CN114250212A

CN114250212A - 一种透明质酸酶冻干制剂及其制备方法

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Publication number: CN114250212A
Application number: CN202111525137.5A
Authority: CN
Inventors: 乔莉苹; 周宁; 郭学平
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明提供一种透明质酸酶冻干制剂，所述冻干制剂包括透明质酸酶和透明质酸盐。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：本配方创新性的采用透明质酸盐作为透明质酸酶的酶活保护剂及分散剂，在生产低分子及寡聚透明质酸的过程中，不会引入额外的杂质。在不存在表面活性剂、缓冲剂的情况下，该透明质酸酶冻干制剂可实现高的酶活回收率，高酶活稳定性。透明质酸酶冻干制剂的制备方法适应面广，无论是发酵液上清或是经过不同方法纯化的酶液均可以采用该方法进行冷冻干燥。

Description

一种透明质酸酶冻干制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种透明质酸酶冻干粉制剂及其制备方法。

背景技术

透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸的酶类的总称。

透明质酸酶是一类能够降解透明质酸的酶的总称。早在1928年Duran-Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。1940年Meyer将这种“扩散因子”命名为Hyaluronidase。此后，人们在许多组织及生物体内检测到了透明质酸酶，包括细菌病毒、细菌、真菌等，非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物的毒液中也产生透明质酸酶。脊椎动物中，在蛇、蜥蜴的毒液中，睾丸及其他器官如肝脏、肾脏、淋巴系统及皮肤中均发现透明质酸酶的存在。

透明质酸酶制剂，常常使用复杂的酶活保护剂、稳定剂、缓冲剂来保持其酶活的稳定性。专利CN201610081945.X一种重组人透明质酸酶冻干制剂及其制备方法和应用提供了一种重组人透明质酸酶冻干制剂，包含组分：1400000～500000000IU重组人透明质酸酶、5～10g缓冲剂、60～180g冷冻保护剂、180～300g赋形剂、5～12g酶活保护剂和0.3～5g表面活性剂。专利CN201380057659.4用于透明质酸酶的稳定剂和包括透明质酸酶的冻干粉制剂，所述稳定剂含有：缓冲剂，以提供pH 4.0至6.0；0.001至0.5v/v％的非离子表面活性剂；和0.1至5mM的螯合剂或MgCl₂。

这些稳定剂、保护剂、表面活性剂成分种类多，体系复杂，均会对透明质酸酶的应用产生一定的影响和干扰，用于生产低分子及寡聚透明质酸盐时容易引入杂质，最后干扰低分子及寡聚透明质酸盐成品的品质。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种透明质酸酶冻干制剂及其制备方法。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂包括透明质酸酶和透明质酸盐。

2、根据项1所述的冻干制剂，其特征在于，以所述冻干制剂的质量为基准，所述冻干制剂中所述透明质酸酶的含量为1×10⁶～1×10⁸IU/g，所述透明质酸盐的质量含量为50％～99％。

3、根据项1所述的冻干制剂，其特征在于，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种以上。

4、根据项1所述的冻干制剂，其特征在于，所述透明质酸盐的分子量为400Da～100kDa。

5、根据项1所述的冻干制剂，其特征在于，所述透明质酸酶为芽孢杆菌(Bacillussp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶。

6、一种透明质酸酶冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

配制含有透明质酸酶和透明质酸盐的料液；

将所述料液冷冻干燥，得到透明质酸酶冻干制剂。

7、根据项6所述的制备方法，其特征在于，以所述料液的体积为基准，所述料液中所述透明质酸酶的含量为1×10⁷～1×10⁹IU/L，所述透明质酸盐的含量为0.1～10g/L。

8、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种以上。

9、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸盐的分子量为400Da～100kDa。

10、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶为芽孢杆菌(Bacillussp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶。

11、根据项10所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶选自发酵液上清、盐析复溶酶液、超滤酶液、离子交换洗脱酶液中的一种或两种以上。

12、根据项6所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程为：

在-18℃～-20℃环境下预冻10～24h；

在-35℃～-40℃环境下预冻24～48h；

在-15℃～-40℃，10～20mbar环境下干燥48～72h。

13、一种透明质酸酶冻干制剂，其由项6-12任一项所述的制备方法制得。

14、透明质酸酶冻干制剂在生产低分子或寡聚透明质酸盐中的应用，其特征在于，所述透明质酸酶冻干制剂为项1-5任一项所述的冻干制剂或项13所述的冻干制剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本配方创新性的采用透明质酸盐作为透明质酸酶的酶活保护剂及分散剂，在生产低分子及寡聚透明质酸的过程中，不会引入额外的杂质。

在不存在表面活性剂、缓冲剂的情况下，该透明质酸酶冻干粉制剂可实现高的酶活回收率和酶活稳定性。

透明质酸酶冻干制剂的制备方法适应面广，无论是发酵液上清或是经过不同方法纯化的酶液均可以采用该方法进行冷冻干燥。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

酶纯化结束后，为了更方便后期的使用，及最大限度的保存酶活，一般将酶制备成干粉。其中干粉的制备一般采用冷冻干燥技术，因此酶通常以冻干制剂的形式存在。透明质酸酶冻干制剂常使用复杂的酶活保护剂、稳定剂、缓冲剂来保持其酶活的稳定性。目前使用的稳定剂、保护剂、表面活性剂成分种类多，体系复杂，均会对透明质酸酶的应用产生一定的影响和干扰，用于生产透明质酸盐时容易引入杂质，最后影响低分子及寡聚透明质酸盐的品质。

本发明提供一种透明质酸酶冻干制剂，所述冻干制剂包括透明质酸酶和透明质酸盐。其中透明质酸盐一方面作为透明质酸酶的酶活保护剂和分散剂，可以使透明质酸酶保持较高的酶活，另一方面在透明质酸酶用作透明质酸盐的生产时，透明质酸盐本身作为产物成分，不会引入额外的杂质。

在一个具体的实施方式中，以所述冻干制剂的质量为基准，所述冻干制剂中所述透明质酸酶的含量为1×10⁶～1×10⁸IU/g，例如可以为10⁶IU/g、2×10⁶IU/g、5×10⁶IU/g、8×10⁶IU/g、10⁷IU/g、2×10⁷IU/g、5×10⁷IU/g、8×10⁷IU/g、10⁸IU/g，即每g冻干制剂中所述透明质酸酶的含量为1×10⁶～1×10⁸IU，所述透明质酸盐的含量为0.5～0.99g。其中IU是用来表示酶活力大小的单位。

所述透明质酸盐可以是任何透明质酸盐，在一个具体的实施方式中，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种以上。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸盐的分子量为400Da～100k Da，例如可以为400Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10kDa、50kDa、100kDa。

本发明所述的透明质酸酶可以是任何来源的透明质酸酶，优选为芽孢杆菌产透明质酸酶，更优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶。具体的，芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶的方法可以参考CN201210497017.3(名称为一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途)。

本发明还提供一种透明质酸酶冻干制剂，所述冻干制剂主要由透明质酸酶和透明质酸盐构成，其中，以所述冻干制剂的质量为基准，所述透明质酸酶的含量为1×10⁶～1×10⁸IU/g，所述透明质酸盐的质量含量为50％～99％。冻干制剂中除了透明质酸酶和透明质酸盐，还会含有少量的水分或由透明质酸酶的发酵产品所携带的杂质，但是不含除透明质酸盐以外的稳定剂和分散剂，例如常见的作为酶冻干制剂稳定剂和分散剂的海藻糖、甘露醇等。

在一个具体的实施方式中，制备透明质酸酶的原料为发酵液上清，此时冻干透明质酸酶冻干制剂中除了包含透明质酸酶和透明质酸盐，还会含有一些透明质酸酶的发酵产物，杂蛋白，有机酸等。

在一个具体的实施方式中，制备透明质酸酶的原料为盐析复溶酶液，此时冻干透明质酸酶冻干制剂中除了包含透明质酸酶和透明质酸盐，还具有杂蛋白等。

在一个具体的实施方式中，制备透明质酸酶的原料为超滤酶液，此时冻干透明质酸酶冻干制剂中除了包含透明质酸酶和透明质酸盐，还具有杂蛋白等。

在一个具体的实施方式中，制备透明质酸酶的原料为离子交换洗脱酶液，此时冻干透明质酸酶冻干制剂中除了包含透明质酸酶和透明质酸盐，还具有杂蛋白等。

本发明还提供一种透明质酸酶冻干制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

配制含有透明质酸酶和透明质酸盐的料液；

将所述料液冷冻干燥，得到透明质酸酶冻干制剂。

在一个具体的实施方式中，以所述料液的体积为基准，所述料液中所述透明质酸酶的含量为10⁷～10⁹IU/L，例如可以为10⁷IU/L、2×10⁷IU/L、5×10⁷IU/L、8×10⁷IU/L、10⁸IU/L、2×10⁸IU/L、5×10⁸IU/L、8×10⁸IU/L、10⁹IU/L。所述透明质酸盐的含量为0.1～10g/L，例如可以为0.1g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L。

在一个具体的实施方式中，所述透明质酸盐的分子量为400Da～100kDa，例如可以为400Da、1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10kDa、50kDa、100kDa。

本发明所述的透明质酸酶可以是任何来源的透明质酸酶，优选为芽孢杆菌产透明质酸酶，更优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶。

其中，在配制料液时，透明质酸酶的形式不受限定，例如可以为发酵液上清、盐析复溶酶液、超滤酶液、离子交换洗脱酶液等。其中，发酵液上清是透明质酸酶发酵后得到的上清液，盐析复溶酶液是指将发酵上清液采用硫酸铵盐析—离心获得沉淀-沉淀复溶液体得到的酶液，超滤酶液是指将发酵上清液采用超滤法纯化获得的酶液，离子交换酶液为超滤酶液经阴离子交换树脂纯化获得的酶液。具体的，制备过程为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶的可以参考CN201210497017.3(名称为一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途)。因此，该透明质酸酶冻干制剂的制备方法的适用范围非常广泛，无论是发酵液上清或是经过不同步骤纯化的酶液均可以采用此配方进行冷冻干燥。

冷冻干燥又称升华干燥。将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。物料可先在冷冻装置内冷冻，再进行干燥。也可直接在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。升华过程中所需的汽化热量，一般用热辐射供给。冷冻干燥最主要的优点是干燥后的物料可以保持原来的化学组成和物理性质(如多孔结构、胶体性质等)，因此适合用于酶制剂的制备。

具体的，将含有透明质酸酶和透明质酸盐的料液配制完成后，分装于合适的包装器材中，优选为200～500ml的玻璃广口瓶中。对所述料液进行冷冻干燥时，所述的冷冻干燥工艺可根据容器特征、装量及冻干设备制定。例如对于500ml玻璃广口瓶装量200ml料液，所对应的冷冻干燥工艺的冷冻干燥过程为：

在-18℃～-20℃环境下预冻10～24h；

在-35℃～-40℃环境下预冻24～48h；

在-15℃～-40℃，10～20mbar环境下干燥48～72h；

本发明还提供由上述制备方法制备得到的透明质酸酶冻干制剂。

本发明还提供上述透明质酸酶冻干制剂在生产低分子或寡聚透明质酸盐中的应用。其中，优选的，所述透明质酸酶冻干制剂中所含的透明质酸盐与所生产的透明质酸盐种类相同。例如，如果是生产透明质酸钠，则使用透明质酸钠作为稳定剂，这样能尽可能的减少杂质。

本发明的透明质酸酶冻干制剂以透明质酸盐作为透明质酸酶的酶活保护剂及分散剂，在生产低分子及寡聚透明质酸的过程中，不会引入额外的杂质。而且，冻干制剂的酶活回收率在90％以上，24个月后冻干制剂的酶活百分比高于92％，具有非常优异的储存稳定性。

实施例

(1)制备含有透明质酸酶的发酵液上清

参照CN201210497017.3(一种芽孢杆菌、一种透明质酸酶及其制备方法和用途)中描述的方法进行透明质酸酶发酵，离心后获得发酵液上清。其中，测定含有透明质酸酶的发酵液上清的酶比活为1.4×10⁴IU/mg～3.0×10⁴IU/mg。

其中，含有透明质酸酶的发酵产品的酶活测定方法参照2020版《中国药典》第四部1207《玻璃酸酶测定法》执行，蛋白质的测定方法采用考马斯亮蓝法。

其中，透明质酸酶比活(IU/mg)＝透明质酸酶酶活/蛋白含量。

(2)制备含有透明质酸酶的超滤酶液

发酵液上清液采用30KDa～50KDa的超滤膜超滤得到超滤酶液。其中，测定含有透明质酸酶的超滤酶液的酶比活为1×10⁵IU/mg～4×10⁵IU/mg。

(3)制备含有透明质酸酶的盐析复溶酶液

发酵液上清，25％-35％硫酸铵分级沉淀离心后，采用等体积纯化水重溶得到盐析复溶酶液。其中，测定含有透明质酸酶的盐析复溶酶液的酶比活为2×10⁵IU/mg～6×10⁵IU/mg。

(4)制备含有透明质酸酶的离子交换酶液

超滤酶液或者盐析复溶酶液经过DEAE-FAST FLOW离子树脂吸附，0-1M NaCl梯度洗脱得到离子交换洗脱液，并经过透析除盐获得。其中，测定含有透明质酸酶的离子交换酶液的酶比活为2×10⁵IU/mg～1×10⁶IU/mg。

实施例1

将发酵液上清与透明质酸钠(分子量为8000Da)配制含有透明质酸酶的料液，使用纯化水定容至1L。其中，1L料液中的透明质酸酶含量为1.4×10⁷IU，透明质酸钠的含量为5g。将配制的料液分装于500ml玻璃瓶中，装液量为200ml/瓶。将玻璃瓶置于冷冻干燥机，设置如下冷冻程序：-18℃～-20℃环境下预冻24h，在-35℃～-40℃环境下预冻48h，在-15℃～-40℃，10～20mbar环境下干燥48h，得到透明质酸酶冻干制剂。

测定冻干后透明质酸酶冻干制剂的酶活。

将所得到的透明质酸酶冻干制剂在25℃放置24个月后，测定其酶活。

其中，具体的酶活测定方法按照2020版《中国药典》第4部1207(玻璃酸酶测定法)中描述的方法进行。

实施例2

实施例2与实施例1的不同在于透明质酸酶冻干制剂的制备，使用盐析复溶酶液代替透明质酸酶发酵液上清，其它反应条件与实施例1相同。其中，将实施例1步骤(1)中的发酵液上清，25％-35％硫酸铵分级沉淀离心后，采用等体积纯化水重溶得到盐析复溶酶液。

实施例3

实施例3与实施例1的不同在于透明质酸酶冻干制剂的制备，使用超滤酶液代替透明质酸酶发酵液上清，其它反应条件与实施例1相同。其中，将实施例1中的发酵液上清液采用30KDa～50KDa的超滤膜超滤得到超滤酶液。

实施例4

实施例4与实施例1的不同在于透明质酸酶冻干制剂的制备，使用离子交换洗脱液代替透明质酸酶发酵液上清，其它反应条件与实施例1相同。其中，将实施例3中的超滤酶液经过DEAE-FAST FLOW离子树脂吸附，0-1M NaCl梯度洗脱得到离子交换洗脱液，并经过透析除盐获得。

实施例5-6

实施例5-6与实施例4的不同在于，含有透明质酸酶的料液中透明质酸酶的含量不同。其它反应条件与实施例4相同。具体的，实施例5中透明质酸酶的含量为1.4×10⁸IU/L，实施例6中透明质酸酶的含量为1×10⁹IU/L。

实施例7-9

实施例7-9与实施例1的不同在于，含有透明质酸酶的料液中透明质酸盐的种类不同，含量以及分子量与实施例1相同。其它反应条件与实施例1相同。具体的，实施例7中的透明质酸盐为透明质酸钾，实施例8中的透明质酸盐为透明质酸钙，实施例9中的透明质酸盐为透明质酸镁。

实施例10-12

实施例10-12与实施例1的不同在于，含有透明质酸酶的料液中透明质酸盐的含量不同，透明质酸盐的种类以及分子量与实施例1相同。其它反应条件与实施例1相同。具体的，实施例10中的透明质酸盐的含量为1g/L，实施例11中的透明质酸盐的含量为10g/L，实施例12中的透明质酸盐的含量为0.1g/L。

实施例13-14

实施例13-14与实施例1的不同在于，透明质酸盐的分子量不同，具体的，实施例13为400Da，实施例14为100kDa。

对比例1

对比例1与实施例1的不同在于，配制含透明质酸酶的料液时不使用透明质酸盐，而是使用牛血清白蛋白5g/L，其他的反应条件与实施例1相同。

对比例2

对比例2与实施例1的不同在于，配制含透明质酸酶的料液时不使用透明质酸盐，而是使用5g/L蔗糖，其他的反应条件与实施例1相同。

对比例3

对比例3与实施例1的不同在于，配制含透明质酸酶的料液时不使用透明质酸盐，而是使用5g/L麦芽糖，其他的反应条件与实施例1相同。

对比例4

对比例4与实施例1的不同在于，配制含透明质酸酶的料液时不使用透明质酸盐，而是使用5g/L海藻糖，其他的反应条件与实施例1相同。

具体的各实施例和对比例的主要反应条件，以及得到的冻干制剂中透明质酸酶含量、透明质酸盐如表1所示。

表1各实施例和对比例的反应条件

针对上述实施例和对比例得到的透明质酸酶的冻干制剂的酶活测定结果如表2所示。

表2透明质酸酶冻干制剂的酶活

其中，冻干制剂的酶活，是指冷冻干燥结束时得到的最初透明质酸酶冻干制剂中透明质酸酶的活性与冻干制剂质量的比值。冻干制剂的冻干酶活回收率用来表征冷冻对透明质酸酶酶活的影响，是指冷冻干燥结束时得到的最初的透明质酸酶冻干制剂中透明质酸酶的活性与冷冻前透明质酸酶活性的比值。24个月后，冻干制剂的酶活百分比用来表征透明质酸酶冻干制剂的储存稳定性，指当将透明质酸酶冻干制剂25℃条件下储存时，24个月后的透明质酸酶活性与冷冻结束时得到的最初透明质酸酶活性的比值。

Claims

1.一种透明质酸酶冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂包括透明质酸酶和透明质酸盐。

2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，以所述冻干制剂的质量为基准，所述冻干制剂中所述透明质酸酶的含量为1×10⁶～1×10⁸IU/g，所述透明质酸盐的质量含量为50％～99％。

3.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种以上，优选所述透明质酸盐的分子量为400Da～100kDa，进一步优选所述透明质酸酶为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCCNO.5744产透明质酸酶。

4.一种透明质酸酶冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

配制含有透明质酸酶和透明质酸盐的料液；

将所述料液冷冻干燥，得到透明质酸酶冻干制剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以所述料液的体积为基准，所述料液中所述透明质酸酶的含量为1×10⁷～1×10⁹IU/L，所述透明质酸盐的含量为0.1～10g/L。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁中的一种或两种以上，优选所述透明质酸盐的分子量为400Da～100kDa。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸酶为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744产透明质酸酶，优选所述透明质酸酶选自发酵液上清、盐析复溶酶液、超滤酶液、离子交换洗脱酶液中的一种或两种以上。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥过程为：

在-18℃～-20℃环境下预冻10～24h；

在-35℃～-40℃环境下预冻24～48h；

在-15℃～-40℃，10～20mbar环境下干燥48～72h。

9.一种透明质酸酶冻干制剂，其由权利要求4-8任一项所述的制备方法制得。

10.透明质酸酶冻干制剂在生产低分子或寡聚透明质酸盐中的应用，其特征在于，所述透明质酸酶冻干制剂为权利要求1-3任一项所述的冻干制剂或权利要求9所述的冻干制剂。