CN108085256A - 一种冻干保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳酸菌冻干保护剂，其组成为：海藻糖60‑80g/L，甘露醇30‑50g/L，硫酸锰1‑2g/L，在冻干前以乳酸菌湿菌体和冻干保护剂以体积1:4‑1:10充分混合，乳酸菌存活率可达93％以上，有效解决了乳酸菌冻干菌粉活菌存活率低的问题，在保藏期间性能稳定。本发明还可应用到乳酸菌生产中，可以根据需要制成胶囊剂、片剂、粉剂等不同产品形式。
Description
技术领域
本发明涉及一种冻干保护剂，及其在冻干乳酸菌中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
乳酸菌是一类益生菌，通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处的微生物，其已广泛应用于生物工程、农业、食品安全及生命健康领域。由于乳酸菌活力的影响因素众多，如：温度、pH、气体成分和机械作用力等，造成了其制剂极易失活，功效降低。通过冻干保护的乳酸菌，能有效增强其对高温、干燥等不良环境因子的抵抗能力，提高产品的稳定性；菌体形态在干燥后基本保持不变；复水性能好；脱水彻底适合长途运输和储存。
冻干过程的缺点是冰晶导致的细胞机械性损伤；电解质含量变化造成细胞损伤；脱水引起的损伤；改变细胞膜结构和功能；引起细胞内各种蛋白质变性失活，造成遗传物质损伤。为减小损伤，需在冻干体系中加入保护剂，常用的保护剂包括复合物、糖类、无机盐类、醇类、氨基酸类、聚合物、表面活剂、抗氧化剂等。保护剂成分、配比的筛选以及筛选的试验设计方法，在国内外针对不同菌种都有多项研究及成果。然而现在常用的冻干保护剂存活率较低，导致干粉中活菌数较小和复苏速度较慢。
发明内容
为了解决现有乳酸菌冻干保护剂存活率低的问题，本发明提供了一种冻干保护剂及其在冻干乳酸菌中的应用，以达到降低成本的良好效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的乳酸菌的冻干保护剂，其包含海藻糖、甘露醇和硫酸锰。
具体地，其包含：海藻糖60-80g/L，甘露醇30-50g/L，硫酸锰1-2g/L。
本发明另一目的是上述冻干保护剂在制备乳酸菌冻干粉中的应用，具体地，按乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:4-1:10，在乳酸菌中加入冻干保护剂，得到的乳酸菌冻干粉中乳酸菌存活率可达93％以上。
优选地，乳酸菌选自乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌；
其中，乳酸片球菌冻干保护剂包含：海藻糖73.31g/L，甘露醇38.68g/L，硫酸锰1.40g/L；戊糖片球菌冻干保护剂包含：海藻糖80.21g/L，甘露醇29.65g/L，硫酸锰1.20g/L：植物乳杆菌冻干保护剂包含：海藻糖59.82g/L，甘露醇49.74.65g/L，硫酸锰2.36g/L。
优选地，乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:6。
本发明的第三方面，提供了一种冻干型乳酸菌的制备方法，使用上述所述的冻干保护剂。其中，乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:4-1:10，优选地，乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:6。
优选地，乳酸菌选自乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。
本发明第四方面，提供了一种组合物，包含冻干的乳酸菌及上述所述的冻干保护剂，以及组合物在制备药物或食品中的应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1海藻糖和甘露醇交互作用对乳酸片球菌存活率影响的等高线图
图2海藻糖和甘露醇交互作用对乳酸片球菌存活率影响的响应面图
图3海藻糖和硫酸锰交互作用对乳酸片球菌存活率影响的等高线图
图4海藻糖和硫酸锰交互作用对乳酸片球菌存活率影响的响应面图
图5硫酸锰和甘露醇交互作用对乳酸片球菌存活率影响的等高线图
图6硫酸锰和甘露醇交互作用对乳酸片球菌存活率影响的响应面图
图7海藻糖和甘露醇交互作用对戊糖片球菌存活率影响的等高线图
图8海藻糖和甘露醇交互作用对戊糖片球菌存活率影响的响应面图
图9海藻糖和硫酸锰交互作用对戊糖片球菌存活率影响的等高线图
图10海藻糖和硫酸锰交互作用对戊糖片球菌存活率影响的响应面图
图11硫酸锰和甘露醇交互作用对戊糖片球菌存活率影响的等高线图
图12硫酸锰和甘露醇交互作用对戊糖片球菌存活率影响的响应面图
图13海藻糖和甘露醇交互作用对植物乳杆菌存活率影响的等高线图
图14海藻糖和甘露醇交互作用对植物乳杆菌存活率影响的响应面图
图15海藻糖和硫酸锰交互作用对植物乳杆菌存活率影响的等高线图
图16海藻糖和硫酸锰交互作用对植物乳杆菌存活率影响的响应面图
图17硫酸锰和甘露醇交互作用对植物乳杆菌存活率影响的等高线图
图18硫酸锰和甘露醇交互作用对植物乳杆菌存活率影响的响应面图
具体实施方式
实施案例1 乳酸菌菌体培养及冻干
(1)乳酸菌的培养
甘油管保藏的乳酸片球菌JQII-5(CGMCC NO.10512)、戊糖片球菌JQI-7(CGMCCNO.10511)和植物乳杆菌pc26(CGMCC NO.12810)分别在MRS固体培养基平板上划线，37℃培养24h，分别挑取单菌落转接到装有5ml商业MRS培养基(BD DIFCO)的15ml离心管，37℃培养9-10h，以1％(v/v)的接种量接种到装液量20ml的50ml离心管37℃培养12h，再以1％的接种量接种到MRS培养基装液量500ml的离心瓶(空离心瓶称重)，37℃培养12h。
将离心瓶菌液摇匀分装至50ml离心管，每管装液量20ml，配平后4000rpm、4℃离心10min，弃上清，加等体积0.85％的生理盐水悬浮，相同条件下再次离心，弃上清液，得到湿菌体。
(2)冻干方法
湿菌体与一定配比的保护剂以1:10(w/v)的比例再悬浮，置于4℃冰箱预冻1h，再置于-20℃冰箱预冻1h至固化，然后转移到-80℃冰箱冻结1h。
冻干机开机预冻5分钟左右至温度降为-55℃，将处理好的菌体转移至冻干机冻干12h(样品量大时间可适当延长)，即获得冻干粉。
(3)存活率的计算
冻干前的样品进行梯度稀释(10-6、10-7)平板计数，冻干后的冻干粉加生理盐水20ml，然后进行梯度稀释(10-6、10-7)平板计数，计算冻干后的存活率：
存活率＝冻干后活菌数/冻干前活数×100％
实施案例2 乳酸片球菌冻干保护剂成分研究
1、plackett-burman实验
用minitab软件设计plackett-burman实验，做十二次实验根据存活率比较8个因子的显著性。
按表1的配比配制冻干保护剂，共12组。其中，-1和1分别表示每个因子的高低两个不同水平，对应于表中的各因素-1、1即海藻糖80g/L、100g/L，甘油20g/L、25g/L，甘露醇20g/L、25g/L，可溶淀粉40g/L、50g/L，抗性淀粉40g/L、50g/L，乙酸钠2g/L、2.5g/L，硫酸锰1g/L、1.5g/L，茶粉2g/L、2.5g/L。
实施例1中的湿菌体与配制好的冻干保护剂按照1:10的比例(常规比例)再悬浮，进行冻干，方法见实施例1。并对冻干前、冻干后的样品进行梯度稀释，并计数，计算冻干后的存活率，结果见表1。冻干前菌浓3.55×109CFU/mL
表1 plackett-burman实验设计及结果
根据表1结果比较各因素显著性：
表2 plackett-burman实验各因素效应评价
由表2可知各因素对存活率影响显著性排列顺序为：海藻糖＞甘露醇＞硫酸锰＞甘油＞可溶淀粉＞茶粉＞乙酸钠＞抗性淀粉，其中海藻糖的影响最为显著其次是甘露醇和硫酸锰，海藻糖t值为负说明对响应值有负效应，浓度应递减，甘露醇和硫酸锰为正，浓度应递增。选择显著性排列1,2,3位的因素作为保护剂的成分，分别为海藻糖，甘露醇及硫酸锰。
2、最陡爬坡实验
根据表2结果设计最陡爬坡实验(steepest ascent design)以研究最大响应值的相应区间，最陡爬坡实验设计及结果如表3。冻干前存活率3.63×109CFU/mL。
表3 最陡爬坡实验设计及结果
3、box-behnken实验
根据最陡爬坡实验结果，选取实验3为中心点即海藻糖70g/L，甘露醇40g/L，硫酸锰1.5g/L进行响应面实验设计，用design expert软件(http://www.statease.com/dx10.html)设计实验，采用box-behnken实验设计方法，以菌体存冻干活率为响应值，进行15次实验，中心点重复实验为3次，实验设计及结果如表4所示。冻干前菌浓3.70×109CFU/ml。
表4 不同浓度不同类型保护剂JQII-5冻干存活率
得到的二次拟合方程存活率＝97.48+1.52×A-0.20×B-0.64×C-1.21×AB-0.34×AC-0.41×BC-1.40×A2-2.02×B2-1.95×C2(A为海藻糖，B为甘露醇，C为硫酸锰)，以存活率最高为条件，得到唯一一组解，海藻糖浓度为73.31g/L，甘露醇浓度为38.68g/L，硫酸锰浓度为1.40g/L冻干存活率为98.07％。等高线图和响应面图分别如图1-6所示，等高线中椭圆形或马鞍形表示交互作用显著，而圆形等高线表示因素见交互作用较弱，由图可知海藻糖、甘露醇、硫酸锰两两之间交互作用都比较显著。以最优解海藻糖浓度为73.31g/L，甘露醇浓度为38.68g/L，硫酸锰浓度为1.40g/L冻干存活率符合预期。
4、不同湿菌体与保护剂比例乳酸片球菌存活率
根据上述最佳保护剂配比配制冻干保护剂，按表5中湿菌体与保护剂的比例冻干乳酸片球菌，进一步确定湿菌体与保护剂的最佳比例为1:6，可确保在存活率不变的前提下提高每克菌粉活菌数。通过表5的数据显示，湿菌体和冻干保护剂以体积1:4-1:10充分混合，乳酸菌存活率可达93％以上。
表5 湿菌体与保护剂比例对冻干存活率及菌粉活菌数的影响
实施案例3 戊糖片球菌冻干保护剂成分研究
采用实施例2的方法对戊糖片球菌JQI-7(CGMCC NO.10511)的冻干保护剂成分进行研究。
1、plackett-burman实验
用minitab软件设计plackett-burman实验，做十二次实验根据存活率比较8个因子的显著性。
按表5的配比配制冻干保护剂，共12组。其中，-1和1分别表示每个因子的高低两个不同水平，对应于表中的各因素-1、1即海藻糖80g/L、100g/L，甘油20g/L、25g/L，甘露醇20g/L、25g/L，可溶淀粉40g/L、50g/L，抗性淀粉40g/L、50g/L，乙酸钠2g/L、2.5g/L，硫酸锰1g/L、1.5g/L，茶粉2g/L、2.5g/L。
按实施例1的方法得到戊糖片球菌的湿菌体，与配制好的冻干保护剂按照1:6的比例再悬浮，进行冻干，方法见实施例1。并对冻干前、冻干后的样品进行梯度稀释，并计数，计算冻干后的存活率，结果见表6。
表6 Placket-burman试验设计及结果
表7 plackett-burman实验各因素效应评价
由表7可知各因素对存活率影响显著性排列顺序为：海藻糖＞甘露醇＞硫酸锰＞甘油＞可溶淀粉＞茶粉＞抗性淀粉＞乙酸钠。选择显著性排列1,2,3位的因素作为保护剂的成分，分别为海藻糖，甘露醇及硫酸锰。
2、最陡爬坡实验
根据表6结果设计最陡爬坡实验(steepest ascent design)以研究最大响应值的相应区间，最陡爬坡实验设计及结果如表8。
表8 最陡爬坡实验设计及结果
3、box-behnken实验
根据最陡爬坡实验结果，选取实验2为中心点即海藻糖80g/L、甘露醇30g/L、硫酸锰1g/L进行响应面实验设计，用design expert软件设计实验，采用box-behnken实验设计方法，以菌体存冻干活率为响应值，进行15次实验，中心点重复实验为3次，结果表9所示：
表9 Box-behnken实验结果
得到的二次拟合方程存活率＝94.87+0.51×A+0.11×B+0.84×C-0.22×AB-0.40×AC-0.85×BC-4.33×A2-1.73×B2-1.07×C2(A为海藻糖，B为甘露醇，C为硫酸锰)，以存活率最高为条件，得到唯一一组解，海藻糖浓度为80.21g/L，甘露醇浓度为29.65g/L，硫酸锰浓度为1.20g/L，冻干存活率为95.05％。以最优解进行冷冻干燥，冻干存活率符合预期。等高线图和响应面图分别如图7-12所示
实施案例4 植物乳杆菌冻干保护剂成分研究
采用实施例2的方法对植物乳杆菌pc26(CGMCC NO.12810)的冻干保护剂成分进行研究。
1、plackett-burman实验
用minitab软件设计plackett-burman实验，做十二次实验根据存活率比较8个因子的显著性。
按表9的配比配制冻干保护剂，共12组。其中，-1和1分别表示每个因子的高低两个不同水平，对应于表中的各因素-1、1即海藻糖80g/L、100g/L，甘油20g/L、25g/L，甘露醇20g/L、25g/L，可溶淀粉40g/L、50g/L，抗性淀粉40g/L、50g/L，乙酸钠2g/L、2.5g/L，硫酸锰1g/L、1.5g/L，茶粉2g/L、2.5g/L。
按实施例1的方法得到戊糖片球菌的湿菌体，与配制好的冻干保护剂按照1:6的比例再悬浮，进行冻干，方法见实施例1。并对冻干前、冻干后的样品进行梯度稀释，并计数，计算冻干后的存活率，结果见表10。
表10 Placket-burman试验
表11 plackett-burman实验各因素效应评价
由表11可知各因素对存活率影响显著性排列顺序为：海藻糖＞甘露醇＞硫酸锰＞甘油＞可溶淀粉＞茶粉＞抗性淀粉＞乙酸钠。选择显著性排列1，2，3位的因素作为保护剂的成分，分别为海藻糖，甘露醇及硫酸锰。
2、最陡爬坡实验
根据表10结果设计最陡爬坡实验(steepest ascent design)以研究最大响应值的相应区间，最陡爬坡实验设计及结果如表12。
表12 最陡爬坡实验设计及结果
3、box-behnken实验
根据最陡爬坡实验结果，选取实验4为中心点即海藻糖60g/L、甘露醇50g/L、硫酸锰2g/L进行响应面实验设计，用design expert软件设计实验，采用box-behnken实验设计方法，以菌体存冻干活率为响应值，进行15次实验，中心点重复实验为3次，结果表13所示：
表13 Box-behnken实验结果
得到的二次拟合方程存活率＝93.37-0.11×A-0.048×B+0.47×C-0.10×AB-0.11×AC-0.16×BC-2.45×A2-1.50×B2-0.33×C2(A为海藻糖，B为甘露醇，C为硫酸锰)，以存活率最高为条件，得到唯一一组解，海藻糖浓度为59.82g/L，甘露醇浓度为49.74.65g/L，硫酸锰浓度为2.36g/L，冻干存活率为93.54％。以最优解进行冷冻干燥，冻干存活率符合预期。等高线图和响应面图分别如图13-18所示。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种冻干保护剂，其特征在于，包含海藻糖、甘露醇和硫酸锰。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，包含以下组分：
海藻糖60-80g/L；
甘露醇30-50g/L；
硫酸锰1-2g/L。
3.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂在制备乳酸菌冻干粉中的应用；
优选地，乳酸菌选自乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
乳酸片球菌冻干保护剂包含：海藻糖73.31g/L，甘露醇38.68g/L，硫酸锰1.40g/L；
戊糖片球菌冻干保护剂包含：海藻糖80.21g/L，甘露醇29.65g/L，硫酸锰1.20g/L；
植物乳杆菌冻干保护剂包含：海藻糖59.82g/L，甘露醇49.74.65g/L，硫酸锰2.36g/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，按乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:4-1:10，在乳酸菌中加入冻干保护剂；
优选地，乳酸菌与冻干保护剂的体积比为1:6。
6.一种冻干型乳酸菌的制备方法，其特征在于，使用权利要求1所述的冻干保护剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述乳酸菌选自乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。
8.一种组合物，其特征在于，包含冻干的乳酸菌，及权利要求1的冻干剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其在制备药物或食品中的应用。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述的乳酸菌选自乳酸片球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌。
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