CN109725141B - Sa-磁珠冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法 - Google Patents
Sa-磁珠冻干工作液、sa-磁珠冻干品及冻干品的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种SA‑磁珠冻干工作液、SA‑磁珠冻干品及冻干品的制备方法，所述冻干工作液适用于碱性磷酸酶发光体系，包括蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为酪蛋白钠。所述冻干工作液还包括缓冲液，所述缓冲液为TBS缓冲液，所述TBS缓冲液的组分为10‑50mM Tris‑HCl，0.9％NaCl，pH：7.4。本发明的冻干工作液，包括了酪蛋白钠和TBS缓冲液，以使冻干工作液更适于碱性磷酸酶反应体系的SA‑磁珠冻干品；SA‑磁珠与冻干工作液的混合液以微液滴形式点样到芯片中再通过原位冻干后得到冻干品，冻干品复溶后能够保持很好的结合生物素的活性，与生物素化抗体、抗原及碱性磷酸酶标记抗体发生夹心反应后，对酶催化底物的活性影响小，发光值高而稳定。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂技术领域，特别是涉及一种链霉亲和素偶联磁珠(SA-磁珠)工作液、链霉亲和素偶联磁珠(SA-磁珠)冻干品及冻干品的制备方法。
背景技术
目前市售的SA-磁珠保存在低温(4-8℃)缓冲液中。这种SA-磁珠混悬后吸取一定体积，可以直接用于基于SA-磁珠、生物素化抗体及酶标记抗体的液相免疫反应体系中。但液体保存的SA-磁珠不适合应用于蛋白芯片或微流控芯片中，蛋白芯片或微流控芯片内需要预先包埋的冻干的固相SA-磁珠，且要求SA-磁珠仍能具有一定的骨架结构，在使用时，加入待检测样品(一般为血清样品)后SA-磁珠能够快速复溶和分散均匀，并能保持链霉亲和素与生物素化抗体的高效结合活性。此外，芯片上的SA-磁珠以干燥固相状态存在也便于芯片试剂长期保存和常温运输，将大大减少芯片试剂保存和运输成本。
专利CN108008125A中公开了一种适用于免疫磁珠的冻干工作液和免疫磁珠冻干品及其制备方法，对普通免疫磁珠的冻干有一定效果，但是对于SA-磁珠不太适合，尤其是当此SA-磁珠与生物素化抗体及碱性磷酸酶标记抗体联合使用，用来检测样品中抗原含量时，该专利中冻干工作液成分对SA-磁珠稳定性、分散性及碱性磷酸活性具有一定的影响。其中，冻干工作液成分白蛋白(如BSA)对碱性磷酸酶酶解底物AMPPD的发光强度影响较大，另外如果冻干磁珠复溶或分散不充分，将增大检测结果的变异系数(CV值)，造成结果的精密度下降。此外，磷酸盐缓冲液在冻干过程中结晶会使溶液pH值剧烈变化，从而导致蛋白质变性，活性降低。
因此，有必要对现有的冻干工作液组分进行优化，以适用于SA-磁珠，尤其是适用于碱性磷酸酶发光体系的SA-磁珠。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供了一种SA-磁珠冻干品的冻干工作液及其制备方法，以解决SA-磁珠存储时间短、运输不便，SA-磁珠冻干品发光强度不稳定、复溶性差等问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种SA-磁珠冻干品的冻干工作液，所述冻干工作液适用于碱性磷酸酶发光体系，包括蛋白保护剂，所述蛋白保护剂为酪蛋白钠。
具体的，酪蛋白钠而不是白蛋白的加入，可以起到蛋白保护剂的作用，而且不会对碱性磷酸酶酶化学发光系统造成影响，有利于获得重复性好的检测结果。
优选地，所述冻干工作液还包括缓冲液，所述缓冲液为TBS缓冲液，所述TBS缓冲液的组分为10-50mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4。在一些具体实施例中，所述Tris-HCl为10mM、20mM、30mM、40mM或50mM。
具体的，TBS缓冲液比磷酸盐缓冲液(PBS)更有利于碱性磷酸酶反应体系，PBS缓冲液冻干过程中结晶会使溶液pH值剧烈变化，蛋白质容易变性，活性降低，而TBS缓冲液在冷冻干燥过程中，溶液pH值变化较小，此外，较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，所以用无磷缓冲液更适合碱性磷酸酶反应体系。
优选地，所述冻干工作液还包括甘氨酸、菊糖、甘露醇、吐温-20、和Proclin 300。
具体的，甘氨酸可以减弱冻干过程中盐结晶引起的溶液pH值的剧烈变化，同时，结晶型甘氨酸能升高制品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的冻干品复溶速度减慢或蛋白质结构的破坏，有利于保护链霉亲和素的蛋白活性；菊糖对碱性磷酸酶的活性起保护作用；甘露醇作为赋形剂，无吸湿性，干燥快，能够防止冻干磁珠聚集；吐温-20有利于提高链霉亲和素与生物素、抗体与抗原的特异性识别，同时减少他们之间的非特异性结合；Proclin 300是一种高效抑菌剂，具有广泛的抑菌效果、极佳的相容性和稳定性、低毒性，同时，Proclin300抑菌剂不影响碱性磷酸酶的活性，也不影响反应体系中抗体与抗原的结合。
优选地，所述冻干工作液包括下述重量百分数的组分：1～2％甘氨酸、1～3％菊糖、1～3％甘露醇、0.05％吐温-20、1～3％酪蛋白钠，0.02％ProClin 300。
本发明还提供了一种SA-磁珠冻干品，所述SA-磁珠冻干品包括冻干剂，所述冻干剂由SA-磁珠分散于冻干工作液中，再经原位冻干而得，所述冻干工作液采用如上所述的冻干工作液。
优选地，所述冻干剂封装于微流控芯片中。
本发明还提供了一种SA-磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提供SA-磁珠；
2)提供冻干工作液；
3)将步骤1)中的SA-磁珠与步骤2)中的冻干工作液混匀；
4)将步骤3)中的混合液进行冻干；
5)完成后进行封装，得到SA-磁珠冻干品。
优选地，步骤4)中所述冻干包括：将步骤3)中的混合液通过点样仪点样到芯片上，再置于冷冻干燥仪中进行冷冻干燥。更优选的，所述点样是指将混合液分散为微升或纳升级液滴置于芯片上，由此，可以更有利于冻干试剂的复溶，磁珠活性及稳定性保持的更好，如果冻干试剂复溶或分散不充分，将增大检测结果的变异系数(CV值)，造成结果的精密度下降。
更优选地，所述冷冻干燥包括预冻、升华、解吸步骤；
预冻：降温到共晶点温度10-20℃以下，保持1小时；升温到共晶点温度附近，保持1小时；再降温到共晶点温度10-20℃以下，保持2小时；
升华：升温并维持在共晶点温度5℃以下，保持15小时，真空度控制在1～5Pa；
解吸：升温到常温，真空控制，保持6小时。
在预冻过程中，通过设置两次降温过程，有助于使样品整体瞬间结成极细小的晶体，由此，更利于后续的升华过程。同时，在升华过程后，样品内空隙小，冻干后复溶性能好。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)开发了一种冻干工作液，包括了酪蛋白钠和TBS缓冲液，以使冻干工作液更适于碱性磷酸酶反应体系的SA-磁珠冻干品；
2)SA-磁珠与冻干工作液的混合液以微液滴形式点样到芯片中，有利于冻干、复溶及活性保持；
3)SA-磁珠冻干品复溶后能够保持很好的结合生物素的活性，与生物素化抗体、抗原及碱性磷酸酶标记抗体发生夹心反应后，对酶催化底物的活性影响小，发光值高而稳定。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1冻干工作液的配制
分别配制以下冻干工作液：
冻干工作液A：
TBS缓冲液(10mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，1％甘氨酸，1％菊糖，1％甘露醇，1％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液B：
TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，1％甘氨酸，1％菊糖，2％甘露醇，2％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液C：
TBS缓冲液(30mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，1％甘氨酸，2％菊糖，1％甘露醇，3％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液D：
TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，1％甘氨酸，3％菊糖，2％甘露醇，1％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液E：
TBS缓冲液(40mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，1％菊糖，1％甘露醇，2％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液F：
TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，1％菊糖，2％甘露醇，1％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液G：
TBS缓冲液(50mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，2％菊糖，1％甘露醇，3％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液H：
TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，2％菊糖，3％甘露醇，2％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300
冻干工作液I：
PBS缓冲液(20mM PB，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，2％菊糖，2％甘露醇，1％酪蛋白钠，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
冻干工作液J：
TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9％NaCl，pH：7.4)，2％甘氨酸，2％菊糖，2％甘露醇，2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％吐温-20，0.02％ProClin 300。
实施例2SA-磁珠冻干品的制备
1)通过磁力架吸附SA-磁珠，将SA-磁珠分别与冻干工作液A，B，C，D，E，F，G，H，I，J混匀，磁珠含量调整为1％(1g/100mL)。
2)用自动点样仪将SA-磁珠点样到0.5cm×0.5cm玻璃芯片上，每点100nL，7×7方阵，共49个点。
3)SA-磁珠冻干品冷冻干燥
预冻：芯片在4℃进箱，进箱完毕后保持1小时，使所有样品从4℃的同一起点降温到-46℃，并在-46℃并保持1小时，把样品加热到共晶点温度并保持1小时，然后使样品再次降温，并在-46℃保持2小时。
升华：控制板层温度，使样品的温度维持在共晶点温度低5℃，并在此状况下维持15小时，直到样品中的冻结冰升华完毕为止；冻干箱的真空度控制在1～5Pa。
解吸：把样品温度加热到20℃并维持到冻干结束，在20℃和高真空的状况下保持6小时，进一步降低样品中残余水分。
4)SA-磁珠冻干后状态
采用合理的冻干工艺曲线，10种冻干工作液均能使SA-磁珠具有很好的冻干状态，冻干样品有良好的物理形态，外观无缺损，表面平整，体积与冻结时的体积基本相等，颜色均匀一致，内部疏松多孔，复水迅速而完全，残余水分含量合格。
实施例3SA-磁珠冻干品的复溶及活性检测
1)SA-磁珠冻干复溶后活性检测
用100μL超纯水分别将10种SA-磁珠冻干品复溶；
复溶后的10种SA-磁珠以及同批次未冻干SA-磁珠悬液中加2μL生物素化碱性磷酸酶(Biotin-AP)(5ng/μL)，37℃孵育10min。
加入200μL SA-磁珠清洗缓冲液，吸附洗涤三次，每次3min磁吸。
加200μL酶底物液，混匀后取170μL至酶标板，在酶标仪中37℃孵育5min，测发光信号值，结果如表1所示。
表1 SA-磁珠冻干前后结合生物素化碱性磷酸酶的活性分析
表1中结果表明：冻干工作液A-H中SA-磁珠冻干品复溶后较冻干前活性没有显著变化；冻干工作液I中SA-磁珠冻干品复溶后活性是冻干前对照SA-磁珠活性的80％，说明磷酸盐缓冲液对碱性磷酸酶发光体系有较大影响，冻干工作液J中SA-磁珠冻干复溶后活性是冻干前对照SA-磁珠活性的131％，但是变异系数(CV)由原来的2.01％变成了10.03％。说明BSA虽然能够提高发光强度，但是对结果精密度影响较大。如果为了提高发光强度，可以考虑在酶底物液中加入适当浓度的BSA。
2)SA-磁珠冻干复溶后稳定性检测
将SA-磁珠冻干品于2～8℃下密封放置一年，再进行复溶及活性检测，方法及步骤同上，结果如表2所示。
表2 SA-磁珠冻干品密封放置于2～8℃一年后结合生物素化碱性磷酸酶的活性分析
将SA-磁珠冻干品于室温密封放置半年，再进行复溶及活性检测，方法及步骤同上，结果如表3所示。
表3 SA-磁珠冻干品密封放置于室温半年后结合生物素化碱性磷酸酶的活性分析
表2、表3中结果表明：SA-磁珠冻干品密封放置于2～8℃一年或者冻干后密封放置于室温半年后，其活性基本保持不变，表明SA-磁珠通过本发明的冻干工作液及冻干方法冻干后稳定性良好。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种链霉亲和素偶联磁珠冻干品，其特征在于，所述链霉亲和素偶联磁珠冻干品包括冻干剂，所述冻干剂由链霉亲和素偶联磁珠分散于冻干工作液中，再经原位冻干而得，所述冻干工作液适用于碱性磷酸酶发光体系，所述冻干工作液由蛋白保护剂、缓冲液、甘氨酸、菊糖、甘露醇、吐温-20和Proclin 300组成，所述蛋白保护剂为酪蛋白钠，所述缓冲液为TBS 缓冲液，所述TBS缓冲液的组分为10-50mM Tris-HCl，0.9% NaCl，pH：7.4；所述冻干工作液的下述组分重量百分数如下：1～2%甘氨酸、1～3%菊糖、1～3%甘露醇、0.05%吐温-20、1～3%酪蛋白钠，0.02% ProClin 300。
2.根据权利要求1所述的链霉亲和素偶联磁珠冻干品，其特征在于，所述冻干剂封装于微流控芯片中。
3.一种链霉亲和素偶联磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提供链霉亲和素偶联磁珠；
(2)提供权利要求1所述的冻干工作液；
(3)将步骤(1)中的链霉亲和素偶联磁珠与步骤(2)中的冻干工作液混匀；
(4)将步骤(3)中的混合液进行原位冻干；
(5)原位冻干后进行封装，得到链霉亲和素偶联磁珠冻干品。
4.根据权利要求3所述的链霉亲和素偶联磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述原位冻干包括：将步骤(3)中的混合液通过点样仪以矩阵形式点样到芯片上，再置于冷冻干燥仪中进行冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的链霉亲和素偶联磁珠冻干品的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥包括预冻、升华、解吸步骤；
预冻：降温到共晶点温度以下，保持1 小时；升温到共晶点温度附近，保持1 小时；再降温到共晶点温度以下，保持2小时；所述共晶点温度为10-20℃；
升华：升温并维持在共晶点温度5℃以下，保持15小时，真空度控制在1～5Pa；
解吸：升温到常温，在高真空的状况下保持6 小时。
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