证临床标本的无反应性;
阳性对照:含磷酸盐、小牛血清和HEV-IgG抗体,用于验证临床标本的有反应性。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述HEV基因重组抗原的包被浓度为150-400ng/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述信号生成物质包括:酶、荧光物质、稀土离子、化学发光物质、电化学发光物质;其中,所述酶包括:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶;所述荧光物质包括:异硫氰酸荧光素FITC、荧光素;所述稀土离子包括:Eu3+、Sm3+、Tb3+、Dy3+及其螯合物配基;所述化学发光物质包括:丫啶酯及其衍生物;所述电化学发光物质包括:多环芳烃类、酰肼类、联吡啶类化合物以及三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述标记物为铕标记物20×,是保存于Tris缓冲液中的Eu3+标记的鼠抗人IgG单克隆抗体,临用前1:20稀释使用。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述HEV基因重组抗原包括通过基因工程技术制备的戊型肝炎病毒基因重组抗原,或通过合成方法制备的戊型肝炎病毒基因重组抗原;所述固相材料包括:微孔反应板、试管、塑料颗粒或塑料微粒、磁微粒、或其它不同大小、形状的塑料制品。
6.一种如权利要求1所述的试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,制备包被HEV基因重组抗原的固相材料;
第二步,用信号生成物质标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的试剂盒的制备方法,其特征在于,第一步具体为:
(1)将HEV基因重组抗原溶解于包被缓冲液后,浸泡固相材料,静置20~30小时;其中,包被缓冲液是0.1MpH8.0(±0.2)的PBS,包被体积为100μL/孔缓冲液,其中,该缓冲液中含有:0.01%SDS;
(2)用含表面活性剂的缓冲液洗涤步骤(1)制备的HEV基因重组抗原包被的固相材料后,加入含酪蛋白的缓冲液,室温静置18~24小时,其中含酪蛋白的缓冲液包含了0.05mol/LpH7.8±0.2,含0.5%酪蛋白钠盐、10%蔗糖、0.05%NaN3的TSA缓冲液;
(3)弃去缓冲液,干燥固相材料,从而完成HEV基因重组抗原包被固相材料的制备。
8.如权利要求6所述的试剂盒的制备方法,其特征在于,第二步具体为:
(1)将鼠抗人IgG单克隆抗体用超纯水调整至1.0-4.0mg/mL,温度为20~25℃范围内,透析过夜;
(2)室温条件下,按照标铕比例铕:蛋白=1:2~1:4,用纯化水完全溶解Eu-DTTA,滴加到透析后的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液中,搅拌混匀5-10分钟,然后室温避光静置24小时±2小时;
(3)待标记物反应时间完成后,采用层析柱分离,分管收集流出液,流出液即为铕标记原液。
9.一种如权利要求1所述的试剂盒在检测戊肝IgG抗体中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,在所述包被HEV基因重组抗原的固相材料中先加入样本稀释液,然后将样品或阴阳性对照按顺序加入相应微孔,再于室温下振荡反应;
第二步:在微孔内加入用信号生成物质标记的鼠抗人IgG单克隆抗体后,室温振荡;
第三步,在每个微孔内加入增强液,室温振荡;
第四步,用时间分辨荧光检测仪进行荧光强度测定。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107966559A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-04-27 | 上海透景诊断科技有限公司 | 用于血清淀粉样蛋白a免疫检测的样本稀释液及其制备方法和应用 |
CN109725141A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-07 | 东莞东阳光科研发有限公司 | Sa-磁珠冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法 |
CN109765374A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-17 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种戊肝IgG抗体的检测方法及试剂盒 |
CN113495156A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 郑州达诺生物技术有限公司 | 一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法 |
CN113495140A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 郑州达诺生物技术有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法 |
CN113721034A (zh) * | 2021-11-02 | 2021-11-30 | 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 | 一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1610697A (zh) * | 2001-11-08 | 2005-04-27 | 养生堂有限公司 | 戊型肝炎病毒单克隆抗体或其结合活性片段及其用途 |
CN101393207A (zh) * | 2008-10-07 | 2009-03-25 | 江苏省原子医学研究所 | 一种脱氧雪腐镰刀烯醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
CN101551396A (zh) * | 2008-04-02 | 2009-10-07 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 |
CN103323599A (zh) * | 2013-04-09 | 2013-09-25 | 广州诺诚生物制品股份有限公司 | 一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法 |
CN103529213A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫骥生物医药有限公司 | 检测戊型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103760350A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-04-30 | 朱宝 | 一种乙酰肝素酶的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
-
2014
- 2014-09-25 CN CN201410497696.3A patent/CN105445463A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1610697A (zh) * | 2001-11-08 | 2005-04-27 | 养生堂有限公司 | 戊型肝炎病毒单克隆抗体或其结合活性片段及其用途 |
CN101551396A (zh) * | 2008-04-02 | 2009-10-07 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法 |
CN101393207A (zh) * | 2008-10-07 | 2009-03-25 | 江苏省原子医学研究所 | 一种脱氧雪腐镰刀烯醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
CN103323599A (zh) * | 2013-04-09 | 2013-09-25 | 广州诺诚生物制品股份有限公司 | 一种狂犬病毒核蛋白时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法 |
CN103529213A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-22 | 北京华卫骥生物医药有限公司 | 检测戊型肝炎病毒的方法及量子点标记免疫层析试纸及其制备方法 |
CN103760350A (zh) * | 2014-01-09 | 2014-04-30 | 朱宝 | 一种乙酰肝素酶的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法 |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107966559A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-04-27 | 上海透景诊断科技有限公司 | 用于血清淀粉样蛋白a免疫检测的样本稀释液及其制备方法和应用 |
CN109725141A (zh) * | 2018-12-21 | 2019-05-07 | 东莞东阳光科研发有限公司 | Sa-磁珠冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法 |
CN109725141B (zh) * | 2018-12-21 | 2022-04-29 | 东莞东阳光医疗智能器件研发有限公司 | Sa-磁珠冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法 |
CN109765374A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-05-17 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种戊肝IgG抗体的检测方法及试剂盒 |
CN113495156A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 郑州达诺生物技术有限公司 | 一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法 |
CN113495140A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 郑州达诺生物技术有限公司 | 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体定量试剂盒及其使用方法 |
CN113721034A (zh) * | 2021-11-02 | 2021-11-30 | 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 | 一种检测s100b蛋白的时间分辨免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用 |
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