CN112342172A - 一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用。本发明涉及的乳酸菌冻干保护剂组成为：麦芽糖7％‑10％，聚乙二醇3％‑6％，牛血清蛋白4％‑8％，谷胱甘肽3‰‑8‰，钴胺素0.5‰‑2‰。与现有技术相比，应用本发明涉及的保护剂可有效地提高了乳酸菌在真空冷冻干燥后的存活率(存活率大于96％)和有效活菌数(菌粉活菌数大于1011cfu/g),延长了菌粉的货架期(室温保存1年，活菌数大于1011cfu/g，损失率小于10％)。

Description

一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌在食品、农业、畜牧业、医药等领域有着广泛的应用。目前，乳酸菌制品普遍采用冷冻干燥等方法制备，在冻干前加入适当的保护剂可以减少冻干过程对细胞的损害，提高乳酸菌的存活。樊振等对植物乳杆菌和肠膜状明串株葡聚糖亚种进行保护剂优化，确定最佳保护剂配方分别为：脱脂乳15％、海藻糖6％、甘油2％、抗坏血酸3％和脱脂乳15％、海藻糖6％、甘油1％、抗坏血酸2％，优化后两株菌的冻干存活率分别达到88.21％和90.02％。发明专利《一株植物乳杆菌及一种冷冻干燥乳酸菌的方法》申请公布号：CN108315277 A，该专利提及一种保护剂，由水、小分子糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖等重量比组合物)、蛋白质(脱脂乳粉与酵母粉的组合物)、除氧剂(L-半胱氨酸盐)组成，菌泥与该保护剂按质量比1：(8-15)：(1.5-3.5)：(0.3-0.6)：(0.8-1.2)混合搅拌制得上机液，-20℃真空度18-22Pa下冻干制备植物乳杆菌LP5菌粉，其中活菌数为4.6×1011CFU/g以上，在25℃恒温条件下保藏360天，活菌存活率为75％以上。发明专利《乳酸菌真空冷冻干燥保护剂及其冻干工艺》申请公布号：CN 108624542 A，该专利提供了乳酸菌真空冷冻干燥保护剂，包括甘油1％-10％、海藻糖5％-20％、脱脂乳粉5％-20％、维生素C 0.5％-3％、阿拉伯胶10％-30％，余量为纯水，菌种的存活率大于90％，嗜热链球菌存活率大于80％。发明专利《嗜酸乳杆菌复合冻干保护剂及其制备和使用方法》申请公布号：CN 102757922 B，该发明保护剂的组成为乳糖、半乳糖、海藻糖、Na2HPO4、抗坏血酸钠、MgSO4。提高了嗜酸乳杆菌冷冻干燥保藏的存活率(85％以上)和稳定性，延长了嗜酸乳杆菌的保藏期(保存期1年，菌粉活菌数大于1011cfu/g)。发明专利《一种适于常温存放的乳酸菌冻干粉的制备》申请公布号：CN105602875 B，该发明采用干酪乳杆菌菌种液、嗜酸乳杆菌菌种液或两者按照1:1混合的菌种液作为菌种，并采用含有特定含量的聚葡萄糖、麦芽糖和海藻糖等复配的冻干保护剂，制备得到活菌数高于2×1011CFU/g，水分含量低于5％的适于室温存放的乳酸菌冻干粉，存放1年活菌数下降25-50％。发明专利《一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法》申请公布号：CN108676759 A，该发明公开了一种冻干保护剂，含有脱脂乳粉10％，谷氨酸钠6％，海藻糖12％，乳糖4％，菊粉6％，甜菜碱3％，虫草多糖2％，保护剂的比例按菌泥质量的4倍进行配制，其中乳酸菌主要包括植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌等。使用该保护剂进行冻干保护后，冻干菌粉的存活率都在85％以上，菌粉活菌数在1011CFU/mL以上。发明专利《一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺》申请公布号：CN 108676720 A，该发明公开的保护剂组分为普鲁兰多糖、Tris-HCl和硫酸亚铁铵。冻干制备的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌产品冻干存活率达到95.8％-96.7％，冻干粉产品在37℃、相对湿度65％的恒温条件下做产品加速试验，100天成活率达到72.6％-92.3％；制备动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌产品冻干存活率达到80.3％-90.1％，冻干粉产品在37℃、相对湿度65％的恒温条件下做产品加速试验，100天成活率达到65.4％-69.6％；制备屎肠球菌、粪肠球菌产品冻干存活率达到97.4％-98.1％，冻干粉产品在37℃、相对湿度65％的恒温条件下做产品加速试验，100天成活率达到85.3％-89.2％。该技术方案下各乳酸菌冻干后的存活率，是目前使用保护剂对乳酸菌进行冷冻干燥处理所能得到的较高的处理效果。
使用单一物质的乳酸菌冷冻干燥保护剂，不能全面的对乳酸菌进行保护，保护效果一般，如发明专利《一种冻干保护剂及其在制备乳酸菌冻干粉中应用》申请公布号：CN110373351 A，该发明公开了一种冻干保护剂，含有羧甲基茯苓多糖，冻干植物乳杆菌后存活率为77.48％。人们意识到使用不同种类的保护剂混合在一起形成复配保护剂，在冷冻干燥过程中使其相互协同作用可以提高对乳酸菌的保护效果，如发明专利《一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法》申请公布号：CN 107287121 A，该发明公开的保护剂有效成分由海藻糖、脱脂奶粉、复合添加组分(甘油和山梨醇混合)和渗透稳定组分(L-半胱氨酸、维生素C和乙酸钠混合)组成，冻干后获得的发酵剂常温下可保存30天，活菌存活率达到75％以上。但由于在保护剂的选择和配比上缺少科学的依据，这使得乳酸菌冷冻干燥后的实际效果不是十分理想，仍有很大的空间可以提高。
因此，如何合理地搭配不同种类的大分子、小分子保护剂，组合成最佳的乳酸菌冻干保护剂，从而改善传统的冻干保护剂在乳酸菌冻干后生物存活率低、稳定性不足等缺点，仍是今后乳酸菌工业生产应用所急需解决的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种乳酸菌冻干保护剂，按重量百分比计，麦芽糖7％-10％，聚乙二醇3％-6％，牛血清蛋白4％-8％，谷胱甘肽3‰-8‰，钴胺素0.5‰-2‰，余量为水。
所述作为乳杆菌保护剂按重量百分比计，麦芽糖7.5％-9％，聚乙二醇3％-5.5％，牛血清蛋白5.5％-7.5％，谷胱甘肽4.6‰-6.2‰，钴胺素0.8‰-1.5‰，余量为水。
所述作为乳球菌的述冻干保护剂，所述保护剂按重量百分比计，麦芽糖8.8％-10％，聚乙二醇3.5％-5.8％，牛血清蛋白6.2％-8％，谷胱甘肽3‰-4.5‰，钴胺素1‰-1.8‰，余量为水。
所述作为双歧杆菌所述的冻干保护剂，所述保护剂按重量百分比计，麦芽糖8.5％-9.8％，聚乙二醇4％-4.9％，牛血清蛋白4.5％-7.6％，谷胱甘肽6.7‰-7.6‰，钴胺素1.3‰-2‰，余量为水。
一种保护剂的制备方法，按上述比例将麦芽糖、聚乙二醇和牛血清蛋白溶解于水中，配制成保护剂母液A将谷胱甘肽和钴胺素溶解于适量的水中，配制成保护剂母液B；将冷却后的母液A与母液B按1:1的体积比混合均匀，即获得保护剂溶液。
所述保护剂母液A灭菌后与过0.22μm无菌滤膜除菌后的母液B混合；其中，配制成保护剂母液A经115℃灭菌20min
一种利用的保护剂制备乳酸菌冻干菌粉的方法，将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:3-1:8的质量比混合均匀，于-20℃预冻5-12h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥10-18h，得到乳酸菌冻干菌粉。
利用乳杆菌保护剂权制备乳酸菌冻干菌粉的方法，将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:4-1:6的质量比混合均匀，于-20℃预冻6-10h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥14-17h，得到乳酸菌冻干菌粉。
利用乳球菌保护剂权制备乳酸菌冻干菌粉的方法：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:3-1:5的质量比混合均匀，于-20℃预冻10-12h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥10-15h，得到乳酸菌冻干菌粉。
利用双歧杆菌保护剂权制备乳酸菌冻干菌粉的方法：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:5-1:8的质量比混合均匀，于-20℃预冻5-8h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥15-18h，得到乳酸菌冻干菌粉。
本发明所具有的优点：
本发明所涉及的复合型冻干保护剂既含有小分子渗透型保护剂，如麦芽糖、钴胺素，其在溶液中可以结合水分子，增加溶液粘性，减少水在结晶过程中对乳酸菌细胞的损伤；又含有大分子非渗透型保护剂，如聚乙二醇、牛血清蛋白，可以在菌体外形成包裹，防止冰晶在形成过程中对菌体细胞的伤害；同时谷胱甘肽具有抗氧化作用，可有效抑制自由基的形成，防止对细胞膜造成破坏；并且保护剂中钴胺素作为一种维生素还有助于维持乳酸菌的活力和存活，钴胺素是微生物体内的一种重要辅酶，参与机体内核苷酸、氨基酸和重要蛋白质的合成，在冷冻干燥过程中保证了微生物的正常生理代谢。进而本发明将上述多种类的保护剂混合使其具有各自的功能和作用，聚乙二醇、牛血清蛋白可以从乳酸菌细胞外部进行全方位保护，防止冷冻过程的冰晶损害，麦芽糖则从内部结合水增加黏度防止水结晶形成损伤，谷胱甘肽则防止冻干过程中外界环境对细胞形成氧化伤害，钴胺素保证了冻干过程中细胞内部正常的生理代谢和重要物质的合成，几种保护剂相互协同相互促进，对乳酸菌细胞形成了全方位的多重保护。同时，该保护剂理论上可以应用于各种乳酸菌(如其它种类的乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌等)的冷冻干燥过程。针对不同种类的乳酸菌，需要对保护剂的配比和冻干条件进行适当的调整优化以获得最佳的冻干效果。
与现有技术相比，本发明涉及的保护剂有效地提高了乳酸菌在真空冷冻干燥后的存活率(存活率大于96％)和有效活菌数(菌粉活菌数大于1011cfu/g),延长了菌粉的货架期(室温保存1年，活菌数大于1011cfu/g，损失率小于10％)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明适用于乳酸菌的复合型冷冻干燥保护剂兼具有渗透型保护剂、非渗透型保护剂和抗氧化剂，且配比科学，因此在冷冻干燥过程中对乳酸菌起到良好的保护作用，最终能够显著地提高乳酸菌的存活率并延长乳酸菌冻干粉制品的货架期。
实施例1：
称取麦芽糖8g、聚乙二醇4g、牛血清蛋白6g溶解于50mL蒸馏水中，配制成保护剂母液A，115℃灭菌20min，冷却；称取谷胱甘肽0.5g、钴胺素0.1g溶解于50mL无菌水中，配制成保护剂母液B，将母液B过0.22μm无菌滤膜除菌；随后将母液A和母液B完全混合均匀，获得保护剂溶液。
将布氏乳杆菌种子液按2％的体积比接种到1L的MRS培养基中，37℃厌氧发酵培养24h，将发酵液在4000rpm下离心30min，收集布氏乳杆菌菌泥，按质量比1:5加入上述保护剂，混合均匀后于-20℃预冻8h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥15h，获得布氏乳杆菌冻干菌粉。
按梯度稀释培养的方式检测冻干前和冻干后的有效活菌数，冻干存活率为97.5％，菌粉有效活菌数为6.79×1011cfu/g；室温密封存放1年后，菌粉的有效活菌数为6.21×1011cfu/g，损失率仅为8.5％。
实施列2：
称取麦芽糖10g、聚乙二醇5g、牛血清蛋白8g溶解于50mL蒸馏水中，配制成保护剂母液A，115℃灭菌20min，冷却；称取谷胱甘肽0.4g、钴胺素0.15g溶解于50mL无菌水中，配制成保护剂母液B，将母液B过0.22μm无菌滤膜除菌；随后将母液A和母液B完全混合均匀，获得保护剂溶液。
将屎肠球菌种子液按2％的体积比接种到1L的MRS培养基中，37℃厌氧发酵培养18h，将发酵液在4000rpm下离心30min，收集屎肠球菌菌泥，按质量比1:3加入上述保护剂，混合均匀后于-20℃预冻12h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥12h，获得屎肠球菌冻干菌粉。
检测冻干前和冻干后的有效活菌数，冻干存活率为98.9％，菌粉有效活菌数为8.93×1011cfu/g；室温密封存放1年后，菌粉的有效活菌数为8.42×1011cfu/g，损失率仅为5.7％。
实施列3：
称取麦芽糖9.5g、聚乙二醇4.5g、牛血清蛋白7g溶解于50mL蒸馏水中，配制成保护剂母液A，115℃灭菌20min，冷却；称取谷胱甘肽0.7g、钴胺素0.2g溶解于50mL无菌水中，配制成保护剂母液B，将母液B过0.22μm无菌滤膜除菌；随后将母液A和母液B完全混合均匀，获得保护剂溶液。
将植物乳杆菌种子液按2％的体积比接种到1L的MRS培养基中，37℃厌氧发酵培养28h，将发酵液在4000rpm下离心30min，收集植物乳杆菌菌泥，按质量比1:6加入上述保护剂，混合均匀后于-20℃预冻6h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥18h，获得植物乳杆菌冻干菌粉。
检测冻干前和冻干后的有效活菌数，冻干存活率为96.2％，菌粉有效活菌数为4.31×1011cfu/g；室温密封存放1年后，菌粉的有效活菌数为3.9×1011cfu/g，损失率仅为9.6％。

Claims (10)

1.一种乳酸菌冻干保护剂，其特征在于：按重量百分比计，麦芽糖7％-10％，聚乙二醇3％-6％，牛血清蛋白4％-8％，谷胱甘肽3‰-8‰，钴胺素0.5‰-2‰，余量为水。
2.按权利要求1所述的乳酸菌冻干保护剂，其特征在于：所述保护剂按重量百分比计，麦芽糖7.5％-9％，聚乙二醇3％-5.5％，牛血清蛋白5.5％-7.5％，谷胱甘肽4.6‰-6.2‰，钴胺素0.8‰-1.5‰，余量为水。
3.按权利要求1所述的乳酸菌冻干保护剂，其特征在于：所述保护剂按重量百分比计，麦芽糖8.8％-10％，聚乙二醇3.5％-5.8％，牛血清蛋白6.2％-8％，谷胱甘肽3‰-4.5‰，钴胺素1‰-1.8‰，余量为水。
4.按权利要求1所述的乳酸菌冻干保护剂，其特征在于：所述保护剂按重量百分比计，麦芽糖8.5％-9.8％，聚乙二醇4％-4.9％，牛血清蛋白4.5％-7.6％，谷胱甘肽6.7‰-7.6‰，钴胺素1.3‰-2‰，余量为水。
5.一种权利要求1所述得到保护剂的制备方法，其特征在于：按上述2倍浓度比例将麦芽糖、聚乙二醇和牛血清蛋白溶解于水中，配制成保护剂母液A；按上述2倍浓度比例将谷胱甘肽和钴胺素溶解于适量的无菌水中，配制成保护剂母液B；将冷却后的母液A与母液B按1:1的体积比混合均匀，即获得保护剂溶液。
6.按权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述保护剂母液A灭菌后与过0.22μm无菌滤膜除菌后的母液B混合。
7.一种利用权利要求1所述的保护剂制备乳酸菌冻干菌粉的方法，其特征在于：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:3-1:8的质量比混合均匀，于-20℃预冻5-12h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥10-18h，得到乳酸菌冻干菌粉。
8.按权利要求7所述的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的保护剂制备乳酸菌冻干菌粉的方法，其特征在于：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:4-1:6的质量比混合均匀，于-20℃预冻6-10h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥14-17h，得到乳酸菌冻干菌粉。
9.按权利要求7所述的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的保护剂制备乳酸菌冻干菌粉的方法，其特征在于：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:3-1:5的质量比混合均匀，于-20℃预冻10-12h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥10-15h，得到乳酸菌冻干菌粉。
10.按权利要求7所述的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的保护剂制备乳酸菌冻干菌粉的方法，其特征在于：将乳酸菌菌体与保护剂溶液以1:5-1:8的质量比混合均匀，于-20℃预冻5-8h，然后-80℃下于3-10Pa真空度下冷冻干燥15-18h，得到乳酸菌冻干菌粉。
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