CN102757922A - 嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

一种嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂及其制备和使用方法，本发明保护剂的组成为乳糖、半乳糖、海藻糖、Na₂HPO₄、抗坏血酸钠、MgSO₄。与现有技术相比，本发明保护剂不含有甘油，提高了嗜酸乳杆菌冷冻干燥保藏的存活率(存活率在85％以上)和稳定性，延长了嗜酸乳杆菌粉的保藏期(保存期1年，菌粉活菌数大于10¹¹cfu/g)；并由于不含乳成分，可以广泛应用于非乳制品中；本发明的制备方法和使用方法简单、易操作、成本低。

Description

嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂及其制备和使用方法

技术领域

本发明属于生物菌制品技术领域，具体涉及一种制备高活性嗜酸乳杆菌菌粉的复合冻干保护剂及其制备和使用方法。

背景技术

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为乳杆菌属，革兰氏阳性，不产芽孢，无鞭毛、荚膜、芽孢的细长杆菌，不运动，以单个、成双或短链形式存在，可发酵糖产生乳酸、乙醇、过氧化氢等厌氧或兼性厌氧的微生物，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，产生DL型乳酸。

目前嗜酸乳杆菌菌粉的制备主要采用真空冻干技术，但嗜酸乳杆菌如果直接进行冷冻干燥，存活率极低，因此筛选合适的保护剂至关重要。保护剂的作用与其化学结构有密切关系，应具有3个以上的氢键或一些离子基团，它们能够取代水与细菌蛋白质结合，保证蛋白质的稳定性，防止冻干时细胞内外冰晶的形成；保护剂的持水性可使冻干过程中细胞的水分不至于急剧下降，而使细胞蛋白质结构免遭破坏；保护剂能将菌体包裹其中，减少菌体与氧接触，降低细胞代谢。因此，开发复合冻干保护剂是制备高活性嗜酸乳杆菌菌粉的关键。

已有报道的一种嗜酸乳杆菌冻干保护剂，其组成为脱脂乳(16％)、麦芽糊精(10％)、海藻糖(10％)、L-谷氨酸、维生素C(2％)、甘油(2％)、MnSO₄(0.8％)，用其制得嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数10¹⁰cfu/g(徐丽萍.嗜酸乳杆菌冻干菌粉保护剂选择的研究.食品工业科技，2007，28(5)：119-122)。中国专利(申请号200910236172.8)公开了一种嗜酸乳杆菌冻干复合保护剂及其应用方法，其中的冻干保护剂的组成为脱脂奶粉、甘油、乳糖、谷氨酸钠及维生素C。由于甘油的添加导致菌粉易吸水变潮湿，导致嗜酸乳杆菌在贮存过程中死亡速度加快，降低了产品中的活菌数；此外，益生菌制剂一般要求菌粉中无乳成分，因此脱脂乳(粉)的添加对嗜酸乳杆菌冻干菌粉在非乳制品中的应用带来不便。

现有的保护剂中都含脱脂牛乳、血清、甘油、明胶、阿东糖、蔗糖、葡萄糖和乳糖等。有研究表明，大分子保护剂在单独使用时对细胞的保护作用效果不明显；若选择合适的大分子与小分子混合的保护剂，在保存期间能维持较高的细胞存活率；但由于微生物形态的差异和对环境条件要求的不同往往冻干效果相差很大、稳定性差，其冻干存活率为40％左右，菌粉活菌数在10⁸～10¹⁰cfu/g；由于其中加有甘油使得在贮存期间容易吸潮，造成菌种大量死亡、菌粉贮存期短，达不到商品要求的活菌数。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂及其制备和使用方法，该保护剂中无乳成分和甘油，解决嗜酸乳杆菌菌粉在冻干过程中的活菌数低、存活率不高、冻干菌粉容易吸水受潮以及不便在制剂中使用的问题。

本发明的嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，所述复合冻干保护剂的组成为：乳糖3～6g，半乳糖5～8g，海藻糖4～6g，Na₂HPO₄ 0.5～0.8g，抗坏血酸钠0.7～1.3g和MgSO₄ 0.2～0.4g，及100mL无菌水。

本发明复合冻干保护剂的组成还可以为：乳糖3.5～5.5g，半乳糖5.5～7.5g，海藻糖4～6g，Na₂HPO₄ 0.5～0.75g，抗坏血酸钠0.8～1.25g和MgSO₄0.2～0.4g，及100mL无菌水。

本发明的嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂的制备方法为：将抗坏血酸钠溶解于适量的无菌生理盐水中，过滤除菌得溶液A；再用余量的蒸馏水加热溶解乳糖、半乳糖、海藻糖、Na₂HPO₄和MgSO₄混合均匀；110℃灭菌15min，冷却后得溶液B；将溶液A与溶液B混合均匀，即得复合冻干保护剂产品。

本发明的嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂的使用方法为，将离心收集的嗜酸乳杆菌菌泥与所述的保护剂按1∶2的体积比混合均匀，于-40℃预冻3～8h，再于4～6Pa条件下冷冻干燥18～24h，得嗜酸乳杆菌菌粉。

本发明冻干保护剂的组分分为渗透型和非渗透型两类，海藻糖属于非渗透型，其不能进入细胞，能使溶液呈过冷状态，在低温条件下降低溶质浓度，从而起到保护作用；乳糖、半乳糖、Na₂HPO₄、抗坏血酸钠和MgSO₄属于渗透型，其在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化水的结晶过程，达到保护目的，但各组分的使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同。此外，保护剂中的糖类具有多个羟基，在冻干过程中可取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。

与现有技术相比，本发明保护剂由乳糖、半乳糖、海藻糖，Na₂HPO₄，抗坏血酸钠和MgSO₄组成，不含有甘油成分，提高了嗜酸乳杆菌冷冻干燥保藏的存活率(存活率在85％以上)和稳定性，延长了嗜酸乳杆菌粉的保藏期(保存期1年，菌粉活菌数大于10¹¹cfu/g)；并由于不含乳成分，可以广泛应用于非乳制品中；本发明的制备方法和使用方法简单、易操作、成本低。

具体实施方式

以下结合实例详细说明本发明技术方案的实施方式和使用效果。

实施例1、

先称取7g乳糖、11g半乳糖、8.5g海藻糖、1.3g Na₂HPO₄和0.4g MgSO₄，加热溶解于180mL蒸馏水中，经110℃灭菌15min，冷却至室温；再将2g抗坏血酸钠溶解于20mL无菌生理盐水中，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；再将滤液与冷却后的溶液按无菌操作要求混合均匀，即得复合冻干保护剂。

将嗜酸乳杆菌经活化检查无杂菌，形态无异常后，将其按4％(v/v)的接种量接入MRS培养基中，发酵温度为37℃，兼性厌氧发酵培养18h后，6000r/min离心10min，获得嗜酸乳杆菌菌泥；按体积比1∶2加入上述冻干保护剂，摇匀静置30min，在-40℃低温冰箱中预冻4h后，置入冻干机在4～6Pa下冷冻干燥20h，即得加有保护剂的嗜酸乳杆菌菌粉。

经检测，冻干存活率为85.21％，菌粉活菌数为3.69×10¹¹cfu/g。

实施例2、

先将8.5g乳糖、12g半乳糖、10g海藻糖、1.2g Na₂HPO₄和0.6g MgSO₄，加热溶解于185mL蒸馏水中，经110℃灭菌15min，冷却至室温；再将1.7g抗坏血酸钠溶解于15mL无菌生理盐水，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；再将滤液与冷却后的溶液按无菌操作要求混合均匀，即得复合冻干保护剂。

按实施例1方法获得嗜酸乳杆菌菌泥，按体积比1∶2加入上述冻干保护剂，摇匀静置30min，在-40℃低温冰箱中预冻6h后，置入冻干机在4～6Pa下冷冻干燥18h，即得加有保护剂的嗜酸乳杆菌菌粉。

经检测，冻干存活率为87.68％，菌粉活菌数为3.21×10¹¹cfu/g。

实施例3、

先将11g乳糖、15g半乳糖、12g海藻糖、1.5g Na₂HPO₄和0.8g MgSO₄，加热溶解于180mL蒸馏水中，经110℃灭菌15min，冷却至室温；再将2.5g抗坏血酸钠溶解于20mL无菌生理盐水中，用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；再将滤液与冷却后的溶液按无菌操作要求混合均匀，即得复合冻干保护剂。

按实施例1方法获得嗜酸乳杆菌菌泥；按体积比1∶2加入上述冻干保护剂，摇匀静置30min，在-40℃低温冰箱中预冻8h后，置入冻干机在4～6Pa下冷冻干燥24h，即得加有保护剂的嗜酸乳杆菌菌粉。

经检测，冻干存活率为92.68％，菌粉活菌数为3.81×10¹¹cfu/g。

Claims (4)

1.一种嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，所述复合冻干保护剂的组成为：乳糖3～6g，半乳糖5～8g，海藻糖4～6g，Na₂HPO₄ 0.5～0.8g，抗坏血酸钠0.7～1.3g和MgSO₄ 0.2～0.4g，及100mL无菌水。

2.根据权利要求1所述的复合冻干保护剂，其特征在于，复合冻干保护剂的组成为：乳糖3.5～5.5g，半乳糖5.5～7.5g，海藻糖4～6g，Na₂HPO₄0.5～0.75g，抗坏血酸钠0.8～1.25g和MgSO₄ 0.2～0.4g，及100mL无菌水。

3.制备权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂的方法，其特征在于，是将抗坏血酸钠溶解于适量的无菌生理盐水，过滤除菌得溶液A；再用余量的蒸馏水加热溶解乳糖、半乳糖、海藻糖、Na₂HPO₄和MgSO₄混合均匀；110℃灭菌15min，冷却后得溶液B；将溶液A与溶液B混合均匀，即得嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂产品。

4.按照权利要求1所述的嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂的使用方法，其特征在于，将离心收集的嗜酸乳杆菌菌泥与所述的冻干保护剂按1∶2的体积比混合均匀，于-40℃预冻3～8h，再于4～6Pa条件下冷冻干燥18～24h，得嗜酸乳杆菌菌粉。