CN107502567B - 发光杆菌冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发光杆菌冻干粉及其制备方法，将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液；将冻干悬液冷冻至预冻温度以获得预冻制品，将所述预冻制品依次进行升华干燥、解析干燥，其中，在升华干燥中包括至少两次升温及维持温度过程，以使所述预冻制品由所述预冻温度逐步升温至第一温度，第一温度比所述预冻温度高48℃‑64℃。本发明还提供一种发光杆菌冻干粉，其由所述发光杆菌冻干粉制备方法制备而成。本发明克服了现有发光杆菌冻干粉稳定性较差的问题，改善了所述发光杆菌冻干粉的储存稳定性，延长了所述发光杆菌冻干粉的保存期。
Description
技术领域
本发明涉及水质监测领域，尤其涉及一种发光杆菌冻干粉及其制备方法。
背景技术
随着现阶段我国环境污染情况，水质问题得到广泛的关注。其中，现有采用发光菌毒性检测法对水质进行检测。发光菌毒性检测法具有检测操作简单、检测准确的特点。由于发光菌的相对发光度与水质综合的毒性相关，因此，通过检测敏感发光菌的变化即可实现对水质的监测。现有技术中一般采用发光菌的冻干粉用于水质监测。由于现有发光杆菌冻干粉工艺的限制，现有发光杆菌冻干粉稳定性较差，严重影响了发光菌水质监测检测的准确性及其推广应用。因此，亟待提供一种新的发光杆菌制备工艺。
发明内容
为克服现有发光杆菌冻干粉稳定性较差的问题，本发明提供一种发光杆菌冻干粉及其制备方法。
本发明为解决上述技术问题提供一技术方案：一种发光杆菌冻干粉制备方法，其包括以下步骤：将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液；将冻干悬液冷冻至预冻温度以获得预冻制品，将所述预冻制品依次进行升华干燥、解析干燥；
所述升华干燥所处环境压力为0.01～0.1MPa；
所述升华干燥包括7个升华阶段：
第一升华阶段，保持所述预冻温度8～12min；所述预冻温度比所述冻干悬液的共晶点温度低5℃-10℃；
第二升华阶段，在1h～1.5h内，将温度由所述预冻温度逐步升高温度8℃～12℃，获得第一升华温度；
第三升华阶段，维持第一升华温度2h～2.5h；
第四升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第一升华温度逐步升高温度15℃～23℃，获得第二升华温度；
第五升华阶段，维持第二升华温度2h～2.5h；
第六升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第二升华温度逐步升高至第一温度；第一温度比所述预冻温度高48℃-64℃；及
第七升华阶段，维持第一温度2h～2.5h；
所述解析干燥包括3个阶段：第一解析阶段，维持所述第一温度5～15min；
第二解析阶段，在1h～1.5h内将温度逐步由所述第一温度上升至所述第二温度，所述第二温度比所述第一温度高15℃～25℃；及
第三解析阶段，维持所述第二温度1h～1.5h，获得所需发光杆菌冻干粉；所述解析干燥所处环境压力为0-0.002Mpa；
其中，将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液包括：
浊度为190～220的菌液中加入所述保护添加剂，每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括蛋白质类7g～11g；糖类7g～9g；盐类2g～4g；所述冻干悬液的共晶点为-50℃～-35℃；其中，所述蛋白质类包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白中的一种或两种的组合。
优选地，所述糖类包括海藻糖、甘露醇、蔗糖或乳糖中的一种或几种的组合；所述盐类包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、碳酸钾、碳酸钠、碳酸钙或碳酸镁的一种或几种的组合。
本发明为解决上述技术问题提供又一技术方案：一种发光杆菌冻干粉，其采用如上所述发光杆菌冻干粉制备方法制备获得。
与现有技术相比，本发明所提供的发光杆菌冻干粉及其制备方法具有以下的优点：
本发明所提供的发光杆菌冻干粉制备方法中，先将冻干悬液进行预冻后，一次进行升华干燥及解析干燥，其中，升华干燥中至少包括两次升温及维持温度阶段，通过这样的限制，可保证发光杆菌在逐步由预冻温度升温至第一温度过程中逐渐干燥，所述第一温度与所述预冻温度之间的温差限定，可保证所述预冻制品可有足够的能量完成升华干燥。而不会出现由于温度差过大，而使所述预冻制品持续按过快软化或塌陷，也不会出现由于温差较小，而使所述预冻制品干燥无法有效的干燥的问题。本发明所提供的方法可使结晶水逐步升华变为水蒸气，提高所述发光杆菌在升华干燥过程中的稳定性，进一步提高所述发光杆菌保存的稳定性及活性的持久性。
所述发光杆菌冻干粉制备方法使用解析干燥，可进一步降低最终获得的冻干制品中水分含量，从而抑制微生物的生长繁殖和某些化学反应的发生，进一步改善所述发光杆菌冻干粉的储存稳定性，延长所述发光杆菌冻干粉的保存期。
本发明所提供的发光杆菌冻干粉具有疏松多孔状，无明显塌陷、膨胀、离壁的问题。所述发光杆菌冻干粉相对于现有的发光杆菌冻干粉具有更优的稳定性，可保存时长更长。
【附图说明】
图1是本发明第一实施例提供的发光杆菌冻干粉制备方法的流程示意图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施实例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明第一实施例中提供一种发光杆菌冻干粉制备方法S10，其包括如下的步骤：
步骤S101，制备冻干悬液；将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液；
步骤S102，制备获得预冻制品；将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，预冻温度比所述冻干悬液的共晶点温度低5-10℃；
步骤S103，对预冻制品进行升华干燥；将所述预冻制品逐步升温至第一温度以使其升华干燥；
步骤S104，对进行升华干燥后的制品解析干燥；将经所述步骤S103处理后的制品由第一温度逐步升温至第二温度以使水分进一步去除，以获得所需发光杆菌冻干粉。
在本发明一些较优的实施例中，在上述步骤S103及步骤S104中每升温至一个温度，均需要保持该温度一定时间，所述时间的长度可依据制品干燥状态决定。
具体地，在上述步骤S101中，浊度为190～220的菌液中加入所述保护添加剂，每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括蛋白质类5g～20g；糖类2g～10g；盐类1g～5g。更优地，所述保护添加剂包括蛋白质类7g～11g，糖类7g～9g；盐类2g～4g。
具体地，在本发明一些较优的实施例中，上述步骤S101具体可包括先将培养好的发光杆菌菌液离心，用重量百分比为2.5%的盐溶液重悬，再添加上述重量百分比的蛋白质类及糖类。
在本发明中，所述蛋白质类包括但不受限于：脱脂奶粉、牛血清白蛋白或氨基酸等中的一种或几种的组合。所述蛋白质类可在所述发光杆菌的外表面形成蛋白质膜，在所述发光杆菌冻干的过程中，可以保护菌体的细胞质膜和蛋白质功能的完整性，从而可对发光杆菌起到赋型剂的作用，以提高所述发光杆菌冻干过程的稳定性。
所述糖类包括单糖、二糖，所述糖类具体可为但不受限于：海藻糖、甘露醇、蔗糖或乳糖等中的一种或几种的组合。所述糖类的添加可为所述发光杆菌提供保护层，进一步提高所述发光杆菌在冻干过程中的稳定性。
所述盐类包括但不受限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、碳酸钾、碳酸钠、碳酸钙或碳酸镁等的一种或几种的组合。所述水优选为去离子水。
所述发光杆菌可为明亮发光杆菌。所述明亮发光杆菌来源于中国科学院南京土壤研究所。
在本发明一些较优的实施例中，上述步骤S102，所述预冻温度的设定由冻干悬液的共晶点决定，基于本发明上述的保护添加剂成分，所述冻干悬液的共晶点为-50℃～-35℃，所述预冻温度比所述冻干悬液的共晶点温度低5℃～10℃，则所述预冻温度可为-60℃～-40℃。更优地，所述预冻温度还可进一步比所述冻干悬液的共晶点温度低6℃～8℃。
更优地，在本发明中，所述发光杆菌冷冻干燥的过程在一冷冻离心机中进行。
在本发明中，对所述冻干悬液进行预冻的目的是使所述预冻悬液中的水分完全冻结，形成有利于升华的结晶，赋予发光杆菌冻干粉与干燥前相同的形态。所述预冻的环节是整个发光杆菌冻干流程的基础。优化的预冻工艺可以提高所述发光杆菌的冻干效率以及所述发光杆菌冻干粉的品质。
在本发明一些较优的实施例中，上述步骤S103中，将所述预冻制品逐步升温至第一温度，具体为采用对温度进行阶梯式的升温设计，针对每一阶段的升温操作，均分别对应不同的参数控制。
具体地，在本发明一些较优的实施方式中，将升华干燥分为多个细化阶段，具体以所述预冻温度及所述第一温度之间温度差的大小为准，所述第一温度比所述预冻温度高48℃-64℃，具体可为48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、55℃、57℃、60℃、63℃或64℃等温度。所述第一温度与所述预冻温度之间的温差限定，可保证所述预冻制品可有足够的能量完成升华干燥，温度差过大，会使所述预冻制品持续按过快软化或塌陷，而温差较小，则无法使所述预冻制品干燥有效的干燥。
在一些具体实施例中，所述升华干燥可包括至少5个细化阶段，具体包括：
第一升华阶段，保持所述预冻温度8～12min，将升华干燥所处的环境压力降至0.01～0.1MPa；
第二升华阶段，在1h～1.5h内，将温度由所述预冻温度逐步升高温度8℃～12℃，获得第一升华温度；
第三升华阶段，维持第一升华温度2h～2.5h；
第四升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述一升华温度逐步升高至第一温度；及
第五升华阶段，维持第一温度2h。
在一些优选实施例中，所述升华干燥还可进一步包括7个细化阶段，具体如下：
第一升华阶段，保持所述预冻温度8～12min，将升华干燥所处的环境压力降至0.01～0.1MPa；
第二升华阶段，在1h～1.5h内，将温度由所述预冻温度逐步升高温度8℃～12℃，获得第一升华温度；
第三升华阶段，维持第一升华温度2h～2.5h；
第四升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第一升华温度逐步升高温度15℃～23℃，获得第二升华温度；
第五升华阶段，维持第二升华温度2h～2.5h；
第六升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第二升华温度逐步升高至第一温度；及
第七升华阶段，维持第一温度2h～2.5h。
在上述第二升华阶段至所述第七升华阶段中，升华干燥所处的环境压力与在所述第一升华阶段中所处的环境压力一致。
优选地，在本发明中，所述第二升华阶段中，升温速率为0.089℃/min～0.192℃/min，更优地，所述升温速率可具体为0.089℃/min、0.1℃/min、0.111℃/min、0.133℃/min、0.15℃/min、0.167℃/min、0.187℃/min或0.192℃/min。
在本发明中，所述第四升华阶段中，升温速率为0.1℃/min～0.192℃/min，更优地，所述升温速率可具体为0.1℃/min、0.13℃/min、0.153℃/min、0.16℃/min、0.17℃/min或0.192℃/min。
在本发明中，所述第六升华阶段中，当所述第一温度比所述第二升华温度高25℃-29℃时，所述升温速率可为0.167℃/min～0.242℃/min，所述升温速率可进一步具体为0.167℃/min、0.17℃/min、0.2℃/min、0.208℃/min、0.21℃/min、0.226℃/min、0.23℃/min或0.242℃/min。
在本发明中，上述的升华干燥操作是通过升高温度，去除经过预冻处理的预冻制品进行升华的阶段。在所述的升华阶段过程中，是对预冻制品进行加热以使预冻制品中的水升华。如果在升华干燥过程中，如温度升温过快，会使预冻制品出现过快软化或塌陷等问题，严重的还会使预冻制品融化起泡，导致所述发光杆菌冻干失败。如温度升温过低则会给制冷系统提出过高的要求，且降低速率。
在上述第二升华阶段、第四升华阶段及第六升华阶段中，每个阶段均具有不同的升温温度，其升温温度的温度差依次为8℃～12℃、15℃～23℃、25℃-29℃，可见在升华干燥过程中，升温温度的温度差依次增大。在进行升华干燥的初期，升温的温度差较小，可避免所述预冻制品升温温度太大而出上述预冻制品的问题，而在升华干燥进行到中后期，则可以持续加大升温幅度，从而提供升华干燥的效率，缩短升华干燥所需的时间。
因此，在上述步骤中，将所述升华干燥细分为至少5个阶段，并在完成一次升温后，保持该温度一段时间，可进一步提高所述发光杆菌在升华干燥过程中的稳定性，以提高所述发光杆菌保存的稳定性及活性的持久性。
在本发明一些较优的实施例中，上述步骤S104中解析干燥是用于进一步去除经过上述步骤S103升华干燥后的制品中残留水分和晶体结合水，以进一步降低最终获得的冻干制品中水分含量，从而抑制微生物的生长繁殖和某些化学反应的发生，进一步改善获得所述发光杆菌冻干粉的储存稳定性，延长所述发光杆菌冻干粉的保存期。
在所述步骤S104中，所述解析干燥可细分为三个阶段，具体如下：
第一解析阶段，维持所述第一温度5～15min，将解析干燥所处环境压力进一步下降至0-0.002Mpa；
第二解析阶段，在1h～1.5h内将温度逐步由所述第一温度上升至所述第二温度；及
第三解析阶段，维持所述第二温度1h～1.5h，获得所需发光杆菌冻干粉。
在上述的第二解析阶段与第三解析阶段中，进行解析干燥所处环境压力为0-0.002MPa，接近于真空状态，具体可为0.001MPa、0.002MPa。
在上述具体的解析干燥过程中，由于经过升华干燥后的制品中水较难去除，因此，需要给予足够的能量才能使水从吸附状态中解析出来。因此，第二温度需比第一温度高，其中，所述第二温度的选择以不造成经升华干燥后的制品过热而变形为准。较优地，所述第二温度比所述第一温度高15～25℃，具体可为15℃、19℃、20℃、22℃或25℃。
可以理解，在本发明中，所述第二解析阶段中，升温速率为0.17℃/min-0.41℃/min，更优地，所述升温速率可具体为0.17℃/min、0.2℃/min、0.23℃/min、0.25℃/min、0.3℃/min、0.33℃/min、0.37℃/min或0.41℃/min。
本发明的第二实施例提供一种利用上述发光杆菌冻干粉制备方法制备获得的发光杆菌冻干粉，所述发光杆菌冻干粉为疏松多孔状的白色粉末。所述发光杆菌冻干粉使用真空封装袋封装。
为了更进一步地说明，提供如下的实验组及对比组：
实验组1-1
将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液；其中，浊度为200的菌液中加入所述保护添加剂，每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括2.5g氯化钠，3g甘露醇，5g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，预冻温度为-55℃；
将所述预冻制品逐步升温至第一温度以使其升华干燥，升华干燥包括如下7个细分阶段：
1）维持：-55℃，10min，压力降为0.05MPa；
2）升温：1小时由-55℃升温至-45℃，压力0.05MPa，升温速率为0.167℃/min;
3)维持：-45℃维持2小时，压力0.05MPa；
4）升温：2小时由-45℃升温至-25℃，压力0.05MPa，升温速率为0.167℃/min；
5）维持：-25℃维持2小时，压力0.05MPa；
6）升温：2小时由-25℃升温至0℃，压力0.05MPa；
7）维持：0℃维持2小时，压力0.05MPa。
经过升华干燥处理后的制品再进行解析干燥，解析干燥包括如下3个细分阶段：
1）维持0℃，10min，压力降为0.001 MPa；
2）升温：1小时0℃升温至20℃，压力0.001MPa，升温速率为0.33℃/min;
3)维持：20℃维持1小时，压力0.001MPa。
实验组1-2
实验组1-2与实验组1-1的区别在于：浊度为200的菌液中加入所述保护添加剂，每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：2.1g氯化钠，0.4g氯化镁，3g甘露醇，5g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
实验组1-3
实验组1-3与实验组1-1的区别在于：每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：1.9g氯化钠，0.4g氯化镁，0.2g硫酸钙，3g甘露醇，5g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
实验组1-4
实验组1-4与实验组1-1的区别在于：每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：2.5g氯化钠，3g蔗糖，5g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
实验组1-5
实验组1-5与实验组1-1的区别在于：每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：2.5g氯化钠，5g甘露醇，3g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
实验组1-6
实验组1-6与实验组1-1的区别在于：每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：2.5g氯化钠，8g海藻糖，8g脱脂奶粉，1g牛血清白蛋白。
实验组1-7
实验组1-7与实验组1-1的区别在于：每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括：2.5g氯化钠，3g甘露醇，5g海藻糖，4g脱脂奶粉，5g氨基酸。
对比组1-1
对比组1-1与实验组1-1的区别在于：所述保护添加剂包括：1.3g氯化钠，5g海藻糖，6.7g脱脂奶粉，精氨酸0.2g。
实验组2-1
实验组2-1与实验组1-1的区别在于：将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，预冻温度为-50℃；
实验组2-2
实验组2-2与实验组1-1的区别在于：将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，预冻温度为-45℃；
对比组2-1
对比组2-1与实验组1-1的区别在于：将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，将冻干悬液温度降至4℃、维持30min，再降温至-40℃，维持4-6h；
实验组3-1
实验组3-1与实验组1-1的区别在于：将所述预冻制品逐步升温至第一温度以使其升华干燥，升华干燥包括如下5个细分阶段：
1）维持：-55℃，10min，压力降为0.05 MPa；
2）升温：1小时由-55℃升温至-45℃，压力0.05MPa，升温速率为0.33℃/min;
3)维持：-40℃维持2小时，压力0.05MPa；
4）升温：2小时由-45℃升温至0℃，压力0.05MPa，升温速率为0.33℃/min；
5）维持：0℃维持2小时，压力0.05MPa。
实验组3-2
实验组3-2与实验组1-1的区别在于：升华干燥中2）阶段具体为：升温：1小时由-55℃升温至-43℃，压力0.05MPa，升温速率为0.2℃/min;
实验组3-3
实验组3-3与实验组1-1的区别在于：升华干燥中2）阶段具体为：升温：1小时由-55℃升温至-47℃，压力0.05MPa，升温速率为0.133℃/min;
实验组3-4
实验组3-4与实验组1-1的区别在于：升华干燥中3）阶段具体为：维持：-45℃维持2.3小时，压力0.05MPa；
实验组3-5
实验组3-5与实验组1-1的区别在于：升华干燥中4）阶段具体为：升温：2小时由-45℃升温至-20℃，压力0.05MPa，升温速率为0.208℃/min；
实验组3-6
实验组3-6与实验组1-1的区别在于：升华干燥中4）阶段具体为：升温：2小时由-45℃升温至-22℃，压力0.05MPa，升温速率为0.197℃/min；
实验组3-7
实验组3-7与实验组1-1的区别在于：升华干燥中5）阶段具体为：维持：-25℃维持2.5小时，压力0.05MPa；
实验组3-8
实验组3-8与实验组1-1的区别在于：升华干燥中6）阶段具体为：升温：2.5小时由-25℃升温至4℃，压力0.05MPa，升温速率为0.193℃/min；
实验组3-9
实验组3-9与实验组1-1的区别在于：升华干燥中7）阶段具体为：维持：0℃维持2.5小时，压力为0.05MPa。
对比组3-1
对比组3-1与实验组1-1的区别在于：预冻完成后，以0.3℃/min升温速率将产品温度升至-20℃，并维持20-30h，压力为0.026Mpa。
实验组4-1
实验组4-1与实验组1-1的区别在于：解析干燥中1）阶段具体为：1）维持0℃，30min，压力降为0.001MPa；
实验组4-2
实验组4-2与实验组1-1的区别在于：解析干燥中2）阶段具体为：升温：1小时由0℃升温至15℃，压力0.001MPa，升温速率为0.25℃/min。
实验组4-3
实验组4-3与实验组1-1的区别在于：解析干燥中2）阶段具体为：升温：1小时由0℃升温至22℃，压力0.001MPa，升温速率为0.367℃/min。
实验组4-4
实验组4-4与实验组1-1的区别在于：解析干燥中3）阶段具体为：维持：20℃维持1.2小时，压力0.001MPa。
实验组4-5
实验组4-5与实验组1-1的区别在于：解析干燥中3）阶段具体为：维持：20℃维持1.5小时，压力0.001MPa。
对比组4-1
对比组4-1与实验组1-1的区别在于：完成升华干燥后，以最快升温速率将产品温度升至20℃，并维持10-20h，至冻干制品无水分挥发后结束冻干过程。
为了更好地验证使用本发明所提供的发光杆菌冻干粉制备方法制备获得的发光杆菌冻干粉的形状、溶解性、发光性能检测、灵敏度检测及其修正系数。
其中，有关所述发光杆菌冻干粉的形状、溶解性如表1中所示。其中，复苏稀释液为2%氯化钠溶液。
表1，不同实验组及对比组的发光杆菌冻干粉的形状、溶解性参数列表
基于上述表1中的结果可知，除了对比组2-1，其他的实验组及对比组所制备获得冻干粉均为白色粉末状、且具有疏松多孔状的结构，所述发光杆菌冻干粉无明显塌陷、膨胀或者离壁现象。
而针对水合试剂复融性的问题，上述的实验组1-1、实验组2-1、实验组3-1及实验组4-1中所获得的发光杆菌冻干粉在加入复苏稀释液后，均可立即溶解，因此具有较优的溶解性能。
而在对比组1-1、对比组3-1及对比组4-1所获得发光杆菌冻干粉加入复苏稀释液后溶解性能也较佳。
针对对比组2-1中，在制备过程中，将冻干悬液进行预冻获得预冻制品，其中，将产品温度降至4℃、维持30min，再降温至-40℃，维持4-6h，这样的冷却方式，影响了最终获得的发光杆菌冻干粉的表面性能，因此，对比组2-1中的发光杆菌冻干粉无法立即溶解在复苏稀释液中。
更进一步地，用2%的氯化钠溶液复苏上述实验组及对比组制备获得的发光杆菌冻干粉，将复苏后的所述发光杆菌放入生物毒性监测仪，利用七水硫酸锌进行测试，连续测试14天，并取第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天及第14天中所述发光杆菌冻干粉发光性能检测、灵敏度检测及其修正系数，数据汇总如表2中所示。
表2，不同实验组及对比组的发光杆菌冻干粉的发光性能、灵敏度及其修正系数参数列表
其中，D1/D3/D5/D7/D9/D11/D13/D14分别表示第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天及第14天。
有关发光性能，所述发光杆菌冻干粉在性能测试第1天的初始发光值需大于等于10000RLU，由表2中可知，实验组1-1、实验组2-1、实验组3-1及实验组4-1中发光值均大于10000RLU，而对比组1-1、对比组2-1及对比组3-1中初始发光值也大于10000RLU，但对比组4-1中的初始发光值仅为18580RLU。
进一步地，如表2中所示，查看发光性能的资料中，当进行测试至第13天及第14天时，实验组1-1、实验组2-1、实验组3-1及实验组4-1中发光值均大于1000RLU，因此，可判定产品合格。而当测试进行至第13天及第14天时，对比组1-1、对比组2-1、对比组3-1及对比组4-1相较于其初始发光值变化较大，在对比组2-1、对比组3-1及对比组4-1中，测试获得的发光值小于1000PLU。因此，可知上述四个对比组获得的发光杆菌冻干粉的稳定性差于上述四个实验组。
有关发光杆菌的发光灵敏度，如表2中所示，当所述发光杆菌的发光灵敏度在20%-70%范围内，则发光杆菌冻干粉符合要求。由表2中可知，实验组1-1、实验组2-1、实验组3-1及实验组4-1中发光杆菌的发光灵敏度均在上述20%-70%范围内，而对比组1-1、对比组2-1、对比组3-1及对比组4-1在第13天、第14天的发光灵敏度为约10%，不在上述限定的范围内，可见，四个对比组获得的发光杆菌冻干粉的发光灵敏度的持久性差于上述四个实验组。
同样地，有关修正系数中，对比组1-1、对比组2-1、对比组3-1及对比组4-1中有不符合修正系数CF值范围为0.6-1.8的实验数据。综合上述内容，可知，四个对比组获得的发光杆菌冻干粉的稳定性差于上述四个实验组。
在本发明中，实验组1-1、实验组2-1、实验组3-1及实验组4-1中先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使结晶水升华为水蒸气，从而获得干燥制品。本发明中，所述发光杆菌冻干冷冻干燥过程中包括预冻、升华干燥、解析干燥三个阶段。其中，预冻是使发光杆菌快速冷冻到预定的温度，升华干燥是大量升华，去除溶剂的阶段，解析阶段是去除残留水分和晶体结合水的阶段。在本发明中所提供的发光杆菌冻干粉的制备方法不使所述发光杆菌中的蛋白质、微生物等发生变性或失去生物活力。
与现有技术相比，本发明所提供的发光杆菌冻干粉及其制备方法：
本发明所提供的发光杆菌冻干粉制备方法中，先将冻干悬液进行预冻后，一次进行升华干燥及解析干燥，其中，升华干燥中至少包括两次升温及维持温度阶段，通过这样的限制，可保证发光杆菌在逐步由所述预冻温度升温至第一温度过程中逐渐干燥，所述第一温度与所述预冻温度之间的温差限定，可保证所述预冻制品可有足够的能量完成升华干燥。温度差过大，会使所述预冻制品持续按过快软化或塌陷，而温差较小，则无法使所述预冻制品干燥有效的干燥。本发明所提供的方法可使结晶水逐步升华变为水蒸气，提高所述发光杆菌在升华干燥过程中的稳定性，进一步提高所述发光杆菌保存的稳定性及活性的持久性。
所述发光杆菌冻干粉制备方法使用解析干燥，可进一步降低最终获得的冻干制品中水分含量，从而抑制微生物的生长繁殖和某些化学反应的发生，进一步改善所述发光杆菌冻干粉的储存稳定性，延长所述发光杆菌冻干粉的保存期。
在本发明中，对所述冻干悬液进行预冻的目的是使所述预冻悬液中的水分完全冻结，形成有利于升华的结晶，赋予发光杆菌冻干粉与干燥前相同的形态。所述预冻的环节是整个发光杆菌冻干流程的基础。优化的预冻工艺可以提高所述发光杆菌的冻干效率以及所述发光杆菌冻干粉的品质。
在本发明中，上述的升华干燥操作是通过升高温度，去除经过预冻处理的预冻制品进行升华的阶段。在所述的升华阶段过程中，是对预冻制品进行加热以使预冻制品中的水升华。如果在升华干燥过程中，如温度升温过快，会使预冻制品出现过快软化或塌陷等问题，严重的还会使预冻制品融化起泡，导致所述发光杆菌冻干失败。如温度升温过低则会给制冷系统提出过高的要求。因此，在上述步骤中，将所述升华干燥细分为至少5个阶段，并在完成一次升温后，保持该温度一段时间，可进一步提高所述发光杆菌在升华干燥过程中的稳定性，进一步提高所述发光杆菌保存的稳定性及活性的持久性。
采用本发明上述的发光杆菌冻干粉制备方法，与现有技术相比，制备获得所需发光杆菌冻干粉的时间更短，因此，可提高发光杆菌冻干粉的效率。更进一步地，通过设置至少两次的升温及维持温度的过程，可将冷冻干燥的过程分为多个阶段，从而可使所述发光杆菌逐步的冻干。多个阶段中每段的时间最短为1小时，最长为2.5小时，由于将所述冷冻干燥的过程中分为预冻、升华干燥、解析干燥多个阶段，因此，可使所述发光杆菌冻干过程的可控性更强，以利于对所述发光杆菌的随时监控，更进一步保证所制备获得的发光杆菌冻干粉的质量。
本发明所提供的发光杆菌冻干粉制备方法中，所使用的保护添加剂中，采用蛋白质粉、盐类及糖类的组合，可以有效地对需要进行冻干处理的发光杆菌提供保护，此外，所述蛋白质粉、盐类及糖类的组分的不同，也会影响所述冻干悬液的共晶点温度，因此，所述保护添加剂中组分的选择及其配比会影响最终制备获得的发光杆菌冻干粉的性能及其稳定性。
本发明所提供的发光杆菌冻干粉具有疏松多孔状，无明显塌陷、膨胀、离壁的问题。所述发光杆菌冻干粉相对于现有的发光杆菌冻干粉具有更优的稳定性，可保存时长更长。
以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等均应包含本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种发光杆菌冻干粉制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液；将冻干悬液冷冻至预冻温度以获得预冻制品，将所述预冻制品依次进行升华干燥、解析干燥；
所述升华干燥所处环境压力为0.01～0.1MPa；
所述升华干燥包括7个升华阶段：
第一升华阶段，保持所述预冻温度8～12min；所述预冻温度比所述冻干悬液的共晶点温度低5℃-10℃；
第二升华阶段，在1h～1.5h内，将温度由所述预冻温度逐步升高温度8℃～12℃，获得第一升华温度；
第三升华阶段，维持第一升华温度2h～2.5h；
第四升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第一升华温度逐步升高温度15℃～23℃，获得第二升华温度；
第五升华阶段，维持第二升华温度2h～2.5h；
第六升华阶段，在2h～2.5h内，将温度由所述第二升华温度逐步升高至第一温度；第一温度比所述预冻温度高48℃-64℃；及
第七升华阶段，维持第一温度2h～2.5h；
所述解析干燥包括3个阶段：第一解析阶段，维持所述第一温度5～15min；
第二解析阶段，在1h～1.5h内将温度逐步由所述第一温度上升至所述第二温度，所述第二温度比所述第一温度高15℃～25℃；及
第三解析阶段，维持所述第二温度1h～1.5h，获得所需发光杆菌冻干粉；所述解析干燥所处环境压力为0-0.002Mpa；
其中，将所需制备的发光杆菌与保护添加剂混合形成冻干悬液包括：
浊度为190～220的菌液中加入所述保护添加剂，每100ml菌液中加入的所述保护添加剂包括蛋白质类7g～11g；糖类7g～9g；盐类2g～4g；所述冻干悬液的共晶点为-50℃～-35℃；其中，所述蛋白质类包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白中的一种或两种的组合。
2.如权利要求1中所述发光杆菌冻干粉制备方法，其特征在于：所述糖类包括海藻糖、甘露醇、蔗糖或乳糖中的一种或几种的组合；所述盐类包括氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、碳酸钾、碳酸钠、碳酸钙或碳酸镁的一种或几种的组合。
3.一种发光杆菌冻干粉，其特征在于：其采用如权利要求1-2中任一项所述发光杆菌冻干粉制备方法制备获得。
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