CN103468572A - 一种发光菌的冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发光菌的冻干保护剂，该冻干保护剂是由如下重量份数的主要原料制备得到：半乳糖42～55份，海藻糖19～26份，脱脂乳98～105份。上述冻干保护剂能用于发光菌冻干粉的制备，其用于制备发光菌的冻干粉时与菌液的最佳体积比为1:7～13之间。该冻干保护剂能提高发光菌冻干粉中每克的含菌量，并能保证发光菌冻干粉中的含菌量稳定性和提高发光菌复苏特性。

Description

一种发光菌的冻干保护剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种发光菌的冻干保护剂的制备及在发光菌冻干粉制备上的应用。

背景技术

发光细菌是进行生物发光的一类细菌。其多数为海生，与发光浮游生物同是引起海面发光的原因。发光菌形态虽多种多样，但生理特性却非常相似。一般对明胶不产生液化，分解蛋白质后不形成毒物，常寄生在各种动物体上引起“发光病”，即寄生发光。目前，国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌。

其中，明亮发光杆菌是革兰氏阴性菌,可在水质急性毒性的测定中所使用。费氏弧菌是一种生长在海洋中的革兰氏阴性菌，普遍存在于海洋环境及海洋生物体中，是某些海洋鱼类的致病菌。研究人员发现当菌群密度达到一定阈值时费氏弧菌会产生集体发光现象；后来的研究表明此生物发光现象是因为其自诱导剂的积累引起的；费氏弧菌通过该自诱导剂进行相互交流，启动相关基因的表达，从而引起其表型的变化。任何对细胞代谢机制的抑制作用，如各种无机毒物与有机毒物，都会导致其发光的减少，所以费氏弧菌目前被普遍作为环境测试指标。青海弧菌能持续稳定地发射蓝绿光（最大发射波长485nm），一旦遭遇有毒有害物质，很快会被抑制发光，其发光抑制程度与所受的有毒有害物质的毒性及浓度有对应关系，且它是一种淡水菌，所以被广泛应用于饮用水监测中。

国际上20世纪八十年代初，开始使用发光菌检测环境水质污染状况。我国于1995年开始推荐使用海洋发光菌，作为环境水质污染监测的生物学方法之一。上述发光菌常以菌液、菌膜或冻干粉的形式在环境监测中出现；而冻干粉因保质期长、便于运输、使用方便，是最常用的保存手段。目前，关于发光细菌冻干粉复合保护剂的研究不多，现在常用的保护剂保护率较低，导致干粉中活菌数较小和复苏速度缓慢，且发光强度不稳定，不利于发光菌冻干粉在监测中的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种能有效提高发光菌冻干粉的含菌量的冻干保护剂。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的发光菌的冻干保护剂，其包括如下重量份数的主要原料：半乳糖42～55份，海藻糖19～26份，脱脂乳98～105份。

优选，其包括如下重量份数的主要原料：乳糖50份，海藻糖25份，脱脂乳104份。

本发明的另一个目的是上述冻干保护剂在制备发光菌冻干粉中的应用。

上述应用，包括以下步骤：

1）制成每升中含有半乳糖42～55g、海藻糖19～26g、脱脂乳98～105g的冻干保护剂；

2）按冻干保护剂体积：菌液体积为1：7～13将冻干保护剂添加到菌液中，冲悬均匀后分装；

3）将分装好的菌液放入冻干机中，冻干10h。

优选为，上述应用包括以下步骤：

1）制成每升中含有半乳糖42～55g、海藻糖19～26g、脱脂乳98～105g的冻干保护剂；

2）按冻干保护剂体积：菌液体积为1：8将冻干保护剂添加到菌液中，冲悬均匀后分装；

3）将分装好的菌液放入冻干机中，冻干10h。

上述应用还包括以下步骤：

1）将发光菌的冻干粉用3%NaCl溶液进行溶解，复苏10min，接种到液体培养基中，25℃，180rpm培养18h；

2）取复苏好的菌液，接种到液体培养基中，25℃，180rpm培养18h；

本发明提供的发光菌冻干粉的保护剂，有效提高了发光菌冻干粉的含菌量，使其可以达到1×10⁹CFU/g，且通过本发明的冻干保护剂制备的发光菌的冻干粉复苏速度快、发光强度稳定。有利于发光菌冻干粉的生产研究以及在环境监测中的应用，有效提高了发光菌冻干粉的经济效益。

附图说明

图1是发光菌的冻干粉复苏时间与发光强度结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1发光菌冻干粉中含菌量的对比试验

制备不同配比的发光菌保护剂，用于对比试验，各实验组的具体成分见表1：

表1：发光菌保护剂的成分

组别	半乳糖（g）	海藻糖（g）	脱脂乳（g）
				实验组1	4.0	1.9	9.5
实验组2	4.2	1.9	9.8
				实验组3	4.4	2.2	10.0
实验组4	4.6	2.2	10.0
				实验组5	4.6	2.3	10.2
实验组6	5.0	2.5	10.2
				实验组7	5.0	2.5	10.4
实验组8	5.1	2.7	10.5
				实验组9	5.5	2.8	10.8

将上述各实验组中的组分，分别溶于100ml水中，制成8种不同的保护剂。且以脱脂乳15g，甘油5mL，海藻糖12.5g溶于100mL水中，制成保护剂作为对照组。该对照组的成分是目前使用的发光菌冻干保护剂成分。

将不同配比的发光菌冷冻保护剂用于发光菌冻干粉制备试验，具体操作如下：

1）发光菌的复苏与增菌

将费氏弧菌的冻干粉用3%NaCl溶液进行溶解，复苏10min，接种到装于500mL锥形瓶中的优化液体培养基中，25℃，180rpm培养18h。取复苏增菌好的菌液，接种到装于500mL锥形瓶中的优化液体培养基中，接种量为2%，25℃，180rpm培养18h。

2）发光菌的离心浓缩

取培养好的菌液10mL，10000rpm离心分离20min，倒掉上清。

3）两种保护剂冲悬及冻干

分别用1.25mL的上述各个实验组以及对照组的冻干保护剂冲悬均匀后，放入冻干机冻干10h。将做好的冻干粉用3%NaCl溶液进行溶解，复苏10min，然后用3%NaCl溶液进行梯度稀释，做菌落计数。

用上述不同配比的冻干保护剂分别用于制备明亮发光杆菌和青海弧菌的冻干粉中，具体操作参照费氏弧菌的冻干粉的制备，三种菌的冻干粉的含菌量结果如表2所示：

表2：不同配比的保护剂制备的发光菌的含菌量

从结果可以看出，使用本发明的冻干保护剂制备的费氏弧菌、明亮发光杆菌和青海弧菌的冻干粉（实验组3～9组）的含菌量都要远远高于对照组的冻干剂，最佳配比的一组（实验组7）的保护剂使冻干粉含菌量约为对照组的5倍。

实施例2保护剂最佳添加量的确定

将上述实验组6和实验组7配比的保护剂，在用于发光菌冻干粉的制备时，分别按冻干保护剂体积：菌液体积为1:7，1:8，1：10，1:11，1:13，1:14添加到费氏弧菌菌液中，具体操作步骤参见实施例1，结果如表3所示：

表3：添加不同量的保护剂后冻干粉中的含菌量

从结果可以看出，实验组6和实验组7均是按冻干保护剂体积：菌液体积为1:8添加冻干保护剂时，冻干粉中含菌量显著高于按其他比例添加冻干剂。

实施例3保护剂最佳复苏时间的确定

依据实施例1、2，选取最佳配比复合保护剂，采用冻干保护剂体积：菌液体积为1:8添加冻干保护剂，对菌剂发光复苏影响进行试验，其复苏时间与对应的发光值如图1所示。

通过图1可以看出，复苏5min后相对发光强度在300左右，发光强度在10min稳定后达到420，随后达到稳定状态。采用本发明制备的冻干粉保护剂组分的费氏弧菌冻干粉的复苏时间缩短了5min，同时10min左右能达到较稳定的状态，且达到稳定状态下的发光强度要远高于其他冻干粉保护剂制备的费氏弧菌冻干粉。

Claims (6)

1.一种发光菌的冻干保护剂，其特征在于，其包括如下重量份数的主要原料：半乳糖42～55份，海藻糖19～26份，脱脂乳98～105份。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，其包括如下重量份数的主要原料：乳糖50份，海藻糖25份，脱脂乳104份。

3.权利要求1或2所述的冻干保护剂在制备发光菌冻干粉中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）按权利要求1所述的原料重量比，制成每升中含有半乳糖42～55g、海藻糖19～26g、脱脂乳98～105g的冻干保护剂；

2）按冻干保护剂体积：菌液体积为1：7～13将冻干保护剂添加到菌液中，冲悬均匀后分装；

3）将分装好的菌液放入冻干机中，冻干10h。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）按权利要求1所述的原料重量比，制成每升中含有半乳糖42～55g、海藻糖19～26g、脱脂乳98～105g的冻干保护剂；

2）按冻干保护剂体积：菌液体积为1：8将冻干保护剂添加到菌液中，冲悬均匀后分装；

3）将分装好的菌液放入冻干机中，冻干10h。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，还包括以下步骤：

1）将发光菌的冻干粉用3%NaCl溶液进行溶解，复苏10min，接种到液体培养基中，25℃，180rpm培养18h；

2）取复苏好的菌液，接种到液体培养基中，25℃，180rpm培养18h。

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